CZ33436U1 - Sada oligonukleotidových sekvencí a rekombinantní plazmid pro detekci bakterií druhu Paenibacillus larvae - Google Patents

Sada oligonukleotidových sekvencí a rekombinantní plazmid pro detekci bakterií druhu Paenibacillus larvae Download PDF

Info

Publication number
CZ33436U1
CZ33436U1 CZ201936128U CZ201936128U CZ33436U1 CZ 33436 U1 CZ33436 U1 CZ 33436U1 CZ 201936128 U CZ201936128 U CZ 201936128U CZ 201936128 U CZ201936128 U CZ 201936128U CZ 33436 U1 CZ33436 U1 CZ 33436U1
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
oligonucleotide sequences
larvae
paenibacillus
recombinant plasmid
paenibacillus larvae
Prior art date
Application number
CZ201936128U
Other languages
English (en)
Inventor
Milan Bartoš
Lenka Chalupová
Viktor Růžička
Tomáš Erban
Original Assignee
Biovendor Laboratorni Medicina A S
Vu Rostlinne Vyroby Vvi
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biovendor Laboratorni Medicina A S, Vu Rostlinne Vyroby Vvi filed Critical Biovendor Laboratorni Medicina A S
Priority to CZ201936128U priority Critical patent/CZ33436U1/cs
Publication of CZ33436U1 publication Critical patent/CZ33436U1/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/124—Animal traits, i.e. production traits, including athletic performance or the like
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Sada oligonukleotidových sekvencí a rekombinantní plazmid pro detekci bakterií druhu Paenibacillus larvae
Oblast techniky
Technické řešení se týká sady oligonukleotidových sekvencí pro detekci bakterií druhu Paenibacillus larvae.
Technické řešení se dále týká také rekombinantního plazmidu pro použití jako standard při detekci bakterií druhu Paenibacillus larvae.
Dosavadní stav techniky
Bakterie druhu Paenibacillus larvae jsou původcem moru včelího plodu, což je celosvětově se vyskytující závažná choroba včel. Mor včelího plodu vede k uhynutí jednotlivých včelstev, ale i celých včelnic a způsobuje tak závažné ekonomické ztráty včelařům.
Cílem technického řešení je návrh sady oligonukleotidových sekvencí pro spolehlivou detekci bakterií druhu Paenibacillus larvae metodou polymerázové řetězové reakce (PCR) a návrh rekombinantního plazmidu pro použití jako standard pro kvantifikační účely.
Podstata technického řešení
Cíle technického řešení se dosáhne sadou oligonukleotidových sekvencí (primerů) 5-GACCTTTCATCTGTTCGCGG-3' (PaeF) a 5 -GACCCTTCGGTCCAAGTACC-3' (PaeR) se sondou 5-GGCGATGGCGGAAGGGAACC-3'.
Pro detekci bakterií druhu Paenibacillus larvae je oligonukleotidová sekvence PaeS na svém 5'konci označena vhodným známým fluoroforem (například fluoresceinem apod.) a na svém 3 konci jeho příslušným známým zhášečem.
Pro kvantifikační účely (určení koncentrace genomové DNA na principu jeden genom = jedna bakterie) se použijí vhodné standardy tvořené rekombinantními plazmidy, ve kterých je nasyntetizovaná jedna kopie cílové sekvence, jejíž součástí jsou výše uvedené oligonukleotidové sekvence. Vhodným rekombinantním plazmidem je např. plazmid se sekvencí
-GACCTTTCATCTGTTCGCGGTGCGAACTACCTGTTTGGTGGCGATGGCGGAAGGGA ACCACACGTACCCATCCCGAACACGGCCGTTAAGCCTTCCAGCGCCGATGGTACTTGG ACCGAAGGGTC-3 .
Při provádění detekce se smíchá část směsi pro polymerázovou řetězovou reakci (PCR mix) obsahující výše uvedené oligonukleotidové sekvence a další známé komponenty nutné k průběhu PCR reakce s jedním nebo více standardy o definované koncentraci cílové sekvence. Další část PCR mixu se smíchá s vyšetřovaným vzorkem. Následně proběhne PCR reakce současně se standardy i se vzorkem, přičemž se průběžně měří hodnoty relativní fluorescence vzorků i standardů. Poté se stanoví hodnota Ct, tedy druhá derivace křivky ze záznamu PCR. Při pozitivním výsledku (hodnota Ct vyšší než 35) se v případě potřeby použitím vhodného matematického modelu (lineární regrese závislosti hodnoty Ct na koncentraci standardu) spočítá výchozí koncentrace (množství genomů/bakterií) ve vyšetřovaném vzorku.
Samotná PCR reakce pak probíhá v termocykleru, přičemž nejprve probíhá 15 minut při teplotě 95 °C počáteční aktivace, poté za stejné teploty proběhne 45 amplifikačních cyklů, každý o délce
- 1 cz 33436 U1 sekund, následně probíhá 40 sekund při teplotě 60 °C čtení fluorescenčního signálu FAM a poté 20 sekund při teplotě 72 °C konečná extenze.
Tento postup umožňuje odlišit bakterie druhu Paenibacillus larvae od bakterií jiných druhů rodu Paenibacillus a také od bakterií rodu Mellisococcus, které jsou častým původcem infekce u včel a u kterých by mohlo dojít k jejich záměně s bakteriemi rodu Paenibacillus.
Objasnění výkresů
Na přiložených výkresech je na obr. 1 záznam z termocykleru při identifikaci izolátů DNA bakterií druhu Paenibacillus larvae s využitím sady oligonukleotidových sekvencí podle technického řešení, na obr. 2 záznam z termocykleru při detekci bakterií druhu Paenibacillus larvae ve vzorcích mrtvých včel s využitím sady oligonukleotidových sekvencí podle technického řešení a na obr. 3 záznam z termocykleru identifikaci bakteriálních kultur bakterií druhu Paenibacillus larvae s využitím sady oligonukleotidových sekvencí podle technického řešení.
Příklady uskutečnění technického řešení
Příklad 1
Použití sady jedinečných a doposud nepublikovaných oligonukleotidových sekvencí
5' -GACCTTTCATCTGTTCGCGG-3' (PaeF), 5' -GACCCTTCGGTCCAAGTACC-3' (PaeR) a 5 -GGCGATGGCGGAAGGGAACC-3' (PaeS) na 20 izolátech DNA získaných z Výzkumného ústavu rostlinné výroby v Praze. Použité oligonukleotidové sekvence byly testovány ve společnosti Genetrac, s.r.o. a BioVendor-Laboratomí medicína, a.s. a jsou výsledkem vlastních analýz sekvencí získaných na Výzkumném ústavu rostlinné výroby Praha a následného praktického testování. Tyto oligonukleotidové sekvence jsou specifické a stabilní.
Reakční směs pro PCR reakci měla objem 20 μΐ a obsahovala všechny tři výše uvedené oligonukleotidové sekvence s koncentrací každé z nich lOpM. Dalšími složkami PCR reakce je enzym Taq polymeráza (1 mezinárodní jednotka), deoxyribonukleotidy o koncentraci 100μΜ a reakční pufr o koncentraci chloridu hořečnatého l,5mM.
PCR reakce proběhla v termocykleru (mic, BMC), přičemž nejprve probíhala 15 minut při teplotě 95 °C počáteční aktivace, poté za stejné teploty 45 amplifikačních cyklů, každý o délce 5 sekund, následně probíhalo 40 sekund při teplotě 60 °C čtení fluorescenčního signálu FAM a poté 20 sekund při teplotě 72 °C konečná extenze.
Pozitivní výsledek indikující přítomnost DNA bakterií druhu Paenibacilllus larvae byl zaznamenám u 18 vzorků skutečně tvořených DNA bakterií tohoto druhu. Negativní výsledek indikující nepřítomnost DNA bakterií druhu Paenibacilllus larvae byl zaznamenám u vzorků DNA bakterií druhu Paenibacillus alvei a bakterií rodu Mellisococcus - viz křivky al abl na obr. 1.
Příklad 2
Stejným způsobem jako v příkladu 1 se analyzovalo 12 vzorků mrtvých včel, z nichž 10 bylo infikovaných bakteriemi druhu Paenibacillus larvae, 1 bakteriemi druhu Paenibacillus alvei a 1 bakteriemi rodu Mellisococcus získaných z Výzkumného ústavu rostlinné výroby v Praze.
Pozitivní výsledek indikující přítomnost bakterií druhu Paenibacilllus larvae byl zaznamenán u všech 10 vzorků skutečně infikovaných těmito bakteriemi. Negativní výsledek indikující
-2CZ 33436 U1 nepřítomnost bakterií druhu Paenibacilllus larvae byl zaznamenám u vzorku infikovaného bakteriemi druhu Paenibacillus alvei a u vzorku infikovaného bakteriemi rodu Mellisococcus viz křivky a2 a b2 na obr. 2.
Příklad 3
Stejným způsobem jako v příkladu 1 se analyzovalo 12 vzorků bakteriálních kultur získaných z Výzkumného ústavu rostlinné výroby v Praze, z nichž 10 byly vzorky kultury bakterií druhu Paenibacillus larvae, 1 vzorek kultury bakterií druhu Paenibacillus alvei a 1 vzorek kultury bakterií rodu Mellisococcus.
Pozitivní výsledek indikující přítomnost bakterií druhu Paenibacilllus larvae byl zaznamenám u všech 10 vzorků kultury bakterií tohoto druhu. Negativní výsledek indikující nepřítomnost bakterií druhu Paenibacilllus larvae byl zaznamenám u vzorku kultury bakterií druhu Paenibacillus alvei a u vzorku kultury bakterií rodu Mellisococcus - viz křivky a3 a b3 na obr. 3.
Příklad 4
U izolátů DNA identifikovaných v příkladu 1 jako náležejících bakterii druhu Paenibacillus larvae se použitím různě koncentrovaných standardů (v rozsahu 105 až 101 kopií/μΐ) ve formě rekombinantního plazmidu
-GACCTTTCATCTGTTCGCGGTGCGAACTACCTGTTTGGTGGCGATGGCGGAAGGGA ACCACACGTACCCATCCCGAACACGGCCGTTAAGCCTTCCAGCGCCGATGGTACTTGG ACCGAAGGGTC-3', tj. s nasyntetizovanou jednou kopií cílové sekvence, stanovil počet cílových sekvencí.
Po přepočtu měřených relativních fluorescencí a proložení kalibrační křivkou byly získány koncentrace cílových kopií v izolátech v rozmezí 5 x 104 až 3 x 102kopií/pl, což odpovídalo počtu genomů patogenu v biologickém vzorku.
Příklad 5
U vzorků mrtvých včel identifikovaných v příkladu 1 jako infikovaných bakteriemi druhu Paenibacillus larvae se použitím různě koncentrovaných standardů (v rozsahu 105 až 101 kopií/μΐ) ve formě rekombinantního plazmidu uvedeného v příkladu 4 stanovil počet cílových sekvencí.
Po přepočtu měřených relativních fluorescencí a proložení kalibrační křivkou byly získány koncentrace cílových kopií ve vzorcích v rozmezí 2xl04až7xl01 kopií/mg včelí tkáně, což odpovídalo počtu genomů patogenu v biologickém vzorku.
Příklad 6
U izolátů bakteriálních kultur identifikovaných v příkladu 3 jako bakteriální kultury bakterií druhu Paenibacillus larvae se použitím různě koncentrovaných standardů (v rozsahu 105 až 101 kopií/μΐ) ve formě rekombinantního plazmidu uvedeného v příkladu 4 stanovil počet cílových sekvencí.
Po přepočtu měřených relativních fluorescencí a proložení kalibrační křivky byly získány koncentrace cílových kopií v izolátech v rozmezí 9xl04až8xl03 kopií/ml bakteriální kultury, což odpovídalo počtu genomů patogenu v biologickém vzorku.
-3CZ 33436 U1
Průmyslová využitelnost
Sada oligonukleotidových sekvencí podle technického řešení umožňuje snadnou, ale především přesnou detekci bakterií druhu Paenibacillus larvae u koncového uživatele, která zajišťuje vysokou reprodukovatelnost výsledků. Tyto oligonukleotidové sekvence jsou využitelné pro screenování lokalit na výskyt a predikci vzniku včelího moru.
Rekombinantní plazmid ve formě standardů pro kvantifikaci umožňuje odhadnout rozsah infekce způsobené bakteriemi druhu Paenibacillus larvae v biologickém materiálu, především ve vzorcích tkání uhynulých včel nebo v izolované DNA.
NÁROKY NA OCHRANU

Claims (4)

1. Sada oligonukleotidových sekvencí pro detekci bakterií druhu Paenibacillus larvae vyznačující se tím, že obsahuje kombinaci primerů 5-GACCTTTCATCTGTTCGCGG-3' a 5-GACCCTTCGGTCCAAGTACC-3' a sondu 5-GGCGATGGCGGAAGGGAACC-3'.
2. Sada oligonukleotidových sekvencí podle nároku 1, vyznačující se tím, že sonda je na svém 5'-konci označená fluoroforem a na svém 3'-konci jeho zhášečem.
3. Rekombinantní plazmid pro detekci bakterií druhu Paenibacillus larvae
5 -ACCTTTCATCTGTTCGCGGTGCGAACTACCTGTTTGGTGGCGATGGCGGAAGGGAA CCACACGTACCCATCCCGAACACGGCCGTTAAGCCTTCCAGCGCCGATGGTACTTGGA CCGAAGGGTC-3 .
CZ201936128U 2019-04-16 2019-04-16 Sada oligonukleotidových sekvencí a rekombinantní plazmid pro detekci bakterií druhu Paenibacillus larvae CZ33436U1 (cs)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ201936128U CZ33436U1 (cs) 2019-04-16 2019-04-16 Sada oligonukleotidových sekvencí a rekombinantní plazmid pro detekci bakterií druhu Paenibacillus larvae

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ201936128U CZ33436U1 (cs) 2019-04-16 2019-04-16 Sada oligonukleotidových sekvencí a rekombinantní plazmid pro detekci bakterií druhu Paenibacillus larvae

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ33436U1 true CZ33436U1 (cs) 2019-12-03

Family

ID=68768772

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ201936128U CZ33436U1 (cs) 2019-04-16 2019-04-16 Sada oligonukleotidových sekvencí a rekombinantní plazmid pro detekci bakterií druhu Paenibacillus larvae

Country Status (1)

Country Link
CZ (1) CZ33436U1 (cs)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Soliman et al. Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for rapid detection of viral hemorrhagic septicaemia virus (VHS)
Hamiduzzaman et al. A multiplex PCR assay to diagnose and quantify Nosema infections in honey bees (Apis mellifera)
TWI425093B (zh) Method for Extracting Bursaphelenchus xylophilus from Wood Tablets, LAMP Primer of Bursaphelenchus xylophilus and Method for Detecting Bursaphelenchus xylophilus from Wood
RU2680094C1 (ru) Тест-система для выявления ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) у сельскохозяйственных животных
Adamek et al. Concentration of carp edema virus (CEV) DNA in koi tissues affected by koi sleepy disease (KSD)
JP5753778B2 (ja) 蠕虫卵、特に鞭虫卵の生物学的活性を測定する方法
Goarant et al. Quantification of Vibrio penaeicida, the etiological agent of Syndrome 93 in New Caledonian shrimp, by real-time PCR using SYBR Green I chemistry
Zhu et al. Onsite and visual detection of ranavirus in largemouth bass (Micropterus salmoides) by an isothermal recombinase polymerase amplification method
CN104357570A (zh) 一种杀鲑气单胞菌杀鲑亚种快速检测引物及其应用
CZ33436U1 (cs) Sada oligonukleotidových sekvencí a rekombinantní plazmid pro detekci bakterií druhu Paenibacillus larvae
RU2710065C1 (ru) Синтетические олигонуклеотидные праймеры и способ выявления ДНК вируса АЧС методом петлевой изотермической амплификации
RU2715333C1 (ru) Набор реагентов для выявления и идентификации днк возбудителей бруцеллеза методом полимеразной цепной реакции в реальном времени "ом-скрин-бруцеллез-рв"
RU2550257C2 (ru) СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ТИПИЧНЫХ И АТИПИЧНЫХ ШТАММОВ Yersinia pestis СРЕДНЕВЕКОВОГО БИОВАРА МЕТОДОМ ПЦР С ГИБРИДИЗАЦИОННО-ФЛУОРЕСЦЕНТНЫМ УЧЕТОМ РЕЗУЛЬТАТОВ
Koiwai et al. Rapid diagnosis of three shrimp RNA viruses using RT-PCR-DNA chromatography
JP2012528571A (ja) 先進的病原体検出およびスクリーニング
RU2378384C2 (ru) Олигонуклеотидные праймеры, способ и тест-система для выявления генома вируса африканской чумы лошадей методом полимеразной цепной реакции в формате электрофоретической детекции продуктов амплификации
JP2024509708A (ja) 自動式ファーゴグラム
Quintana et al. Report of a real-time PCR assay for Paenibacillus larvae DNA detection from spores of scale samples
US20070196818A1 (en) Using Nucleic Acids for Clinical Microbiology Testing
Singh et al. Development and standardization of visual loop mediated isothermal amplification (LAMP) assay for specific diagnosis of Johne’s disease
RU2839982C1 (ru) Способ выявления РНК вируса Mammarenavirus guanaritoense методом ОТ-ПЦР в реальном времени
CN113502317A (zh) 血流感染患者血液样本处理方法
RU2732923C1 (ru) Способ и набор для обнаружения бактерий рода campylobacter у больных с воспалительными заболеваниями кишечника
CN111778343A (zh) 一种检测布鲁氏菌s2疫苗株的引物对、试剂盒及其应用
RU2824666C1 (ru) Олигонуклеотидные праймеры для выявления РНК вируса энзоотического лейкоза крупного рогатого скота полимеразно-цепной реакцией

Legal Events

Date Code Title Description
FG1K Utility model registered

Effective date: 20191203

MK1K Utility model expired

Effective date: 20230416