CZ325697A3

CZ325697A3 - Způsob čištění erythropoetinu

Info

Publication number: CZ325697A3
Application number: CZ973256A
Authority: CZ
Inventors: Dino Zanette; Edoardo Giacomo Sarubbi; Adolfo Soffientini; Ermenegildo Restelli; Armando Grigoletto
Original assignee: Gruppo Lepetit S. P. A.
Priority date: 1995-04-14
Filing date: 1996-04-09
Publication date: 1998-06-17
Also published as: SI0820468T1; AU693693B2; DK0820468T3; EA000694B1; CA2216130C; CZ291770B6; DE69609061D1; KR100442076B1; WO1996032413A1; JP3998156B2; NO974524D0; KR19980703851A; EP0820468B1; DE69609061T2; NO317188B1; CA2216130A1; CN1181759A; NZ307173A; AR001622A1; EA199700314A1

Description

Vynález se týká jednoduchého a účinného způsobu pro izolaci biologicky účinných glykoproteinů, například erythropoetinu z biologických tekutin, které tyto látky obsahují.

Dosavadní stav techniky

Příprava erythropoetinu z různých zdrojů včetně buněk, které byly získány genetickým inženýrstvím byla popsána v různých evropských patentových spisech, například EP 148 605,.. EP 205 564, EP 209 539, EP 267 678, EP 649 464 a EP 672 160.

Pod pojmem erythropoetin se v průběhu přihlášky rozumí přírodně se vyskytující erythropoetin, který je možno získat například z lidské moči nebo polypeptidu, jejichž řetězec aminokyselin včetně glykosylace je zdvojen ve srovnání s přírodně se vyskytujícím erytjropoetinem. Uvedené látky podporují in vivo buňky kostní dřeně ke zvýšené produkci retikulocytů a červených krvinek. Zahrnut je také erythropoetin, který je možno získat z kultury savcích buněk tak, že se do těchto buněk uloží neporušený gen pro erythropoetin nebo erythropoetin, který je možno získat z kultury savčích buněk aktivací endogenního genu nebo genů pro erythropoetin, tak jak bylo popsáno například v mezinárodní patentové přihlášce, zveřejněné pod .číslem WO 93/09222 (podána jako PCT/US 92/09627, nebo v mezinárodní patentové přihlášce, zveřejněné pod číslem W0 94/12650 s prioritou z US přihlášky č. 07/985 586.

Způsob podle vynálezu je zvláště vhodný pro izolaci erythropoetinu ze živného prostředí, v němž jsou pěstovány kultury buněk, produkujících erythropoetin.

Pod pojmem živné prostředí se rozumí jakákoliv kapalina, získaná syntetickým způsobem, například živné prostředí pro^pesťování*savčxčřT'buněk', zvláš'tětakových7které“byiypo^”^-“ drobeny genetické transformaci.

Živné prostředí se v tomto případě oddělí od vypěstovaných buněk a buněčné- drti filtrací nebo ultrafiltrací obvyklým způsobem. Z tohoto důvodu znamená zfiltrované živné prostředí prostředí, oddělené od buněk a buněčné drti filtrací nebo ultrafiltrací.

Produkční buňky jsou s výhodou stabilizované nebo nestabilizované buněčné linie eukaryotického původu nebo s výhodou buněčné linie savců, které jsou při pěstování ve vhodném prostředí schopné produkovat požadovaný glykoprotein v izolovatelném množství. Jako příklady takových buněk je možno uvést fibroblasty, keratinocyty, epitheliální buňky, například z mléčné žlázy nebo ze střev, endotheliální buňky, buňky glie, nervové buňky, krevní buňky, například lymfocyty nebo buňky kostní dřeně, svalové buňky a mimoto také prekurzory všech . těchto somatických buněčných typů. Jak již bylo uvedeno, jde s výhodou o buněčný materiál savčího původu, například může jít o myšij krysy, králíky, kočky, psy, vepře, skot, ptáky, ovce, kozy, koně^ opice nebo Člověka. Nejvýhodnější je materiál z primátů a člověka. Pod pojmem produkční buňky se rozumí také primární, sekundární nebo imortalizované buňky obratlovců, zvláště savců, nejvýhodněji primátů nebo Člověka po transfekci exogenním genetickým materiálem, který přímo nebo nepřímo u buněk vyvolává produkci ízolovatelného množství erythropoetinu, tak jak bylo popsáno v mezinárodních patentových přihláškách č. WO 93/09222 nebo WO 94/12650.

Příklady imortalizovaných lidských buněčných linií, které je možno použít k produkci erythropoetinu jsou obecně i

známé a dostupné. Jde například o HeLa buňky a Jejich deri.vátynapříklad.A-TCCwCCL,. 22.l*a*2.2 ,^o_.buňky_karcinomu,,mléčné žlázy MCF-7, například ATCC HTB 22, o leukemické buňky K-562, například ATCC CCL 234, buňky karcinomu KB, například ATCC CČL 17, buňky karcinomu vaječníku 2780AD, popsané v publikaci Van del Blick A. M. a další, Cancer Res., 48, 5927 až 5932, 1988, buňky Ráji, ATCC CC1 86, buňky Jurkat, ATCC TIB 152, buňky Namalwa, ATCC CRL 1432, buňky HL-60, ATCC CCL 240, buňky WiDr, ATCC CCL 218, buňky HT1080, ATCC CCL 1219, buňky Daudi, ATCC CCL 213, buňky RPMI 8226, ATCC CCL 155, buňky U-937, ATCC CRL 1593, buňky Bowesova .melanomu, ATCC CRL 9607, podlinie WI-38VA13 buněk 2RSATCC CCL 75.1 a buňky MOLT-4, ATCC CRL 1582. Je také možno použít sekundární kmeny lidských fibroblastů, například WI-38, ATCC CCL 75 a MRC-5, ATCC CCL 171.

Jak již bylo uvedeno, způsobem podle vynálezu je možno

středí uvedených kultur.

jakéhokoliv živného proŠiroká aplikace technologií genetického inženýrství pro přípravu biologicky aktivních bílkovin ve velkém měřítku podstatně zvýšila vyhlídky získat tyto látky v množství, které odpovídá poptávce. V některých případech je vsak izolace těchto látek z živného prostředí obtížná, pracná a nákladná. Jde zvláště o případy, kdy bílkovina je vysoce glykosylována, jak již bylo svrchu uvedeno. V těchto oblastech stále přetrvává potřeba jednoduchých a účinných izolačních postupů, které by byly použitelné pro výrobu uvedených látek ve velkém měřítku.

V případe, že se v průběhu přihlášky uvádí specifická účinnost erythropoetinu, jde o účinnost, stanovenou metodou ELISA, například pomocí zkušebního balíčku pro stanovení lidského erythropoetinu (R and D systems, lne.).

Obsah bílkovin ve vzorku se měří zkouškou BCA na bílkoviny. Tyto»zkoušky*budouwdále-uvedeny podrobněji v odstavcich,_wtýr= kajících se analytických postupů.

Vynález si klade za úkol navrhnout izolační postupy, zvláště vhodný chromatografický postup, který by využíval jednoduchých materiálů, například matrice s dihydroxyboronylovými skupinami. Tento chromatografický stupeň je účinný a snadno proveditelný a je tedy možno jej zařadit jako první nebo některý následující stupeň vícestupňového postupu. V případe zařazení jako první stupeň se tato chromatografie s výhodou kombinuje s chromatografi i na iontoměniči jak bude dále podrobněji popsáno. Uvedený vícestupňový postup může zahrnovat mimoto jakýkoliv počet dalších chromatografických stupňů, při nichž je možno použít chromatografii na iontoměniči, chromatografii s oddělením izolovaných látek podle molekulové hmotnosti, hydrofobní interakci a afinitní chromatograf ické postupy.

V případě, že se dihydroxyboronylová chromatografie provádí jako některý provádí se tento postup s výhodou tak, že se částečně čistěný materiál, který obsahuje erythropoetin nanese na chromatograf ickou matrici, kterou je matrice s dihydroxyboronylovými skupinami. Částečně Čištěný materiál se rovněž uvede do rovnovážného stavu v tomtéž pufru jako matrice před nanesením na tuto matrici. Tento pufr bude dále označován jako první ekvilibrační pufr a bude podrobněji popsán. Tento postup je pro čištění erythropoetinu zvláště vhodný.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří způsob čištění erythropoetinu, který spočívá v tom, Že se • ·

a) zfiltrované živné prostředí s obsahem glykoproteinu,

j.. _t. - . . - který_ mábý t^izolován,-Uyede^do styku s chromatografickou matricí s díhydroxyboronylovým materiálem, předem uvedenou do rovnovážného stavu,

b) matrice se promyje prvním elučním pufrem a tento eluát se přímo uvede do styku s aniontoměničovou matricí s kvarterními amoniovými funkčními skupinami a

c) glykoprotein se vymývá druhým elučním pufrem.

Svrchu uvedeným způsobem je možno dosáhnout vysokého stupně čištění glykoproteinu ze živného prostředí, takže je tento postup možno účinně použít jako první stupeň vícestupňového postupu.

Podle výhodného provedení způsobu podle vynálezu je možno postupovat tak, že se živné prostředí,, které obsahuje požadovaný glykoprotein, který má být izolován, podrobí postupu, který spočívá v tom, že se

a) zfiltrované živné prostředí uvede do styku s ohromatografickou matricí, nesoucí dihydroxybóronylový materiál,

b) matrice se vymývá prvním elučním pufrem a eluát se přímo uvede do styku s aniontoměničovou matricí, nesoucí kvarterní amoniové funkční skupiny,

c) matrice se vymyje druhým elučním pufrem,

d) provede se ultrafiltrace při použití membrány-, oddělující látky s molekulovou hmotností 5000 až 30 000,

e) provede se případná diafiltrace k výměně pufru za jiný pufr, který je vhodný k provádění následujícího stupně,

f) provádí se gelová filtrace při použití pryskyřice, oddělující^látky^s molekulovou hmotností v rozmezí 5000 až 250 000. ——

Podle dalšího výhodného provedení spočívá způsob podle vynálezu v tom, že se

a) živné_ prostředí kultury upraví na pH 7,5 až 9,0 a uvede se do styku s chromatografickou matricí s dihydroxyboronylovými skupinami v rovnovážném stavu s prvním ekvilibracním pufrem, kterým je vodný pufr s koncentrací 25 až 100 mM s iontovou silou v rozmezí 2 až 20 mS/cm a s pH v rozmezí 7,5 až 9,0,

b) matrice se nejprve promyje prvním ekvilibracním pufrem a pak tímtéž pufrem s obsahem 10 až 100 mM nízkomolekulárnísloučeniny, obsahující 1,2-cis-diolové skupiny,

c) eluce se provádí prvním eluČním pufrem, kterým je vodný pufr o pH v rozmezí 7,5 až 11,0 s obsahem sloučeniny s 1-hydroxy, 2-aminoskupinami v koncentraci 20 až 200 mM, popřípadě v přítomnosti 2 až 8 M chaotropního činidla, 2 až 40 mM akceptoru kyanátových skupin a 0,01 až 0,1 % hmotnostních smáčedla,

d) eluát se uvede do styku s aniontomeničovou matricí, nesoucí kvarterní amoniové funkční skupiny, v rovnovážném stavu s druhým ekvilibracním pufrem, kterým je vodný pufr o pH 7,5 až 11,0, obsahující 0,01 až 0,1 % hmotnostních smáčedla,

e) matrice se promyje druhým ekvilibracním pufrem a pak tímtéž pufrem, obsahujícím navíc až 50 mM soli,

f) eluce se provádí druhým elučním pufrem o pH 7,5 až

11,0 v přítomnosti 0,01 až 0,1 % hmotnostních smáčedla a 150 až 350 mM soli,

g)

h)

i) provede se ultrafiltrace při použití membrány, oddělujíc í*!-látky*s molekulovouřhmotností-5000 až 30 000, provede se případná díafiltrace k výměně pufru za jiný pufr, který je vhodný k provedení následující filtrace na gelu a provede se filtrace na gelu při použití separacní pryskyřice, oddělující látky s molekulovou hmotností v rozmezí 5000 až 250 000.

Pod pojmem chromatografická matrice s obsahem dihydroxyboronylových skupin se rozumí jakákoliv známá chromatograf ická matrice, která nese boritanovou funkci, v níž je atom boru stabilně vázán na uhlíkový řetězec, v němž proximální uhlíkový atom má dostatečnou hustotu volných elektronů k tomu,, aby zůstal vázán na atom boru za různých podmínek použití. S výhodou je tento proximální uhlíkový atom atom aromatické skupiny, například atom uhlíku, tvořící součást benzenového kruhu, popřípadě substituovaného. Zvláště $ výhodné jsou pro použití k provádění způsobu podle vynálezu. ΐ tak zvané fenylboritanové pryskyřice. Jako příklad těchto pryskyřic je možno uvést pryskyřice,, uvedené v US patentových spisech č. 4 562 251, 4 778 888 a 4 269 605. Z těchto látek jsou v současné době nejvýhodnější matrice z agarosy s fenylboritanovýmí skupinami. Tyto matrice se běžně dodávají například od Amicon lne nebo Grace lne. pod obchodními názvy MATREX GEL, jde například o typy MATREX GEL PBA-10.

PBA-30 a PBA-60. V případě, že je tento stupeň zařazen jako první stupeň postupu, prováděného ve více stupních, je nejvýhodnějším materiálem pro toto použití agarosa s fenylboritanovýml skupinami, dodávaná pod názvem MATREX GEL PBA-60, v níž je kyselina m-aminofenylboritá kovalentně vázána na agarosu s velikostí částic v rozmezí 50 až 150 mikrometrů při částicích kulovitého tvaru, obsaženo je 60 až 100 mikroM . kyse-l-iny^bori té/ml* gelu. Pro další.stupně^čištění, j sou ..však.._ΓΊΙΤΤ-_Γ-výhodnější jiné agarosové matrice s obsahem fenylboritanových skupin, například MATREX GEL PBA-30, v níž je kyselina m-aminofenylboritá kovalentně vázána na agarosu, jejíž kulovité částice mají průměr 50 až 150 mikrometrů, množství kyseliny je 30_ až 50 mikroM kyseliny borité/ml gelu.

V současné, době je nejvhodnější použití těchto chromatograf ických matricí při chromatografii, prováděné na sloupci, i když použití těchto materiálů v jiných systémech není zcela vyloučeno.

Při použití při chromatografii na sloupci se chromá- .....

tografická matrice se svrchu uvedenými funkčními skupinami s výhodou užívá při teplotě místnosti, zvláště výhodné při _t teplotě 5 až 25 °C a zejména 10 až 20 °C, nejvýhodnější tepi -4-« i e

Svrchu uvedený první ekvilibracní pufr se s výhodou volí ze skupiny glycin, fosfáty, trialkylamoniumhydrogenuhličitan a kyselina 4-(2-hydroxyethyl)-l-piperazinoethanosulfonová, HEPES, v uvedené koncentraci, iontové síle a pH. Zvláště výhodná koncentrace pro tento první ekvilibracní pufr je koncentrace přibližně 50 mM, zvláště výhodná hodnota pH je při- bližne 8,5 a výhodná vodivost přibližně 2,5 mS/cm . Tyto výhodné podmínky je možno použít jak v případě, že je uvedený postup zařazen jako první stupeň nebo jako kterýkoliv další' stupeň postupu, prováděného ve více stupních.

Svrchu uvedená nízkomolekulární sloučenina s obsahem

1,2-cis-diolových skupin může být jakákoliv známá nízkomolekulární sloučenina, která obsahuje uvedené skupiny, to znamená, že obsahuje nejméně dvě hydroxyskupiny na sousedních •

«1

atomech uhlíku tak, aby mohla vzniknout přibližně rovinná konfigurace. Representativními příklady těchto látek, kte‘ ττ ΓΠ-. if.^ - Γ-Κ'ΙΤΠΠ- T t-H*W**W ré jsou běžně známé, mohou být polyoly s krátkým otevřeným řetězcem, například sorbitol,. mannitol, adonitol, arabitol, glycerol, erythritol a cis-inositol a také monosacharidy s uzavřeným řetězcem, jako ribosa a mannosa, velmi výhodný je sorbitol. Zvláště výhodné je použití nízkomolekulární látky s obsahem 1,2-cis-diolových skupin v koncentraci přibližně 50 mM v případě, že běží o první stupeň čištění, kdežto v případě použití tohoto postupu v některém následujícím stupni je výhodná koncentrace této látky 20 až 100 mM, nejvýhodnejŠí je koncentrace 100 mM.

Svrchu uvedená sloučenina, obsahující 1-hydroxy-2-aminoskupiny, která tvoří hlavní složku prvního eluční.ho pufru, může být jakákoliv sloučenina, která obsahuje uvedené funkční skupiny a může vytvořit vodný pufr se svrchu uvedeným rozmezím pH. Jako příklad takových sloučenin je možno uvést 2-amino-2-hydroxymethyl-l,3-propandiol, který je uváděn také jako tris nebo tris(hydroxymethyl)aminoethan, dále bis(hydroxymethyl)aminoethan, N-(2-hydroxy-l,l-bis/hydroxymethylethyl/)glycin, uváděný také jako tricin . a N,N-bis(2-hydroxyethyl)glycin, uváděný také jako bícin. Tyto látky se s výhodou užívají v koncentraci 20 až 100 mM, přičemž v případě prvního stupně čištění se obvykle užívá koncentrace 50 mM. První eluční pufr se s výhodou upravuje na pH přibližně 8,5.

V případě použití v některém z následujících stupňů čištění je výhodné koncentrační rozmezí 20 až 150 mM,. nejvýhodnější je koncentrace 100 mM. Také pro toto použití je v současné době výhodnou sloučeninou tris.

Výhodné podmínky eluce v případě použití chromatogra.fie na matrici, obsahující fenylboritanové skupiny jako • ·

- 10 druhého chromatografického stupně zahrnují použití eluční,ho pufru,_ob sáhují čího 100 mM tris a 100 mM sorbitolu.

’^,***^T· - ' H * ” — · “ - . mi HlMMUii

S výhodou obsahují druhý ekvilibrační pufr a druhý eluČní pufr svrchu uvedenou sloučeninu s obsahem 1-hydroxy, 2-aminoskupin jako svou hlavní složku. V těchto případech je výhodná koncentrace uvedené látky 20 až 200 mM.

Pod pojmem chaotropní činidlo se rozumí Činidlo, které napomáhá přeměně bílkovinného materiálu na vhodnou sůl a tím i solubilizaci tohoto materiálu ve vodném prostředí, obecně v důsledku svých disociačních. vlastností.

Jako příklady chaotropních činidel je možno uvést močovinu a její deriváty a také guanidin. V případě použití chaotropního činidla se toto činidlo užívá v koncentračním rozmezí 2 až 8 M, s výhodou 4 až 6 M.

Akceptorem kyanátových skupin může být jakákoliv známá sloučenina, která je schopna rychle vázat ionty ONO , kteréi se mohou vytvořit při hydrolýze močoviny. Výhodným akcepto-Λ;

rem kyanátových skupin je glycin. V případě jeho použití při provádění způsobu podle vynálezu se glycin s výhodou užíváJ v koncentraci 2 až 40 mM, zvláště 20 mM.

Pod pojmem smáčedlo se v průbehupřihlášky rozumí jakákoliv známá látka, která snižuje povrchové napětí, to znamená síly, působící na povrchu kapalin s tendencí změn- . . šit jejich povrch. Výhodnými příklady smáČedel mohou být zvláště polyoxyethylensorbitanové deriváty mastných kyselin, známé pod obchodním názvem Tween, velmi výhodnou látkou pro g toto použití je zejména Tween 20, to znamená polyoxyethylensorbitanmonolaurát. V případě svého použití se smáčedlo užije v koncentraci 0,01 az 0,1 %, s výhodou 0,01 % hmotnostních.

·· ·»·* • · ·♦ 00 0’ ·«·· · · · · • · · · · 9 ♦·· ·♦»»»»·*···· > · i * · * *· tlil ♦ »· ···♦ 9*··

- 11 Svrchu uvedená aniontomenicová matrice, obsahující kvarterní^amoniové^funkční skupiny'může^býť' jakákoliv'běžně·* dodávaná matrice dohoto typu. Výhodné pro toto použití Jsou matrice na bázi agarosy nebo celulosy, například na bázi mikrokrystalické celulosy nebo zesítěné agarosy. Zvláště výhodné Jsou také ty matrice, které obsahují diethylaminoethylové, triethylaminomethylové nebo trimethylaminomethylové funkční skupiny.

Zvláště výhodnou aniontoměničovou matricí je zesítená agarosa s trímethylaminomethylovými skupinami, která se běžně dodává například pod názvem Q-Sepharose (Pharmacia AB). Chromatografie s použitím takové matrice se s výhodou provádí na sloupci při teplotě místnosti.

V případě, že se do promývacího nebo elučního pufru přidává sůl, tak jak bylo svrchu uvedeno,, je účelem, tohoto přidání zvýšeni iontové sily pufru, Jak se to běžně provádí. K uvedenému účelu je proto možno použít kteroukoliv z běžně užívaných solí. Jednou z nejčastěji používaných solí je v tomto případě chlorid sodný.

Ultrafiltrační stupeň je možno uskutečnit běžným způsobem při použití systému s tangenciálním průtokem nebo systému, tvořeného komorou s míchaným obdahem. Použitou membránou je s výhodou polysulfonová membrána nebo membrána z regenerované celulosy, může jít o běžně dodávané typy membrán, například od Millipore lne. nebo Amicon lne. K provádění způ sobu podle vynálezu jsou vhodné zvláště takové membrány, jimiž je možno oddělit sloučeniny od molekulové hmotnosti 10 000

Ultrafiltrát se pak popřípadě podrobí diafiltraci, opět známým způsobem a s výhodou v tomtéž pufru, který se pak užije pro následnou filtraci na gelu. Jako pufr pro tuto • .· • 9 · 4 · ·4 • 4 4 4· 4 • 9 4 44 4*4

4 4 4 44

4 4 4 4Λ 44 *·

- 12 filtraci na gelu je například možno použít vodný pufr o pH v rozmezí 6 až 8. Svrchu uvedená sůl je v tomto pufru příwawMawMMWHWWMmMvM·. - - - —*—»11· i II I.*·*». .Η *·ιι«ιιι*· tomná s výhodou v rozmezí 100 až 200 mM a zvláště v množství

100 mM, pH se pohybuje v rozmezí 7,4 až 7,5.

K provádění tohoto stupně způsobu podle vynálezu je možno použít běžné matrice pro filtraci na gelu. Jako příklady těchto matric je možno, uvést polydextrany, zesítěné působením akrylamidů, například hydrofilní gely s vysokou mechanickou pevností, připravené kovalentním zesítěním allyldextrahu působením NjN^-methylenbisakrylamidu, použít je možno také gely na bázi zesítěné celulosy. Zesítěné dextranakrylamidové gely jsou běžně dodávány a jsou známé například pod obchodním názvem Sephacryl (Pharmacia AB). Výhodným gelem totohoto typu je Sephacryl Ξ-200 HR s průměrem částic 25 až 75 mikrometrů, jehož zesítění je řízeno tak, aby byly odděleny globulární bílkoviny s molekulovou hmotností v rozmezí 5000 až 250 000.

i

Jako příklad zesítěných gelů na bázi celulosy je možno uvést běžně dodávané porézní gely ze zesítěné celulosy, například GLC 300 s průměrem částic v rozmezí 44 až 125 mikrometrů nebo GLC 1000 se středním průměrem částic 53 až 125 mikrometrů (Amicon, lne.).

Způsob podle vynálezu je zvláště vhodný k provádění ve velkém měřítku vzhledem k tomu, že je tvořen řadou postupů, které je snadno možno za sebou zařadit bez obvyklých.....

nevýhod těchto stupňů.

Mimoto se při provádění způsobu podle vynálezu používá pouze vodných rozpouštědel, což přináší další výhodu, jak bude každému odborníku zcela zřejmé.

·* ·· · · * • · »

• · 4 4· · * · ·

44

Mimoto je tímto způsobem možno postupovat od prvního 'cfíroi^ťografickéhó'^sťupně'7ťo'' znamená· od* s tupne, * prováděného na matrici s dihydroboritanovými skupinami do druhého chromatografického stupně s použitím aniontoměnicové matrice přímým přenesením eluátu z prvního stupně do druhého stupně bez nutnosti výměny nebo úpravy rozpouštědla.

,r, * . j

Tato skutečnost může usnadnit celý postup, avšak mimoto přispívá ke zvýšení celkového výtěžku.

Způsobem podle vynálezu je tedy možno izolovat produkt typu erythropoetinu s průměrnou specifickou účinností 145 000 až.175 000 jednotek ELISA/mg, přičemž se vychází ze zfiltrovaného živného prostředí s průměrnou specifickou účinností 500 až 2000 jednotek·.ELISA/mg.

Kombinace prvního a druhého chromatografického'stupně mimoto dovoluje,-..60, až’ lOO-násobné. čištění .tohoto-i-materiálu,.,. přičemž pro úplný postup, provedený ve všech stupních je ' celkový faktor čištění výsledné látky 110 až 150.

V případě erythropoetinu je produktzískaný, na. konci způsobu podle vynálezu možno izolovat jako pevnou látku po odstranění solí a.po lyofilizaci běžným způsobem, nebo je možno uskutečnit v získaném roztoku výměnu rozpouštědla, například diafiltrací k získání roztoku, vhodného pro výrobu farmaceutických prostředků, například podle patentového spisu EP 430 200.

Praktické provedení vynálezu bude vysvětleno následujícími příklady, které však nemají v žádném případě sloužit k omezení rozsahu vynálezu.

- 14 . Příklady provedení vynálezu * .................... Im HllilMFi. muMIWHi·,·, ... II inwWMHWWmwliiMt ..i ....lpi. lil .MBUfr·.1,^—1. ,1.1»l ili

Příklad 1

Chromatografie na matrici s fenylboritanovými skupinami jako první stupeň Čištění erythropoetinu

Supernatant z kultury buněk, produkujících lidský erythropoetin, získaný například způsobem podle příkladu 21 mezinárodní patentové přihlášky WO 93/09222 nebo podle mezinárodní patentové přihlášky WO 94/12650 a obsahující přibližně 20 mg erythropoetinu se zfiltruje při použití běžně dodávaného prostředku, obsahující membránu s průměrem otvorů

1,2 a 0,5 mikrometrů (Opticap, Millipore lne.). Pak se mate- riál podrobí ultrafiltraci na běžně dodávaném prostředku, obsahujícím membránu z regenerované celulosy S1Y30 (Amicon lne.), a oddělující sloučeniny s molekulovou hmotností 30 000, pak se provádí diafiltrace při použití vody a 0,05M HEPES o 2 pH 8,5, vodivost 2,5 mS/cm . Ultrafiltrát se nanese na chromatografický sloupec s obsahem nabobtnané agarosy s fenylboritanovými skupinami, užije se 120 ml agarosy PBA 60 (Aiiii. . . . con lne. ) v.rovnovážném stavu s 0,05 M. HEPES o.pH.8,5 s.^ob- sáhem 0,1 % Tween 20 (pufr A), sloupec se udržuje na teplotě 10 až 15 °C chlazením, vodou. Rychlost průtoku se nastaví na 2 až 4 objemy sloupce, CV, za hodinu. Po promytí pufrem A až do stabilizace základní čáry podle optické hustoty OD při 280 nm se sloupec dále promývá při použití 0,05 M HEPES o pH 8,5 s obsahem 0,01 % Tween 20 a 0,05 M sorbitolu (pufr B). Eluce se provádí při použití 0,02 M tris o pH 8,5 s obsahem 6 M močoviny, 0,02 M. glycinu a 0,01 % Tween 20 (pufr C) a materiál,, který se vymývá v hlavním vrcholu při sledování OD při 280 nm se izoluje, tento materiál má přibližně 4 až 5-násobný objem, sloupce., získá se ve výtěžku 70 až 80 % a produkt je v něm čištěn přibližně dvacetkrát. Materiál se ·' · * φ

- 15 pak přímo nanese na sloupec zesítěné agarosy s trimethylamino methylovým i skupinami .jako aniontoměničové pryskyřice, užije se 25 ml nabobtnané pryskyřice Q-Sepharose FF, (Pharmacia AB) v rovnovážném stavu s 0,02 M tris o pH 8.,5 s obsahem 0,01 % Tween 20 (pufr D). Po promytí pufrem D při stálé rychlosti průtoku až do stabilizace základní cáry se pak sloupec promývá tímtéž pufrem, který navíc obsahuje 0,05 M chloridu sodného (pufr E), k eluči se užije 0,02 M tris o.pH 8,5 s obsahem 0,01 % Tween 20 a 0,15 M chloridu sodného (pufr F). Materiál z oblasti vrcholu při sledování OD při 280 nm se izoluje, výtěžek je přibližně.80 %. Materiál se pak koncentruje ultrafiltrací při použití komory s míchaným obsahem a membránou, schopnou oddělit sloučeniny od molekulové hmotnosti 10 000 (YM10, Amicon). . .

Koncentrovaný roztok se nanesena sloupec, obsahující gel zesítěného dextranu.s akrylamidem Sephacryl S 200 (Pharmacia AB), v rovnovážném stavu 0,02 M Tris o pH 7,4 s obsahem 0,15 M NaCl (pufr G), sloupec se vymývá týmž pufrem. Odebírají se jednotlivé frakce, frakce s obsahem'erythropoetinu (detekce zkouškou ELISA) se spojí a koncentrují ultrafiltrací svrchu uvedeným způsobem.

Příklad 2

Chromatografie na materiálu s fenylboritanovými skupinami . jako jeden z dalších stupňů při čištění erythropoetinu

Roztok částečně čištěného lidského erythropoetinu, získaného z produkčních buněk způsobem podle příkladu 21 mezinárodní patentové přihlášky W0 93/09222 nebo podle

W0 94/12650 a obsahující přibližně 20 mg erythropoetinu se podrobí diafiltraci nebo dialýze proti vodě a 0,05 M HEPES

... 2 o pH 8,5 s 0,15 M NaCl při vodivosti 18 mS/cm . Pak se

*4 4«

4· 4 • 4 4 4

4*4 4 4

4 *

4 '4*

4' _v

4 4	44*4
4 4'	4
•	4'
4	* 4
4	4
4444	4

4

4 4 * ·

- 15 materiál nanese na chromatografický sloupec agarosy s fenylbdriťándvými* skúp‘ih‘am’i7*už'i'jé^,'s'e''l'2O* ml* nabobtnané· prysky-'*** řiče PBA 30 (Amicon lne.) v rovnovážném stavu v 0,05 M HEPES o pH 8,5 s obsahem 0,15 M NaCl (pufr A ), sloupec se udržuje na teplotě 10. až 15 °C chlazením vodou. Rychlost průtoku se upraví na 2 až 4 objemy sloupce CV za hodinu. Sloupec se promývá pufrem_A^x až.do stabilizace základní čáry při optické hustotě OD při 280 nm. K eluci se užije 0,10 M Tris o pH 8,5 s obsahem 0,1 M sorbitolu (pufr b'), materiál, který tvoří obsah vrcholu při OD při 280 nm se oddělí, objem tohoto materiálu je přibližně 4 až 5 CV, výtěžek je přibližně 90 %.

Analytické postupy

ELISA

Specifická účinnost erythropoetinu, získaného způsobem podle vynálezu se měří metodou ELISA pro lidský erythropoetin EPO. Postup je známý a zkušební balíček se běžně dodává pod obchodním názvem QUANTIKINE IVD (R and D Systems).

Analýza bílkovin

Zkoušky na bílkovinu se provádějí při použití zkušebního balíčku BCA protein Assay (Pierce Chemical Co.). Jde o postup, který kombinuje biuretovou reakci (redukce bílkovin 2+ 1+ pomocí Cu na Cu v alkalickém prostředí) s vysoce specifickou reakcí kyseliny bicinchonové BCA na Cu¹⁺.

Specifická účinnost

Specifickou účinnost jednotlivých vzorků je možno vypočítat podle následující rovnice:

*4 4444'	4 4	4«	4 ·	• 4
« 4 4.	4 4	• 4	4 4' 4	4
• 4	4 4	/ 4	4' 4	4 4
4 4 ·.	4 4	4 4>	44 4 4	4
4 4	4 4	•	·' 4	4
• 4 44, 4	4 4	4444	·«	4>

Specifická účinnost = počet jednotek erythropoetinu při

.......... ,._Η.,w., zkoušeewEL-I-SA/mg bílkoviny při BCA.>*-*>—,

Čištěný erythropoetin má specifickou účinnost přibližně 200 000 jednotek ELISA/mg bílkoviny při BCA. Specifická účinnost, zjištěná při zkoušce ELISA je pouze nepřímo spojena se skutečnou biologickou účinností erythropoetinu. Z tohoto důvodu se obvykle provádí ke stanovení specifické účinnosti in vivo biologická zkouška, která je v oboru dobře známa a k níž se užívají polycythemické myši, které prodělaly období sníženého zásobení kyslíkem. Tímto způsobem je možno mezinárodzjistit specifickou účinnost vzorku a vyjádřit ji v nich jednotkách/mg bílkoviny, jak je v oboru běžné.

Analýza HPLC

Zařízení: Systém Waters 616 LC, opatřený detektorem model 996..

Sloupec: Vydac pro bílkoviny, C^, 3 mikrometry, 4,6 t Γ1f1uú rOCtuVa

PDA x 250 mm.

3.

acetonitril 95 : 5, B) 0,1% vodná kyselina trifluoroctová a acetonitril 5 : 95.

Gradient: min (%B): 5 (5), 50 (95).

Rychlost průtoku: 1 ml/min.

Analýza SDS-PAGE

Analýza SDS-PAGE se provádí na Phas Systém (Pharmacia

AB), densitometrická měření se provádějí na průtokovém densitometru Flying spot CS-9301 PC (Shimadzu Co), podle návodu výrobce běžným způsobem.

9 99 91	99 *·	99		99
9 9	9 9 9 9	9 9-	9	9
9 9	9 9u 9	9 9		• 9
• ♦· 9	9 9 9 9	99 9	9	' 9
9 ¹ 9	9·9	9	9	9
• 999 9	.«9 9»99	99		• 9

Analytické údaje a výsledky

Při hodnocení produktu, získaného z řady zkoušek se specifická účinnost erythropoetinu v supernatantu buněčné kultury pohybovala v rozmezí 500 až 2000 jednotek ELISA/mg. Specifická účinnost erythropoetinu po prvním chromatografickém stupni se pohybovala v rozmezí 35 000 až 95 000 jednotek ELISA/mg.. Specifická účinnost erythropoetinu na konci čistění podle příkladu 1 se pohybovala průměrně v rozmezí 145 000 až 175 000 jednotek ELISA/mg.

Podle výsledků analýzy HPLC a podle SDS-PAGE tak, jak bylo svrchu uvedeno, je možno prokázat, že erythropoetin tvořil na konci postupu více než 92 % plochy pod křivkou AUC.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

............................ ¹ ................ΙΙΙ·Ι»»<Μ><ί·Ι·ΙΙΙ<Τ» «IIW||I.III>«I!II|I >» IIM1I 1«. RÍ»7.1 utiiRiK .4URU «II

1. Způsob čištění erythropoetinu, vyznačující s e t í tn , že se

a) materiál s obsahem erythropoetinu nanese na chromatograf ickou matrici s dihydroxyboronylovými skupinami, ' předem uvedenou do rovnovážného stavu v prvním ekvilibračním pufru,

b) sloupec se promyje ekvilibračním· pufrem a

c) eluce se provádí vodným pufrem o pH v rozmezí 7,5 ^Yaž 11 s obsahem sloučeniny s l-hydroxy-2-aminoskupinami a 1,2-cis-diolovými skupinami.
2. Způsob čištění erythropoetinu, vyznačující s e t í m. , že se

a) zfiltrované Živné prostředí obsahem glykoprotěinu, který má být izolován, uvede do styku .s chromatografickou matricí s dihydroxyboronylovým materiálem, předem uvedenou do rovnovážného stavu,

b)

c) matrice se promyje prvním elučním pufrem a tento eluat se přímo uvede do styku s aniontomenicovou matricí s kvarterními amoniovými funkčními skupinami a glykoprotein se vymývá druhým elučním pufrem.
3. Způsob čištění erythropoetinu, vyznačuj í cí se tím, že se

a) zfiltrované živné prostředí s obsahem glykoproteinu, který má být izolován, uvede do styku s chromatografickým materiálem s obsahem dihydroxyboronylových skupin, předem uvedeným do rovnovážného stavu v prvním ekvilibračním pufru,

• to • · to • toto' •j * · to » 9 ·' to 9 • to • <1 I . * to, · • «. to « · • a i; · · · to to • • .« to to • ··· · • • to ····* ·· ·

h) eluce se provádí prvním elučním pufrem,

-^_^|ΜΜΙ<·^Ι·ΜΜ»ΜΜΐαΝΜ|||·Μν^0|«Μ·^ » *

c) eluát se přímo uvede do styku s aniontoměničovou matricí s obsahem kvarterních amoniových skupin, • d) provede se eluce druhým elučním pufrem, , e) provede se.ultrafiltrace při použití membrány, oddělující látky od molekulové hmotnosti 5000 až 25 000,

f) popřípadě se provede diafiltrace k výměně pufru za pufr, vhodný pro následující stupeň a ·

g) provede se gelová filtrace při použití pryskyřice, oddělující materiály s molekulovou hmotností v rozmezí 5000 až 250000.
4. Způsob Čištění erythropoetinu, vyznačuj í- c í s e t í m , že se

a) živná.prostředí kultury upraví na pH 7,5 až 9,0 a uvede se do styku s chromatografickou matricí s dihydroxyboronylovými skupinami v rovnovážném stavu s J prvním ekvilibračním pufrem, kterým je vodný pufr s ¹ koncentrací 25 až 100 mM s iontovou silou v rozmezí ’

2 až 20 mS/cm a s pH v rozmezí 7,5 až 9,Oj

b) matrice se nejprve promyje prvním ekvilibračním pufrem a pak tímtéž pufrem s obsahem 10 až 100 mM nízkomolekulární sloučeniny, obsahující 1,2-cis-diolové skupiny, t

c) eluce se provádí prvním elučním pufrem, kterým je vodný pufr o pH v rozmezí 7,5 až 11,0 s obsahem sloučeniny s 1-hydroxy, 2-aminoskupinami v koncentraci 20 až 200 mM, popřípadě v přítomnosti 2 až 8 M , chaotropního činidla, 2 až 40 mM akceptoru kyanátových skupin a 0,01 až 0,1 % hmotnostních smáčedla,

4« ··*· *« ·· • · 4 4·4444»* ··*·· ··»* ^J 4 4. ·***«)*·** •••«44·* ···· · 4· ··· ····

d) eluát se uvede do styku s aniontoměničovou matricí,

.............................................* nesoucí**kvarterní amoniové funkční* skup iny 7 v^H rov-'·' novážném stavu s druhým ekvilibracním pufrem, kterým je vodný pufr o pH 7,5 až 11,0, obsahující 0,01 až 0,1 % hmotnostních smáčedla,

e) matrice se promyje druhým ekvilibracním pufrem a pak tímtéž pufrem, obsahujícím navíc až 50 mM soli,

f) eluce se provádí druhým elučním pufrem o pH 7,5 až 11,0 v přítomnosti 0,01 až 0,1 % hmotnostních smáčedla a 150 až 350 mM soli,

g) provede se ultrafiltrace při použití membrány, oddělující látky s molekulovou hmotností 5000 až

30 000,

h) provede se případná diafiltrace k výměně pufru za jiný pufr, který je vhodný k provedení následující filtrace na gelu a

i) provede se filtrace na gelu při použití separační pryskyřice, oddělující látky s molekulovou hmotností v rozmezí 5000 až 250 000.
5. Způsob podle některého z nároků 1, 2, 3 nebo 4, vyznačující se tím, že se jako chromatografický materiál s dihydroxyboronylovými skupinami použije . agarosa s fenylboritanovými skupinami.

• 5. Způsob podle některého z nároků 1, 2, 3 nebo 4, vyznačující se tím, že se první ekvilibrační pufr volí ze skupiny glycin, fosfát, trialkylamoniumhydrogenuhličitan a kyselina 4-(2-hydroxyethyl)-l-piperazinethansulfonová.

99 ♦···

9 9 •

• 999

II 9 999 ·

9 99 · 9 99 *

9 9 9 9 99 9

99 9 9 9 99 9 99

9 9 9 9 9«

99 9999 «9 *9
7. Způsob podle nároku 6, vyznačující . ,s_e , t^í_m___>nrje^se_ jako první _ekyil i b r ač n í puf r_uži je^kýselina 4-(2-hydroxyethyl)-l-piperazinoethansulfonová v koncentraci 0,05 M,
8. Způsob podle některého z nároků 1 až 7, vyznačující se t í m , že pH prvního ekvllíbraČního pufru má hodnotu 8,5.
9. Způsob podle některého z nároků 1 nebo 4 až 8, vyznačující se tím, že se sloučenina s nízkou molekulovou hmotností s obsahem 1,2-cis-diolových skupin volí ze skupiny polyolů s nízkou molekulovou hmotností a ’ přímým řetězcem, jako jsou sorbitol, mannitol, adonitol,.

arabitol, glycerol, erythritol a cis-inositol a z monosacharidů s uzavřeným řetězcem, jako jsou ribosa a monosa.
10. Způsob podle nároku 9, vyznačuj íc í se t i m , že se jako sloučenina s nízkou molekulovou .* hmotností s obsahem 1,2-cis-diolových skupin užije sorbitol. 1.

I

K
11. Způsob podle nároku 9 nebo 10, vyznačující se tím, že se sloučenina s nízkou molekulovou hmotností s obsahem 1,2-cis-diolových skupin užije v koncentraci 0,05 M.
12. Způsob podle některého z nároků 1 nebo 4 až 11, vyznačující se tím, že druhý ekvilibrační pufr obsahuje sloučeninu s obsahem l-hydroxy-2-aminoskupin v koncentraci 0,02 až 0,2 M.
13. Způsob podle některého z nároků 1 nebo 4 až 11, vyznačující se tím, že druhý eluční pufr obsahuje sloučeninu s obsahem 1-hydroxy, 2-aminoskupin v koncentraci 0,05 M.

«· ·♦»· t· ·* t· • · β • « • · « · * * • · • * « • · • · • · · • • ·»· • » • * • · • ♦ • · ·«» · · ·♦ »··· • · *«
14. Způsob podle některého z nároků 4 až 13, v-y značuj ící se tím,, že se sloučenina s obsahem 1-hydroxy, 2-aminoskupin volí ze skupiny, zahrnující 2-amino-2-hydroxymethyl^l,3-propandiol, bis(hydroxymethyl)aminoethan, N-/2-hydroxy-l,1-bis(hydroxymethylethyl)/glycin a N,N-bis(-2-hydroxyethyl)glycin.
15. Způsob podle-některého z nároků 4 až 14, vyznačující se tím, že se chaotropní činidlo volí z močoviny, derivátu močoviny aguanidinu.
16. Způsob podle nároku 15, vyznačujícíse t í m , že se jako chaotropní činidlo užije 6 M močovina.
17. Způsob podle některého z nároků 4 až 16, vyznačující se tím, že se jako akceptor kyanátových skupin užije glycin..
18.. Způsob podle některého z nároků 3 až 17, vyznačující se tím, že se aniontoměničová pryskyřice, nesoucí kvarterní amoniové funkční skupiny, volí ze skupiny, zahrnující mikrokrystalickou celulosu nebo zesítěnou agarosovou matrici, nesoucí diethylaminoethylové, triethylaminomethylové nebo trimethylaminomethylové funkční skupiny.
19. Způsob podle nároku 18, vyznačující se t í m , že se jako aniontoměničová matrice užije trimethylaminomethylagarosa.
20. Způsob podle některého z nároků 3 až 19, vyznačující se tím, že se k filtraci na gelu užije- zesítěný dextranakrylamidový gel s řízenou velikostí otvorů.