CZ330197A3 - Růstové modulátory neuritů centrální nervové soustavy (CNS), farmaceutické prostředky je obsahující, buňky je exprimující, způsoby jejich použití, které vedou k modulaci, podpoře a zesílení nervového růstu v CNS, zlepšení paměti, zvýšení synaptické výkonnosti v CNS, a způsob testování schopnosti látky modulovat aktivitu nervové adhezní molekuly - Google Patents

Description

* Růstové modulátory neuritů centrální nervové soustavy (CNS), farmaceutické prostředky je obsahující, buňky je exprimující, způsoby jejich použití, které vedou k modulaci, podpoře a zesílení nervového růstu v CNS, zlepšení paměti, zvýšení synaptické výkonnosti v CNS, a způsob testování schopnosti látky modulovat aktivitu nervové adhezní molekuly

Oblast techniky

Předložený vynález se všeobecně týká modulace růstu neuronů (nervových buňek) v centrální nervové soustavě a zvláště způsobů a doprovodných látek, konstruktů a prostředků přispívajících ke zlepšení růstu neuronů v centrální nervové soustavě. Předložený vynález se zvláště týká používání buňěčných adhezních molekul a především nervových adhezních molekul jako je LI za účelem podpory a zlepšení takovéhoto růstu neuronů.

Dosavadní stav techniky

Schopnost neuronů prodlužovat neurity je velmi důležitá pro tvorbu nervových spojení během vývoje nervové soustavy. Tato schopnost je také potřebná k tvorbě nových spojení během regenerace, pokud byla tato poškozena v důsledku poranění.

Neurity se prodlužují zvláště během vývoje centrální a periferní nervové soustavy všech druhů vyšších organizmů (Cajal (1928) Degeneration and regeneration in nervous systém, Oxford University Press, London). Tato vlastnost přísluší axonům a dendritům. Avšak u dospělých organizmů je obnovený růst axonů a dendritů v centrální nervové soustavě zastaven.

V periferní nervové soustavě jsou axony všech obratlovců schopny po způsobeném poranění opět růst (Cajal (1928); Martini (1994) J. Neurocytol. 23:.1-28). Avšak u savců je obnovený růst neuritů po poranění omezen pouze na neuritové výběžky. Obnovený růst v nervovéch procesech je všek možný u nižších druhů obratlovců (Stuermer et al. (1992) J. Neurobiol. 23:537-550). Naopak v centrální nervové soustavě má potenciál pro obnovený růst neuritů většina ne-li všechny neurony dospělých vyšších i nižších obratlovců (Aguayo (1995) Axonal regeneration from injured neurons in the adult mammalian centrál nervous systém. In:Synaptic Plasticity (Cotman, C. Wed.,) New York, The Guilford Press, pp.457-484).

Gliové buňky jsou rozhodující determinanty kontrolující obnovený růst , axonů. Savčí gliové buňky všeobecně umožňují růst neuritů v centrální nervové soustavě během vývoje (Silver et al. (1982) J. Comp. Neurol. 210:1029; Miller et al. (1985) Develop. Biol. 111:35-41; Pollerberg et al. (1985) J. Cell. Biol. 101:1921-1929) a v periferní nervové soustavě dospělých jedinců (Fawcett et al. (1990) Annu. Rev. Neurosci. 13:43-60). Gliové buňky dospělé savčí periferní nervové soustavy mohou po způsobeném poranění revertovat do určitého rozsahu na jejich dřívější růstový potenciál, což jim umožňuje podporovat regeneraci (Kalderon (1988) J. Neurosci. Res. 21:501-512; Kliot et. al. Induced regeneration of dorsal root fibres into the adult mammalian spinal cord, In: Current Issues in Neural Regeneration, New York, pp. 311328; Calstedt et. al. (1989) Brain Res. Bull. 22:93-102). Gliové buňky centrální nervové soustavy některých nižších obratlovců zůstávají permisivní ·· ···· · · · · · · · • · · · · · · · · · ·

Χ· ' ··· · · · · ··· · · · ···· · ······ · · · ···· · · · · · · · ·· · · na růst neuritů v dospělosti (Stuermer et al. (1992) J. Neurobiol. 23:537-550). Naopak gliové buňky centrální nervové soustavy dospělých savců nejsou scopny podporovat obnovení růstu neuritů po poranění.

Několik rozpoznávacích molekul, které vydávají pokyn k podpoře nebo zastavení růstu neuritů bylo identifikováno (Martini (1996). Mezi rozpoznávacími molekulami podporujícími růst neuritů hraje prominentní roli nervová buňečná adhezní molekula LI (Schachner (1990) Seminars in the Neurosciences 2:497-507). Růst neuritů závislý na molekule LI je zprostředkován homofilní interakcí. LI sesiluje růst neuritů na neuritech a Schwannových buňkách, které exprimují LI, a na fibroblastech transfekovaných molekulou LI (Bixby et al. (1982) Proč. Nati. Acad. Sci. U.

S. A 84:2555-2559; Chang et al. (1987) J. Cell Biol. 104:355-362; Lagenaur et al. (1987) Proč. Nati. Acad. Sci. U. S. A 84:7753-7757; Seiheimer et al. (1988) J. Cell Biol. 107:341-351; Kadmon et al. (1990a) J. Cell Biol. 110:193-208; Williams et al. (1992) J. Cell Biol. 119:883-892). Exprese LI je značně zesílema u dospělých myší po přerušení periferních nervů (Nieke et al. (1985) Differentiation 30:141-151; Martini et al. (1994a) Glia 10:70-74). Během dvou dnů se LI nahromadí v místech kontaktu mezi neurony a Schwanovými buňkami, kde jsou koncentrovány hlavně na buňěčném povrchu Schwanových buňek, ale nikoliv neuronů (Martini et. al. (1994a)). Schopnost homofilické vazby molekuly LI je dále zesílena molekulární asociací s nervovou buňečnou adhezní molekulou N-CAM (Kadmon et al. (1990a); Kadmon et al. (1990b) J. Cell Biol. 110:209-218 a 110:193:208; Horstkorte et al. (1993) J. Cell Biol. 121:1409-1421). Vedle svých vlastností, které podporují růst neuritů se LI účastní také buňečné adheze (Rathjen et al. (1984) EMBO J. 3:1-10; Kadmon et al. (1990b) J. Cell Biol. 110:209-218; Appel et al. (1993) J. Neurosci. 13:4764-4775), dále migrace granulových buňek (Lindner et al. (1983) Nátuře 305:427-430) a také myelinace axonů (Wood et al. (1990) J. Neurosci. 10:3635-3645).

LI obsahuje šest imunoglobulinových domén a pět homologních opakování podobných fibronektinu typu III. LI působí jako signální převodník, přičemž je proces rozpoznání prvním krokem v komplexní sérii událostí vedoucích ke změnám v ustálené úrovni intracelulárních poslů. Tyto posly zahrnují inositol fosfáty, Ca²⁺, pH a cyklické nukleotidy. (Schuch et al. (1990) Neuron 3:13-20; von Bohlen a Hallbach et al. (1992) Eur. J. Neurosci. 4:896-909; Doherty et al. (1990) Curr. Opin. Neurobiol. 2:595-601) stejně jako změny v aktivitách protein kináz jako jsou protein kináza C a pp60^c'^src . (Schuch et al. (1990) Neuron 3:13-20; Atashi et al. (1992) Neuron 8:831842). LI je také asociována s kasein kinázou typu II a jinými neidentifikovanými kinázami, které LI fosforzlují (Sadoul et al. (1989) J. Neurochem. 328:251-254). Růst neuritů zprostředkovaný molekulou LI je citlivý na blokování kanálů Ca²⁺ typu L a na toxinu černého kašle (pertussis). Tyto nálezy ukazují na důležitost kanálů Ca²⁺ a proteinů G při růstu neuritů zprostředkovaném molekulou LI (Williams et al. (1992) J. Cell. Biol. 119:883-892). Molekula LI je také přítomna na proliferujících, nezralých astrocytech v kultůře neuritový růst je na těchto buňkách podporován daleko lépe než na nediferencovaných, LI imunonegativních, astrocytech (Saad et al. (1991) J. Cell. Biol. 115:473-484). Avšak v podmínkách in vivo bylo zjištěno, že astrocyty exprimují LI za jakéhokoliv vývojového stavu počínaje 13. dnem

······ ·· * ·· ·· · ···· · _o · · · · · · > ···· ···· • · · · · · • · · · ·· · · · ·· ·· embryonálního vývoje až do dospělosti (Bartsch et al. (1989) J. Comp. Neurol. 284:451-462; a nepublikované údaje).

Jestliže má LI kapacitu podporovat růst neuritů, je příslušné zjistit, zda exprese LI a jiných členů imunoglobulinové rodiny v astrocytech může obejít potenciální inhibični molekulární cesty, které se uvádějí, že jsou přítomné na gliových buňkách a myelinu v dospělé centrální nervové soustavě Schachner et al., Perspectives in Developm. Neurobiol. in Press: Schwab et al. (1993) ann. Rev. Neurosci. 16:565-595). Toto má zvláštní význam k vývoji účinných strategií sloužících k léčbě slabosti způsobené porušením nebo poraněním nervových tkání CNS a týká se to podstaty tohoto vynálezu.

Podstata vynálezu

V souladu s předloženým vynálezem je popsána látka a příslušné způsoby vedoucí k modulaci nervového růstu a zvláště k takovému růstu, který může být podporovám v centrální nervové soustavě (CNS) a zvláště pak v myelinované nervové tkáni. Látky, které jsou předmětem předloženého vynálezu, jsou význačné ve své schopnosti podporovat takový nervové růst v prostředí, na které bylo tradičně nahlíženo jako na inhibující známé růstové faktory. Toto inhibující prostředí zvláště zahrnuje ty inhibični molekuly, které jsou přítomny na gliových buňkách a myelinu centrální nervové soustavy.

Látky, které jsou předmětem předloženého vynálezu, patří do skupiny nervových buňěčných adhezních molekul. Látky, které jsou předmětem předloženého vynálezu, jsou vybrány ze skupiny molekul patřících do imunoglobulinové rodiny, zvláště pak těch členů, kteří zprostředkovávají nervové buňečnou adhezi nezávislou na Ca²⁺. Do této skupiny patří LI, NCAM a glykoprotein asociovaný s myelinem. Jiné buňěčné adhezní molekuly, které mohou také ovlivňovat nervový růst v CNS jsou laminin, fibronectin, Ncadhedrin, BSP-2 (myší N-CAM), D-2, 224-1A6-A1, Ll-CAM, NILE, NrCAM, TAG-1 (axonin), Ng-CAM a F3/F11.

Látky, které jsou předmětem předloženého vynálezu, patří do nové rodiny uváděné zde jako rodina LI nervových rekogničních molekul. Tato rodina zahrnuje LI, NgCAM, neurofascin, neuroglian z Drosophily, Ll.l a LI.2 ze zebřičky a jiné molekuly. Tato skupina látek obsahuje domény podobné imunoglobulinu a opakování podobné fibronektinu, které jsou charakteristické u LI a v této souvislosti vykazují pozoruhodnou kolinearitu, vysoký stupeň N-glykosidicky spojených karbohydrátů, které zahrnují karbohydrátovou strukturu HNK-1, a vykazují vzor proteinových fragmentů obsahujících hlavní pruh 185 kD a menší pruhyl65 a 125 kD.

Látky, které jsou předmětem předloženého vynálezu, také zahrnují fragmenty buňěčných adhezních molekul a jejich napodobeniny, které modulují růst neuritů v CNS. Tyto látky zahrnují zvláště molekuly, které obsahují strukturní motivy charakteristické pro extracelulární matrix, zvláště opakování podobná fibronektinu typu III a doménám podobným imunoglobulinu. Tyto strukturní motivy zahrnují především ty, které jsou strukturně podobné opakováním 1 až 2 u fibronektinu typu III a doménám podobným imunoglobulinu I až II, III až IV a V až VI.

Předložený vynález se týká způsobů podporujících a zesilujících nervové regeneraci in vivo a příslušných genetických konstruktů, jako jsou ·· ···· ·· · · · · · ·· · ···· ···· ······ ··· ···· ·· · · ··· ·· · · plazmidy, vektory, transgeny, apod., a také farmaceutických prostředků, které mohou být použity k zvládnutí podstaty těchto způsobů. Látky, které jsou předmětem předloženého vynálezu, mohou být připraveny zejména jako vektory nebo plazmidy a vneseny do nervových buňek centrální nervové soustavy, tedy tam, kde je regenerace potřebná, např. technikami genové terapie tak, aby došlo k expresi látky, která je předmětem předloženého vynálezu, a aby tak došlo k podpoře požadovaného nervového růstu. Jiná strategie má v úmyslu formulaci jedné nebo více vhodných látek v prostředku, který může být podobně přímo dopraven do místa CNS, jako je parenterální podání. Podání takového prostředku může sloužit za účelem inhibice spíše než podpory nervového růstu vlivem homofilické vazby. Tento efekt může být potřebný ve zvláštních případech, kde se může objevit nebo se už objevuje nežádoucí nebo nekontrolovaný růst, čehož se rozšířeně týká tento vynález.

Ve shodě s tím schopnost látek podílet se na homofilické bazbě činí antagonisty k těmto látkám, včetně protilátek, schopné působit jako aktivátory a tím participovat na podpoře nervového růstu a regeneraci. Tento vynález se tak rozšířeně týká i přípravy vhodných konstruktů a přípravků obsahujících protilátky k těmto látkám za účelem terapeutického použití. Protilátky k LI mohou také, např., napomáhat zčásti ke zkouškám vedoucím k objevu těchto látek nebo k identifikaci dalších látek, které mohou mít aktivitu a využití jak v diagnostice, tak v terapii, ve shodě s předloženým vynálezem. Zvláště, jak je popsáno níže s odkazem na izolaci a charakterizaci CHL1, což je analog LI, protilátky jako polyklonální protilátky, mohou být použity k identifikaci dalších členů rodiny LI CAM molekul. Předložený vynález se tedy rozšířeně týká i takovýchto členů CAM, které jsou izolovány použitím těchto protilátek. Tento vynález také zahrnuje diagnostické aplikace, kde je například potřebné určit potenciál pro nervové růst nebo aktuální vývoj tohoto růstu v CNS pomocí detekce a měření přítomnosti, množství a aktivity jedné nebo více látek, které jsou předmětem předloženého výnálezu. Podobně, a jak je popsáno níže, tento vynález se týká zkoušek, včetně zkoušek vedoucím k objevu těchto látek, které aktivují látky, které jsou předmětem předloženého vynálezu. Např., nějaké látky mohou být testovány na modulaci pomocí zkoušky obsahující látku, která je předmětem předloženého vynálezu, nebo buněčnou linii nebo kulturu vyvinutou ve spojení s ní.

Krátce popsáno, předložený vynález také zahrnuje transgenní myší linie exprimující nervovou adhezní molekulu v diferencovaných astrocytech a gliových buňkách a v buňkách a tkáních z nich odvozených. Toto se týká zvláště nervové adhezní molekuly LI. Astrogliální exprese LI zesiluje růst neuritů v tkáni centrální nervové soustavy odvozené z těchto transgenních myší.

Také, jak je popsáno, tento vynález zahrnuje způsoby vedoucí k zesílení růstu neuronů CNS, k zlepšení paměti a ke zvýšení synaptické výkonnosti, jak je to měřeno pomocí stabilizace dlouhodobé potenciace a jinými podobně užitečnými metodami. Zahrnuty jsou také způsoby testování látek a jiné manipulace, které upravují působení této nervové adhezní molekuly.

Ve shodě s tím je hlavní podstatou tohoto vynálezu poskytnout transgenní savčí organizmus, jehož gliové buňky exprimují exogenní nervové adhezní molekuly.

Další podstatou tohoto vynálezu je poskytnout buňečnou kulturu obsahující gliové buňky transgenního savčího organizmu.

Další podstatou tohoto vynálezu je poskytnout systém buněčné kultury obsahující poškozené nebo nepoškozené optické neurony nebo jiné části nervového systému transgenního savčího organizmu.

Ještě další podstatou tohoto vynálezu je poskytnout způsob, jak zesílit nervové růst neuronů CNS, který zahrnuje pěstování těchto neuronů na systému kultury gliových buňek.

Další podstatou tohoto vynálezu je poskytnout způsob, jak zesílit růst neuronů CNS, který zahrnuje pěstování těchto neuronů na optických neuronech nebo jiných částech nervového systému umístěném v systému buňečné kultury.

Ještě další podstatou tohoto vynálezu je poskytnout způsob, jak zesílit růst neuronů CNS, který zahrnuje sekreci nervové adhezní molekuly implantovanou buňkou.

Další podstatou tohoto vynálezu je poskytnout způsob, jak zlepšit paměť, což zahrnuje aplikaci množství buňek optického nervu nebo jiných částí nervového systému umístěných v systému buňečné kultury do mozku savce za účelem zlepšení paměti.

Další podstatou tohoto vynálezu je poskytnout způsob, jak zlepšit paměť, zahrnující dopravení vektoru, který umožňuje expresi nervové adhezní molekuly v gliových buňkách, ke gliovým buňkám mozku savce, který má potřebu takového zlepšení paměti.

Další podstatou tohoto vynálezu je poskytnout způsob, jak zlepšit paměť, což zahrnuje zahrnuje sekreci nervové adhezní molekuly implantovanou buňkou.

Další podstatou tohoto vynálezu je poskytnout způsob, jak zlepšit synaptíckou účinnost v CNS savce, který má tuto potřebu, zahrnující podávání množství buňek systému gliové buňečné kultury do mozku savce.

Další podstatou tohoto vynálezu je poskytnout způsob, jak zlepšit synaptíckou výkonnost v CNS savce, který má tuto potřebu, zahrnující podávání množství buňek optického nervu nebo jiných částí nervového systému umístěných v systému buňečné kultury do mozku savce.

Další podstatou tohoto vynálezu je poskytnout způsob, jak zlepšit synaptíckou účinnost v CNS savce, který má tuto potřebu, což zahrnuje dopravení vektoru, který umožňuje expresi nervové adhezní molekuly v gliových buňkách, do gliových buňek mozku savce.

Další podstatou tohoto vynálezu je poskytnout způsob, jak zlepšit synaptíckou výkonnost, což zahrnuje zahrnuje sekreci nervové adhezní molekuly implantovanou buňkou.

Další podstatou tohoto vynálezu je poskytnout způsob testování schopnosti látky nebo jiné entity modulovat aktivitu nervové adhezní molekuly, což zahrnuje přidání neuronů CNS do systému gliové buňečné kultury; přidání testované látky do systému buňečné kultury; měření neuronálního růstu neuronů CNS; korelování rozdílu v úrovni neuronálního růstu buňek v přítomnosti této látky vůči kontrolní kultuře, do níž nebyla žádná látka přidána.

Další podstatou tohoto vynálezu je poskytnout způsob testování schopnosti látky nebo jiné entity modulovat aktivitu nervové adhezní molekuly, což zahrnuje přidání neuronů CNS do optického nervu nebo jiných částí nervového systému buňečné kultury; přidání testované látky do systému buňečné kultury měření neuronálního růstu neuronů CNS; korelování rozdílu • · · ·

• · · v úrovni neuronálního růstu buňek v přítomnosti této látky vůči kontrolní kultuře, do níž nebyla žádná látka přidána.

Další podstatou tohoto vynálezu je poskytnout testovací systém na zkoušení látek na jejich schopnost modulovat produkci nervové adhezní molekuly, což zahrnuje systém gliové buňečné kultury a neuronů CNS přidaných do tohoto systému.

Další podstatou tohoto vynálezu je poskytnout testovací systém na zkoušení látek na jejich schopnost modulovat produkci nervové adhezní molekuly, což zahrnuje pěstování systému gliové buňečné kultury zaočkované těmito látkami; přidání neuronů CNS do systému buňečné kultury; a sledováné.neuronálního růstu a účelem stanovení vlivu látky.

Další podstatou tohoto vynálezu je poskytnout testovací systém na zkoušení látek na jejich schopnost modulovat produkci nervové adhezní molekuly, což zahrnuje pěstování optického nervu nebo jiných částí nervového systému umístěnho v systému buňečné kultury zaočkované těmito látkami; přidání neuronů CNS do systému buňečné kultury; a sledováné neuronálního růstu a účelem stanovení vlivu látky.

Další podstatou tohoto vynálezu je poskytnout testovací systém na zkoušení látek na jejich schopnost modulovat produkci nervové adhezní molekuly, což zahrnuje zaočkování kultury neuronů CNS těmito látkami; přidání rozpustné nervové adhezní molekuly; a sledování neuronálního růstu a účelem stanovení vlivu látky.

Jiné podstaty a výhody se stanou zjevnými odborníkům v oboru z přehledu následného podrobného popisu uvedeného s odkazem na obrázky.

Přehled obrázků na výkrese

Obr. 1 ukazuje mapu chimérického transgenu GFAP-L1. Myší cDNA LI dlouhá 4,05 kb byla vnesena do exonu 1 upraveného genu GFAP pomocí linkerů Notl. V tomto konstruktu je před cDNA LI místo sestřihu pozdního genu SV40 (V) a za cDNA LI je polyadenylační signální místo (pA) SV40. Umístění kodonu ATG od LI a polyadenylační signál jsou znázorněny. Exony jsou znázorněny jako obdélníky.

Obr. 2 ukazuje analýzu Nothern blot RNA z mozku pocházející z různých transgenních linii. 10 ug celkové RNA z celého dospělého mozku bylo naneseno do každé dráhy a bylo próbováno myší cDNA LI. Doba expozice byla 3 dny. Dráhy 1 až 3, mozky od různých transgenních mláďat (dráha l:línie 3426; dráha 2: linie 3427; dráha 3: linie 3418; dráha 4: mozek z netransgenní kontroly). Je vidět, že hladina transgenní mRNA LI (šipka) je různá u tří transgenních linii, přičemž nejvyšší je u linie 3426, střední u linie 3427 a nejnižší u linie 3418. Pozice rRNA 28S a 18S je ukázána na pravém okraji.

Obr. 3 ukazuje umístění mRNA LI v dospělých nepoškozených (A, C a E) a poškozených (15 dní po poškození, B a D) optických nervech z netransgenní (A, B a E) a transgenní myši (C a D) z linie 3426 metodou hybridizace in šitu. U zvířat divokého typuje mRNA LI detekovatelná pouze v neuronálních buňkách sítnice, ale ne v gliových buňkách optického nervu (A a B). U transgenních zvířat jsou viditelné buňky obsahující transkripty LI v optickém nervu (C a D). Hustota buňek pozitivních na LI je nejvyšší v nemyelinové bližší části nervu. Hustota buňek pozitivních na LI v nervu je • · · · ······ · · · • · · · · ··· ·· ·· mírně zvýšena po poškození (porovnejte C a D). Rozmístění buňek exprimujících LI (C a D) je v optickém nervu podobné jako u buňek exprimujících GFAP (E). Měřítko u E je 100 um (pro A až E).

Obr. 4 ukazuje dvojitou imunofluorescenční mikroskopickou lokalizaci LI (A a B) a GFAP (C) nepoškozených (A a C) a poškozených (28 dní po poškození, B) optických nervů z dospělých transgenních (linie 3426, A a B) a zvířat divokého typu (C). Imunoreaktivita LI v optických nervech transgenních zvířat je podstatně zvýšená po poškození (porovnejte A a B). Vzor imunoreaktivity LI uv poškozených transgenních nervech je podobná vzoru imunobarvení GFAP v nepoškozených nervech divokého typu. Gandlionové axony nemyelinovaných sítnicových buňek pozitivních na LI jsou přítomné v nepoškozeném nervu divokého typu (A). Měřítko u C je 50 um (pro A až C).

Obr. 5 ukazuje dvojitou imunofluorescenční mikroskopickou lokalizaci LI (A a D) a GFAP (B a E) v pěstovaných astrocytech z transgenních zvířat linie 3426 (A, B a C) a zvířat divokého typu (D, E a F). Je vidět, že pouze buňky z transgenních zvířat exprimují LI, kdežto astrocyty ze zvířat divokého typu jsou negativní na LI. Měřítko u F je 30 um (pro A až F).

Obr. 6 ukazuje (A) analýzu Western blot poškozených (15 dní po poškození) a nepoškozených optických nervů z transgenních zvířat a zvířat divokého typu. 25 ug celkového proteinu poškozených (dráhy 1, 3 a 5) nebo nepoškozených nervů (dráhy 2, 4 a 6) bylo naneseno a detekováno pomocí polyklonálních protilátek afinitně purifikovaných proti LI. Proteinové extrakty byly připraveny z myší transgenní linie 3426 (dráhy 1 a 2), 3427 (dráhy 3 a 4) a ze zvířat divokého typu (dráhy 5 a 6). Je vidět zvýšení v expresi LI u transgenních zvířat ve srovnání s netransgenními kontrolami. Po poškození optického nervu se zvýšení množství LI objevilo u transgenních zvířat , kdežto množství LI u zvířat divokého typu kleslo. Molekulové hmotnosti ( v kD) jsou vyznačeny na levém okraji.

Obr 7. ukazuje příklady růstu neuritů z myších cerebelárních neuronů pěstovaných na kryostatových sekcích optických nervů divokého typu (A a B) a transgenních (C a D) zvířat (linie 3426). A a C předtavují nepoškozené optické nervy, B a D reprezentují poškozené optické nervy. Měřítko u D je 50 um (pro A až D).

Obr. 8 ukazuje a porovnává délky neuritů cerebelárních neuronů udržovaných na kryostatových sekcích nepoškozených (c) a poškozených (1) optických nervů (28 dní po poškození) ze zvířat divokého typu (WT) a transgenních zvířat (linie 3426, 3427 a 3418). Je vidět, že délka neuritů na sekcích z transgenních zvířat je větší než na sekcích ze zvířat divokého typu. V neuritech transgenních linii jsou vždy delší na poškozených než na nepoškozených nervach, kdežto délky neuritů na nepoškozených nebo poškozených nervech zvířat divokého typu nevykazují významný rozdíl. Je vidět, že délka neuritů koreluje pozitivně s hladinou exprese LI u různých transgenních linii (viz také údaje z analýzy Western blot). Střední hodnota +standartní odchylka průměru od jednoho reprezentativního pokusu (z 12) je znázorněna.

Obr. 9 je graf znázorňující délky neuritů cerebelárních neuronů udržovaných na kryostatových sekcích nepoškozených (c) a poškozených (1) optických nervů (28 dní po poškození) ze zvířat divokého typu (WT) a transgenních zvířat bez preinkubace a po preinkubaci sekcí s afinitně • · · · • ·

Q · · · · · o· · « · · · · • · · · · · ···· ·· · · ··· purifikovanými polyklonálními protilátkami proti LI (anti LI) a proti myším jaterním membránám (anti játra). Neuritové délky na neuronech bez preinkubace s jakýmikoliv protilátkami byly vzaty jako 100% a neuritové délky na sekcích těch samých neuronů získaných po působení protilátky byly vyjádřeny v poměru k této hodnotě. Významné snížení (60%) délky neuritů působením protilátek proti LI bylo zjištěno na kryostatových sekcích z transgenních zvířat. Čísla nahoře představují celkový počet neuronů měřených pro každou hodnotu. Střední hodnoty +- standartní odchylka jsou z nejméně čtyř nezávislých experimentů provedených ve dvojici.

Obr. 10 ukazuje a porovnává neuritové délky myších cerebelárních (A) a kuřecích DRG (B) neuronů na povrchu astrocytů připravených ze zvířat divokého typu (WT) a tansgenních zvířat (linie 3426) v nepřítomnosti protilátek a po preinkubaci sekcí s afinitně purifikovanými polyklonálními protilátkami proti LI (anti LI) a proti myším jaterním membránám (anti játra). Neuritové délky na astrocytech bez preinkubace s jakýmikoliv protilátkami byly vzaty jako 100% a neuritové délky na povrchu astrocytů získaných po působení protilátky byly vyjádřeny v poměru k této hodnotě. Významné snížení (přibližně 40%) délky neuritů je vidět pouze na transgenních astrocytech po preinkubaci povrchů s protilátkami proti LI. ). Střední hodnota +- standartní odchylka jsou vzaty z nejméně 100 neuronů ze dvou nezávislých experimentů provedených ve čtveřici. * uvádí střední hodnoty, které se podstatně lišily (p < 0,05, Mann-Whitney U test) z kontroly (astrocyty divokého typu nebo transgenní bez působení protilátek).

Obr. 11 demonstruje obnovený růst axonů in vivo v optickém nervu (0 až 2000 um). 6 až 8 týdnů staré transgenní myši GFAP-L1 a myši divokého typu byly poraněny a po 14 dnech sledovány na biotinový ester značený fluoresceinem za účelem označení ganglionových axonů anterostupňovým značením. Každý bod reprezentuje jedno zvíře.

Obr. 12 ukazuje obnovený růst axonů in vivo v optickém nervu (0 až 800 um). 6 až 8 týdnů staré transgenní myši GFAP-L1 a myši divokého typu byly poraněny a po 14 dnech sledovány na biotinový ester značený fluoresceinem za účelem označení ganglionových axonů anterostupňovým značením. Každý bod reprezentuje jedno zvíře.

Obr. 13 ukazuje vliv injikování kuřecích protilátek proti LI do IMHV na vyhýbacím testu (ztráta paměti) v jednozkouškovém pasivním vyhýbacím cvičení. Každý bod reprezentuje skupinu ptáků, kteří dostali injekce protilátek proti LI (anti-Ll) (uzavřené kruhy) nebo fyziologického roztoku (otevřené čtverce) v čase vztaženém na uvedené cvičení. Všechna zvířata byla testována 24 hodin po cvičení (*, p < 0,05 mezi fyziologickým roztokem a skupinou protilátek, ksí²).

Obr. 14 porovnává dva grafy ukazující vliv injekcí Ig I až IV a fragmentů FN v čase -30 min. a +5,5 hod. na udržení paměti při pasivním vyhýbacím cvičení. Všechna zvířata byla testována 24 hodin po cvičení. Počet zvířat v každé skupině je znázorněn na histogramech (*, p < 0,05, **, p < 0,005).

Obr. 15 porovnává sérii grafů ukazujících vliv protilátek proti LI (anti

LI) na LTP v pyramidálních neuronech v oblasti CA1 krysích hypokampálních řezů, a, Průměrné (n=4) EPSP zaznamenané před a 50 min.

po (šipka) TBS v kontrolním místě, které nebylo injikováno protilátkou, b)

Průměrné (n=4) EPSP zaznamenané před a 50 min. po TBS (šipka) v přítomnosti králičích polyklonálních protilátek proti LI (Rathjen et al. (1984)). c) Časový sled EPSP počátečního sklonu před a po TBS v přítomnosti protilátek proti LI (frakce IgG, koncentrace 6,2 mg/ml) nebo polyklonálních protilátek proti imunoglobulinovým doménám I až IV rekombinantně exprimovaným v buňkách CHO (Hyneš (1992) Cell 369:11-25) (antiserum obsahující přibližně lmg/ml specifických protilátek) a následujících kontrol: (1) Kontrola LTP (žádné protilátky), (2) v přítomnosti frakce IgG polyklonálních protilátek proti myším jaterním membránám (3,5 mg/ml), které silně reagují s krysími hypokampálními řezy (Lindner et al. (1983) Nátuře 305:427-430), (3) v přítomnosti králičího neimunního séra a (4) v přítomnosti protilátek proti LI bez induce LTP s TBS (6,2 mg/ml; viz také e,f). Výsledky jsou vyjádřeny jako střední hodnoty +- S.E.M z procent počátečního sklonu EPSP ze základní hodnoty zaznamenané během 20 min. před TBS (n=5) z řezů z nejméně 3 zvířat; hodnoty LTP v přítomnosti protilátek proti LI se liší od kontrol LTP v p < 0,001 pro protilátky proti LI a v p < 0,01 pro protilátky proti imunoglobulinovým doménám I až IV. d) Koncentrační závislost poklesu v LTP působením frakce IgG polyklonálních protilátek proti LI (koncentrace 6,2 mg/ml); 2 mg/ml; 0,6 mg/ml; 0,06 mg/ml; p<0, 0001). Jako kontrola jsou ukázány výsledky z polyklonálních protilátek proti jaterním membránám (3,5 mg/ml). e) Průměrné (n=4) EPSP zaznamenané před a 60 min. po (šipka) podání polyklonálních protilátek proti LI bez přítomnosti TBS. f) Průměrné (n=4) intracelulárni excitační postsynaptické proudy (EPSP) zaznamenané před a 30 min. po (šipka) podání polyklonálních protilátek proti LI bez přítomnosti TBS.

Obr. 16 demonstruje vliv imunoglobulinových domén I až IV, polyklonálních protilátek proti NCAM a oligomannosidových glykopeptidů na LTP. a) časový sled počátečního sklonu EPSP před a po TBS v přítomnosti imunoglobulinových domén I až IV (216 ug/ml; 3,2 mM; ve 20 mM Tris/HCl pH7 ,6; p < 0,01) a fibronektinových (FN) homologních opakováních I až V (225 ug/ml; 3,8 mM; ; ve 20 mM Tris/HCl pH 7,6) od LI v porovnání s kontrolní LTP (20 mM Tris/HCl pH 7,6). b) časový sled počátečního sklonu EPSP před a po TBS v přítomnosti protilátek proti NCAM (frakce IgG, 3,9 mg/ml), antiséra proti axoninu-1, a následující kontroly: (1) neimunní králičí sérum, (2) frakce IgG neimunního králičího séra (3,0 mg/ml) a (3) v přítomnosti protilátek proti NCAM (3,9 mg/ml, p < 0,06) bez indukce LTP s TBS. c) časový sled počátečního sklonu EPSP před a po TBS v přítomnosti oligomannosidových glykopeptidů, kontrolních glykopeptidů odvozených z asialofetuinu (přibližně 100 uM) a bez přítomnosti glykopeptidů. Výsledky jsou vyjádřeny jako střední hodnoty +- S.E.M z procent počátečního sklonu EPSP ze základní hodnoty zaznamenané během 20 min. před TBS (n=5 nebo 6 z řezů z nejméně 3 zvířat).

Obr. 17 graficky ukazuje vliv protilátek proti LI a oligomannosidových karbohydrátů na předešle stanovenou LTP a na synaptickou transmisi zprostředkovanou receptory NMDA. a) časový sled počátečního sklonu EPSP před a po TBS v přítomnosti protilátek proti LI aplikovaných jak během pokusu (6,2 mg/ml), tak po 10 min. od TBS (6,2 mg/ml). b) časový sled počátečního sklonu EPSP před a po TBS v přítomnosti oligomannosidových karbohydrátů aplikovaných jak během pokusu (100 uM), tak po 20 min. od TBS (100 uM). c) Průměrný (n=4) EPSP receptoru NMDA zaznamenaný v přítomnosti CNQX (30 uM) před a po 30 min. (šipka) aplikaci protilátek proti • · · · ·· ·· · ·· • · · « · · · · · · ·

1β· · ·· · ····

AM ··· · · · ···· ·

LI. d) Průměrný (n=4) EPSP receptorů NMDA zaznamenaný v přítomnosti CNQX (10 uM) před a po (šipka) 60 min. aplikaci oligomannosidových karbohydrátů. Výsledky v a) a b) jsou vyjádřeny jako střední hodnoty +S.E.M z procent počátečního sklonu EPSP ze základní hodnoty zaznamenané během 20 min. před TBS (n=5 z řezů z nejméně 3 zvířat).

Obr. 18 ukazuje nukleotidovou sekvenci 4,43 kb dlouhého insertu cDNA v klonu pX#2 a odvozenou aminokyselinovou sekvenci myší CHL1. Nejdelší otevřený čtecí rámec (bp 296 až bp 3922) obsahuje 1209 aminokyselin a je zakončen terminačním kodonem TGA. Dvě hydrofóbní oblasti představují signální peptid (aminokyseliny 1 až 24) a transmembránovou oblast (1082 až 1104) jsou podtrženy. Dvě šipky ukazují 5' a 3' konce klonu 311 izolovaného z knihovny lambda gtll. Potenciální místa pro glykosidaci na asparaginu (Hubbart a Ivatt, 1981) jsou označena pod aminokyselinovou sekvencí plnými znaky diamantu. Imunoglobulinové domény jsou číslovány římskými číslovkami od I do VI pod konzervovaným tryptofanem. Charakteristické cysteiny jsou označeny kroužkem. Opakování podobná FN jsou číslována FI až F5 a charakteristické tryptofany (chybějící v Fl, F2: W 732, F3: W 830, F4: W 936, F5: W1053) a tyrosiny/fenylalaniny (Fl: Y 682, F2: Y 781, F3: F 888, F4: Y989, chybí u F5) jsou zarámovány. Závorka zvýrazňuje sekvence RGD a DGEA (aminokyselinové zbytky 185 až 187 a 555 až 558). Netranslatované sekvence jsou označeny čísly kurzívou. Sekvenční údaje jsou dostupné z EMBL/Genebank/DDBJ pod číslem X94310.

Obr. 19 ukazuje doménovou strukturu, kódující oblast bakteriálně exprimovaného proteinového fragmentu a graf hydrofobicity myší CHL1. (a) diagram znázorňuje strukturální rysy odvozené z primární sekvence CHL1. Čísla uvádějí aminokyselinovou sekvenci od místa počátku translace. Imunoglobulinové domény I až IV jsou označeny polovičními kroužky (čísla aminokyselin uvádějí cysteiny tvořící disulfidové můstky). Opakování podobná FN 1 až 5 jsou symbolizavána orámováním (čísla aminokyselin uvádějí hranice domény). Potenciální místa pro N-glykosidaci jsou označena plnými kroužky. Signální peptid a transmembránová oblast je vyznačena zubatým orámováním, (b) Podtržení vyznačuje pozici cDNA kódující rekombinantní protein produkovaný v E. coli. (c) Graf hydrofobicity (Kyte a Doolittle, 1982) odvozené aminokyselinové sekvence ukazuje charakteristické rysy integrálního membránového proteinu s putativní fidrofóbní signální sekvencí a transmembránovou doménou (*). Pozitivní hodnoty označují hydrofobicitu. Číslování v souřadnicích uvádí pozici aminokyseliny.

Obr. 20 ukazuje porovnání intracelulárních domén molekul rodiny LI. Sekvence intracelulárních domén začínajících prvním aminokyselinovým zbytkem po putativních transmembránových oblastech jsou srovnány pro myší CHL1, myší LI, kuřecí Nr-CAM, kuřecí Ng-CAM, kuřecí neurofascin, Drosophilí neuroglia a LI.2 ze zebřičky. Čísla uvádějí pozice aminokyselin u CHL1 a šedé orámování vyznačuje mezery provedené do sekvence CHL1. Totožné aminokyseliny, které jsou ve většině sekvencí, jsou vyznačeny černě. Tři závorky (I, II a III) vyznačují vysoce konzervované úseky.

Obr. 21 je analýza Northern blot mRNA CHL1 a LI z různých tkání myši a krysy.

(a) Póly (A) RNA (2ug) z mozku bez cerebella (dráhy 1 až 5), míchy (dráhy 3, 7) a dorzálních kořenových ganglií (dráhy 4, 8) a celkové RNA (10 ug) z cerebella (dráhy 2, 8) z devět dní staré myši byly hybridizovány s • · lf ···· ·· 9 999 9 • · · · · 9 9 99 · · ····· ··· * · · * · · · · • · · » · · · · • · ·· · · · · · · · ribopróbami CHL1 (dráhy 1 až 4) nebo LI (dráhy 5 až 8). Póly (A) RNA (1 ug) z ledvin (dráha 9), slinivky (dráha 10), jater (dráha 11), thymu (dráha 12) a póly (A) RNA (0,5 ug) z střev (dráha 13) a plic (dráha 14) z devět dní staré myši byly hybridizovány s ribopróbou CHL1.

(b) Celková RNA (20 ug) PC12 buňek indukovaných (dráha 1) a neidukovaných (dráha 2) s NGF, buňek COS-1 (dráha 3) a celkové RNA (30 ug) z cerebella devět (dráha 4) a šest (dráha 5) dní starých krys byly hybridizovány s ribopróbou CHL1. Značky RNA jsou uvedeny na levém okraji.

Obr. 22 demonstruje specificitu polyklonálních protilátek proti CHL1 a expresi CHL1 v různých tkáních.

(a) Analýza Northern blot mozku z imunopurifikovaného s LI (dráha 1 (2 ug)), N-CAM (dráha 2 (2 ug)), MAG (dráha 3 (2 ug)) a proteinového fragmentu purifikovaného rekombinantní aniontovou výměnnou chromatografií (dráha 4 (0,1 ug)) pomocí protilátek proti CHL1.

(b) Analýza Northern blot rozpustných (S) a nerozpustných (M) frakcí detergentových lyzátů hrubých membrán z mozku (dráha 1), jater (dráha 2), plic (dráha 3), ledvin (dráha 4) a střev (dráha5) devět dní starých myší. Čísla nalevo (b) uvádějí molekulové hmotnosti imunoreaktivních proužků CHL1 z mozku (dráha 1) a jater (dráha 2). Standarty molekulových hmotností jsou uvedeny na levém a pravém okraji.

Obr. 23 ukazuje detekci CHL1 na tranzientně transfekovaných buňkách COS-1. Povrchvé kultury COS-1 buňek transfekovaných CHL1 (a) a netransfekovaných (c) byly imunobarveny polyklonálními protilátkami proti CHL1. (b, d) odpovídající mikrografie fázového kontrastu pro (a, c). Čárka v d = 30 pro a až d.

Obr. 24 ukazuje lokalizaci mRNA CHL1 a LI v sekcích myší sítnice, optického nervu a cerebelárního kortexu pomocí hybridizační analýzy in šitu. V sítnici 7 dní staré myši je mRNA LI detekovatelná v ganglionových buňkách lokalizovaných v ganglionové buňečné vrstvě (1 v a) a v amakrinových a horizontálních buňkách lokalizovaných ve vnitřní jaderné vrstvě (2 v 1). Jiné buňečné typy v sítnici nebo gliových buňkách v optickém nervu neobsahují detekovatelné hladiny transkriptů LI (a). mRNA CHL1 je po týdnu detekovatelná v ganglionových buňkách a v několika buňkách lokalizovaných na vnitřním okraji ve vnitřní jaderné vrstvě (b). Gliové buňky lokalizované v bližších (t. j. blízko sítnice) oblastech optického nervu jsou silně značeny próbou z antisense cRNA CHL1, kdežto gliové buňky lokalizované ve vzdálenějších oblastech jsou viditelné až po týdnu (b). V cerebelárním kortexu dva dny starých myší jsou transkripty LI detekovatelné ve hvězdicových a košíčkových buňkách v molekulární vrstvě (mol) a v Golgiho a granulových buňkách v interní granulové vrstvě (iGl:d). Transkripty LI jsou rozmístěny v podobném vzoru, s tou jedinou výjimkou, že jakékoliv značení je ztěží viditelné v tenkých částech molekulární vrstvy (b). Sekce hybridizované próbou sense cRNA CHL1 nejsou označeny (pro 7 dní starou sítnici a optický nerv, viz c).

Obr. 25 ilustruje imunofluorescenční mikroskopickou lokalizaci CHL1 v kulturách astrocytů. Dvojité imunoznačení pěstovaných myších astrocytů bylo provedeno s polyklonálními protilátkami proti CHL1 (a, d) a s polyklonálními protilátkami proti GFAP (b, e), (c, f) jsou odpovídající • · · mikrografie fázového kontrastu pro (a,b) a (d, e). Čárka v c a F = 20 um pro a až c a d až f.

Obr. 26 je analýza Western blot deglykossilované CHL1 rozpustných (S) a nerozpustných (M) frakcí detergentových lyzátů hrubých membrán z mozku sedm dní starých myší byly inkubovány s N-glykosidázou F (N), 0glykosidázou (O), oběma enzymy (N+O) nebo bez enzymu (-) a sloučeny s protilátkami proti CHL1 v Western blotu. Standarty molekulové hmotnosti jsou uvedeny v kD na pravém okraji. Molekulové hmotnosti glykosilovaných a deglykosilovaných proteinových komponent CHL1 jsou uvedeny v kD v rámečku níže.

Obr. 27 ukazuje přítomnost karbohydrátu MNK-1 v imunoprecipitátech CHL1 z mozkové tkáně. CHL1 byla imunoprecipitována z detergentových lyzátů z celého mozkové tkáně z devět dní starého myšího mozku pomocí protilátek proti CHL1. Mozkové lyzáty (dráha 1) a imunoprecipitáty (dráhy 2, 3) byly rozděleny na SDS-PAGE, blotovány a inkubovány s monoklonální protilátkou 312 proti epitopů HNK-1 (dráhy 1, 2) nebo protilátkami proti CHL1 (dráha 3). Standarty molekulových hmotností jsou uvedeny v kD na pravém okraji.

Obr. 28: Růst neuritů hipokampálních neuronů ve společné kultuře stransfektanty L929.

Hipokampální neurony odvozené od krys embryonálního dne 18 byly pěstovány v subkonfluentní monovrstvě transfektantů L929 nebo rodičovských buňek L929. Po 11 až 12 hod. společné kultivace byly buňky fixovány a označeny monoklonální protilátkou 412 (rozpoznávající epitop karbohydrátu HNK-+) nebo polyklonální protilátkou proti NCAM. Pro měření délky celého neuritu byl určen pouze nejdelší neurit na každé větvi kvůli velmi rozvětvenému charakteru neuronů v této kultuře.

(A) Růst neuritů je podporován CHL1 a inhibován protilátkami. Neurony byly pěstovány s transfektanty CHL1 (CHL1) nebo buňkami L929 (L929) s (+AB) nebo bez polyklonálních protilátek proti rekombinantní CHL1 (500 ug/ml purifikovaného IgG, přidaného 45 min. po naplátování) a na transfektantech Ll. Průměrná celková délka neuritů z 4 až 5 nezávislých experimentů je uvedena. Odchylky jsou standartní chyby průměru.

(B) Různé linie CHL1 podporují růst neuritů lépe než Ll. Neurony byly pěstovány na dvou různých transfektantech CHL1 (linie CHL1 1, linie CHL1

2) s mírně různými hladinami exprese, na rodičovských buňkách L929 (L929) a na transfektantech Ll (Ll). Celková délka neuritů je podána jako procento buňek L929 z kontroly (ctr). Odchylky jsou standartní chyby průměru.

(C) Podpora délky neuritů ovlivňuje délky všech tříd neuritů. Graf kumulativní frekvenční distribuce celkové délky neuritů hipokampálních neuronů pěstovaných společně s transfektanty CHL1 (linie CHL1 1 a 2) a s rodičovskými buňkami L929 (L929) s (+AB) nebo bez působeni protilátek je podán v (A). Procento neuronů s neurity delšími než nebo stejně dlouhými dané délce x (vertikální osa) byly vyznačeny jako funkce délky neuritů x (horizontální osa). Hodnoty pocházejí z jednoho reprezentativního experimentu.

Obr. 29: Růst neuritů malých cerebelárních neuronů ve společné kultuře s transfektanty L929.

Cerebelární neurony odvozené z 6 až 7 dní starých myší byly pěstovány 20 hod. na transfektantech CHL1 (CHL1), CHL1 transfekovaných • · li* · • · · ···· · · neexprimujících buňkách L929 (slepý vzorek), rodičovských buňkách L929 (L929) a na transfektantech LI (LI). Barvení buňek bylo provedeno, jak již bylo popsáno v obr. 7.

(A) CHL1 podporuje růst neuritů malých cerebelárních neuronů. Je uvedena průměrná celková délka neuritů ze tří experimentů. Odchylky jsou standartní chyby průměru.

(B) CHL1 podporuje také růst neuritů malých cerebelárních neuronů lépe než LI. Celková délka neuritů je podána jako procento buňek L929 z kontroly (ctr). Odchylky jsou standartní chyby průměru.

(C) Zvýšení růstu neuritů cerebelárních neuronů vlivem CHL1 ovlivňuje všechny třídy neuritů. Graf kumulativní frekvenční distribuce celkové délky neuritů procenta neuronů s neurity delšími než nebo stejně dlouhými dané délce x (vertikální osa) byly vyznačeny jako funkce délky neuritů x (horizontální osa). Hodnoty pocházejí z jednoho reprezentativního experimentu.

Obr. 30: Růst neuritů hipokampálních neuronů po působení rozpustné CHL1.

Hipokampální neurony byly pěstovány na miskách potažených poly-Llysinem 12 hod. s přidáním supernatantů (40 ug/ml celkového proteinu) hrubých membránových preparací transfektantů CHL1 (CHL1), rodičovských buňek L929 (L929) nebo transfektantů LI (LI). Barvení a měření délky neuritů bylo provedeno, jak již bylo popsáno (obr. 7).

(A) Rozpustná CHL1 z transfektantů L929 podporuje růst nejlépe . Absolutní délka nejdelšího neuritu a celková délka neuritů jsou uvedeny. Hodnoty jsou průměrem ze tří experimentů. Odchylky jsou standartní chyby průměru.

(B) Rozpustná CHL1 podporuje mírné zvýšení počtu neuritů. Celková délka neuritů v procentech neuritové délky hipokampálních neuronů po působení transfektantů odvozených z rodičovských buňek L929 (ctr) je uvedena. Hodnoty jsou průměrem ze tří experimentů. Odchylky jsou standartní chyby průměru.

(C) Rozpustná CHL1 také ovlivňuje růst neuritů všech tříd neuritů. Grafy kumulativní frekvenční distribuce celkové délky neuritů z jednoho reprezentativního experimentu jsou uvedeny.

Obr. 31: Kvantitativní agregační analýza a stabilita proteinů CHL1 a LI v transfektantech L929 (A) Kvantitativní analýza agregace buňečných transfektantů S2. Za účelem detekování agregace transfektované buňky CHL1 (CHL1) (ctr) a LI (LI) byly pěstovány (v hustotách přibližně 3xl0⁶ buňek/ml) 18 hod. v médiu s (+ind) nebo bez (-ind) indukce transgenové exprese pomocí CuSO4. Počet částic byl spočítán na hemacytometru na začátku a na konci inkubace. Procento agregace bylo vypočítáno pomocí indexu (1-Ν/Ν0)χ100. N18 a NO představují počet částic na konci nebo začátku inkubační periody. Hodnoty jsou průměrem ze čtyř nezávislých experimentů. Odchylky jsou standartní chyby průměru.

(B) Kinetika agregace transfektantů L929. Transfekované CHL1 (CHL1), transfekované CHL1 neexprimující L929 (slepý vzorek), rodičovské L929 (L929) a transfekované LI (LI) buňky byly odmyty z tkáňové kultury působením roztoku trypsin-EDTA o nízké koncentraci, promyty a inkubovány ve 37° C v polystyrénových zkumavkách. Část každého vzorku byla odebrána • · každýc 30 min. počet částic byl spočítán na hemacytometru. Výsledky jsou vyjádřeny, jak je to popsáno v (A). Hodnoty jsou průměrem ze tří nezávislých experimentů. Odchylky jsou standartní chyby průměru.

Detailní popis výhodného provedení vynálezu: Předložený vynález se týká použití určitých látek označovaných zde jako neurální růstové modulátory CNS (CNGM) a zvláště třídy neurálních buňečných adhezních molekul tak, jak jsou zde definovány a jejich schopnosti podporovat růst neuritů v centrální nervové soustavě (CNS). Všeobecně jsou neurony vyvinuté centrální nervové soustavy považovány za neschopné obnoveného růstu, což je způsobeno inhibitorními molekulárními mechanizmy přítomnými na gliových buňkách. Látky a způsoby předloženého vynálezu mohou být použity k překonání této inhibíce a k podpoře růstu neuritů v CNS.

Látky podle tohoto vynálezu zahrnují a mohou být selektovány z jakékoliv buňečné adhezní molekuly, která je schopna modulování a podporování růstu neuritů v CNS a zvláště pak molekul patřících do imuniglobulinové rodiny. Molekuly jsou vybírány především z členů imuniglobulinové rodiny, kteří zprostředkovávají neuronální buňečnou adhezi nezávislou na Ca²⁺, včetně LI, N-CAM a glykoproteinu asociovaného s myelinem. Vynález rovněž zahrnuje fragmenty těchto molekul a analogy a příbuzné molekuly, které mají aktivitu podporující neurity. Zvláště výhodné strukturní motivy pro tyto fragmenty a analoga zahrnují domény podobné k opakováním homologním k fibronektinu typu III (zvláště opakování 1 a 2) a imunoglobulinovým doménám (zvláště doménám I-II, ΠΙ-IV a V-VI). Protože látky podle tohoto vynálezu a zvláště členové rodiny LI a CAM vykazují homofilickou vazbu, jak tyto látky, tak jejich antagonisti a zvláště protilátky k nim, mohou sloužit jako aktivátory s ohledem na receptory pro tyto látky, a mohou tak být využity jak k diagnostickým, tak k terapeutickým aplikacím stejným způsobem a k tomu samému účelu, jako původní látky. LI působí jako receptor a protilátka proti ní může být využita jako aktivátor k růstu neuritů, jak je to popsáno níže, a k nervové regeneraci, zvláště v CNS. Tato schopnost je dále demonstrována možností protilátek proti LI sloužit ve způsobu, jak identifikovat další členy rodiny nervových rekogničních molekul LI a CAM, které zde slouží jako látky, a vynález se tak rozšiřuje na molekuly, které jsou identifikovány , izolovány a charakterizovány pomocí těchto protilátek. Z těchto důvodů je třída látek identifikovaná jako modulátory nervového růstu v CNS považována za zahrnující i protilátky proti molekulám rodiny CAM, jako je LI a její analoga, jako je CHL1, popsané níže.

Předložený vynález se týká v jednom aspektu ektopické exprese neurálních růstových modulátorů CNS (CNGM) nebo neurálních buňečných adhezních molekul na diferencovaných astrocytech in vivo. Bylo zjištěno, že tyto molekuly zesilují růst neuritů na jednovrstevných kulturách astrocytů a kryostatových sekcí nepoškozených a poškozených dospělých myších optických nernů, a také in vivo, v experimentech s deformací optického nervu u transgenních zvířat. Zvýšená schopnost růstu neuritů je úměrná hladině ektopické exprese CNGM. Toto je demonstrováno porovnáním odlišných transgenních linií podle tohoto vynálezu, které exprimují různé bazální hladiny CNGM kódovaných transgenem, a korelacemi následné zvýšené exprese CNGM po porušení optického nervu.

Mělo by být uznáno, že ačkoliv optické nervy, jak porušené i neporušené, jsou vhodné pro použití podle předloženého vynálezu, může být podobně použita jákákoliv část nervové soustavy, včetně částí mozku a míchy.

Růst neuritů je závislý na hladinách exprese CNGM v astrocytech, což demonstruje specifický efekt způsobený CNGM v podpoře růstu neuritů v transgenních zvířatech. Inhibice růstu neuritů polyyklonálními protilátkami proti CNGM, ale ne protilátkami proti myším jaterním membránám, dále podporuje tuto specificitu, zvláště, protože obě protilátky reagují dobře s buněčnými povrchů neuronů a astrocytů transgenních zvířat.

Ve výhodném provedení je CNGM molekula LI. Biologické efekty LI mohou být inhibovány protilátkami proti LI, což ukazuje, že LI je homofilicky aktivní v konfiguraci trans v buňečném povrchu transgenních astrocytů. Dále druhově specifické protilátky proti LI, které nereagují s kuřecími dorzálními kořenovými ganglionovými neurony, inhibují neuritový růst v tomto typu neuronální buňky na transgenních astrocytech. Tyto zjištění jednoznačně identifikují LI jako aktivní molekulu působící trans a ukazují, že ektopická exprese LI gliovými buňkami, které normálně postrádají expresi LI, zesiluje růst neuritů in vitro.

Zesílení růstu neuritů na gliových buňkách zprostředkované transgenem, které normálně neexprimují LI in vivo, ukazuje, že gliové buňky dospělé savčí centrální nervové soustavy mohou být uzpůsobeny více k neuritovému růstu. Ztráta molekul, které podporují růst neuritů skrz gliové buňky (Smith et al. (1986) J. Comp. Neurol. 251:23-43; Smith et al. (1990) Dev. Biol. 138:377-390) se proto ukazuje být kompenzována expresí rekogniční molekuly, která je normálně hodně exprimována v gliových buňkách v dospělé savčí periferální nervové soustavě (Niecke et al. (1985); Bixby et al. (1988) J. Cell. Biol. 107:353-362; Seilheimer et al. (1988) J. Cell. Biol. 107:341-351).

Fenotyp dospělých astrocytů z předložených transgenních linií může být modifikován směrem ke schopnosti k obnovení exprese LI Schwannovými buňkami po způsobení poškození. Zvýšení exprese LI Schwannovými buňkami je pravděpodobně zprostředkováno neurotropiny aktivovanými po poškození autokrinními mechanizmy (Seilheimer et al. (1987) EMBO J. 6:1611-1616). Podobně může být exprese LI astrocyty v kultuře aktivována TGF-beta a NGF (Saad et al. (1991)). Vytvořením myší s transgenem GFAPL1 je neschopnost zralých astrocytů odpovídat na vervové poranění překonána aktivací molekuly LI. Exprese LI může být zvláště výhodná pro růst neuritů v myelinovaných dráhách centrální nervové soustavy, které normálně obsahují několik molekul, které inhibují růst neuritů (Schachner et al., Perspectives in Developm. Neurobiol. in Press; Schwab et al. (1995) Ann. Rev. Neurosci. 16:565-595).

Předložený vynález demonstruje, že inhibiční působení astrogliálních a oligodendrogliálních buňek může být překonáno, přinejmenším zčásti, růst neuritů je umožněn podporujícími vlastnostmi látek zde definovanými a zvláště jak je ilustrováno aktivitou ektopicky exprimované LI. Exprese LI v astrocytech se zdá také kompenzovat inhibiční efekty vykonávanými oligodendrocyty. Permisivní a nepermisivní molekulární mechanizmy proto nemusí být lokalizovány na tom samém typu buňky aby se objevil růst neuritů. Místo toho mohou být tyto molekulární mechanizmy zdíleny mezi ·· ·· • ·

různými typy buňek. Buňečná a molekulární manipulace LI a jiných molekul podporujících růst neuritů může proto umožnit zesílení regenerativní kapacity dospělé centrální nervové soustavy po poranění nebo chorobě.

Jak bylo ukázáno výše, předložený vynález se týká podpory neurálního růstu v CNS, včetně takového růstu, který je potřebný pro regeneraci struktur, k jejichž ztrátě došlo vlivem poranění nebo nemoci, stejně jako těch struktur a tkání vykazujících nekompletní nebo nehotovou formaci. Látky podle tohoto vynálezu také vykazují neuroprotektivní nebo nervově ochranný efekt, jak je to ilustrováno níže, a např., mohou být podávány za účelem inhibování neurální degenerace nebo ztráty různé povahy.

Vynález se také týká konstruktů a prostředků obsahujících nebo dopravujících látky podle tohoto vynálezu, ať už podporováním exprese jistých látek prostřednictvím genové terapie a podobně nebo exogenním podáváním těchto látek, kde je to vhodné nebo potřebné, ve formě farmaceutických prostředků za účelem léčení poraněných nebo nemocných struktur CNS. V tomto spojení je uvažováno, že jisté látky jsou schopné vykonávat růst podporující efekt, když jsou takto podávány, ačkoliv je známo, že členové uvedené skupiny, jako je LI a N-CAM, se váží homofilicky a mohou tak být více účinné, když jsou podávány pomocí exprese. Vynález se týká obou typů cest a protokolů, kde je to možné.

Mělo by být také uvedeno, že se předložený vynález týká použití sekretujících buňek CNGM za účelem modulace nervového růstu, regenerace a přežívání vervu v CNS. Určité rozpustné CNGM a její fragmenty a příbuzné molekuly jsou také předmětem vynálezu.

Následující pojmy budou definovány níže.

Pojem látka, nervový růstový modulátor CNS, CNGM, nervová rekogniční molekula, rekogniční faktor, rekogniční faktorový protein, nervová adhezní molekula a jakékoliv varianty, které zde nejsou zvlášť uvedeny, mohou být použity zaměnitelně a jako takové použity v předložené žádosti a nárocích, které se týkají proteinového materiálu včetně jednoduchých nebo komplexních proteinů a týkají se také těch proteinů, které mají aminokyselinovou sekvenci předešle popsanou a profil aktivit uvedený zde a v nárocích. Tyto pojmy také zahrnují aktivní fragmenty těchto proteinů, příbuzné molekuly a analoga, včetně malých molekul, které se chovají podobně jako uvedené látky.

Ve shodě s tím jsou proteiny vykazující stejnou nebo pozměněnou aktivitu podobně míněny. Za tyto modifikace mohou být považovány cílené mutageneze nebo mohou být náhodné, stejně jako ty, které jsou získány vlivem mutací v hostitelích, kteří je produkují. Pojmy nervový růstový modulátor CNS, CNGM, nervová rekogniční molekula, rekogniční faktor, rekogniční faktorový protein, nervová adhezní molekula jsou také uváděny, že zahrnují proteiny zde citované stejně jako podstatná homologa a alelické variace.

Aminokyselinové zbytky zde popsané jsou uváděny v izomerní formě L. Avšak zbytky v v izomerní formě D mohou být zaměněny za jakýkoliv zbytek v izomerní formě L pokud je polypeptidem udržována funkční vlastnost vazby imunoglobulinu. NH2 uvádí volnou aminoskupinu přítomnou na konci polypeptidu. COOH uvádí volnou karboxylovou skupinu přítomnou na konci polypeptidu. Podle standartní polypoptidové nomenklatury, J. Biol.

·· ···· • · • · • · • · « ·

Chem. 243:3552-59 (1969) jsou uvedeny zkratky aminokyselin v následující Tabulce:

TABULKA ZKRATEK AMINOKYSELIN

SYMBOL	AMINOKYSELINA
Jedno písmeno	Tři písmena
Y	Tyr	tyrosin
G	Gly	glycin
F	Phe	fenylalanin
M	Met	methionin
A	Ala	alanin
S	Ser	serin
I	Ile	isoleucin
L	Leu	leucin
T	Thr	threonin
V	Val	valin
P	Pro	prolin
K	Lys	lysin
H	His	histidin
Q	Gin	glutamin
E	Glu	kyselina glutamová
W	Trp	tryptofan
R	Arg	arginin
D	Asp	kyselina asparagová
N	Asn	asparagin
C	Cys	cystein

Mělo by být poznamenáno, že všechny sekvence aminokyselinových zbytků jsou zde ve formě, jejíž levá a pravá orientace je konvenční směr od konce amino ke konci karboxy. Dále by mělo být poznamenáno, že pomlčka na začátku nebo na konci sekvence aminokyselinových zbytků uvádí peptidovou vazbu na další sekvenci nebo jeden a více aminokyselinových zbytků. Výše uvedená Tabulka je zde uvedena kvůli převodu třípísmenného zápisu na jednopísmenný, protože se tyto zápisy zde mohou střídat.

Replikon je jakýkoliv genetický element (např. plazmid, chromozóm, virus), který funguje jako autonomní jednotka replikace DNA in vivo; tj., je schopna replikace pod vlastní kontrolou.

Vektor je replikon, jako je plazmid, fág nebo kosmid, ke kterému může být připojen jiný segment DNA za účelem provedení replikace připojeného segmentu.

Molekula DNA označuje polymerni formu deoxyribonukleotidů (adenin, guanin, thymin a cytosin) v její jednovláknové formě nebo ve formě dvouvláknové šroubovice. Tento pojem označuje pouze primární a sekundární strukturu molekuly a neomezuje ji na jakékoliv zvláštní terciální formy. Tento pojem zahrnuje dvouvláknovou DNA nacházející se, inter alia, v lineárních molekulách DNA (např. réstrikční fragmenty), virech, plazmidech a chromozómech. Při popisování struktury zvláštních dvouvláknových molekul DNA mohou být sekvence popsány podle normální konvence tak, že uvádějí • · · · pouze sekvenci ve směru od 5' ke 3' podél netranskribovaného vlákna DNA (tj. vlákna majícího sekvenci homologní k mRNA).

Počátek replikace označuje ty sekvence DNA, které se účastní syntézy DNA.

Kódující sekvence DNA je dvouvláknová sekvence DNA, která je transkribována a translatována do polypeptidu in vivo, když je umístěna pod kontrolu vhodné regulační sekvence. Hranice kódující sekvence jsou určeny iniciačním kodonem na 5' konci amino a translačním terminačním kodonem na 3 konci karboxy. Kódující sekvence může zahrnovat , ale není omezena na, prokaryontní sekvence, cDNA z eukaryontní mRNA, genomové sekvence DNA z eukaryontní (např. savčí) DNA a také syntetické sekvence DNA. Polyadenylační signál a transkripční terminační sekvence budou obvykle umístěny na 3' konci vzhledem ke kódující sekvenci.

Transkripční a translační kontrolní sekvence jsou regulační sekvence DNA, jako promotory, zesilovače, polyadenylační signály, terminátory a tak podobně, které slouží k expresi kódující sekvence v hostitelské buňce.

Promotorová sekvence je regulační oblast DNA schopná bazby s RNA polymerázou v buňce a zahájení transkripce směrem ke 3' konci kódující sekvence. Za účelem defonování předloženého vynálezu je promotorová sekvence omezena na svém 3' konci transkripčním iniciačním místem a přesahuje směrem k 5' konci tak, že zahrnuje minimální počet baží nebo elementů nezbytnách pro zahájení transkripce na úrovni detekovatelné nad pozadí. Uvnitř promotorové sekvence se budou nacházet transkripční iniciační místo (vhodně definované mapováním pomocí nukleázy Sl), stejně jako proteinové vazebné domény (konsensní sekvence) odpovědné za vazbu RNA polymerázy. Eukaryontní promotory budo často, ale ne vždy, obsahovat úseky TATA a CAT. Prokaryontní promotory obsahují Shine-Dalgarnovy sekvence společně s konsensnímí sekvencemi -10 a -35.

Expresní kontrolní sekvence je sekvence DNA, která kontroluje a reguluje transkripci a translaci jiné sekvence DNA. Kódující sekvence je pod kontrolou transkripčních a translačních kontrolních sekvencí v buňce, když RNA polymeráza přepisuje kódující sekvenci do mRNA, která je potom přeložena do proteinu kódovaného kódující sekvencí.

Pojem oligonukleotid, jak je zde používán uvádějíce próby, je definován jako molekula složená z jednoho nebo více ribonukleotidů, s výhodou více než tří. Jeho přesná velikost bude záležet na na mnoha faktorech, které naopak záležejí na konečné funkci a použití oligonukleotidu.

Pojem primer, jak je zde používán, označuje oligonukleotid, který se buď vyskytuje přirozeně v purifikovaném restrikčním digestu nebo je vyroben synteticky, který je schopen působit jako místo zahájení syntézy, když je umístěn do podmínek, v kterých je syntéza indukována a to prodloužením primeru, tj. v přítomnosti nukleotidů a indukující látky jako DNA polymerázy a ve vhodné teplotě a pH. Primer je buď jednovláknový nebo dvouvláknový a musí být dostatečně dlouhý k zahájení syntézy potřebného produktu v přítomnosti indukující látky. Přesná délka promeru bude záležet na mnoha faktorech, včetně teploty, zdroje primeru a použitého způsobu. Například v diagnostických aplikacích obsahuje oligonukleotidový primer typicky 15-25 nebo i více i méně nukleotidů, v závislosti na komplexnosti cílové sekvence.

Primery zde selektované jsou v podstatě komplementární k různým vláknům cílové sekvence DNA. To znamená, že primery musí být dostatečně • · · · komplementární aby hybridizovaly s příslušnými vlákny. Proto sekvence primeru nemusí odpovídat přesné sekvenci předlohy. Například, nekomplementární nukleotidový fragment je připojen k 5' konci primeru s tím, že zbytek sekvence primeru je komplementární k vláknu. Naopak, nekomplementární baze nebo delší sekvence jsou vmezeřeny dovnitř primeru, za předpokladu, že sekvence primeru má dostatečnou komplementaritu se sekvencí vlákna aby hybridizovala a tím utvořila templát pro syntézu prodlouženého produktu.

Jak je použito zde, pojmy restrikční endonukleázy a restrikční enzymy se týkají bakteriálních enzymů, které štěpí dvouvláknovou DNAv místě ne bo blízko místa specifické nukleotidové sekvence.

Buňka je transformovaná exogenní nebo heterologní DNA, když je takováto DNA vnesena dovnitř buňky. Tranformující DNA je a nebo není integrována (kovalentně spojena) do chromozomální DNA tvořící genom buňky. Například u prokaryont, kvasinek a savčích buňek je transformující DNA udržována na epizómových elementech jako jsou plazmidy. S ohledem na eukaryontní buňky je stabilně transformovaná buňka taková, v které byla transformující DNA integrována do chromozómu tak, že je děděna dceřinnými buňkami během replikace chromozómu. Tato stabilita je demonstrována schopností eukaryontní buňky vytvořit buňečné linie nebo klony obsahující populaci dceřiných buňek, které obsahují transformující DNA. Klon je populace buňek odvozených z jediné buňky nebo společného předka mitózou. Buňečná linie je klon primární buňky, který je schopen stabilního růstu in vitro mnoho generací.

Dvě sekvence DNA jsou v podstatě homologní, když se shoduje nejméně 75% (výhodně nejméně 80% a nejvýhodněji nejméně 90 nebo 95%) nukleotidů v definované délce sekvencí DNA. Sekvence, které jsou v podstatě homologní, jsou identifikovány srovnáním sekvencí dostupných v sekvenčních databankách pomocí standartního software, nebo v hybridizačních experimentech typu Sothern za, např., stringentních podmínek, jak je to definováno pro příslušný systém. Definování vhodných hybridizačních podmínek je odbornou věcí, viz např. Maniatis et al. supra; DNA cloning, Vols. I a II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.

Heterologní oblast konstruktu DNA je identifikovaný segment DNA uvnitř dlouhé molekuly DNA, který se nenachází ve spojení s delší molekulou v přírodě. Když heterologní oblast kóduje savčí gen, tento gen bude obvykle ohraničen DNA, která neohrahičuje savčí genomovou DNA v genomu výchozího organizmu. Jiný příklad heterologní kódující sekvence je konstrukt, kde kódující sekvence samotná se nenachází v přírodě (např. cDNA, kde gonomová kódující sekvence obsahuje introny, nebo syntetické sekvence mající kodony jiné než u přirozeného genu). Alelické variace nebo přirozeně se vyskytující se mutační události nejsou příčinou vzniku heterologních oblastí DNA, jak je zde definováno.

Protilátka je jakýkoliv imunoglobulin, včetně protilátek a fragmentů z ní pocházejících, který váže specifický epitop. Pojem zahrnuje polyklonální, monoklonální a chimérické protilátky, posledně jmenované jsou popsány detailně v U. S. Patent No. 4,816,397 a 4,816,567.

Společné protilátkové místo je taková strukturní část molekuly protilátky obsažená v těžkém a lehkém řetězci variabilních a hypervariabilních oblastí, která specificky váže antigen.

• · · · ·♦··»!····· ^2υ ...........

Pojem molekula protilátky ve svých různých gramatických formách, jak je to zde použito, se týká jak intaktní imunoglobulinové molekuly, tak imunologicky aktivní části imunoglobulinové molekuly.

Příkladné molekuly protilátky jsou původní imunoglobulinové molekuly, skutečné jsou původní imunoglobulinové molekuly a ty jejich části známé v oboru jako Fab, Fab',F(ab) a F(v), které jsou upřednotněny pro použití v terapeutických způsobech zde popsaných.

Části protilátek Fab a F(ab') jsou připravovány proteolytickou reakcí papainu a pepsinu na skutečné původní imunoglobulinové molekuly způsoby, které jsou dobře známy. Viz např. U. S. Patent No. 4,342,566, Theofilopolous et. al. Části protilátek Fab' jsou dobře známy a jsou produkovány z částí F(ab ) následnou redukcí merkaptoetanolem disulfidových vazeb spojujících dva těžké řetězce a následnou alkylací výsledného bílkovinného merkaptanu činidlem jakým je iodoacetamid. Upředňostněny jsou intaktní molekuly protilátek.

Pojem monoklonální protilátka ve svých různých gramatických formách se vztahuje na protilátku mající pouze jeden druh vazebného místa, které imunogenně reaguje s příslušným antigenem. Monoklonální protilátka tak typicky vykazuje jedinou vazebnou afinitu pro antigen, s kterým imunně reaguje. Monoklonální protilátka tak obsahuje molekulu mající pluralitu vzájemných míst, každé imunospecifické na jiný antigen; např. dvojitě specifickou (chimérní) monoklonální protilátku.

Pojem farmaceuticky přijatelný se týká molekulárních entit a prostředků, které jsou fyziologicky tolerantní a nezpůsobují alergické nebo podobné reakce, jako jsou žaludeční nevolnost, závrať a podobně, když jsou podávány člověku.

Pojem terapeuticky účinné množství zde znamená množství dostatečné k zabránění a s výhodou ke snížení nejméně o 30 procent a ještě výhodněji o 50 procent a nejvýhodněji o 90 procent klinicky významné změně ve fázi aktivity S cílové buněčné masy nebo jiného patologického stavu, jako např. zvýšeného krevního tlaku, horečky nebo množství bílých krvinek.

Sekvence DNA je operativně spojena k expresní kontrolní sekvenci, když expresní kontrolní sekvence řídí a reguluje transkripci a translaci té sekvence DNA. Pojem operativně spojena zahrnuje sekvenci, která má vhodný počáteční signál (např. ATG) na jejím začátku, která slouží k expresi a udržování správného čtecího rámce, který umožňuje expresi sekvence DNA pod řízením expresní kontrolní sekvence a produkci požadovaného produktu kočovaného touto sekvencí DNA. Jestliže gen, který je požadován k vnesení do rekombinantní molekuly DNA, neobsahuje vhodný počáteční signál, je takový počáteční signál dodatečně vnesen na začátek tohoto genu.

Pojem standartní hybridizační podmínky se týká koncentrace soli a teplotních podmínek, které se v podstatě rovnají 5xSSC a 65 °C pro hybridizaci a promývání.

V jednom aspektu se předložený vynález týká transgenních zvířat, která exprimují CNGM nebo neurální rozpoznávací molekulu, zvláště LI, a to výhodně v astrocytech. Tato zvířata mají zvýšenou schopnost nervového růstu v centrální nervové soustavě.

Vynález také zahrnuje zkoušku na testování potenciálních prostředků, které jsou účinné při modulaci nervového růstu cílových savčích buněk přerušením nebo potenciací nervové rozpoznávací aktivity CNGM. Jako • ·

nervová rozpoznávací aktivita nebo nervová adhezní aktivita je míněn jakýkoliv biologický efekt, který je výsledkem vazby CNGM na jinou molekulu, včetně intracelulárních efektů na druhé přenašeče. V jednom případě je testovaný prostředek podáván do buněčného vzorku s ligandem, který aktivuje nervový růstový modulátor CNS, nebo transgennímu zvířeti exprimujícímu nervový růstový modulátor CNS, to vše za účelem stanovení vlivu modulátoru na vazebnou aktivitu modulátoru k jakémukoliv chemickému vzorku nebo testovanému prostředku porovnáním s kontrolou. Určující charakteristiky nejméně jednoho z předložených nervových růstových modulátorů CNS, zvláště LI, je jejich účast na změnách v ustálených hladinách intracelulárních přenašečů, zahrnujících Ca²⁺, pH a cyklické nukleotidy, stejně jako změny v aktivitách protein kináz, jako jsou protein kináza c, pp60^c'^src, kasein kináza typu II a jiná kináza, která fosforyluje LI.

Systém zkoušky je adaptován na identifikaci látek nebo jiných entit, které jsou schopné vazby na CNGM nebo proteiny v cytoplazmě nebo v jádře a tím schopny inhibovat nebo potenciovat transkripční aktivitu. Takové zkoušky jsou užitečné při vývoji látek, které jsou specifické na danou buněčnou aktivitu, jako je nervový růst nebo zvýšení synaptické působivosti nebo které potenciují takovou aktivitu v čase nebo hladině aktivity. Takové látky jsou používány například k modulování nervového růstu při zranění nebo k léčbě jiných patologií, například k léčbě neurodegenerativních nemocí jako jsou Parkinsonova choroba, ALS, Huntingtonova choroba a Alzheimerova choroba.

V ještě dalším provedení se vynález týká agonistů a antagonistů aktivity nervového růstového modulátorů CNS. Zvláště látka nebo molekula, která inhibuje schopnost neuronů rozeznávat CNGM jako LI je používána k zamezení nervového růstu tam, kde je takový růst kontraindikativní, a jak je popsáno výše, farmaceutický prostředek obsahující takovou látku je podáván přímo do cílového místa. V jiném provedení je agonistem peptid mající sekvenci části domény LI, zvláště té domény mezi fibronektinovými opakováními 2 a 3 nebo je agonistem protilátka proti této oblasti. Obě tyto molekuly jsou potenciálně použity tam, kde má daný CNGM jako LI schopnost homolytické vazby (t. j. jedna molekula LI váže jinou molekulu LI a proto obě protilátky proti LI a proti fragmentům LI jsou schopny vazby k LI).

Jedno z diagnostických využití předloženého vynálezu se týká použití přítomných CNGM ve zkouškách na testování inhibitorů protein kinázy. Protože molekuly CNGM jsou v aktivním stavu fosforylovány, jsou také defosforylovány specifickými fosfatázami. Blokování specifické kinázy nebo fosfatázy je proto cesta k farmakologickému působení, které moduluje aktivitu těchto nervových rozpoznávacích proteinů.

Předložený vynález se podobně týká vývoje protilátek proti CNGM včetně přirozeně vzvolaných a rekombinantně připravených protilátek. Protilátky jsou například použity k testování expresních knihoven za účelem získání genů, které kódují CNGM. Takové protilátky zahrnují polyklonální i monoklonální protilátky připravené známými genetickými technikami, stejně jako zahrnují dvojitě specifické (chimérní) protilátky a také protilátky obsahující jiné vlastnosti uzpůsobující je pro další diagnostické použití spojené s jejich schopností modulovat nervový růst.

• ·

Protilátky proti nervovým růstovým modulátorům CNS jsou zvláště selektovány a zahrnuty do rozsahu předloženého vynálezu pro jejich zvláštní schopnost vazby proteinu. Aktivita nervových růstových modulátorů nebo specifických polypeptidů je sledována přímo pomocí uvedených testovacích technik skrz použití vhodně značeného množství nervového růstového modulátoru nebo protilátky nebo jejich analoga.

CNGM, jejich analoga a jakékoliv inhibitory nabo protilátky, které jsou vyvolány, jsou schopné použití ve spojení s různými diagnostickými technikami, včetně imunozkoušky jako je radioimunozkouška, s použitím, například, protilátky proti CNGM, která byla označena radioaktivní adicí, redukcí borohydridem sodným nebo radiojodinací.

Kontrolní množství inhibitorů nebo protilátek v imunozkoušce je vneseno do kontrolního vzorku. Po tom co má značený materiál nebo jeho vazebný patrner možnost reagovat s místy uvnitř vzorku, je výsledné množství změřeno známými technikami, které jsou různé podle povahy připojené značky. Protilátky proti CNGM jsou použity v příkladu protokolu.

V případě, když jsou použity radioaktivní značky v podobě izotopů ³H, 14/-I 32_n 36^. 5157 _n „ 58^ 59-r-. 90_v 125_T 131_T „ 186r>„ · „

C, P, Cl, Cr, Co, Co, Fe, Y, 1, 1 a Re, jsou použity současné měřící techniky. V případě, když je značkou enzym, je detekce provedena jokoukoliv ze současně používaných kolorimetrických, spektrofotometrických, fluorospektrofotometrických, amperometrických a gazometrických technik, které jsou v oboru známy.

Předložený vynález se týká zkoušky, která je provedena ve formě testovací soupravy pro kvantitativní analýzu na přítomnost nervových růstových modulátorů nebo na identifikaci látek nebo jiných činidel, které napodobují nebo blokují jejich aktivitu. Systém testovací soupravy obsahuje značenou komponentu připravenou jednou z radioaktivních nebo enzymových technik zde popsaných, zahrnuje připojení značky na nervové růstové modulátory jejich agonisty nebo inhibitory, a obsahuje další imunochemická činidla, nejméně jednou z nich je volný nebo imobilizovaný ligand schopný vazby se značenou komponentou nebo jejím vazebným partnerem a stanovením příslušného.

V dalším provedení se předložený vynález týká určitých terapeutických způsobů, které jsou založeny na aktivitě nervových růstových modulátorů CNS, jejich podjednotek nebo jejich aktivních fragmentů, nebo na činidlech a jiných látkách, které mají tu samou aktivitu. První terapeutický způsob je spojen s podporou nervového růstu v CNS, který je způsoben přítomností a aktivitou CNGM, jejich aktivních fragmentů, analog a příbuzných látek, a který zahrnuje podávání látky schopné modulování produkce nebo aktivity CNGM, v množství účinném k dosažení podpory vývinu CNS, obnoveného růstu nebo rehabilitace u pacienta. Naopak jiné látky nebo jiní neutralizující vazební partneři CNGM jsou podávány za účelem inhibice nebo zabránění nežádoucího nervového růstu. Také modulace působení specifických kináz a fosfatáz , které jsou účastny fosforylace a defosforylace CNGM se týká tohoto způsobu a umožňuje terapie založené na aktivaci CNGM.

Terapeutický způsob, který je zde všeobecně popsán, zahrnuje způsob léčby různých onemocnění a jiných buběčných dysfunkcí a poruch podáváním farmaceutických prostředků, které obsahují účinné inhibitory nebo aktivátory nervového růstového modulátoru CNS nebo jeho podjednotek nebo jiných stejně účinných látek vyvinutých například pomocí zkoušky ne testování • ♦ · • · · · látek, která je připravena a používána ve shodě s dalším aspektem předloženého vynálezu. Například látky nebo jejich vazební partneři k nervovým růstovým modulátorům CNS a proteinům jsou podávány aby inhibovaly nebo potenciovaly navázání a aktivitu druhého přenašeče.

Jak je uvedeno výše, vynález se týká objevu celé rodiny molekul LI CAM a zvláště analoga k LI známého jako CHLÍ. CHL1 obsahuje terminální signální sekvenci na konci N, šest imunoglobulinových domén, fibronektinu podobná opakování, transmembránovou doménu a intracelulární doménu na konci C, která je dlouhá přibližně 100 aminokyselin. CHL1 je nejvíce podobná ve své extracelulární doméně k kuřecí Ng-CAM (40% aminokyselinové identity), poté myší LI, kuřecímu neurofascinu, kuřecí NrCAM, drosofilímu neuroglianu a Ll.l zebřičky (37 až 28% aminokyselinové identity), myší F3, krysí TAG-1 a králičí BIG-1 (přibližně 27% aminokyselinové identity), podobnost s jinými členy rodiny Ig (např. N-CAM, DCC, HLAR, rse) je 16 až 11%. Intracelulární doména je nejvíce podobná myší a kuřecí Nr-CAM, myšímu a krysímu neurofascinu 1 (přibližně 50% aminokyselinové identity), poté kuřecímu neurofascinua Ng-CAM, drosofilímu neuroglianu a Ll.l a LI.2 zebřičky (přibližně 40% aminokyselinové identity). Vedle celkové vysoké homologie a Zachovalé modulární struktury mezi předešle uvedenými členy rodiny Ll(myší/lidská Ll/krysí NILE; kuřecí Ng-CAM; kuřecí/myší Nr-CAM; drosofilí neuroglian; Ll.l a LI.2 zebřičky; kuřecí/myší neuroglian/krysí ADGP). Charakteristické vlastnosti LI byly určeny s ohledem na počet aminokyselin mezi pozicemi konzervovaných aminokyselinových zbytků, které definují vzdálenosti uvnitř a mezi dvěmi přilehlými doménami podobnými Ig a opakováními podobnými FN. Tyto vykazují kolinearitu v šesti doménách podobných Ig a přilehlých čtyř opakováních podobných FN, která je značně konzervována mezi LI a molekulami obsahujícími tyto moduly (pojmenována soubor rodiny LI) a zahrnuje formy se spojením GPI podskupiny F3 (myší F3/kuřecí Fll/lidská CNTN1; krysí BIG-l/myší PANG; krysí TAG-l/myší TAX-l/kuřecí axonin-1). Molekula rakoviny konečníku (DCC) předešle uvedena jako molekula podobná N-CAM přináleží do souboru rodiny LI. Jinými strukturními znaky CHL1 sdílenými mezi členy rodiny LI jsou vysoký stupeň N-glykosidicky navázaných karbohydrátů (přibližně 20% jejich molekulové hmotnosti), obsahuje karbohydrátovou strukturu HNK-1, a vzorek proteinových fragmentů obsahující hlavní pruh 185 kD a menší fragmenty 100 a 125 kD. Stejně jako pro ostatní členy rodiny LI je převážná exprese LI pozorována v nervovém systému a pozdějších vývojových stádiích.

Následující příklady jsou uvedeny v pořadí tak aby plně ilustrovaly výhodné provedení vynálezu. Neměly by být žádným způsobem upraveny tak aby neomezovaly široký rozsah vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Transgen GFAP-L1 a vytvoření transgenní myši

Gliový fibrilární kyselý protein (GFAP, Eng et al. (1971) Brain Res.

28:351-354) je přednostně exprimován astrocyty v pozdních stádiích vývoje myší centrální nervové soustavy (Landry et al. (1990) J. Neurosci. Res.

• · · · • * Λ. · · * · • · Í Τ ·· · · ·

25:194-203). Proto byly regulační sekvence genu GFAP použity aby řídily expresi nervové buněčné adhezní molekuly LI v zralých astrocytech transgenních myší. Transgen GFAP-L1 (Obr. 1) kóduje pouze nervovou buněčnou adhezní molekulu LI protože kodon ATG genu GFAP byl mutován a kódující sekvence LI je následována na 3' konci translačním signálem pro zastavení a polyadenylačním signálem (Toggas et al. (1994) Nátuře 367:188193). Tento konstrukt byl použit k vytvoření tří různých linii transgenních myší, označených 3418, 3426 a 3427.

Myší cDNA LI (Moos et al. (1988) Nátuře 334:701-703) byla vnesena do exonu 1 myšího genu pro gliový fibrilární kyselý protein (GFAP), který byl modifikován, jak je uvedeno výše (Toggas et al. (1994) Nátuře 367:188193). Myší cDNA LI dlouhá 4,05 kb obsahující celou kódující sekvenci proteinu a 250 netranslatovaných nukleotidů na 3' konci byla spojena s modifikovaným transgenem GFAP-L1.

Transgen GFAP-L1 dlouhý 14,5 kb byl vyštěpen z modifikovaného klonovacího vektoru digescí s Sfi I, poté byla provedena elektroforéza a elektroeluce z agarózového gelu. Purifikovaná DNA byla naředěna na konečnou koncentraci 2 ug/ml v T5E0J (5 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,1 mM EDTA). Přibližně 2 pl naředěné DNA byly mikroinjekovány do samčího jádra oplodněných vajíček odebraných od samiček CB6F1 (s velkou ovulací), které byly spářeny se samci C57/B1/6J. Vajíčka, která přežila mikromanipulaci, byla přenesena do vejcovodu uměle březí samičky podle popsaných způsobů (Hogan et al. (1986) Manipulating Mouše Embryo, Cold Spring Harbour Laboratory, New York).

Příklad 2

Analýza Southern blot

Myši byly analyzovány na integraci transgenu do myšího genomu pomocí analýzy Southern blot genomové DNA izolované z biopsií ocasu (Southern (1975) J. Mol. Biol. 98:503-517). Transgenní zakladatelské myši byly pářeny a mláďata testována stejným způsobem kvůli vytvoření transgenních linií. Vzorky DNA o hmotnosti 10 ug byly štěpeny enzymy Bam HI, Eco RI a Xba I a poté podrobeny elektroforetické separaci na agarózovém gelu o koncentraci 0,7% a DNA byla přenesena na membránu Hybond N+ (Amersham) v alkalickém prostředí. Fragment Eco RI dlouhý 3,3 kb z cDNA LI nebo fragment Hind III dlouhý 330 pb z pozdního sestřihu SV40 a z polyadenylačního místa purifikovaného z píazmidu Al,5 (Maxwell et al. (1989) Biotechniques 7:276-280) byl označen náhodným primerováním s ³²píalfa-CTP (Boehringer Mannheim) za účelem použití jako próby. Prehybridizace byla provedena při 65°C jednu hodinu v 5x SSPE, 5x Denhardtův roztok, 0,5% (w/v) SDS a 0,1 mg/ml sonikované nehomologní DNA. Hybridizace byla provedena přes noc. Konečné podmínky promývání pro všechny Southernovy bloty byly 0,lx SSPE a 0,l%SDS (w/v) při 65°C.

Příklad 3

Analýza Northern blot

Anestetizované dospělé myši (12 týdnů staré) byly utraceny smrtelnou dávkou chloralhydrátu a odebráné mozky byly okamžitě zmraženy v tekutém • · · ·

dusíku. Celková buněčná RNA byla izolována rozdrcením tkáně v tekutém dusíku. Čtyřmolární guanidium thiocyanát byl přidán k rozdrcené tkáni. Izolace celkové RNA byla provedena jak je popsáno (Chomczynski et al. (1987) Anal. Biochem. 162:156-159; Pagliusi et al. (1989) AMOG. J. Neurosci. Res. 22:113-119). Výtěžky RNA byly odhadnuty z absorbance při 260 nm. 10 ug RNA bylo frakcionováno na 1% agarózových a formamidových gelech kvůli analýze Northern blot (Thomas (1980) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 77:201-205).

Náhodně primerované próby cDNA LI byly použity k současné detekci endogenní mRNA LI o délce 6 kb (Tacke et. al. (1987) Neurosci. Lett. 82:8994) a také z transgenu odvozené mRNA LI o délce 4,2 kb. Denzitometrická analýza Northern blotů byla provedena na skanovacích obrázcích (Arcus scanner, Agfa-Gavaert) z originálních filmů pomocí programu Image (NIH, Research Serveces Branch, NIMH).

Analýza Northern blot celkové RNA z celých mozků transgenních zvířat odhalila transkripty odhadované velikosti (4,2 kb) pro mRNA odvozenou z transgenu (Obr. 2). Tyto transkripty jsou jasně odlišné od endogenní mRNA LI, která je dlouhá 6 kb a pochází z postmitotických neuronů. Denzitometrická analýza odhalila, že hladiny mRNA LI odvozené z transgenu byly 34%, 13% a 8% v liniích 3426, 3427 a 3418, jak to bylo porovnáno s hladinami endogenní mRNA LI (100%).

Příklad 4

Zvířata

Pro kultury na kryostatických řezech a experimenty v imunocytochemii a hybridizaci in šitu byla kontrolní zvířata brána ze zásoby stejně starých normálních myší C57bl/6J nebo jiných netransgenních potomků. Pro izolaci malých cerebelárních neuronů a pro příravu kultur astrocytů byla používána šest dní stará netransgenní mláďata ICR. Neurony dorzálního kořenového ganglionu (DRG) byly připraveny z osm dní starých kuřecích embryí.

Příklad 5

Hybridizace in šitu

Kvůli ověření, že astrocyty transgenních zvířatexprimovaly LI in vivo byly analyzovány optické nervy pomocí hybridizace in šitu. Byl vybrán optický nerv, protože obsahuje pouze gliové buňky a neobsahuje neuronální buněčná tělíska. Astrocyty in vivo normálně postrádají expresi LI ve všech vývojových stádiích (nepublikované údaje).

Kvůli detekci mRNA LI v kryostatických řezech čersvě zmražených mozkových řezů byly vytvořeny digoxigeninem značené cRNA pomocí transkripce in vitro (Dórries et al. (1993) Histochemistry 99:251-262). Sekvence kódující extracelulární část LI (Moos et al. (1988)) byla subklonována do vektoru pBluescript KS+ (Stratagene). Próby cRNA va smyslu a proti smyslu čtení byly vytvořeny přepisem insertu LI po linearizaci výsledného plazmidu s Xho I a nebo Xba I pomocí promotorů T7 a T3. Kvůli vytvoření prób cRNA GFAP byl subklonován fragment cDNA GFAP (Lewis et al. (1984) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81:2743-2745; laskavě poskytnut Dr. N. J. Cowanem) dlouhý 1,2 kb a kódující konec N proteinu do vektoru ····

• · · · pBluescript KS+. Próby cRNA ve smyslu a proti smyslu čtení byly vytvořeny přepisem výsledného plazmidu, linearizací s Eco RI a Xho I z promotorů T3 a T7. Kvůli zlepšení pronikání do tkáně byly próby cRNA ve smyslu a proti smyslu čtení srovnány za podmínek alkalycké hydrolýzy aby došlo k získání průměrné délky fragmentů přibližně 300 nukleotidů. Hybridizace in šitu na řezech optických nervů připravených z dospělých zvířat (12 dní starých) byla provedena jak je popsáno (Dórries et al. (1993); Bartsch et al., J. Neurosci., v tisku).

V netransgenních kontrolách byly transkripty detekovány pouze v nervových buňkách sítnice, ale nikoliv v optickém nervu, ani před (Obr. 3A) ani po poškození (Obr. 3B). Naopak, mRNA Ll byly exprimovány gliovými buňkami optických nervů z transgenních myší (Obr. 3C). Buňky pozitivní na mRNA Ll byly detekovatelné jak ve vzdálených myelinovaných, tak v bližších nemyelinovaných částech nervu. Intenzita hybridizačního signálu byla vyšší v nemyelinované bližší části ve srovnání s myelinovanou vzdálenější částí nervu.

Podobné rozmístění pozitivních buněk a podobné rozdíly v intenzitě značení mezi nemyelinovanými a myelinovanými oblastmi byly pozorovány pomocí próby cRNA GFAP (porovnejte Obr. 3C a E). Počet buněk pozitivních na mRNA Ll v optickém nervu transgenních zvířat však byl vždy významně menší než počet buněk pozitivních na GFAP, pravděpodobně kvůli nižší citlivosti próby cRNA Ll. Detekovatelné hladiny mRNA Ll jsou alternativně dosaženy v astrocytech s vysokou hladinou exprese GFAP. Takový prahový efekt může být způsoben navržením transgenu GFAP-L1, který obsahuje pouze 2 kb ze sekvence GFAP ve směru 5' konci. Studie in vitro dokládají, že oblast mezi 2 a 6 kb v protisměru k místu počátku transkripce obsahuje sekvenční elementy zesilující expresi GFAP řízených spojených genů v buňkách C6 (Sarid (1991) J. Neurosci. 28:217-228). Konečně, modifikace exonu 1 genu GFAP včetně vnesení velké cDNA Ll může snížit stabilitu chimérní mRNA ve srovnání s mRNA GFAP a změnit efekty způsobené regulačními sekvencemi GFAP umístěnými v obouch směrech v modifikované oblasti.

Po poškození optického nervu byla pozorovány zvýšená exprese Ll v transgenních (Obr. 3D), ale nikoliv v netransgenních (Obr. 3B) optických nervech. Počet buněk, které exprimovaly Ll a intenzita hybridizačního signálu Ll byly podobné u různých zvířat stejné transgenní linie, ale lišil se mezi různými transgenními liniemi. Ve shodě s výsledky získanými pomocí analýzy Northern blotu (viz výše) byly buňky pozitivní na mRNA Ll nejčetnější v linii 3426, poté v linii 3427 a nejméně četné v linii 3418. Tato rozdílnost v hladině exprese transgenu u různých linií může být odvozená z řady faktorů, zvláště vlivem okolních oblastí hostitelského chromatinu, které ohraničují různá transgenní integrační místa (Proudfoot (1986) Nátuře 322:562-565;Reik et al. (1987) Nátuře 328:248-251; Sapienze et al. (1987) Nátuře 328:251-254).

Příklad 6

Protilátky

Výroba polyklonálních králičích protilátek proti myší Ll a purifikace na imunoafinitní koloně na Ll (Rathjen et al. (1984); Martini et al. (1988) a • ·

polyklonálních protilátek proti myší jaterní membráně (Lindner et al. (1983); Pollerberg et al. (1985) byly popsány. Myší polyklonální protilátka proti GFAP byla koupena (Boehringer Mannheim).

Kvůli analýze Western blot byly polyklonální a monoklonální protilátky zviditelněny pomocí peroxidázy z ředkvičky konjugované s kozími protimyšími a nebo králičími protilátkami (Dianova, Hamburg, Německo). Kvůli imunochemii byly primární protilátky detekovány pomocí konjugovaných kozích protimyších a králičích protilátek značených fluoresceinem, isothiocyanátem nebo tetramethzylrhodamid isothiocyanátem (Dianova). Digoxigeninem značené próby cRNA pro hybridizaci in šitu byly zviditelněny pomocí s alkalickou fosfatázou konjugovaných fragmentů Fab k digoxigeninu (Boehringer Mannheim).

Příklad 7

Udržování neuronů na kryostatických řezů

Pro analýzu, jestli jsou optické nervy z transgenních zvířat více vodivé do růstu neuritů než optické nervy z divokého typu zvířat byly cerebelární neurony udržovány na kryostatických řezech poškozených a nepoškozených optických nervů (Obr 7).

Optické nervy z 6 až 16 týdnů starých myší byly připraveny jak je popsáno (Bartsch et al. (1989) J. Comp. Neurol. 284:451-462. Krátce, poškozené a nepoškozené optické nervy byly zakotveny a zmraženy v hormonálně definovaném mediu bez séra (Fischer (1986b) neurosci. Lett. 28.325-329) pomocí tekutého dusíku. Tkáňové řezy (14 um tlusté) byly podélně rozříznuty na kryostatu Frigocut 270 (Jung-Reichardt), upevněny do sterilního podložního sklíčka potaženého poly-L-lysinem (Sigma, 0,001% ve vodě) a vysušeny 2 až 3 hodiny ve sterilním bloku. Poté bylo provedeno promytí řezů v médiu 5 min. Malé cerebelární neurony purifikované přes gradient perkolu (Keilhauer et al. (1985) Nátuře 316:728-730) získané z šest dní starých myší ICR (6 x 10⁴ buněk v 100 ul média) bylo naneseno na každé sklíčko. Buňky byly udržovány v inkubátoru při 37°C ve zvlhčené atmosféře 5% CO2 a 95% vzduchu.

Růst neuritů byl také měřen v přítomnosti protilátek. Řezy byly předinkubovány s polyklonálními protilátkami proti LI nebo polyklonálními protilátkami proti myším jaterním membránám (100 ug/ml, dialyzovány intenzivně a naředěny v médiu) po 1 hod. při 37°C. Po odstranění protilátek byly řezy opatrně promyty médiem (5 krát, každé promytí 5 min. při pokojové teplotě) a poté byly přidány v Perkolovém gradientu purifikované malé cerebelární neurony. Po dvou dnech byly kryostatové kultury fixovány v 4% paraformaldehydu v PBS po dobu 30 min. při pokojové teplotě a pak byly změřeny délky neuritů. Aby se vyhnulo krajovémým efektům při měření, nevyhodnocovaly se řezy, které byly umístěny na vnější hraně obnášející 20% ze sklíčka. Pomocí programu na semiautomatický výpočet obrazové analýzy (IBAS, Kontron, Zeiss) byly změřeny délky všech neuritů, které vyrostly na těchto řezech a průměrná délka neuritů vztažená na tělo nervové buňky byla vypočítána. Pro každý experiment a optický nerv (poškozený nebo nepoškozený) byla průměrná délka neuritů, které rostly na nervech transgenních zvířat, vztažena k příslušným hodnotám kontrolních zvířat.

• ♦ · ·

Dvanáct nezávislých experimentů bylo provedeno s poškozenými a nepoškozenými nervy pomocí nejméně dvou transgenních zvířat.

Pro transgenní zvířata bylo pozorováno prodloužení délky neuritů na poškozených nervech ve srovnání s nepoškozenými nervy. Na rozdíl od toho nebyly délky neuritů na poškozených a nepoškozených optických nervech zvířat divokého typu významně odlišné (Obr. 8). Neurity pěstovaných neuronů na nepoškozených optických nervech z transgenních zvířat byly konzistentně delší než neurity pěstovaných neuronů na nepoškozených nervech ze zvířat divokého typu. Maximální zvětšení délky neuritů na 300% bylo pozorováno, když byl použity řezy z linie 3426. Podobně byla zvětšena délka neuritů na poškozenýc nervech transgenních linií až na 400%, když se porovnaly s poškozenými nervy ze zvířat divokého typu.

Aktivita podporující růst neuritů transgenních optických nervů korelovala pozitivně s hladinou exprese LI (Obr. 8). Nepoškozené optické nervy linie 3426, které exprimují nejvyšší hladinu proteinu LI byly potentnější v prodloužení neuritové délky než linie 3427 a 3418, které exprimovaly nižší hladinu LI. Na poškozených optických nervech linií 3426 a 3427 (28 dní po poškození) byla délka neuritů čtyři krát větší než na poškozených optických nervech zvířat divokého typu. Zjištění, že zvětšení délky neuritů v poškozených optických nervech bylo podobné pro linie 3426 a3427 (ačkoliv linie 3426 vykazuje 25% zvýšení exprese proteinu LI po poškození ve srovnání s linií 3427) indikuje, že hladina proteinu LI v linii 3427 již dostačuje k maximální indukci růstu neuritů na malých cerebelárních neuronech.

Preinkubace nepoškozených optických nervů ze zvířat divokého typu s polyklonálními protilátkami proti LI nebo myším jaterním membránám významně neovlivnily lélky neuritů (Obr. 9). Naopak, délky neuritů byly redukovány o více než 50%, když byly kryostatické řezy nepoškozených a poškozených optických nervů z transgenní linie 3426 preinkubovány s protilátkami proti LI (Obr. 9). Protilátky proti jaterním membránám, které silně váží optické nervy a malé cerebelární neurony (údaje neukázány), nevykazují podobné inhibiční efekty. Je zajímavé, že preinkubace poškozených optických nervů ze zvířat divokého typu s protilátkami proti LI indukovala prodloužení délky neuritů ve srovnání s poškozenými nervy ze zvířat divokého typu bez předchozí preinkubace s protilátkami proti LI. Protilátky proti myším jaterním membránám nevykazují významné zvýšení ve za stejných podmínek, což ukazuje, že přidání buněčných povrchových reaktivních protilátek per se neporuší růst neuritů.

Příklad 8

Udržování neuronů na jednovrstevných kulturách astrocytů

K přípravě jednovrstevných astrocytů byly vyčištěny přední mozky z šest dní starých myší od jiné než nervové tkáně a disociovány jak bylo popsáno (Schnitzer et al. (1981) J. Neuroimmunol. 1:429-456; Fischer et al. (1982a) Neurosci. Lett. 29:297-302; Keilhauer et al. (1985). Buňky byly udržovány na poly-L-lysinem potažených (Sigma, 0,001% ve vodě) tkáňových miskách v médiu BME (Gibco) obsahujících 10% koňské sérum a 2 mM glutamin po dobu 14 až 21 dnů. Kontaminující oligodendrocyty a neurony byly odstraněny protřepáním misek při každé výměně média a dalším • ·

pěstováním buněk v intervalech čtyř dnů. Imunologické barvení GFAP po 14 dní udržování ukázalo, že více než 90% buněk byly astrocyty. Po 14 dnech v kultuře byly buňky dány do kontaktu s trypsinem a udržovány jako jedna vrstva pět dní na sklíčkách potažených poly-L-lysinem. Malé cerebelární neurony purifikované v gradientu Perkolu (Schnitzer et al. (1981)) ze šest dní starých myší a dorzálního kořenového ganglionové neurony (DRG) (Seilheimer et al. (1988) J. Cell. Biol. 107:341-351) z osm dní starých kuřecích embryí byly poté přidány na jednu vrstvu astrocytů. Po 6 hodinách společné kultury pro celeberální a 12 hodinách pro neurony DRG byly buňky fixovány 2% paraformaldehydem v PBS a délky neuritů byly analyzovány jak je popsáno v Příkladu 7.

Růst neuritů z myších malých cerebelárních nebo kuřecích dorzálních kořenových ganglionových (DRG) neuronů byl také studován v jednovrstevných kulturách astrocytů odvozených z transgenních (linie 3426) nebo netransgenních kontrol (Obr. 10, Tabulka 1).

Tabulka 1

Délky neuritů cerebelárních a dorzálních kořenových ganglionových (DRG) neuronů udržovaných na astrocytických jednovrstvách připravených z myší divokého tytu (WT) a transgenní linie 3426.

	Cerebelární neurony	DRG neurony
WT	65 +- 34 mm	90 +- 10 mm
WT + anti LI	72 +- 30 mm	105 +- 14 mm
WT + anti játra	57 +- 24 mm	107 +- 12 mm
3426	75 +- 41 mm	137 +- 10 mm
3426 + anti LI	45 +- 25 mm	88 +- 8 mm
3426 + anti játra	58+-31 mm	124 +- 15 mm

Délky neuritů na astrocytech bez preinkubace s jakoukoliv protilátkou nebo po působení bez polyklonálních protilátek proti LI (anti LI) nebo protilátek proti myším jaterním membránám (anti játra) jsou uvedeny. Průměrné hodnoty +- standartní odchylka jsou z nejméně 100 neuronů ze dvou nezávislých experimentů provedených dvakrát.

Délka neuritů cerebelárních neuronů nebo neuronů DRG na transgenních astrocytech byla přibližně o 15% až 50% delší v porovnání s délkou neuritů u astrocytů divokého typu (Tabulka 1). Protilátky proti jaterním membránám neovlivnily délku neuritů na astrocytických jednovrstvách ze zvířat divokého typu nebo transgenních zvířat (Obr. 10, Tabulka 1). Preinkubace astrocytických jednovrstev s protilátkami proti LI neovlivnilo význymně délku neuritůna buňkách z divokého typu zvířat.. Naopak, snížilo délku neuritů cerebelárních neuronů a neuronů DRG pěstovaných na byňkách z transgenních zvířat přibližně o 40%. V tomto ohledu je pozoruhodné, že polyklonální protilátky proti myší Llpoužité v této studii nereagují s neurony z kuřat (Martini et al., 1994a; údaje neuvedeny). Na imunofluorescenční analýze je však prokázáno, že tyto protilátky se váží • ··· stejně efektivně jako protilátky proti LI na astrocyty z transgenních zvířat a na malé cerebelární myší neurony (údaje neuvedeny).

Příklad 9

Imunofluorescence a mikroskopie Aurion-GP immunogold

Imunologické barvení LI a GFAP čerstvě zmražených příčně a podélně řezaných optických nervů nebo astrocytických jednovrstev divokého typu a transgenních zvířat byly provedeny jak bylo popsáno (Bartsch et al. (1989)). Pro dvojité značení jsme nejprve inkubovali astrocyty jako živé buňky s protilátkami proti LI (2 ug/ml v 1% BSA v PBS) při 4°C po dobu 30 min. Po permeabilizaci buněk pomocí 70% metanolu při -20°C po dobu 10 min. byly buňky inkubovány s protilátkami proti GFAP po dobu 30 min. při 4°C.

Pro výpočet délky neuritů v experimentech s kryostatovanou kulturou, když bylo použito zesílené barvení Aurion immuno R-Gent stříbro podle pokynů výrobce (Aurion, Immuno Gold Reagents & Accessories Custom labelling, Wageningen, Nizozemí)) s malými modifikacemi. Krátce, kultury byly fixovány 4% paraformaldehydem v PBS na 10 min. pri pokojové teplotě, inkubovány v 50 mM glycinu v PBS po dobu 10 min. a potom ponechány 15 min. v blokovacím pufru (BB, 0,5% BSA v PBS). Po třech promytích v BB, každé promytí 5 min., byly buňky inkubovány s protilátkami proti LI naředěnými do BB (2ug/ml) po 30 min. při pokojové teplotě. Poté byly kultury promyty 3 krát v BB, každé promytí 5 min., byly přidány sekundární protilátky naředěné 1:20 v BB na 1 hod. při pokojové teplotě. Po třech promytích v destilované vodě byly kultury fixovány v 2% glutaraldehydu v PBS na 10 min. při pokojové teplotě a znovu promyty 3 krát destilovanou vodou. Směs zesilovače a vývojky v poměru 1:1 byla poté přidána při pokojové teplotě. Po objeveni reakčního produktu byla sklíčka promyta 3 krát destilovanou vodou a uložena do glycerolu.

Imunoreaktivita na LI v optických nervech netransgenních myší byla omezena na nemyelinované sítnicové ganglionové buněčné axony (Bartsch et al. (1989)). V nepoškozených optických nervech z transgenních zvířat byla také nalezena slabá imunoreaktivita na LI ve spojení s buněčnými tělísky a procesy v radiálně orientovaných buňkách (Obr. 4A). Intenzita této imunoreaktivity na LI v transgenních optických nervech zesílila značně po poškození (Obr. 4B) a byla podobná v rozmístění jako imunoreaktivita na GFAP zjištěná v nepoškozených (Obr. 4B) nebo poškozených (neznázorněno) nervů divokého typu.

Exprese LI byla dále analyzována v kulturách astrocytů připravených z předních mozků šest dní starých transgenních zvířet. Žádná imunoreaktivita na LI nebyla detekována na astrocytech ze zvířat divokého typu (Obr. 5D). Naopak, buňky pozitivní na LI byly přítomny v kulturách z transgenních zvířat (Obr. 5A). Jak je demonstrováno při dvojitém imunologickém barvení, ty samé buňky se ukázaly být pozitivní na GFAP (Obr. 5B a E), což ukazuje, že buňky exprimující LI jsou skutečně astrocyty. Protože imunologické barvení LI bylo provedeno na živých buňkách, zdá se pravděpodobné, že je LI v transgenních zvířatech také exponována na buněčném povrch astrocytů in vivo.

• v · ·

Příklad 10

Analýza Western blot

Kvůli dalšímu výpočtu množství exprese LI v transgenních myších GFAP-L1 byly analyzovány pomocí analýzy Western blot detergentové extrakty homogenátů nepoškozených a poškozených (15 dní po poškození) optických nervů z myší divokého typu a transgenních dospělých myší Obr. 6).

Poškozené (15 dní po poškození) a kontralaterální nepoškozené optické nervy z 8 dní starých zvířat byly vyčištěny od jiných tkání a poté zmraženy v tekutém dusíku. Bylo dbáno aby pouze myelinované distální, ale nikoliv imunoreaktivní na LI nemyelinované a částečně myelinované proximální oblasti nervů byly použity. Nervy byly zmraženy a rozmraženy 10 krát před sonikací v sonikátoru Branson B15 při 4°C po dobu 5 min. Tkáně byly potom homogenizovány v homogenizátoru Dounce v homogenizačním pufru (1% Triton X-100, 2 M močovina, 5 mM benzamidin, 0,1 mM jodoacetamid, 1 mM fenylmethansulfonylfluorid, 5 mM Na-p-tosyl-L-lysinchloro-methyl keton v PBS). Homogenáty byly vyčištěny centrifugací při 16000 g při 4°C po dobu 15 min. Supernatanty byly ponechány s methanol/chloroformem aby se vysrážely proteiny jak bylo popsáno ve Wessel et al. (1984). Proteinová složka byla stanovena v supernatantu (Pierce). Po provedení SDS-PAGE na 7% plochých gelech při redukčních podmínkách byly proteiny (25 ug) analyzovány pomocí analýzy Western blot s polyklonálními protilátkami proti LI (0,4 ug/ml). sekundární protilátky konjugoné s peroxidázou z ředkvičky (2 ug/ml) byly detekovány pomocí blotovací detekční soupravy ECL (Amersham). Denzitometrická analýza imunoblotů ukázala, že exprese LI v nepoškozených optických nervech transgenních zvířat byla přibližně o 40% a 13% (linie 3426 a 3427) vyšší než v nepoškozených optických nervech zvířat divokého typu. Exprese LI v poškozených transgenních nervech byla o 310% a 200% (linie 3426 a 3427) vyšší než u poškozených nervů zvířat divokého typu. Porovnání mezi poškozenými a kontralaterálními nepoškozenými optickými nervy ze zvířat divokého typu odhalilo sníženou expresi proteinu LI o 40% na poškozené straně. Naopak, množství proteinu LI v poškozených nervech linii 3427 a 3426 stouplo o přibližně 30% v porovnání s nepoškozenými kontralaterálními stranami. Hladina exprese LI v linii 3426 byly přibližně o 35% a 25% vyšší než v linii 3427 pro nepoškozené a poškozené optické nervy.

Příklad 11

Obnovený růst axonů v optickém nervu in vitro až 8 týdnů staré transgenní myši GFAP-L1 a myši divokého typu byly utraceny a po 14 dnech sledovány na fluoresceinem značený biotin ester za účelem označení sítnicových ganglionových buněčných axonů postupným značením. Výsledky jsou znázorněny na Obr. 11 a 12. Každý bod představuje jedno zvíře.

* r

Příklad 12

Identifikace hranice mezi homologními opakováními 2 a 3 fibrinového typu III v nervové buněčné adhezní molekule LI jako neuritový růst podporující a signál přenášející domény

Ke stanovení domén v nervové buněčné adhezní molekule LI odpovědných za růst neuritů byly vytvořeny monoklonální protilátky proti LI a jejich vliv na růst neuritů malých cerebelárních neuronů v kultuřě byl sledován. Když bylo 11 protilátek použito jako substráty, pouze protilátka 557.B6, která rozeznává epitop reprezentovaný syntetickým peptidem obsahujícím aminokyseliny 818 až 832 na hranici mezi homologními opakováními 2 a 3 fibrinového typu III, byla stejně účinná jako LI v podpoře růstu neuritů, zvýšení hladiny intracelulárního Ca₂₊ a stimulaci spotřeby inositol fosfátů. Tato zjištění dokazují, že růst neuritů a změny v těchto druhých přenašečích jsou shodné. Tato shoda byla potvrzena schopností antagonistů kanálů Ca₂₊ a toxinu černého kašle inhibovat růst neuritů na LI a protilátce 557.B6. Tato pozorování ukazují ponejprve na odlišné místo na LI vázané na buněčném povrchu, jako na prominentní signál přenášející doménu, přes kterou se ukazují probíhat rozpoznávací děje pro spuštění růstu neuritů, zvýšení spotřeby inositol fosfátů a zvýšení hladiny intracelulárního Ca₂₊.

Příklad 13

Imunoreaktivita L2/HNK-1 v reinervovaném periferním nervu: přednostní exprese v motorových s axonem asociovaných Schwannových buňkách

Karbohydrátový epitop L2/HNK-1 (dále uváděný L2) je exprimován v dospělé myši myelinovanými Schwannovými buňkamiventrálních kořenů a svalových nervů, ale zřídka dorzálních kořenů a nebo kožních nervů. Protože substrátově potažené glykolipidy L2 podporují růst pěstovaných motorových, ale nikoliv smyslových neuronů, L2 tak ovlivňují preferenční reinervování svalových vervů skrz regeneraci motorových axonů in vivo.

Vliv regenerujících se axonů na expresi L2 způsobenou reinervovanými Schwannovými buňkami bylo proto analyzováno vedením motorových a smyslových axonů do svalových a kožních větví femorálních nervů osm týdnů starých myší. Regenerující se axony z kožních větví nevedly k imunocytochemicky detekovatelné expresi L2 ve svalových nebo kožních nervových větvích. Axony regenerující se ze svalových větví vedly k slabé expresi L2 od několika Schwannových buněk kožní větve, ale vyvolaly silnou expresi L2 od mnoha Schwannových buněk svalové větve. Myelinové Schwannovy buňky předešle asociované s motorovými axony se tak lišily od předchozích smyslových s axonem asociovaných myelinových Schwannových buněk v jejich schopnosti exprimovat L2, když jsou spojeny s motorovými axony. Toto zvýšenní exprese L2 během rozhodujících stádií reinervace způsobují motorové axony regenerující se do vhodné, svalové dráhy s výhodou nad těmi, které se regenerují do nevhodné, smyslové dráhy.

Příklad 14

LI ve zpevnění paměti při pasivním vyhýbacím testu u kuřat

Cvičení jednodenních kuřat při jedné zkoušce na pasivním vyhýbacím testu, při kterém se kuřata učí potlačovat tendenci klovat na malou lesklou kuličku, když je napuštěna hořce chutnajícím methylanthranilátem, má za následek časově závislou buněčnou a molekulární kaskádu kulminující v přetvoření presynaptických a postsynaptických elementů ve dvě diskrétní oblasti předního mozku, střední mediální hyperstriatum ventrale (IMHV) a Lobus parolfactorius (LOP) (Rose (1991) Trends In Neurosciences 14:390397). Kaskáda zahrnuje dvě odlišné vlny glykoproteinové syntézy, jak je to zřejmé ze zvýšené inkorporace fukózy, vyskytující se jak v IMHV tak v LPO v různých časech po cvičení. Obě vlny jsou nezbytné pro dlouhotrvající (tj. 24 hodin a déle) udržení paměti ve vyhýbacím testu, ve kterém je zřejmá oslabení u kuřat, která by se jinak vyhnula předchozí hořké kuličce a klove do suché kuličky v testu.

Za předpokladu úlohy LI při zprostředkování mezibuněčného kontaktu byla předložená stusie podstoupena aby stanovila, jestli LI patří mezi glykoproteiny spojované s učením, které se účastní na tvorbě vln syntézy glykoproteinů, a jsou tak nezbytné pro tvorbu paměti. Jestliže je tomu tak, protilátky proti LI, které jsou podávané ve vhodném čase vzhledem ke cvičení, by měly zabránit synaptické přestavbě nutné pro dlouhotrvající paměť a proto produkovat zeslabení provádění cvičení. Podobně, jestliže extracelulární domény molekuly LI hrají nějakou roli v rekogničních a adhezních procesech, které jsou potřebné pro synaptickou přestavbu a stabilizaci, exogenně podávané fragmenty extracelulární domény, které se budou vázat homofilně k endogenní molekule, budou narušovat tento proces.

Protilátky a fragmenty

Polyklonální protilátky byly připraveny v králících imunizací s imunoafinitně purifikovanou LI (Ng-CAM, 8D9) následované provedeným imunizačním postupem (Rathjen et al. (1984)). LI byla izolována z jednodenních kuřecích mozků pomocí monoklonální protilátkové kolony 8D9 (Lagenaur a Lemmon (1987) Proč.Nati. Acad. Sci. USA 84:7753-7757) opět podle zavedeného postupu (Rathjen et al. (1984)). Protilátky byly izolovány ze séra získaného po třetí imunizaci pomocí Protein G Sepharosy (Pharmacia LKB) podle pokynů výrobce. Rekombinantně exprimované fúzované proteiny v E. coli reprezentující šest imunoglobulinových (Ig-I-VI) a pět fibronektinových (FN1-5) opakování byly připraveny jak bylo popsáno v Appel et al. (1993).

Sodium dodecylsulfátová elektroforéza v polyakrylovém gelu (SDS-PAGE) a imunobloty kuřecích subcelulárních frakcí ul proteinu z mozkového homogenátu, z hrubých membrán, z rozpustných frakcí (Burchuladye et al. (1990) Brain Res. 535:131-138) a z postsynaptických nahromadění (Murakami et al. (1986) J. Neurochem. 46:340-348), všechno z jednodenních kuřecích mozků, bylo separováno na SDS-PAGE za redukujících podmínek na 5 až 15% polyakrylovém gradientovém gelu (Laemmli (1970) Nátuře 227:146-148), a potom bylo vše přeneseno na nitrocelulózu (Burnette (1981) Anal. Biochem. 112:195-203). Po inkubaci přes noc s protilátkami proti LI při naředění 1:1000 v Trisem pufrovaném roztoku, pH 7,2, obsahujícím 5% sušené mléko bez tuku, byly detekovány imunoreaktivní proužky podle předešle popsaného způsobu (Scholey et al. (1993) Neurosciences 55:499-509).

Cvičební a testovací postupy

Jednodenní Rossova kuřata obou pohlaví, vylíhnutá v inkubátorech, byla přemístěna v párech do malých klecí, předběžně cvičena na klování do malé (2,5 mm) chromové kuličky namočené do methylanthranilátu, jak bylo popsáno v Lossner a Rose (1983) J. Neurosciences 41:1357-1363. Ptáci, kteří klovali do hořké kuličky osvědčili stereotypní zápornou odpověď tím, že mohutně potřásali hlavou a vraceli se zpět od kuličky. 24 hodin po cvičení byla zvířata testována na přítomnost suché chromové kuličky shodné s tou předchozí. Zadržení pasivního učení se vyhýbat kuličce bylo vidět u zvířat, která se vyhýbala testované kuličce. Při každém opakování tohoto protokolu bylo cvičeno a testováno 24 až 36 kuřat, více než 80% cvičených, neinjikovaných kuřat se normálně vyhýbalo kuličce v testu za těchto podmínek, i když zde bylo někdy snížení vyhýbání se u ptáků injikovaných kontrolním roztokem. Naopak, ptáci, kteří jsou cvičeni na namočenou kuličku do vody, klovali do suché kuličky hodně a jejich výsledek vyhýbání byl stěží nad 5 až 10%. Celý test a cvičení bylo prováděno rutinně experimentátorem, který nevěděl, která zvířata jsou která.

Injekce

Protilátky LI a fragmenty FN1-5 a Ig I-VI byly dializovány přes noc proti 0,9% fyziologickému roztoku a koncentrace byla pravena na 1 mg/ml pro LI a 250 Ug-ml pro fragmenty. Kuřata dostala dvoustranné intrakraniální injekce do středního mediálního hyperstriata ventrale (IMHV) 10 ul protilátek LI na jednu hemisféru; kontrolní zvířata dostala podobné injekce fyziologického roztoku. Přesné dopravení do IMHV bylo provedeno pomocí speciálně navrženého držáku hlavy a zapouzdřené Hamiltonovy stříkačky (Davis et al. (1982) Pharm. Biochem. Behav. 17:893-896). Kuřata dostávší ze stříkačky jak fyziologický roztok tak protilátky před cvičením nebo testem nevykázala žádnou významnou změnu chování a klovala do kuličky během cvičení podle předpokladu. Velký extracelulární objem mozku nově vylíhnutých kuřat znamená, že injikováná dávka je dobře tolerována. Předešlé oznámení ukázalo (Schley et al. (1993)), že po injekci může dojít k malé difúzi protilátek z injikovaného místa. Přesnost umístění injekce byla rutinně monitorována vizuální kontrolou mozků post mortem. Při každém opakování experimentu byla vyhodnocena stejně velká skupina kuřat, která byla injikováná buď fyziolofickým roztokem a protilátkou nebo fragmentem, v experimentu s LI byly skupiny kuřat injikovány fyziolofickým roztokem nebo protilátkou v jednom z osmi časových bodů vzhledem ke cvičení; 2 hod. nebo 30 min. před cvičením, nebo +1 hod., +3 hod., +4 hod., +5,5 hod., +8 hod., + 12 hod. po cvičení, na základě předchzích pozorování bylo předvídáno, že jakékoliv efekty budou pozorovány u ptáků jak po 30 min., tak po 5,5 hod. po cvičení, a počet opakování těchto časových bodů byl podle toho větší (N=17, 28, 17, 19, 18, 21, 19 a 18 zvlášť pro injekce protilátky). Fragmenty FN1-5 a Ig I-VI LI byly injikovány buď po 30 min. nebo po 5,5 hod. a retenční test proveden po 24 hod. Retence ve skupinách kuřat s injekcemi fyziologického • · roztoku a protilátek proti LI nebo fragmentů LI byla porovnány statisticky přes chí². Výsledky jsou znázorněny na Obr. 13 a 14.

Příklad 15

Účast LI a NCAM na dlouhotrvající potenciaci

Transverzní hypokampální řezy (400 um) z halothenem anesteziovaných samčích krys kmene Wistar (180-220 g) byly připraveny podle standardních technik. Řezy byly udržované v malých komůrkách a zpočátku oživované 45 min. v hypermolární (320 mOsm/kg) umělé cerebrospinální tekutině (ACSF) při pokojové teplotě. Teplota lázně byla poté zvýšena na 30°C a médiu bylo vyměněno na normotonické ACSF (307 mOsm/kg) obsahující (v mM): NaCl, 124,0; KC1, 2,5; Mg₂SO₄, 2,0; CaCl₂, 2,5; KH₂PO₄, 1,25; NaHCO₃, 26,0; glukóza, 10; sukróza, 4; probubláváno 95% O₂/ 5% CO₂ (pH 7,4); množství perfůze: 0,75 ml/min. Schafferova kolaterálně spojová vlákna byla stimulována stočenými platinovími a iridiovými drátky (50 um v průměru) umístěnými v oblasti striatum radiatum v oblasti CA1. Stimulační test sestával z monofázových impulzů trvajících 100 us každých 30 sekund a síla stimulace byla upravena aby se získalo 30% maximální amplitudy EPSP (maximální EPSP bez posunutého populačního trnu). Hodnoty EPSP byly zaznamenány z oblasti CA1 stratům radiatum pomocí dvou skleněných mikropipet (2M NaCl, 1 až 5 MOhm) umístěné přibližně 300 uM od stimulační elektrody na každé straně.

Po stabilním záznamu po dobu nejméně 15 min. byly injikovány protilátky a proteinové fragmenty do dendritického pole CA1 v blízkosti (50 až 75 um) jedné záznamové elektrody (ta elektroda, pozorně nastavená na 30%) pomocí modifikovaného mikroinjekčního systému (Nanolitrový injektor, WPI) kontinuálně dopravujícího 5 nl každých 10 sekund až do konce experimentu pokud není uvedeno jinak. Promytí protilátek s následnou indukcí LTP nebylo možné kvůli zřejmým důvodům, ale bylo ověřeno, jestli se LPT může indukovat uvnitř každého řezu záznamem z druhé elektrody, kde nebyly protilátky aplikovány. I když nepronikl hrot injekční mikropipety do řezu, byla někdy pozorována malá redukce v amplitudě EPSP, když se s injekcí začínalo. Tento objemový artefakt byl nezávislý na druhu injektované látky. Proteiny byly dialyzovány proti 20 mM PBS při pH 7,4 pokud není uvedeno jinak a koncentrace vztaženy na koncentrace v pipetě.

min. po začátku mikroinjikování byla indukována LTP s vypuknutím stimulace theta (TBS) sestávající ze tří sledů po 4 sekundách; každý sled sestával z deseti vysokofrekvenčních nárazů 5 pulzů při 100 Hz a nárazy byly odděleny 200 ms (Reichardt et al. (1991) Annu. Rev. Neurosci. 14:531-570). Trvaní stimulačních pulzů bylo zdvojnásobeno během TBS. Indukci LTP mohlo být úplně zabráněno perfuzí 10 uM D(-)-2-amino-5fosfonopentanoovou kyselinou (D-AP5; Tocris). Záznamy z celých buněk byly získány z neuronů CA1 pomocí slepého svorkového systému se svorkovým amplifikátorem EPC-9. Teplota lázně byla 30°C. Svorkové elektrody byly vytaženy z 1,5 mm borosilikovaného skla OD a měly rezistence mezi 3 a 8 MOhmy. Pipety nebyly ani vyžíhány plamenem ani potaženy. Elektrody byly rutinně namočeny do roztoku obsahujícím (v mM): glukonát draselný, 129; KC1, 5; MgCl₂, 1; CaCl₂, 1; N-(l-hydroxyethyl)-piperazin-N'-(2ethansulfonová kyselina) (HEPES), 5; l,2-bis(2-aminofenoxy)ethan-

Ν,Ν,Ν',Ν',-tetraoctová kyselina (BAPTA), 5; Na-ATP, 10 a Na-GTP, 0,3, s pH upraveným na 7,3 KOH. Sériová rezistence nebyla kompenzována. Odpovědi byly zprůměrovány ze tří až čtyř signálů buď vytištěny pro vizuální analýzu nebo uloženy na disk pro pozdější analýzu. Statistická vyhodnocení byla provedena pomocí analýzy variací s plánovitými srovnáními a kontrastní analýzou; čas byl uvažován jako závislá proměnná s jednou úrovní opakovaných měření. Anti-Ll (Rathjen et al. (1984)), anti-Ig I-VI (Hyneš et al. (1992)) a anti-játrové membránové protilátky (Linder et al. (1983)) byly vyrobeny jak bylo předešle popsáno. Výsledky jsou znázorněny na Obr. 15.

Domény I-VI podobné Ig a homologní opakování I-V typu FN III byly exprimovány v bakteriích a purifikovány jak bylo popsáno VI (Hyneš et al. (1992)). Protilátky proti NCAM a axoninu-1 byly vyrobeny jak bylo popsáno (Larson et al. (1986) Science232:985-988; Bailey et al. (1992) Science 256:645-649). Produkce oligomanosidových glykopeptidů z ribonukleázy B a kontrolních glykopeptidů z asialofetuinu byla popsána (Larson et al. (1986)). Výsledky jsou znázorněny na Obr. 16.

Receptorem NMDA zprostředkované EPSP byly izolovány podáním 30 uM non-NMDA blokovacího činidla 6-cyano-7-nitroquinoxalin-2,3-dionu (CNQX; Tocris) 20 min. před podáním protilátek nebo glykoproteinů. Na konci každého experimentu bylo ověřeno, že D(-)-2-amino-5fosfonopentanoová kyselina (D-AP5; Tocris) úplně potlačila tyto odpovědi. Výsledky jsou znázorněny na Obr. 17.

Příklad 16

LI má nervově ochranný efekt

Byl proveden experiment na další vysvětlení aktivity LI v nervové tkáni CNS. Alikvoty vzorků myších mesencefalonových buněk byly natřeny a pěstovány na čtyřech separátních miskách s médii připravenými, jak je uvedeno níže: první kontrolní miska byla natřena pouze poly-L-lysinem; druhá miska byla natřena poly-L-lysinem a LI; třetí kontrolní miska byla natřena poly-L-lysinem a lamininem; Čtvrtá miska byla natřena poly-Llysinem, lamininem a LI. Všechny misky dostaly alikvotní množství buněk a byly inkubovány za stejných podmínek. Po 7 dnech byly všechny misky obarveny na přítomnost dopaminu a výsledek byl pozorován. Misky, které byly natřeny LI vykazovaly růst o 200% až 400% větší než kontroly. Misky natřené lamininem vykazovaly větší růst neuritů, ale ne více než u misek s LI. Výsledky ukazují, že LI má velký nervově ochranný efekt, protože životnost buněk měřená na počet buněk, které rostly, byla velmi zvýšena proti kontrolám.

Příklad 17

Rozpustná forma LI (Ll-Fc) je funkčně aktivní a je silné činidlo v udržování živých nervů

Rozpustná forma LI byla vytvořena v buňkách COS jako rekombinantní spojený protein Ll-Fc postupem popsaným v Neuron 14:57-66, 1995. Rekombinantní protein byl purifikován afinitní chromatografii s proteinem A a byl použit jako substrát natřený na plastický materiál a nebo jako rozpustná molekula přidaná do kultivačního média v 1 až 10 ug/ml. Růst neuritů a přežívání mesencefalických neuronů ode dne 17 krysích embryí byl zkoušen v kultuře po 7 dnech udržování in vitro. Dopaminergické neurony byly rozlišeny imunologickým barvením na dopamin-beta-hydrolázu (DBH) a spočítány pomocí morfometrického vybavení IBAS. Kultury s přidanou rozpustnou Ll-Fc byly udržovány na poly-DL-otnithinu (PORN) a substrátově potažené Ll-Fc byly přidány na vršek předešle potažených PORN (za podmínek popsaných v Appel et al., J. Neuroscience 13:4764-4775, 1993. NCAM-Fc byla použita jako kontrola.

Tabulka - Přežívání a růst neuritů neuronů DBH’ po 7 dní in vitro substrátově natřené LI rozpustná LI pouze PORN (kontrola) počet neuronů

129 +- 20 +- 7 +- 2 délka neuritů

179 +- 40

135 +- 27 +- 9

Střední hodnoty jsou z alespoň tří nezávislých experimentů +- SEM

Počty jsou z jednotky pole

Délky všech neuritů (celková délka neuritů) na jeden neuron byly stanoveny (v um)

Rozpoznání mezi nervovými buňkami důležitá podmínka pro vývoj funkční nervové soustavy. Rozpoznávací molekuly jsou exprimovány na buněčném povrchu, kde zprostředkovávají interakce mezi sousedícími buňkami, např. jsou to cadhedriny, nebo interakce mezi buněčným povrchem a extracelulárním matrixem, např. jsou to integriny (Takeichi, 1991; Ruoslahti, 1988; Hyneš, 1992). Nedůležitější rodinu rozpoznávacích molekul zastupují imunoglobulinu (Ig) podobné domény. Ig podobné domény reflektují společného předka imunoglobulinů a buněčných adhezních molekul, obě molekuly se účastní specifických rozpoznávacích proceců (Edelman, 1970). V nervové soustavě obsahuje rodina Ig více než 24 různých molekul. Některé molekuly obsahující Ig podobné domény mají mnoho funkcí v extracelulární doméně: receptory pro cytokiny a neurotropiny mají vysoké afinitní funkce stejně jako rozpoznávací vlastnosti (Tannahill et al., 1995; Pulido et al., 1992). Třírozměrná struktura Ig podobných domén je podobná FN podobným opakováním (Main et al., 1992; Leathy et al., 1992)., což jsou také strukturní motivy v několika molekulách extracelulárního matrixu, jako je fibronektin, členové tenascinové rodiny a jiné (Williams a Barclay, 1988; Baron et al., 1992; Erickson, 1993). Nervové rozpoznávací molekuly rodiny Ig mají charakteristický časový, prostorový a buněčně typový expresní profil (přehledné články, viz Edelman, 1988; Schachner, 1991; Rathien a Josseli, 1991; Rutiehauser, 1993). Rozpoznávací molekuly této rodiny se funkčně překrývají v tom, že všechny podporují adhezi buněk a růst neuritů. Některé rozpoznávací molekuly jsou silně homofilické, tj. navzájem se vázající, kdežto jiné jsou především heterofilické, tj. váží se na nestejné partnery, kterými jsou často jiní členové rodiny Ig nebo molekuly extracelulárního matrixu (Brůmmendorf a Rathjen, 1993, 1994). Sočasná znalost funkčních vlastností individuálních Ig podobných domén a FN podobných opakování vervových rozpoznávacích molekul ukazuje na různé a překrývající se funkční • · ···· · * · · · 9 9 • · · · · · 9 ·«·· • · ·· · · · · · • ··· · · · ···· · ·«···· · · · • 9 · · ·· ·· ··· · · 9 9 vlastnosti při rozpoznávaní, růstu neuritů a odpuzování (Gennarini et al., 1991; Frel et al., 1992; Taylor et al., 1993; Appel et al., 1993, 1995; Pesheva et al., 1993; Feisenfeld et al., 1994; Hoim et al., 1995).

Mezi nervovými rozpoznávacími molekulami rodiny Ig, rodiny molekul podobných nervové rozpoznávací molekule LI se ukazuje velká podobnost ve funkci a struktuře. Jsou to silné promotory růstu neuritů a jsou přiměřeně exprimovány během pozdního vývoje, nejvíce v době prvního výskytu axogeneze. Jsou přednostně exprimovány v neuronech, i když někteří členové rodiny LI se také vyskytují v gliových buňkách, které samy jsou podpůrné pro neurity (Martini a Schachner, 1986; Bixby et al., 1988; Seilheimer a Schachner, 1988).

V experimentech, které následují, je identifikována a charakterizována jiný člen rodiny LI, kterým je blízký homolog LI, a to jest CHL1. CHL1 obsahuje šest Ig podobných domén a FN podobných opakování, z nichž čtyři jsou vysoce homologní k FN podobným opakováním jiných členů rodiny LI. Neúplné FN podobné opakování je umístěno v oblasti ležící blízko membrány, což je nejvíce variabilní oblast mezi molekulami podobnými s LI. Jiné vlastnosti CHL1 zdílené se členy rodiny Lljsou exprese v pozdním vývojovém stádiu v nervové soustavě a vysoká míra N-glykosidace, včetně exprese karbohydrátu HNK-1.

Příklad 18

Zvířata

Myši ICR a krysy Wistar byly používány ke tkáňovým preparacím.

Protilátky

Polyklonální protilátky vyvolané proti rekombinantně exprimované extracelulární části CHL1 (aminokyseliny 499 až 1063 (Obr. 18 a 19)) a LI (aminokyseliny 126 až 1981 (Appel et al., 1993)) byly vyvolány v králících jak bylo popsáno (Rathien a Schachner, 1984). Za účelem vyvolání protilátek proti CHL1 bylo do králíka injikováno 200 ug purifikovaného peptidu následované čtyřmi dalšími injekcemi po 100 ug v intervalech tří týdnů. Protilátky proti LI byly zakoncentrovány ze séra vysrážením amónium sulfátem (13,5 mg/ml). Monoklonální krysí protilátka 412 byla použita k identifikaci karbohydrátového epitopů HNK-1 (Kruše et al., 1984). Monoklonální protilátky proti gliovému fibrilárnímu kyselému proteinu (GFAP) byly získány od Boehringera (Mannheim). Monoklonální protilátky proti antigenu Ol byly popsány (Sommer a Schachner, 1981).

Purifikace nervových adhezních molekul

LI, N-CAG a MAG byly imunoafinitně purifikovány z detergentových extraktů hrubých buněčných frakcí z dospělého myšího mozku pomocí kolon s monoklonálními protilátkami (Rathien a Schachner, 1984; Falssner et al., 1985; Poltorak et al., 1987).

Knihovny cDNA a jejich testování

Preparace knihovny lambda gtll odvozené z poly(A)* RNA z mozků z dní starých myší a testování této knihovny imunoafinitně purifikovanými polyklonálními protilátkami proti LI bylo provedeno podle (Tacke et al.,

1987). Za účelem získání delších klonů cDNA byla vytvořena nová knihovna DNA: RNA byly purifikována z mozků 6 až 14 dní starých myší způsobem přes guanidium thiocyanát/kyselý fenol (Chomezynski a Sacchi, 1987). Poly(A)* RNA byla nabohacena přes dvě po sobě následující pasáže přes kolonu s oligo(dT) celulózou (Sambrook et al., 1989). 8 ug poly(A)* RNA bylo použito na syntézu oligo(dT) primerované dvouvláknové cDNA pomocí soupravy na syntézu cDNA (Amersham). cDNA byla vybrána podle velikosti a ligována do plazmidu pXMDl s adaptory DralII obsahujícími místo Sáli (Kluxen et al., 1992). Za účelem propagace a amplifikace knihovny byl použit kmen E. coli TOPIO (Invitrogen, Nizozemí). Při testování byly alikvoty přímo naneseny na nylonové membrány (BIODYNE™ Pall) s hustotou 2xl0⁴ bakterií na filtr (138 cm²). Replikované filtry byly inkubovány přes noc při 37°C. Poté byly bakterie lyžovány (0,5M NaOH; 1,5M NaCl), filtry byly neutralyzovány (3M NaCl; 0,5M Tris-HCl pH 8,0), promyty ve 2xSSC, vysušeny a zapékány 2 hod. při 80°C. Nylonové membrány byly prehybridizovány, pak hybridizovány s fragmentem dlouhým 1 kb (HincII/KpnI) z CHL1 (odvozeno z knihovny lambda gtll) radioaktivně označené náhodným primerováním (Boehringer Mannheim) podle pokynů výrobce, promyty za silně stringentních podmínek při 42°C a potom exponovány na film jak bylo popsáno (Sambrook et al., 1989). Šest pozitivních klonů bylo dále charakterizováno restrikčním mapováním a sekvencováním podle standardních protokolů (Sambrook et al., 1989). jeden klon (pX#2), který obsahoval insert CHL1 dlouhý 4,43 kb, byl dále charakterizován.

Sekvencování DNA a sekvenční analýza

Nukleotidové sekvence byly stanoveny řetězovou terminační metodou dideoxy (Sanger et al., 1977) pomocí dvouvláknové DNA jako předlohy pro T7 DNA polymerázu (Pharmacia) a syntetických oligonukleotidů jako primerů. Sekvence cDNA byly sestaveny a analyzovány programem DNASTAR (DNASTAR, lne., Londýn). Pokud neuvedeno jinak, byly aminokyselinové sekvence porovnány pomocí Jolun Heinovy metody (Hein, 1990) (velikost mezer =11, délka mezer = 5, hodnota K = 2).

Porovnání proteinových sekvencí

K výpočtu indexu podobnosti (%) pro srovnání vzdáleností mezi konzervovanými aminokyselinovými zbytky bylo několik rozdílných proteinů obsahujících šest Ig podobných domén a aledpoň čtyři FN podobné domény porovnáno v konzervovaných aminokyselinových zbytcích v Ig podobných doménách (cysteiny, kde jsou můstky S-S) a v FN podobných opakováních (tryptofan a tyrosin/fenylalanin). Počet aminokyselinových zbytků mezi těmito konzervovanými místy byl stanoven. Tento počet je uveden jako konzervovaná vzdálenost. Průměrná hodnota vzdáleností, tj. konsensní vzdálenosti a standardní odchylky (SD) mezi členy rodiny LI byla vypočítána. Hodnota SD byla zaokrouhlena na nejbližší vyšší celé číslo. Vzdálenost pro každý protein byla porovnána se průměrnou vzdáleností a považována za shodnou, pokud se hodnota vzdálenosti rovnala průměrné hodnotě +- SD (= konsensní vzdálenost). Počet shod až do 18 konsensních vzdáleností byl vypočítán pro každý indivuální protein (index podobnosti = počet shod / 19 x 100). Například: V proteinu CHL1 se shoduje 16 hodnot vzdálenosti ačkoliv tři ze všech kritérií se neshodují. To dává index podobnosti 16 - 19 neboli 84% pro CHL1.

Příklad 19

Buněčná kultura a exprese CHL1 a LI v buňkách COS-1

Insert klonu pX#2 dlouhý 4,43 kb byl ligován do pXMDl štěpeného Sáli (Kluxen et al., 1992; Kluxen a Lobbert, 1993). Subfragment EcoRI (plazmid polylinker)/PvuII pb 4048) myší cDNA LI (Moos et al., 1988) byl ošetřen T4 DNA polymerázou a ligován do pXMDl.

Buňky COS-1 udržovány v DMEM (0,1% glukóza) a doplněny 10% (v/v) fetálním telecím sérem při 37°C v zvlhčené atmosféře s 5% CO2. DEAE dextranem zprostředkovaná transfekce DNA byla provedena jak bylo popsáno (Kluxen et al., 1992) s některými modifikacemi. Krátce, buňky byly stočeny na hustotu 10000 buněk na cm². O jeden den později, po dvouch promytích s DMEM (0,45 % glukóza), bylo médium nahraženo transfekčním roztokem složeným z DMEM doplněným 10% (v/v) Nu-sérem (Becton Dickinson, Švýcarsko), 0,4 mg/ml (w/v) DEAE-dextranem (Pharmacia), 50 uM chloroquinonem a 1,25 ud/ml DNA (w/v) (4 ml na misku o průměru 10 cm). Buňky byly inkubovány 4 hod. při 37°C a v 5% CO2. Potom bylo médium odstraněno a buňky byly inkubovány 2 min. ve fosfonátovém pufru (pH 7,3 obsahujícím 10% dimethylsulfoxid (v/v). Po dvou promytích s DMEM (0,45% glukóza) byl přidán DMEM doplněný 10%(v/v) fetálním telecím sérem a 20 ug/ml gentamycinu a buňky byly inkubovány v tomto médiu. O 24 hodin později byly buňky odděleny od stěny po inkubaci s 0,01% trypsinem a 0,0004% EDTA v Hanksově rovnovážném solném roztoku (HBSS) po dobu 5 min. a při 37°C., znovu rozetřeny kvůli imunichemii při hustotě 20000 buněk na cm² ve 24 komůrkových miskách (falkon) obsahujících poly-L-lysinem natřené skleněné otvory (11 mm v průměru) a inkubovány dalších 24 hodin . Pro analýzu Western blot byly buňky znovu rozetřeny na misky s tkáňovou kulturou a inkubovány dalších 48 hod.

Buňky PC 12 byly udržovány v DMEM doplněným 10%(v/v) fetálním telecím sérem a 5% (v/v) koňským sérem na kolagenem potažených miskách pro tkáňové kultury. Pro indukci buněk s nervovým růstovým hormonem (NGF) bylo médim odstraněno z jednovrstvý při 50% shlukování a nahraženo médiem se sníženým obsahem séra (5% koňské sérum) doplněným 100 ng/ml 7s-NGF (Sigma, Švýcarsko). Po dvou dnech inkubace byly buňky odděleny od stěny po inkubaci s 0,01% trypsinem a 0,04% EDTA, stočeny a podrobeny extrakci RNA.

Primární kultury astrocytů byly připraveny podle McCarthy a De Vellis (1980) s modifikacemi (Guénard et al., 1994) a použity k imunologickému barvení po jednom až dvou dnech in vitro. Primární kultury oligodendrocytů byly připraveny jak bylo popsáno v Laeng et al., (1994) a udržovány in vitro po dobu 12 dnů.

Příklad 20

Výroba protismyslové RNA

Insert klonu pX#2 dlouhý 4,43 kb byl ligován do pBS II SK štěpeného

Sáli (Stratagene) následované vystřižením fragmentu Apal (vektor)/AvrII (pb3330 (Obr. 18)) za účelem získání fragmentu cDNA CHL1 kódujícího extracelulární část proteinu (viz Obr. 18 a 19). Podobný konstrukt pro LI byl připraven ligací fragmentu EcoNI (plasmid polylinker)/EcoRI (pb 3304) cDNA LI (Moos et al., 1988) ošetřeného T4 DNA polymerázou a ligovaného do pBS II SK- štěpeného Smál. Plazmidy byly štěpeny Xbal a použity k syntéze protismyslové RNA značené ³²P pomocí T7 RNA polymerázy jak bylo popsáno (Melton et al., 1984).

Analýza Northern blot

Poly(A)* mRNA byla připravena z různých tkání právě narozených a 9 dní starých myší pomocí soupravy Oligotex™ Direct mRNA (QIAGEN lne., Dússeldorf, Německo) podle pokynů výrobce. Poly(A)* mRNA a značka RNA (žebřík RNA, GIBCO/BRL) byla podrobena elektroforéze na 0,8% formadid/agarózovém gelu a posléze přenesena na membránu Hybond-N (Amersham) pomocí kapilárního přenosu (Southern, 1975) v 20x SSC. Po vazebném spojení pomocí UV (OV-Stratalinker^R 1800, Stratagene, La Jolla, CA), bylo množství DNA přenesené a navázané na membránu zkontrolováno barvením methylenovou modří (Sambrook et al., 1989). Po prehybridizaci 2 hod. při 65°C byla membrána hybridizována pře noc s CHL1 a LI specifickými ³²P značenými protismyslovými próbami RNA v hybridizačním pufru (5xSSC, 2,5x Denhartův roztok, 50 mM Na₂PC>4 (pH 6,5), 0,1% SDS, 1 mM EDTA, 2 ug/ml DNA z lososího mlíčí, 50% formamid) při 65°C. Filtr byl potom 3 krát promyt při 65°C v 0,lx SSC, 0,1% SDS po dobu 1 hod. a exponován na film.

Příklad 21

Exprese a purifikace rekombinantního proteinu CHL1 v E. coli cDNA-fragment CHL1 dlouhý 1,7 kb (MscI; pb 1791 (který pochází z klonovacího místa vektoru a 5'konce klonu CHL1 odvozeného z lambda gtll) a BsmAI;pb 3494) kódující šestou Ig podobnou doménu (Ig VI) a FN podobná opakování 1, 4, 5 (viz Obr. 18 a 19b) byl subklonován do unikátního restrikčního místa BamHI vektoru pET (Studier a Moffatt, 1986). Správná sekvence plazmidu byla potvrzena sekvencováním. Kmen E. coli BL21 (DE3) byl transformován tímto plazmidem. Exprese a purifikace rekombinantního proteinu přes iontově výměnnou chromatografii byla provedena podle Appel et al. (1993). SDS-PAGE a barvení Coomassie ukázalo hlavní proužek s předpokládanou molekulovou hmotností (70 kD), který obsahoval alespoň 80% celkového proteinu (neukázáno).

Tkáňové frakce

Detergentové lyzáty celé tkáně byly připraveny homogenizací tkání v 40 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 1 mM fenylmethylsulfonylflurid (PMSF), 1% Triton X100 a udržovány v 4°C po 3 hod. za neustálého míchání. Rozpustná frakce byla oddělena od nerozpustného materiálu centrifugací při 100000 g.

Za účelem přípravy detergentových lyzátů membránových frakcí byly tkáně homogenizovány v lmM NaHCO₂ (pH 7,9, 0,2 mM CaCl₂, 0,2 mM

MgCl₂, 1 mM spermidin, 5 ug/ml aprotonin, 10 ug/ml trypsinový inhibitor ze sojových bobů, 1 mM PMSF a 0,5 mM jodoacetamid při 4°C. Membránové a • ·

4? · ♦·· · · · ···· · ·«·««· ·«· ···· ·· · · · · ♦ ·· · · rozpustné frakce byly potom odděleny a membránový sediment byl rozsuspendován v solubilizačním roztoku (20 mM Tris-HCl (pH 7,9), 0,15 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0,5% Triton X100, 5 ug/ml aprotonin, 10 ug/ml trypsinový inhibitor ze sojových bobů, 1 mM PMSF a 0,5 mM jodoacetamid).

Tranzientně transfektované buňky COS-1 byly dvakrát promyty s HBSS a inkubovány v 1 mM EDTA v HBSS po dobu 10 min. při 37°C. Buňky byly potom odstraněny pomocí ožehnutou Pasterovou pipetou a stočeny centrifugací při 200 g 10 min. při 4°C. Buňky byly lyžovány v 20 mM TrisHCl (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM jodoacetamid, 1 mM PMSF a 1% MP-40 a supernatant byl pročištěn centrifugací (13000 g). Stanovení proteinů bylo provedeno jak je popsáno v Bradford (1976).

Analýza Western blot

Proteiny byly odděleny pomocí SDS-PAGE (Laemmil, 1970) na 8% nebo 10% plochých gelech za redukčních podmínek a přeneseny na nitrocelulózové filtry (0,45 um, BA 85; Schleicher & Schuell, Dassel, Německo) kvůli imunodetekci podle Faissner et al., (1985) pomocí antiséra CHL1 (naředěno 1:500, 1:10000 pro ECL), polyklonální protilátky proti LI (naředěny 1:1000, 1:15000 pro ECL) monoklonální protilátky 412 (naředěny 1:1000, 1:10000 pro ECL) a alkalické s fosfatázou spojené sekundární protikrysí a protikráličí IgG. Navázané protilátky byly detekovány buď zesílenou chemiluminiscencí (ECL) podle pokynů výrobce pomocí blotovacích detekčních činidel (Amersham) a filmů nebo pomocí BCIP a NBT jako chromogenních substrátů.

Příklad 22

Enzymová spojovací imunosorbentní zkouška

Enzymová spojovací imunosorbentní zkouška (ELISA) byla provedena jak bylo popsáno v Husmann et al., (1992) s tou výjimkou, že proteiny byly natřeny v koncentracích 100 ng/ml. Antisérum CHL1 bylo použito v několika zředěních mezi 1:250 a l:2xl0⁶.

Deglykosilace CHL1

Detergentové lyzáty homogenátu mozkové tkáně (200 ul, proteinové koncentrace 6 mg/ml) ze 7 dní starých myší byly odděleny do rozpustné frakce a nerozpustného meteriálu centrifugací (viz Tkáňové frakce) a inkubovány s 0,5 jednotkami N-glykosidázy F nebo 2,5 jednotkami Oglykosidázy nebo s oběmi enzymy ve stejných koncentracích podle pokynů výrobce (Boehringer Mannheim, Německo). Lyzáty byly rozděleny na 10% gelech SDS-PAGE. Proteiny byly přeneseny na nitrocelulózu a inkubovány s antisérem CHL1 (1:500 naředěné) vyvolanému proti rekombinantnímu fragmentu proteinu CHL1 (viz Obr. 18).

Imunoprecipitace

Rozpustná frakce detergentových lyzátů homogenátu z mozkových tkání (proteinové koncentrace 300 mg/ml) z 9 dní starých myší (viz Tkáňové frakce) byla inkubována s 10 ul antiséra CHL1 nebo s polyklonálními protilátkami proti LI přes noc při 5°C v 5 ml pufru (20 mM Tris-HCl (pH

7,4), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA) obsahujícím 1% NP40 a 30 ul G-Sepharosy (Pharmacia/LKB). Po postupném promytí v pufrech obsahujících 0,1% NP40, 0,05% SDS a potom 20 mM Tris-HCl (pH 7,4) byly kuličky Sepharosy povařeny na 10 min. v 5x koncentrovaném nanášecím pufru (250 mM TrisHCl (pH 6,6), 10% SDS, 50% glycerolu, 0,5% bromfenolová modř, 25% Bmerkaptoethanol) a supernatant byl rozdělen na 10% gelech SDS-PAGE. Proteiny byly přeneseny na nitrocelulózu a detekovány polyklonálními protilátkami proti Ll, antisérem CHL1 nebo monoklonální protilátkou 412 pomocí analýzy Western blot.

Nepřímá imunofluorescence

Za účelem obarvení buněčného povrch (Schnitzer a Schachner, 1981) byly buňky COS-1 transfekované CHL1 a slepě (pouze vektor) naneseny do komůrek a inkubovány 30 min. při pokojové teplotě společně s primárními protilátkami (antisérum CHL1 (naředěno 1:100) nebo polyklonálními protilátkami proti Ll (naředěnými 1:200)) v DMEM obsahujícím 10% fetální telecí sérum, 10 mM HEPES (pH 7,3) a 0,02% NaN3 a potom se sekundárními protilátkami. Po imunologickém barvení byly buňky fixovány 4% paraformaldehydem ve fosfátovém pufru (pH 7,3) a ponechány v Moviolu (Hoechst) obsahujícím 2,5% jodid draselný. Pro dvojité imunofluorescentní barvení astrocytů a oligodendrocytů byla provedena inkubace primárních protilátek s povrchovými buněčnými antigeny jak bylo popsáno pro transfekované buňky COS-1. Potom byla provedena inkubace buněk s primárními protilátkami proti mezibuněčnými antigeny po permeabilizaci buněk methanolem při -20°C.

Příklad 23

Hybridizace in šitu

Za účelem vytvoření protismyslových prób cRNA označených digoxigeninem o stejné velikosti z příslušných částí CHL1 a Ll byly použity stejné konstrukty jako pro analýzu Northern blot. Smyslové próby byly vytvořeny z podobných konstruktů s inserty v opačné orientaci, všechny próby cRNA byly vytvořeny pomocí T7 RNA polymerázy následované alkalickým působením kvůli získání průměrné délky fragmentů 250 nukleotidů. Hybridizace in šitu byla provedena jak bylo popsáno (Bartsch et al., 1992; Dorries et al., 1994).

Výsledky a diskuze

Identifikace cDNA CHL1

Testování expresní knihovny lambda gtll na klony cDNA kódující buněčnou adhezní molekulu Ll přes polyklonální protilátky vyvolané proti imunopurifikované Ll z mozku (Tacke et al., 1987) identifikovalo klon 311. Tento klon obsahoval neúplnou cDNA homologní k Ll (34,1% podle Lipman a Pearson (1985)) a otevřený čtecí rámec dlouhý 2112 párů baží (pb) kódující 704 aminokyselin včetně cytoplasmové části. Kvůli izolaci klonů cDNA o úplné délce byl použit fragment DNA tohoto klonu na testování jiné knihovny cDNA. Bylo izolováno šest nezávislých klonů. Dva klony obsahovaly inserty dlouhé 4,2 a 4,4 kb, které obsahovaly úplnou kódující oblast blízkého homologa LI (CHL1). Klon obsahující insert dlouhý 4,4 kb byl dále zkoumán.

DNA a odvozené aminokyselinové sekvence a strukturní vlastnosti

Insert, který je dlouhý 4,4 kb, kóduje 5 'netranslatovanou oblast dlouhou 295 pb, otevřený čtecí rámec dlouhý 3627 pb a 3'netranslatovanou oblast dlouhou 518 pb (Obr. 18). I když je na 3' konci úsek oligo(A), jasný konsensní polyadenylační signál chybí. Sekvence kolem startovacího kodonu ATG (pozice 296, Obr. 18) nemá optimální konsensní sekvenci pro iniciaci translace (Kozák, 1987). Ale tento kodon ATG je vzat jako startovací kodon pro translaci na základě dvou důkazů. Proti směru translace je předcházen terminačními kodony ve všech třech čtecích rámcích a po něm následuje potenciální signální sekvence s místem štěpení předpokládaným po zbytcích 24 nebo 25 (hodnoty 8,65 a 6,40 podle algoritmu von Heijne (1986)) (Obr. 18).

Translace otevřeného čtecího rámce dává protein o délce 1209 aminokyselin s vypočítanou molekulovou hmotností 134,9 kD a profil charakteristický pro integrální membránový glykoprotein. Pravděpodobná extracelulární doména je složena z 1081 aminokyselin s 18 potenciálními místy pro N-glykosidaci (Obr. 18 a 19a) a více než 60 O-glykosilačních konsensních míst (neukázáno) (Pisano et al., 1993), po ní následuje transmembránová doména dlouhá 23 aminokyselin, jak je usuzováno z hydropatické analýzy podle Kyte a Doolittle (1982) (Obr. 19c). Tato doména je na svém N-terminálním konci ohraničena polárním zbytkem a na svém Cterminálním konci je ohraničena zásaditou aminokyselinou, což souhlasí pro transferový signál terminase (Obr. 18). Intracelulární oblast je složena ze 105 aminokyselinový zbytků.

Extracelulární oblast obsahuje dva hlavní strukturní motivy opakovaných domén, které jsou charakteristické pro rodinu LI: úsek dlouhý 685 aminokyselin s homologií k doménám podobným Ig a úsek dlouhý 472 aminokyselin s homologií k opakováním podobným FN (Obr. 1 a 2a). Všech šest domén podobných Ig obsahuje charakteristický pár cysteinových zbytků, které jsou umístěny ve vzdálenostech 47 až 54 aminokyselin od sebe (Obr. 19). Konzervovaný prolin (s výjimkou šesté domény podobné Ig) na konci struktury beta B ve spojení s úsekem typu C2 konzervovaných aminokyselin okolo druhého cysteinového zbytku v každé doméně (DXGXYXCXAXN) srovnává domény podobné Ig podle sady C2 (Williams a Barclay, 1988). mezi doménami podobnými Ig a transmembránovou oblastí jsou čtyři domény, které jsou homologní k opakováním podobným FN ve fibronektinu (Kornblihtt et al., 1985). Každá z těchto domén přibližně 100 aminokyselin obsahuje velmi konzervovaný tryptofan (s výjimkou prvního opakování podobného FN) a tyrosinové/fenylalaninové zbytky v N- a C-terminálních oblastech. Je zajímavé, že páté opakování podobné FN je pouze poloviční na rozdíl od jiných členů rodiny LI (Obr. 18). Jestli toto poloviční opakování podobné FN představuje jednu z několika alternativních sestřihových forem, jedna z nichž obsahuje úplnou doménu podobnou FN, se může stanovit způsoby jinými než je analýza Northern blot. V tomto kontextu je důležité, že nebyl nalezen žádný důkaz pro alternativní sestřih pomocí restrikčné analýzy šesti nezávisle izolovaných klonů (neukázáno). Alternativní sestřih této domény podobné FN byl pozorován u CAM/BRAVO, kde byly izolovány izoformy cDNA, kterým chybí páté opakování podobné FN (Grumet et al., 1991; Kayyem et al., 1992). Nepřítomnost páté domény podobné FN v kuřecím neurofascinu (Volkmer et al., 1992) je nejpravděpodobněji také způsobeno alternativním sestřihem, protože jeho krysí homolog, ankyrin vazebný glykoprotein (ABGP) (Davis et al., 1993), obsahuje pátou doménu podobnou FN. Takže CHL1 vnáší nový strukturní rys do rodiny LI: pouze čtyři a jedno poloviční opakování podobné FN je exprimováno (Obr. 19).

Jiným strukturním rysem CHL1 je přítomnost sekvence RGD (aminokyseliny 185 až 187) ve druhé doméně podobné Ig (Obr. 18). Tento tripeptid byl původně identifikován jako místo buněčného přichycení uvnitř desáté domény fibronektinu typu III (Pietschbacher a Rusolahti, 1984) a přispívá k vazbě na integrin (pro přehled viz Rusolahti a Pietschbacher, 1987). Trojrozměrná strukturní analýza opakování podobných FN ukázala, že motiv RGD je umístěn mezi strukturami beta F aG (Main et al., 1992). Tento motiv se také nachází u jiných členů rodiny LI. U třetího opakování podobného FN kuřecí Ng-CAM (Burgoon et al., 1991) a druhových homologů kuřecího neurofascinu a krysí ABGP se nachází sekvence RGD na stejném místě, tj. mezi strukturami beta F aG. Motivy RGD se také nacházejí u LI (dva u myší LI a krysí (NILE) a jeden u lidské LI (Moos et al., 1988; Hlavin a Lemmon, 1991; Prince et al., 1991). Všechny sekvence RGD u LI se nacházejí v šesté Ig podobné doméněm, ale v různém aminokyselinovém složení než RGD v FN podobných modulech fibronektinu. Stejně jako u LI je tripeptid u CHL1 umístěn v struktuře beta E druhé Ig podobné domény. Jestli jsou sekvence RDG u těchto proteinů funkčně aktivní, není v současnosti známo. V tomto kontextu je zajímavé, že prodloužení neuritů indukované molekulou TAG-1 (Furley et al., 19902), členem rodiny F3/F11 (Brůmmendorf a Rathjen, 1993, 1994), který obsahuje motiv RGD v druhé FN podobné doméně, závisí na B, integrinu a LI (Felsenfeld et al., 1994). Toto pozorování zvyšuje možnost přímé fyzické interakce mezi druhým opakováním podobným FN a integrinem betal.

CHL1 také obsahuje sekvenci DGEA (aminokyseliny 555 až 558) ve struktuře beta C šesté Ig podobné domény (Obr. 18). Tato sekvence se nenachází u ostatních členů rodiny LI. Sekvence DGEA se také účastní při rozpoznání integrinu alfa2 betal a kolagenu typu I, který obsahuje tento motiv (Staatz et al., 1991).

Strukturní podobnost CHL1 s jinými rozeznávacími molekulami rodiny Ig

Porovnání aminokyselinové sekvence CHL1 s translatovanou genovou sekvenční databankou EMBL ukázalo, že CHL1 je z 87,2% identická k 109 aminokyselin dlouhému úseku a z 79,6% identická k 93 aminokyselin dlouhému úseku předešle identifikovanému v lidském mozku (příjmové číslo HS2431 a HSXT02610 (Adams et al., 1992, 1993)). Takže se ukazuje, že existuje velmi konzervovaná molekula CHL1 u člověka. Sekvence myší, lidské a krysí Ll/NILE, kuřecí Ng-CAM, kuřecí Nr-CAM, Ll.l zebřičky (Tongiorgi et al., 1995), kuřecího neurofascinu/krysí ABGP, Drosofilího neuroglianu (Bieber et al., 1989), myší F3/kuřecí Fl/lidská CNTN1 (Gennarini et al., 1989; Ranscht, 1988; Brůmmendorf et al., 1989; Berglund a Ranscht, 1994), krysí TAG-l/kuřecího axoninu-l/lidské TAX-1 (Furley et al., 1990;Hasler et al., 1993;Tsiotra et al., 1993) a krysí BIG-l/myší PANG (Yoshihara et al., 1994; Connelly et al., 1994) nalezené v translatované ·· ···· · · · ·· · · ·· · ···· ···· • ··· · · · · · · · · ···· ·· ·· ··* ·· ·· genové sekvenční databance EMBL byly porovnány s CHL1. Srovnání je znázorněno v Tabulce 1, která je uvedena níže.

CHL1 je nejpodobnější ke kuřecí Ng-CAM (37% aminokyselinové identity v extracelulární doméně, Tabulka 1) a myší Nr-CAM (64% aminokyselinové identity v extracelulární doméně, Tabulka 2). Ale stupeň identity, zvláště v extracelulární části, není dostatečný pro úvahu, že tyto proteiny jsou druhové homology. Nedávno byl identifikován neúplný klon cDNA myší Nr-CAM (Moscoso a Sanes, 1995). Myší Nr-CAM je téměř identický (99%) ke kuřecí NR-CAM (viz Tabulka 2). Proto není CHL1 pravděpodobně homologem Nr-CAM u myši. CHL1 je čtvrtým členem rodiny LI u myši společně s LI, Nr-CAM, neurofascinem (Moscoso a Sanes, 1995) a společně s velmi konzervovanými druhovými homology u člověka (Adams et al., 1992, 1993).

Když uvažujeme podobnost intracelulárních sekvencí kuřecí a myší NrCAM a kuřecíhoa myšího neurofascinu (99% a 87%, Tabulka 2), je velmi nepravděpodobné, že jsou myší LI a kuřecí Ng-CAM druhové homology, protože vykazují pouze 10% sekvenční identitu v intracelulární doméně (Tabulka 2). Existence Ng-CAM jako pátého člena rodiny LI u myši s velmi konzervovanou intracelulární doménou je spíše očekáváno. Je zajímavé, že myší LI podporuje růst neuritů přes feterofilní interakci s kuřecí Ng-CAM (Lemmon et al., 1989), což implikuje že členové rodiny LI mohou interagovat se sebou navzájem.

Vedle podobností v celkové struktuře členů rodiny LI (Tabulka 1 a Tabulka 3) jsou identifikovány nejvíce konzervované oblasti v cytoplasmové oblasti (Obr. 20). Nápadná homologie je evidentní pro členy rodiny LI u všech druhů dosud identifikovaných, které obsahují intracelulární doménu: LI, CHL1, Nr-CAM, Ng-CAM, neurofascin, neuroglian, a Ll.l zebřičky a také neúplné sekvence LI.2 zebřičky (Tongiorgi et al., 1995) a myší Nr-CAM a neurofascin (Moscoso a Sanes, 1995) (Tabulka 2). Uvnitř této oblasti jsou dva úseky téměř identické, jeden umístěný blízko u a částečné uvnitř segmentu procházejícího plazmatickou membránou a druhý na jeho Cterminálním konci (I, III v Obr. 20). Jiný aminokyselinový úsek, který je konzervovaný u LI, , Nr-CAM, Ng-CAM, neurofascinu, Ll.l a LI.2, ale nikoliv u CHL1 (Tabulka 2), obsahuje motiv RSLE (II v Obr. 3), který pochází z alternativního sestřihu a je exprimován pouze v neuronech (Grumet et al., 1991; Miura et al., 1991; Volkmer et al., 1992). Protože je intracelulární oblast nejvíce konzervovaná mezi těmito proteiny, všichni členové rodiny LI mohou používat té samé signální transdukční cesty k aktivaci prodloužení neuritů. Bylo demonstrováno, že cytoplazmové domény u ABGP, LI a Nr-CAM interagují s ankyrinem propojujícím buněčnou rekognici s cytoskeletálním lešením (Davis et al., 1993; davis a Bennett, 1994).

Příklad 24

Identifikace strukturních požadavků v extracelulární doméně za účelem klasifikování členů rodiny LI

Pro další studium všeobecných kriterií rodiny LI jsme zkoumali umístění velmi konzervovaných aminokyselin v doménách podobných Ig (cysteinů, které se účastní můstků S-S) a opakování podobných FN (tryptofan, tyrosin/fenylalanin) pro některé členy rodiny Ig (Tabulka 3). Molekuly • · • · · · obsahující šest domén podobných lg a alespoň čtyři opakování podobná FN (rodina LI a nižší rodina F3/F11 s kotvou GPI (Brummendorf a Rathjen, 1993)) odhalily velmi konstantní počet aminokyselin, které oddělují tyto konzervované aminokyseliny. Pět různých parametrů vzdálenosti bylo vzato do úvahy:

1) počet aminokyselin oddělujících konzervované cysteiny, které tvoří cysteinové můstky (S-S) v každé doméně podobné lg (Tabulka 3, sloupce Igl, Ig2, Ig4, Ig5 a Ig6);

2) počet aminokyselin mezi druhým cysteinem v jedné doméně podobné lg a prvním cysteinem následující domény podobné lg, který odráží vzdálenost mezi dvěma sousedícími doménami podobnými lg (Tabulka 3, sloupce 1-2,2-3,3-4,4-5 a 5-6);

3) počet aminokyselin mezi posledním konzervovaným cysteinem šesté domény podobné lg a konzervovaným tryptofanem prvního opakování podobného FN, který odráží vzdálenost mezi modulem domény podobné lg a modulem opakování podobného FN Tabulka 3, sloupce IgG-FNl);

4) počet aminokyselin mezi konzervovaným tryptofanem, tyrosinem/fenylalaninem každého jednotlivého opakování podobného FN (Tabulka 3, FN1, FN2, FN3 a FN4);

5) počet aminokyselin mezi tyrosinem/fenylalaninem jednoho opakování podobného FN a tryptofanem následujícího opakování podobného FN, který odráží vzdálenost mezi dvěmi sousedícími opakováními podobnými FN (Tabulka 3, FN1-FN2, FN2-FN3, FN3-FN4).

Pro získání vysoce stringentních podmínek pro porovnání molekul podobných LI jsme nezahrnovali do výpočtu průměrných vzdáleností a standardních odchylek několik málo hodnot, které se jasně odchylovaly od průměru, nejpravděpodobněji v důsledku alternativního sestřihu (neuroglian: Ig2, 2-3; Nr_CAM a ABGP: Ig6-FN1; F3: Ig4, FN3; Ng-CAM: FN2, FN3 Tabulka 3, označeno *)). I když počet aminokyselin mezi můstky S-S pro první a šestou doménu podobnou lg (Igl; standardní odchylka (SD) = 3; Ig6: SD = 4) a počet aminokyselin mezi konzervovaným tryptofanem, tyrosinem/fenylalaninem opakování podobných FN tři a čtyři (FN3: SD = 4; FN4: SD = š) jsou mírně rozdílné, všechny ostatní parametry vzdáleností zůstávají pozoruhodně konstantní pro různé molekuly (FN1-FN2: SD = 0; FN2 a 2-3: SD = 2 (Tabulka 3)). Na základě těchto kriterií jsme vypočítali index podobnosti (viz Materiál a Metody) pro několik molekul podobných lg ve vztahu k průměrným hodnotám v seznamu Tabulky 3. Pro LI, CHL1, NgCAM, Nr-CAM, ABGP, Ll.l, TAG-1 a BIG-1 byl získán index podobnosti 74 až 95% (Tabulka 3). Pro drosophilí neuroglian byla stanovena mírně nižší hodnota (66%), zřejmě proto, že je zde evoluční vzdálenost mezi obratlovci a hmyzem. F3 a jeho druhové hology jsou méně konzervovaní, zvláště v jejich doménách podobných lg, ale stále vykazují index podobnosti 63%. Avšak některé úseky konzervovaných aminokyselin, které jsou základem silně konzervované kolinearity (např. FxVxAxNxxG(8x)S(4x)TxxAxPxxxP na konci prvního opakování podobného FN nebo NxxGxGPxS mezi posledními dvěmi strukturami beta třetího opakování podobného FN (neukázáno), podporují myšlenku, že F3 náleží do rodiny LI. Je zajímavé, že počet aminokyselin mezi sousedními doménami (domény podobné lg nebo opakování podobná FN) je dokonce více konzervován mezi těmito molekulami, což ukazuje, že vzdálenost mezi jednotlivými doménami je •

důležitým strukturním rysem, tj. rozhodujícím pro funkci nervových rozlišovacích molekul (Tabulka 3, sloupce 1-2, 2-3, 3-4, 4-5, 5-6, FN1-FN2, FN2-FN3 a FN3-FN4). Tato vysoká konzervace tohoto seřazení (kolinearity) a vzdáleností je použita k obecnějšímu definování extracelulární domény členů rodiny LI. Na základě těchto právě definovaných kriterií obsahují tyto extracelulární domény modul šsti domén podobných Ig na konci N, po němž následují čtyři opakování podobnéá FN. Tento strukturní rys budeme nazývat kazetou rodiny LI.

Takže všichni členové rodiny LI sdílejí charakteristické rysy kazety rodiny LI a také velmi konzervované aminokyseliny. Tyto výsledky navrhují, že jsou tyto molekuly odvozeny od společné předchozí molekuly, která obsahovala kazetu rodiny LI, která mohla rozšířit svůj funkční potenciál skrz genovou duplikaci pro účely nejrůznějších buněčných interakcí v složitějších nervových soustavách. Hlavní rodina LI tak může být rozdělena na klasické členy rodiny LI (LI, CHL1, Ng-CAM, Nr-CAM, neurofascin, neuroglian, Ll.l), kteří obsahují variabilní šesté opakování podobné FN, transmembránovou doménu a velni konzervovanou intracelulární doménu, a na podskupinu F3/F11 (F3/F11/CNTN1, BIG-l/PANG a TAG-l/Axonin1/TAX-l), jejíž společným rysem je spojení s membránou skrz skupinu GPI a v které nebylo zatím identifikováno žádné variabilní páté opakování podobné FN. Extracelulární domény obou podskupin obsahují kazetu rodiny LI.

Ostatní členové velké rodiny Ig, např. N-CAM (Cunningham et al., 1987; Barthels et al., 1987), MAG (Arquint et al., 1987; Lai et al., 1987; Salzor et al., 1987), neuromusculin (Kanla et al., 1993) a rse (Mark et al., 1994) nebo fibronectin (Kornblihtt et al., 1985), kteří obsahují domény podobné Ig a nebo opakování podobná FN, vykazují jasně odlišní parametry vzdáleností, což ukazuje, že jsou mnohem méně příbuzné mezi sebou a k členům rodiny LI (Tabulka 3). Je zajímavé, že gen kódující lidský příbuzný leukocytární společný antigen (HLAR) (Streull et al., 1988) a produkt genu potlačujícího nádory (DCC), který je deletován u rakoviny konečníku (Fearon et al., 1990), jsou blízce příbuzní k rodině LI podle parametrů vydálenosti (index podobnosti 42% a 50%). Rozbor konzervovaných aminokyselin odhalil, že DCC je opravdu mnohem bližší k rodině LI než k N-CAM, jak bylo dříve navrženo v Fearon et al., (1990) a Pierceall et al., (1994), i když se zdá, že ztratily pátou a šestou doménu podobnou Ig. Nedávná studia ukazují, že DCC je exprimován přednostně v mozku a že růst neuritů rkysich buněk PC12 je stimulován na substrátu fibroblastů transfekovaných DCC, které exprimují tento protein na svém povrchu (Pierceall et al., 1994). I když HLAR také vykazuje také relativně vysoký index podobnosti, jeho příbuznost k rodině LI není tak zřejmá.

Příklad 25

Tkáňové rozšíření mRNA CHL1 a proteinu

Pro stanovení, jestli CHL1 zdili přednostní expresi v nervové soustavě společně s jinými členy rodiny LI, jsme analyzovali expresi CHL1 v různých tkáních na úrovni mRNA a proteinu. V analýze Northen blot hybridizovala ribopróba CHL1 se silným proužkem mRNA o velikosti 8 kb (Obr. 21), který je o dost větší než velikost mRNA detekované próbou LI (6 kb) (Tacke et al.,

1987). Menší a slabší proužek mRNA (Obr. 21a, dráha 3) je «··«·« 9 9 9 9 9 99

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 nejpravděpodobněji způsoben hybridizací k ribozomální RNA. RNA dlouhá 8 kb byla detekována v mozečku, mozku bez mozečku a v míše, ale nikoliv v dorzálním kořenovém gangliu (DRG) (Obr. 21a). Naopak, ribopróba LI ukázala silný signál s RNA z DRG (Obr. 21a). mRNA CHL1 byla také detekována v mozečku devět dní staré krysy a míše šest dní staré krysy, ale nikoliv v krysích buňkách PC12 udržovaných s a bez NFG nebo v buňkách COS-1 (Obr. 21b). Ve všech ostatních tkáních, které byly analyzovány (brzlík, plíce, játra, střeva, slinivka a ledviny), nebyl detekován žádný signál (Obr. 21a). K identifikaci proteinu CHL1 byly vytvořeny protilátky proti bakteriálně exprimovanému fragmentu. 1,7 kb dlouhý fragment cDNA reprezentující část šesté domény podobné Ig a čtyři opakování podobná FN (Obr. 18 a 19b), ale nikoliv transmembránovou anebo intracelulární oblast, byl nakloňován do expresního vektoru pET. Exprese výsledného proteinového fragmentu vedla k detekci proužku o velikosti 70 kD pomocí barvení Coomassie modř po SDS-PAGE, který byl purifikován pomocí výměnné iontové chromatografií. Analýza Western blot (Obr. 22a) a ELISA (neukázáno) prokázalo, že antiséra ze dvou králíků reagovaly s proteinovým fragmentem CHL1, ale nikoliv s purifikovanými LI, N-CAM a MAG. Některé reakce s bakteriálními proteiny, které putovaly společně s peptidem CHL1 nebo s degradačními produkty fragmentu CHL1, byly pozorovány (Obr. 22a, dráha 4).

Pro další prozkoumání specificity protilátek a stanovení, jestli tyto protilátky rozpoznávají na buněčném povrchu exprimovanou CHL1, byly tranzientně transfekované buňky COS-1 prozkoumány těmito protilátkami. Imunocytochemie odhalila povrchovou expresi CHL1 na buňkách transfekovaných CHL1, ale nikoliv na buňkách transfekovaných pouhým vektorem (Obr. 23). Tyto výsledky také ukazují, signální sekvence je funkční a že otevřený čtecí rámec je správný.

I když byl první klon cDNA CHL1 izolován z expresní knihovny pomocí testování s imunoafinitně purifikovanými protilátkami proti LI z mozku, reakce různých preparací protilátek proti rekombinantně exprimovaným doménám podobným Ig LI s buňkami transfekovanými CHL1 nebyly pozorovány (neukázáno). Také protilátky proti CHLlvyvolané proti extracelulární části této molekuly (Obr. 19) nereagovaly s buňkami transfekovanými LI (neukázáno). Je proto pravděpodobné, že polyklonální protilátky proti LI použité pro testování expresní knihovny byly reaktivní s intracelulární částí CHL1 na konci C, který je nejvíce homologní mezi CHL1 a LI.

Antiséra CHL1 byla použita k identifikaci imunoreaktivních proteinů v několika tkáních (mozek, játra, lpíce, ledviny a střeva z devět dní starých myší, Obr. 23b). Hrubé membránové frakce, rozpustné nebo nerozpustné v 0,5% Tritonu X-100, byly analyzovány pomocí analýzy Western blot. Polyklonální protilátky proti LI byly použity jako kontrola. Protilátky CHL1 rozeznávají tři různé proužky 185, 165 a 125 kD v nerozpustných a rozpustných frakcích membrán z mozku, proužek 185 kD byl detekován pouze slabě v rozpustné frakci a proužek 125 kD byl méně zastoupen v nerozpustné frakci (Obr. 23b, dráhy 1 a 2), což ukazuje, že proužek 185 kD je pravděpodobně membránově vázána forma CHL1, kdežto proužky 125 kD a 165 kD jsou pravděpodobně proteolyticky štěpené fragmenty. Podobné rozložení imunoreaktivních proužků bylo pozorováno po analýze Western blot • · · ·· · 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 99

9 9 9 · · 9 *«···

9 9 9 9 9 9 99

9999 99 *· 99999 99 buněk COS-1 transfekovaných CHL1 a celé mozkové tkáně (neukázáno). Podobné rozložení proužků bylo pozorováno pro LI (Faissner et al., 1985; Sadoul et al., 1988), Ng-CAM (Grumet et al., 1984) a Nr-CAM (Kayyem et al., 1992). Avšak dvoubázová konsensní sekvence pro proteolytické štěpení v třetí doméně podobné FN (LI: SKR; Ng-CAM: SRR; Nr-CAM: SRR; Nr-CAM: SRRSKR) se nenachází u CHL1. Podobně jako jiní členové rodiny LI bylo u CHL1 zjištěno, že je exprimováno pouze v pozdních stádiích vývoje. CHL1 nebyla detekovatelná v mozku před embryonickým dnem 15 pomocí analýzy Western blot (neukázáno). Imunoreaktivní proužek 50 kD byl detekován v detergentové rozpustné frakci celé jaterní tkáně. Tento proužek je nejpravděpodobněji způsoben nějakou reaktivitou protilátek CHL1 s proteinem podobných CHL1, protože žádná mRNA, která by odpovídala CHL1, nebyla vidět v játrech při analýze Northen blot (Obr. 22a). Žádná imunoreaktivita k CHL1 nebyla detekována v jiných tkáních, které byly zkoušeny (Obr 23b).

Členové rodiny LI jsou přednostně exprimováni v neuronech CNS. Proto jsme se zajímali, jestli má také CHL1 tento profil exprese. Experimenty hybridizace in šitu byly provedeny za účelem identifikace buněk syntetizujících LI a CHL1 v sítnici, optickém nervu a v cerebelárním kortexu mladých právě narozených myší. V sítnici 7 dní staré myši jsou exprimovány mRNA LI (Obr. 24a) a CHL1 (Obr. 24b) ganglionovými buňkami. Transkripty LI byly dále detekovatelné v amakrinových a horizontálních buňkách umístěných na vnitřní jaderné vrstvě (Obr. 24a). mRNA CHL1 byla naopak detekovatelná jen příležitostně v několika málo buňkách umístěných na vnitřní hraně vnitřní jaderné vrstvy (Obr. 24b). Gliové buňky v optickém nervu neobsahovaly detekovatelné hladiny transkriptů LI (Obr. 24a). Naopak, mRNA CHL1 byla silně exprimovaná v gliových buňkách umístěných v bližších oblastech optického nervu (Obr. 24b) a nízké hladiny exprese CHL1 byly viditelné v gliových buňkách umístěných ve vzdálenějších oblastech tohoto nervu (Obr. 24b).

V cerebelárním kortexu dva dny starých myší byla mRNA LI detekovatelná v hvězdicových a košíčkových buňkách umístěných v molekulární vrstvě a v Golgiho a granulových buňkách umístěných ve vnitřní granulární vrstvě (Obr. 24d). Ty samé buněčné typy byly označeny, když byly řezy hybridizovány s protismyslovou próbou cRNA CHL1 (Obr. 24e), s tou výjimkou, že transkripty CHL1 byly sotva detekovatelné v buňkách umístěných ve vnitřní části molekulární vrstvy (porovnejte Obr. 24d a e). Jako negativní kontrola byly řezy hybridizovány s příslušnými smyslovými próbami cRNA a nebylo pozorováno žádné označení buněk (pro sítnici a optický nerv, který byl hybridizován se smyslovou próbou cRNA CHL1, viz Obr. 24c). Kvůli odpovědi na otázku, zda gliové buňky exprimují CHL1 in vitro byly z předních mozků právě narozených myší nebo krys připraveny kultury purifikovaných astrocytů nebo oligodendrocytů. Ty samé polyklonální protilátky proti CHL1, které specificky detekovaly CHL1 na buněčném povrchu tranfekovaných buněk COS-1, byly použity. Astrocyty a oligodendrocyty byly identifikovány protilátkami proti GFAP nebo s protilátkami proti antigenu Ol. Kultury astrocytů obsahovaly některé buňky, které byly značeny dvojitě polyklonálními protilátkami proti CHL1 (Obr. 25a,

d) a monoklonálními protilátkami proti GFAP (Obr. 25b, e). Analýza kultur oligodendrocytů však neodhalila žádnou společnou lokalizaci CHL1 a ·· «··· • · · antigenu 01, což znamená, že zralé oligodendrocyty neexprimují in vitro detekovatelné hladiny CHL1. Konbinovaná pozorování ukazují, že CHL1 a LI vykazují překrývající se, ale také různé profily exprese. Nejnápadnější je, že CHL1, ale nikoliv LI, je xprimována v určitých gliových buňkách nervové soustavy in vivo, což naznačuje, že různí členové rodiny LI vykonávají různé funkce.

Analýza glykosilace a detekce karbohydrátu HNK-1 u glykoproteinu CHL1 Protože pozorovaná molekulová hmotnost CHL (185 kD) je podstatně větší než vypočítaná molekulová hmotnost (134,9 kD), byl analyzován příspěvek karbohydrátů k molekulové hmotnosti a také typ karbohydrátové modifikace. Detergentové rozpustné a nerozpustné frakce z hrubých mozkových membrán sedm dní starých myší byly podrobeny enzymovou deglakosilací. Po působení N-glykosidázy F (PNGázaF) byla molekulová hmotnost všech imunoreaktivních proteinů CHL1 (Obr. 26): proužek 185 kD se posunul na 150 kD, proužek 165 kD na 135 kD a proužek 125 kD na 110 kD. Výsledkem působení O-glykosidázy, enzymu, který štěpí na serin/threonin připojené galaktosyl beta(l-3)N-acetylgalaktosaminyl disacharidy (Glasgow et al., 1977) byla lehce zvýšená pohyblivost: proužky 185 a 165 kD se posunuly na 180 a 160 kD, kdežto proužek 125 kD se neposunul. Tato pozorování ukazují, že většina karbohydrátové molekulové hmotnosti je způsobena N-připojenými karbohydráty. Působení obou enzymů společně (Obr. 26) vedlo k většímu posunu než bylo vidět u jednotlivých enzymů, což naznačuje, že ne všechna glykosilační místa, nejspíše Oglykosidační místa, byla štěpena O-glykosidázou samotnou. Výsledky ukazují, že CHL1 obsahují přibližně 30% své molekulové hmotnosti jako Nglykosidicky připojené karbohydráty.

Několik nervových buněčných adhezních molekul nese karbohydrát HNK-1, jako např. LI (Kruše et al., 1984), TAG-1 (Dodd et al., 1988), NrCAM (Grumet et al., 1991), F3 (Gennarini et al., 1989), N-CAM (Kruše et al., 1984), glykoprotein asociovaný s myelinem MAG (McGarry et al., 1983; Kruše et al., 1984) a P_o (Bollenson a Schachner, 1987). Proto jsme analyzovali, jestli nese CHL1 karbohydrát HNK-1. CHL1 byla imunoprecipitována z detergentových lyzátů celé mozkové tkáně z devět dní starých myší protilátkami proti LI. Jako kontrola byla LI podobně imunoprecipitována polyklonálními protilátkami z toho samého mozkového extraktu. Analýza Western blot s monoklonálními protilátkami 412 vyvolanými proti karbohydrátovému epitopu HNK-1 ukázala, že oba imunoprecipitáty obsahovaly proužky, které byly rozpoznány monoklonální protilátkou 412 v molekulových hmotnostech očekávaných pro CHL1 (Obr. 27) nebo LI (neukázáno). Protože karbohydrát HNK-1 se účastní buněčné adheze a váže se na laminin (Keilhauer et al., 1985; Kůnemund et al., 1988; Halí et al., 1993, 1995), může CHL1, podobně jako ostatní členové rodiny LI, interagovat s lamininem skrz karbohydrát HNK-1.

·^; -.3 -/3' '···',Ύ ·· ···· ·· · · · · · * · · » · · · ···« · • · · · ·· ·· ··· · · ··

Závěr

Výše popsané experimenty přidaly CHL1 do rodiny LI nervových rozeznávacích molekul, které se vyskytují u tak různých druhů, jako jsou člověk, krysa, myš, kuře, zebřička a Drosophila, a tak ustanovují filogeneticky konzervovanou rodinu molekul, jejiž všichni členové jsou exprimováni pozdě ve vývoji při nástupu axogeneze v neuronech a podmnožině neuronů. Skutečnost, že existuje mnoho molekul podobných LI, ukazuje požadavek přírody na strukturně podobné, ale funkčně různé molekuly podporující růst neuritů, a ukazuje na evoluci rodiny LI jako na skupinu molekul, která může určovat regulaci vedení axonů.

I když byl vynález popsán a ilustrován zde skrz odkazy na různý specifický materiál, postupy a příklady, rozumí se, že vynález není omezen na zvláštní kombinace materiálu a postupů vybraných pro ten účel. Mnohé variace takových detailů mohou být zahrnuty, což bude odborně vítáno.

Následuje abecední seznam citací uvedených v Příkladech 18 až 25.

Adams, M.D.. Dubnick, M., Kerlavage. A.R.. Mořeno, R., KeUey, J.M., Utterback.

T.R., Nagle, J.W.. fields, C. and Venier. J.C. (1992). Sequence identification of

2375 human brain genes. Nátuře. 355:632-634.

• · · · · ·

i./·

WO 96/32959

Adams, M.D.. Kerlavage, A.R., Fields, C. and Venter, J.G. (1993). 3400 new expressed sequcnce tags identify diversitv of transcripts in human brain. Nátuře Gene/. 4:258-267.

Appel, F. Holin, J., Conscience, J.F. and Schachner, M. (1993). Several extracéllnlar domains of the neurai cell adhesion moiecule -Ll are involved in nemile óutgroWťh and cell body adhesion. J. Neurosci. 13tA3(i&-4TJS.

Appel, F.,HoIm, J., Conscience, J.-F., von Bohlen dhd Halbach, F.. Faissner, A., James, P. and Schachner, M. (1995). Identifícation of the border betwcen fibronectin type III homologous repeats 2 and 3 of the neurai cell adhesion . molecule LI as a neurite outgrowth promoting and signa! transducing domain. J. Neurobiol 28:297-312.

Arquint, M., Rodei. J., Chia, L.-S, Down, 1. Wilkinson, D., Bayley. H-, Braun, P. and Dutin, R. (1987). Molecular cloning and prímaiy stnicturé of myelinassociated glycoprotein. Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 84:600-604.

Baron, M., Main, A.L., Driscoll, P.C., Mardon, H.J., Boyd, J. and Campbell, J.D. (1992). H-NMR assigninent and secondaiy structure of the cell adhesion type III module of fibronectin. Biochem. 31:2068-2073.

Bartheis, D., Santoni. WiUe, W._ Ruppert, C., Chaix, J.-C., Hirsch, M.-R-,

Fontecilla-Champs, J.C. and Goridis, C. (1987). Isolation and nudeotide sequcnce 20 of mouše N-CAM cDNA that codes for a Mr 79000 polypeptide wilhoul a membratie-španning region. EMBO J. 6:907-914.

Bartsch, S., Bartsch, Ό., Dorries, U., Faissner, A.. Weller, A., Ekblorn, P., and Schachner. M. (1992). Expression of tenascin in the developing and adult cerebellar cortex. J: Neurosci. 12:736-749.

WO9602959 • · • · · ·

··’ PCT/0S*6/Ó5434

Berglund. E.O. and Ranscht, B. (1994). Molecular cloning and in silu locaiization of the human contactin gene (CNTN1) on chromosome 12ql l~ql2. Genomics 21:571-582Bieber, A.J., Snow. P.M., Hortsch, M., Patel, N.H., Jacobs, J.R., Traquina, Z.R.,

Schilling. J. and Goodman, C.S. (1989). Drosophiia neurqgilan: a member ofthe immunoglobulin superfamily with extensive homologyto the vertebrate neural cell adhesion moleculc LI. Cell 59:447-460.

iBixby, J.L., Lilien, J. and Reichardt, L.F. (1988). Identifjeation of ťhe major proteins that promoie neuronal process outgrowih on Schwann cells fa vitro. J. Cell 10 Biol. 107:353-362.

Bollenson, E. and Schachner, M. (1987). The peripheral myelin glycoprotein Po expresses the L2ZHNK-1 and L3 carbohydrate structures shared by neural adhesion molecules. Neurosci. Letí. 82:77-82.

Bradford, M.M. (1976). A rapid and sensitive methód for quantitation of mierogramm quantities of protein utilizing the principle of protein-dye bindíng. Anal. Biochem. 72:248-254.

Brummendorf, T-, Wolff. J.M., Frank. R. and Rathjen, F.G (1989). Neural cell recognition mólecule F11: homology with fibropecrin lype III and immunoglobulin type C domains. Neuron 2:1351-1361.

Brummendorf, T. and Rathjen, F.G. (1993). Axonal glycopipteins with t

immunoglobulin and fibronectin type IlI-related domains in vertebrates: structural features, binding activities, and signál transduction. J. Neurochem. 61:1207-1219.

Brummendorf, T. and Rathjen, F.G. (1994). Cell adhesion molecules 1: immunoglobulin superfamily. In Sheierline, P., ed. Protein Profile, Academie 25 Press, London, 951-1058.

·: .:·Χ

WO 96132959 ’ t>3 *·.* . ί PC17US9<»M>tá34

Surgoon, Μ.Ρ., Grumet, M.. Mauro. V.. Edelman. G.M. andCunningham, B.A.

(1991). Structure of the chicken neuron-glia cell adhesion molecule Ng-CAM: origin of the polypeptide and relation to the Ig superfamily. J. Cell Biol. 112:10171029.

Chomczynski, P. and Sacchi, N (1987). Single-step methodof RNA isolation by acidic guanidinium thiocyanale-phenol-chloroform cxtraction.Anal. Biochem. 162:158-159.

>· ·'·

Connelly, M.A., Grady, R.C., Mushinskí, J.F. and Martu, K.B. (1994). PANG, a gene eneoding a neuronai glycoprotein, is ectropieally activaledby intiacistemal A10 type particle long terminál repeats in murine piasmacytomas. Proč. Huti. Acad.

Sci. (USA) 91:1337-1341.

Cunningham, B.A.. Hemperley, J.J., Murray, B.A., Prediger, E.A., Brackenbury, R. and Edelman, G.M. (1987). Neural cell adhesion molecule: structure, immunoglobulin-like domains, cell surface niodulation, and alternativě RNA splicing. Science 236:799-806.

Davís, J.Q., McLauehlin, T. and Bennett, V. (1993). Ankynn-binding proteins related to nervous systém cell adhesion molecules: Candidates to provide transmembrane and intracellular connections in adult brain. J. Cell Biol. 121:121133.

Davis, J. and Bennett. V. (1994). Ankyrin binding activity shared by the neurofascin/Ll/NrCAM family of nervous systém cell adhesion molecules. J. Biol.

Chem. 269.27163-27166. '«

Dodd, J., Moiton, S._ Karagogeos, D., Yamamoto. M. and Jessell, T. (1988).

Spatial regulation of axonal glycoprotein expression on subsets of embtyonic spinal 25 neurons. Neuron 1:105-116.

• · • · · · • · • · · • · · · · · · ··· · · · · · · Λ * ·

WO 96/32959 j ........ ŤtT/IlS96/O5?B4

Dorries. U-. Bartsch. U., Nolté, Č., Roth, J, and Schachner, M. (1993). Adapúon of anon-radioactíve in sítu hybridisation method to ělectron mícroscopy: Detecúon of tenáxcin mRNAs in mouše cerebeilum with digoxigenin-labellcd probesand goldlabelled antibodies. Histochem. 99Ώ.51-262.

Edelman, G-M. (1970). Thé covalentsíructure of a human IgG. XI. Funerinnal implications. Biochem. 9:3197-3205.

Edelman, G.M. (1988). Morphoregulatory molecňles. Biochem. 27:3533-3543.

Erickson, H.P. (1993). Tenascin-C, tenascin-R, and tenascin-X: A family of talented proteins in scarch of íimctions. Curr. Opin. Cell Biol. 5:869-876.

Faissner, A., Teplow, D.B.. Kubler, D., Keilhauer. G.. Kinzel, V. and Schachner, M. tl985). Biosynthesis and membiane topography of the neumí cell adhesion molecule LI. EMBO J. 4:3105-3113.

Fearon, E.R., Cho, K.R., Nigra. J.M., Kem. -SJE.. Simons, J.W., Ruppert, J.M., Hamilton, S.R., Preisinger, A.C., Thomas, G., Kinzler, K.W. and Vogelstein, B.

(1990). Identification of a chromosome 18q gene that is altered in colorectal cancers. Science 247:49-56.

Feisenfeld, D.P., Hyneš, M.A., Skolor. K.M., Furley, A.J. and Jessel, TM (1994). TAG-1 can mediate homophilicbinding, but ncurite outgrowth on ŤAG-1 requires an L l-like molecule and B, integrins. Neuron 12:675-690.

Frei, T., von Bohlen und Halbach, F., Wille, W. and Schachner, M. (1992). Differcnt cxuacellular domains of the neural cell adhesion molecule (N-CAM) are involved in different functions. J. Cell Biol. 118:177-194.

Furley, A.J., Monon. S.B.. Manalo, D.. Karagogeos, D.. Dodd, J. and JesselL T.M.

(1990). The axonal glycoprotein TAG-1 is an inununoglobulin superfamilv membcr with neurite outgrowth-promoting activiry. Cell 61:157-170.

WO 96/32959

Gennarini. G.. Cibelli. G., Rougon, G.. Mattei, M.G. and Goridis. C. (1989). The mouše neuronal cell surface protein F3: A phosphatídylínositol-anchoied member of tiie immunoglobulin superfamily related to chicken contactin. J. Ceň Biol. 109:775-788.

Gennarini, G., Durbec, P., Bonad, A.. Rougon, G. and Gordis,C. (1991). Transfected F3/F11 neuronal cell surface protein ňiediates intercelliílar adhesion and promotes neurite outgrowth. Neuron 6:595-606.

* · ·

Glasgow. L.R., Paulson. J.C. and Hill, R.L. (1977). Systematic purification of five glyčosidases from Strepiococcus (Díplococcus) pneumoniae. J. Biol. Chem. 252:8615-8623.

Grumet, M,. Hoffman, S., Chuong, C.M. and Edelman, G.M. (1984). Polypeptide components and binding functions of neuron-glia cell adhesion molecules. Proč. Nati. AcadSci. USA 81:7989-7993.

Grumet, M., Mauro, V., Burgoon, M.P., Edelman. G.M. and Cuímingham, B.A. (1991). Structure of anewnervous systém giycoprotein, Nr-CAM, and its relaúonship to subgroups of neural cell adhesion molecules. J. Cell Biol. 113:13991412.

Guénard, V., Gwynn, L. and Wood, P. (1994). Astrocytes inhibit Schwann cell proliferation and myeiinalion of dorsal root ganglion neurons in vitro. J. Neurosci. 14:2980-2992.

Halí, H., Liu, L., Schachner, M. and Schmitz, B. (1993). The L2/HNK-1 carbohydrate mediatcs adhesion of neural cells to laminin. Eur. J. Neurosci 5:3442.

Halí, H., Vorherr. T. and Schachncr, M. (1995). Characterization of a 21 amino aeid peptide sequence of the laminin G2 domain that ís involved in HNK-1 carbohydrate binding and cell-adhesion. Glvcobiology 5:435-441.

• · · ·

JyČTflíŠsÍĚgV5434

WO96Z32959 &c.\.

Hasler. T.H.. Rader. C., Stoecklí, E.T.. Zuellig, R.A. and Sonderegger, P. (1993), cDNA cloning. struciural features, and eucaryotíc expression of human TAG1/axonin-l. Eur. J. Biochem. 211:329-339.

Hein, J. (1990). Unified approach to alígnment and phylogenies. Meth. Engytnol.

183:628-645. Hejjne von, G. (1986). A new method for prediciing sequence eleavagc sites. Nucl.

AcidsRes. 14:4683-4690. *

Hlavin, M.L. and Lemmon, V. (1991). Molecular structure and functional testing of - human L1CAM: An interspecies comparison. Genomics 11:416-423.

Holin, 1, Appel, F. and Schachner, M. (1995). Seveial extracellular domains of the neural cell adhesion molecule LI are invólved in homophilic interacúons. J. Neurose! Res. 42:9-20.

Hubbard, S.C. and Ivatt, R.J. (1981). Synthesis and processing of aspargine-iinked oligosaccharides. Annu. Rev. Biochem. 50:555-583.

Husmann. K., Faissner, A. and Schachner, M. (1992). Tenascin promotes cerebellar granule cell migration and neurite oulgrowth by dífferent domains in ťhe fibronectin type-IH repeats. J. Cell BioL 116:1475-1486.

Hyneš, R.O. (1992). Iniegiíns: Versaíility, modulation, and signaling in cell adhesion. Cell 68:11-25.

Kanla, G. S., Han, P. L., Kán, Y. T., and Bellen. H. (1993). NEUROMUSCULIN. a Drosophila gene expressed in peripheral neuronal precursors and muscles, eneodes a cell adhesion molecule. Neuron. 11:673-687.

53/ wosaaxs 53/ . ρϊτηώάίώ

Kayyam, J. F_ Roman. J. M.. de la Rosa. E. J. Schwarz, U. aňd Drever, W. J.

(1992). Bravo/NrCAM is dosely related to the cell adhesion molecules LI and NgCAM and has a similar heterodimer structure. J. Cell Biol. 118:1259-1270.

Keilhauer. G., Faissncr, A., and Schachner. M. (1986). Dífferentíal inhibiůon of ncurone-neurene. neurone-astrocyte and astrocvte-astiocyte adhesion hý 1.1,1 ,?_t and N-CAMaritibodies. Nátuře 316:728-730.

Kluxen, F. W., Bnms. C- and Lubbert, H. (1992). Expressioiťcloning of íat brain somatostatin receptor cDNA. Proč. Natí. Acad. Soc. /USA), 89:4618-4022.

- Kluxen, F. W. and Lubbert, H. (1993), Maxima! expression of recombínant cDNAs 10 in COS cells for use in expression cloning. Anal. Biochem. 208:352-356.

Komblihtt, A. R., Uinezawa. K. Vibe-Pedersen, K. and Baralle,

F. E. (1985). Primarv structure of human fibronectm: differential splicing may generále at least 10 polypeptide from a single gene. EMBO J. 4:1755-1759.

Kozak, M. (1987). At least six nucleotides preceding the AUG imtiator codon enhance (nanslation in manunalian cells. J. Mol. Bibl. 196:947-950.

Kruše, J., Mailhammer, R., Wemecke. H., Falssner. A.. Sommer, I.. Goridis. C. and Schachner, M. (1984). Nepral cell adhesion molecules and myelin-associáted glycoprotein share a common carbohydrate inoiety recognized by monodonal antibodies L2 and HNK-1. Nátuře 311:153-155.

Kunemund, V., Juneawala, F. B„ Fischer, G. Chou. D. K. lí., Keilhauer, G. and Schachner, M. (1988). The L2/Hnk-1 carbohydrate of neural cell adhesion molecules is involvcd in cell interactions. J. Cell Biol. 106:213-223.

Kyte, J. and Doolittle. R. F. (1982). A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. J. Mol. Biol. 157:105-132.

• · •Z · · * · . · · ·· * ····.'« ••PCT/US9&ttM34 • · ···· · · ♦ · · * • · · · • · · : : • · · · · ···· ·· ··

WO 96/32959

LaemmiL U- K. (1970). Clcávage of stnictural proicins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nátuře 2275680-685.

Laeng. P., Decimo, D.„ Pettmann, B. Janci. T. and Labourdette. G. (1994). Retinoic acid regulates the development of oligodendrocyte precursor cells in vitro. J.

Neurósci. Res. 39:613-633.

Lai, C., Brow, M. A., Navo. K. A, Noronha. A. B., Quarles, R.H., Bloom, F. E., Milner, R. J. and Sutcliffe, X G. (1987). Two forms of 18236/myelin-associated glycoprotein, a cell adhesion molecule for postnatal neural development, are produced by alternativě splicing. Proč. Nati. Acad Sci. (USA). 84:4337-4341.

Leahy, D. X, Hendrickson, W. A., Aukil, I. and Erickson, H P. (1992). Slructure of a fibronectín type-IH domain from tenascin phased by MAD analysis of the selenomelhionyl protein. Science 258:987-991.

Lemmon, V., Farr, K. L. arid Laeenaur. C. (1989). Ll -mediated axon growth occurs via a hemophilic binding mechanism. Neuron 2:1597-1603.

Lipman, D. J. and Pearson, W. R. (1985). Rapid and sensitive protein siinilarity searches. Science 227:1435-1441.

Main, A. L., Harvey. T. S., Baron, M.. Boyd, J. and Campbell,

I. D. (1992). The three-dimensional stnicture of the tenťh type III module of fibronectin: an insighi into RGD-mediated interactions. Cell 71:671-678.

Mark, M. R., Scadden. D. T., Wang, Z.. Gu. O. Goddard, A, hnd Godowski, P. J. (1994). Rse, a novel reccptor-type tyrosine kínase vňth homology to Axl/Ufo, is expressed at high levels in the biain. J. Biol. Chem. 269:10720-10728.

Mariini, R. and Schachner. M. (1986). Immunoelectron microscopic localization of neural cell adhesion molecules (Ll„ N-CAM, and MAG) and their shared

WO 96/32959

53Z : : i»cl7u&Lb5434 «· φφφ · · φφ carbohydrate epiiope and mvelin basic protein in developing sciatic nerve. J. Čelí BioL 103:2439-2448.

McCarthy, IL D. and De Vellis J. (1980). Prepararion of separate astroglial and oligódendroglial cell cultures from rat cerebral lissue.J. Cell BioL B5-.890-902.

McGany, R. C., Helfand, S. L., Quarles. R. H. and Rodcr, J. C. (1983).

Recognition of myelin-associated glycoprotein by the monoclonal anribody HNK-1. Nátuře 306:376-378. *Melton, D. A., Krieg, P. A., Rebagliati, M. A., Maniatis, T., Zinn, K. and Grecn, ' M. R. (1984). Effičient in vitro synthesis of biologically active RNA and RNA hybridization probes from plasmids containing a SP6 promotér. Nud. Acids Res. 12:7035-7056.

Miura, M. Kobayasalii, M., Asou,H. and Uvemura. K. (1991). Molecular cloning of cDNA encodine the rat nelítal cell adhesion inolecule Li. Two LI isofoíms in the cytopiesmic region are produced by diffexentiai splicing. FEBS Letí. 289:91-95.

Moos. M., Tacke, R. Scherer, H., Teplow, D„ Fnih. K. and Schachnor, M, (1988). Neurai adhesion molecule LI as a membcr of the immunoglobulin superfamily wiih binding domains similar to fibronectin. Nátuře 334:701-703.

Moscoso, L. M. and Sanes, J. R. (1995). Expression of four immunoglobulin superfamily adhesion molecules (LI, Nr-CAM/BRAVO. Neurofascin/ABGP, and

N-CAM) ín the developing mouše spinal coid. J. Comp. Neurčil. 352:321-334.

Pesheva, P., Gennarini, G., Goridis, C. and Schachner, M. (1993). The F3/11 cell adhesion molecule mediates the repulsion of neurons by the extracellular matrix glvcoprotein JI-160/180. Neuron 10:69-82.

WO 96/32959 33/ .i..*».* .íPCT/O£&&té434

PierceaU, W. E.. Cho, K. R. Getzcnberg, R H.. Roale, M. A- Hedrick, L-,

Vogelstein. B. and Fearon. E.R. (1994). NIH3T3 celíš expressing the deleted in colorectal cancer tumor suppressor ctíte product stimulate ncurite outgrowth in rat

PC 12 pheochromocytoma cells. J. Cell Biol. 124:1017-1027.

Pierschbachcr, M. D. and Ruosiahti, E. (1984). Cell attachment activity of fibroncctin can be duplicated by smáli synthetic fragmems of the moleeule. Nátuře 309:30-33.

jr. ·' ’

Pisano, A., Redmond, J. W., Wiliiams, K. L. and Gooley, A. A. (1993). Glýcosylation sites identified by solid-phase Edman degradation: O-linked glycošylation motifs on human glycophorin A. Glyčobiol. 3:429-435.

Poltorak. M., SadoiiL R. Kelhauer, G., Landa, C.. Faharing, T. and Schachner, M. (1987). The myelin-associated glycoprotein (MAG), a mtínber of the L2/HMNK-1 faiňily of neural cell adhesion molectíles, is involved in neuron-olíeodandorocyte and oiigodendrocyte-oligodendrocytě intcraction. J. Cell Biol. 105:1893-1899.

Prince, J. T., Alberti. L., Healy, P. A., Nauman. S. J. and Slallcup, W.B. (1991)Molccular cloning of NILE glycoprotein and evidence for its continued expression in mature rat CNS, J. Neurosci. Res. 30:567-581.

Pulido, D., Campuzano, S., Kida, T., Modolell, J. and Barbacid, M. (1992). Dtrk. a Drosophila gene related to the trk íamily óf ncurotrophin receptors, eneodes a novel class of neural cell adhesion moleeule. EMBO J. 111:391-404.

>

Ranscht, B. (1988). Sequence of contactin, a 130 kD glycoprotein concentrated in areas of intemeuronál contact, defines a new member of the immunoglobtďin supergene family in the nervous systém. J. Cell Biol. 107:1561-1573.

Rathjen, F.G. and Schachner, M. (1984). Immunocvtological and biochemical characterization of a new neuronal cell surface component (LI antigen) which is involved in cell adhesion. EMBO J. 3:1-10.

·« ·«· · • ·

guidance of vertebrate axons: Domains and dynamics of the immunoglobulín/fibronectin type Π1 subfamíly. Semin. Neurosci. 3:297-307.

Ruoslahtl, É. aňd Pierschbacher, M.D. (1987). New perspectives in cell adhesion:

RGD and intcgrins.Science 238:491-497.

Ruoslahtl, É. (1988). Fibronectin and its receptors. Annu. Rev. Biochem. 57:375413. *

Rutishauser, U. (1993). Adhesion molecules of the ncrvous systém. Curr. Opin. Neuróbfol. 3:709-715.

Sadou!,-K., Sadoul, R., Faissner, A. and Schachner, M. (1988). Biochemical characterizatíon of differem molecuiar fonns of the neumí cell adhesion molecule LI. J. Neurochem. 50:510-521.

Salzer, J.L. Holmes, W.P. and Coltnan, D.R. (1987). The amíno ačíd sequences of the myelin-assoejated glycoproteins: Homology to the immunoglobuhn gene superfamily. J. Cell Biol. 104:957-965.

Sambrook, J_, Fritsch. E.F. and Mamatis, T. (1989). Molecuiar cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, NY.

Sanger, F.S., Nícklen. S. and Coulson, A.R. (1977). DNA sequencing with chainterminaúng inhibitors. Proč. Nati. Acad Sci. (USA) 74:5463-5467.

í

Schachner, M. (1991). Neural recognition molecules and their influence on ceUular functions. In Leioumeau, P.C., Kater, S.B. and Macagno. E.R., eds. The Nerve Growth Cone. Raven Press, NY, 237-254.

Schachner, M. (1994). Neural recognition molecules in disease and reecncration.

Curr. Opin. Neurobiol. 4:726-734.

WO 9682959 ·· · ♦ · · ·· · · · · · • · ···· ···· • · · · · ···· • · ♦ · · · · ···.**·

ί..·..* ρ€Τ/ϋ996/ϋ5434

Schniizer. J. and Schachňer. M. (1981). Expression of Thy-1, H-2, arid NS-4 cell surface anúgéns and tetanus toxin receptors in early postnatal and adult mouše ccrebellum. Neuroimmunol. 1:429-456.

Seilhejmer, B. and Schachňer, M. (1988). Studies of adhesion molecules medianng interacúons between cellsof peripheral nervous systém mdicate a major role for Li in mediaring sensorv neuron growth on Sdíwann cells in culturc. J. Cell Biol. 107:341-351. Sommer, I. and Schachňer, M. (1981). Monoclonal antibodies (Ol to 04) to oligodendrocyte surfaces: An immunocyiochemical study in the centrál nervous systém. Dev. Biol. 83:311-327.

Southern. E.M. (1975). Detection of specific sequénces among DNA fragments separated by ge! eleCtrophoreSis. J. Mol. Biol. 98:503.

Staatz, W.D., Fok, K.F., Zutter, M.M., Adams, S.P.. Rodiiguez. B.A. and Santoro, S.A. (1991). Idcntificaúon of a tetrapeplide recognition sequence to the α^β, integrin in collagen. J. Biol. Chem. 266:7363-7367.

Streuli, M.. Krueger. N-X._ Halí, L.R.. Schlossman, S.F. and Saito, H. (1988). A new member of the immunoglobulin superfámily that has a cvtoplasmic region homologous to the leukocyte common anúgen. J. Exp. Med. 168:1523-1530.

Studier, F.W. and Moffatt. B.A. (1986). Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direci selech ve high-level expression of cloned genes. J. Mol. Biol. 189:113-130.

«

Tacke, R_. Moos, M., Teplow, D.B., Fruh, K., Scherer, H., Bach, A. and Schachňer, M. (1987). Isolahon of cDNA dones óf the mouše neurál cell adhesion molecule LI. Neurose! Letí. 82:89-94.

Taketchi, M. (1991). Cadherin cell adhesion receptors as a morphogenetic regulátor. Science. 251:449-455.

·» 9 · · ·

WO96G2959 £

• · · · · · ·.

• · · · ····*·

*..* .:^CTAi&&ré434

Tannahill. L., Klein. R. and Schachner, M. (1995). The neurotrophin receptors TřkA and TrkB are inhibitory for neurite outgr-owth. Eur. J. NeurosčL 6:14241428.

Taylor, J., Pesheva, P. and Schachner, M. (1993). Influence of jannsin and rena^ein 5 on growth cone behavior in vitro. J. Neuřo$ci. Rcs. 35:347-362.

Tongiorgi, E., Bernardi, R.R. and Schachner, M. (1995). Zebrafish neuronsexpress two Ll-relateď molecules during early axonogenesiš. J. Neurosci. Res. 42:547-561.

Talotra, P.C., Karagogeos, D., Theodorakis, K., Michaelidis, T.M., Módi, WJS.,

Euriey, A.J., Jessell, T.M. and Papamatheakis, J. (1993). Isolation of the cDNA and 10 chromosomal localization of the gene (TAX-1) eneoding the human axonal glycoprotein TAG-1. Genomics 18:562-567.

Volkmer, H., Hassel, J3-, Wolff, J.M., Frank, R. and Rathjen, F.G. (1992). Structure of the axonal surface iecognition molecule neurofascin and its relalionship to a neurai subgroup of the immunogiobulin superfamily. J. Cell Biol. 118:149-161.

Williams, A.F. and Barclay, A.N. (1988). The immunogiobulin superfamily domains for cell surface recognition. Ann. Rev. Immunol. 6:381-405.

Yoshihara, Y., Kawasaki, M-, Táni, A.. Tamada, A., Nagata, S.. Kagamiyáma, H. and Mori, K. (1994). BIG-1: A new TAG-l/F3-related member of the immunogiobulin-superfamily with neurite outgrowth-promoting activity. Neuron

Claims (3)

1. Způsob podpory nervového růstu in vivo v centrální nervové soustavě savce vyznačující setím, že obsahuje podávání množství látky podporující nervový růst savce, látky obsahující nervovou buněčnou adhezní molekulu, která je schopna překonat inhibiční molekulární cesty vyskytující se v gliových buňkách a myelinu a podporující nervový růst, a podávání aktivních fragmentů z této látky odvozených, příbuzných látkek, obdobných látek, antagonictických látek, protilátek , analog, sekretujících buňek a rozpustných molekul, těch všech z této látky odvozených a nebo na této látce založených.

   Způsob podle nároku 1 vyznačující setím, že obsahuje látku odvozenou od členů velké imunoglobulinové rodiny, kteří zprostředkovávají nervovou buněčnou adhezi nezávislou na Ca²⁺.

   Způsob podle nároku 1 vyznaču jící se tím, že obsahuje látku odvozenou z molekul, které obsahují strukturní motivy podobné homologním opakováním ve fíbronektinu typu III a doménám podobným imunoglobulinu.

   Způsob podle nároku 3 vyznaču jící setím, že obsahuje strukturní motivy strukturně podobné homologním opakováním 1 až
2. 2 ve fíbronektinu typu III a doménám podobným imunoglobulinu I až II, III až IV a V až VI

   Způsob podle nároku 2 vyznaču jící setím, že obsahuje látku vybranou ze skupiny sestávající z LI, N-CAM a glykoproteinu asociovaného s myelinem.

   Způsob podle nároku 2 vyznaču jící setím, že obsahuje látku vybranou ze skupiny sestávající z lamin inu, fíbronektinu, Ncadhedrinu, BSP-2 (myší N-CAM), D-2, 224-1A6-A1, Ll-CAM, NILE, Nr-CAM, TAG-1 (axonin-1), Ng-CAN a F3/F11.

   Rekombinantní molekula DNA pro použití ve způsobu podle jakéhokoliv nároku 1 až 6 obsahující látku, aktivní fragment, příbuznou látku, obdobnou látku nebo analog, vše z té látky odvozené, které jsou spojeny s expresní kontrolní sekvencí.

   Vektor obsahující rekombinantní molekulu DNA podle nároku 7.

   Transformovaný hostitel obsahující vektor podle nároku 8.

   Protilátka vyvolaná proti látce podle jakéhokoliv nároku 1 až 6.

   Protilátka podle nároku 10 obsahující polyklonální protilátku.

   Protilátka podle nároku 10 obsahující monoklonální protilátku.

   Způsob upravující nervový růst v centrální nervové soustavě savce vyznačující setím, že obsahuje podáváním nervový růst upravujícího množství protilátky podle nároku 10, nebo podáváním fragmentů, příbuzných látek, obdobných látek, analog, sekretujících buněk nebo rozpustných molekul, těch všech z této protilátky odvozených a nebo na této látce založených.

   Farmaceutický prostředek pro úpravu nervového růstu v centrální nervové soustavě savce vyznačující setím, že obsahuje terapeuticky účinné množství látky podle nároku 1, posilujících látek, antagonistických látek, fragmentů, příbuzných látek, obdobných látek, analogů, sekretujících buněk nebo rozpustných molekul a farmaceuticky přijatelných nosičů těch všech z této protilátky odvozených a nebo na této látce založených.

   Transgenní savci obsahující gliové buňky, které exprimují exogenní nervovou adhezní molekulu.

   Transgenní savci podle nároku 15, kde jsou gliovými buňkami astrocyty.

   Transgenní savci podle nároku 15, kde je nervovou adhezní molekulou LI.

   Buněčná kultura obsahující gliové buňky transgenních savců podle jednoho z nároků 15 až 17.

   Buněčný tkáňový systém obsahující tkáň z nervové centrální soustavy buňky transgenních savců podle jednoho z nároků 15 až 17.

   Způsob posilování nervového růstu neuronů CNS vyznaču jící se t í m, že obsahuje pěstování neuronů v buněčném tkáňovém systému podle nároku 18.

   Způsob posilování nervového růstu neuronů CNS vyznaču jící se t í m, že obsahuje pěstování neuronů v buněčném tkáňovém systému podle nároku 19.

   Způsob posilování paměti vyznačující setím, že obsahuje podávání množství buněk buněčného tkáňového systému podle nároku 18 do mozku savce, který toto posilování paměti potřebuje.

   Způsob posilování paměti vyznačující setím, že obsahuje podávání množství buněk buněčného tkáňového systému podle nároku

   19 do mozku savce, který toto posilování paměti potřebuje.

   24. Způsob posilování paměti vyznačující setím, že obsahuje dopraveni vektoru, který umožňuje expresi nervové adhezní molekuly v gliových buňkách, do gliových buněk mozku savce, který toto posilování paměti potřebuje.

   25. Způsob podle nároku 24 vyznačující setím, že nervovou adhezní molekulou je LI.

   26. Způsob zvýšení synaptické výkonnosti v CNS savce, který toto zvýšení potřebuje, vyznačující setím, že obsahuje podávání množství buněk buněčného tkáňového systému podle nároku 18 do mozku savce.

   27. Způsob zvýšení synaptické výkonnosti v CNS savce, který toto zvýšení potřebuje, vyznačující setím, že obsahuje podávání množství buněk buněčného tkáňového systému podle nároku 19 do mozku savce.

   28. Způsob zvýšení synaptické výkonnosti v CNS savce, který toto zvýšení potřebuje, vyznačující setím, že obsahuje dopravení vektoru, který umožňuje expresi nervové adhezní molekuly v gliových buňkách, do gliových buněk mozku savce, který toto zvýšení potřebuje.

   29. Způsob podle nároku 26 vyznačující setím, že zvýšení synaptické výkonnosti je demonstrováno stabilizací dlouhotrvající potenci ace.

   30. Způsob podle nároku 27 vy z nač u jící se tím, že zvýšení synaptické výkonnosti je demonstrováno stabilizací dlouhotrvající potenciace.
3. 3 1. Způsob podle nároku 28 vyznaču jící se tím, že zvýšení synaptické výkonnosti je demonstrováno stabilizací dlouhotrvající potenciace.

   32. Způsob testování schopnosti látky nebo jiné entity upravovat aktivitu nervové adhezní molekuly, vyznaču jící se tím, že obsahuje:

   a. přidávání neuronů CNS do buněčného tkáňového systému podle nároku 18;

   b. přidávání testované látky do buněčného tkáňového systému;

   c. měření nervového růstu neuronů CNS; a

   d. korelování rozdílu v hladině nervového růstu buněk obsahujících tuto látku vzhledem ke kontrolní kultuře, do které nebyla žádná taková látka přidána.

   • « ······ ·« · · » • · · · · · · • · · · · ·

   33. Způsob testování schopnosti látky nebo jiné entity upravovat aktivitu nervové adhezní molekuly, vyznačující setím, že obsahuje:

   a. přidávání neuronů CNS do buněčného tkáňového systému podle nároku 19;

   b. přidávání testované látky do buněčného tkáňového systému;

   c. měření nervového růstu neuronů CNS; a

   d. korelování rozdílu v hladině nervového růstu buněk obsahujících tuto látku vzhledem ke kontrolní kultuře, do které nebyla žádná taková látka přidána.

   34. Způsob podle nároku 32 vyznačující setím, že nervovou adhezní molekulou je LI.

   35. Způsob podle nároku 33 vyznačující setím, že nervovou adhezní molekulou je LI.

   36. Zkouškový systém na testování látek a jiných činidel na schopnost upravovat produkci nervové adhezní molekuly, vyznačující se t í m, že obsahuje:

   a. pěstování buněčného tkáňového systému podle nároku 18 zaočkovaného látkou nebo činidlem;

   b. přidávání neuronů CNS do buněčného tkáňového systému kroku a); a

   c. měření nervového růstu za účelem stanovení vlivu látky na výše uvedené.

   37. Zkouškový systém na testování látek a jiných činidel na schopnost upravovat produkci nervové adhezní molekuly, vyznačující se t í m, že obsahuje:

   a. pěstování buněčného tkáňového systému podle nároku 19 zaočkovaného látkou nebo činidlem;

   b. přidávání neuronů CNS do buněčného tkáňového systému kroku a); a

   c. měření nervového růstu za účelem stanovení vlivu látky na výše uvedené.

   38. Zkouškový systém podle nároku 36 vyznačující setím, že nervová adhezní molekula je vybrána ze skupiny sestávající z lamininu, fibronektinu, N-cadhedrinu, BSP-2 (myší N-CAM), D-2, 224-1A6-A1, Ll-CAM, NILE, Nr-CAM, TAG-1 (axonin-1), Ng-CAN a F3/F11.

   39. Zkouškový systém podle nároku 36 vyznaču jící se tím, že nervovou adhezní molekulou je LI.

   40. Zkouškový systém podle nároku 37 vyznaču jící setím, že nervová adhezní molekula je vybrána ze skupiny sestávající z lamininu, fibronektinu, N-cadhedrinu, BSP-2 (myší N-CAM), D-2, 224-1A6-A1, Ll-CAM, NILE, Nr-CAM, TAG-1 (axonin-1), Ng-CAN a F3/F11 í'· V Z