CZ352399A3

CZ352399A3 - Způsob výroby kyseliny pantotenové

Info

Publication number: CZ352399A3
Application number: CZ19993523A
Authority: CZ
Inventors: Frank Dr. Elischewski; Jörn Dr. Kalinowski; Alfred Prof. Dr. Pühler; Nicole Dr. Dusch; Jürgen Dr. Dohmen; Mike Dr. Farwick; Georg Dr. Thierbach
Original assignee: Degussa-Hüls Aktiengesellschaft
Priority date: 1999-10-05
Filing date: 1999-10-05
Publication date: 2000-08-16

Abstract

Způsob výroby a zlepšení mikroorganismů produkujících Dpantotenovou kyselinu zesílením nukleotidových sekvencí kódujících ketopantoátreduktázu, zejména genu panE, jednotlivě nebo navzájem kombinovaně, a popřípadě doplňkově genu iívC, mikroorganismy obsahující tyto nukleotidové sekvence a způsob výroby D pantotenové kyseliny sestávajícího z fermentace těchto mikroorganismů, koncentrování pantotenové kyseliny v médiu nebo v buňkách mikroorganismů a izolace D-pantotenové kyseliny.

Description

Způsob výroby pantotenové kyseliny

Oblast techniky

Pantotenová kyselina představuje komerčně významný vitamín, který se využívá v kosmetice, medicíně, ve výživě lidí a zvířat.

Dosavadní stav techniky

Pantotenová kyselina se může vyrábět chemickou syntézou nebo biotechnicky fermentací vhodných mikroorganismů ve vhodných živných roztocích. Při chemické syntéze je důležitou sloučeninou DL-pantolakton. Vyrábí se vícestupňovým způsobem z formaldehydu, isobutyraldehydu a kyanidu. V dalších krocích způsobu se dělí racemická směs a D-pantolakton se kondenzuje s β-alaninem a získá se pantotenová kyselina.

Výhoda fermentační výroby pomocí mikroorganismů spočívá v přímé tvorbě žádoucí stereoisomerní D-formy.

Pantotenovou kyselinu mohou v živném roztoku, který obsahuje glukózu, DL-pantoovou kyselinu a β-alanin, produkovat různé druhy baktérií, jako například Escherichia coli, Arthrobacter ureafaciens, Corynebacterium erythrogenes, Brevibacterium ammoniagenes a také kvasinky, jako například Debaromyces castellii, jak se ukazuje v EPA 0 493 060. EPA 0 493 060 dále ukazuje, že při Escherichia coli se amplifikací genů biosyntézy pantotenové kyseliny, které se nacházejí na plazmidech pFV3 a PFV5, v živném roztoku, který obsahuje glukózu, DL-pantoovou kyselinu a β-alanin, zlepšuje tvorba D-pantotenové kyseliny.

EPA 0 590 857 a US patent 5,518,906 popisují mutanty odvozené od kmene IFO3547 Escherichia coli, jako FV5714, FV525, FV814, FV521, FV221, FV6051 a FV5069, které nesou rezistence vůči rozličným antimetabolitům, jako je salicylová kyselina, β-ketomáselná kyselina, β-hydroxyasparagová kyselina, O-methyltreonin a α-ketoisovalerová kyselina, a produkují D-pantotenovou kyselinu v živném roztoku, který obsahuje glukózu a β-alanin. V EPA 0 590 857 a US patentu 5,518,906 se dále ukazuje, že po amplifikaci genů biosyntézy pantotenové kyseliny, které se nacházejí na plazmidu pFV31, se ve výše uvedených kmenech v živném roztoku obsahujícím glukózu zlepšuje produkce D-pantoové kyseliny a v živném roztoku obsahujícím glukózu a β-alanin se zlepšuje produkce D-pantotenové kyseliny.

Ve WO 97/10340 se kromě toho ukazuje, že v kmenech Escherichia coli vytvářejících pantotenovou kyselinu se pomocí zvýšení aktivity enzymu syntázy acetohydroxykyseliny II, enzymu biosyntézy valinu, dále může zvyšovat produkce pantotenové kyseliny.

Vynálezci si stanovili za úkol poskytnout nové podlohy pro zlepšený způsob výroby pantotenové kyseliny.

Podstata vynálezu

Vitamín pantotenové kyselina představuje komerčně významný produkt, který se využívá v kosmetice, medicíně, ve výživě lidí a zvířat. Existuje proto obecný zájem o poskytnutí zlepšených způsobů výroby pantotenové kyseliny. Když se • 9 • ♦ · · v následujícím textu uvádí D-pantotenová kyselina nebo pantotenová kyselina nebo pantotenát, míní se tím nejenom volná kyselina, ale také soli D-pantotenové kyseliny, jako například vápenatá, sodná, amonná nebo draselná sůl. Předmětem vynálezu je způsob výroby a zlepšení mikroorganismů produkujících pantotenovou kyselinu pomocí zesílení, zejména nadměrné exprese nukleotidových sekvencí, zejména genu panE, kódujících ketopantoátreduktázu, jednotlivě nebo kombinovaně navzájem a popřípadě dodatečně genu ilvC.

Pojem „zesílení popisuje v této souvislosti zvýšení intracelulární aktivity jednoho nebo více enzymů, které jsou kódovány příslušnou DNA, tím, že se zvýší počet kopií genu (genů), použije se silný promotor nebo se použije gen, který kóduje příslušný enzym s vysokou specifickou aktivitou a tato opatření se popřípadě kombinují.

Zjistilo se zejména, že při nadměrné expresi genu panE spolu s genem panB, panC a panD se dále zlepšuje tvorba pantotenové kyseliny. K dosažení nadměrné exprese se může počet kopií odpovídajících genů zvýšit pomocí plazmidových vektorů, jako například pBR322 (Sutcliffe, COLD SPRING HARBOR SYMPOSIA ON QUANTITATIVE BIOLOGY 1979, 43: 77-90) nebo pUC19 (Viera, Gene 1982 19:259-268), nebo se může mutovat promotorové a regulační oblast, která se nachází proti směru strukturního genu. Známým příkladem toho je mutace lac-UV5 promotoru lac (Wínnacker: Gene und Klone,

Eine Einfůhrung in die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Deutschland, 1990). Stejným způsobem působí expresivní kazety, které se vkládají proti směru strukturního genu. Tato metoda se použila například při LaVallie et al., (BIO/TECHNOLOGY 11, 187-193 (1993) a v PCT/US97(13359. Dále sa může alternativně dosáhnout nadměrné

exprese příslušných genů změnou složení médií a provedení kultivace. Příkladem toho je obecně známá regulace exprese operonu lac pomocí glukózy a laktózy. Vynálezci kromě toho zjistili, že nadměrná exprese genu panE se výhodně projevuje v kmenech, které vykazují mutace rezistence vůči metabolitům a antimetabolitům, jako například rezistenci vůči L-valinu. Dále se zjistilo, že nadměrná exprese genu panE se výhodně projevuje v kmenech, které mají defektní mutace v genech metabolických drah, jako například v genu avtA nebo ilvE, které převádějí prekurzory pantotenové kyseliny nebo snižujú tvorbu pantotenové kyseliny.

Mikroorganismy, které jsou předmětem předloženého vynálezu, mohou produkovat pantotenovou kyselinu z glukózy, sacharózy, laktózy, fruktózy, maltózy, melasy, škrobu, celulózy nebo z glycerolu a ethanolu. Přitom se jedná o plísně, kvasinky nebo zejména gram-pozitivní baktérie, například rodu Corynebacteríum, nebo gram-negativní baktérie, například Enterobacteriaceae. Při čeledi Enterobacteriaceae je třeba jmenovat zejména rod Escherichia s druhem Escherichia coli. V rámci druhu Escherichia coli je potřebné uvést takzvané kmeny K-12, jako například kmeny MG1655 nebo W3110 (Neidhard et al.: Escherichia coli and Salmonella. Cellular and Molecular Biology (ASM Press, Washington D. C.) ) nebo kmen Escherichia coli divokého typu IFO3547 (Institut pro fermentaci, Osaka, Japonsko) a od nich odvozené mutanty. Při rodu Corynebacterium je možno uvést zejména druh Corynebacterium glutamicum, který je v odborném světe znám pro svou schopnost tvořit aminokyseliny. K tomuto druhu patří kmeny divokého typu, například Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Brevibacterium flavum ATCC14067, Corynebacterium melassecola ATCC17965 a jiné.

• · · · · · • · · · * · · · • 99 9 9

Pro izolaci genu ilvC a genu panE se nejdříve vytvoří například z Escherichia coli mutant, který nese mutaci v genu ilvC a genu panE.

Nukleotidová sekvence genu ilvC Escherichia coli je známa (Wek and Hatfield, Journal of Biological Chemistry 261, 2441-2450 (1986)). Metody izolace chromozomální DNA jsou rovněž známy (Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press,

1989). Volbou vhodných primerů se může pomocí polymerázové řetězové reakce amplifikovat gen ilvC (Innis et al., PCR protokols. A guide to methods and applications, 1990, Academie Press). Potom se vloží do plazmidového vektoru.

Jako plazmidové vektory přicházejí v úvahu takové, které se mohou replikovat v příslušných mikroorganismech. Pro Escherichia coli přicházejí pro předložený vynález v úvahu například vektory pSClOl (Vocke and Bastia, Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 80 (21), 6557-6561 (1983)) nebo pKK223-3 (Brosius and Holý, Proceedings of the National Academy of Science USA 81, 6929 (1984)), pro Corynebacterium glutamicum například vektor pJCl (Cremer et al., Mol. Gen. Genet. 220:478-480 (1990)) nebo pEKEx2 (Eikmanns et al., Gene 102:93-98 (1991)) nebo pZ8-l (evropský patentový spis 0 375 889) a pro Saccharomyces cerevisiae například vektor pBB116 (Berse, Gene 25: 109-117 (1983)) nebo pDGl (Buxton et al., Gene 37: 207-214 (1985)). Metody vkládání fragmentů DNA do plazmidových vektorů jsou popsány v Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Metody transformace a elektroporace jsou popsány v Tauch et al. (FEMS Microbiology Letters 123:343-347 (1994). Příkladem takového transformovaného kmene je kmen Escherichia coli MG1655/pFE32. Plazmid pFE32 obsahuje gen ilvC z MG1655,

4 4 4 4 4

4444 44 • ♦ • 4. 4 který se zabudoval do vektoru pBR322. Dalším příkladem takového transformovaného kmene je kmen ATCC13032/pFE91 Corynebacterium glutamicum. Plazmid pFE91 obsahuje gen ilvC z ATCC13032, který se vložil do vektoru pECm3. Plazmid pECm3 je derivátem plazmídu pECm2 (Tauch, 1994, FEMS Microbiological Letters, 123:343-348), jehož gen rezistence vůči kanamycinu se odstranil pomocí restrikce BglII a BamHI s následnou religací.

Pro zabudování mutace do genu ilvC, která eliminuje jeho funkci, se může do tohoto zabudovat například delece nebo inzerce. Pro vytvoření delece se může pomocí vhodných restrikčních enzymů a následného navázání vzniklých konců odstranit vnitřní část nukleotidové sekvence strukturního genu. Tímto způsobem mutovaný gen ilvC je nefunkční. Stejným způsobem se může do genu ilvC vložit druhý gen, aby kódoval rezistenci vůči antibiotiku. Tímto způsobem mutovaný gen ilvC je rovněž nefunkční. Takto mutovaný gen ilvC se může potom vložit do mikroorganismu a v jeho chromozómu se může nahradit genem divokého typu. Metody provedení nahrazení genu jsou známy z literatury. Pro Escheríchia coli se může použít metoda popsaná Hamilton et al. (Journal of Bacteriology 171, 4617-4622 (1989)), která je založena na replikačních mutantech plazmidu pSCIOl, citlivých na teplotu. Takovým plazmidem je například pMAK705. Pro Corynebacterium glutamicum se může použít metoda genové výměny popsaná Schwarzerem a Puhlerem (BIO/TECHNOLOGY 9, 84-87 (1991)), při které se používají nereplikativní plazmidové vektory. Pro Saccharomyces cerevisiae je popsána metoda cílené výměny genů v Rocca et al. (Nucleic Acid Research 20(17), 4671-4672 (1992)).

·· ·♦»· ·· ·· · ·

Mutovaný gen ilvC se může například takto vytvořit z genu ilvC divokého typu. Plazmid pFE32 se skládá z pBR322, do jehož restrikčního místa střihu byl vložen gen ilvC divokého typu. Do místa střihu KpnI genu ilvC pFE32 byl vložen gen aacCl, který kóduje rezistenci vůči antibiotiku gentamycinu (Schweizer, BioTechniques 15 (5), 831-834 (1993)). Tímto způsobem získaný plazmid pFE33 obsahuje alelu ilvC::aacCl, která již nemůže tvořit žádný funkční genový produkt ilvC. Alela ilvC::aacCl se odebrala z plazmidu pFE33 a vložila do místa střihu Sphl plazmidu pMAK705, čímž vznikl plazmid pBDl. Plazmid pDBl je plazmidovým vektorem způsobilým k výměně alel, který se skládá za prvé z pMAK705 a za druhé z alely ilvC::aacCl. Plazmid pDBl se použil podle metody popsané Hamiltonem et al., aby se vyměnil gen ilvC divokého typu nacházející se v MG1655 za alelu ilvC::aacCl. Tímto způsobem vzniklý kmen se označil jako FE4.

Pro izolaci mutantu FE4, který nese mutaci v genu panE, se kmen FE4 podrobil transpozonové mutagenezi s transpozonem Tn5. Transpozon Tn5 je popsán v Auerswald (COLD SPRING HARBOR SYMPOSIA ON QUANTITATIVE BIOLOGY 45, 107-113 (1981)). Metoda transpozonové mutageneze je popsána například v příručce od Millera, A: Short Course in Bacterial Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Releated Bacteria (Cold Spring Harbor Laboratory Press,

1992). Metoda je dále popsána v Simon (Gene, 80, 161-169 (1998)) a také v příručce od Hagemanna: Gentechnologische Arbeitsmethoden (Gustav Fischer Verlag, 1990) a v početných jiných publikacích přístupných veřejnosti. Mutanty se mohou dále vytvářet po mutagenezi ultrafialovým světlem nebo po zpracování chemikálií vyvolávající mutaci, jako například Nmethyl-N' -nitro-N-nitrosoguanidinem. Mezi mutanty získanými tímto způsobem se mohou po zkoušce potřeby růstových látek,

zejména potřeby pantotenové kyseliny, izolovat takové mutanty, které nesou mutaci v genu biosyntézy pantotenové kyseliny. Zvláštní zájem je o takové mutanty, potřebující pantotenovou kyselinu, které mohou zhodnocovat jako růstovou látku nikoli ketopantoát, ale pantoát, a tedy jsou mutovány v genu panE kódujícím ketopantoátreduktázu (EC 1.1.1169). Příkladem k tomu je takto získaný kmen FE5, který kromě mutace ilv::aacCl nese mutaci panE::Tn5.

Mikroorganismy, které nesou defektní mutaci v genu ilvC a panE, jako například kmen FE5 Escherichia coli, se mohou použít jako hostitelé pro klonování k izolaci genu ilvC a obzvláště zajímavého genu panE nebo nukleotidových sekvencí, které kódují proteiny s ketopantoátreduktázovou aktivitou.

K tomu se založí genová banka zájem poutajícího mikroorganismu. Založení genových bank je popsáno v obecně známých učebnicích a příručkách. Jako příklad možno uvést učebnici od Winnackera: Gene und Klone, Eine Einfůhrung in die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Deutschland, 1990) nebo příručku od Sambrooka et al.: Molecular Cloning,

A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Známou genovou bankou je banka kmene W13110 E. coli K-12, kterou založili Kohara et al. (Cell 50, 495 - 508 (1987)). Genové banky různých mikroorganismů se mohou zatím získat zakoupením, jako například genová banka kmene Sp63 Saccharomyces pombe od firmy Stratagene (Heidelberg, Německo) v plazmidu Lambda FIX II (Elgin, Strategies 4: 6-7 (1991)), genová banka kmene W1485 Escherichia coli od firmy CLONTECH (Heidelberg, Německo) v plazmidu pGADlO (Kitts, CLONTECH (Heidelberg, Německo) Vectors On Disc version 1.3, 1994), kterého nukleotidová sekvence je přístupná pod GenBank accession number (přírůstkovým číslem genové banky)

U131 88. Genová banka vyrobená výše popsaným způsobem se potom může pomocí transformace zavést do výše popsaného hostitele FE5. Takto se například pGADlO - genová banka W1485 zavedla do kmene FE5 pomocí transformace a získané transformanty se přezkoušely na svou schopnost růst na živné půdě bez pantotenové kyseliny. Inzerce obsažené v plazmidové DNA získaných transformantů prototrofních vůči pantotenové kyselině se mohou prozkoumat pomocí určení nukleotidové sekvence. Metody určování nukleotidových sekvencí se mohou přečíst například v Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Science USA 74:5463-5467 (1977)). Nukleotidové sekvence se mohou přiřadit genům pomocí zkoumání homologie. Jedna z možností pro toto vyhledávání homologie nabízí srovnání s nukleotidovými sekvencemi báze dat EMBL a genové banky, které se mohou uskutečnit prostřednictvím BLAST E-mail Service (Altschul, Journal of Molecular Biology 215, 403-410 (1990)). Příkladem takového transformantů je kmen FE5/pFEbankl6 Escherichia coli, který nese gen panE kmene MG1655 E. coli.

Gen panE izolovaný a identifikovaný popsaným způsobem se může potom v žádoucím mikroorganismu přivést k expresi. K tomu se amplifikuje pomocí plazmidových vektorů. Tyto zase mohou být opatřeny signálovými strukturami, které zajišťují účinnou transkripci a translaci. Přehled expresivních vektorů se nachází například v učebnici Winnacker: Gene und Klone, Eine Einfúhrung in die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Deutschland, 1990) nebo v Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Dále se mohou expresivní signály, jako například promotor tac, vložit do chromozómu proti směru genu panE. Takové metody jsou popsány ve WO 98/04715. Gen panE, který se má exprimovat, se může vzít z klonovaného • ··· • · chromozomálního fragmentu DNA nebo se může zase amplifikovat pomocí polymerázové řetězové reakce. Množství ketopantoátreduktázy nacházející se v příslušném mikroorganismu se může stanovit pomocí metody popsané Shimizu et al. (Journal of Biological Chemistry 263: 12077-12084 (1988)). Příkladem takového kmene je kmen MG1655/pFE65 Escherichia coli. Plazmid pFE65 se skládá z vektoru pKK223-3, do jehož restrikčního místa štěpení EcoRI se vložil gen panE Escherichia coli MG1655.

Podle vynálezu se projevilo jako výhodné dodatečně ke genu panE kódujícímu ketopantoátreduktázu zesílit, zejména nadměrně exprimovat jeden nebo více genů biosyntézy pantotenové kyseliny. K tomu patří geny, které kódují enzymy ketopantoát-hydroxymethyltransferázu (EC 4.1.2.12), aspartát-l-dekarboxylázu (EC 4.1.1.11) a pantotenát-syntetázu (EC 6.3.2.1). V Escherichia coli nesou tyto geny označení panB, panD a pan C (Miller, A: Short Course in Bacterial Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Releated Bacteria (Cold Spring Harbor Laboratory Press,

1992). K tomu se geny mohou vložit do různých kompatibilních plazmidových vektorů. Příklady k tomu jsou v Bartolome et al. (Gene 102, 75-78 (1991)). Exprese genů se může dále zvýšit změnou proti směru uložených chromozomálních signálových struktur. Dále se příslušné geny mohou uspořádát navzájem za sebou za kontroly společného promotoru a vložit do plazmídového vektoru a zavést do vhodného mikroorganismu. Příkladem k tomu je kmen MG1655/pFE80 Escherichia coli. Plazmid pFE80 se skládá z plazmidu pKK223-3, který obsahuje geny panB, panD, panC a panE v uvedeném pořadí. Proti směru genu panB se nachází v pFE80 promotor tac jako expresivní signál.

• · · • 9 9 * • · · 9 • · · 9

9

Dále se jako výhodné ukázalo nadměrně exprimovat gen panE a expresivní jednotku skládající se z genů panB, panD, panC a panE v hostitelských kmenech, které obsahují chromozomální mutace.

Mohou se použít jednotlivě nebo společně mutace, které způsobují rezistenci vůči produktům metabolismu, jako například L-valinu nebo β-ketoisovalerové kyselině, nebo vůči analogům produktů metabolismu, jako například β-hydroxyasparagové kyselině nebo O-methyltreoninu. Takové mutanty se vyskytují spontánně nebo se mohou vytvářet po mutagenezi ultrafialovým světlem nebo po zpracování s chemikálií vyvolávající mutaci, jako například N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanídínem, a potom selektovat na agarových plotnách, které obsahují příslušnou látku. Způsoby vyvolání mutace a selekce jsou obecně známy a mohou se mezi jiným přečíst v Miller (A. Short Course in Bacterial Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Releated Bacteria (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992)) nebo v příručce „Manual of Methods for General Bacteriology od American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981). Příkladem pro takové mutanty je kmen FE6 Escherichia coli, který se izoloval jako spontánně se vyskytující, vůči L-valinu rezistentní mutant kmene MG1655.

Dále se mohou cíleně vyloučit nepříznivé nebo rušivé chromozomálně kódované metabolické reakce. K tomu se do příslušných genů vloží inzerce nebo delece a takto vzniklé mutované geny, popřípadě alely se zabudují do chromozómu příslušného hostitele. Mohou se použít metody, které byly popsány výše pro mutaci genu ilvC. Příkladem takových mutantů je kmen FE7 Escherichia coli, který nese mutaci avtA::aadB v chromozómu. Přitom se jedná o kmen MG1655, ·» 99« · • · 9 ·

9 • · · 9·9· ·· •9 ···

9 9

9 9 · 9

9 9 «

9 9

9« · ·« •9 99 · 9 ·

9 9 9

9 9 * « • 9 9 9

9« do jehož genu avtA se vložil gen aadB z plazmidu ρΗΡ45Ω, zprostředkovávající rezistenci vůči streptomycinu (Prentki a Krisch, Gene 29, 303-313 (1984) . V hostitelských kmenech vytvořených tímto způsobem se může potom nadměrně exprimovat gen panE samotný nebo v kombinací s jinými geny. Příklady k tomu jsou kmeny FE6/pFE80 a FE7/pFE80.

Mikroorganismy vytvořené podle vynálezu se mohou kultivovat pro účely produkce pantotenové kyseliny kontinuálně nebo diskontinuálně způsobem batoh nebo způsobem fed batoh (přítokový systém) nebo způsobem repeated fed batoh (opakovaný přítokový systém). Zhrnutí známých kultivačních metod se popisuje v učebnici od Chmíela (Bioprozesstechnik 1. Einfúhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) nebo v učebnici od Storhase (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Viewegh Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)). Kultivační médium, které se má použít, musí vhodným způsobem vyhovovat nárokům daných mikroorganismů. Popisy kultivačních médií různých mikroorganismů se nacházejí v příručce „Manual of Methods for General Bacteriology od American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981). Jako zdroje uhlíku se mohou použít cukry a sacharidy, jako je například glukóza, sacharóza, laktóza, fruktóza, maltóza, melasa, škrob a celulóza; oleje a tuky, jako například sójový olej, slunečnicový olej, arašídový olej a kokosový olej, mastné kyseliny, jako je palmitová kyselina, stearová kyselina, linolová kyselina; alkoholy, jako je například glycerol a ethanol; a organické kyseliny, jako je například octová kyselina. Tyto látky se mohou používat jako jednotlivé složky nebo jako směs. Jako zdroje dusíku se mohou používat organické sloučeniny obsahující dusík, například peptony, kvasnicový extrakt, masový extrakt, sladový extrakt, máčecí voda, sójová mouka a močo13 • •e· ·· ·· «««a • · * • · 9 ·« • ♦ · • · * ·· 9 *·

ΑΛΚ. ‘AfeWSÍa^wi^ifcí**;

99 · « « • * « * * · ♦ · · *· vina, nebo anorganické sloučeniny, jako je například síran amonný, chlorid amonný, fosforečnan amonný, uhličitan amonný a dusičnan amonný. Zdroje dusíku se mohou používat jednotlivě nebo jako směs. Jako zdroje fosforu se mohou používat kyselina fosforečná, dihydrogenfosforečnan draselný nebo hydrogenfosforečnan draselný nebo příslušné soli obsahující sodík. Kultivační médium musí dále obsahovat soli kovů, jako například síran hořečnatý nebo síran železa, které jsou potřebné pro růst. Konečně se mohou dodatečně k výše uvedeným látkám používat esenciální růstové látky, jako jsou aminokyseliny a vitaminy. Ke kultivačnímu médiu se mohou kromě toho přidávat vhodné prekurzory pantotenové kyseliny, jako β-alanin nebo ketopantoová kyselina a její soli. Uvedené látky se mohou ke kultuře přidávat ve formě jednorázové vsázky nebo se mohou vhodným způsobem přidávat během kultivace.

Pro kontrolu pH kultury se používají zásadité sloučeniny, jako je hydroxid sodný, hydroxid draselný, amoniak, nebo kyselé sloučeniny, jako je kyselina fosforečná nebo kyselina sírová. Pro kontrolu tvorby pěny se mohou používat odpěňovadla, jako například polyglykolestery mastných kyselin. Pro udržování stability plazmidů se mohou k médiu přidávat vhodné selektivně působící látky, například antibiotika. Aby se udržovaly aerobní podmínky, zavádí se do kultury kyslík nebo směsi obsahující kyslík, například vzduch. Teplota kultury je obvykle přibližně 20 °C až 50 °C a zejména přibližně 25 °C až 45 °C. Kultura se udržuje tak dlouho, dokud se nevytvoří maximum pantotenové kyseliny. Tohoto cílu se obvykle dosáhne za 10 hodin až 160 hodin.

···· «0 0000 00

Koncentrace vytvořené pantotenové kyseliny se může stanovit pomocí známých způsobů (Velisek; Chromatografic Science 60, 515-560 (1992))).

Následující mikroorganismy se uložily v Německé sbírce mikroorganismů a buňkových kultur (DSMZ, Braunschweig, Německo) podle budapešťské smlouvy:

Escherichia coli K12 kmen FE5 jako DSM12378,

Escherichia coli K12 kmen MG1655/pFE32 jako DSM12413,

Escherichia coli K12 kmen MG1655/pFE65 jako DSM12382,

Escherichia coli K12 kmen MG1655/pFE80 jako DSM12414,

Escherichia coli K12 kmen FE6 jako DSM12379,

Escherichia coli K12 kmen FE7 jako DSM12380.

Pomocí způsobu podle vynálezu se odborníkovi se poskytuje nový nástroj k docílení zlepšení tvorby pantotenové kyseliny mikroorganismů.

Příklady provedení vynálezu

Předložený vynález se v následujícím textu blíže vysvětluje na základě příkladů provedení.

Příklad 1

Produkce mutantu ilvC::aacCl panE::Tn5 kmene MG1655 Escherichia coli K12 • · · · • · · · · ·

1. Příprava mutantu ilvC::aacCl

Vycházeje z nukleotidové sekvence pro gen ilvC v E. coli K12 MG1655, (EMBL-GenBank: Accession Nr. M87049) se syntetizovaly primery PCR (MWG Biotech (Ebersberg, Německo) ). Fragment DNA o velikosti přibližně 1500 bp se mohl amplifikovat pomocí těchto prímerů za standardní metody PCR od Innis et al. (PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academie Press). Chromozomální DNA E. coli K12 MG1655 použitá pro PCR se izolovala pomocí kitu NucleoSpin C + T (Macherey-Nagel (Duřen, Německo), popis produktu NucleoSpin C + T, Art.-Nr. 740952). Velikost se stanovila pomocí gélově elektroforetického dělení (30 minut, 10 V/cm) v 0,8% agarózovém gelu.

Primer PCR pro gen ilvC z E. coli:

ilvCl 5'- AGAAGCACAACATCACGAGG -3'

ÍlvC2 5' -CTCCAGGAGAAGGCTTGAGT -3'

Produkt PCR genu ilvC se transformoval do plazmidu pCR®2.1 a do kmene TOP10F' E. coli K12 (Invitrogen (Leek, Holandsko), popis produktu Originál TA Cloning® Kit, Cat. no. KNM2030-01).

Úspěch klonování se dokázal štěpením DNA plazmidu pCR® 2.1ilvC restrikčními enzymy Eagl (Pharmacia Biotech (Freiburg, Německo), popis produktu Eagl, Code no. 27-0885-01), EcoRI (Pharmacia Biotech (Freiburg, Německo), popis produktu EcoRI, Code no. 27-0884-03) a Knpl (Pharmacia Biotech (Freiburg, Německo), popis produktu KpnI, Code no. 27-0908-01). K • 9 · · • ·

9 9 9 9 9

9 9 9 9 > ·· 9 9 tomu se izolovala plazmidová DNA pomocí kitu QIAprep Spin Plasmid (QIAGEN (Hilden, Německo), Cat. No. 27106) a po štěpení v 0,8% agarózovém gelu (30 minut, lOV/cm) se dělila.

Pro izolaci genu ilvC z plazmidu pCR®2.1ilvC se izolovaná plazmidová DNA štěpila enzymy HindlII (Pharmacia Biotech (Freiburg, Nemecko), popis produktu HindlII, Code no. 27-0860-01) a Xbal (Pharmacia Biotech (Freiburg, Německo), popis produktu Xbal, Code no. 27-0948-01), štěpná násada se dělila v 0,8% agarózovém gelu (30 minut, 10 V/cm) a fragment ilvC 1,5 kbp se izoloval pomocí kitu GLASSMAX™ (GIBCO BRL (Eggenstein, Německo), popis produktu GLASSMAX™ Spin Cartridges, Cat. No. 15590-052). Izolovaný fragment ilvC se lígoval s plazmidem pMAK705 rovněž štěpeným HindlII a Xbal (Hamilton et al., Journal of Bacteriology 1989, 171:46174622) pomocí T4-DNA-ligázy (Pharmacia Biotech (Freiburg, Německo), popis produktu T4-DNA-ligáza, Code no. 27-0870-03) a kmen DH5amcr E. coli (Grant, Proceedings of the National Academy of Science 1990, 87: 4645-4649) se elektroporoval s ligační násadou (Tauch, FEMS Microbiology Letters 1994, 123: 343-347). Selekce buňek nesoucích plazmid se uskutečňovala rozetřením elektroporační násady na agar LB (Lennox, Virology 1955, 1: 190), který byl smíchán s 25 pg/ml chloramfenikolu (Sigma (Deisenhofen, Nemecko), (Deisenhofen, Německo), Code no. C 0378), a inkubací 24 hodin při 30 °C. Hledaný plazmid se mohl po izolaci DNA a kontrolním štěpení, při následné gelové elektroforéze v 0,8% agarózovém gelu (30 minut, 10 V/cm), pomocí enzymů HindlII, Xbal a KpnI identifikovat v jednom klonu a označil se jako pFE30.

Pro izolaci genu ilvC z plazmidu pFE30 se izolovaná plazmidová DNA štěpila enzymem BamHI (Pharmacia Biotech (Freiburg, Německo), popis produktu BamHI, Code no. 27-086817

. 03), štěpná násada se dělila v 0,8% agarózovém gelu (30 minut, 10 V/cm) a fragment ilvC 1,5 kbp se izoloval pomocí • kitu GLASSMAX™. Izolovaný fragment ilvC se ligoval pomocí

T4-DNA-ligázy s plazmidem pBR322 rovněž štěpeným BamHI (Sutcliffe, COLD SPRING HARBOR ON QUANTITATIVE BIOLOGY 1979, 43: 77-90) a kmen DH5amcr E. coli se elektroporoval s ligační násadou. Selekce buněk nesoucích plazmid se prováděla rozetřením elektroporační násady na agar LB, který byl smíchán se 100 μg/ml ampicilinu (Sigma (Deisenhofen, Německo), Code no. A 9518), a inkubací 24 hodin při 37 °C. Získané kolonie se paralelně naočkovaly na agar LB+ampicilin a LB + (5μg/ml) tetracyklinu (Sigma (Deisenhofen, Německo), Code no. T3383). DNA z kolonií senzitivních na tetracyklin se izolovala pomocí kitu QIAprep Spin Plasmid a úspěch klonování se ověřoval štěpením pomocí BamHI a KpnI a následným dělením v 0,8% agarózovém gelu (30 minut, 10 V/cm). Zkonstruovaný plazmid se nazval pFE32.

/

Do místa střihu KpnI plazmidu pFE32 se klonoval gen « aacCl a získaný plazmid se označil pFE33. Gen aacCl se k tomu izoloval z agarózového gelu (30 minut, 10 V/cm), ve kterém se dělila KpnI-restrikční násada plazmidu pMS255 (Becker, Gene 1995, 162: 37-39). Ligace se uskutečňovala _B pomocí T4-DNA-ligázy. Po eletroporaci ligační násady do kmene DH5amcr se transformanty selektovaly na agaru PA ' (Sambrook, Molecular cloning, 2^nd edn, Cold Spring Harbor,

1989), který byl smíchán s 10 μg/ml gentamycinu (Sigma (Deisenhofen, Německo), Code no. G3632) . DNA z kolonií rezistentních vůči gentamycinu se izolovala pomocí kitu QIAprep Spin Plasmid a úspěch klonování se ověřoval štěpením pomocí BamHI a KpnI a následným dělením v 0,8% agarózovém gelu (30 minut, 10 V/cm).

Fragment ilvC:aacCl se vyštěpil z plazmidu pFE33 restrikcí Sphl (Pharmacia Biotech (Freiburg, Německo), popis produktu Sphl, Code no. 27-0951-01), dělil v 0,8% agarózovém gelu (30 minut, 10 V/cm) a izoloval pomocí kitu GLASSMAX™. Fragment se ligoval s plazmidem pMAK705, štěpeným Sphl, pomocí T4-DNA-ligázy, ligační násada se elektroporovala do kmene DH5ccmcr a transformanty se selektovaly pomocí inkubace na agaru PA+gentamycin 24 hodin při 30 °C. DNA z kolonií rezistentních vůči gentamycinu se izolovala pomocí kitu QIAprep Spin Plasmid a úspěch klonování se dokázal štěpením pomocí Sphl a EcoRI v 0,8% agarózovém gelu (30 minut, 10 V/cm). Zkonstruovaný plazmid se nazval pDBl.

Pomocí plamzidu pDBl se v kmenu E. coli K12 MG1655 vyměnil chromozomální gen ilvC za přerušený fragment ilvC:aacCl. Pro genovou výměnu se použila modifikovaná metoda podle Hamiltona et al. Plazmid pDBl se elektroporoval do kmene E. coli K12 MG1655 a potom se k selekci kointegrátů inkubovaly transformanty 24 hodin při 42 °C na LB-chloramfenikolovém agaru. Získané kolonie se k rozjednocování znovu inkubovaly nanesené na stejném médiu 24 hodin při 42 °C. Pro dezintegraci plazmidu se jednotlivé kolonie inkubovaly v 5 ml kapalného média LB 24 hodin při 42 °C a potom se rozetřela zřeďovací řada kapalného média na agar LB-chloramfenikol. Tato zřeďovací řada se inkubovala 24 hodin při 30 °C. Pro ošetření plazmidu se jednotlivé kolonie získané ze zřeďovací řady nanesly v 3 za sebou následujících nátěrech jednotlivých kolonií na agar LB vždy na 24 hodin při 42 °C. Pro kontrolu fenotypu se získané jednotlivé kolonie paralelně naočkovaly na agarové plotny s následujícími médii: médium E (Vogel, Journal of Biological Chemistry 1956, 218: 97-106) + glukóza (0,4%), médium E + glukóza (0,4%) (Sigma (Deisenhofen, Německo), Code no. G8270) + 50 μg/ml isoleuci19 • · ···· ·· ·· • · · . ♦ .» · · * · · · · · · · · nu (Sigma (Deisenhofen, Německo), Code no.17268), médium E + glukóza (0,4%) + 50 μρ ketoisovalerátu (ICN (Eschwege, Německo), Code no. 151395), médium E + glukóza (0,4%) + 50 μρ/ml isoleucinu + 50 μρ ketoisovalerátu, médium PA + gentamycin + médium LB + chloramfenikol. Tato média se inkubovala 48 hodin při 37 °C. Mezi 150 testovanými jednotlivými koloniemi se nacházela jedna, jejíž fenotyp indikoval výměnu chromozomálního genu ilvC za fragment ilvCiaacCl. Tento kmen se označil jako FE4.

2. Produkce dvojnásobného mutantu ilvC::aacCl panE::Tn5

Kmen FE4 se nanesl do 5 ml kapalného média LB + lOmM MgSCL + 0,2% maltózy (Sigma (Deisenhofen, Německo), Code no. M5885) (LBMgMal) při 37 °C na optickou hustotu 0,5. Měření optické hustoty se uskutečnilo fotometrem Novaspec II Pharmacia (Freiburg, Německo) při vlnové délce 660 nm. 2 ml roztoku baktérií se odstřeďovalo 5 min pri 3000 ot./min (centrifuga Beckmann model J2-21, rotor JA-17). Po extrakci pelety pomocí 0,5 ml kapalného média LBMgMal se suspenze smíchala s 30 μΐ lyzátu λ::Tn5(Simon, Gene 1989, 80(1):161169), přibližně 10⁸ bakteriofágů. Tento lyzát se izoloval z kmene E. coli K12 C600 (Appleyard, Genetics 1954, 39:440452), podle Hagemannovy metody (Gentechnologische.Arbeitsmethoden, Gustav Fischer Verlag, 1990: 14-18). Suspenze s lyzátem λ::Τη5 se inkubovala 45 minut při 30 °C. Po odstřeďování 5 minut při 3000 ot./min se peleta extrahovala do 10 ml PA + lOmM pyrofosfátu a inkubovala 3 hodiny při 37 °C. Roztok baktérií se rozetřel jako zřeďovací řada na médium Eagar + glukóza (0,4%) + 25 μρ/ml kanamycinu + 50 μρ/ml isoleucinu + 50 μρ/ml ketoisovalerátu + 50 μρ/ml pantotenátu a inkuboval 48 hodin při 37 °C. Jednotlivé kolonie se paralel20

J-H' 4·' • · · · • · • 9 9 9 9 9 ně naočkovaly na médium E-agar + glukóza (0,4%) + 25 pg/ml kanamycinu + 50 μς/πιΐ isoleucinu + 50 gg/ml ketoisovalerátu + 50 gg/ml pantotenátu a na médium agarE + glukóza (0,4 %) + 25 gg/ml kanamycinu + 50 μg/ml isoleucinu + 50 μς/ml ketoisovalerátu a 48 hodin inkubovaly při 37 °C. Mezi 14000 naočkovanými jednotlivými koloniemi se mohla identifikovat jedna kolonie, označená jako FE5, která rostla na médiu Eagar + glukóza (0,4%) + 25 μς/ml kanamycinu + 50 μς/ml isoleucinu + 50 μς/ml ketoisovalerátu + 50 μς/ml pantotenátu, nikoliv však na médiu E-agar + glukóza (0,4%) + 25 μς/ml kanamycinu + 50 μς/ml isoleucinu + 50 μς/ml ketoisovalerátu.

3. Charakterizace kmenů FE4 a FE5

Spolu s kmeny E. coli SJ2 (Jakowski, Genetic Stock Center, Yale University), který nese mutaci v genu panB, MW6 (Williams, Genetic Stock Center, Yale University), který nese mutaci v genu panC, a DV9 (Vallari, Journal of Bacteriology 1985, 164:136-142), který nese mutaci v genu panD, jakož i s divokým typem se kmeny FE4 a FE5 nanesly na různě doplněná základní média (média E-agar + glukóza (0,4%) + 50 μς/ml isoleucinu + 50 μg/ml ketoisovalerátu; při SJ2, DV9 a MW6 přídavně 50 μς/ml thiaminu) a inkubovaly 48 hodin při 37 °C. Jako přídavné suplementy se použily pantotenát (vápenatá sůl), ketopantoát (sodná sůl), β-alanin (Sigma (Deisenhofen, Německo), Code no. A7752) a pantoát (draselná sůl). Ketopantoát se připravil z ketopantolaktonu reakcí s ekvimolárními množstvími NaOH při 60 °C a následným odpařením. Ketopantolakton se syntetizoval podle Ojima et al. (Organic Synthesis 63, 18 (1985)). Pantoát se připravil z pantoyllaktonu (Sigma (Deisenhofen, Německo), Code no. P2625) podle metody od Primerana a Burnsa (Journal of Bacteriology 1983, 153: 2599 9 9 9

9999 99 99

269). Výsledek testu růstu (tabulka 1) ukázal, že kmen FE4 rostl na všech různě doplněných základních médiích. Kmen FE5 rostl jenom na médiích, které byly doplněny buď pantotenátem, nebo pantoátem, nikoliv však na základních médiích, která byla smíchána s ketopantoátem.

Tabulka 1

Kmen	Suplementy základního média Žádný β-Alanin Ketopantoát Pantoát Pantotenát [50 μg/ml] [50 μg/ml] [50 μg/ml] [50 μg/ml]

MG1655	+ + + + +

SJ2	- - + + +

MW6	+

DV9	— + — — +

FE4	+ + + + +

FE5	— — — + +

+ = růst

- = žádný růst

Příklad 2

Izolace genu panE Escherichia coli K12 kmene W1485

99 999 ····

99

9 9 9

99

Do kmene FE5 se elektroporovala genomová knihovna (Genomic Library) E. coli K12 W1485 MATCHMAKER (CLONTECH (Heidelberg, Nemecko), Cat. no XL4001AB). Genomová knihovna (Genomic Library) E. coli K12 MATCHMAKER obsahuje chromozomální DNA E. coli K12 W1485 jako inzerty o průměrné velikosti 1,0 kbp v plazmidu pGADlO, velikost jednotlivých inzertů se přitom mění od 0,5 do 3,0 kbp (CLONTECH (Heidelberg, Německo) ). Selekce transformantů se provedla rozetřením na médium E-agar + glukóza (0,4%) + 100 pg/ml ampicilinu + 50 μg/ml isoleucinu + 50 μg/ml ketoisovalerátu. Z 20 získaných kolonií se pomocí kitu QIAprep Spin Plasmid izolovala plazmidová DNA. Štěpením plazmidové DNA pomocí EcoRI a následným dělením v 0,8% agarózovém gelu (30 minut, 10 V/cm) se ukázalo, že při plazmidech se jednalo o 20 vektorů pGADlO s rozdílně velkými inzerty. Sekvencování (IIT Biotech (Bíelefeld, Německo)) inzertů ukázalo srovnáním homologie pomocí programu BLAST (Altschul, Journal of Molecular Biology 1990,

215: 403-410), že inzerty obsahovaly v 7 případech úplný gen ilvC a v 13 případech otevřený čtecí rastr, který byl označen jako „podobný na Salmonella typhimurium apbA (EMBLGenBank: přírůstkové číslo U82664). Tento otevřený čtecí rastr se jako označil panE.

Příklad 3

Nadměrná exprese genu ilvC E. coli v kmenu E. coli K12 MG1655

Pro nadměrnou expresi genu ilvC se použil plazmid pFE32 (viz příklad 1). Kódující oblast genu ilvC je v plazmidu pFE32 pod kontrolou promotoru tet kódovaného plazmidem pBR322. Plazmid pFE32 se elektroporoval do kmene E. coli K12 MG1655 a transformanty se po následné inkubaci během 24 ·· · 4 « 4 ··♦♦ • · 4 4 4 4 ···· · 4 4 · • * * · · · 4 • · · 4 4 4 ··· 44 44 hodin při 37 °C selektovaly na agaru LB, který byl smíchán se 100 pg/ml ampicilinu. Získaný kmen se označil jako MG1655/pFE32.

Příklad 4

Nadměrná exprese genu pan E E. coli v kmenu MG1655 E. coli K12

Vycházeje z nukleotidové sekvence pro gen panE v E. coli K12 MG1655 se syntetizovaly primery PCR (MWG Biotech (Ebersberg, Nemecko)). Fragment DNA o velikosti přibližně 1000 bp se mohl amplifíkovat pomocí těchto primerů za standardní metody PCR z chromozomální DNA E. coli K12 MG1655. Chromozomální DNA E. coli K12 MG1655 použitá pro PCR se izolovala pomocí kitu NucleoSpin C + T. Velikost se stanovila dělením gelovou elektroforézou (30 minut, 10 V/cm) v 0,8% agarózovém gelu.

Primer PCR pro gen panE z E. coli·.

panEl 5'- AGGAGGACAATGAAAATTAC -3' panE2 5'-TCAGTCTCTTCACTACCAGG -3'

Produkt PCR genu panE se transformoval do plazmidu pCR®2.1 a do kmene E. coli TOP10F' (Invitrogen (Leek, Holandsko), popis produktu Originál TA Cloning® Kit, Cat. no. KNM2030-01). Úspěch klonování se dokázal štěpením DNA plazmidu pCR®2.1panE restrikčními enzymy EcoRI a HincII (Pharmacia Biotech (Freiburg, Nemecko), popis produktu HincII, Code no. 27-0858-01). K tomu se izolovala plazmidová DNA

9999

9 99 9 ♦

· · • · * 99

9 9 • 9 ·

999

99

9 9 9 • · · · • 9 9 9

9 9 9 '99 pomocí kitu QIAprep Spin Plasmid a po štěpení v 0,8% agarózovém gelu (30 minut, 10 V/cm) se dělila.

Pro izolaci genu panE z plazmidu pCR®2.1panE se izolovaná plazmidová DNA štěpila enzymem EcoRI, štěpná násada se dělila v 0,8% agarózovém gelu (30 minut, 10 V/cm) a fragment panE 1,0 kbp se izoloval pomocí kitu GLASSMAX™. Izolovaný fragment panE se ligoval s plazmidem pKK223-3, rovněž štěpeným EcoRI, pomocí T4-DNA-ligázy a kmen E. coli DH5amcr se elektroporoval s ligacní násadou. Selekce buněk nesoucích plazmid se prováděla rozetřením elektroporační násady na agar LB, který byl smíchán se 100 gg/ml ampicilinu a následnou inkubací 24 hodin při 37 °C. Hledaný plazmid se mohl po izolaci DNA a kontrolním štěpení, při následné gelové elektroforéze v 0,8% agarózovém gelu (30 minut, 10 V/cm), pomocí enzýmů EcoRI a HincII identifikovat v jednom klonu a označil se jako pFE65.

Kódující oblast genu panE je v plazmidu pFE65 pod kontrolou promotoru tac kódovaného plazmidem pKK223-3. Plazmid pFE65 se elektroporoval do kmene E. coli K12 MG1655 a transformanty se po následné inkubaci během 24 hodin při 37 °C selektovaly na agaru LB, který byl smíchán se 100 μg/ml ampicilinu. Získaný kmen se označil jako E. coli K12 MG1655/pFE65.

Příklad 5

Nadměrná exprese genu panE E. coli spolu s panB, panC a panD E. coli v kmenu MG1655 E. coli K12

Vycházeje z nukleotidové sekvence pro gen panB, gen panC a gen panD v E. coli K12 MG1655 (EMBL-GenBank: pří25 ·♦·· *· ···· • · · • · · · · • · · ♦ »··· ··

Μ ··· ·· ·· * 9 9 9 • · · · • · 9 9

9 9 9

9 99 růstkové číslo L17086) se syntetizovaly primery PCR (MWG Biotech (Ebersberg, Německo)). Pomocí primerů panB se mohl z chromozomální DNA E. coli K12 MG1655 amplifikovat fragment DNA o velikosti přibližně 800 bp, pomocí primerů panD fragment DNA o velikosti přibližně 400 bp za standardní metody PCR. Pomocí primerů panC se mohl z chromozomální DNA E. coli K12 MG1655 amplifikovat fragment DNA o velikosti přibližně 850 bp modifikovanou standardní metodou PCR. Taq-polymeráza se nahradila Pfu-polymerázou a podmínky tlumení v násadě PCR se příslušně modifikovaly (STRATAGENE (Heidelberg, Německo), popis produktu Pfu-polymeráza, Code no. 600135). Chromozomální DNA E. coli K12 MG1655, použitá pro PCR, se izolovala pomocí kitu NucleoSpin C + T. Velikost všech amplifikátů se stanovila dělením gelovou elektroforézou (30 minut, 10 V/cm) v 0,8% agarózovém gelu.

Primer PCR pro gen panB z E. coli:
panBl	5'- AGGATACGTTATGAAACCGA	-3'
panB2	5'-ACAACGTGACTCCTTAATGG	-3'
Primer PCR	pro gen panC z E. coli:
panCl	5'- AGGAGTCACGTTGTGTTAAT	-3'
panC2	5'-AAGTATTACGCCAGCTCGAC	-3'
Primer PCR	pro gen panD z E. coli:
panDl	5'- AGGTAGAAGTTATGATTCGC	-3'
panD2	5' -TAACAATCAAGCAACCTGTA	-3'

9999 • 9 9 9 9 9 * 9 9

9 9 99 •9 9

9 9

9· 9 99 ·· 99 ♦ *9 9

9 9 9

9 9 9 9

9 9 9

9 99

Produkt PCR genu panB se transformoval do plazmidu pCR®2.1 a do kmene TOPIOF' (Invitrogen (Leek, Holandsko). Úspěch klonování produktu PCR panB se dokázal štěpením DNA plazmidu pCR® 2.1panB restrikčními enzymy EcoRI, EcoRV (Pharmacia Biotech (Freiburg, Německo), popis produktu EcoRV, Code no. 27-0934-01) a PvuII (Pharmacia Biotech (Freiburg, Německo), popis produktu PvuII, Code no. 27-096001). K tomu se izolovala plazmidová DNA pomocí kitu QIAprep Spin Plasmid a po štěpení v 0,8% agarózovém gelu (30 minut, lOV/cm) se dělila. Produkt PCR genu panD se transformoval do plazmidu pCR®2.1 a do kmene TOPIOF' (Invitrogen (Leek, Holandsko) . Úspěch klonování produktu PCR panD se dokázal štěpením DNA plazmidu pCR® 2.lpanD restrikčními enzymy EcoRI, EcoRV a HincII. K tomu se izolovala plazmidová DNA pomocí kitu QIAprep Spin Plasmid a po štěpení v 0,8% agarózovém gelu (30 minut, lOV/cm) se dělila. Produkt PCR genu panC se elektroporoval do plazmidu pUCl9 (Viera, Gene 1982 19:259268) a do kmene E. coli DH5amcr. Úspěch klonování produktu PCR panC se dokázal štěpením DNA plazmidu pUC19panC restrikčními enzymy EcoRI, HindlII a Sáli (Pharmacia Biotech (Freiburg, Německo), popis produktu Sáli, Code no. 27-0882-01). K tomu se izolovala plazmidová DNA pomocí kitu QIAprep Spin Plasmid a po štěpení v 0,8% agarózovém gelu (30 minut, 10 V/cm) se dělila. Zkonstruovaný plazmid se nazval pFE60.

Pro izolaci genu panB z plazmidu pCR®2.1panB se izolovaná plazmidová DNA štěpila enzýmem EcoRI, štěpná násada se dělila v 0,8% agarózovém gelu (30 minút, lOV/cm) a fragment panB 800 bp se izoloval pomocí kitu GLASSMAX™. Izolovaný fragment panB se pomocí T4-DNA-ligázy ligoval s plazmidem pKK223-3, rovněž štěpeným EcoRI, a kmen E. coli DH5amcr se elektroporoval s lígační násadou. Selekce buněk nesoucích plazmid se prováděla rozetřením elektroporační násady na ····

4* 44··

4·4· ··

4 ·

4 · · ·

4 4

4 · ··· ·· ·· · · ·

4 4 4

4 · 4 4

4 · · ·· agar LB, který byl smíchán se 100 Bg/ml ampicilinu, a následnou inkubací 24 hodin při 37 °C. Hledaný plazmid se mohl po izolaci DNA a kontrolním štěpení, při následné gelové elektroforéze v 0,8% agarózovém gelu (30 minut, 10 V/cm), restrikčními enzymy EcoRI, EcoRV a PvuII identifikovat v jednom klonu a označil se jako pFE40. Kódující oblast genu panB je v plazmidu pFE40 pod kontrolou tac-promotoru kódovaného plazmidem pKK223-3.

Pro izolaci genu panD z plazmidu pCR®2.1panD se izolovaná plazmidová DNA štěpila enzymem EcoRI, štěpná násada se dělila v 0,8% agarózovém gelu (30 minut, lOV/cm) a fragment panD 400 bp se izoloval pomocí kitu GLASSMAX™. Izolovaný fragment panD se pomocí T4-DNA-ligázy ligoval s plazmidem pKK223-3, rovněž štěpeným EcoRI, a kmen E. coli DHóamcr se elektroporoval s ligační násadou. Selekce buněk nesoucích plazmid se prováděla rozetřením elektroporační násady na agar LB, který byl smíchán se 100 pg/ml ampicilinu a ná* slednou inkubací 24 hodin při 37 °C. Hledaný plazmid se mohl po izolaci DNA a kontrolním štěpení, při následné gelové elektroforéze v 0,8% agarózovém gelu (30 minut, 10 V/cm) identifikovat v jednom klonu restrikčními enzymy EcoRI, EcoRV a HincII a označil se jako pFE50. Kódující oblast genu panD je v plazmidu pFE50 pod kontrolou tac-promotoru kódovaného plazmidem pKK223-3.

Gen panC se štěpením pomocí HindlII-Smal (Pharmacia Biotech (Freiburg, Německo), popis produktu Smál, Code no. 27-0942-01) izoloval z plazmidu pFE60, k tomu sa štěpná násada dělila v 0,8% agarózovém gelu (30 minut, 10 V/cm) a fragment panB 850 bp se izoloval pomocí kitu GLASSMAX™. Izolovaný fragment panC se pomocí T4-DNA-ligázy ligoval s plazmidem pFE50, rovněž štěpeným HindlII a Smál, a kmen E.

*9 9999 •9 9999

*9 99 • 9 9 9 • 9 9 9

9 ·· coli DH5amcr se elektroporoval s ligační násadou. Selekce buněk nesoucích plazmid se prováděla rozetřením elektroporační násady na agar LB, který byl smíchán se 100 gg/ml ampicilinu a následnou inkubací 24 hodin při 37 °C. Hledaný plazmid se mohl po izolaci DNA a kontrolním štěpení, při následné gelové elektroforéze v 0,8% agarózovém gelu (30 minut, 10 V/cm) identifikovat v jednom klonu restrikčními enzymy EcoRI, EcoRV, Smál, HindlII a HincII a označil se jako pFE52. Kódující oblasti genu panD a genu panC jsou v plazmidu pFE52 pod kontrolou tac-promotoru kódovaného plazmídem pKK223-3 a tvoří jeden operon.

Do místa střihu EcoRI následujícím po tac-promotoru plazmidu pFE52 se klonoval gen panB a získaný plazmid se označil pFE70. Gen panB se k tomu izoloval z agarózového gelu (30 minut, 10 V/cm), ve kterém se dělila EcoRIrestrikční násada plazmidu pFE40. Ligace se prováděla pomocí T4-DNA-ligázy. Po eletroporaci ligační násady do kmene SJ2 se transformanty selektovaly na agarovém médiu E, které bylo smícháno s 0,4% glukózy, 100 gg/ml thiaminu a 100 μg/ml ampicilinu. DNA z kolonií rezistentních vůči ampicilinu se izolovala pomocí kitu QIAprep Spin Plasmid a úspěch klonování se ověřoval štěpením pomocí EcoRI, EcoRV, Smál, HindlII a HincII a následným dělením v 0,8% agarózovém gelu (30 minut, 10 V/cm). Kódující oblasti genu panB, genu panD a genu panC jsou v plazmidu pFE70 pod kontrolou tac-promotoru kódovaného plazmídem pKK223-3 a tvoří jeden operon.

Gen panE se štěpením pomocí HindlII-Sphl (Pharmacia Biotech (Freiburg, Německo), popis produktu Sphl, Code no. 27-0951-01) izoloval z plazmidu pFE65, k tomu se štěpná násada dělila v 0,8% agarózovém gélu (30 minut, 10 V/cm) a fragment panE se izoloval pomocí kitu GLASSMAX™. Izolovaný

• 9 ♦· • 9 · 9 • 9 · 9

9 9 9 • 9 9 >

»·9 99 fragment panE se pomocí T4-DNA-ligázy ligoval s plazmidem pFE70, rovněž štěpeným HindlII a částečně Sphl, a kmen FE5 se elektroporoval s ligační násadou. Selekce buněk nesoucích plazmid se prováděla rozetřením elektroporační násady na médiumE-agar + glukóza (0,4%) + 50 μς/ιηΐ isoleucinu + 50 gg/ml ketoisovalerátu, který byl smíchán se 100 μς/ιηΐ ampicilinu a následnou inkubací 48 hodin při 37 °C. Hledaný plazmid se mohl po izolaci DNA a kontrolním štěpení, pří následné gelové elektroforéze v 0,8% agarózovém gelu (30 minut, 10 V/cm), identifikovat v jednom klonu restrikčními enzymy EcoRI, EcoRV, Sphl, HindlII a HincII a označil se jako pFE80. Kódující oblasti genu panB, genu panD, genu panC a genu pan E jsou v plazmidu pFE80 pod kontrolou tac-promotoru kódovaného plazmidem pKK223-3 a tvoří jeden operon.

Plazmid pFE80 se elektroporoval do kmene E. coli K12 MG1655 a transformanty sa selektovaly na agaru LB, který byl smíchán se 100 μς/ιηΐ ampicilinu, a následnou inkubací 24 hodin při 37 °C. Získaný kmen se označil jako MG1655/pFE80.

Příklad 6

Nadměrná exprese genu panE E. coli spolu s panB, panC a panD E. coli v mutantu E. coli K12 MG1655, rezistentním vůči valinu

Kmen E. coli K12 MG1655 se nanesl na médiumE-agar, který byl smíchán s 0,4 % glukózy a 100 μg/ml valinu (Sigma, Deisenhofen, Německo), V0258). Po 48 hodinách inkubace při 37 °C se mohla izolovat jedna kolonie. Tento kmen se označil jako FE6. Plazmid pFE80 se elektroporoval do kmene FE6 a transformanty se selektovaly na agaru LB, který byl ·* ··*· ···· «·

9999 · 9 • 9 999

9 9 9

9 9

999

99 k 9 9 9 » 9 9 9 » 9 9 9 » · · · ·· ·· smíchán se 100 μς/ml ampicilinu, a následnou inkubací 24 hodin při 37 °C. Získaný kmen se označil jako FE6/pFE80.

Příklad 7

Nadměrná exprese genu panE E. coli spolu s panB, panC a panD E. coli v mutantu avtA::aadB E. coli K12 MG1655

Vycházeje z nukleotidové sekvence pro gen avtA (EMBLGenBank: přírůstkové číslo Y00490) v E. coli K12 MG1655 se syntetizovaly primery PCR (MWG Biotech (Ebersberg, Německo) ). Pomocí těchto primerů se mohl standardní metodou PCR z chromozomální DNA E. coli K12 MG1655 amplifikovat fragment DNA o velikosti přibližně 1,6 kbp. Velikost se stanovila dělením gelovou elektroforézou (30 minut, 10 V/cm) v 0,8% agarózovém gelu.

Primer PCR pro gen avtA E. coli:

avtAl 5'- TGCTCTCTCTCAACGCCGAA -3' avtA2 5'-GAAGCCGCCAACCAGGATAA -3'

Produkt PCR genu avtA se transformoval do plazmidu pCR®2.1 a do kmene TOP10F' (Invitrogen (Leek, Holandsko). Úspěch klonování se dokázal štěpením DNA plazmidu pCR®2.1avtA restrikčními enzymy EcoRI a Smál. K tomu se izolovala plazmidová DNA pomocí kitu QIAprep Spin Plasmid a po štěpení v 0,8% agarózovém gelu (30 minut, 10 V/cm) se dělila. Do místa střihu Smál plazmidu pCR®2.1avtA se klonoval gen aadB a získaný plazmid se nazval pFE23. Gen aadB se k tomu izoloval z agarózového gelu (30 minut, 10 V/cm), ve kterém se dělila restrikční násada Smál plazmidu ρΗΡ45Ω * · '· · • · · · · · · · · ···· ·♦ ·· ··· 0· (EMBL-GenBank: přírůstkové č. K02163). Ligace se prováděla pomocí T4-DNA-ligázy. Po elektroporaci ligační násady do kmene DH5amcr se transformanty selektovaly na agaru PA, který byl smíchán s 20 μς/πιΐ streptomycinu (Sigma, Deisenhofen, Německo), Code no. S6501). DNA z kolonií rezistentních vůči streptomycinu se izolovala pomocí kitu QIAprep Spin Plasmid a úspěch klonování se ověřil štěpením pomocí EcoRI a Sphl a následným dělením v 0,8% agarózovém gélu (30 minut,

V/cm).

Fragment avtA::aadB se vyštěpil z plazmidu pFE23 restrikcí EcoRI, dělil 0,8% agarózovém gelu (30 minut, 10 V/cm) a izoloval pomocí kitu GLASSMAX™. Fragment se ligoval s plazmidem pMAK705, částečně štěpeným EcoRI, pomocí T4-DNAligázy, ligační násada se elektroporovala do kmene DH5amcr a transformanty se selektovaly pomocí inkubace na agaru LB + μg/ml streptomycinu + 25 μg/ml chloramfenikolu 24 hodin při 30 °C. DNA z kolonií rezistentních vůči streptomycinu a chloramfenikolu se izolovala pomocí kitu QIAprep Spin Plasmid a úspěch klonován se dokázal štěpením pomocí Sphl a EcoRI v 0,8% agarózovém gelu (30 minut, 10 V/cm). Zkonstruovaný plazmid se nazval pFE24.

Pomocí plazmidu pFE24 se v kmenu E. coli K12 MG1655 vyměnil chromozomální gen avtA za alelu avtA::aadB. Pro genovou výměnu se použila modifikovaná metoda podle Hamiltona et al. Plazmid pFE24 se elektroporoval do kmene E. coli K12 MG1655 a potom se transformanty kvůli selekci kointegrátů inkubovaly 24 hodin při 42 °C na agaru LB-chloramfenikol. Získané kolonie se pro rozjednocování znovu inkubovaly nanesené' na stejném médiu 24 hodin při 42 °C. Pro dezintegraci plazmidu se jednotlivé kolonie inkubovaly v 5 ml kapalného média LB 24 hodin při 42 °C a potom se rozetřela zřeďovací • · · · · · ·· řada kapalného média na agar LB-chloramfenikol. Tato zřeďovací řada se inkubovala 24 hodin při 30 °C. Pro ošetření plazmidu se jednotlivé kolonie získané ze zřeďovací řady nanesly v 3 za sebou následujících nátěrech jednotlivých kolonií na agar LB vždy na 24 hodin při 42 °C. Pro kontrolu fenotypu se získané jednotlivé kolonie paralelně naočkovaly na agarové plotny s následujícími médii: médium LB + 20 gg/ml streptomycinu a médium LB + 25 gg chloramfenikolu.

Tato média se inkubovala 48 hodin při 37 °C. Mezi 250 testovanými jednotlivými koloniemi se nacházela jedna, jejíž fenotyp indikoval výměnu chromozomálního genu avtA za fragment avtA::aadB. Tento kmen se označil jako FE7.

Plazmid pFE80 se elektroporoval do kmene FE7 a transformanty se selektovaly na agaru LB, který byl smíchán se 100 μg/ml ampicilinu, následnou inkubací 24 hodin při 37 °C. Získaný kmen se označil jako FE7/pFE80.

Příklad 8

Stanovení aktivity ketopantoátreduktázy v různých kmenech Escherichia coli K12

Specifická aktivita ketopantoátreduktázy se stanovila podle metody popsané v Shimizu et al. (Journal of Biological Chemistry 263: 12077-12084 (1988)). K tomu se pomocí Hybaid RiboLyser (Heidelberg, Německo) a RiboLyser Kit Blue získaly buňkové extrakty jednotlivých kmenů. Aktivita ketopantoátreduktázy extraktů se stanovila na základě spotřeby NADPH při přídavku ketopantoátu. Pre kmen E. coli K12 MG1655 se stanovila specifická aktivita ketopantoátreduktázy 6,5 mU/mg, pro kmen E. coli K12 MG1655/pFE65 22,0 mU/mg. V případě kmene FE5 se nedala změřit žádná aktivita.

···· ·· ···· ·· ··

Příklad 9

Tvorba pantotenátu pomocí různých kmenů Escherichia coli K12

Tvorba pantotenátu kmeny MG1655, MG1655/pFE32, MG1655/pFE65, MG1655/pFE80, FE6/pFE80 a FE7/pFE80 se zkoumala v dávkové (batoh) kultuře. Jako kultivační médium se použilo médiumE, popsané Vogelem (Journal of Biological Chemistry 1956, 218: 97-106), s glukózou (0,4%) jako zdrojem uhlíku. Složení použitého média je uvedeno v tabulce 2.

Tabulka 2

Sloučenina	Koncentrace
MnSO₄.7H₂O	0,2 g/1
Monohydrát citrónové kyseliny	2,0 g/1
K₂HPO₄	10,0 g
NaNH₄HPO₄.H₂O	3,5 g/1

250ml Erlenmeyerovy baňky se naplnily 20 ml uvedeného živného média a násada se naočkovala. Po inkubaci 48 hodin pří 37 °C se stanovila optická hustota a koncentrace pantotenátu. Pro stanovení hustoty buněk se použila optická hustota s fotometrem Novaspec II Photometer od firmy Pharmacia (Freiburg, Německo) při měřicí vlnové délce 580 nm. Obsah pantotenátu se stanovil ve sterilně filtrovaném supernatantu kultury. Stanovení pantotenátu (jako vápenaté soli) se provedlo pomocí kmene Lactobacillus plantarum ATCC® 8014 podle údajů příručky „DIFCO MANUAL firmy DIFCO (Michigan, USA;, 10^th Edition, 1100-1102 (1984)). Výsledek je zhrnut v tabulce 3.

• · · « ► * · 4 » · · 4 • · · 4

Tabulka 3

Kmen	Koncentrace [pg/ml]	Hustota buněk [0D580]	Produktivita [gg/ml/oD₅₈₀]
MG1655	0,51	2,8	0,18
MGl655/pFE32	1,7	2,8	0, 60
MG1655/pFE65	4,6	2,9	1,6
MG1655/pFE80	14,0	2,9	4,8
FE6/pFE80	35,7	3,2	11,2
FE7/pFE80	41,7	3,0	13,9

Příklad 10

Tvorba pantotenátu různými kmeny Escherichia coli K12 v přítomnosti ketopantoátu

Tvorba pantotenátu kmeny MG1655, MG1655/pFE32, MG1655/pFE65 při přidaném ketopantoátu se zkoumala v dávkové (batoh) kultuře. K tomu se médium popsané v příkladu 8 doplnilo 50 gg/ml ketopantoátu. Ostatní podmínky pokusu jsou takové, jak se uvádějí v příkladu 8. Výsledek je zhrnut v tabulce 4.

Tabulka 4

Kmen	Koncentrace [gg/ml]	Hustota buněk [0D580]	Produktivita [pg/ml/oD₅₈₀]
MG1655	6,2	2,9	2,1
MG1655/pFE32	9,0	2,9	3,1
MG1655/pFE65	12, 6	2,9	4,3

►999 9 9 9 9 ► · * · ‘ · * 9 99 • · 9 9 9

Příklad 11

Izolace genu ilvC Corynebacterium glutamicum ATCC13032

Chromozomální DNA z C. glutamicum ATCC13032 se izolovala tak, jak se popisuje v Tauch et al. (Plasmid, 33:168179) a parciálně štěpila restrikčními enzymy Sau3A (Pharmacia Biotech (Freiburg, Německo), popis produktu Sau3A,

Code no. 27-0913-02). Fragmenty DNA v rozsahu velikostí 7 až 9 kb se izolovaly pomocí „Nucleotrap Extraction Kit for Nucleic Acids (Macherey a Nagel, Duřen, Německo; Cat. No. 740584) a ligovaly do defosforylovaného místa střihu BamHI vektoru pUC19 (Viera et al., 1982, Gene, 19:259-268; MBI Fermentas, Litva). Ligace se provedla tak, jak se popisuje v Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor), přičemž směs DNA s T4-ligázou (Pharmacia Biotech (Freiburg, Německo) se inkubovala přes noc. Tato ligační směs se následně elektroporovala do kmene E. coli DH5aMCR (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A., 87:4645-4649) (Tauch, 1994, FEMS Microbiological Letters, 123:343-348) a rozetřela na agar LB (Lennox, 1955, Virology, 1:190) + 100 mg/ml ampicilinu. Po inkubaci během 24 hodin při 37 °C se mohla získat z transformantů genová banka C. glutamicum reizolací plazmidové DNA podle „metody alkalické lýzy od Birnboima a Dolyho (1997, Nucleic Acids Research, 7: 1513-1523). Pomocí této genové banky se elektroporovaly kompetentní buňky kmene FÉ5 E. coli, který nese mutace v genu panE a ilvC. Elektroporační násada se v návaznosti na regenerační fázi (Tauch et al., 1994, FEMS Microbiological Letters, 123:343-348) dvakrát promyla médiem E (Vogel and Bonner, 1956, Journal of Biological Chemistry, 218:97-106). Selekce transformantů se provedla rozotřetím na médium E-agar + glukóza (0,4 %) + 100 ·· ···· • · · · · · μς/πιΐ ampicilinu + 50 μg/ml isoleucinu + 50 μς/ιηΐ ketoisovalerátu. Ze 4 získaných kolonií se pomocí kitu QIAprep Spin Plasmid izolovala plazmidová DNA. Štěpením Xbal plazmidové DNA a následným dělením v 0,8% agarózovém gelu (30 minut, 10 V/cm) se ukázalo, že při plazmidech se jednalo o vektory pUC19 s přibližně 6,5 kbp velkými inzerty. Sekvencování inzertů s následným srovnáním homologie pomocí programu BLAST (Altschul, Journal of Molecular Biology 1990, 215: 403-410) ukázalo, že inzerty ve všech případech obsahovaly úplný gen ilvC z C. glutamicum (EMBL-GenBank: přírůstkové č. L09232). Jeden z těchto plazmidů se označil jako pFE90.

Příklad 12

Exprese genu ilvC Corynebacterium glutamicum ATCC13032 v Corynebacterium glutamicum ATCC13032

Pro expresi genu ilvC z C. glutamicum v C. glutamicum ATCC13032 se použil plazmid pECm3. Plazmid pECm3 je derivátem plazmidu pECm2 (Tauch, 1994, FEMS Microbiological Letters, 123:343-348), kterého gen rezistence vůči kanamycinu se odstranil pomocí restrikce BglII (Pharmacia Biotech (Freiburg, Německo), popis produktu BglII, Code no. 27-094602) a BamHI s následnou religací. Plazmidy pECm2 a pECm3 jsou schopny replikace v E. coli a také v C. glutamicum. Pro izolaci genu ilvC z plazmidu pFE90 (příklad 11) se izolovaná plazmidová DNA štěpila enzymem Xbal (Pharmacia Biotech (Freiburg, Německo), popis produktu Xbal, Code no. 27-094801), štěpná násada se dělila v 0,8% agarózovém gélu (30 minut, 10 V/cm) a izoloval se 6,5 kbp fragment ilvC pomocí kitu GLASSMAX™. Izolovaný fragment ilvC se ligoval pomocí T4-DNA-ligázy s plazmidem pECm3, rovněž štěpeným Xbal, a kmen FE5 E. coli se elektroporoval s ligační násadou.

·· ·»·· «· ···· ·· ·· • · · ··· o ♦ « .

• · · *♦·· · · · · • »·· * ··« ·· » ·«,·.,.· ·,.··..·

Selekce buněk nesoucích plazmid se provedla rozotřením elektroporační násady na agar LB, který byl smíchán s 50 μg/ml chloramfenikolu, a následnou inkubací 24 hodin při 37 °C. Hledaný plazmid se mohl po izolaci DNA a kontrolním štěpení, při následné gelové elektroforéze v 0,8% agarózovém gelu (30 minut, 10 V/cm), identifikovat v jednom klonu enzymem Xbal a označil se jako pFE91.

Plazmid pFE91 se elektroporoval do kmene C. glutamicum ATCC13032 a transformanty se selektovaly na agaru LB, který byl smíchán se 7,5 μg/ml chloramfenikolu, a následnou inkubací 48 hodin při 30 °C. Získaný kmen se označil jako C. glutamicum ATCC13032/pFE91.

Příklad 13

Tvorba pantotenátu pomocí Corynebacterium glutamicum. ATCC13032

Tvorba pantotenátu pomocí kmene C. glutamicum ATCC13032/pFE91 se zkoumala v médiu CGXII (Keilhauer et al., 1993, Journal of Bacteriology, 175:5595-5603) s 10 mg/ml chloramfenikolu, v dalším textu označovaném jako testovací médium C. glutamicum. Toto médium je uvedeno v tabulce 5. Po 50 ml čerstvě nasazeného testovacího média C. glutamicum se naočkovalo 16-hodinovou kulturou (testovací médium C. glutamicum, 30 °C, 150 Upm) s hustotou buněk o.D.sqo 0,1. Po 48hodinové inkubaci při 30 °C a 150 U/min se buňky odstranily 10-minutovou centrifugací při 5000 x g, supernatant se sterilně filtroval a stanovila se koncentrace pantotenátu. Hustota buněk se stanovila tak, jak se popisuje v příkladu 9.

• · 9 9 * 9

1999 99

9999

9 9

9 9 99 ♦ 99 ·

9 9 9

9 9 9 • 9 9 9

9 9 9

Stanovení pantotenátu (jako vápenaté soli) se provedlo pomocí kmene Lactobacillus plantarum ATCC® 8014 podle údajů příručky „DIFCO MANUAL firmy DIFCO (Michigan, USA;, 10^thEdition, 1100-1102 (1984)). Výsledek je uveden v tabulce 6.

Tabulka 5

Látka	Koncentrace na litr	Poznámka
(NH₄)₂SO₄	20 g
Močovina	5 g
KH₂PO₄	1 g
k₂hpo₄	1 g
MgSO₄.7H₂O	0,25 g
MOPS	42 g
CaCl₂	10 mg
FeSO₄.7H₂O	10 mg
MnSO₄.H₂O	10 mg
ZnSO₄.7H₂O	1 mg
CuSO₄	0,2 mg
NiCl₂.6H₂O	0,02 mg
Biotin	0,5 mg
Glukóza	40 g	Odděleně auto- klávovaná
Protokatechová	0,03 mg	Sterilně
kyselina		filtrovaná

• · * · · · * » · ·· · ·· 99

9 9 9 9 9 «

9 999 9 99 9

9 9 9 9 9 9 9 9

9 » - » « 9 9

9 99 99 9 9

Tabulka 6

Kmen	Koncentrace [pg/ml]	Hustota buněk [0D580]	Produktivita [μρ/πι1/οϋ58θ]
ATCC13032	0,2	20	0,010
ATCC13032/pFE91	0,3	20	0,015

Příklad 14

Exprese genu panE Saccharomyces cerevisiae

1. Amplifikace čtecího rastru YHR063c:

Vycházeje z nukleotidové sekvence čtecího rastru YHR063c Saccharomyces cerevisiae (přírůstkové číslo U00061 National Center for Biotechnology, Bethesda, MD, USA) se syntetizovaly následující PCR-primery (MWGBiotech, Ebersberg, Německo). Začátek, popřípadě konec čtecího rastru je označen tečkou (.):

• OJD539 (5' EcoRI-Notl START):

5'- GCG CGA ATT CAG ATC CGC GGC CGC AAA GAG GAG AAA TTA ACT.ATG ACT GCA CCA CAC AGA AG -3' • OJD540 (3' Spel-Pstl STOP):

5'- CGC GAC TAG TCT GCA G.TC AGT CCT TTC TCC AGT CAC-3'

Jako templát sloužila genomová DNA kmene JD242 S. cerevisiae, která se izolovala podle metody od C. Guthrieho a G. R. Finka (Guide to yeast genetics and molecular biology, Methods in Enzymology, sv. 194, Academie Press, San Diego, ·· ···· • · 4·· · • 4 • 4 4 » * · ·♦·♦ 999 φ

4 » 9 4 4 4 • · 4 4 * «

4 ··« 9,9 φ»

CA, 1991). Tento kmen je haploidním segregantem diploidního kmene SC288C (Winston et al., Yeast 11, 53 a dále, (1995)), jehož genom se sekvencoval (Goffeau et al., Science 274, str. 546, (1996)). Tetradenová analýza se provedla podle metody C. Guthrieho a G. R. Finka (Guide to yeast genetics and molecular biology, Methods in Enzymology, sv. 194, Academie Press, San Diego, CA, 1991). Kmen JD242 je auxotrofní pro leucin (alela leu2Ál) a uráčil (alela ura3-52). Fragment DNA o velikosti přibližně 1,2 kB se mohl amplifikovat použitím kitu „High Fidelity Expand Polymerase od firmy Roche (Mannheim) 28 cykly PCR za podmínek uvedených výrobcem. Velikost se stanovila elektroforetickým dělením v 0,8% agarózovém gelu.

2. Konstrukce pJD-YHR063c:

Pro expresi čtecího rastru YHR063c v S. cerevisiae se vložil PCR-amplifikát do kyvadlového vektoru pJDCEX2 E. coli - S. cerevisiae (obrázek 8 a Dohmen at al., 1995, Journal of Biological Chemistry 270, 18099-18109) .

Produkt PCR se restringoval pomocí EcoRI a Spěl (AGS, Heidelberg, Německo). Následně se smíchal s pJDCEX2-DNA, která byla zpracována EcoRI a Xbal (AGS, Heidelberg, Německo) , a ligoval s T4-DNA-ligázou (Roche, Mannheim, Německo). Ligační násada se transformovala do kmene XLl-Blue E. coli (Bullock et al., 1987, Biotechniques 5, 376). Transformant se získal selekcí na agaru LB, který obsahoval 150 gg/ml ampicilinu (Sigma, Diesenhofen, Německo). Plazmidová DNA z klonů rezistentních vůči ampicilinu se preparovala alkalickou lýzou (Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Izolovaná plazmidová DNA se zkoumala restrikcí pomocí Notl a Pstl a následným dělením v 0,8% agarózovém • 9 ♦ »·· ►9 ·

9* 99

9 99 9 9 gelu. Plazmid se žádanou strukturou dostal název pJD-YHR063c (obrázek 9). Sekvence produktu PCR klonovaném v pJD-HYR063c se ověřovala sekvencov^áním s oligonukleotidy oJD105 a 0JDIO6.

OJD105 (T-CYC1):

5' -GAAGTCATCGAAATAG-3 '

0JDIO6 (P-CUP1):

5-TCGTTTCTGTCTTTTTC-3'

3. Konstrukce pKK-YHR063c:

Pro expresi čtecího rastru YHR063c v E. coli se použil plazmid pKK223-3 (Brosius and Holý, Proceedings of the National Academy of Science USA 81, 6929 (1984)). K tomu se plazmid pJD-YHR063c nejdříve restringoval s EcoRI a Pstl (AGS, Heidelberg, Německo). Fragment YHR063c o velikosti přibližně 1,2 kB se po elektroforetickom dělení v 0,8% agarózovém gelu z tohoto vystřihl a DNA se izolovala kitem QiaexII Gel Extraktion (Qiagen, Hilden, Německo). Následně se ligovala do plazmidu pKK223-3, který byl otevřen pomocí EcoRI a Pstl, T4-DNA-ligázou (Roche, Mannheim, Německo) . Ligační násada se transformovala do kmene XLl-Blue E. coli (Stratagene, LaJolla, CA, USA. Transformant se získal selekcí na médiu LB, které obsahovalo 150 μg/ml ampicilinu (Sigma, Deisenhofen, Německo). Plazmidová DNA z klonů rezistentních vůči ampicilinu se preparovala alkalickou lýzou (Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Úspěch klonování sa zkoumal restrikcí pomocí EcoRI a Pstl a následným dělením v 0,8% agarózovém gelu. Plazmid se žádánou strukturou dostal název pKK-YHR063c.

• 9 ·*··

9· ····

---- ·· ·· ► 9 * · t · · » 9 9 9 9 9 « « · ¹ * · ♦ 9 9 9 » ► · · 9 9 9 9 « ·♦ ·*9 99 ··

Příklad 15

Komplementace mutantu FE5 E. coli

Pro analýzu funkce panE čtecího rastru z S. cerevisiae se zkoumalo, zda exprese tohoto čtecího rastru může komplementovat potřebu pantotenové kyseliny kmene FE5 E. coli (příklad 1). Tento kmen jev mutován do genloci panE a ilvC. K tomu se nejdříve kmen FE5 transformoval plazmidem pKK-YHR063c.

Následně se zkoumal růst kmene FE5/pKK-YHR063c na minimálním agaru M9 (Sambrook et al.: Molecular Cloning a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,

1989), který byl doplněn 50 μς/ml ketoisovalerátu (Kiv) a 50 μς/ml isoleucinu (Ile) , v závislosti na přídavku pantotenátu (50 pg/ml). Jako negativní kontrola sloužil kmen FE5/pKK223-3 a jako pozitivní kontrola kmen FE4/pFE65 (příklad 4). Tabulka 7 ukazuje výsledek pokusu: Čtecí rastr YHR063c S. cerevisiae nacházející se v plazmidu pKK-YHR063c komplementuje dvojnásobnou mutaci panE-ilvC kmene FE5 E. coli. Čtecí rastr YHR063c má funkci genu panE.

Tabulka 7

Kmen	M9 + Kiv + Ile s pantotenátem	M9 + Kiv + Ile bez pantotenátu
FE5/pFE65	růst	růst
FE5/pKK223-3	růst	žádný růst
FE5/pK-YHR063c	růst	růst

* 9 • 99 9

999·

9 9 9 9 9 • 9 9 * 9 999

9 9 9

9 9

999

9 9 9

9 9 9 9

9 9 9 * 9 9 9

Příklad 16

Stanovení aktivity ketopantoátreduktázy v různých kmenech Saccharomyces cerevisiae

Kmen JD242 S. cerevisiae (viz příklad 14) se transformoval plazmidy pJDCEX2 a pJD-YHR063c podle metody Dohmen et al. (Dohmen et al., Yeast 7, 691(1991)). Selekce transformantů se provedla na minimálním médiu bez leucinu s 1,8% agarem (viz tab. 8a,b).

Jako živné médium se použil variant minimálního média Yeast Nitrogen Base (YNB), popsaného v Difco-Manual (Michigan, USA;, 10^th Edition, 1100-1102 (1984)), neobsahující pantotenovou kyselinu. Médium obsahovalo přídavně glukózu (2%), uráčil (40 gg/ml) , CuSO₄ (150 μΜ) pro indukci Pcvpi~ promotoru suplementu pJDCEX2 a pJD-YHR-063c,-Leu Drop-Out od firmy CLONTECH (Heidelberg, Německo, Cat. No. 8605-1) (650 gg/ml) a suplementy ketopantoát (100 μg/ml) a β-alanin (100 μg/ml). Složení použitého média je uvedeno v tabulce 8a a b.

•4 4444

4 4 > 4 4

4 4

4444 44

4

444 4 4

4

4· 444 • 4 44 • 4 4 4

4« 4

4 4 4

44

Tabulka 8a:

Sloučenina	Množství na litr
(NH₄)₂SO₄	5 g
kh₂po₄	¹ g
MgSO₄.7H₂O	0,5 g
NaCl	0,1 g
CaCl₂	0,1 g
H3BO3	500 pg
CuSO₄	40 gg
KI	100 gg
FeCl₃.6H₂O	200 pg
MnSO₄.H₂O	4 00 μg
Na₂MoO₄.2H₂O	400 μg
ZnSO₄.7H₂O	200 μg
Biotin	2 μg
Folová kyselina	2 μg
Inositol	2 mg
Niacin	400 μg
p-Aminobenzoová kyselina	200 μg
Pyridoxinhydrochlorid	400 μg
Riboflavin	200 μς
Thiaminhydrochlorid	400 μg

·· 9999

9

9 9

999 9

9999

99

Tabulka 8b:

Přísada	Množství na litr
Glukóza	20 g
Uráčil	40 mg
CuSO₄	24 mg
-Leu DO suplement	650 mg
Ketopantoát	100 mg
β-Alanin	100 mg

250ml Erlenmeyerovy baňky se naplnily 50 ml uvedeného živného média, násada se naočkovala pomocí očka s jednotlivou koloniou agarové plotny (viz tab. 8a, b) a inkubovala 72 hodin při 30 °C a 175 U/min. Touto předkulturou se naočkovalo 50 ml stejného živného média v 250ml Erlenmeyerově baňce tak, aby mela optickou hustotu (580 nm) 0,5. Po 24 hodinách kultivace při 30 °C a 175 U/min se měřila optická hustota fotometrem Novaspec II od firmy Pharmacia (Freiburg, Německo) při měřicí vlnové délce 580 nm. Pro obě kultury měla hodnotu 4,0. Specifická aktivita ketopantoátreduktázy kmenů S. cerevisiae JD242/pJDCEX2 a pJD242/pJD-YHR063c se stanovila podle metody popsané v Shimizu et al. (Journal of Biological Chemistry 263: 12077-12084 (1988)).

K tomu se pomocí Hybaid RiboLyser (Heidelberg, Německo) a RiboLyser Kit Red získaly buňkové extrakty jednotlivých kmenů. Aktivita ketopantoátreduktázy extraktů se stanovila na základě spotřeby NADPH při přídavku ketopantoátu. Obsah proteinů se zjistil podle Bradfortovy metody (Bradford, Analytical Biochemistry 72, 248 a dále, (1976)). Pro kontrolní kmen JD242/pJDCEX2 se stanovila specifická aktivita ketopantoátreduktázy 3 mU/mg proteinu a pro kmen JD242/pJDYHR063c specifická aktivita 386 mU/mg proteinu.

•9 9999

Příklad 17

Tvorba pantotenátu různými kmeny Saccharomyces cerevisiae

Tvorba pantotenátu kmeny S. cerevisiae JD242/pJDCEX2 a JD242/pJD-YHR063c se zkoumala v dávkové (batoh) kultuře.

250ml Erlenmeyerovy baňky se naplnily 50 ml živného média uvedeného v tab. 8a, b, násada se naočkovala pomocí očka s jednotlivou koloniou z agarové plotny (viz tab. 8a,b) a inkubovala 72 hodin při 30 °C a 175 U/min. Touto předkulturou se naočkovalo 50 ml stejného živného média v 250ml Erlenmeyerově baňce tak, aby měla optickou hustotu (580 nm) 0,5. Po 24 hodinách kultivace při 30 °C a 175 U/min se stanovila optická hustota a koncentrace pantotenátu. Pro stanovení hustoty buněk se měřila optická hustota fotometrem Novaspec II od firmy Pharmacia (Freiburg, Německo) při měřicí vlnové délce 580 nm. Obsah pantotenátu se stanovil ve sterilně filtrovaném supernatantu kultury.

Stanovení pantotenátu (jako vápenaté soli) se provádělo pomocí kmene Lactobacillus plantarum ATCC® 8014 podle údajů příručky „DIFCO MANUAL firmy DIFCO (Michigan, USA;, 10^thEdition, 1100-1102 (1984)). Výsledek je zhrnut v tabulce 9.

Tabulka 9

Kmen S. cerevisiae	Koncentrace [pg/ml]	Hustota buněk [0D580]	Produktivita [pg/ml/oD₅₈₀]
JD242/pJDCEX2	0, 93	4,0	0,023
JD242/pJD-YHR063c	1,12	4,1	0,027

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob výroby a zlepšení mikroorganismů produkujících pantotenovou kyselinu zesílením, zejména nadměrnou expresí nukleotidových sekvencí kódujících ketopantoátreduktázu, zejména genu panE, jednotlivě nebo navzájem kombinovaně, a popřípadě přídavně genu ilvC.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že k dosažení nadměrné exprese se zvyšuje počet kopií genů, popřípadě nukleotidových sekvencí v mikroorganismech pomocí inzerce plazmidových vektorů nesoucích tyto geny, popřípadě nukleotidové sekvence.
3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že k dosažení nadměrné exprese se mutuje promotorové a regulační oblast nacházející se proti směru strukturního genu.
4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že k dosažení nadměrné exprese se zabudují proti směru strukturního genu expresivní kazety.
5. Způsob podle nároků 1 až 4, vyznačuj ící se t i m , že se v mikroorganismech zesiluji, zejména nadměrně exprimují nukleotidové sekvence kódující ketopantoátreduktázu, které mají jednu nebo více mutací rezistence vůči metabolitům a/nebo antimetabolitům.
6. Způsob podle nároků 2 až 5, vyznačuj ící se t í m , že k dosažení zesílení nebo nadměrné exprese se mění kultivační médium a/nebo provedení fermentace.

9«·· • · 9 9 ' 9 9 • * 9 9999 * 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 _e

9999 99 99 999 • 9 9 9

9 9 9 9 • * 9 9 • ·9 9

99 99
7. Způsob podle nároků 1 až 6, vyznačující se t í m , že se v mikroorganismech eliminují metabolické dráhy, které snižujú tvorbu pantotenátu (pantotenové kyseliny).
8. Způsob podle nároku 7,vyznačující se tím, že se eliminuje gen avtA.
9. Způsob podle nároku 7,vyznačující se tím, že se eliminuje gen ilvE.
10. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se v mikroorganismech, zejména rodů korynebaktérií nebo E. coli, nadměrně exprimuje nebo zesiluje gen ilvC C. glutamicum.
11. Způsob podle nároků 1 až 9, vyznačuj ící se t i m , že se přídavně k nukleotidovým sekvencím kódujícím ketopantoátreduktázu zesiluje, zejména nadměrně exprimuje jeden nebo více genů metabolické dráhy tvorby pantotenové kyseliny.
12. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že se přídavně zesiluje, zejména nadměrně exprimuje jeden nebo více genů, které kódují enzymy ketopantoáthydroxymethyltransferázu (EC 4.1.2.12), aspartát-l-dekarboxylázu (EC 4.1.1.11) a pantotenátsyntetázu (EC 6.3.2.1).
13. Způsob podle nároků 11 a 12, vyznačuj ící se t í m , že se používají rozličné kompatibilní plazmidové vektory, které obsahují uvedené geny.

• 4 ·

4 4

4 4 4

4 4 4 «··· 44 ·» *··4

4 4 4

4 4 4 44

4 4 4 • 4 4 • 4 444 «· *4

4 4 4 • 4 «

4 4 4

4 4 4
14. Způsob podle nároků 10 a 11, vyznačuj ící se t í m , že se používá kmen transformovaný jedním nebo několika navzájem kompatibilními plazmidovými vektory a plazmidový vektor nese jeden nebo více z uvedených genů včetně genu panE, ve kterém jsou geny uspořádány za sebou a pod kontrolou jednoho společného promotoru nebo jsou uspořádány od sebe odděleně pod kontrolou rozdílných promotorů.
15. Plazmidový vektor pFE80, vyznačuj ící s e restrikční mapou zobrazenou na obrázku 6 a uložený v kmenu MG 1655/pFE80 E. coli K12 pod označením DSM 12414.
16. Plazmidový vektor pFE65, vyznačuj ící s e restrikční mapou zobrazenou na obrázku 5 a uložený v kmenu MG1655/pFE65 E. coli K12 pod označením DSM 12382.
17. Plazmidový vektor pFE32, vyznačuj ící s e restrikční mapou zobrazenou na obrázku 4 a uložený v kmenu MGl655/pFE32 E. coli K12 pod označením DSM 12413.
18. Kmen FE6 E. coli K12, který nese rezistenci vůči valinu.
19. Kmen FE7 za fragment avtA:

E. coli K12, ve kterém je vyměněn gen avtA aadB, uložený pod označením DSM 12380.
20. Mikroorganismus (hostitelská buňka) rodu E. coli nebo Corynebacterium, který obsahuje jeden z plazmidových vektorů podle nároků 11 až 14 a popřípadě jednu nebo více rezistencí vůči metabolitům a/nebo antimetabolitům.
21. C. glutamicum ATCC 13032/pFE91, který obsahuje plazmidový vektor pFE91 s genem ilvC C. glutamicum.

»· MM ♦ · · ⁵⁰ i tyj ···· ·· ··#· 9 · · • · ··· • · · » • · · *· Α«* «·

9 9 9

9 9 9

9 9 9

9 9 9
22. Způsob výroby pantotenové kyseliny, vyznačující se tím, že se provádějí následujícíkroky:

a) fermentace mikroorganismů podle jednoho nebo několika z předcházejících nároků,

b) koncentrování pantotenové kyseliny v médiu nebo v buňkách mikroorganismů a

c) izolace pantotenové kyseliny.
23. Způsob podle nároku 22, vyznačuj ící se t i m , že se jako prekurzor přidává ketopantoát.
24. Způsob podle nároku 23, vyznačuj ící se t i m , že se ve stupni a) přidává prekurzor pantotenové kyseliny, zvolený ze skupiny zahrnující β-alanin a ketoisovalerát.
25. Způsob podle jednoho nebo více z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že se používají mikroorganismy rodu E. coli nebo Corynebacterium nebo kvasinky.