CZ33298A3

CZ33298A3 - Promotor lidského endoglinového genu a jeho použití pro přípravu léčiva

Info

Publication number: CZ33298A3
Application number: CZ98332A
Authority: CZ
Inventors: Wolff Graulich; Dirk Nettelbeck; Hans-Harald Prof. Dr. Sedlacek; Rolf Prof. Dr. Müller
Original assignee: Aventis Pharma Deutschland Gmbh
Priority date: 1997-02-06
Filing date: 1998-02-04
Publication date: 1998-08-12
Also published as: EP0857781A3; CN1203948A; AU736724B2; PL324688A1; TR199800168A2; KR19980071084A; JPH11178A; BR9800563A; AR011110A1; CA2222981A1; HU9800247D0; DE19704301C1; AU5293198A; MX9800981A; CZ289227B6; HUP9800247A2; CN1196784C; EP0857781A2; US6103527A; RU2230115C2

Description

Promotor lidského endoglinového genu a jeho použiti pro přípravu léčiva

Oblast techniky

Vynález se týká promotoru lidského endoglinového genu, nebo jeho funkčních skupin a jeho použiti pro přípravu léčiva.

Dosavadní stav techniky

Jedním z důležitých problémů genové terapie je řízeni transkripce a translace efektorového genu, který je vložen do buňky. Toto řízení je na úrovni transkripce umožněno připojením sekvence promotoru nebo zesilovače před kódující sekvenci efektorového genu („upstream od efektorového genu).

Pod pojmem „promotorové sekvence rozumíme úsek genu, ke kterému jsou schopny se vázat regulační proteiny, tzv. transkripční faktory, které aktivují transkripci efektorového genu, ležícího za promotorovou sekvencí („downstream od promotoru). Sekvence ležící po směru transkripce se označují jako „downstream sekvence, sekvence položené v opačném směru jako „upstream sekvence. „Efektorovým genem se všeobecně rozumí strukturní gen, jehož genový produkt má např. požadovaný účinek ve smyslu genové terapie.

Promotorové sekvence mohou být specifické pro buňku, buněčně nespecifické, virově specifické, metabolicky specifické nebo specifické pro buněčný cyklus. Příklady takových promotorových sekvencí a jejich použití, např. pro • · genovou terapii různých nemoci, jsou uvedeny v patentových přihláškách WO 96/06940, WO 96/06938, WO 96/06941 a WO 96/06939. Kromě toho tyto patentové přihlášky předkládají způsoby a příklady kombinování těchto promotorových sekvencí, např. pro účely řízení efektorovéno genu způsobem specifickým pro buňku nebo pro buněčný cyklus.

Promotory, v závislosti na jejich výběru a kombinaci, způsobí- více či méně omezenou a více či méně silnou transkripci efektorového genu, který je na nich závislý. Endotelové buňky jsou příkladem výhodných cílových buněk pro genovou terapii, na jedné straně proto, že endotelové buňky jsou přímo přístupné genovým konstruktům, které se injikují do oběhového systému, a na druhé straně proto, že se přímo účastní rozvinutí a postupu mnohých poruch, jako jsou např. nádorová onemocnění, záněty, alergie, autoimunitní nemoci, reakce odhojení orgánu, oběhové a koagulační poruchy, a také se účastní procesu uzdravování, anebo jsou v přímém sousedství s místem takových poruch.

Cílové promotory specifické pro buňku jsou zpravidla promotory genů kódující takové proteiny, které se tvoří zvláště silně anebo výlučně, v příslušné cílové buňce. V případě endotelových buněk je jedním takovým proteinem endoglin.

Endoglin je receptor TGFP, který nepřenáší signál (Gougos et al., J. Biol. Chem. 265: 8361, 1990, Cheifetz, J. Biol. Chem. 267, 19027, 1992, Mořen et al., BBRC 189, 356, 1992). Zatímco v normálním endotelu se vyskytuje v malém množství, v proliferujícím endotelu se exprimuje ve zvýšeném rozsahu (Westphal et al., J. Invest. Der. 100, 27, 1993, Burrows et al., Pharmac. Ther. 65, 155, 1994). Nic dalšího není známo o síle promotoru a jeho buněčné specifičnosti.

• · · · • · · · • e ··· · · · · • · ·· · ·· ···· · • » · · · · · · · • · · · · ·» · · *♦ ··

Přestože gen endoglinu je znám už 4 roky (Bellon et al., 1993), nebylo dosud možné izolovat endoglinový promotor.

Sekvence cDNA lidského endoglinu byla popsána Bellonem et al. (Eur. J. Immunol. 23, 2340, 1993), zatímco sekvenci myšího endoglinu popsal Ge et al. (Gene 138, 201, 1994). Přestože je dostupná sekvenční informace pro část netranslatovaného úseku na 5'konci endoglinového genu, nic se neví o funkci tohoto úseku ani o promotorovém úseku.

Receptor VEGF je jiný endotelový buněčně specifický protein. V tomto případě se rozlišují dva receptory (Plate et al., Int. J. Cancer 59, 520, 1994): Receptor VEGF 1 (fit—1) (deVries et al., Science 255, 989, 1992), jehož cytoplazmatická část obsahuje tyrosinkinázu podobnou fms, a receptor VEGF 2 (flk 2, KDR) (Terman et al., BBRC 187, 1579, 1992), jehož cytoplazmatická část obsahuje tyrosinkinázu. Oba receptory se nacházejí téměř výlučně na endotelových buňkách (Senger et al., Cancer Metast. Rev. 12, 303, 1993).

Další endotelové buněčně specifické receptorové tyrosinkinázy jsou tie-1, tie-2 (Partanen et al., Mol. Cell Biol. 12, 1698, 1992, Schnuerch a Risau, Development 119, 957, 1993, Dumont et al., Oncogene 7, 1471, 1992) a B61 receptory (Eck) (Bartley et al., Nátuře 368, 558, 1994, Pandey et al., Science 268, 567, 1995, van der Geer et al., Ann. Rev. Cell Biol. 10, 251, 1994).

Jiným endotelovým buněčně specifickým proteinem je molekula B61, což je ligand receptoru B61 (Holzman et al., J. Aminokyselin. Soc. Nephrol. 4, 466, 1993, Bartley et al., Nátuře 368, 558, 1994), endothelin a zvláště endothelin B (O'Reilly et al., J. Cardiovasc. Pharm. 22, 18, 1993, Benatti et al., J. Clin. Invest. 91: 1149, 1993, O'Reilly et al., BBRC 193, 834,1993), jehož promotorovou sekvenci popsal • · · ·

Benatti et al.(J. Clin. Invest. 91: 1149, 1993), endothelin (Yanasigawa et al., Nátuře 332, 411, 1988), jehož promotorovou sekvenci popsal Wilson et al. (Mol. Cell Biol. 10, 4656, 1990), receptory endothelinu, zejména receptory endothelinu 1 (Webb et al., Mol. Pharmacol. 47, 730, 1995,

Haendler et al., J. Cardiovasc. Pharm. 20, 1, 1992), receptory manózo-6-fosfátu (Perales et al., Eur. J.Biochem. 226, 225, 1994), jejichž promotorovou sekvenci popsal Ludwig et al. (Gene 142, 311, 1994), Oshima et al. (J. Biol. Chem.

263, 2553, 1988) a Pohlman et al. (PNAS USA 84, 5575, 1987), von Willebrandův faktor (vWF), jehož promotorovou sekvenci popsali Jahroudi a Lynch (Mol. Cell. Biol. 14, 999, 1994), Ferreira et al. (Biochem. J. 293, 641, 1993) a Aird et al.

(PNAS USA 92, 4567, 1995).

Dalšími endotelovými buněčně specifickými proteiny jsou IL-1, např. formy IL-Ια a IL-Ιβ, které jsou produkovány aktivovanými endotelovými buňkami (Warner et al., J. Immunol. 139, 1911, 1987), jejichž promotorové sekvence popsali Hangen et al. (mol. Carcinog. 2, 68, 1986), Turner et al. (J. Immunol. 143, 3556, 1989), Fenton et al. (J.

Immunol. 138, 3972, 1987), Bensi et al. (Cell Growth Diff.

1, 491, 1990), Hiscott et al., Mol. Cell Biol. 13, 6231,

1993) a Moři et al. (Blood 84, 1688, 1994), receptor IL-1, jehož promotorovou sekvenci popsal Ye et al. (PNAS USA 90, 2295, 1993), a adhezivní molekula cévní buňky (VCAM-1), jejíž exprese je v endotelových buňkách aktivována lipopolysacharidy, TNF-α (Neish et al., Mol. Cell Biol. 15, 2558, 1995), IL-4 (Iademarco et al., J. Clin. Invest. 95,

264, 1995), a IL-5 (Marni et al., J. Clin. Invest. 92, 1866,

1993). Promotorovou sekvenci VCAM-1 popsali Neish et al. (Mol. Cell Biol. 15, 2558, 1995), Ahmad et al. (J. Biol.

·· ···· ·· ···· ·· ·· • · · « · ···· • · · · · · * ·· · « · • · · * · · ··· ••••á ·· ·· ·· ··

Chem. 270, 8976, 1995), Neish et al. (J. Exp. Med. 176,

1583, 1992), lademarco et al. (J. Biol. Chem. 267, 16323,

1992) a Cybulski et al. (PNAS USA 88, 7859, 1991).

Další endotelové buněčně specifické promotory jsou syntetické aktivátorové sekvence, a to takové syntetické aktivátorové sekvence, které jsou složeny z oligomerizovaných vazebných míst pro transkripční faktory přednostně nebo selektivně aktivní v endotelových buňkách, jako je např., transkripční faktor GATA-2, jehož vazebné místo v endotelinovém genu 1 je 5'-TTATCT-3' (Lee et al., Biol. Chem. 266, 16188, 1991, Dorfmann et al., J. Biol. Chem. 267, 1279, 1992, Wilson et al., Mol. Cell Biol. 10, 4854, 1990), a mohou se použít jako alternativa k přirozeným promotorům specifickým pro endotel, a také endotelový glukózový přenašeč 1 specifický pro mozek, neboť mozkové endotelové buňky exprimují tento přenašeč velmi silně kvůli transendotelovému přenosu D-glukózy v mozku (Gerhart et al.,

J. Neurose. Res. 22,

Promotorovou sekvenci popsal Murakami et al.

(J. Biol. Chem.

267, 9300, 1992).

Avšak některé z těchto promotorů, přestože jsou dostatečně specifické pro endotelové buňky, jako např.

promotor genu von Willebrandova faktoru nebo gen receptoru

VEGF (flk-1), mají relativně nízkou aktivitu. Aktivita takových „slabých” promotorů může být zvýšena jejich kombinací s bazálním promotorem zesilovačem, ale to je obvykle (např. SV40) nebo doprovázeno snížením specifičnosti.

Podstata vynálezu

Cílem předkládaného vynálezu proto bylo najit promotor, který by byl jak specifický pro endotel tak i dostatečně silný.

Překvapivě se zjistilo, že právě gen endoglinu má, kromě jiných vlastnost i obě tyto vlastnosti.

Vynález se proto týká promotoru lidského endoglinového genu a jeho funkčních skupin nebo variant. Zjistilo se, že

tento promotor	zaujímá délku nejvýše	2415	párů baží	(tab. 1,
sekvence s identifikačním číslem	1) a	výhodně	obsahuje
nukleotidovou	sekvenci 1 až 2378,	a to	včetně	iniciační
sekvence.
Aby bylo	možné promotor podle	tohoto	vynálezu

charakterizovat, promotorové sekvence endoglinového genu, nebo její části, byla spojena s reportérovým genem (tj. např. gen kódující enzym luciferázu) v plazmidu pGL3 (Promega), a tímto konstruktem byly transfekovány endotelové buňky (buněčná linie ECV-340) a pro srovnání také cervikální karcinomové buňky (buněčná linie HeLa). Překvapivě se zjistilo, že endoglinový promotor je 80x silnější než vWF promotor. To je tak překvapivé proto, neboť vWF se exprimuje endotelově specifickým způsobem a dalo by se tedy očekávat, že síla endoglinového promotoru bude podobná promotoru vWF. Zjistilo se také, že endoglinový promotor je 30x aktivnější v endotelových buňkách než v buňkách cervikálniho karcinomu. To je opět překvapivé, neboť promotor vWF, který je také endotelově specifický, má podobnou sílu jak v endotelových buňkách tak i v buňkách cervikálniho karcinomu. Tudíž genový promotor vWF je výrazně překonán endoglinovým promotorem podle vynálezu, a to jak z hlediska síly promotoru, tak i z hlediska specifičnosti promotoru.

Dále se zjistilo, že části promotorových sekvenci podle vynálezu projevuji silnou endotelově specifickou aktivitu.

V následující tabulce jsou uvedeny relativní aktivity (vztažené k aktivitě promotoru SV40 jako standardu) konstruktů promotoru endoglinového genu, odstraněnou (deletovanou) oblastí 5'konce, který má v endotelově buňce.

Nukleotidová sekvence	Relativní aktivita
promotor SV40	1
endoglinový promotor (tab. 1, sekvence
ident. č. 1), sekvence: 1 - 2415	11,5
částečná sekvence: 36-2415	10,2
částečná sekvence: 470-2415	13,0
částečná sekvence: 948-2415	10,0
částečná sekvence: 1310-2415	2,0
částečná sekvence: 1847-2415	3,3
částečná sekvence: 2339-2415	0,2

„Funkčními skupinami promotoru se v tomto vynálezu rozumí všechny částečné sekvence promotoru podle vynálezu, které mají promotorovou aktivitu, zvláště pak částečné sekvence od nukleotidu 1 k nukleotidu 2378, od nukleotidu 36 k nukleotidu 2378, od nukleotidu 470 k nukleotidu 2378 a od nukleotidu 948 k nukleotidu 2378, a také od nukleotidu 36 k nukleotidu 2415, od nukleotidu 470 k nukleotidu 2415, od nukleotidu 948 k nukleotidu 2415, výhodně částečné sekvence od nukleotidu 470 k nukleotidu 2415 a od nukleotidu 470 k nukleotidu 2378. Částečné sekvence s promotorovou aktivitou zasahují také např. od nukleotidu 1310 k • · · · « * • · · · nukleotidu 2415, od nukleotidu 1310 k nukleotidu 2378, od nukleotidu 1847 k nukleotidu 2415 a od nukleotidu 1847 k nukleotidu 2378.

Avšak předkládaný vynález se neomezuje na promotor popsaný sekvencí identifikačního čísla 1 a jeho funkční skupiny, ale zahrnuje také jeho varianty, které projevují promotorovou aktivitu. Varianty této povahy obsahují např. delece, adice, inzerce a/nebo substituce jedné nebo více baží, výhodně 1 až 50, zvláště 1 až 25 a zejména 1 až 5 baží. Promotorové aktivita se dá snadno měřit, např. popsaným luciferázovým testem.

Předkládaný vynález se dále týká konstruktu nukleové kyseliny, který obsahuje:

a) alespoň jednu nukleotidovou sekvenci (sekvenci nukleové kyseliny) promotoru podle vynálezu (složka a) a dále, kde je to vhodné

b) alespoň jeden efektorový gen (složka b) , jehož transkripce je aktivována složkou a.

Přitom složka a je výhodně lokalizována proti směru čteni („upstream) od složky b.

Předkládaný vynález se dále týká konstruktu nukleové kyseliny, ve kterém se promotorové sekvence endoglinového genu podle vynálezu kombinuje s promotorovou sekvencí, která je specifická pro jinou cílovou buňku, nebo je virově, či metabolicky specifická, nebo je specifická pro buněčný cyklus, a alespoň s jedním efektorovým genem, a to tak, že tato kombinace promotorových sekvencí řídí aktivaci transkripce alespoň jednoho efektorového genu.

Nukleotidový konstrukt podle vynálezu je výhodně tvořen deoxyribonukleovou kyselinou DNA. Termín „konstrukt nukleové kyseliny nebo „nukleotidový konstrukt znamená umělou • · • · · · • ♦ • · · · strukturu, která je tvořena nukleovou kyselinou a která je v cílové buňce přepisována. Konstrukt je výhodně vložen do vektoru (nosiče), např. do virového vektoru, nebo do nevirového vektoru, jako je např. plazmid. Odborníkovi jsou známy způsoby přípravy jak virových tak i nevirových vektorů.

Předkládaný vynález se dále týká buněk, které obsahují konstrukt nukleové kyseliny podle vynálezu.

Všeobecně platí, že výběr efektorového genu závisí na nemoci, která bude genovými konstruktem léčena.

Příklady efektorových genů pro léčení nádorových onemocnění, leukémií, autoimunitních nemocí, alergií, artritid, zánětů, odhojení orgánu a reakce hostitele proti štěpu, poruchy systému krevní koagulace, kardiovaskulární nemoci, anémie, infekce nebo poškození CNS, v patentových přihláškách WO 96/06940, WO jsou popsány

96/06938, WO

96/06941 a WO 96/06939.

Tak např. efektorové geny vyhovující předkládanému vynálezu kódují cytokin, chemokin, růstový faktor, cytokinový receptor, chemokinový receptor nebo receptor pro růstový faktor, a dále také antagonistu cytokinu, protein indukující cytostázi, cytotoxicitu nebo apoptózu, a také protilátku nebo fragment protilátky, inhibitor angiogeneze, koagulační faktor, inhibitor koagulace, fibrinolytický protein, enzym štěpící prekurzor léku a tak tvořící lék, protein s účinkem na krevní oběh, nebo antigen infekčního patogenu, který vyvolá imunitní reakci.

Konstrukt nukleové kyseliny podle vynálezu může dále obsahovat dva nebo více shodných nebo odlišných efektorových genů, které jsou navzájem spojeny buď promotorovými sekvencemi nebo sekvencí vnitřního ribozomálního vstupního

4 • · · · • * • · · · • · 4 * 4 4 4 · 4 4 4·

4 · · · 4 4· • 444» «4 · ·4· 44 místa (IRES). Příklady jsou též uvedeny ve výše zmíněných patentových přihláškách.

Konstrukt nukleové kyseliny podle vynálezu se může použít např. pro expresi genu specifickou výhradně pro endotelové buňky, expresi specifickou pro endotelové buňky a současně metabolicky specifickou, pro expresi specifickou pro endotelové buňky a současně specifickou pro buněčný cyklus a/nebo specifickou pro endotelové buňky a současně virově specifickou, přičemž gen je výhodně gen kódující farmakologicky aktivní sloučeninu nebo enzym, který štěpí neaktivní prekurzor léku, a tím vytváří aktivní lék.

Konstrukt nukleové kyseliny podle vynálezu se výhodně použije pro přípravu léčiva pro léčení výše uvedených nemocí, přičemž příprava léčiva obecně zahrnuje klonování konstruktu nukleové kyseliny do vhodného vektoru, který je pak podáván pacientovi. Odborníkovi jsou známy další způsoby použití promotoru podle vynálezu nebo konstruktu nukleové kyseliny podle vynálezu.

Následující příklady společně s tabulkou a obrázky popisují podrobněji vynález, aniž by ho jakkoliv omezovaly.

Tabulka 1. Sekvence lidského endoglinového promotoru. Báze č. 1 odpovídá úseku sekvence nejblíže 5'konci. Vysoce konzervativní sekvenční Alu oblast leží mezi bázemi 1360 až 1666, zatímco dokumentovaná homologická oblast s cDNA z M. musculus začíná v oblasti blíže 3'konci od báze 2300 a dokumentovaná část cDNA z H. sapiens (netranslatovaný 5' úsek) začíná od báze 2379.

• · · 4 • · · · • 4

Popis obrázků

Obr. 1. Klonováni promotoru lidského endoglinového genu. A: Fragment promotoru lidského endoglinového genu, připravený metodou PCR, byl klonován do klonovaciho místa TA ve vektoru pCR 2.1 (Invitrogen). B: Fragment obsahující promotor lidského endoglinového genu byl vystřižen z konstruktu pCR 2.1 Endo restrikčními enzymy Mlul a Xhol a klonován do reportérového vektoru pGL3 s luciferázou (Promega).

Obr. 2. Luciferázová aktivita různých promotorů specifických pro endotelové buňky. Všechny promotory byly klonovány do vektoru pGL3 a hodnoty jsou standardizovány vzhledem k bazálnímu promotoru SV40.

SV40 je bazální SV40 promotor bez zesilovače. pGL3Endo je endoglinový promotor (viz. obr. 1B). Zesilovač vWF+SV40 znamená promotor von

Willebrandova faktoru zesílený zesilovačem

SV40 umístěným promotor VEGF receptoru flk-1 (-224/startovni kodon).

vWF je promotor von

Willebrandova faktoru bez dodatečných zesilovačů.

Obr. 3.

Luciferázová aktivita promotoru lidského endoglinového genu v endotelových a jiných buňkách.

Konstrukty jsou stejné jako na obr. 2.

Aktivita endoglinového promotoru v endotelových buňkách linie ECV40 byla srovnána s aktivitou téhož promotoru v buňkách HeLa z buněčné linie cervikálního karcinomu. Výsledky jsou standardizovány vzhledem k bazálnímu promotoru SV40. V tomto testu byla aktivita v buňkách ECV304 29x vyšší než v HeLa • · · · • · · · • · · · · ···· • · · · · «4 ♦ · · ·· • · 9 · ♦ ····

9 9 9 9 ·· ·· « ··9 buňkách.

Obr. 4. Předpokládaná vazebná místa pro transkripčni faktory v endoglinovém promotoru. Je ukázán pouze úsek mezi Alu sekvencí a začátkem cDNA. Všechna vazebná místa jsou umístěna na ( + ) řetězec.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Pro klonování promotoru byla užita klonovací souprava „Promoter-Finder DNA Walking (Clontech). Pomocí této soupravy byl namnožen (amplifikován) fragment

2,4 kb ležící ve směru

5' od dokumentované sekvence.

Amplifikace proběhla ve dvou bězích PCR, a sice z 5'netranslatovaného úseku cDNA lidského endoglinového genu pomocí dvou genově specifických oligonukleotidových primerů:

El: GCTGGGCTGGAGTTGCTGTCCGAAGGATG (sekvence identifik. č. 2)

E2: AATGGATGGCAGTGACAGCAGCAGTCCTG (sekvence identifik. č. 3)

Podmínky pro PCR byly následující:

1. PCR : Oligonukleotidový primer El, 25 s při 94 °C, 39 cyklů: 25 s při 94 °C, 20 s při 60 °C, 4 min při 68 °C, a 4 min při 68 °C.

2. PCR (hnízdové, „nested): Oligonukleotidový primer E2, s při 94 °C, 26 cyklů: 25 s při 94 °C, 20 s při 61 °C, 4 min při 68 °C, a 4 min při 68 °C.

Polymeráza: DNA polymeráza pro amplifikaci dlouhých templátů (Boehringer Mannheim).

• · • · · · • · · ·

Fragmenty amplifikované v PCR byly přečištěny pomoci odstředivkových minikolon QIAquick (Qiagen), a pak vloženy do klonovaciho vektoru (pomoci klonovaci soupravy „Originál TA Cloning, Invitrogen). Takto vzniklý konstrukt pCR2.1Endo (viz obr. la) byl sekvenován a klonovaná oblast byla rozpoznána jako 2415 baží dlouhý úsek 5'koncové oblasti lidského endoglinového genu (sekvence viz. tab. 1).

Klonovaný úsek z tohoto vektoru byl klonován do luciferázového reportérového vektoru pGL3 (Promega) a aktivita promotoru byla testována jako u konstruktu pGL3Endo (viz obr. lb) v buňkách HeLa a buňkách ECV304.

Buňky byly transfekovány buď způsobem který používá DEAE/dextran (upraveno podle Sompayrac et al., PNAS 78, 7575, 1981) nebo použitím prostředku LipofectAMINE (Gibco BRL) . Tak byl transfekován konstrukt pGL3Endo stejně jako bazální promotor SV40 coby standard. Promotor flk-l-(VEGF) (-225/startovní kodon ATG) a promotor Willebrandova faktoru (vWF) (-487/+247) , buď s nebo bez zesilovače SV40, byly také transfekovány. Konstrukt obsahující zesilovač SV40 je odlišný tím, že jeho aktivita je výrazně vyšší než aktivita promotoru divokého typu, zatímco jeho specifičnost, i když je snížená, není odstraněna. Všechny konstrukty byly klonovány do pGL3 a luciferázový test byl proveden tak, jak jej popisuje Herber et al. (Oncogene 9, 1295, 1994) a Lucibello et al. (EMBO J. 14, 132, 1995).

Luciferázová aktivita různých promotorů v buňkách ECV304 (obr. 2) ukazuje, že klonované fragmenty 5'koncového úseku endoglinového genu projevují promotorovou aktivitu. Tato aktivita je velmi vysoká v porovnání s aktivitou jiných promotorů specifických pro endotelové buňky. Je 4x vyšší než aktivita promotoru flk-1 a více než 80x vyšší než aktivita « · · · • · . · · · · • · • · · · · « * ♦ · · · · • · · · · · · · · • · · · · · · · · · · · · promotoru vWF. Aktivita konstruktu pGL3Endo je dokonce vyšší než aktivita promotoru vWF zesíleného sekvenci zesilovače SV40. Tyto údaje potvrzují, že klonovaný úsek je promotor lidského endoglinového genu.

Obr. 3. ukazuje srovnání aktivity endoglinového promotoru v buňkách linie ECV340 a HeLa buňkách linie cervikálního karcinomu. Když jsou hodnoty standardizovány vzhledem k bazálnímu promotoru SV40, aktivita v ECV340 buňkách je 29x vyšší než v HeLa buňkách. To ukazuje, že klonovaný promotor je nejen aktivní v endotelových buňkách, ale je současně specifický (selektivní) pro tyto buňky.

Obr. 4. znázorňuje pravděpodobná vazebná místa pro transkripční faktory v sekvenci endoglinového promotoru. Několik silně homologních potenciálních vazebných míst, která mohou zodpovídat za specifičnost (selektivitu) a aktivitu promotoru a která zahrnují několik konzervativních NF-κΒ vazebných míst, leží v úseku mezi konzervativní Alu sekvencí a dokumentovanou cDNA sekvencí.

Průmyslová využitelnost

Vynález se týká promotoru lidského genu endoglinu, jeho funkčních skupin a jeho použití pro přípravu léčiva. Léčivo připravené na základě promotoru dle vynálezu je vhodné pro genovou terapii různých nemocí, jako např. nádorových onemocněni, leukémií, autoimunitních nemocí, alergií, artritid, zánětů, odhojeni orgánu a reakce hostitele proti štěpu, poruch systému krevní koagulace, kardiovaskulárních nemocí, anémie, infekce nebo poškození CNS.

• 4 • · · ·

4 4 4

4 44 44444 • 4 · · · * · 4 4 4 44

4 444· 4 4· · 4 4 · 44 44 4 4 44

1. Sekvence identifikačního čísla 1.

1	CGGGGGTTCC TCCTCTGTAA AGTGGAGGTA
31	TAACGGTACC CACCTCCTGG GGTGGCTGTG
61	AGGATTCAGA GCTGATAAGG TGAACGCCTA
91	GGGCGGGCCC TGGTGCAGAG AGAGCGCTCA
121	GCTCCTAGGG CTGGATTAAC TGTCCCTGGG
151	GCACAGATCT CGGTCTGGGG CCTGTGGAAA
181	CCTCAGAGCC ACCCCTGAAC CCCCACCGAG
211	CCACCCTTTG CCTCGCAGTG CCCATGGCCT
241	CGTCTCCGAG GTTACAGGAA AAGGCAGAGG
271	AGATGCCCTT CTCAGGGTGG CCCTCTGGGA
301	GAGGACACTC TCCCTTGACC TCAAAGCCAC
331	GCTTGGCTGC AAACTGGCCA GGCAGCCACA
361	AGGCTGGGCA AGCAGAACGA TCCCTAATCC
391	CCACCCAAAG AGCCACACCG ACCCTCCCAG
421	CCGCTGTGAC AGCTCCTGCA GAGACAAACA
451	CACGGCCTAC TCTTGTCACC CGGGCCGGCC
481	AATAAGCACG GAGAGGCAAG GCCTCAGACC

• · · · · · · · · · · · • · · · · · · · · • · · · · · · · · · · · ·

CTGGACAGAC ATCCTCCCTC CAGAGGCACC

AGGGCCTCAG CCTTCTCCTC CCTCCCTGGG

CCTCAATTTC TCCACCTGTG ACCCAGGGCA

GGTGGATCCA GGGAGAAGAA CCTTCTGGCT

CCATCTCACC ATGGGTCCTG GCAGCACACA

CAAAGATTTG GCCTCTCAAA GCCTAGCTCT

GCCAGCGTCC TTCTGCTCAA GAACTCTCCA

TGACTCCCAG TGGCCCTAAG GACAAAGTCC

TGGCATTTGA GGCCCTCCCA ATGCAGGGCC

AGACTCTGCC TCTCCAGCTT CCTGTCCCCA

CCACACCCCT GCTGGTCTCA CGGTGGTCCG

ACTGTTTCCT GCTTCTGTGC CTTTGCTTAG

TCTGGCACCC CTGCCTGGCA TGCTTTCCTC

ACCCCTTCTT CTCCCCAATC CCAACTCACC

CAGTCTTTCA AAGGGCAGGC CTAAATACCA

GGCCCTCCAG GTGGCCCAGG ATTCCTTCTC

TGAGCTTTCA TGGGCCTGGC CCTGGGTGCT

ACCTGTGAGT AGTCCCACGG TGGGTACATA

1-.

1051

1081

1111

1141

1171

1201

1231

1261

1291

1321

1351

1381

1411

1441

1471

1501

1531

1561

GTAGGTGCGC TTACTGTTCG CAGAATGAAC ATGGGACAGT TTGGGGACTG TCACCCAGCT CAGGGAGCAC TGATGGGGAA GCATCTCCTG TATGTCCCAG GGCTCAGTGC TGTAGTGTCC TGACCCTCAG AAATCTCATA ATGGCTTGGT CAGGAAGGCA TCGTGCCCCA CTTTGCAAAC AGGGGGTGCT GAGAATTGAG GGGCCTTGTC CAAGGTCTCA TGGCTAGGAG CAAGCAGAAT CGGATTTGAA CCCAGGGCCA CGTGACTTCA GAAGTGCCAT TAAAGTCCCC ATAATTCGGA GCTGTCTTCT TTTTTTTTTT CTTTCTTTTT TTTGAGACCG AGCCTCACTC TGTCACCTAG GCCAGGAGTG CAGTGGTCTG ATCTCAGCTC ACTGCAACCT CCGCCTCCTA GGTTCAAGTG ATTCTCTAGC CTCAGCCTCC CAAGTAGCTG GGACTACAGG CGCACGTCAT CATGCCCAGC TAACTTTTGT ATTTTTAGTA GAGATGGGTT TTCACCATGT TGGTCAGGCT GGTCTCGAAC ·· · · «

TCCTGACCTC AAGTGATCCG TCTGCCTCGG CCTCTCAAAG TGCTGGGATT ATAGGCTTGA GCCACTACAC TCGGCCTGGA GCTGTGTTTT GTCGGTGAAG GATTTTCCAC CCATGAAGGG GTCAGACGTG AAGCGTGTGG CCCTGGGCAG CTCCTCTGAG CCCAGAGACG CCAGCCCTAG CCGCCTTGCT GTGCCACTTT GGGACTTCCC TCCCTAGCCT GAGCTTCAGT TTTCCTGCCT GTTAGGCAGC CCCATGTCAA CTGCACTTAG TAGGCCGGGT TTGATGCCCG ACAAGACGTG AAGTGGTGGA GGTGGGCAGG ATCCCAGCGC TACCATCTTC TTGAACCAGT GATCTCAACA CATCGGATTT CTGTTTCCTC ATCTGCAAAA TGGGATCAGT GAGCTCAGGT GGGTCACAAA TTCTACAGGA ACTACTTTAG CCAAGCCCGG CCCCCTGAAA GTTCCCCTCG GTGGGCAGTT AGGGTGATTG TTTTCATCTG TGGGGCTCCC

TGATGCGTCC CACCCACCAG CCTTGGAGAG

GGTGGGATGG GAGGGTGGGG TGCTTGGGGA

GACAAGCCTA GAGCCTGGGC CCTCCCACCC

CACTGCCTCC CCCCATCCCA GGGCCCCCCA CCCAGTGACA AAGCCCGTGG CACTTCCTCT ACCCGGTTGG CAGGCGGCCT GGCCCAGCCC CTTCTCTAAG GAAGCGCATT TCCTGCCTCC CTGGGCCGGC CGGGCTGGAT GAGCCGGGAG CTCCCTGCTG CCGGTCATAC CACAGCCTTC ATCTGCGCCC TGGGGCCAGG ACTGCTGCTG TCACTGCCAT CCATT

Claims

1. Promotor lidského endoglinového genu, obsahující sekvenci uvedenou v tab. 1, nebo funkční skupiny a varianty tohoto promotoru.

2. Promotor podle nároku 1, kde funkční skupiny obsahují sekvence nukleotidů 1 až 2378, 36 až 2378, 470 až 2378, 948 až 2378, 1310 až 2378, 1847 až 2378, 36 až 2415, 470 až 2415, 948 až 2415, 1310 až 2415 nebo 1847 až 2415.

3. Konstrukt nukleové kyseliny, obsahující alespoň jednu promotorovou sekvenci lidského endoglinového genu podle nároku 1 nebo 2.

4. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 3, který navíc obsahuje efektorový gen s promotorovou sekvencí lidského endoglinového genu (složka a) aktivující transkripci efektorového genu (složka b).

5. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 4, kde promotorové sekvence lidského endoglinového genu leží proti směru transkripce (upstream) od efektorového genu.

6. Konstrukt nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 3 až 5, kde promotorová sekvence lidského endoglinového genu se kombinuje s alespoň jednou další aktivační sekvencí, a tato aktivační sekvence je vybrána ze skupiny obsahující virově specifickou, metabolicky specifickou, buněčně specifickou nebo pro buněčný cyklus specifickou aktivační sekvenci.

·· ·*·· ·« ···· ·· ··

9 9 · · · «···» • · · · 9 9 99 9

9 9 99 9 9 9 999 99

9 9 9 9 9 9 9 99

999 9 9 9 9 9 9 99··

7. Konstrukt nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 3 až 6, kde nukleová kyselina je DNA.

8. Konstrukt nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 3 až 7, který je vložen do vektoru.

9. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 8, kde vektor je plazmidový nebo virový vektor.

10. Konstrukt nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 4 až 9, kde efektorový gen je gen kódující aktivní sloučeninu, která je vybrána ze skupiny obsahující cytokiny, chemokiny, růstové faktory, cytokinové receptory, chemokinové receptory, receptory pro růstové faktory, a také antagonisty cytokinů, proteiny s antiproliferačním, cytostatickým nebo apoptickým účinkem, protilátky, fragmenty protilátek, inhibitory angiogeneze, koagulační faktory, inhibitory koagulace, fibrinolytické proteiny, enzym štěpící prekurzor léku, a tím tvořící lék, protein s účinkem na krevní oběh, nebo antigen infekčního patogenu, který vyvolá imunitní reakci.

11. Konstrukt nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 3 až 10, který obsahuje několik efektorových genů, které jsou spojeny navzájem buď promotorovými sekvencemi nebo vnitřními ribozomálními vstupními místy (IRES).

12. Buňka obsahující konstrukt nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 3 až 11.

13. Použiti konstruktu nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 3 až 10, nebo buňky podle nároku 12, pro přípravu léčiva pro léčeni nemoci, která je vybrána ze skupiny obsahující nádorové nemoci, leukémie, autoimunitní nemoci, alergie, artritidy, záněty, odhojení orgánu, reakce hostitele proti štěpu, poruchy krevní koagulace, kardiovaskulární nemoci, anémii, infekce nebo poškození CNS.