CZ337599A3 - Zařízení ke stimulaci nervové regenerace - Google Patents

Abstract

Vynález se týká stimulace regenerace nervů, která se rrůže užítjak naperiferní nervy tak i na nervy centrálního nervového systému, zejménanamíchu. Zařízení obsahuje biokompatibilní manžetu, do kteréje zaveden systémpro expresi neurotrofíckého faktoru.

Description

Předkládaný vynález se lékařské biologie nervového týká biologie, zvláště pak systému. Konkrétně se . týká způsobů stimulace regenerace nervového systému, které lze využít jak pro periferní nervy, tak i pro nervy centrálního systému, zvláště míchu. Díky jejich lokálnímu a specifickému charakteru mohou být využity ke stimulaci různých patologických způsoby podle předkládaného vynálezu regenerace nervového systému v řadě situací, zvláště v případě míšních lézí nebo léz.í periferních nervů nebo nervů brachiálního nebo lumbálního plexu.

Dosavadní stav techniky

Léze nervového systému, jak centrálního (CNS) nebo periferního (PNS), jsou v traumatologii velmi frekventované a vážné’. Míšní léze, ať již traumatického nebo degenerativního původu, léze periferních nervů nebo léze brachiálního či lumbálního plexu způsobovaly,že zranění nebo nemocní jedinci byly vážně postiženi po celý život. Ačkoliv PNS má značnou ' kapacitu spontánně -regenerovat, použití konvenčních způsobů reparace nervů vedlo k výsledkům, které byly pouze zklamáním. Tyto způsoby spočívají především v přímých anastomózách nebo vsazení autologních nebo heterologních nervových štěpů, pokud je ťenze tak velká, že nedovoluje sešití obou konců nervu (v případě značné ztráty tkáně nebo rozsáhlé lacerace nervu vyžadující resekci φ φ φφ ► φφφ φφφφ • φφ φ φ φ • ♦ φ φ • · · · •ΦΦ ··· φ φ * ♦ φ · nervového segmentu). Při užití těchto způsobů méně než 5 % pacientů, kteří prodělali reparaci n. medianus. v· zápěstí, získalo normální čití nebo motorickou funkci po 5 letech (1).

V současnosti se nabízí alternativní způsob k výše zmíněným konvenčním způsobům, a sice použití . trubicovité protézy spojující konce poškozeného nervu, tzv, manžetová technika (2,3). Tato technika poskytuje tu ' výhodu, ' že zjednodušuje podmínky pro znovuspojení nervových svazků a umožňuje úspěšné přemostění, a to jak experimentálně, tak i klinicky, malých ztrát nervové tkáně (do 5 až 7 mm,.viz 1, 6). Avšak aby bylo možné delší přemostění při větších ztrátách tkáně, zdá se nezbytné přidat do trubicovité protézy neurotrofickou látku nebo . buňky. Experimentálně bylo testováno několik faktorů, jako např. FGF-1.a ' FGF-2 nebo NGF aplikované in vivo do stentu (7-10) nebo CNTF či IGFII aplikované systémově, aniž by však výsledky prokázaly jasně význam pro nervovou 'regeneraci (7-12) . Kromě toho dosud neexistuje žádný klinicky vhodný způsob léčení míšních lézí.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje řešení výše uvedených problémů při léčení nervových degenerativního původu, nervové regenerace lézí, ať už traumatického nebo Vynález se týká způsobu stimulace pomocí biokompatibilní manžety kóduj ící také týká a přípravku, obsahujícího nukleové kyseliny neurotrofické faktory. Předkládaný vynález se zařízení ke stimulaci nervové regenerace, které obsahuje biokompatibilní manžetu, do které se vnese systém pro expresi faktoru stimulujícího růst nervu (neurotrofického faktoru).

·· ·# * · · « • 999 9999 ··· ► · · 9 ··· ···

Další aspekt předkládaného vynálezu se týká soupravy ke stimulaci nervové regenerace, která obsahuje biokompatibilní manžetu a také přípravek, který obsahuje systém pro expresi faktoru stimulujícího růst nervu. Vynález se také týká použití biokompatibilní manžety, do které se vnese systém pro expresi neurotrofického faktoru, k přípravě prostředku určeného ke stimulací nervové regenerace.

Předkládaný vynález je kromě toho' využitelný pro regeneraci periferních nervů regenerace v míše.

Předkládaný vynález je a také ke stimulaci axonové důsledkem' několika zjištění koncentraci stimulaci růstu neuronů, několik vlastností, vyhází zejména z toho, že ' bylo demonstrováno, že je možné chirurgicky provést fyzické přemostění mezi dvěma úseky nervu pomocí vhodného zařízení, a dále do tohoto zařízení, zavést systém pro expresi · neurotrofického faktoru. Dále vychází z toho, že byla demonstrována možnost .indukovat lokální trofického faktoru po dobu .dostatečnou ke Předkládaný vynález tak kombinuje které jsou zvláště ' výhodné z terapeutického hlediska. Tak především dovoluje, a sice díky efektu prodlouženého uvolňování, dlouhodobé působení. Navíc j'e biologický účinek neurotrof ického faktoru zesílen podpůrným účinkem (stent-efekt) manžety, která urychluje a vede růst neuronu. Vynález také umožňuje velmi lokalizované, a tudíž také velmi specifické,' působení trofických faktorů, které jsou uzavřeny v těsném zařízení přímo na místě traumatu nebo degenerace. Výsledky uvedené v příkladech ukazují, že způsob podle předkládaného vynálezu umožňuje, rychlou, účinnou a lokální reparaci nervů.

Způsob podle předkládaného vynálezu spočívá v lokálním působení na úrovni přetnutí nervu. Proximální nebo distální úsek rozděleného nervu nebo nervového svazku se vloží do ·· ·· flfl * · · · · flfl • · · · · • · · fl · • · · · ···· fl··· ,, * _ • flfl · • · · · • ··· ··· .· ♦ · ¹ flfl flfl • flfl jednoho konce biokompatibilní manžety, kde je fyzicky upevněn. Do uvedené manžety se pak vnese přípravek obsahující systém pro expresi neurotrofického faktoru.' Pak se do druhého konce manžety vloží druhý úsek nervu nebo^! nervového svazku, kde je také fyzicky upevněn. Aby se zabránilo difúzi expresního systému mimo manžetu, je výhodné podvázání konců a/nebo spojení biologickým lepidlem. Toto zařízení navíc umožňuje i injekce expresního systému. Přítomnost výztuže (opory) a neurotrofického faktoru ve vysoké koncentraci po dlouhou dobu umožňuje, jak ukazují příklady, rekonstituovat kontinuitu nervu a tak obnovit odpovídající aktivitu.

Způsob podle předkládaného vynálezu, který je specifický pro periferní nervový systém, spočívá v tom, že se vezme periferní nerv nebo - kořen, který sousedí s lézí a po resekci části- nervu nebo kořenu se nasadí biokompatibilní manžeta. Proximální část nervu, ať už má motorickou -nebo senzorickou funkci, se vloží do manžety a upevní, např. šitím nebo pomocí biologického lepidla. Expresní systém kódující neurotrofický faktor se vstříkne injekcí do manžety, která je ponechána na místě. Distální část nervu se pak znovu spojí s druhými koncem manžety, což umožní obnovit kontinuitu axonu, (Obr. 1).

Z hlediska centrálního nervového systému, zejména míšního systému, je způsob . podle předkládaného vynálezu zvláště vhodný k přemostění poškození v míše. Tento typ traumatu, pro který neexistuje' dosud žádný způsob léčení, představuje hlavní aplikační možnost zařízení podle vynálezu. Lze předpokládat dva hlavní způsoby využití: buďto přemostění periferních aferentních vláken pod lézí ke zdravé dřeni nad lézí (Obr. 5), nebo přemostění od zdravé dřeně nad lézí ke zdravé dřeni pod lézí (Obr. 6).

V prvním případě, jeden nebo několik kořenů pod míšní lézí se přeruší (obr. 5A), vloží do trubicovité protézy

4444 4444

444 ·· 44 • 4 4 4 • 4 4 4

444 444

4 ·· 44 (manžety) a upevní šitím nebo biologickým lepidlem.. Do stentu je pak zaveden expresní systém nesoucí . geny schopné stimulovat axonální prodlužování motoneuronů a/nebo případně různé faktory, o kterých je známo, že stimulují obnovu růstu axonu, jako je např.' štěp periferního nervu nebo buňky. Stent se potom vloží do podélné incize provedené ve zdravé dřeni nad lézí,· a to tak aby se proximální konec trubice dotýkal šedé hmoty předního rohu míšního (místo lokalizace míšních motoneuronů). Stent je připojen jedním nebo několika stehy k arachnoidee a přilepen biologickým lepidlem. Takové uspořádání může obnovit funkci určitých klíčových svalů.

Ve druhém případě se poškozená část dřeně vyřízne a stent se implantuje jak po proudu tak i proti proudu tak, aby spojil hlavní svazky (pyramidální, kortikospinální a pod.) mezi úseky nad a pod poškozeným místem (obr. 6) . Stent se pak naplní stejným substrátem jak bylo uvedeno výše.

V- rámci tohoto popisu vynálezu proximální sekce nebo proximální část nervu znamená, část nervu, která je v kontaktu s centrálním nervovým systémem. V případě periferních nervů je proximální část ta část, která je spojena s míchou. V případě míšní léze je proximální částí myšlena ta část, která jé v kontaktu s centrálním nervovým systémem.

- Distální část sekce nebo proximální část nervu znamená periferní část nervu. V případě periferních nervů je proto která je ve spoj.ení s nervovým

V případě míšní léze je která je oddělena od distální část ta část, zakončením (nervosvalovou ploténkou) proximální částí myšlena ta část, spojení s centrálním nervovým systémem. - .

Při aplikaci . vynálezu může manžeta- být v podstatě, jakékoliv zařízení které je kompatibilní s terapeutickým užitím. Výhodná struktura a složení manžety jsou definovány v následujících bodech:

I) obnovuje kontinuitu axonu, ·· ·» • · · • · • · • · ·· · ···· ·· • · • · ··· ♦ ·

II) může obsahovat přípravek obsahující systém pro expresi aktivních faktorů, III) může sloužit jako stent pro obnovu růstu axonu, a sice směrem od míchy k periferii, od periferie k míše, a také od míchy k míše. Schopnost manžety sloužit sama jako stent spočívá ve schopnosti nervů adherovat k jejímu povrchu a růst na něm, zejména tedy na vnitřním povrchu. Adherence může být důsledkem jakékoliv biologické a/nebo chemické a/nebo fyzikální interakce způsobující adhezi' a/nebo spojení buněk s manžetou. Kromě toho pro použití v humánní terapii je žádoucí, aby manžeta byla nepropustného nebo polopropustného typu a nedovolovala průchod expresního systému.

Výhodně manžeta představuje pevnou, netoxickou a biokompatibilní výztuž. Může to být konkrétně manžeta z vláken syntetického materiálu nebo materiálů jako je např. silikon, PAN/PVC, PVFD, polytetrafluoetylen (PTFE) nebo akrylové kopolymery. V příkladech jsou . uvedena výhodná specifická provedení vynálezu, kdy manžeta je z biomateriálú, jako je napři zesíťovaný kolagen, kostní prášek, polymery založené na cukrech, deriváty kyseliny polyglykolové/polymléčné, estery kyseliny hyaluronové nebo výztuže založené na křídě. Výhodně je pro manžetu podle předkládaného vynálezu užit silikon nebo kolagen. Může to být kolagen, humánního, bovinního neb'o myšího původu. Výhodně je manžeta složena z dvouvrstvy kolagenu typu I nebo IIInebo IV, výhodněji kolagenu typu IV/IVox nebo silikonu. Jako příklad takových manžet lze uvést manžetu Sil.astic (DowCorning) ze silikonu. Výhodně má manžeta trubicovitý tvar s kruhovým nebo i hranatým průřezem. Průměr manžety zvolí odborník podle požadovaného účelu. Konkrétně např. pro stimulaci regenerace periferního nervu se užije relativně malý průměr, od 0,05 do 15 mm. Výhodněji je vnitřní průměr • · · · ··· ··»

• · »» ·· manžety mezi 0,5 a 10 mm. Při použiti pro regeneraci míchy se užije manžeta s větším průměrem. Konkrétně pro .tuto aplikaci může mít manžeta vnitřní průměr až 15 až 20 mm, v závislosti na relevantním nervovém úseku. Pro přemostění kořenů vybíhajících v úrovni brachiálního plexu,; průměr manžety výhodně odpovídá průměru kořene. Délka manžety je obecně určena velikostí ztráty tkáně, která má být kompenzována. Obecně lze užít manžetu dlouhou 0,5 až 5 cm. Výhodně je délka manžety menší než 5 cm, ztráty tkáně představující rozpětí delší než 5 cm jsou méně časté.

Jak již bylo uvedeno výše, způsob podle vynálezu spočívá v tom, že se jako první krok vloží první část nervu do manžety. To je výhodně proximální část nervu. Ta je pak upevněna na místě, aby se zajistil I)dobrý růst nervu a II) nepropustnost celého zařízení. Aby se toho dosáhlo, je možné provést sešití mezi nervem a manžetou a/nebo použít biologické lepidlo. Steh může být proveden obvyklým chirurgickým způsobem pomocí vhodného vlákna. Biologické lepidlo je jakékoliv biokompatibilní' lepidlo, 'které 'lze aplikovat na nervový systém. Zvláště to může být biologické lepidlo užívané v humánní chirurgii, zejména lepidlo obsahující fibrin: např. Bi.ocolle (Biotransfusion, CRTS, Lilie, Francie ), Tissucol (Immuno AG, Vídeň, . Rakousko)apod.

Způsob podle vynálezu obsahuje, jak již bylo zmíněno výše, vnesení přípravku do manžety, přičemž přípravek obsahuje systém pro expresi neurotrofických faktorů.

Z. hlediska předkládaného vynálezu termín expresní systém znamená jakýkoliv konstrukt, který umožňuje in vivo expresi nukkleové .kyseliny kódující neurotřofický faktor. Výhodně expresní systém obsahuje nukleovou kyselinu kódující neurotrofický faktor, který je řízen transkripčním promotorem (expresní kazeta). Tato nukleová kyselina je buďto DNA nebo '44 • · 4 ·· 44 • 4 · 4

9 ·

4

444» 4444

4

4

444

RNA. V případě DNA se jedná o cDNA, gDNA nebo hybridní DNA, což je DNA obsahující jeden nebo více intronů gDNA, ale ne všechny. DNA může být. také syntetická nebo semisyntetická, zvláště DNA uměle syntetizovaná pro optimalizaci kodonů nebo k vytvoření redukovaných forem.

Promotor transkripce, může být jakýkoliv promotor, který je aktivní v savčí buňce, a zvláště v nervové buňce. Může to být. promotorový úsek, který je . přirozeně, zodpovědný za expresi neurotrofického faktoru, ža předpokladu, že je schopen funkce v relevantní buňce nebo organismu. Může to být také úsek jiného původu (který je zodpovědný za expresi jiných’ proteinů, nebo dokonce syntetický úsek). Konkrétně to může být promotorový úsek eukariotických nebo virových genů. Např. je to promotorový úsek odvozený z genomu cílové buňky. 2 eukaryotických promotorů lze užít promotory, které' jsou genově specifické, indukovatelné nebo jiné, slabé nebo silné, a nebo z nich odvozené' sekvence. Jde např. o běžné nespecifické promotory (např. promotor genu HPRT, PGK, alfaaktinu, tubulinu), promotory genů tubulárních filament .(GFAP, desmin, vimentin, neurofílamenta nebo keratinové geny apod.), promotory terapeutických genů (např. promotor genu MDR, CTFR, faktoru’ VIII nebo ApoAI a pod.) nebo alternativně promotory odpovídající na podnět (receptor steroidních hormonů, receptor kyseliny retinové a pod.). Podobně to mohou být promotory pocházející z virovývh sekvencí,, jako jsou např. promotory adenovirovývh genů E1A. a MLP, časný promotor CMV nebo alternativně promotor z LTR RSV a pod. Navíc lze tyto promotorové úseky modifikovat tak, že se přidá aktivační nebo regulační sekvence nebo že se přidá sekvence, umožňující tkáňově-specifickou nebo převládající expresi.

Výhodně se podle vynáíezu použije konstitutivní eukaryotický promotor nebo virový promotor. _ . ' ·· · • * · • · · • · • · '

9 9

9 9

999

944 • · • · ···· ··** ··· 9

99 . Navíc expresní kazeta ' výhodně obsahuje signální sekvenci/ která směruje syntézu produktu do- sekretorické metabolické dráhy cílové buňky. Signální sekvence je buď přirozená signální sekvence syntetizovaného produktu nebo je to jiná funkční signální sekvence nebo i umělá signální sekvence.

Expresní kazeta tedy' obecně úsek lokalizovaný na 3'-konci, který nese terminační signál transkripce a polyadenylační místo.

Trofické	faktory,	které	se . mohou	užít	podle
předkládaného	vynálezu	spadaj í	v podstatě	do	rodiny
neurotrofinů,	neurokinů,,	rodiny	beta-TGF a	roidin	typu
fibroblastovéhop růstového	faktoru.	(FGF) a růstového f	aktoru

podobného insulinu (IGF) (přehled viz 16) .

Výhodnější je podle předkládaného vynálezu použití BDNF,

NT-3 nebo NT-4/5 z rodiny neurotrofinú.

Neurotrofický faktor odvozený z mozku (BDNF_Z brainderived neurotrophic factor), který popsal Thoenen (17), je. protein z 118 aminokyselin s molekulovou hmotností 13,5 kD. BDNF in vitro stimuluje vytváření neuriťů a přežívání gangliových neuronů . z retiny, cholinergních neuronů septa a dopaminergních· neuronů mesencefala (středního mozku) v kultuře in vitro (přehled viz 18). Sekvence DNA kódující lidský BDNF a BDNF krysy byly klonovány a sekvencovány (19) společně s částečnou sekvencí kódující BDNF prasete (20). Ačkoliv vlastnosti tohoto· faktoru jsou potenciálně výhodné, terapeutické využití BDNF naráží na mnohé potíže. Zvláště nedostatečná biologická , dostupnost omezuje terapeutické využití BDNF. Neurotrof ický faktor pocházející z mozku (BDNF)· použitý podle předkládaného vynálezu je buďto lidský BDNF nebo BDNF zvířete.

• 9 9 9 9 9 · 9 · · ·· * 9 9 9 9 · · · · ·· · • · 9 9 9 9 9 9 9 9 • 9999 999 9 999 999

Neurotrofin-3 (NT3) je secernovaný protein- složený ze 119 aminokyselin, který umožňuje přežíváni neuronů in vitro dokonce i při velmi nízké koncentraci (21) . Sekvence cDNA kódující lidský NT3 byla publikována (22).'

Rodina pocházej ící neurotrophic aminokyselin neurotrofický glial cells derived je protein kD. Má z 134 základní

TGF-B obsahuje zvláště z gliových buněk (GDNF, factor). GDNF (23) s molekulovou hmotností kapacitu podporovat in vitro přežívání dopaminergních neuronů a motoneuronů (16). GDNF pužitý podle předkládaného vynálezu je buďto lidský GDNF nebo GDNF zvířete. Sekvence cDNA kódující lidský GDNF a také GDNF krysy byly. klonovány a s.ekvencovány (23) .

Další neurotrofický faktor, který může být použit podle vynálezu, je zvláště CNTF (ciliární neurotrofický faktor). CNTF je neurokín schopný- zabránit odumření neuronů. Klinické zkoušky s tímto faktorem byly předčasně ukončeny pro nedostatek výsledků. A.le nyní vynález dovoluje prodloužené a kontinuální působení CNTF, společně v kombinaci' s dalšími trofickými faktory. cDNA pro lidský a myší CNTF byly klonovány a sekvencovány (EP 385060, WO 91/04316).

- Dalšími neutrofickými faktory,'které se mohou užít podle předkládaného vynálezu, jsou např. IGF-1 (Lewis ét al., 1993) a fibroblastový růstový faktor (FGFa, FGFP). Zejména IGF-1 a FGFa jsou velmi vhodní kandidáti. Sekvence genu FGFa byla popsána v odborné literatuře, společně s vektory.umožňujícími její expresi in vitro (WO 95/25803) . ..

Expresní systém podle předkládaného . vynálezu proto výhodně umožňuje in vivo produkci neurotrofických faktorů vybraných ze skupiny obsahující neurotrofiny, neurokiny a skupinu TGF. Výhodněji jde o faktor vybraný ze skupiny • 9 • · · · · • ·

0

0 · · 0 · • · · · · · ··· 9 9999

0 9 obsahující BDNF, GDNF, CNTF, NT3, FGFa a IGF-1, Nejvýhodnější je produkce NT3.

Kromě toho je v jedené variantě předkládaného vynálezu možné použít expresní systém, který dovoluje produkci dvou neurotrofických faktorů. V takovém provedení vynálezu expresní systém obsahuje buďto dvě. expresní kazety nebo jedinou kazetu umožňující současnou expresi dvou. nukleových kyselin (bicistronická jednotka). Pokud systém obsahuje dvě expresní kazety, mohou užívat shodné nebo odlišné promotory.

V expresním systému podle předkládaného vynálezu je výhodně expresní kazeta součástí vektoru. To je zejména virový 'nebo plazmidový vektor. V případě expresního systému, který obsahuje několik expresních kazet, kazety mohou být neseny několika samostatnými vektory nebo jedním a tímž vektorem.

Vektory podle předkládaného vynálezu jsou standardní plazmidové vektory obsahující kromě expresní kazety (kazet) ještě replikační počátek a markerový gen. Různé typy zlepšených vektorů byly publikovány, a sice bez replikačního počátku a markerového genu (WO 96/26270) nebo mající např. podmíněný replikační počátek ((PCT/FR96/01414. Tyto vektory se mohou výhodně užít podle předkládaného vynálezu.

Vektor podle předkládaného vynálezu může být také virový vektor. Různé vektory byly konstruovány z virů, které mají pozoruhodné vlastnosti z hlediska přenosu genů. Zvláště lze uvést adenoviry, retroviry, AAV a herpetické viry. Aby je bylo možné užít jako vektor' pro přenos genů, je genom těchto virů modifikován, takže nejsou schopny autonomní replikace v buňce. Tyto viry jsou pak tzv. replikačně defektní. Obecně je jejich genom modifikován tak, že se v expresní kazetě substituují úseky nezbytné pro virovou replikaci v trans.

4

4 4 4 4

444 444

Výhodné je podle předkládaného vynálezu užití virových vektorů odvozených z adenovirů. Adenoviry jsou viry s lineární dvouřetězcovou DNA velikosti 36 kb. Jejich genom obsahuje na každém konci invertovanou terminální repetici (ITR), enkapsidační sekvenci (Psi), časné geny a pozdní geny. 'Hlavní časné geny jsou obsaženy v úsecích El, E2, E3 a E4 . Z nich jsou zejména geny v úseku El nezbytné pro propagaci viru. Hlavní pozdní geny jsou obsaženy v úsecích LI až L5. Genom adenovirů Ad5 byl plně sekvencován a je přístupný v databázi (viz např. GeneBank M732260). Podobně části nebo i celé genomy jiných adenovirů (Ad2, Ad7, Adl2 apod.) byly také sekvencovány.

Pro použití -jako vektory pro přenos genů byly připraveny mnohé konstrukty založené na adenovirech, které obsahují různé terapeutické geny. Konkrétně jsou ve stavu techniky popsány adenoviry s deletovaným úsekem El, který je nezbytný pro replikaci viru, kam byla vložena heterologní sekvence DNA (Levrero et al., Gene 101,, 1991, 195, Gosh-Ghoudhury et al., gene 50, 1986, 161) . Kromě toho pro zlepšení vlastností vektorů byly navrženy jiné delece a- ' modifikace adenovirového genomu. Tak např. byla zavedena teplotně-senzitivní bodová mutace v mutantě tsl25, což umožnilo inaktivovat DNA-vazebný protein (DBP) velikosti 72 kD (13) . V dalších vektorech jsou delece v jiném úseku, který, je nezbytný pro replikaci a propagaci viru, a sice E4. Úsek É4 se skutečně účastní regulace exprese pozdních genů, podílí se na stabilitě pozdní jaderné RNA, podílí se na supresi exprese proteinů hostitelské buňky a hraje roli v účinnosti replikace virové' DNA. Adenovirové vektory, které mají deletované úseky El a E4, vykazují redukovanou hladinu základního . šumu transkripce a exprese virových genů. Takové vektory byly popsány např. v patentových přihláškách WO94/28152, • ·

9 9 i « • 9 · 9

999 9 9 9

9

9 9 • · , · 9 9 9

9 9 9 9 999

9 9 9 9

99999999 99 99

WO95/02697 a WO96/2237. Kromě toho byl popsán i vektor nesoucí modifikaci v genu IVa2 (WO 96/10088). Rekombinantní adenoviry popisované v odborné literatuře jsou připravovány z adenovirů různých sérotypů, jejichž -struktura a vlastnosti se poněkud odlišují, ale'přesto mají srovnatelnou genetickou organizaci.

Rekombinantní adenoiviry jsou- buďto humánního nebo zvířecího- původu. Co se týká adenovirý humánního původu, výhodně lze zmínit adenoviry zařazené do skupiny C, konkrétně adenoviry typu 2 (Ad2), 5 (Ad5) , 7 (Ad7) nebo 12 (Adl2) .

Z adenovirů zvířecího původu jsou výhodné adenoviry psů, a zvláště všechny kmeny adenovirů CAV2- (např. kmen Manhattan nébo kmen -A26/61, ATCG VR-800). Další adenoviry zvířecího původu jsou uvedeny např. v patentové přihlášce WO 94/26914, na kterou se tímto odkazuje. ,

Ve¹ výhodném provedení vynálezu je rekombinantní adenovirus humánní adenovirus skupiny C. Výhodněji je to adenovirus Ad2 nebo Ad5.

Rekombinantní adenoviry jsou produkovány v. enkapsidáční linii, což je buněčná linie, která je schopna komplementovat v trans jednu nebo ' několik funkcí, . které chybí v rekombinantním adenovirovém genomu. Jednou z takových linií je linie 293, do které byla integrována část adenovirového. genomu. Přesněji řečeno linie 293 je linie l.idských embryonálních ledvinných buněk, které obsahují levý konec (asi 11 až 12%) genomu adenovirů sérotypů 5 (Ad5), včetně levého úseku ITR, enkapsidačního úseku, úseku El, a to včetně Ela a E1B, úseku kódujícího protein pIX a části úseku kódujícího protein pIVa2. Tato linie je. schopna transkomplementovat adenoviry, které jsou defektní v úseku El, tj . které postrádají část nebo i celý úsek El, a produkovat virus ve vysokém titru. Tato linie je schopna »* · · · · * 9 9 9 9 • · 9 9 9 » » · · 9999 « · 9 9

999 9 9 99 produkovat v permisívní teplotě . (32°C)virový kmen, který obsahuje E2 s teplotně-senzitivní mutací. Byly popsány i jiné linie schopné komplementovat El, zejména linie odvozené od buněk lidského plicního karcinomu A549 (WO 94/28152) nebo lidských retinoblastů (Hum. Gen. Ther. 1996, 215). Kromě toho byly popsány i linie schopné transkomplementovat i několik virových funkcí. Zvláště je třeba zmínit linie komplementújící úseky El a E4 (Yeh et al., J. Virol 70: 1996, 559, Cancer Gen. Ther. 2, 1995, 322, Krougliak et al., Hum. .Gen. Ther. 6, 1995, 1575 a linie komplementújící funkce úseků El a E2 (WO 94/28152, WO 95/02697 a WO 95/27071). Rekombinantí adenoviry se obvykle produkují tak, že se virová DNA vnese do enkapsidační linie, po té následuje l.ýze buněk asi po 2 až 3 dnech (kinetika adenovirového cyklu odpovídá 24 až 36 hodinám). Po lýzi buněk se izolují rekombinantí virové částice centrifugací na cesiumchloridovém gradientu. Alternativní způsoby byly popsány v patentové .přihlášce FR 96/08164, na kterou se tímto odkazuje'.

Kazeta pro expresi terapeutických genů může být vložena do různých míst genomu rekombinantního adenoviru, a sice způsoby odborníkovi známými. Za prvé může být vložena na úrovni 'delece v El. Může být také vložena v do úseku E3, a sice jako dodatečná sekvence nebo jako náhrada původní sekvence. Také může být vložena do místa E4. Při konstrukci vektoru obsahujícího dvě expresní kazety, jedna může .být v úseku El a druhá v úseku E3 nebo E4. Je také možné vložit obě kazety do jednoho úseku.

Přípravek podle předkládaného vynálezu obsahující expresní systém může být formulován různými způsoby. Zvláště může být ve sterilním izotonickém roztoku soli (hydrogenfosdorečnan a dihydrogenfosforečnan sodný, chlorid sodný, hořečnatý, draselný a vápenatý, apod., nebo směsi

• · • φ e · * · φ φφφφ φ·φ φ«· • φ φ φ φ φ · ···· φφφφ φφ φφ φφ «φ takových solí), nebo se může jednat o suchý, zvláště pak lyofilizovaný přípravek, který, v závislosti na případu, po přidání sterilní vody nebo fyziologického roztoku umožní vytvořit injikovatelný roztok. Lze užít i jiné excipienty, jako jsou např. stabilizující proteiny (lidský sérový albumin, viz FR 96/03074, polyxamer nebo hydrogel. Hydrogel se dá připravit z jakéhokoliv biokompatibilního a necytotoxického (homo- nebo hetero-) polymeru. · Takové polymery byly popsány např. v přihlášce WO 93/08845. Některé z nich, zejména připravené z etylénoxidu a/nebo propylénu jsou komerčně dostupné. Avšak když je expresní systém tvořen plazmidovými vektory, je výhodné přidat do přípravku jedno nebo několik eh'emických nebo biochemických činidel podporujících přenos genů. V tomto smyslu je možno uvést konkrétně např. kationtové polymery polylysinu . typu (LKLK)n nebo (LKKL)h popsané v patentové přihlášce WO 95/21931, polyetylenimin (WO 96/02655;) , DEAE-dextran nebo kationtové lipidy či lipofektanty. Tyto látky mají schopnost kondenzovat DNA a podporovat její asociaci s buněčnou membránou. Patří sem· lipopolyaminy (lipofectamin a transfectam popsané v' přihláškách WO 95/18863 a WO' 96/17823), různé kationtové nebo neutrální lipidy (DOTMA, DOGS, DOPE apod.), a také peptidy jederného původu (WO 96/25508) případně upravené tak, aby zaměřovaly určitou cílovou tkáň. Příprava přípravku obsahujícího takové chemické vektory podle předkládaného vynálezu se provádí způsoby odborníkovi známými, .obecně jednoduše tím, že se jednotlivé složky přivedou do kontaktu.

Ve zvláště výhodném provedení předkládaného vynálezu expresní systém obsahuje rekombinantní adenovirus kódující neurotrofický faktor. . Konkrétním neurotrofickým faktorem je NT3. Pro použití podle předkládaného vynálezu je adenovirus výhodně, formulován a podáván ve formě dávek mezi 10⁴

·. fc •fc ·· ·· • · · · · *· · · fcfc fc • · fcfcfc fc fc fcfcfc • · ♦ · fc···· ··· fcfcfc fc « · · · fcfc •fcfcfc ···· fcfc fcfc ·· fcfc a 10^--1 pfu, výhodně 10' až 10*'“' pfu. Termín pfu (jednotka tvořící plak) odpovídá infekčnosti roztoku adenoviru a stanoví se infekci vhodné buněčné kultury a změřením, obecně zpravidla po 15 dnech, počtu infikovaných buněčných plaků. .Způsoby stanovení titru roztoku virů jsou v odborné literatuře dostatečně popsány. Dále uvedené příklady zřetelně ukazují, že dávky 10^s až 10⁷ dovolují I) účinný přenos genů do oddělených neuronů, II) dlouhotrvající expresi transgenu v uvedených neuronech a III) obnovu kontinuity axonů.

Expresní systém může být do manžety vnesen různými způsoby, zejména injekční stříkačkou. Výhodné je vstříknutí pomocí mikroinjekční stříkačky (Hamilton nebo Terumo). Jedním zvláště výhodným provedením předkládaného vynálezu je stimulace obnoveného růstu periferních nervů. Tento přístup lze využít v řadě patologických stavů, zejména u traumat a nervových degenerací. Lze ho aplikovat na chirurgicky přístupný nerv, zvláště např. n.

n. ulnaris, n. medíanus, kolaterální nervy prstů a mezikostní nervy paží a na ischiadický nerv (který má průměr asi 1 cm na svém počátku) nebo bércový nerv (průměr 6 až 7 mm) v dolní končetině.

Dalším zvláště výhodným provedením předkládaného vynálezu je obnova kontinuity nervu po úrazu na úrovni kořenů brachiálního plexu (průměr 5 až 6 mm) nebo přímo na úrovni vlastní míchy. V současné době není žádný způsob léčby takových lézí. Způsob podle předkládaného vynálezu umožňuje vytvořit přemostění mezi dření ležící nad a pod poškozeným místem, a tak spojit hlavní nervové svazky a regenerovat kontinuitu nervů. Pro tyto aplikace má manžeta výhodně průměr velký až 15 až 20 mm. Konkrétně pro přemostění kořenů extrahovaných na úrovni brachiálního plexu vnitřní průměr manžety odpovídá průměru kořenu..

jakýkoliv radialis, • fl fl* » * * · » · · · ·· · ··· • fl • fl

Předmětem předkládaného vynálezu je proto také zařízení k lokálnímu prodlouženému uvolňování neurotrořícké látky na úrovni nervové léze, kteréžto zařízení se skládá z biokompatibilní manžety, která umožňuje spojit části nad a pod lézí, a do které se vnese systém exprimující neurotrofický faktor.

Předkládaný vynález ' lze užít ke stimulaci regenerace nervů in vivo, a to jak lidí tak zvířat. Kromě toho lze vynálezu využít u zvířat k výzkumu vlastností nových trofických faktorů (nových proteinů, mutant apod.). V takovém případě se provede přetětí nervu zvířete a aplikuje se zařízení podle předkládaného vynálezu, do kterého se vnese systém exprimující faktor, který má být testován. Kapacita testovaného faktoru obnovit kontinuitu nervu se stahoví způsobem, který je. popsán dále v příkladech. Zařízení podle předkládaného vynálezu dále umožňuje srovnávat různé faktory nebo zkoumat synergické působení různých faktorů.

Předkládaný vynález je v následující části popisu podrobněji vysvětlen pomocí' příkladů, které jsou však pouze ilustrativní a nijak předkládaný vynález neomezují.

Popis obrázků

Obr. 1: Schematické znázornění aplikace zařízení podle předkládaného vynálezu na periferní nerv.

Obr. 2: Mikrofotografie ze sakrolumbálního úseku míchy demonstrující vysokou hladinu produkce β-galaktosidázy (zobrazeno pomocí substrátu X-gal) uvnitř motoneuronů míchy.

Obr. 3: Makroskopický pohled na obnovu růstu tkáně v D12. A) Kontrolní zvíře: žádná souvislá tkáň není mezi proximálním a distálním koncem nervu. B) Pohled na obsah stentu u zvířete, které dostalo injekci 10⁷ pfu AdNT3. Lze '00 00 00 00 00 0 00 0 0 00 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 • » 0 0 0 000 0 000 000

0 0 0 0 0 0 0000 0000 00 00 00 00 vidět přítomnost tkáně spojující proximální a distální konce obnovovaného nervu.

Obr. 4: Vzhled retrográdního , barvení HRP na D12. A) V kontrolní skupině je vidět pouze několik málo slabě obarvených m.otoneuronů, B) Ve skupině, které bylo '.podáno IQ⁷ pfu Ad-NT3 je přítomen velký počet silné obarvených míšních neuronů.

Obr. 5: Schematické znázornění aplikace přemostění periferního aferentního vlákna pod lézí do zdravé dřeně míchy nad uvedenou lézí.

Obr. 6: Popis aplikace zařízení podle předkládaného vynálezu v míše.

Obr. 7: Závislost motorické odpovědi, na čase po operaci nervu a aplikaci zařízení podle předkládaného vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

1. Metody

1.1. Adenovirové vektory

Jak již bylo zmíněno výše, virové vektory, a zvláště adenoviry, představují zvláště' výhodně provedení předkládaného vynálezu.

Rekombinantní adenoviry zde použité byly získány homologní rekombinací způsobem,· který byl ' popsán již v dosavadním stavu techniky. Stručně shrnuto, byly připraveny v buňkách 293 rekombinací mezi linearizovaným fragmentem virového genomu (dl324) a plazmidem obsahujícím levou ITR, enkapsidační sekvenci, transgen a jeho promotor a také virové ·* fe · · fe · fe······· ··· • fe • fe fefe • fefe · • · · · •fefe ··· fe · • fe fefe sekvence umožňující rekombinaci. Viry pak byly pomnoženy v buňkách linie 293. Ty jsou pravidelně znovu purifikovány v naší, laboratoři typu P3 . Virové genomy lze také připravit v prokaryotických buňkách způsobem popsaným v přihlášce WO 96/25506. Konkrétně byly užity následující viry:

AD-P-gal: Defektní rekombinantní adenovirus odvozený z adenoviru sérotypu. Ad5 obsahující I) deleci úseku Ěl, kde je vložena expresní kazeta obsahující nukleovou kyselionu kódující β-galaktosidázu z E. coli řízenou LTR promotorem z viru Rousova sarkomu (RSV-LTR nebo jen RSV) a II) deleci úseku E3. Tento konstrukt byl již popsán v publikaci Stratford-Perricudet et al. (J. Clin. Invest. 90, 1992, 626) .

Ad-NT3: Rekombinantní adenovirus sérotypu Ad5, který obsahuje, a sice vloženou do genomu místo deletovaného úseku El, expresní kazetu NT3, obsahující cDNA kódující NT3 pod kontrolou transkripčního promotoru, (konkrétně, RSV LTR) . Alternativní konstrukt obsahoval další deleci v úseku E4, jak bylo již popsáno v patentové přihlášce WO 96/22378.

Ad-CNTF: Rekombinantní adenovirus sérotypu Ad5, ,který obsahuje, a sice vloženou do genomu místo deletovaného úseku El, expresní kazetu CNTF, obsahující cDNA kódující CNTF pod kontrolou transkripčního promotoru ('konkrétně RSV LTR). Detaily této konstrukce jsou uvedeny v přihlášce WO 94/08026. Alternativní konstrukt obsahoval další deleci v úseku E4, jak bylo již popsáno v patentové přihlášce WO 96/22378.

Ad-GDNF: Rekombinantní adenovirus sérotypu Ad5, který obsahuje, a sice vloženou do genomu místo deletovaného úseku El, expresní kazetu GDNF, obsahující cDNA kódující GDNF pod kontrolou transkripčního promotoru (konkrétně • 4 '44

4 4

4 4

444 444

4

44

444 4

4

4

4444 4444

RSV LTR). Detaily této konstrukce jsou uvedeny v přihlášce WO 94/26408. Alternativní konstrukt obsahoval další delecí·v úseku E4, jak bylo již popsáno v patentové přihlášce WO 96/22378.

Ad-BDNF: Rekombinantní adenovirus sérotypu Ad5, který obsahuje, a sice vloženou do genomu místo deletovaného úseku El, expresní kazetu BDNF, obsahující cDNA kódující BDNF pod kontrolou transkripčního promotoru (konkrétně RSV LTR). Detaily této konstrukce jsou uvedeny v přihlášce WO 94/25804. Alternativní konstrukt obsahoval další delecí v úseku E4, jak bylo již popsáno v patentové přihlášce WO 96/22378.

Ad-FGFa: Rekombinantní adenovirus sérotypu Ad5, který obsahuje, a sice vloženou do genomu místo' deletovaného úseku El, expresní kazetu FGFa, obsahující cDNA kódující FGFa pod kontrolou transkripčního promotoru (konkrétně RSV LTR). Detaily této , konstrukce' jsou uvedeny v přihlášce WO 94/25804. Alternativní konstrukt obsahoval další delecí v úseku E4, jak bylo již popsáno v patentové přihlášce WO 96/22378.

1.2. Chirurgický protokol

Jako pokusná zvířata byli použiti samci laboratorního potkana, kmene Sprague-Dawley o váže 320-340 g (Iffa Credo, Les. Oncins, Francie) . V celkové anestézii (intraperitoneální injekce pentobarbitalu 1 ml/kg - Sanoři Santé Animalej byla naříznuta kůže na pravé zadní končetině ve výši stehna a svaly byly odděleny tak, aby byl odhalen pravý ischiadický nerv. Nerv se přeřízl uprostřed mezi popliteálním prostorem a místem separace ischiadického nervu a odstranil se segment dlouhý 5 mm (obr. 1B) . Byla použita tubulární silikonová • 4 ·* 44 · 4 4

4 4 «

4 444

4 4

44

4 • 4 ··· ·

• 4

4

4

4

4

4 4'· • 4 • ·

4

4444 4444 protéza (14 mm dlouhá, 1,47 mm v průměru, tloušťka stěny: 0,23 mm, Silastic, Dow Corning Corporation, USA) . Proximální konec nervu se zavedl do trubičky a na místě je držen pomocí nylonového stehu 9/0, který spojuje míchu a nerv. Druhý steh mezi trubičkou a nervem distálně je na místě založen tak, že se dosáhne ztráty tkáně 10 mm (maximální vzdálenost, ve které lze pozorovat u krys, spontánní regeneraci periferního nervu v daných experimentálních podmínkách) (obr. 1C) . Nepropustnosti spojení proximálně se pak dosáhlo s pomocí fibrinového lepidla (Tissucol·, Immuno AG, Vídeň, Rakousko) , před tím, než se zavedlo do stentu, v kontaktu s proximálním koncem nervu, 10 μΐ virového roztoku · nebo izotonického fyziologického roztoku pro kontrolní zvířata, prostřednictvím mikroinjekční stříkačky (obr. ID) . Mrtvý objem stentu se naplnil izotonickým fyziologickým roztokem (roztok 0,9% chloridu sodného) předtím, než se vložil distální konec nervu, v ohybu, do tubulární protézy, a nepropústnost tohoto konce se zajistila opět fibrinovým lepidlem (obr. 1E). Svaly a kůže se poté zašily pomocí standardního nylonového šicího vlákna 6/0 a 4/0. Zvířata se individuálně umístila do. klecí a udržovaly se 12 hodinové cykly den/noc.

1.3. Kontrola opětného růstu axonu a retrográdní značení spinálních motoneuronů křenovou peroxidázou (HRP).

O dvanáct dní později, a poté, co byla zvířata uvedena do celkové anestézie, je spojení opět odkryto a oddělenp od okolních adherujících tkání. Předtím, než se spojení přeruší ve vzdálenosti 3 mm pod proximálním koncem původního přeříznutí nervu, se sleduje, zda je přítomna spojitá tkáň. Takto získaný „pahýl se propláchne izotonickým fyziologickým roztokem předtím, než se naplní 30% (hmotnost/objem) roztokem • t 99

9 9 9

9 9 9

9 9999

9 9

99

99

9 9 9

9 9 9

999 999

9

9.9 99 ·· · · ····

KRP (Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA). Po inkubaci 1 hodinu, se tento roztok odstraní, a konec nervu se opláchne izotonickým fyziologickým roztokem před uzavřením svalů a kůže a vrácením· zvířat zpátky do klecí. Čtyřicet osm hodin později jsou zvířata znovu uvedena do anestézie, a po

..propláchnutí PBS, jsou fixována intrakardiální infúzí 3,6* glutaraldehydu. Pak jsou vyňaty míchy, dále se fixují hodiny v 3,6% glutaraldehydu, a vloží se do roztoku 30% (hmotnost/objem) sacharózy na dobu 48 až 72 hodin.

Ze sakrolumbálních částí zmražené míchy se řežou podélné sériové řezy o tloušťce 35 pm, a přítomnost HRP se vyšetřuje pomocí 'obvyklé techniky popsané lýesulamem (15) a za použití 3,3',5,'-tetrametylbenzidinu.

1.4. Detekce β-galaktosidázy'

Aktivita β-galaktosidázy byla vizualízována za použití substrátu X-Gal (14). Stručně, podélné řezy sakrolumbální míchy o tloušťce 100 pm jsou inkubovány 18 h ve 37 °C v PBS (4 mM) , obsahujícím hexakyanoželeznatan draselný kyanoželezitan draselný (4 mM) , substrát X-Gal- (0,4. mg/ml) a chlorid’ hořečnatý (4 mM). Po inkubaci se tkáňové řezy propláchly v PBS, a pak zalily do vodného média (GelatinGlycerol) .

'··

Příklad 2

2. Průkaz retrográdního transportu nereplikujících se adenovirů axotomizovanými míšními motoneurony a' verifikace exprese transgenu

9999 9 9 9 « ► ·· ·· ·· • · · · · · · • · ·. · · · · • ··· · ··· ··· ·· ·· ·* ··

První studie umožnila 'demonstrovat, že axotomizované neurony mohou retrográdně transportovat adenovirové vektory a, exprimovat transgen po dobu, která může být až 4 týdny. Vektor (adenovirus-p-galaktosidáza popsaný v 1.1.)' byl injikován v množství 10³ pfu na každou trubičku, a exprese jeho transgenu se testovala 4. den, 14. den a ve 4 týdnech.

Ve 4 dnech byla. pozorována vysoká exprese β-galaktosidázy ve ventrálním rohu sakrolumbální části míchy, která přísluší kořenům inervujícím- ischiadický nerv (obr. 2). Tato vysoká exprese transgenu míšními motoneurony byla zjištěna ve 14 dnech, s celkovým průměrným počtem buněk pozitivních na β-galaktosidázu 63,2 ± 33,6, tedy účinnost infekce 12,25 % z celkového počtu· míšních neuronů inervujících ischiadický nerv. Výskyt β-galaktosidázové aktivity v sakrolumbálním úseku míchy byl detekován až 4 týdny's klesající se intenzitou značení (tabulka- 1).

Příklad 3

3. Test účinku vektoru kódujícího, neurotrofin (NT3) na obnovení růstu áxonu ischiadického nervu, krys při ztrátě tkáně 10 mm

Na základě těchto léčebného systému typu výsledků ukazujících možnost použití genové terapie in vivo ke stimulaci

• φ ··· « φφ ·· • · · * • · • · • · φ·· φ ···· φφ · ·· φ • · • « • φ φφφ φ φφ opětného nervového růstu po axotomii, jsme testovali účinekadenoviru nesoucího transgen kódující neurotrofín-3 (Ad-NT3 popsaný v 1.1.) na regeneraci periferního nervu. Výsledky získané 12 dnů po provedení axotomie a reparace nervu vodicím stentem vyrobeným z materiálů Sílastic, do kterého se zavedlo 10' pfu vektoru nebo izotonický fyziologický roztok, ukázaly, že spojitá tkáň je pozorována - pouze ve skupině zvířat léčených Ad-NT3 (obr. 3, tabulka II). Analýza retrográdním značením s HRP velkého počtu míšních motoneuronů, které regenerovaly axon skrze vodicí stent, naznačuje, že tato spojitá tkáň se vytváří obnoveným růstem nervu, s průměrem 182,3 ± 76,5.HRP-pozitivních neuronů proti 24,25 ± 42,7 HRPpozitivních neuronů v kontrolní skupině (obrň 4, tabulka II).

Tyto .výsledky umožnily učinit závěr, že zařízení podle vynálezu používající replikačně defektní adenovirové’vektory nesoucí geny kódující neurotrofické faktory,' může být použito pro podporu opětného růstu axonu, a to jak centrálního tak i periferního.

Příklad 4

4. Srovnání obnovení funkce po přerušení periferního nervu u krys

Vytvořila .se léze na úrovni ischiadického nervu u dospělých krys tak, aby vznikla ztráta alespoň TO mm tkáně. Proximální a distální části léze se spojily pomocí zařízení podle vynálezu (silikonová trubička, 14 mm dlouhá, 1,47 mm vnitřní průměr, materiál Sílastic), do kterého byl zaveden buďto izotonický fyziologický roztok, nebo AV-RSVPgal (10⁷ pfu v 10 μΐ), nebo AV-RSVNT₃ (10⁷ pfu v 10 μΐ) , nebo jako • 0 • · 0 · • 0 · ·

0 000

* 0 0 9

0 0 · • 0 0 990 9

9 · ·· 90 alternativa protein NT3. Obnovení funkce se měřilo elektromyograficky; motorická, odpověď v lýtkovém svalu se zaznamenávala každé dva týdny (obr. 7).

Obnovení funkce še pozorovalo ve skupině ošetřované AV-R,SVNT₃ ve srovnání s dalšími skupinami·. Tento nárůst byl statisticky významný ve srovnání, v- průběhu času, se skupinou AV-RSV3gal po dni 112, a ode dne 70. ke dni 112 se skupinou rNT3. Elektromyografická analýza jednotlivých profilů ukazuje, že ošetření s AV-RSVNT₃ zvyšuje pravděpodobnost, že se zahájí opětný růst nervu u daného zvířete. Ale poté, co opětný růst začal, hladina tohoto růstu se již nemění.

Tyto výsledky svědčí pro to, že přenos genu kódujícího neurotrofický faktor prostřednictvím techniky popsané v předkládaném vynálezu je účinný pro zvýšené oživení funkce po přerušení periferního nervu.

·♦ • · » · · • 9 ·« Μ • · · * · · • · • · ···* ···· ·· ·· ·· ·· • · « · · • · · · · ··» φ »·· • · · ·· ♦· ·«

Seznam citované literatury

- Archibald et al. J. Comp. Neurol. 1991, 306, 685-696.

- Lundborg et al. - J. Neuropathol. Exp. Neurol. 1982, 41,

412-422.

- Lundborg et al. - Exp. Neurol. 1982, -76, 361-375.

- Seckel et al. - Plast. Reconstr, Surg. 1986, 78, 793-798.

- Lundborg et al. - Scand. J. Plast. Reconstr. Surg. Hand

Surg. 1991, 25, 79-82.

- Lundborg et al. - J.Hand Surg. 1994, 19, 273-276.

- Cordeiro et al. - Plast. Reconstr. - Surg. 1989, 13, 183198.

- A.ebisher et al. - J. Neurosci. Res. 1989, 23, 282-289.

- Laquerriere et al. - Microsurg. 1994, 15, 203-210.

- Derby et al. - Exp. Neurol. 1993, 119, 176-191.

- Sahenk et al. - Brain Res. 1994, 655, 246-250.

- Glazner et al. - Neurosci. 1993, 54, 791-797.

- Van der Vliet et al., 1975

- Finiels et al. - Neuroreport, 1995, 7, 373-378.

- Mesulam - J. Histochem. Cytochem. 1978,_: 26, 106-117.

- Henderson, Adv. Neurol. 68 (1995) 235

- Thoenen (Trends in NeuroSci. 14 (1991) 165

- Lindsay in Neurotrophic Factors', Ed, (1993) 257, Academie

Press

19	- Maisonpierre	et al., Genomics	10 (1991)	558
20	- Leibrock et	al., Nátuře 341 (	1989) 149
21	- Henderson et	al., Nátuře 363,	266-270 i	(1993)
22	- Hohn et al.,	Nátuře 344 (1990	) 339
23	- L.-F. Lin et	al., Science, 260, 1130-1132 (1993

·♦ 44 «4

44 4 4 4 4 4 • 4 4 4 4 4

4 4 4 4 444 • · , 4 4 · • 444 4444 ·4 ··

4· 44

4 4 • 4 4

444 444 ' 4

44

Tabulky

Tabulka 1

Stanovení účinnosti infekce motcneuronů po axotomii adenovirovým vektorem kódujícím β-galaktosidázu

Období	Zvíře	Počet silně značených neuronů	Počet značených buněčných těl	Celkový počet značených neuronů
D4	1	10 .	12	22
	2	36	55	91 ‘
	3	17	31	48
D14	1	16	24	40
	2	59	48	107
	3	24	6	30
4 týdny				difúzní označení

Tabulka 2

Účinek injekce Ad-NT3 na obnovu růstu 'axonů v D12

Skupina	Zvíře	Období	Kontinuita tkáně	Počét pozitivi na HRP	neuronů' lích
kontrola	T01	D12	+	0
	T02	D12	-	9
	T03	D12	-	88
	T05	D13	-	0
Ad-NT3	N71	D12	+++	182
107 pfu	N72	D12	+++	106 .
	N73	D12	+++	N.D.*
	N75	D14	4- + +	259 '

N.D.: nebylo stanoveno * Zvíře uhynulo během infúze

Claims (11)

1. PATENTOVÉ

   NÁROKY • · · · · · • · . • · ···· · ·· ·

   PV SSte-to ·· · · ·· ·· v • · · · · ·· · • · · · « ·· · • · ··· · ··· ··· • · · · ·

   1. Zařízení ke stimulaci vyznačující s § biokompatibilni manžetu, do které expresi neurotrofického faktoru.

   Souprava ke stimulaci vyznačující se biokompatibilní manžetu a přípravek, pro expresi neurotrofického faktoru.

   regenerace nervů tím, že obsahuje je zaveden systém pro regenerace nervů t í m, že obsahuje který obsahuje systém
2. 3. Použití biokompatibilní manžety, do které je zaveden systém pro expresi neurotrofického faktoru, pro přípravu prostředku ke stimulaci regenerace nervů.
3. 4. Použití podle nároku 3 pro přípravu prostředku ke stimulaci regenerace periferních nervů.
4. 5. Použití podle nároku 3 pro přípravu prostředku ke stimulaci axonovéregenerace v míše.
5. 6. Použití biokompatibilní manžety, do které je zaveden systém pro expresi neurotrofického faktoru, pro přípravu prostředku k léčení traumatické léze nervového systému..

   Prostředek pro lokální a neurotrofické látky na vyznačuj ící biokompatibilní manžetu, která prodloužené uvolňováni úrovni nervové léze t i m, že obsahuje umožňuje spojit části nad • · a pod lézí, do kteréžto manžety je zaveden systém pro expresi neurotrofického faktoru.

   • 4 ·· · · · · ••44 4 4 4 · • •4 4 4 44 4

   4 4 4 444· 444 444

   Použití' podle kteréhokoliv z nároků. 3' až 6, kdy manžeta je tvořena trubicovitou výztuží a biokompatibilniho materiálu.

   z netoxického
6. 9. Použití podle kteréhokoliv z nároků 3 až 6, kdy první část nervu se vloží do jednoho konce manžety, kde se upevní stehem a/nebo lepidlem, do manžety se zavede expresní systém, a pak se do druhého konce manžety vloží druhý úsek nervu a upevní se stehem a/nebo lepidlem.
7. 10. Použití podle kteréhokoliv z nároků 3 až 6, kdy expresní systém obsahuje vektór obsahující nukleovou kyselinu, která kóduje neurotrofický faktor.
8. 11. Použití podle nároku 10, kdy vektor .je virový vektor.
9. 12. Použití podle nároku 11, kdy vektor' je adenovirový vektor.
10. 13. Použití podle nároku 10, kdy se -neurotrofický faktor vybere ze skupiny obsahující faktory ' z rodin neurotrofinů, neurokinů, beta-TGF, TGF a IGF.
11. 14. Použití podle nároku 13, kdy se neurotrofický faktor vybere ze skupiny obsahující BDNF, GDNF, CNTF, NT3, FGFa