CZ359999A3

CZ359999A3 - Farmaceutická kompozice snižující chuť k jídlu

Info

Publication number: CZ359999A3
Application number: CZ19993599A
Authority: CZ
Inventors: Heerden Fanie Retief Van; Robert Vleggaar; Roelof Marthinus Horak; Robin Alec Learmonth; Vinesh Maharaj; Rory Desmond Whittal
Original assignee: Csir
Priority date: 1998-04-15
Filing date: 1998-04-15
Publication date: 2000-05-17

Abstract

Farmaceutická kompozice obsahuje extrakt, který lze získat z rostliny rodu Trichocaulon nebo Hoodia obsahující činidlo potlačující chuť kjídlu mající vzorec 1. Rovněžje zahrnut způsob získání extraktu a způsob přípravy sloučeniny 1 a jejích analogů. Řešeníje dále rozšířeno o použití extraktů sloučeniny 1 ajejích analogů pro přípravu léčiv, majících aktivitu snižující chuť kjídlu. Řešení dále poskytuje nové meziprodukty pro přípravu sloučeniny 1.

Description

Předkládaný vynález se týká steroidních glykosidů, kompozic které obsahují steroidní glykosidy a nového použití těchto steroidních glykosidů a kompozic, které je obsahují. Vynález se dále týká způsobu extrakce a izolace těchto steroidních glykosidů z rostlinného materiálu, způsobu syntetické přípravy těchto steroidních glykosidů a produktů takové extrakce a takových syntetických způsobů.

Podstata vynálezu

Zejména se přihláška vynálezu týká činidla snižujícího chuť k jídlu, způsobu pro syntetickou přípravu činidla snižujícího chuť. k jídlu, způsobu extrakce činidla snižujícího chuť k jídlu z rostlinného materiálu, kompozice snižující chuť k jídlu obsahující činidlo snižující chuť k jídlu a způsobu snížení chuti k jídlu.

Předkládaný vynález poskytuje postup přípravy extraktu rostliny rodu Trichocaulon nebo rodu Hoodia, přičemž extrakt zahrnuje činidlo snižující chuť k jídlu, postup zahrnuje stupně zpracování sebraného rostlinného materiálu rozpouštědlem k extrakci frakcí majících aktivitu snižující chuť k jídlu, separaci extrakčního roztoku od zbytku rostlinného materiálu, odstranění rozpouštědla z extrakčního roztoku a získání extraktu. Takto získaný extrakt může být dále čištěn, například vhodnými rozpouštědlovými extrakčními postupy.

Vynález dále poskytuje rostlinný extrakt připravený ze skupiny zahrnující rod Trichocaulon a rod Hoodia a mající aktivitu snižující chuť k jídlu.

• · • ·

Extrakt se může připravit z rostlinného materiálu, jako jsou stonky nebo kořeny uvedených rostlin rodu Trichocaulon nebo rodu Hoodia. Rod Trichocaulon a rod Hoodia jsou šúavnaté rostliny rostoucí ve vyprahlých oblastech, jaké se nacházejí v Jižní Africe. V jedné přihlášce vynálezu se extrakt snižující chuú k jídlu získá z druhu Trichocaulon piliferum. Druh Trichocaulon officianale se může také použít k získání extraktu snižujícího chuť. k jídlu. V další přihlášce vynálezu se extrakt snižující chutí k jídlu může získat z druhu Hoodia currorii, Hoodia gordonii nebo Hoodia lugardii. Biologické zkoušky provedené přihlašovatelem ukázaly, že některé tyto extrakty vykazují aktivitu snižující chutí k jídlu.

Rostlinný materiál se může homogenizovat v přítomnosti vhodného rozouštědla, jako je například směs methanolu a methylenchloridu, zařízením jako je Waringův misie. Extrakční roztok se potom může oddělit od zbytku rostlinného materiálu vhodnou separační technikou, jako například filtrace nebo odstředění. Rozpouštědlo se může odstranit na rotační odpařovačce, výhodně ve vodní lázni při teplotě 60 °C. Oddělený surový extrakt se může dále extrahovat methylenchloridem a vodou, dříve než se rozdělí na methylenchloridový extrakt a vodní extrakt.

Methylenchloridový extrakt může mít rozpouštědlo, které se může výhodně odstranit na rotační odpařovačce a výsledný extrakt se může dále čistit extrakcí směsí methanolu a hexanu. Extrakční produkt z extrakce směsí methanolu a a hexanu se potom může rozdělit na methanolový extrakt a hexanový extrakt. Methanolový extrakt se může odpařit k odstranění rozpouštědla, aby se získal částečně čistý aktivní extrakt.

Částečně čistý aktivní extrakt se může rozpustit v methanolu a dále se může frakcionovat sloupcovou chromatografií za použití silikagelu jako adsorpčního media a směsi chloroformu a 30% methanolu jako eluentu.

Získá se velké množství různých frakcí a každá může být hodnocena vhodnou biologickou zkouškou k určení aktivity na snížení chuti k jídlu.

Frakce mající aktivitu snižující chuú k jídlu se mohou výhodně dále frakcionovat sloupcovou chromatografií na silikagelu jako adsorpčním mediem a rozpouštědla 9:1 chloroform:methanolu a výsledné subfrakce se bilogicky zkouší na aktivitu snižující chuť k jídlu. Subfrakce vyznačující se aktivitou snižující chutí k jídlu mohou být dále, je-li to žádoucí frakcionovány a čištěny za použití sloupcové chromatografie se silikagelem jako adsorpčním mediem a směsí ethylacetátu a hexanu 9:1 jako rozpouštědlem. Výsledné čištěné frakce mohou být opět hodnoceny vhodnými biologickými postupy na aktivitu snižující chuť k jídlu.

Přihlašovatel zjistil, že alespoň jedna taková čištěná frakce má dobrou aktivitu snižující chut k jídlu a aktivní látka ve frakci byla identifikována konvenčními chemickými technikami zahrnující nukleární magnetickou rezonanci a bylo zjištěno, že se jedná o sloučeninu strukturního vzorce

• · • · • · • ·

V souladu s nomenklaturou S.I., aktivní látka 1 je sloučenina 3-0-[-β-D-thevetopyranosyl-(l->4)-β-D-cymaropyranosyl-(l->4)-β-D-cymaropyranosyl]-12B-0-tigloyloxy-14-hydroxy-14fi-pregn-5-en-20-on (C₄₇H₇₄O₁₅ M⁺ 878).

Dalším aspektem vynálezu je způsob přípravy rostlinného extraktu rodu Trichocaulon nebo rodu Hoodia, přičemž extrakt zahrnuje činidlo snižující chuť. k jídlu, postup zahrnující lisování sebraného rostlinného materiálu na oddělené šťávy z pevného rostlinného materiálu a získání volné šťávy pevného rostlinného materiálu za vzniku extraktu.

Extrakt může být sušen k odstranění vlhkosti, například sušením rozprašováním, vymrazováním nebo vakuovým sušením za vzniku volně tekoucího prášku.

Vynález se dále týká kompozice mající aktivitu ke snížení chuti k jídlu zahrnující extrakt, jak je popsán shora.

Kompozice může být smíchána s farmaceutickým excipientem, ředidlem nebo nosičem a případně se připraví v jednotkové dávkové formě.

Vynález se dále rozšiřuje na použití extraktu jak je popsán shora na přípravu léčiva mající aktivitu snižující chuť k jídlu, na extrakt jak je popsán shora pro použití jako léčiva mající aktivitu snižující chuť k jídlu a na způsob snížení chuti k jídlu tak, že se člověku nebo zvířeti podá účinná dávka kompozice popsaná shora.

Sloučenina 1 je nová sloučenina a -vynález je rozšířen na sloučeninu 1 a určité analogy nebo deriváty tohoto steroidního trisacharidu snižující chuť k jídlu. Má se za to, že molekuly vybrané jako analogy nebo deriváty dodávají steroidnímu trisacharidu vlastnosti, zvyšující aktivitu • · • · • · · · • · · · · ·· · · aktivní složky. Při výběru analogů byly brány v úvahu následující účinky:

(i) Hydrofobní interakce a lipofilita

Modifikace funkční skupiny aktivní molekuly se provádí k dosažení změny hydrofobnosti a lipofility molekuly.

Bylo dokázáno, že zvýšená lipofilita koreluje se zvýšenou biologickou aktivitou, menší rozpustností ve vodě, zvýšenou detergencí a buněčnou lýzou, zvýšeným ukládáním v tkáních, rychlejším metabolismem a eliminací, zvýšenou vazbou plasmových proteinů a rychlejším počátkem působení.

(ii) Elektronické vlastnosti a ionizační konstanty

Modifikace funkční skupiny se také provádí za účelem dosažení změny kyselosti a bázicity, která bude hrát hlavní roli při regulaci transportu sloučeniny na místa působení a při vazbě na tomto cílovém místě.

(iii) Vázání vodíku

Modifikace funkční skupiny karboxylové a karbonylové skupiny v aktivní molekule se provádí za účelem dosažení změny interakce mezi proteiny v biologických systémech a chemicky modifikovanými funkčními skupinami.

(iv) Stérické parametry

Účelem změny sférických rysů molekuly je zvýšení vazby k jejímu receptoru a tak zvýšení její biologické aktivity.

Následující chemické modifikace se provádějí za účelem dosažení hydrofobnosti a lipofility, elektronického vázání a • · ·

ϊ sférických parametrů molekuly:

a) Chemická modifikace skupiny C-12 a esterové funkční skupiny;

b) Chemická modifikace 5,6-dvojné vazby, například hydrogenace a migrace;

c) Chemická modifikace C-20 karbonylové skupiny a C-17 acetylové skupiny;

d) Chemická modifikace kruhu D steroidního nebo aglykonového kruhu;

e) Modifikace cukrů trisacharidové části.

Předkládaný vynález poskytuje sloučeninu obecného vzorce

(2) kde R = alkyl

R-]_ = H, alkyl, tigloyl, benzoyl, nebo jiná organická esterová skupina;

R₂ = H nebo jeden nebo více 6-deoxysacharidů nebo jeden nebo více 2,6-dideoxysacharidů, nebo molekuly glukózy nebo jejich kombinace;

a kde přerušovaná čára znamená případně přítomnost další vazby mezi C4-C5 nebo C5-C6.

Předkládaný vynález také zahrnuje sloučeninu jak je popsána shora, kde dále je další vazba mezi C5-C6, R = methyl, R-^ = tigloyl, R₂ = 3-0-[-β-D-thevetopyranosyl-(l->4) • · i

β-D-cymaropyranosyl-(l->4)-β-D-cymaropyranosyl], a kde sloučenina má obecný vzorec

Další aktivní analogy derivátů sloučeniny 1 snižující chuť k jídlu podle vynálezu jsou sloučeniny mající následný strukturní vzorec

OH (3) • ·

kde R = alkyl; a

R-L = H, alkyl, tigloyl, benzoyl nebo jakákoliv jiná organická esterová skupina

(4)

OH

kde R = alkyl; a

R^ = H, alkyl, tigloyl, benzoyl nebo jakákoliv jiná organická esterová skupina

OH <5) • · · · * · kde R = alkyl; a

R-^ = H, alkyl, tigloyl, benzoyl nebo jakákoliv jiná organická esterová skupina

OMe (6) kde R = alkyl; a

Rj = H, alkyl, tigloyl, benzoyl nebo jakákoliv jiná organická esterová skupina

kde R = alkyl; a

R-^ = H, alkyl, tigloyl, benzoyl nebo jakákoliv jiná organická esterová skupina.

• · !

(8) kde R = alkyl

R^_ = H, alkyl, tigloyl, benzoyl, nebo jiná organická esterová skupina;

(9) kde R = alkyl

R-j_ = H, alkyl, tigloyl, benzoyl, nebo jiná organická esterová skupina;

R₂ = H nebo jeden nebo více 6-deoxysacharidů nebo jeden • · ·· ···« nebo více 2,6-dideoxysacharidů, nebo molekuly glukózy nebo jejich kombinace;

(10) kde R = alkyl

R-L = H, alkyl, tigloyl, benzoyl, nebo jiná organická esterová skupina;

R

(11) kde R = alkyl

R-^ = H, alkyl, tigloyl, benzoyl, nebo jiná organická • · • · )

• fc ·· • · · • ·· • · · ·· ···· fcfc fc • fc · • fc ·« esterová skupina;

a kde přerušovaná čára znamená případně přítomnost další vazby mezi C4-C5, C5-C6 nebo C14-C15.

(12) kde R = alkyl

R-j_ = H, alkyl, tigloyl, benzoyl, nebo jiná organická esterová skupina;

(13)

9994

9« »9

9 9 9 9 9 • 9 9 9 4

9 9 9 » 9

9 9 9 9

9994 99 94

94

9 9 9

9 9 9 9

9 4 9

99 kde R = alkyl

R-^ = H, alkyl, tigloyl, benzoyl, nebo jiná organická esterová skupina;

R2 = H nebo jeden nebo více 6-deoxysacharidů nebo jeden nebo více 2,6-dideoxysacharidů, nebo molekuly glukózy nebo jejich kombinace;

a kde přerušovaná čára znamená případně přítomnost další vazby mezi C4-C5, C5-C6 nebo C14-C15; a R₃ = H, alkyl, aryl, acyl nebo glukoxy.

kde R = H, alkyl, aryl, nebo jakýkoliv steroid mající C14 beta hydroxylovou skupinu, C12 beta hydroxylovou skupinu a C17 acylovou skupinu, C5-C6 olefin nebo jejich kombinace.

Vynález je dále rozšířen na postup pro syntetickou přípravu sloučeniny mající aktivitu snižující chutí k jídlu.

Postup používá steroid jako výchozí materiál (nebo meziprodukt nebo prekurzor), kde steroid má chemický vzorec

(15) •4' '' frfr' ' ·* »· ♦ · ·· frfrfr · · · · · · · fr • frfr · · fr frfrfr· frfr · t · · fr frfr ·· fr frfrfr frfrfr frfrfrfr • frfrfr ·· frfr frfr·· frfr frfr

- 14 Steroid 15 se může připravit ze sloučeniny mající vzorec 22, který zahrnuje stupně (i) zpracování progesteronu majícím vzorec

(16) s mikroorganismem Calonectrica decora za vzniku sloučeniny 12S, 15a-dihydroxyprogesteronu vzorce

(17) (ii) zpracováním sloučeniny 17 tosylchloridem a pyridinem za vzniku sloučeniny 12S-hydroxy-15a-(p-toluensulfonyl)progeste ronu vzorce

(18) • · · (iii) zpracováním sloučeniny 18 s kolidinem při teplotě 150 °C za vzniku sloučeniny i2E-hydroxy-^¹⁴-progesteronu vzorce

(19) (iv) zpracováním sloučeniny 19 s acetylchloridem a acetanhydridem při 120 °C za vzniku sloučeniny 3,12S-diacetoxypregna-3,5,14-trien-20-onu vzorce

AcO

(20) (v) zpracováním sloučeniny 20 s ethylenglykolem a katalytickým množstvím p-toluensulfonové kyseliny za vzniku sloučeniny 3,12S-diacetoxy-20,20-ethylendioxypregna-3,5,14-trienu vzorce i

• ·· · ·»

(21) (vi) zpracováním sloučeniny 21 s NaBH₄ za vzniku sloučeniny 3S, 12S-dihydroxy-20,20-ethylendioxypregna-5,14-dien-12-acetátu vzorce

V prvním alternativním postupu postup pro přípravu steroidu 15 podle vynálezu zahrnuje stupně (a) zpracování sloučeniny 22 s redukčním činidlem například LiAlH₄ za vzniku sloučeniny 3E,12S-dihydroxy-20,20-ethylendioxypregna-5,14-dienu vzorce

(23) • 9 • 999 ί

- 17 (b) zpracování sloučeniny 23 s N-bromacetamidem (NBA) a bází například pyridinem za vzniku sloučeniny 3S,12S-dihydroxy-14,15-epoxy-20,20-ethylendioxypregnen-5-enu vzorce

(24) (c) zpracování sloučeniny 24 s redukčním činidlem za vzniku sloučeniny 3S,12S,14S-trihydroxy-20,20-ethylendioxypregn-5-enu vzorce

a (d) zpracování sloučeniny 25 s kyselinou například kyselinou octovou a vodou za vzniku steroidní sloučeniny 15, 3S,12S,14S-trihydroxypregn-5-enu.

Reakční schéma A zobrazuje postup přípravy steroidního meziproduktu 15 ze sloučeniny 22 podle prvního alternativního postupu podle vynálezu (a zahrnuje přípravu sloučeniny 22 ze sloučeniny 16 pro ilustrativní účely) .

• · • · • · • ·

120) (21) • · • ·

U5) • · • ·

I

V druhém alternativním postupu pro přípravu steroidů 15 podle vynálezu postup zahrnuje stupně (a) zpracování sloučeniny 22 (3S,12S-dihydroxy-20,20-ethylendioxypregna-5,14-dien-12-acetát) s p-toluensulfonylchloridem a bází, například pyridinem za vzniku sloučeniny

3S,12S-dihydroxy-20,20-ethylendioxypregna-5,14-dien-3-tosyl-12-acetátu vzorce

(b) zpracování sloučeniny 26 octanem draselným v rozpouštědle například acetonu za vzniku sloučeniny 6S,12S-dihydroxy-20,20 -ethylendioxy-3,5a-cyklopregnan-14-en-l2-acetátu vzorce

(27) (c) zpracování sloučeniny 27 s redukčním činidlem, například LíA1H₄ a například tetrahydrofuranem za vzniku sloučeniny 6S,12S-dihydroxy-20,20-ethylendioxy-3,5a-cyklopregnan-14-enu vzorce • 4 • 4

(28) (d) zpracování sloučeniny 28 s N-bromacetamidem, případně kyselinou octovou a bází například pyridinem za vzniku sloučeniny 6β,12fi-dihydroxy-20,20-ethylendioxy-14,15-epoxy3,Sa-cyklopregnanu vzorce

OOOH (29) (e) zpracování sloučeniny 29 s redukčním činidlem například LíA1H₄ a například tetrahydrofuranem za vzniku sloučeniny 6β, 12β, 14fi-trihydroxy-20,20-ethylendioxy-3,5a-cyklopregnanu vzorce • · • ·

OH (30) a (f) zpracování sloučeniny 30 s kyselinou, například kyselinou chlorovodíkovou a rozpouštědlem, například acetonem za vzniku sloučeniny 15.

Reakční schéma B zobrazuje postup přípravy meziproduktu 15 ze sloučeniny 22 podle druhého alternativního postupu podle vynálezu.

• ·

Reakční schéma B

(15) Směs epimerů (15a) C-17pacety( (15b) C-17aacetyl

O

OH

HO • ·

- 24 Sloučenina 1 se může připravit syntézou z prvního karbohydrátového meziproduktu ve formě aktivované monosacharidové cymarosové části, která se může připravit ze sloučeniny mající vzorec 36. Sloučenina 36 se může připravit podle postupu, který zahrnuje stupně (i) zpracování α-D-methyl-glukózy mající vzorec

s benzaldehydem a chloridem zinečnatým za vzniku sloučeniny methyl-4,6-0-benzyliden-a-D-glukopyranosidu vzorce

(32) (ii) zpracování sloučeniny 32 s tosylchloridem a pyridinem při teplotě 0 °C za vzniku sloučeniny methyl-4,6-O-benzyliden-2-O-tosyl-a-D-glukopyranosidu vzorce

(33) • · (iii) zpracování sloučeniny 33 s NaOMe při teplotě 100 °C za vzniku sloučeniny methyl 4,6-O-benzyliden-3-O-methyl-a-D-methylpyranosidu vzorce

(34) (iv) a zpracování sloučeniny 34 s N-bromsukcinimidem (NBS) za vzniku sloučeniny methyl 6-brom-4-0-benzoyl-3-0-methyl-6-deoxy-a-D-altropyranosidu vzorce

a (v) zpracováním sloučeniny 35 s NaBH₄ a NiCl₂ za vzniku sloučeniny methyl 4-0-benzoyl-3-0-methyl-6-deoxy-a-D-altropyranosidu vzorce

(36) • ·

Vynález je dále rozšířen na způsob přípravy kabohydrátového meziproduktu ve formě aktivované monosacharidové cymarosové části, který zahrnuje stupně (i) zpracování sloučeniny 36 s PhSSiMe^, Znl₂ a Bu4⁺I“ za vzniku sloučeniny 4-0-benzoyl-3-0-methyl-6-deoxy-aS-D-fenylthioaltrosidu vzorce

SPh (37) (ii) případně zpracování sloučeniny 37 s diethylaminosulfur trifluoridem (DAST) například při 0 °C za vzniku sloučeniny 4-0-benzoyl-3-0-methyl-2-fenylthio-2,6-dideoxy-aS-D-fluorcymaropyranosidu mající vzorec

nebo (iii) případně zpracování sloučeniny 37 s terč.butyldimethylsilylchloridem a imidazolem v rozpouštědle například pyridinu za vzniku 4-0-benzoyl-3-0-methyl-2-0-terc.butyldimethylsilyl-cdS-D-fenylthioaltrosidu mající vzorec ·

»· 99

9 9 9 9

9 9 9 < · ♦

99 .

(39)

SPh kde Z = TBDMS = terč.butyldimethylsilyl;

a (iv) zpracování sloučeniny 39 s bází například s methoxidem sodným za vzniku 3-O-methyl-2-O-terc. butyldimethylsilyl-ceS-D -fenylaltrosidu mající vzorec

(40)

SPh kde Z = TBDMS = terč.butyldimethylsilyl.

Reakční schéma C zobrazuje postup přípravy aktivované monosacharidové cymarosové části 40 ze sloučeniny 36 podle vynálezu (a zahrnuje přípravu sloučeniny 36 ze sloučeniny 31 pro ilustrativní účely).

- 28 Reakční schéma C

Ph

(34);.

Br-

Z = t-butyldimelhylsilyl ze • ·

Syntéza sloučeniny 1 může také zahrnovat druhý karbohydrátový meziprodukt ve formě aktivované monosacharidové thevetosové části, která se může připravit sloučeniny vzorce 47. Sloučenina 47 se může připravit postupem, který zahrnuje stupně (i) zpracování α-D-glukózy mající vzorec

(41) s acetonem a kyselinou sírovou za vzniku sloučeniny 1,2 : 5, β-di-O-isopropyliden-Qí-D-glukofuranózy vzorce

(42) (ii) zpracování sloučeniny 42 s NaH a Mel za vzniku sloučeniny 1,2 : 5,6-di-0-isopropyliden-3-0-methyl-of-D-glukofuranózy vzorce

(43)

- 30 (iii) zpracování sloučeniny 43 s kyselinou octovou za vzniku sloučeniny 3-O-methyl-aS-D-glukopyranózy vzorce

(iv) zpracování sloučeniny 44 s methanolem a kyselinou chlorovodíkovou za vzniku sloučeniny methyl 3-0-methyl-o!S-D-glukopyranosidu mající vzorec

OMe (v) zpracování sloučeniny 45 s benzaldehydem a chloridem zinečnatým za vzniku sloučeniny methyl 4,6-O-benzyliden-3-Omethyl-oíS-glukopyranosidu mající vzorec

OMe (46) • · (vi) zpracování sloučeniny 46 s N-bromsukcinamidem, chloridem nikelnatým a roztokem borohydridu za vzniku sloučeniny methyl

4-0-benzoyl-3-0-methyl-6-deoxy-G!S-glukopyranosidu maj ící vzorec

ί

(47)

Vynález je dále rozšířen na způsob přípravy aktivované monosacharidové thevetosové části, který zahrnuje stupně (i) zpracování sloučeniny 47 s fenylthiotrimethylsilanem a trimethylsilyltrifluormethansulfonátem za vzniku sloučeniny 4-0-benzoyl-3 -O-methyl-l-f enylthio-6-deoxy-o;É-glukopyranosidu majícím vzorec

SPh (48) (ii) zpracování sloučeniny 48 s pivaloylchloridem a rozpouštědlem například pyridinem za vzniku sloučeniny 4-0-benzoyl-3-0-methyl-2-0-pivaloyl-l-fenylthio-6-deoxy-aSglukopyranosidu majícím vzorec

..............0* 0 • · 0 · 0 · ·

00 0 ·

0 0 0 0 0

0 0 0 0 » ,0-0,.* » 0 0

0 0 »

0 0 0 » 0 » » • 0 00

(49) a (iii) zpracování sloučeniny 49 s bromačním činidlem například N-bromsukcinimidem a diethylaminosulfur trioxidem za vzniku sloučeniny 4-0-benzoyl-3-0-methyl-2-0-pivaloyl-lfluor-6-deoxy-S-glukopyranosidem vyskytujícím se jako stereoisomery mající vzorec

Reakční schéma D znázorňuje postup přípravy aktivované monosacharidové thevetosové části 50A a 50B ze sloučeniny 48 podle vynálezu (a zahrnuje přípravu sloučeniny 47 ze sloučeniny 41 pro ilustrativní účely).

« · · φ φφφφ • ·· · φ · • φ » φφφ φφφ φφφ φφ φφφφ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ • φ φφ

- 33 Reakční schéma D

149)

•99« 4* 9* 94-99

4944 9 949 449 4 «9 9 4 9 9999 «4 949 9 9 99 49 9

44 499 4949

4499 44 99 9999 99 99

Podle dalšího aspektu vynález poskytuje postup syntetické přípravy sloučeniny vzorce 1 jejích analogických derivátů, který zahrnuje stupně syntézy vhodného steroidního meziproduktu nebo prekurzoru a kopulaci požadovaného čísla vhodných monosacharidů se steroidním meziproduktem.

Vynález také poskytuje způsob kopulace monosacharidové cymarosy se steroidním meziproduktem, který zahrnuje stupně (i) reakci cymarosové části vzorce 38 se steroidovým meziproduktem vzorce 15, například při teplotě -15 °C v přítomnosti chloridu cínu v rozpouštědle, například etheru za vzniku sloučeniny 3-0-[4-0-benzoyl-2-fenylthio-S-D-cymaropyranosyl] -12,14-S-dihydroxypregnan-5-en-20-onu vzorce

BzO

(51) a (ii) zpracování sloučeniny 51 s chloridem tiglové kyseliny v pyridinu a poté s bází například NaOMe za vzniku sloučeniny 3-0- [-2-fenylthio-£-D-cymaropyranosyl] -12S-tigloyl-oxy-14-hydroxy-14S-pregn-5-en-20-onu vzorce • · ·· fr» ·· ' *·. frfr • frfrfr fr frfr · fr frfr · • frfr frfr · frfrfr fr • fr frfrfr · · frfr frfr · • frfr frfrfr fr··· • frOfr frfr frfr ···· ·· frfr

(52)

Vynález je dále rozšířen na způsob, který zahrnuje kopulaci monosacharidové cymarosové části na monosacharid thevetosovou část a kopulaci vzniklého disacharidu s kombinovaným steroidním produktem 52 za vzniku sloučeniny 1

Kopulace monosacharidové cymarosové části na monosacharidovou thevetosovou část a kopulace vzniklého disacharidu na kombinovaný steroidní produkt 52 může zahrnovat stupně (i) kopulaci selektivně chráněné cymarosové části vzorce 40 a selektivně chráněné thevetosové části 50 A za použití chloridu cínatého (SnCl₂) a trifluormethansulfonátu stříbrného například při -15 C za vzniku sloučeniny vzorce

(53)

kde Z = TBDMS = terč.butyldimethylsilyl (ii) zpracování sloučeniny 53 s tetrabutylamoniumfluoridem za vzniku sloučeniny vzorce

SPh (54) (iii) zpracování sloučeniny 54 s diethylaminosulfur trifluoridem například při 0 °C za vzniku sloučeniny vzorce

(55) (iv) reakci sloučeniny 55 se sloučeninou 52 za vzniku sloučeniny vzorce · ·--·-·- ··♦·' -¹····'·'’ 9 9 - ‘99 • 999 9 9 9 9 9 9 9 9 • ·· · · · · 9 « · ··· 9 9 9 9 9 9 9 ···· ·» ·· ···· ·· 99

ΟΡν (56) a (v) zpracování sloučeniny 56 Raney-niklovou reakcí a potom s bází například NaOMe za vzniku sloučeniny 1 jak je popsáno shora.

Reakční schéma E znázorňuje postup syntézy meziproduktů 52 a 55 a jejich kopulaci za vzniku sloučeniny 56 .

>· · ·

- 38 Reakční schéma E

BzO

(15)

(52) • 9

(50A)

SPh *·

ΟΡν (53)

ΟΡν

154)

ΟΡν • ·

Podle vynálezu, alternativní způsob zahrnuje kopulaci cymarosy a thevetosové části za vzniku trisacharidu a kopulaci trisacharidu na steroidní derivát za vzniku sloučeniny vzorce 1.

Proces vzniku trisacharidu a kopulace vzniklého trisacharidu na steroidní derivát může zahrnovat stupně (i) kopulaci selektivně chráněné cymarosové části vzorce 40 a sloučeniny 45 za použití chloridu cínatého, AgOTf,

Cp₂ZrCl₂ za vzniku sloučeniny vzorce

(57) kde Z = TBDMS = terč.butyldimethylsilyl;

(ii) zpracování sloučeniny 57 s tetrabutylamoniumfluoridem a diethylaminosulfur trifluoridem za vzniku trisacharidové sloučeniny mající vzorec

ΟΡν (58) a (iii) kopulaci trisacharidu vzorce 58 se steroidovým meziproduktem vzorce

(59) za použití chloridu cínatého, AgOTf, Cp₂ZrCl₂ za vzniku sloučeniny 1.

Steroidní meziprodukt 59 se může připravit zpracováním steroidu 15 s chloridem tiglové kyseliny.

Reakční schéma F znázorňuje postup pro syntézu trisacharidu 58 a syntézu sloučeniny 1 kopulací trisacharidu 58 se steroidním meziproduktem 59.

·· φφ φφ φφ ·· • φ φ φ · φ ·· · φ · · φφφ · φ · · ·· • · ·♦· φ φ φφ φ φ ί

49-* ·· φφφ φφφ<

φφφφ φφ φφ φφφφ φφ φφ

Reakční schéma F

(40)

ΟΡν

SPh

^0Ρν 158)

Ζ« t - buíy [dimethy Isilyl

Meziprodukty 23, 24, 25, 27, 28, 29, 30, 37, 38, 39,

40, 48, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 56, 57 a 58 popsané shora jsou nové sloučeniny a vynález je rozšířen na tyto sloučeniny jako takové.

Sloučenina 1 3-0-[-β-D-thevetopyranosyl-(l->4)-β-Dcymaropyranosyl- (l->4)-β-D-cymaropyranosyl] -12fi-0-tigloyloxy-14-hydroxy-14B-pregn-5-en-20-on a jeho různé analogy a deriváty mají aktivitu snižující chuť. k jídlu.

Vynález je rozšířen na kompozici nebo formulaci, mající aktivitu snižující chuť k jídlu, kde aktivní složka je extrakt získaný z rostlin rodu Trichocaulon a rodu Hoodia.

Aktivní složka může být sloučenina obecného vzorce 1, extrahovaná z rostliny rodu Trichocaulon nebo Hoodia nebo jejich derivátu. Rostlina může být z druhu Trichocaulon officinale nebo Trichocaulon piliferum nebo z druhu Hoodia currorii, Hoodia gordonii nebo Hodia lugardii.

Vynález je dále rozšířen na kompozici nebo formulaci mající aktivitu snižující chuť k jídlu, kde aktivní složka je synteticky připravená sloučenina obecného vzorce 1 nebo její derivát nebo její analog, jak je popsáno shora s odkazem na sloučeninu 2 až 14.

Podle dalšího aspektu vynález poskytuje způsob snížení chuti k jídlu tak, že se podá člověku nebo zvířeti vhodná dávka činidla snižující chuť k jídlu, zahrnující extrakt z rostliny rodu Trichocaulon nebo Hoodia. Extrakt může být včleněn do kompozice nebo formulace které zahrnují také farmaceuticky přijatelné další složky.

Činidlo snižující chuť k jídlu může být izolovaná přírodní nebo syntetická chemická sloučenina vzorce:

• · • · * · · · · nebo

její deriváty nebo analogy,

jak je uvedeno shora.

Kompozice nebo formulace snižující chuť. k jídlu se může skládat z činidla snižující chuť k jídlu smíchaného s farmaceuticky přijatelným excipientem, ředidlem nebo nosičem. Mohou se přidat také další vhodná aditiva, zahrnující stabilizátor a ostatní složky.

Vynález je rozšířen na použití sloučeniny 1 nebo jejích derivátů nebo analogů při přípravě léčiva mající aktivitu snižující chuť k jídlu.

Vynález je dále rozšířen na sloučeninu 1 nebo jejích derivátů nebo analogů jak bylo popsáno shora pro použití jako léčiva mající aktivitu snižující chuť k jídlu.

Je rovněž zahrnut způsob snížení chuti k jídlu podáním člověku nebo zvířeti účinné dávky kompozice jak je popsána shora.

Je zde popsán způsob extrakce steroidníhó glykosidu mající aktivitu snižující chuť k jídlu z rostlinného materiálu získaného z rostliny Trichocaulon nebo Hoodia genus. Tak je vynález rozšířen na extrakt získaný z • ·

rostlinného materiálu rodu Trichocaulon nebo Hoodia a obsahující v podstatě čistý steroidní glykosid vzorce 1.

Vynález je také rozšířen na potraviny nebo nápoje obsahující účinné množství steroidního glykosidu vzorce 1 nebo jeho derivátů nebo analogů jak je popsáno shora, které mají při požití účinek snižující chut k jídlu.

Molekulární genetické studie vedly ke značnému zvýšení pochopení regulace chuti, přesycenosti a tělesné hmotnosti. Tyto studie odhalily řadu centrálních regulačních cest, zprostředkovaných řadou neuropeptidů. Udržení normální tělesné hmotnosti je dosaženo složitou rovnováhou mezi příjmem energie, příjmem potravy a výdejem energie. Energetická homeostáza je subjektem k širokému rozsahu vlivů, hlavně kontrolovaných mozkem. Rozdílné signály zahrnují takové parametry, jako je smysl, čich a chuť.

a gastrointestinální signály, jako je rozšíření gastrointestinálního traktu, chemické signály ke gastrické mukóze a metabolity přenášené krví, jako mastné kyseliny a glukóza.

Centrální neuropeptid Y (NPY), který je negativně regulován leptinem byl označen jako jeden z pozitivních regulátorů přijímání potravy. Bylo prokázáno, že exprese endogenního antagonistu k melanokortinovým receptorům je základem obezity ve zvláštním modelu (myš ob/ob). Ve skutečnosti nedostatek MC4 melanokortinového receptorů zcela replikuje syndrom obezity. Další zprostředkovatelé, o kterých se uvádí že mají úlohu v energetické rovnováze zahrnují bombesin, galonin, a glukagonu podobný peptid-1.

Aniž bychom se vázali na theorii, přihlašovatel se domnívá, že sloučenina 1 a její analogy jak jsou popsány shora působí jako agonist receptorů melanokortinu 4. Účinek tohoto působení spočívá v regulaci NPY ale také ve zvýšení • · · · 4 · 4 4 · · · · • ·· 9 9 9 9 9 · » · *

Φ ·· ·· 9 · * « · • · · 4 4 4

9999 99 99 9999

- 46 cholecystokininu. Účinek cholecystokininu mezi jiným inhibuje gastrické vyprázdnění.

Podle toho je vynález rozšířen na kompozici, mající aktivitu snižující chuť k jídlu zahrnující agonist receptorů melanokortinu 4.

Agonist může být extrakt nebo sloučenina jak je popsána shora, zejména sloučenina vzorce 1. Kompozice může být smíchána s farmaceutickým excipientem, ředidlem nebo nosičem a případně může být připravena v jednotkové dávkové formě.

Vynález je dále rozšířen na použití agonistů receptorů melanokortinu 4 při přípravě léčiva mající aktivitu snižující chuť k jídlu, k agonistů receptorů melanokortinu 4 pro použití jako léčiva mající aktivitu snižující chuť k jídlu, ke způsobu snížení chuti k jídlu tak, že se podá člověku nebo zvířeti účinná dávka zahrnující agonist melaokortinu 4 jak je popsáno shora a k použití agonistů receptorů melanokortinu 4 ke snížení chuti a/nebo k boji proti obezitě u lidí nebo zvířat.

Vynález a jeho účinnost bude nyní dále popsána následujícími příklady a výkresy, které však mají pouze informativní charakter a v žádném případě neomezují rozsah vynálezu.

Ve výkresech,

Obrázek 1 znázorňuje blokové schéma obecnou metodu extrakce prvního surového extraktu snižujícího chuť k jídlu a čištění extraktu snižujícího chuť k jídlu z rostlinného materiálu rodu Trichocaulon nebo Hoodia;

Obrázek 2 znázorňuje grafickou reprezentaci biologické zkoušky provedenou na krysách za použití částečně čištěného

9« • * · • ·

999· 9« methanolového extraktu Trichocaulon piliferum;

Obrázky 3 a 4 společně znázorňují schematickou reprezentaci výhodného provedení postupu podle vynálezu pro přípravu extraktu rostlinného materiálu rodu Trichocaulon nebo Hoodia; a

Obrázky 5 a 6 znázorňují grafickou reprezentaci procentové změny tělesné hmoty krys pro různé skupiny ve dnech -7 až 7 a ve dnech 0 až 7 při opakované dávkové studii za použití šťávového extraktu a materiálu získaného sušením rozprašováním šťávového extraktu rostlinného materiálu druhu Hoodia gordonii.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Obecný způsob extrakce prvního surového extraktu snižujícího chuť k jídlu a čištěného extraktu snižujícího chuť k jídlu z rostlinného materiálu rodu Tricocaulon nebo Hoodia je ilustrován způsobem zobrazeným v blokovém schématu obrázku 1.

Příklad 2

Biologické zkoušky provedené na krysách za použití částečně čištěného methanolového extraktu získaného způsobem ilustrovaným v příkladu 1 ukázaly, že extrakt ve skutečnosti vykazuje aktivitu snižující chuť k jídlu. Aktivita snižující chuť k jídlu aktivního extraktu může být ilustrována typickým příkladem účinku methanolového extraktu Trichocaulon piliferum na krysách způsobem grafické reprezentace na obrázku 2.

Z obrázku 2 bude zřejmé, že testovaná skupina krys ·· ·· ·· ·· ·· ·· • · · · ···· ·»·· • ·· · · · ···· • · · · · · · · · · φ · • · · · · · ···· ···· ·· ·· ···· ·· «· která obdržela dávku extraktu 5. den vykazovala podstatně menší spotřebu potravy další dva dny, zatímco kontrolní skupina nevykazovala srovnatelně menší příjem potravy. Příjem potravy se u testované skupiny vrátil na normál, ve skutečnosti se zvýšil od 8. dne.

Příklad 3

Výhodné provedení postupu podle vynálezu pro přípravu extraktu majícího aktivitu snižující chuť k jídlu je ilustrováno schematicky na příkladu v obrázcích 3 a 4, kde dva obrázky společně ukazují úplný postup. Nicméně, odborník může použít různé další postupy.

Podle obrázku 3, rostlinný materiál rodu Trichocaulon nebo Hoodia je plněn do mísiče například Waringova mísiče pomocí dopravníku 1, s rozpouštědlem ve formě roztoku methylenchlorid/methanol, přiváděným potrubím 2.

Homogenisováný produkt je přiváděn potrubím 4 do separačního stupně 5, který je například filtr nebo odstředivka a zbylý rostlinný materiál je odváděn potrubím 27.

Směs rozpouštědla a extraktu se přivádí potrubím 6 do odpařovacího stupně, kde se odstraní rozpouštědlo, například rotační odpařovačkou. Sušený surový extrakt se vede potrubím 8 do dalšího extrakčního stupně 9 za přidání roztoku směsi methylenchloridu a vody, přiváděného potrubím 29 pro další extrakci a potom do separačního stupně 13, potrubím 11, kde se odstraní vodní frakce přes potrubí 31. Rozpuštěná extraktová frakce se přivede přes potrubí 15 do sušícího stupně, kde se odpaří rozpouštědlo, například rotační odpařovačkou.

Podle obrázku 4, sušený extrakt se vede přes potrubí 10 do extrakčního stupně 12. Roztok methanolu a hexanu se také vede přes potrubí 14 do extrakčního stupně 12 k dalšímu ·· ·· ·· ·· 9· ·· ···· · · · · · · · · • ·· · · · · » · · čištění a extrakci sušeného extraktu. Směs extraktu, methanolu a hexanu se vede přes potrubí 16 do separačního stupně 18, hexanová frakce se odstraní přes potrubí 20 a směs methanolu a extraktu se pak vede přes potrubí 22 do sušícího stupně 24. V sušícím stupni 24 se odstraní rozpouštědlo například odpařování na rotační odparce.

Sušený, částečně čištěný aktivní extrakt se vede přes potrubí 26 a za přidání methanolu přes potrubí 28 do roztokového stupně a rozpuštěná frakce se vede přes potrubí 36 do chromatografické kolony 38.

V koloně 38 se methanolová rozpustná frakce dále frakcionuje za použití silikagelu a rozpouštědla chloroform/30% methanol, na různé frakce, schematicky označené I až V. Podle aktuálního postupu frakcionace prováděného přihlašovatelem, frakcionačním postupem se dosáhlo následujících hmotností jednotlivých frakcí: I (3,9 g); II (2,6 g); III (2,1 g); IV (1,1 g) a V (2,0 g). Tyto frakce jsou individuálně hodnoceny vhodnými biologickými zkouškami (ve stupni se neuvádějí) a ty frakce identifikované jako frakce I a II vykazující značnou aktivitu snižující chuť. k jídlu, jsou vedeny potrubím 40 a 42 do kolon 44 a 46, kde jsou dále frakcionovány a čištěny sloupcovou chromatografií, opět za použití silikagelu a systému chloroform:methanolu 9:1.

Subfrakce II(A) - (C) získané z kolony 44 nevykazují při biologických zkouškách znatelnou aktivitu snižující chuť k jídlu a mohou být recyklovány pro další chromatografické zpracování.

Subfrakce I(A) - (L) získané z kolony 46 jsou také hodnoceny (zkouška není uvedena) a u subfrakce I(C) byla nalezena značná aktivita snižující chuť k jídlu.

Subfrakce I (C) se vede potrubím 48 do kolony 50 k ·· · · frfr frfr ·· frfr • · · · · · · · « fr · · • fr* frfr · ···· ·· frfrfr · · frfr frfr · frfrfr frfrfr ···· • frfrfr frfr frfr frfr·· frfr frfr

- 50 další frakcionaci a dalšímu čištění za použití silikagelu a rozpouštědla ethylacetátu a hexanu v poměru 9:1. Z výsledných čištěných frakcí byla po biologické zkoušce zjištěna u frakce (C) (ii) značná aktivita snižující chuč k jídlu.

Čištěný produkt je identifikován spektroskopií nukleární magnetické rezonance (jak se uvádí v tabulkách 1 a dále) a jedná se o sloučeninu 1.

·· ·· ·· ·· • · · · · ·· · • ·« · · · ······ · · » · · 9 9 ·

9999 99 99 9999

Tabulka 1: -^Η (300,13 MHz) data NMR pro sloučeninu 1 (CDCl^)

Sloučenina 1

Atom vodíku	J(HH)/Hz
Aglykon-3
6	-
12	11,5, 4,1
17	9,3, 9,3
18	-
19	-
21	-
3*	7,1, 1,5
4*	7,1,1,2
5*	1,6, 1,2

Cym-1' á_H/p.p.m.

3,522 m 5,381 m 4,607 dd 3,157 dd 1,029 s 0,951 s 2,164 s 6,888 qq 1,806 dq 1,853 dq

2' ,aq

3'

4'

5'

6' ax

3'-OMe

1”

2”

3^ax

5”

6”

3”-OMe

9,4. 2,1	4,816 dd
13,8, 3,7, 2,1	2,055 ddd
13,8, 9,4, 2,6	1,552 ddd
3,7, 2,9, 2,6	3,776 ddd
9,4, 2,9	3,179 dd
6,3, 9,4	3,821 dd
6,3	1,279 d^a
-	3,408 s^d
9,4, 2,1	4,730 dd
13,8, 3,7, 2,1	2,108 ddd
13,8, 9,4, 2,6	1,601 ddd
3,7, 2,9, 2,6	3,755 ddd
9,4, 2,9	3,239 dd
6,3, 9.4	3,898 dd
6/3	.1,243 d^b
-	3,392 s®

Thev-1

3'

4'»

5'

6'”

3'-OMe

7,7, 8,0 8,0, 2,9

9.3, 2,9

6.3, 9,3

4,273 d 3,469 dd 3,099 dd 3,179 dd 3,351 dd 1,183 d'^c3,622 s a,b,c _v kagjém sloupci může být zaměnitelné ^^,e v každém sloupci může být zaměnitelné týká se atomů tigloátové skupiny ·· aa aa ·· aa aa • · · * · ·· a a ·· a a aa · a a «aaa «· 44· · · ·· · · · a aa aaa aaaa >··· *· 4· aaaa aa «a

Tabulka 2: sloučeninu	Relevantní ¹³C (75,25 1 v cdci₃	MHz) n.m.r
	Aglykonová část		Cukrová část
Uhlík	Jp/p.p.m.	Uhlík	J_c/p.p.m.
1	37,04 T	cym- 1'	95,84 D
2	29,44 T	2'	35,57 T
3	77,24 D	3'	77,05 D
4	38,62 T	4'	82,57 D
5	138,95 S	5'	•68,48 D
6	131,90 D	6'	18,14 Q
7	27/30 T	3'-OMe	57,93 Q
8	35,30 D	1	99,54 D
9	43,04 D	2	35,17 T
10	37,22 S	3	76,99 D
11	26,04 T	4”	82,52 D
12	75,88 D	5	68,30 D
13	53,71 S	6	18/36 Q
14	85,69 S	3”-0Me	57,09 Q
15	34,36 T	Thev- 1'	104,28 D
16	24,31 T	2'	74,62 D
17	57,18 D	3'	85,30 D
18	9,85 Q	4'	74,62 D
19	19,27 Q	5'	71,62 D
20	216,85 S	6'	17,75 Q
21	33,01 Q	3'-ΟΜθ	60,60 Q
• 1	167,60 S
2*	128,69 D
3’	137,66 D
♦ 4	14,41 Q
5*	12,08 Q

týká se atomů tigloátové skupiny

Sloučenina 1

IR data: 3440 cm¹ (OH), 2910 cm¹ (CH), 1700 cm¹ (C=O) [α]^2θ589 = 12,67 ⁰ (c = 3, CHC1₃) teplota tání 147-152 °C.

ϊ ·· te ·* ·· ♦ · ·* « · 9 * ···· ···* ··· · · · ««·· • « ··· « · · · · · · ··· ··· · · · « ···· ·* ·« «··· ·· *·

Příklady 4 až 13 ilustrují syntetické postupy zatímco meziproduktové sloučeniny a steroid 15 se mohou připravit podle prvního alternativního postupu.

Příklad 4

12S,15a-Dihydroxyprogesteron 17

Kultury Calonectria decora (ATCC 14767) se připraví očkováním kulturního media zahrnujícího sacharózu (90 g) , K₂HPO₄ (30 g) Czapekův koncentrát (300 ml) , nápoj z namočené kukuřice (300 ml) a destilovanou vodu (30 1) (150 x 500 ml nádoby). Po 5 dnech třepání při 26 °C se do nádob přidá progesteron 16 (150 g) v suspenzi Tween 80 (0,1% roztok, 1,5 1). Kultury se inkubují dalších 5 dnů a zpracují se odstředěním, dekantací, extrakcí media s chloroformem a odpařením se získá dihydroxyprogesteron 17 (17,5 g, 45 %) .

¹H NMR (CDC1₃): 5,71 (1H, S, H-4); 4,12-4,22 (1H, m, H-15); 4,43 (1H, br, s, OH); 3,46-3,53 (1H, dd, J = 4,6 Hz, H-12); 2,16 Hz (3H, s, H-21); 1,18 (3H, S, H-19);0,74 (3H, s, H-18)

Příklad 5

12S-Hydroxy-15a-(p-toluensulfonyl)progesteron (18)

Dihydroxyprogesteron 17 (75 g, 0,22 mol) se rozpustí v suchém pyridnu (300 ml) a ochladí se na 0 °C. Potom se po kapkách přidá při 0 °C k reakční směsi p-tolensulfonylchlorid (46 g, 0,24 mol) v suchém pyridinu (200 ml). Reakční směs se míchá přes noc při teplotě 0 °C a ochladí se přidáním H₂O (500 ml) . Vodná vrstva se extrahuje ethylacetátem (11) a organický extrakt se promyje kyselinou chlorovodíkovou (6M, 3 x 1 1) , vodným nasyceným hydrogenuhličitanem sodným (500 ml) , vodným chloridem sodným (500 ml) a vodou (500 ml) . Organická

vrstva se suší, filtruje a odpařením se získá p-toluensulfonovaný progesteron 18 (98 g, 92 %) jako viskózní tmavě žlutý olej.

NMR (CDC1₃): 7,7 (2H, d, J = 14Hz, H-2,6); 7,34 (2H, d, J = 8,4 Hz, H-3,5); 5,67 (1H, s, H-4); 4,86-4,93 (1H, m, H-15); 3,45-3,50 (1H, dd, J = 4,6 Hz, H-12); 2,44 (3H, s, H-4Me); 2,15 (3H, s, H-21) 1,13 (3H, s, H-19); 0,74 (3H, s, H-18).

Příklad 6

12S-Hydroxy-A^14_P^rogesteron 19

Roztok tosylovaného progesteronu 18 (98 g, 0,19 mol) v 2,4,6-trimethylkolidinu (500 ml) se zahřívá při zpětném toku při 150 °C po dobu 3 hodin. Reakční směs se ochladí a vlije se do vody (500 ml). Vodná vrstva se extrahuje ethylacetátem (1 1) a organická vrstva se promyje kyselinou chlorovodíkovou (6M 3 x 1 1) , vodným nasyceným hydrogenuhličitaném sodným (500 ml), vodným nasyceným roztokem chloridu sodného (500 ml) a vodou. Po sušení (MgSO₄) se filtruje, ethylacetát se odpaří a surová směs se čistí chromatografií na silikagelu, eluováním směsí acetonu a chloroformu (1:10) a získá se /^¹⁴-progesteron 19 (50 g, 78 %) jako tmavý červený olej .

¹H NMR	(CDC1₃) :	5,73 (1H, s, H-4), 5	, 28	(1H, dd, J = 2,2 Hz,
H-15) ,	4,41 (1H,	br, s, OH), 3,49-3,	52	(1H, dd, J = 4,3 Hz,
H-12) ,	2,80-2,84	(1H, dd, J = 9,2Hz,	H-	17), 2,14 (3H, S,
H-21),	1,19 (3H,	S, H-19), 0,89 (3H,	S,	H-18).

Příklad 7 /

3,12S-Diacetoxypregna-3,5,14-trien-20-on 20

Roztok A¹⁴-progesteronu 19 (50 g, 0,15 mol) v acetylchloridu (1,5 1) a acetanhydridu (750 ml) se zahřívá • · při zpětném toku 2 hodiny. Reakční směs se vlije do suchého ethylacetátu (11) a přidá se vodný nasycený hydrogenuhličitan sodný dokud roztok šumí. Ethylacetátová vrstva se oddělí od vrstvy hydrogenuhličitanu sodného a promývá se další částí vodného hydrogenuhličitanu sodného (3 x 700 ml) a potom nasyceným chloridem sodným (700 ml) a konečně vodou (700 ml). Organická vrstva se suší (MgSO^), filtruje a odpařením se získá 3,12S-diacetoxypregna-3,5,14-trien-20-on 20 (60 g, 93 %) jako oranžový olej.

¹H NMR (CDC1₃) : 5,68 (1H, s, H-14) , 5,44 (1H, m, H-6), 5,31 (1H, dd, J = 2,2Hz, H-15), 4,82-4,86 (1H, dd, J = 4,5Hz, H-12), 3,10-3,18 (1H, t, J = 9,5Hz, H-17), 2,18 (3H, s,

3-Ac), 2,11 (3H, S, 12-Ac), 2,08 (3H, S, H-21), 1,02 (3H, S, H-19) , 1,01 (3H, s, H-18) .

Příklad 8

3,12S-Diacetoxy-20,2 0-ethylendioxypregna-3,5,14-trien 21

Diacetoxylová sloučenina 20 (60 g, 0,14 mol) se rozpustí v benzenu (11) a ethylenglykolu (60 ml) a přidá se p-toluensulfonová kyselina (1 g). (Benzen se před tím zahřívá při zpětném toku v Dean-Stárkově zachycovači) . Směs se zahřívá při zpětném toku za míchání a azeotropicky se odstraňuje voda 16 hodin. K ochlazenému roztoku se přidá vodný nasycený roztok hydrogenuhličitanu sodného (500 ml). Roztok se promyje solankou (500 ml) a vodou (500 ml) a suší se (MgSO₄). Rozpouštědlo se odpaří a surová směs se čistí sloupcovou chromatografií na silikagelu, eluuje se směsí ethylacetátu a hexanu (2:8) a získá se ethylendioxypregna-3,5,14-trien 21 (35 g, 53 %) .

¹H NMR (CDC1₃): 5,68 (1H, S, H-4), 5,45 (1H, m, H-6), 5,31 (1H, dd, J = 2,2Hz, H-15), 4,73-4,85 (1H, dd, J = 4,4Hz, H-12), 3,78-3,98 (4H, m, ethylendioxy), 2,16 (3H, s, 3-Ac), • · ·· 9· • · · · · • ·· · • · · · ·

56”2,04 (3Η, s, 12-Ac), 1,29 (3Η, s, Η-21), 1,12 (3Η, s, Η-19), 1,02 (3Η, s, Η-18).

Příklad 9

3S,12S-Dihydroxy-20,20-ethylendioxypregna-5,14-dien-12-acetát 22

Dienolacetát 21 (35 g, 0,077 mol) se suspenduje v ethanolu (500 ml) a při 0 °C se přidá borohydrid sodný (2,8 g, 0,074 mol). Směs se nechá ohřát na teplotu místnosti a míchá se přes noc. Většina rozpouštědla se odstraní ve vakuu a směs se ředí vodou (500 ml) a extrahuje s ethylacetátem (500 ml). Následuje chromatografie na silikagelu směsí acetonu a chloroformu (1:10) a získá se 3S-alkohol 22 (25 g, 80 %) .

^XH NMR (CDC1₃): 5,41 (1H, m, H-6), 5,28 (1H, dd, J = 2,2Hz, H-15), 4,72-4,81 (1H, dd, J = 4,4Hz, H-12), 3,82-4,02 (4H, m, ethylendioxy), 3,45-3,59 (1H, m, H-3), 2,03 (3H, s, 12-Ac), 1,28 (3H, s, H-21), 1,10 (3H, s, H-19), 1,01 (3H, s, H-18).

Příklad 10

3S,12S-Dihydroxy-20,20-ethylendioxypregn-5,14-dien 23

3E-alkohol 22 (25 g, 60,2 mmol) v suchém tetrahydrofuranu (300 ml) se přidá po kapkách k suspenzi lithiumaluminiumhydridu (2,7 g, 72,2 mmol) v suchém tetrahydrofuranu (500 ml). Reakční směs se míchá při teplotě místnosti 24 hodin a přidá se opatrně voda (2,7 ml) a směs se míchá dalších 10 minut. Potom se přidá hydroxid sodný (15% roztok 2,7 ml) a suspenze se míchá. Po 10 minutách se přidá voda (8,1 ml) a suspenze se míchá 10 minut, filtruje, suší se (MgSO₄) a rozpouštědlo se odpaří a získá se 3S,12E dihydroxypregnadien 23 (20 g, 90 %) .

• » ϊ

- 57 ¹Η NMR (CDC1₃): 5,36 (1Η, m, H-6), 5,23 (1H, dd, J = 2,2Hz, H-15), 3,94-4,06 (4H, m, ethylendioxy), 3,41-3,52 (1H, m, H-3), 3,32-3,36 (1H, dd, J = 4,3Hz, H-12), 1,31 (3H, s, Η) , 1,01 (3H, s, H-19), 0,96 (3H, s, H-18).

¹³C NMR (CDC1₃): 152,4 (C-14), 140,2 (C-5), 121,1 (C-15), 119,7 (C-6), 111,1 (C-20), 79,8 (C-12), 71,6 (C-3), 63,7 a 63,6 (ethylendioxy), 58,8 (C-17), 19,0 (C-19), 11,9 (C-18).

35.125- Dihydroxy-14,l5-epoxy-20,20-ethylendioxypregn-5-en

35.125- Dihydroxy-5,6-epoxy-20,20-ethylendioxypregn-14-en

N-Bromacetamid (211 mg, 1,5 mmol) se přidá při 0 °C k míchanému roztoku 5,4-dienu 23 (500 mg, 1,34 mmol) v acetonu (100 ml), kyselině octové (2,5 ml) a vodě (5 ml). Po 15 minutách se k reakční směsi přidá siřičitan sodný (5% roztok, 50 ml). Aceton se odpaří a vodná vrstva se extrahuje dichlormethanem (3 x 50 ml). Organická vrstva se suší (MgSO₄), filtruje a odpaří. K produktu se přidá pyridin (1 ml) a směs se míchá 0,5 hodiny. Potom se přidá k reakční směsi dichlormethan (100 ml) a a dichlormethan se promyje kyselinou citrónovou (5% roztok, 3 x 100 ml) , nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (50 ml) a vodou (50 ml) . Organická vrstva se suší (MgS0₄), filtruje a odpařením se získá směs 14,15- a 5,6-epoxidů (360 mg, 69 %) jako bílá pěna. Směs epoxidů se nemůže oddělit sloupcovou chromatografií.

Příklad 11

3E,12S-Dihydroxy-14,15-epoxy-20,20-ethylendioxypregn-5-en 24

Směs 14,15- a 5,6-epoxidů (14,4 g, 37,0 mmol) v suchém tetrahydrofuranu (200 ml) se přidá k suspenzi ' · · • · · · · • · « ···· ·· • · · • · · » ·· *« ···· lithiumaluminiumhydridu (1,69 g, 44,4 mmol) v suchém tetrahydrofuranu (300 ml). Reakční směs se míchá při teplotě místnosti 24 hodin a potom se zpracuje jak je popsáno shora přidáním vody (1,69 ml) a hydroxidu sodného (15% roztok, 1,69 ml). Po filtraci a odpaření rozpouštědla se surový produkt čistí sloupcovou chromatografií na silikagelu za použití směsi methanolu a chloroformu 1:9 jako rozpouštědla a získá se nezreagovaný 14,15-epoxy-20,20-ethylendioxypregn-5-en 24 (300 mg, 2,1%).

¹H NMR (CDC1₃): 5,31 (1H, m, H-6), 3,82-3,98 (4H, m, ethylendioxy), 3,43-3,52 (1H, m, H-3), 3,41 (1H, s, H-15), 3,31-3,35 (1H, dd, J=4,3 Hz, H-12), 1,29 (3H, s, H-21), 1,17 (3H, s, H-19), 1,02 (3H, s, H-18).

¹³C NMR (CDC1₃): 139,8 (C-5), 120,8 (C-6), 112,1 (C-20), 77,2 (C-12), 75,4 (C-14), 61,0 (C-15), 22,3 (C-21), 19,2 (C-19), 9,5 (C-18) .

Příklad 12

3S,12S,14S-Trihydroxy-20,20-ethylendioxypregn-5-en 25

14,15-epoxid 24 (300 mg, 0,77 mmol) v suchém tetrahydrofuranu (10 ml) se přidá k suspenzi lithiumaluminiumhydridu (300 mg, 7,89 mmol)v tetrahydrofuranu a reakční směs se zahřívá při zpětném toku 48 hodin. Po přidání vody (3 ml), hydroxidu sodného (15% roztok, 0,3 ml) a filtraci jak je popsáno shora se směs čistí sloupcovou chromatografií na silikagelu za použití směsi methanolu a chloroformu (1:9) jako rozpouštědla a získá se trihydroxypregnen 25 (250 mg, 83 %).

^ΧΗ NMR (CDC1₃): 5,38 (1H, m, H-6), 3,98 (4H, m, ethylendioxy), 3,43-3,53 (1H, m, H-3), 3,25-3,32 (1H, dd, J = 4,1Hz, H-12), 1,32 (3H, s, H-21), 1,01 (3H, s, H-19), 0,98 • 9 ·· ·♦ » · · « ···· · ·

9999

99

I · · *

I · · * » · · · » · · · ·· ··

- 59 (3H, s, H-18) ¹³C NMR (CDC1₃): 139,1 (C-5), 122,1 (C-6), 112,2 (C-20), 85,1 (C-14), 75,1 (C-12), 71,6 (C-3), 23,4 (C-21), 19,4 (C-19),

8,9 (C-18)

Příklad 13

3S,12S,14fi-Trihydroxypregn-5-en 15

Ethylendioxypregnen 25 (250 mg, 0,64 mmol) se rozpustí v kyselině octové (13,4 ml) a vodě a po vymrazení se získá trihydroxysteroid 15 (200 mg, 89 %), teploty tání 228 ⁰ až 235 °C, M+ 348, [a] ²⁰ + 35° (lit. [of] ²⁰ + 29 °) .

^ΤΗ NMR (CDC1₃): 5,39 (1H, m, H-6), 3,56-3,62 (1H, t, J = 8,1 Hz, H-17), 3,42-3,51 (1H, m, H-3), 3,28-3,29 (1H, dd, J = 4,3Hz, H-12), 2,23 (3H, S, H-21), 1,01 (3H, s, H-19), 0,90 (3H, s, H-18) ¹³C NMR (CDC1₃): 217,7 (C-20), 138,9 (C-5), 122,2 (C-6), 85,5 (C-14), 73,6 (C-12), 71,6 (C-3), 57,0 (C-17), 55,1 (C-13), 43,6 (C-9), 42,1 (C-4), 37,3 (C-l), 36,8 (C-10), 35,9 (C-8), 34,5 (C-15), 32,9 (C-21), 31,5 (C-16), 30,1 (C-2), 27,4 (C-7), 24,4 (C-ll), 19,4 (C-19), 8,3 (C-18).

Příklady 14 až 19 ilustrují syntetické postupy, kde se meziproduktové sloučeniny a steroid 15 mohou připravit podle druhého alternativního postupu.

Příklad 14

20,20-Ethylendioxy-3B-toluen-p-sulfonyloxypregn-5,14-άίβη-12β -ol acetát 26

Směs p-toluensulfonylchloridu (650 mg, 3,4 mmol) v ·· 9* • · · · • ·· • · · e • · · ···· ·· ·· *“· «* ·<· • * · ί » « * · • « · · • · · · • · «·

- 60 pyridinu (10 ml) se přidá po kapkách při teplotě 0 °C ke směsi 20,20-ethylendioxypregna-5,14-dien-3S,12S-diol 12-acetátu 22 (1,3 g, 3,1 mmol) v pyridinu (15 ml). Reakční směs se nechá stát při teplotě místnosti 24 hodin a potom se přidá k reakční směsi voda. Roztok se extrahuje ethylacetátem (2 x 50 ml), ethylacetátová vrstva se promyje kyselinou citrónovou (5 x 50 ml), nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (100 ml) , nasyceným roztokem chloridu sodného (100 ml) a vodou 100 ml). Ethylacetátová vrstva se suší (MgSO₄), filtruje a a po odpaření a čištění mžikovou chromatografií za použití směsi hexanu a ethylacetátu (8:2, objem./objem, jako eluantu se získá β-0-tosylsteroid 26 (1,5 g, 84 %) jako žlutý olej (nalezeno M 570,271, ^C32^H42°7^S vyžaduje: M 570,273).

δ_Η 1,021 (3H, 21-H), 2,021 m, OCH₂CH₂O), (1H, m, 30H) , (1H, m, 6-H), s, 19-H), 1,131 (3H, s, 18-H), 1,282 (3H, s, (acetátOCH₃), 2,431 (3H, s, Ar-CH₃), 3,883 (4H,

4,750 (1H, dd, ³ J 10,8 Hz, 5,2Hz, 12-H), 4,890

5,281 (1H, dd ³ J 4,2 Hz, 2,1 Hz, 15-H), 5,388

7,341 (2H, d, ³ J 8,2 Hz, ArH), 7,746 (2H, d, ³

J 8,2 Hz, ArH).

ó_c 13,439Q (C-18), 19,002Q (C-19) , 21,612Q (Ar-methyl)*, 21,671Q (C-21)*, 24,175Q (acetát methyl), 63,401T ethylendioxy), 63,498T (ethylendioxy), 71,531S (C-13),

80,912D (C-12), 82,531D (C-3), 111,363S (C-20), 120,881D (C-15), 121,461 (C-6), 123,715-133,917 (aromatický), 139,903S (C-4), 151,722S (C-5), 170,819S (ester karbonyl).

Příklad 15

20,20-Ethylendioxy-3a,5-cyklo-5a-pregn-4-en-6S,12S-diol-12-acetát 27

Roztok 3E-toluen-p-sulfonyloxypregn-5,14-dienu 26 (1,2 g, 2,1 mmol) a octanu draselného (2,2 g, 22,4 mmol) ve vodě (250 ml) a acetonu (500 ml) se zahřívá při zpětném toku na 60

- 61 °C po dobu 16 hodin. Aceton se odpaří a voda se extrahuje ethylacetátem (200 ml). Ethylacetát se suší (MgSO₄), filtruje a odpaří. Mžikovou chromatografickou separací směsi za použití směsi chloroformu a acetonu (9:1 objem./objem.) jako eluentu se získá 3a,5-cykloderivát 27 (530 mg, 61 %) jako žlutý olej (nalezeno M 416,262, C₂₅H₃₆O₅ vyžaduje: M 416,263).

Ó_H 0,288 (1H, dd, ³ J 8,1 Hz, 4,9 Hz, 4-H&), 0,477 (1H, dd, ³J 4,4 Hz, 4,4 Hz, 4-Hb), 1,025 (3H, s, 19-H), 1,121 (3H, s, 18-H), 1,256 (3H, s, 21-H), 1,989 (3H, s, acetát-CH₃), 3,02 (1H, dd, ³ J 2,8 Hz, 6-H), 3,784-3,947 (4H, m, OCH₂CH₂O), 4,721 (1H, dd, ³ J 8,5 Hz, 5,6 Hz, 12-H), 5,232 (1H, dd, ³ J 3,9 Hz, 1,9 Hz, 15-H) .

5_C 11,678T (C-4), 12,298Q (C-18), 19,971Q (C-19), 23,623Q (C-21), 24,153Q (acetát methyl) 63,700T (ethylendioxy), 63,788T (ethylendioxy), 73,591D (C-6), 80,551D (C-12), 111,126S (C-20), 118,778D (C-15), 152,959S (C-14), 170,991S (ester karbonyl).

Příklad 16

20,20-Ethylendioxy-3a,5-cyklo-5a-pregn-14-en-6S,12S-diol 28

Roztok 3a,5-cykloderivátu 27 (500 mg, 1,2 mmol) v tetrahydrofuranu (20 ml) se přidá po kapkách k suspenzi lithiumaluminiumhydridu (50 mg, 1,3 mmol) v tetrahydrofuranu (10 ml). Reakční směs se míchá 4 hodiny a potom se ochladí přidáním vody (50 μΐ) . Po 30 minutách se přidá hydroxid sodný (15% roztok, 50 μΐ) a míchání pokračuje dalších 30 minut. Přidá se voda (150 μΐ) a reakční směs se filtruje. Tetrahydrofuran se suší (MgS0₄), filtruje a odpaří a čištěním mžikovou chromatografií za použití chloroformu a acetonu (8:2 objem./objem) jako eluantu se získá diol 28 (370 mg, 83 %) jako olej (nalezeno M 374,250, C₂₃H₃₄O₄ vyžaduje M 374,252).

·· ·· ·· ·· ·· ·· ···· · · · · ···· • ·· ·· · ····

- 62 δ_Η 0,298 (1Η, dd, ³ J 8,1 Hz, 4,9 Hz, 4-¾), 0,510 (1H, dd, ³J 4,4 Hz, 4,4Hz, 4-¾) , 0,985 (3H, s, 19-H) , 1,055 (3H, s, 18-H) 1,325 (3H, s, 21-H) , 3,318 (1H, dd ³ J 3,0 Hz, 3,0 Hz, 6-H) , 3,363 (1H, dd, ³ J 11,4 Hz, 4,2 Hz, 12-H), 4,019 (4H, m, OCH₂CH₂O), 4,622 (1H, s, OH), 5,255 (1H, dd, 3 J 3,9 Hz, 1,9 Hz, 15-H).

5_C 11,681T (C-4), 12,243 (C-18), 19/844Q (C-19), 23,604Q (C-21), 63,620T (ethylendioxy), 63,733T (ethylendioxy),

73,569D (C-6), 77,478D (C-12), 111,125S (C-2), 118,702D (C-15), 152,912S (C-14).

Příklad 17

20,20_Ethylendioxy-14,15S-epoxy-3oí, 5-cyklo-5cY, 14S-pregnan-6S,12S-diol 29

N-bromacetamid (150 mg, 1,1 mmol) se přidá při 0 °C k roztoku 20,20-ethylendioxy-3a, 5-cyklo-5o!-pregn-14-en-6S,12S-diolu 28 (340 mg, 0,91 mmol) v acetonu (20 ml), vodě (0,25 ml). Po 15 minutách se přidá k reakční směsi siřičitan sodný (5% roztok, 20 ml). Aceton se odpaří za sníženého tlaku a zbývající roztok se extrahuje s dichlormethanem (3 x 30 ml). Dichlormethanová vrstva se suší (MgSO^), filtruje a odpaří na koncentrovaný objem (50 ,ml). Ke směsi se přidá pyridin (0,5 ml) a směs se míchá další hodinu a potom se dichlormethanová vrstva promyje roztokem kyseliny citrónové (5%, 3 x 30 ml), nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (30 ml) a vodou (30 ml). Dichlormethanová vrstva se suší (MgSO₄), filtruje a odpaří a čištěním mžikovou sloupcovou chromatografií za použití směsi chloroformu a methanolu (9,5:0,5 objem./objem) jako eluantu se získá epoxid 29 (180 mg, 51 %) jako pěna (nalezeno M 390,245, ^3^4^2 vyžaduje: M 390,247).

δ_Η 0,287 (1H, dd,

J 8,1 Hz, 4,9 Hz,

4-¾) , 0,501 (1H, dd,

- 63 ³ J 4,4 Hz, 4,4 Hz, 4-¾) , 0,978 (3H, s, 19-H), 1,048 (3H, s, 18-H), 1,321 (3H, S, 21-H), 3,318 (1H, dd, ³ J 3,1 Hz, 3,1 Hz, 6-H), 3,355 (1H, dd, ³ J 11,2 Hz, 4,1 Hz, 12-H), 3,491 (1H, s, 15-H), 4,001 (4H, m, OCH₂CH₂O), 4,901 (1H, S, H).

ó_c 11,668T (C-4), 11,973Q (C-18), 19,515Q (C-19), 23,519Q (C-21), 59,910D (C-15), 63,601T (ethylendioxy), 63,713T (ethylendioxy), 72,501S (C-14), 73,571D (C-6), 77,471D (C-12), 111,085S (C-20).

Příklad 18

20,20-Ethylendioxy-6E,12S,14-trihydroxy-3a,5-cyklo-5a,14β-pregnan 30

Roztok epoxidu 29 (170 mg, 0,44 mmol) v tetrahydrofuranu (10 ml) se přidá k suspenzi lithiumaluminiumhydridu (20 mg, 0,53 mmol) v tetrahydrofuranu (5 ml) . Reakční směs se zahřívá při zpětném toku 2 hodiny a přidá se voda (20 μΐ) a míchání pokračuje 0,5 hodiny. Přidá se roztok hydroxidu sodného (15%, 20 μΐ) a míchání pokračuje další 0,5 hodiny. Přidá se další množství vody (60 μΐ) a suspenze se míchá 1 hodinu. Po filtraci se suspenze suší (MgSO₄), filtruje a tetrahydrofuran se odpaří. Mžikovým chromatografickým rozdělením vzniklé směsi eluováním směsí chloroformu a methanolu (9:1 objem./objem.) se získá vyžadovaný triol 30 (90 mg, 53 %) jako čirý olej. (Nalezeno M 392,261, C₂₃H₃₈O₅ vyžaduje: M 392,263).

Ó_H 0,287 (1H, dd, ³ J 8,1 Hz, 4,9 Hz, 4-¾) 0,510 (1H, dd ³ J 4,4 Hz, 4,4 Hz, 4-¾) , 0,971 (3H, s, 19-H), 1,042 (3H, s, 18-H), 1,319 (3H, s, 21-H), 3,321 (1H, dd, ³ J 3,0 Hz, 3,0 Hz, 6-H), 3,321 (1H, dd, ³ J 11,1 Hz, 3,9 Hz, 12-H), 3,561 (1H, S, OH), 4,084 (4H, m, OCH₂CH₂O) 4,671 (1H, s, OH).

6_C 11,668T (C-4), 11,971Q (C-18), 19,511Q (C-19), 23,520Q • · • ·

- 64 (C-21), 63,612T (ethylendioxy), 63,711T (ethylendioxy), 73,483D (C-6), 76,051D (C-12), 84,307S (C-14), lll,099S (C-20) .

Příklad 19

3β, 12E, 14-Trihydroxy-14fi-pregn-5-en-20-on 15

Směs triolu 30 (80 mg, 0,20 mmol) v acetonu (20 ml) a kyselině chlorovodíkové (1M, 10 ml) se zahřívá při zpětném toku při 60 °C po dobu 2 hodin. Reakční směs se oddělí a přidá se nasycený roztok hydrogenuhličitanu sodného (20 ml). Aceton se odpaří a vodná vrstva se extrahuje s chloroformem (3 x 20 ml), chloroformová vrstva se suší (MgSO₄), filtruje a odpaří a získají se epimerní trihydroxysteroidy (15a, 15b) (42 mg, 61 %). Separace epimerní směsi 15a, 15b (15 mg) se provede chromatografickou separací za použití směsi chloroformu a methanolu (9:1 objem./objem.) jako eluentu ze získá čistý 17β-ερίϊΏΘΓ (15a) (10 mg) , teploty tání 224 až 229 °C (aceton), (lit. 226-223 °C) , (nalezeno M 348,234, C 72,32, H 9,21 % ^C21^H32°4 vyžaduje C, 72,38, H 9,26 %, M 348,236) a 17a-epimer 15B (3 mg), teploty tání 183-191 °C (aceton), (lit. 184 až 196 °C).

3β,12β,14-Trihydroxy-14fi-pregn-5-en-20-on 15a:

δ_Η 0,963 (1H, s, 19-H), 1,192 (3H, s, 18-H), 2,236 (3H, s, 21-H), 3,325 (1H, dd, ³ J 11,2 Hz, 3,9 Hz, 12-H), 3,464 (1H, S, OH), 3,5140 (1H, m, 3-H), 3,598 (1H, dd, ³ J 9,6 Hz, 9,6 Hz, 17-H), 4,255 (1H, s, OH), 5,383 (1H, m, 5-H).

č_c 8,275Q (C-18), 19,414Q (C-19), 24,400T (C-ll), 24,581T (C-16), 27,443 (C-7), 30,062T (C-2), 32,972Q (C-21), 34,543T (C-15), 35,864D (C-8), 36,975S (C-10), 37,337T (C-l), 42,144T (C-4), 43,565D (C-9), 55,101S (C-13), 57,038D (C-17), 71,597D (C-3), 73,558D (C-12), 85,566S (C-14), 122,223D (C-6),

138,932S (C-5), 217,011S (C-20).

3β,12β,14-Trihydroxy-14fi-pregn-5-en-20-on 15b:

δ_Η 0,996 (1H, S, 19-H), 1,144 (3H, s, 18-H), 2,221 (3H, S, 21-H), 3,339 (1H, dd, ³ J 9,4 Hz, 9,4 Hz, 17-H), 3,492 (1H, m, 3-H), 3,629 (1H, dd, ³ J 11,1 Hz, 3,9 Hz, 12.H), 3,712 (1H, s, OH), 4,325 (1H, s, OH), 5,383 (1H, m, 5-H) .

Příklady 20 až 28 ilustrují postupy pomocí kterých se mohou připravit meziproduktové sloučeniny k přípravě prvního monosacharidu 40.

Příklad 20

Methyl-4,6-O-benzyliden-a-D-glukopyranosid 32

Směs methyl-a-D-glukpyranosidu (30 g, 0,15 mol), benzaldehydu (70 ml) a chloridu zinečnatého (20 g) se míchá při teplotě místnosti 24 hodin. Reakční produkt se vlije do vody a míchání pokračuje 15 minut. Bílá sraženina se filtruje a promyje se diethyletherem. Pevná látka se míchá s roztokem metasiřičitanu sodného (10% roztok) po dobu 15 minut, filtruje se a promyje se s vodou. Pevný materiál se krystaluje z chloroformu a etheru a získá se benzylidenový produkt 32 (31 g, 72 %).

Příklad 21

Methyl-4,6-0-benzyliden-2-0-tosyl-a-D-glukopyranosid 33 p-Toluensulfonylchlorid (25 g, 1,2 ekv.) v pyridinu (100 ml) se přidá po kapkách při teplotě 0 °C k roztoku benzylidenglukózy 32 (31 g, 0,12 mol) v pyridinu (100 ml). Reakční směs se míchá při teplotě místnosti 48 hodin a potom se přidá k reakční směsi led. Vzniklý bílý pevný materiál se promyje vodou a rekrystaluje se z horkého ethanolu a získá se .· · • ··

- 66 tosylovaná glukóza 33 (28 g, 60 %).

Přiklad 22

Methyl-4,6-0-benzyliden-3-0-methyl-oí-D-altropyranosid 34

Tosylát 33 (28 g, 64 mmol) se zahřívá v roztoku sodíku (7 g) v methanolu (150 ml) na teplotu 110 °C po dobu 48 hodin v autoklávu. Reakční nádoba se ochladí a k reakční směsi se přidá pevný oxid uhličitý. Po filtraci se methanol odpaří a pevný materiál se převede do vody. Vodná vrstva se extrahuje chloroformem (3x). Chloroform se suší (MgSO₄), filtruje a odpaří. Surová směs se čistí sloupcovou chromatografií na silikagelu eluováním směsí chloroformu a acetonu (9:1) a získá se altrosid 34 (10 g, 52 %).

Příklad 23

Methyl-6-brom-4-O-benzoyl-3-O-methyl-6-deoxy-a-D-altropyranosid 35

Benzyliden altrosid 34 (10 g, 33 mmol) se přidá k roztoku N-bromsukcinimidu (7,6 g) a uhličitanu barnatého (20 g) v chloridu uhličitém a reakční směs se zahřívá při zpětném toku na 75 °C po dobu 3 hodin. Reakční směs se filtruje a tetrachloruhličitová vrstva se promyje vodou. Organická vrstva se suší (MgS0₄), filtruje a odpařením se získá 6-brom-altrosid 35 (9 g, 69 %).

Příklad 24

Methyl-4-O-benzoyl-3-O-methyl-6-deoxy-a-D-altropyranosid 3 6

Borohydrid sodný (18 g) ve vodě (30 ml) se přidá po kapkách při teplotě 0 °C k roztoku bromaltrosidu 35 (9 g, 23 mmol) a chloridu nikelnatému (18 g) v ethanolu (300 ml) .

• · • 9 9 »· 9 9

- 67 Reakční směs se zahřívá při teplotě zpětného toku na 75 °C po dobu 1 hodiny a potom se filtruje. Ethanol se odpaří a zbývající vodná vrstva se extrahuje chloroformem (3x).

Chloroform se suší (MgSO₄), filtruje a odpaří a získá se 6-deoxyaltrosid 36 (5 g, 72 %).

Příklad 25

4-0-Benzoyl-3-0-methyl-6-deoxy-a!S-D-fenylthioaltropyranosid 3 7

Fenylthiotrimethylsilan (5 ml) a trimethylsilyltrifluormethansulfonát (2 ml) se přidají při 0 °C k roztoku 6-deoxyaltrosidu 36 (5 g, 17 mmol) v dichlormethanu (200 ml). Reakční směs se míchá při teplotě místnosti 6 hodin. Potom se přidá k reakční směsi nasycený hydrogenuhličitan sodný. Dichlormethanová vrstva se suší (MgSO₄), filtruje a odpaří. Surová směs se čistí sloupcovou chromatografií na silikagelu eluováním směsí chloroformu a acetonu (9:1) a získá se αβ-fenylthioaltrosid 37 (4 g, 63 %) .

Příklad 26

4-0-Benzoyl-3-0-methyl-2 -f enylthio-2,6-dideoxy-aS-D-f luorocymaropyranosid 38

Diethylaminosulfurtrifluorid (0,65 g) se přidá rychle při 0 °C k roztoku αβ-fenylthioaltrosidu 37 (0,5 g, 1,33 mmol) v dichlormethanu. Reakční směs se míchá 0,5 hodiny při 0 °C a potom se přidá nasycený hydrogenuhličitan sodný.

Dichlormethan se oddělí od vodné vrstvy, suší se (MgSO₄), filtruje se a odpaří a získá se αβ-fluorcymaróza 38 (450 mg,

%) .

Příklad 27

4-O-Benzoyl-3-0-methyl-2-0-terč. butyldimethylsilyl-ceS-D• · · · • · · · • · · · • · · ·

-fenylthioaltrosici 39

6-Deoxyaltrosid 37 (5 g) se silyluje použitím terč.butyldimethylsilylchloridu (3 g) a imidazolu (3 g) v pyridinu (50 ml). Reakce se zpracuje extrakcí s ethylacetátem, promyje se ethylacetátem s kyselinou chlorovodíkovou (6 N), potom hydrogenuhličitaném sodným a konečně s vodou. Ethylacetátová vrstva se suší (MgSO₄), filtruje se a odpaří a získá silylovaný benzoylfenylthioaltrosid 39 (80 %).

Příklad 28

3-O-methyl-2-O-terč.butyldimethylsilyl-aS-D-fenylthioaltrosid 40

Silylovaný benzoyl fenylthioaltrosid 39 (6 g) se zpracuje methoxidem sodným (100 ml) po dobu 4 hodin. Methanol se odpaří a k reakční směsi se přidá voda. Vodná vrstva se okyselí (pH 5, AcOH) a extrahuje se ethylacetátem.

Ethylacetátová vrstva se promyje vodou, suší se (MgSO₄), filtruje a odpaří a získá se silylovaný methylfenylthioaltrosid 40 (75 %).

Příklady 29 až 37 ilustrují postupy pomocí kterých se mohou připravit meziproduktové sloučeniny k přípravě druhého monosacharidu 50.

Příklad 29

1,2 : 5,6-Di-O-isopropyliden-oí-D-glukofuranóza 42

Kyselina sírová (40 ml) se přidá po kapkách při 0 °C k roztoku a-D-glukózy 41 (50 mg, 0,28 mol) v acetonu (1 1). Reakční směs se míchá 24 hodin a potom se neutralizuje za použití hydroxidu sodného (6 M). Aceton se odpaří a vodná • · • · φ ·· vrstva se extrahuje s chloroformem (2x). Chloroform se suší (MgSO₄), filtruje a odpaří. Krystalizací z cyklohexanu se získá di-isopropylidenglukóza 42 (41 g, 57 %).

Příklad 30

1,2 : 5,6-Di-0-isopropyliden-3-0-methyl-oí-D-glukofuranóza 43 a-D-glukofuranóza 42 (41 g, 0,16 mol) v tetrahydrofuranu (300 ml) se přidá po kapkách k suspenzi hydridu sodného (5 g) v tetrahydrofuranu (200 ml). Po 0,5 hodině se přidá k reakční směsi methyljodid (25 g) v tetrahydrofuranu (100 ml) a reakční směs se míchá 24 hodin. K reakční směsi se přidá voda a směs se extrahuje etherem (3x). Etherová vrstva se suší (MgS0₄), filtruje a odpaří a získá se methyl chráněná glukóza 43 (38 g, 83 %).

Příklad 31

3-0-Methyl-oíS-D-glukopyranosid 44

Methyldiisopropylidenová sloučenina 43 (38 g, 0,14 mol) se rozpustí v kyselině octové (50%, 700 ml) a roztok se zahřívá při zpětném toku 18 hodin. Po ochlazení se odpaří kyselina octová. Surový produkt se čistí sloupcovou chromatografií eluováním směsí chloroformu, methanolu, acetonu a vody (70:27:2:1) a získá se 3-0-methyl-o;S-glukopyranosid 44 (13 g, 50 %).

Příklad 32

Methyl 3-0-methyl-aE-D-glukopyranosid 45

3-0-methyl-o!S-glukopyranosid 44 (10 g) se rozpustí v methanolu (50 ml) a koncentrované kyselině chlorovodíkové (1 ml) zahřívá se při zpětném toku přes noc. Přidá se pevný • · ·· • · · · · • ·· ·· ·*

NaHCO^ a reakční směs se filtruje. Methanol se odpaří a získá se 1,3-di-O-methyl-aS-D-glukopyranosid 45 (95 %).

Příklad 33

Methyl 4,6-0-benzyliden-3-0-methyl-chš-glukopyranosid 46

Glukopyranosid 45 (8 g) se míchá při teplotě místnosti v roztoku benzaldehydu (20 ml) a chloridu zinečnatého (5 g).

Po 24 hodinách se přidá led a vodná vrstva se extrahuje chloroformem. Chloroformová vrstva se suší (MgS0₄), filtruje a odpaří se. Benzalaldehyd se odstraní vakuovou destilací a produkt se čistí sloupcovou chromatografií na silikagelu eluováním směsí acetonu a chloroformu (0,5:9,5) a získá se benzyliden-aS-glukopyranosid 46 (60 %).

Příklad 34

Methyl 4-0-benzoyl-0-methyl-6-deoxy-aS-glukopyranosid 47

Benzylidenová sloučenina 46 (5 g) se zahřívá při zpětném toku při 80 °C ve směsi N-bromsukcinimidu (3,7 g) a uhličitanu barnatého (4 g) v chloridu uhličitém. Po 4 hodinách se reakční směs filtruje a chlorid uhličitý se promyje vodou, suší se (MgSO₄), filtruje a odpařením se získá bromsloučenina (70 %) .

Bromsloučenina (4,3 g) se rozpustí při 0 °C v roztoku ethanolu (300 ml) a chloridu nikelnatého (8,6 g). K tomuto roztoku se přidá po kapkách v průběhu 15 minut borohydrid sodný (8,6 g) ve vodě (50 ml). Reakční směs se zahřívá při zpětném toku při 100 °C po dobu 45 minut, ochladí se, filtruje a odpaří. Přidá se chloroform a chloroformová vrstva se promyje vodou, suší se (MgSO₄), filtruje a odpaří a získá se 6-deoxycukr 47 (70 %).

··

ί

- 71 Příklad 35

4-Ο-Benzoyl-3-O-methyl-1-fenylthio-6-deoxy-aS-glukopyranosid 48

6-Deoxyglukopyranosid 47 (3 g) se rozpustí v dichlormethanu (50 ml). K tomuto roztoku se přidá fenylthiotrimethylsilan (2 g) a trimethylsilyltrifluormethansulfonát (0,2 ml). Roztok se míchá při teplotě místnosti přes noc a potom se přidá nasycený hydrogenuhličitan sodný.

Dichlormethanová vrstva se suší (MgSO₄), filtruje a odpaří. Produkt se čistí sloupcovou chromatografií na silikagelu eluováním směsí ethylacetátu a hexanu (2:8) a získá se sloučenina 48 (60 %).

Příklad 36

4-0-Benzoyl-3-0-methyl-2-0-pivaloyl-l-fenylthio-6-deoxy-αβ-glukopyranosid 49

K roztoku glukopyranosidu 48 (2 g) v pyridinu (20 ml) se přidá pivaloylchlorid (2 ml). Roztok se míchá při teplotě místnosti přes noc a potom se přidá voda. Vodná vrstva se extrahuje ethylacetátem a organická vrstva se promyje HCI (6 N) . Organická vrstva se suší (MgS0₄), filtruje a odpařením se získá pivaloylester 49 (80 %).

Příklad 37

4-0-Benzoyl-3-0-methyl-2-0-pivaloyl-l-fluor-6-deoxy-E-glukopyranosid 50

N-Bromsukcinimid (1,2 g) a dimethylaminosulfur trifluorid (1,2 g) se přidají při 0 °C k roztoku pivaloylesteru 49 (2 g) v dichlormethanu (100 ml). Po 1 hodině se přidá nasycený hydrogenuhličitan sodný. Dichlormethanová vrstva se suší (MgSO₄), filtruje a odpaří.

·· ·« ·« ·· ·· ·♦ • · · φ · · φ · · · · φ ··· · * · φφφφ ·· φφφ · φ φφ φ φ · φ φφ φφφ ·ΦΦΦ φφφφ φφ φφ φφφφ φ· ·· β-Fluorpyranosid 50 se čistí sloupcovou chromatografiί na silikagelu eluováním směsí ethylacetátu a hexanu (2:8), (výtěžek 45 %).

Příklad 38 ilustruje postup, pomocí kterého se může připravit 3-0-[4-0-benzoyl-2-fenylthio-B-D-cymaropyranosyl] -12,14fi-dihydroxypregnan-5-en-20-on (51).

Příklad 38

3-0-[4-0-benzoyl-2-fenylthio-fi-D-cymaropyranosyl] -12,14β-dihydroxypregn-5-en-20-on 51

Chlorid cínatý (190 mg, 1 mmol) se přidá při teplotě -15 °C k roztoku 3,12,14fi-trihydroxypregnan-5-en-20-onu 15 (100 mg, 0,28 mmol) a fluorcymaropyranosidu 38 (210 mg,

0,56 mmol) v suchém diethyletheru a 4A molekulárních sít. Reakční směs se udržuje při -15 °C po dobu 3 dnů. K reakční směsi se přidá nasycený hydrogenuhličitan sodný. Etherová vrstva se suší (MgS0₄), filtruje a odpaří. Produkt se čistí sloupcovou chromatografií na silikagelu eluováním směsí chloroformu a methanolu (9,5:0,5) a získá se glykosid 51 (30 mg, 15 %) .

Příklad 39 až 41 ilustrují syntetické postupy pomocí kterých se mohou kopulovat cymarosové a thevetosové části.

Příklad 39

Thevetoso-cymarosový disacharid 53

Roztok thevetosy 50 A (1,5 g), cymarosy 40 (1,3 g) a molekulárních sít 4A v dichlormethanu se míchá při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny. Reakční směs se ochladí na -15 °C a přidá se chlorid cínatý (0,8 g) a trifluormethansulfonát stříbrný (1,1 g) . Směs se míchá při -15 °C po dobu 16 hodin a přidá se triethylamin (0,5 ml). Reakční produkt se filtruje a dichlormethan se odpaří. Disacharid se čistí sloupcovou chromatografií na silikagelu eluováním směsí ethylacetátu a hexanu (2:8), výtěžek 15 %.

Příklad 40 • Ί ·· • · * · • ·· • · · •··· *· ·« ·· ·· ·· • ·· · · · · · • » · · β · ř • · ··«·*· • · · · · · · ·· ·♦·* ·* ··

Thevetoso-cymarosový disacharid 54

K roztoku disacharidu 53 (200 mg) v tetrah-yrofuranu (20 ml) se přidá tetrabutylamoniumfuorid (0,4 ml). Směs se míchá při teplotě místnosti 1 hodinu a přidá se nasycený hydrogenuhličitan sodný. Reakční směs se extrahuje ethylacetátem a a ethylacetátová vrstva se suší (MgS0₄), filtruje a odpaří. Disacharid 54 se čistí sloupcovou chromatografií na silikagelu směsí acetonu a chloroformu (0,5:9,5), výtěžek 60 %.

Příklad 41

Thevetoso-cymarosový disacharid 55

K roztoku disacharidu 54 (80 mg) v dichlormethanu (10 ml) se přidá při 0 °C diethylaminosulfurtrfluorid (80 μΐ). Směs se míchá při 0 °C po dobu 0,5 hodiny a přidá se nasycený hydrogenuhličitan sodný a více dichlormethanu. Dichlormethan se suší (MgSO₄), filtruje a odpaří. Čištěním sloupcovou chromatografií na silikagelu (ethylacetát:hexanu =1:9) se získá disacharid 55 v 65% výtěžku.

Příklad 42

Výsledky následujících biologických zkoušek na snížení chuti k jídlu jsou uvedeny dále, viz

a) Irwinův test;

b) Test na akutní toxicitu; a ·· φ« • « • #· ·« ·* · · * · • ♦ · • · · ·· ···«.

»♦ ·» • 9 · * • · · · • · · * • · · · ·· ·«

c) Test na anorektickou orální dávku.

a) Irwinův test

Účelem tohoto testu bylo hodnocení činidla snižující chuť k jídlu podle vynálezu, získaného z rostlinného extraktu jak je popsáno shora podle Irwinova testu sledujícího trankvilizační a sedativní účinky.

Experimentální postup

Činidlo snižující chuť k jídlu se extrahuje z rostlinného materiálu podle metody popsané shora a podá se dvěma ze čtyř skupin zvířat, přičemž každá skupina obsahuje tři zvířata: jedna skupina se neošetřuje, jedné skupině se podá dimethylsulfoxid (DMSO), jedné skupině se podá zkušební vzorek v dávce 50 mg/kg a jedné skupině se podá zkušební vzorek v dávce 300 mg/kg. Ošetření se provede intraperitoneální injekcí a pozorování se provádí ve specifických intervalech do pěti hodin po podání. Při interpretaci výsledků se sledují pouze ty symptomy, které jsou jiné než byly pozorovány u zvířat ošetřených DMSO.

Výsledky

Je zřejmé, že rozpouštědlo, DMSO, má značný účinek na zvířata, zejména na mechanismus regulující teplotu. Tělesná teplota všech zvířat ošetřených s rozpouštědlem, samotným nebo s rozpouštědlem s testovaným vzorkem vykázala značný pokles.

Zvířata ve skupině, která byla ošetřena nižší dávkou testované sloučeniny se projevovala sníženým rozptýlením v kleci a sníženou pohybovou aktivitou, jako ve všech ostatních skupinách, včetně kontrolní skupiny. Apatie byla pozorována na stejné úrovni jako u skupiny ošetřované DMSO.

• ·

- 75 Snížené dýchání bylo pozorováno 15 až 60 minut po ošetření. Ptóza (pokles očních víček) byl také pozorován ve větším stupni než u skupiny ošetřené DMSO. Reakce na ušním boltci byla pozitivní stejně jako odezva na prst a ukazovala bázlivost. Tělesná teplota po zpracování na 32,7 °C.

Zvířata ve skupině, která byla ošetřena vysokou dávkou testované sloučeniny se projevovala počátečním sníženým rozptýlením v kleci a sníženou pohybovou aktivitou, ale před smrtí, ke které došlo 1 hodinu po ošetření se projevovala zvýšeným rozptýlením a zvýšenou aktivitou. Po 30 minutách po ošetření došlo k vážným klonickým symetrickým křečím. Dýchání se na počátku snížilo, ale zvýšilo se před smrtí. Reakce na ušním boltci byla zpožděna, odezva na prst byla pozitivní a ukazovala bázlivost, jak bylo pozorováno u zvířat ošetřených nízkou dávkou. Tělesná teplota poklesla po ošetření na 30,7 °C. Byla pozorována zvýšená poziční aktivita a rovněž snížený tonus. Byla pozorována abnormální rotace končetiny, síla sevření se snížila, žádná bolestivá odezva a došlo ke ztrátě vzpřimovacího reflexu.

Diskuse

Při porovnání s kontrolním vzorkem a DMSO ošetřenými zvířaty, zvířata, která byla ošetřena pouze nízkou dávkou (50 mg/kg) vykazují snížené dýchání a zvýšený stupeň ptózy. Zvířata, která obdržela vysokou dávkou (300 mg/kg) testovaného vzorku reagovala velmi intenzivně a tato reakce se projevila křečemi a smrtí. Všechna ostatní pozorování provedená u těchto zvířat se připisují zvířatům, která byla v křečích a umírala. Signály naznačující uklidňující a sedativní působení, jako značně snížené rozptýlení v klecích, sníženou pohyblivost a apatii u testovaných skupin, které by se mohly připsat testovanému vzorku nebyly pozorovány.

Závěrem se může uvést, že testovaný vzorek je smrtelný • · u myší v dávce 300 mg/kg a způsobuje snížené dýchání u myší při dávce 50 mg/kg, pokud se podá intraperitoneálně s DMSO jako rozpouštědlem.

b) Test na akutní toxicitu

- 76 Účelem tohoto testu bylo získání informací o toxicitě vzorku.

Experimentální postup

Rostlinný extrakt připravený podle vynálezu jak je popsáno shora a působící snížení chuti k jídlu se čistí a jeden testovaný vzorek se zkouší při zvýšené dávce orálním ošetření myší. Při zkoušce se použila dvě zvířata ve skupině, s výjimkou, že při nejvyšší dávce se ošetřilo pouze jedno zvíře. Zvířata byla zkoumána na dobrý zdravotní stav a jejich tělesné hmotnosti byly stanoveny v den ošetření.

Podané dávky byly v rozsahu 100 mg/kg až do 3 028,5 mg/kg. Dávky byly stanoveny a smíchaly se s bramborovým škrobem tak, že každé zvíře dostalo celkovou dávku ve výši 0,2 ml. Zvíře č. 13 obdrželo 0,25 ml. Bramborový škrob se připravil smícháním 20 g škrobu s malým množstvím studené vody a přidala se vroucí voda, tak aby objem byl 1 litr. Před dávkováním se suspenze nechala ochladit na teplotu místnosti.

Zvířata v 1. a 2. skupině se ošetřila ve stejný den. Zvířata byla pozorována 24 hodin a pokud se neobjevily žádné příznaky toxicity, ošetřila se další skupina. Stejný postup pokračoval, dokud se neošetřila všechna zvířata. Tímto způsobem se dosáhlo, že zvířata nebyla nezbytně ošetřena, pokud akutní toxická dávka byla dosažena v předchozí skupině.

Zvířata byla pozorována na klinické příznaky toxicity ihned (1 až 2 hodiny) po ošetření a poté denně. Tělesná

·· · · · · · · · · · · • a « ··· ···· ···· ·· ·· ···· ·· ··

- 77 hmotnost se měřila jedenkrát týdně a rovněž se měřila u každého zvířete celková spotřeba potravy a vody.

Žijící zvířata byla euthanazována intraperitoneální injekcí pentobarbitonu sodného (komerčně dostupný pod obchodním jménem Euthanaze, Centaur^R) 14. den pokusu. Potom se provedlo u těchto zvířat posmrtné vyšetření, stejně tak jako u zvířat, která zemřela během pokusu. Sebraly se vzorky pro histopatologii.

Výsledky

Skupina 1 (kontrolní skupina)

Během 14 denní periody pozorování nebyly pozorovány žádné klinické příznaky toxicity. Spotřeba potravy a vody byla v normálních parametrech. Změny v tělesné hmotnosti byly rovněž v normálních parametrech. Žádné histopatologické změny nebyly zjištěny u vzorku jater.

Skupina 2 (100 mg/kg)

Během periody pozorování nebyly pozorovány žádné klinické příznaky toxicity. Spotřeba potravy a vody byla normální, změny v tělesné hmotnosti byly rovněž normální. Žádná makroskopická patologie nebyla pozorována a žádné histopatologické nebo makrofologické změny nebyly zjištěny u vzorku jater.

Skupina 3 (200 mg/kg)

Zvířata v této skupině nevykazovala žádné klinické symptomy toxicity během experimentu. Spotřeba vody a potravy byla normální, stejně tak změny v tělesné hmotnosti. Nebyla pozorována žádná makroskopická patologie, ale játra vykazovala při vyšetření histopatologické změny. Zakalené zduření hepatocytů bylo jemné u zvířete č. 6, ale mírné u zvířete č. 5. Mírná hydropická degenerace se také vyskytuje v hepatocytech zvířete č. 5.

Skupina 4 (400 mg/kg)

Během pozorování nebyly zjištěny žádné klinické příznaky toxicity a žádná makroskopická patologie nebyla zjištěna při posmrtném vyšetření. Na histologii byl zjištěno mírné zakalené zduření a jemné hydropické změny hepatocytů.

Příjem vody a potravy a zvýšení tělesné hmotnosti u zvířete č. 7 bylo normální. Zvíře č. 8 spotřebovalo téměř dvojnásobek celkového množství potravy zvířete č. 7 (144,6 g respective 73,9 g), ale zvýšení v tělesné hmotnosti bylo pouze 0,81 g ve srovnání s 2,7 g.

Skupina 5 (800 mg/kg)

Jedno zvíře (zvíře č. 10) zemřelo tři hodiny po dávkování, aniž vykázalo nějaké specifické příznaky. Další zvíře (zvíře č. 9) přežilo celou periodu pozorování bez příznaků toxicity. Spotřeba vody u zvířete, které přežilo byla normální (42,42 ml), zatímco spotřeba potravy byla vysoká (134,2 g) . Tělesná hmotnost se zvýšila o 2,85 g, což představovalo nejvyšší zvýšení ze zvířat, která se zúčastnila pokusu.

Posmrtné vyšetření zvířete č. 10, které zemřelo krátce po podání ukázalo na překrvené plíce. Žádná cizí tělesná reakce, která by indikovala inhalaci testovaného materiálu nebyla zjištěna. Žádná patologie nebyla pozorována u zvířete č. 9. Jemná cytoplasmická vacuolizace (hydropická degenerace) se nevyskytovala u zvířete č. 10, ale mírná u zvířete č. 9. Žlázový cytoplasmický vzhled jater byl klasifikován u obou zvířat jako mírný.

·· ·· ·· ·· ·· ·· ·· · · · · · · · · · • ·· ·· · ····

- 79 Skupina 6 (1600 mg/kg)

Žádné z přítomných zvířat nevykazovalo jakékoliv příznaky toxicity během trvání pokusu. Při posmrtném vyšetření nebyla pozorována žádná makroskopická patologie, ale mírné degenerativní změny na játrech byly při histopatologickém vyšetření pozorovány u zvířete č. 11. Zvíře č. 12 vykázalo mírné zakalené zduření a mírné hydropické změny hepatocytů. spotřeba potravy a vody byla normální, rovněž zvýšení tělesné hmotnosti.

Skupina 7 (3028,5 mg/kg)

Touto dávkou bylo ošetřeno pouze jedno zvíře. U tohoto zvířete nebyly zjištěny žádné příznaky toxicity během pokusu a rovněž nebyla pozorována žádná makroskopická patologie.

Při histopatologickém vyšetření bylo nalezeno mírné zakalené zduření a hydropní degenerace hepatocytů. Zvířata vykazovala během pozorování ztrátu tělesné hmotnosti (-0,82 g) , ale spotřeba potravy a vody byla normální.

Diskuse

Vzhledem k tomu, že se použilo v každé skupině pouze velmi malé množství zvířat, je obtížné dělat jakékoliv závěry. Skutečnost, že zemřelo při pokusu pouze jedno zvíře při nízké dávce bez jakýchkoliv symptomů může indikovat, že ke smrti nedošlo v souvislosti s testovaným vzorkem ale v důsledku stresu během a/nebo po ošetření. Žádné zvíře ve vyšší dávkové skupině nezemřelo nebo nevykázalo jakékoliv příznaky toxicity, což opět podporuje tuto domněnku.

Zvýšená potřeba potravy pozorována u zvířete 8 by mohla být přisuzována nadměrnému rozlití potravy, jak vyplývá z malého zvýšení tělesné hmotnosti. Je třeba vzít v úvahu, že

všechna zvířata v experimentu byla ošetřena pouze jednou, a že je nepravděpodobné, že činidlo snižující chuť. k jídlu bude mít značný vliv na spotřebu potravy nebo vody nebo tělesnou hmotnost během 14 denní periody, což je případ této zkoušky.

Z histopatologického vyšetření vzorku jater je zřejmé, že patologické změny jsou závislé na dávce, zvířata, která dostala vyšší dávku vykazují větší změny. Pozorovaná patologie nebyla metabolické povahy, ale pravděpodobně byla způsobena testovaným vzorkem. Změny byly pouze degenerativního charakteru a proto vratné. Nebyly pozorovány žádné ireversibilní hepatocelulární změny.

Můžeme shrnout, že zemřelo pouze jedno zvíře při nižší dávce (800 mg/kg), ale jeho smrt nebyla pravděpodobně způsobena testovaným vzorkem. Žádné další zvíře v kterékoliv dávkové skupině nevykazovalo jakékoliv příznaky během 14. denního pozorování po ošetření nebo nezemřelo jako výsledek ošetření. Jedna orální dávka testovaného vzorku zavedla reversibilní hepatocelulární změny závislé na dávce.

c) Anoretický test na orální dávku

Účelem tohoto testu bylo určení aktivity rostlinného extraktu připraveného podle vynálezu a minimální účinnou dávku a ve stejnou dobu prozkoumat jakékoliv postranní účinky, jako je snížené dýchání, jak bylo poznáno v Irwinově testu shora.

Experimentální postup

Zvířata byla rozdělena do skupin náhodným způsobem. Každá ošetřovaná skupina se skládala ze tří zvířat, v kontrolní skupině bylo 6 zvířat. Testovaný vzorek byl dávkován mladým samičkám krys s tělesnou hmotností 100 až 150 g při aklimatizaci po dobu tří po sobě jdoucích dnů. Zvířata

byla pro snadnou identifikaci označena kovovými kroužky a kůže byla označena KMnO₄. Zvířata byl umístěna individuálně ve standardních polykarbonátových klecích a voda a práškové komerční pelety pro živočichy byly dostupné dle libosti. Spotřeba vody a potravin byly měřeny a počítány každý den. Za účelem minimální účinné dávky testovaného vzorku bylo testováno pět dávek. Ošetření bylo orální s testovaným vzorkem suspendovaným v bramborovém škrobu.

Testovaná substance byla sloučenina 1, ve formě bílého granulového prášku připravená z extraktu z rostlinného materiálu podle vynálezu a odměřené množství testovaného vzorku se smíchalo s připraveným bramborovým škrobem a dávkovalo se. Smíchání s bramborovým škrobem se provedlo každý den, těsně před dávkováním. Před přípravou dávkového objemu pro každé zvíře se suspenze důkladně smíchala za použití Vortex.

Byl testován rozsah pěti dávek s kontrolní skupinou, která dostala pouze nosičovou substanci. Dávky byly vybrány na základě účinků zjištěných u shora popsaného Irwinova testu a byly následující:

Skupina 1: 0,00 mg/kg (kontrolní skupina)

Skupina 2: 6,25 mg/kg

Skupina 3: 12,50 mg/kg

Skupina 4: 25,00 mg/kg

Skupina 5: 37,50 mg/kg

Skupina 6: 50,00 mg/kg

Výsledky

Ošetření neovlivnilo zdravotní stav zvířat během studované periody. Zvířata ošetřená s testovaným vzorkem ve všech dávkových skupinách vykázala podstatně sníženou průměrnou tělesnou hmotnost získanou v průběhu celé studované periody a zvířata ve třech z pěti ošetřených skupin skutečně ztratila tělesnou hmotnost.

Průměrná spotřeba potravin se u všech ošetřených skupin během periody snížila. Zvířata ve vyšších dávkových skupinách měla zvýšenou spotřebu vody.

Rychlost dýchání nebyla žádného zvířete v kterékoliv dávkové skupině ovlivněna.

Zvířata ve všech dávkových skupinách měla při posmrtném vyšetření drobivá játra, ale žádná makroskopická patologie nebyla pozorována.

Diskuse

Data sebraná během aklimatizační periody potvrdila, že všechna zvířata zahrnutá do pokusu byla zdravá a tělesná hmotnost byla mezi jednotlivými zvířaty srovnatelná.

Snížení a v některých případech dokonce ztráta v tělesné hmotnosti v kombinaci se sníženým příjmem potravy je silně příznačná se snížením chuťi k jídlu.

Snížení příjmu potravy a poznaná snížená tělesná hmotnost byla nalezena dokonce i v nejnižší dávkové skupině (6,25 mg/kg). Aktuální ztráta tělesné hmotnosti byla nalezena ve skupině s dávkou 12,50 mg/kg.

Je důležité uvést, že všechny ošetřené skupiny měly zvýšenou spotřebu vody a sníženou spotřebu potravy (obrázek 2). Toto by mohlo být v důsledku diuretického účinku testovaného vzorku nebo stimulace třetího centra v mozku.

Positivním aspektem je skutečnost, že nedošlo ke snížení dýchání, jak bylo pozorováno, při testu akutní

toxicity, uvedeném shora s intraperitoneální cestou. Toto by mohlo být v důsledku snížené absorpce z gastrointestinálního traktu, s následnou sníženou biologickou dostupností. Biologická dostupnost při orálním dávkování byla, nicméně dostatečná, aby testovaný vzorek byl účinný. Slabé snížení rychlosti dýchání 1 hodinu po ošetření u většiny skupin by mohla být připsána naplnění žaludku dávkovaným objemem a následnou pasivitou zvířat.

Drobivá játra pozorovaná u ošetřených skupin by mohla být způsobena v důsledku změn metabolismu v závislosti na sníženém příjmu potravy, což způsobilo zvýšený metabolismus tuků a přetížení jater. Pokud tento předpoklad platí, tyto změny mohou být považovány za přechodné, které přestanou s časem po dosažení stabilního stavu nebo po přerušení pokusu. Možný účinek na játra vyžaduje další výzkum.

Jelikož byla tato studie pojata primárně jako zkušební test, bylo použity malé skupiny testovaných zvířat. To činí statistické vyhodnocení dat obtížným, zejména jestliže jednotlivá zvířata reagují zcela odlišně. Nicméně data indikují, že testované vzorky působí jako činidla snižující chutí k jídlu, dokonce i v nej nižších testovaných dávkách (6,25 mg/kg). V rámci testu nedošlo k žádným klinickým příznakům snížení dýchání.

Příklad 43

Sklizené rostliny Hoodia získané buď z přírody nebo kultivačním programem jsou nejprve uchovány při teplotě 4 °C maximálně 48 hodin. Rostliny se omyjí pod vodovodním kohoutkem a nařežou se na řízky cca 1 cm. Řízky se spojí a lisují na hydraulickém lisu při tlaku 303 MPa minimálně 0,5 hodiny. Během lisování se odděleně sebere šťáva z rostlin. Šťáva se uchovává při -18 °C do dalšího zpracování.

• 9

9 • 9 « · 9

99 9

9 9 9 9

9999 ·· 99

Šťáva se suší roztřikováním při vhodných podmínkách a získá se tekoucí prášek. Obsah vlhkosti v prášku je výhodně méně než 5 % po sušení rozprašováním a je-li to nezbytné, dále se suší ve vakuové peci nebo za použití sušárny s fluidním ložem.

Jak štáva, tak materiál sušený rozprašováním jsou účinná jako činidla snižující chuť k jídlu v biologických zkouškách u krys.

Experiment kg rostlin Hoodia gordonii se omyje pod vodovodním kohoutkem a nařežou se na řízky cca 1 cm . Řízky se spojí a lisují na hydraulickém lisu při tlaku 303 MPa minimálně 0,5 hodiny. Štáva se sebere a její zjištěná hmotnost činí v případě použití přírodních rostlin Hoodia gordonii 10 kg a v případě použití rostlin Hoodia gordonii z kultivačního programu činí 20 kg. Šťáva (500 g) se suší rozprašováním při následujících podmínkách:

Rychlost proudu	: 2,85 ml/min
Vstupní teplota	: 110 °C
Výstupní teplota	: 70 °C
Teplota komory:	: 78 °C

Prášek získaný rozprašováním byl volně tekoucí prášek (22 g) s obsahem vlhkosti 6,9 %.

Prášek sušený rozprašováním se analyzoval na koncentraci aktivní složky za použití technik HPLC. Bylo zjištěno, že koncentrace aktivní složky je 13 g/kg prášku získaného sušením rozprašováním.

Metoda HPLC analýzy • · • · * · • ·

Eluant

Kolona

Absorbance

Průtoková rychlost : 1 ml/min Injekční objem : 10 μΐ

Acetonitril:voda (7:3), isokratický Reverzní fáze C-18 225 nm

Metoda

Prášek získaný sušením rozprašováním se rozpustí ve vodě (0,5 ml) a acetonitrilu (0,5 ml). 10 μΐ tohoto roztoku se injektuje do HPLC a stanoví se koncentrace aktivní sloučeniny za použití křivky, která se připraví z čisté sloučeniny 1.

Příklad 44

Výsledky studie navržené ke stanovení možných anoretických účinků sloučeniny 1 u krys jsou uvedené dále. V následujícím jsou uvedeny testované vzorky jako čistá štáva (vzorek 1), vzorek získaný sušením rozprašování šťávy (vzorek 2) a aktivní část (vzorek 3). Vzorky 1 a 2 jsou šťáva a látka získaná sušením rozprašováním jak je popsáno v příkladu 43 shora. Vzorek 3 je sloučenina extrahovaná rozpouštědlem (s 95% čistota).

Krysy Wistar se ošetřily jednou orální dávkou za použití vzorků 1 až 3 . Dvěma dalším kontrolním skupinám se dalo vehikulum (destilovaná voda nebo DMSO). Jako referenční standard se podal orálně fenfluramin (7,5 mg/kg).

Vzorek 1 (čistá šťáva) podávaný orálně, produkoval na dávce závislou redukci ve spotřebě potravy, která byla, ve srovnání s kontrolou, kde se dávkovalo vehikulum, statisticky podstatná při dávkách 1600 mg/kg a -výše. Průvodní snížení v tělesné hmotnosti (nebo rychlost růstu) se rovněž zaznamenávaly. V den dávkování se zaznamenala statisticky podstatná spotřeba vody 3 hodiny po dávkování (6400 mg/kg ΐ

»φ φφ φφ ·· φ φ φ φ φ φ · φ φ φφφφ a 1000 mg/kg) a 6 hodin po dávkování. Mezi 24 a 48 hodin po dávce došlo ke statisticky významnému snížení spotřeby vody při dávkách 3200 mg/kg a výše.

Vzorek 2 (látka získaná rozprašováním šťávy) podaná orálně v množství 76 mg/kg rovněž produkoval, při srovnání se zvířaty ošetřenými vehikulem, statisticky významné snížení ve spotřebě potravy a tělesné hmotnosti. Žádné statisticky významné účinky na spotřebu vody nebyly zaznamenány.

Vzorek 3 (aktivní část) produkoval statisticky významné snížení spotřeby potravy při orální dávce 5,0 mg/kg. Žádné statisticky významné účinky na tělesnou hmotnost nebyly aktivní částí dosaženy, ačkoliv zkoumání dat odkrylo slabé zpoždění v růstu v porovnání s kontrolními zvířaty ošetřenými vehikulem. Rovněž nebyly zaznamenány žádné statisticky významné účinky na spotřebu vody.

Referenční standard, fenfluramin (7,5 mg/kg) produkoval statisticky významné snížení potravy po 6 a 24 hodinách od dávky ve srovnání s kontrolou ošetřenou vehikulem. Žádné statisticky významné účinky na spotřebu vody nebo tělesné hmotnosti nebyly zaznamenány.

Nebyly zaznamenány žádné účinky na játra způsobené ošetřením.

·· ·· ·· fcfc ·· •••fc ···· ···· ··· ·· · ···· ••♦«fcfc ······ • fcfc ··· fc·· · ···· ·· ·· ···· ·· ··

Testovaná substance

Identita

Vzorek 1 (čistá šťáva) Vzorek 2 (látka získaná sušením rozprašováním šťávy)

Vzorek 3 (aktivníčást)

Vzhled Hnědá kapalina Podmínky skladování ;20°C ve tmě Čistota Čistá šťáva

Vehikulum Destilovaná voda

Prášek Bílý prášek

Teplota místnosti ve tmě 4°C ve tmě

Čistá látka získaná sušením rozprašováním šťávy >95 %

Destilovaná voda Dimethylsulfoxid

Experimentální postup

Ke studii bylo použito padesát pět krys Wistar

Tělesná hmotnost, spotřeba potravy (hmotnost zásobníku na potravu) a spotřeba vody (hmotnost nádoby) se zapisují denně ve stejnou dobu každý den od začátku do konce studie.

První den dostaly krysy jednu orální dávku podle následující tabulky:

Skupina	n	Orální ošetření	Dávka (mg/kg)
1	5	Vehikulum (destilovaná voda)	-
2	4	Vzorek 1 (čistá šťáva)	800
3	5	Vzorek 1 (čistá šťáva)	1600
4	5	Vzorek 1 (čistá šťáva)	3200
5	5	Vzorek 1 (čistá šťáva)	6400
6	5	Vzorek 1 (čistá šťáva)	10000
7	5	Vzorek 2 (látka získaná sušením rozprašováním šťávy	38
8	5	Vzorek 2 (látka získaná sušením rozprašováním šťávy	76
9	5	Vzorek 3 (aktivní část)	2,5
10	5	Vzorek 3 (aktivní část)	5,0
11	3	Fenfluramin	7,5

• ·

3 Vehikulum (DMSO)

Skupinám 1 až 8 byla podána dávka za použití konstantního dávkového objemu 10 ml/kg a skupinám 9 až 12 byla podána dávka za požití dávkového objemu 1 ml/kg.

První den byla měřena spotřeba potravy a vody také 1., 3. a 6. hodinu po dávkování.

Po provedeném měření 8. den se zvířata usmrtila zadušením oxidem uhličitým a játra se vyřízla a vložila se před histologií do 10% pufrového formalinu. Byly připraveny řezy jater zalité do vosku silné 4 až 5 μτη a obarveny hematoxylinem a eosinem. Další řezy byly nařezány na kryostatu na 12 μτη a obarveny na přítomnost tuků olejovou červení O (ORO).

Analýza dat

Měřila se spotřeba potravy a vody po skončeném dávkování a hmotnost v každém časovém bodu pro ošetřená zvířata P57 se srovnávala s podobně ošetřenou kontrolní skupinu, kdy bylo použito vehikulum, za použití analýzy rozdílů a následoval Williamsův test pro srovnání s kontrolou.

Data pro zvířata ošetřená fenfluraminem se porovnávala s daty pro kontrolní skupinu ošetřenou vehikulem za použití Studentova testu.

Výsledky

Výsledky jsou shrnuty v tabulkách.

Vzorek 1 (čistá šťáva) podána orálně, produkoval značné, na dávce závislé denní snížení potravy. Doba trvání a amplituda těchto snížení ve spotřebě potravy byla závislá na dávce. 24 • 9 ·· • · • · ·* > · · « • 9 9 hodin po dávce produkoval vzorek 1 (čistá šťáva) statisticky podstatné snížení spotřeby potravy, ve srovnání s kontrolu, kdy bylo k ošetření použito vehikulum, při dávkách 1600 mg/kg a vyšších. Nejvyšší dávka vzorku 1 (šťáva) (10000 mg/g) produkovala statisticky podstatné snížení spotřeby potravy při do 5 dnů po dávce.

Vzorek 2 (látka získaná sušením rozprašováním šťávy) a vzorek 3 (aktivní část) produkovaly značné a statisticky podstatné snížení spotřeby potravy při orální dávce 76 a 5,0 mg/kg. V obou případech trval účinek 48 hodin po dávce.

Referenční standard, fenfluramin (7,5 mg/kg p.o.) produkoval statisticky podstatné snížení potravy, ve srovnání s kontrolní skupinou, kdy bylo k ošetření použito vehikulum, 6 a 24 hodin po dávce (skupina 12).

Vzorek 2 (látka získaná sušením rozprašováním šťávy) a vzorek 3 (aktivní část) neprodukovaly značné, na dávce závislé, účinky na spotřebu vody. V den dávkování produkovala čistá šťáva statisticky podstatné zvýšení spotřeby vody 3 hodiny po dávce (6400 a 10000 mg/kg) a 6 hodin po dávce (10000 mg/kg). Nicméně dva dny po dávce bylo zaznamenáno statisticky podstatné snížení spotřeby vody u zvířat, kterým byl podán vzorek 1 (šťáva) při dávce 3200, 6400 a 10000 mg/kg. Tato snížení nejsou samozřejmě závislá na dávce a docházelo k nim mezi 1. a 2. dnem po dávce. Biologická podstata těchto účinků je nejasná.

Vzorek 1 (čistá šťáva), produkoval na dávce závislé, statisticky podstatné účinky na tělesnou hmotnost při srovnání s kontrolní skupinou, kdy bylo použito k ošetření vehikulum (skupina 1). Při orální dávce 3200 mg/kg a výše, produkoval vzorek 1 (čistá šťáva), ve srovnání s kontrolou, kdy bylo použito k ošetření zvířat vehikulum, statisticky podstatné snížení tělesné hmotnosti nebo snížení rychlosti

49

9 9 4

44

4949 44

4 4

4444 růstu. Tyto účinky byly statisticky podstatné od 48 hodin po dávce do konce studie.

Vzorek 2 (látka získaná sušením rozprašováním ščávy) podána orálně v množství 76 mg/kg také produkovala podstatné snížení růstu zvířat, ve srovnání s kontrolní skupinou (skupina 1), kdy bylo použito k ošetření vehikulum. Tyto účinky byly statisticky podstatné mezi 3. (48 hodin po dávce) a 5. dnem včetně.

Vzorek 3 (aktivní část), ačkoliv zpožďoval růst zvířat při nejvyšší dávce (5,0 mg/kg) ve srovnání s kontrolní skupinou , kdy bylo k ošetření použito vehikulum (skupina 12), tento účinek nebyl statisticky podstatný.

Fenfluramin (7,5 mg/kg) neprodukoval, ve srovnání s kontrolu (skupina 12), kdy bylo použito k ošetření vehikulum, statisticky podstatné účinky na snížení spotřeby vody nebo tělesné hmotnosti.

Pokud se týká vlivu na játra, nebyly zjištěny žádné účinky způsobené ošetřením.

'^Uo^Oiuibjq

-91 ·» aa ·· • a a · · · a ·· * · a a · a · · • aaa· • aaa aa ·· »« • a ·· • * a « • * · · • a a a • · a a ·« ··

Tabulka 1a

Účinky orálního podání na spotřebu potravy u krysy (před dávkou, denně)

tn (0 Q c o o

1 CN τ— 1

co ^.co X» ·*< -<M S+i

Γ-» ^CM íb'

LO 10¹¾ c57 cm Ή

LO <0^Z CN Ή

„8

CO CN ^cnI OOY CN -H

p* -4 ® JJ <M Ή

<η<2. ® jj CN +t

to“ <M Ή

CO 10¾ c?“ ”+l

CN Ή

xť to^ £2

5 4-4 O

o

v—

r~

en

cn

O

Τ'*

cn

co

to

<-

co

1

-- ¹⁰ CO s

— <O

CD®

to 5*

CN®

o®.

co®

- cn r>

o®

00®

Ό M -H

CO CM i

03*“ S-H

-?**“· ® jj CM +1

cď® CM *H

enSJ CM +1

CM

-^co CN Ή

CN Ή

co*’^-* S-H

04*

CD^ “•H

°°

00 ”

c

r*

CO

co

CM

LO

1-

O

o

LO

co

cn

o

_t

co®

o®

. tot

o“

to“

,_o

o“

_C0

o®

•Q E □

vez 1 1

CN Ή

*O CN Ή

cí+i

coS) CN Ή

CN Ή

co<?) CM Ή

_t<n CN +i

CN Ή

CM +1

® ή

CN Ή

“44 CN +f

(0 c o o

CO

CM

co

CO

co

cn

LO

CM

co

CO

TO

1

cn“

ot

ν-'ΐ,

co^.

cn^-

LO IO 0.

cd“

. CO^

o H- c

ΙΟ’Φ » 1

cn Ή

χ?*° CM *H

CM ·Η

CM Ή

LOT CM ·«

CÓ*^N cn*

CM “Π

<0*2 CM

loV CM Ή

CM Ή

c5^J CM ·Η

ca o E

Xj

CO

O

co

xt-

00

xt

τ—

O

co

□

1

cd®.

CD^

o“

CM -

-^CO • P· -

to“

_ CM V“ M,

^05 P* *

; cd'v

CO

T-®

cn“

u_ o

coin 1

^CH44 CM “Π

CN Ή

,**CM CN -H

CN*

“44 CN Ή

eoT CN +i

*O CO Ύ CM Ή

ωΤ CN ·Η

co™ CN Ή

CN ·Η

c?H

σ>

O) E, co

•

o o CD

o o co v·

o o CN CO

O O TT CO

O O O O r—

00 co

CO r>

to o?

o *» LO

to

•

>

'CO

O

00

_z—

00

'CO

Έ

co Ό O

ra > 'CO

CO > 'CO >(/) V £ o N

CO >

co >

CO >

li

c c CD £

'CO >o

>Q Έ

c

0 w

>£ ω >ω o Έ 'CO

E •3 Jč JZ

></> V“ s> o Ji)

><Λ V“ £ o N

'CO >ω V“ £ o

'CO >w V“ £ o

>ω c 3'CO ω > CM θ co CD ON

»CZ) c •5 ω > CM O *’S S N

c > 2 co co CD

> 2 co CO 4lC 2

É 2 3 C C <u LL

s Q E 3 3 ic ω >

o

Φ >

>

N >

.Ng

£S

u- o s

o 2

co

c

CL

r-

CN

CD

v

to

co

Γ

ca

cn

O T—

CM T-7

z

w

sd Standardní deviace >

·· ·· • · « · • · · « • · · * • · · r «« «9 • · · · • · ·

-92«V ·· • · · · • ··* • · · • · · ··* · »·

Tabulka 1b

Účinky orálního podání na spotřebu potravy u krysy (po dávce, denně)

sd Standardní deviace

Skupina 2-8 byla porovnána s vehikulem skupiny 1: Pf < 0,05, p_f < 0,01 Skupina 9-11 byla porovnána s vehikulem skupiny 12: p < 0,05, p < 0,01 • · ···· ·· ·· ···· ·· ·· ?

-93Tabulka 2a

Účinky orálního podání na spotřebu potravy u krysy (po dávce, denně)

Průměrná spotřeba potravy u skupiny (g ± sd) mezi dny

CN r-

CN ν'! cn“ cn-H

LO «-Η

cn . to® cn +t

31,7 ±3,18

CN r-*\ LO^ ω-Η

r> . CN * CN® cn Ή

31,4 ±2,98

»- 39,0 ±17,27

CN ‘ CQť r7® «*

33,1 ±4,82

o . CO® cn Ή

•e . •co cn +1

COCN 1

CN LO* cTh

ro 00 * r* «« CN -H

r- „ r-*. W-H

CD . cn^ ~cn cn -H

CN j5 cn +1

T“ . ot CN +l

O l CN®. cn Ή

CO “4 cn *

O h o¹⁰· CTÍ CN Ή

to . CN^ Ο 11 CN Ή

CN . 0)¾

n- . cn“ <N Ή

» rtcn t

CO co“ .“tn CO Ή

CO Ή

CO <3 CO +1

CO . co^ s~;

co . -e’: tň*® S-h

CO ®4

o . rs®. cn Ή

to * CO 1“

CO v-“ O*

CO rs® cn *

co . f* P> M> _rcn cn +1

rř . c”. S3

1 LO rf· » ¹

LO co -H

xř

σΑ tcT® co +»

cn$ éó-H

CN . ω°. cn+1

to .CO . rs s CN*⁰cn*

CN . 00¾

co O® ω*

to . o° cn Ή

O CN°. ,+ Ρ’ cn -H

cn . to*

P* *4'

1 co to «

σ,ζ sť

co . co®. s+i

co LO . M-o 35

00 *· LO

r> to • “ * co®

,4. co cn +1

co L o® 5Ϊ

00 • “3 σ>*

o o^. Sl

00 §5

§9

.co®

Dávka (mg/kg)

1

o o co

O o CO T—’

o o CN CO

o o Tí“ CO

o o o o r-

00 CO

CO r*

to oT

O, in*

to r<

1

Orální ošetření

/•“X ro Ό O >, E =3 Ξ co >

ro > >ro ></) r· JZ CD L_ O 2

ro > '<0 >L0 ω o s

ro > 'CD >w CD u. O 2

ro > 'CO >00 v 9 o s

ro > 'CO «Λ V“ 2 o N >

c E <u = >w 5 3 5 CN ° jí co 2a O N Ng

Se *3 = « CN o >(/) '5 8

07 'CO >Q Έ .> £ ro co CD u. O s

07 'CD >o Έ .> 2 ro CO 2 o s

c E 2 3 ¢= C CD Li.

o w 2 Q 's-x' E 3 3 Ξ CD >

ro c ’5L □ ω

r-

CN

cn

Ν’

LO

CO

Γ-

00

cn

o T“

t- · τ—

CN r-

sd Standardní deviace • · · · · ··· · · · ···· • · · · · · · · · ·· · ···· ·· ·· ···· ·· ··

-94Tabulka 2b

Účinky orálního podání na spotřebu potravy u krysy (po dávce, denně)

sd Standardní deviace

Skupina 2-8 byla porovnána s vehikulem skupiny 1:' p < 0,05 Skupina 9-11 byla porovnána s vehikulem skupiny 12 (nevýznamná) • ·

-95Tabulka 3a

Účinky orálního podání na tělesnou hmotnost u krysy (po dávce, denně)

sd Standardní deviace

Tabulka 3b

Účinky orálního podání na tělesnou hmotnost u krysy (po dávce, denně)

sd Standardní deviace

Skupina 2-8 byla porovnána s vehikulem skupiny 1: * p_f < 0,05, **p_f < 0,01 Skupina 9-11 byla porovnána s vehikulem skupiny 12 (nevýznamná) • · i

Histologická zpráva

Histologické vyšetření bylo omezeno na játra. Žádné, ošetřením způsobené změny nebyly nalezeny u vzorku 1 (kapalina), u vzorku 2 (stává získaná sušením rozprašováním), vzorku 3 (aktivní část), fenfluraminové nebo DMSO kontrolní skupině.

Nálezy měly podobný výskyt v kontrolních i ošetřených skupinách.

• · · φ φ • * • φ

- 98’Tabulka

Souhrn výskytů mikroskopických patologických změn

Pohlaví: samci Samci ve studii Celkem samců	Skupina 1 0 mg/kg 5 5	Skupina 2 800 mg/kg 4 4	Skupina 3 1600 mg/kg 5 5	Skupina 4 3200 mg/kg 5 5	Skupina 5 6400 mg/kg 5 5	Skupina 6 10000 mg/kg 5 5
Játra
Zkoumaná	5	4	5	5	5	5
Žádné abnormality	0	0	1	2	3	3
Zánětlivá ložiska parenchymálních buněk	0	1	0	0	0	3
(celkem)	0	1	0	0	0	1
Minimální Hepatocytová hypertrofie-centrilobulárni	0	0	0	0	0	1
(celková)	0	0	0	0	0	0
Minimální	2	0	0	0	0	0
Extramedulární hemopoéza (celková)	2	0	0	0	0	0
Minimální	1	0	0	0	0	0
Hepatocytní nekróza - fokální (celková)	1	0	0	0	0	0
Minimální	3	4	4	3	2	2
Portální lymfoidní infiltrace (celková)	3	4	4	3	2	2
Minimální	1	0	0	0	0	0
Eosinofilní hepatocyty - fokální (celková)	1	0	0	0	0	0
Minimální	0	0	1	0	0	0
Portální fibróza (celková) Minimální	0	0	1	0	0	0
Játra (skvrna ORO)	5	4	5	5	5	5
Zkoumaná	2	3	2	4	3	3
Žádné abnormality	3	1	2	1	2	2
Hepatocytní tuk - centrilobulární (celkem)	3	1	2	1	2	2
Minimální	0	0	1	0	0	0
Hepatocitní tuk - periportální (celkem) Minimální	0	0	1	0	0	0

Tabulka (pokračování)

Pohlaví: samci Samci ve studii Celkem samců	Skupina 7 38 mg/kg 5 5	Skupina 8 76 mg/kg 4 4	Skupina 9 2,5 mg/kg 5 5	Skupina 10 5 mg/kg 5 5	Skupina 11 7,5 mg/kg 5 5	Skupina12 0 mg/kg 5 5
Játra
Zkoumaná	5	5	5	5	3	3
Žádné abnormality	2	2	0	1	0	2
Zánětlivá ložiska parenchymálních buněk	0	0	0	0	0	1
(celkem)	0	0	0	0	0	1
Minimální Hepatocytová hypertrofie-centrilobulárni	0	0	1	0	0	0
(celková)	0	0	1	0	0	0
Minimální	3	3	5	4	3	1
Portální lymfoidní infiltrace (celková)	3	3	5	4	3	1
Minimální	0	0	1	0	0	0
Portální fibróza (celková) Minimální	0	0	1	0	0	0
Játra (skvrna OŘO)	5	5	5	5	3	3
Zkoumaná	5	3	3	3	2	2
Žádné abnormality	0	2	2	2	1	1
Hepatocytní tuk - centrilobulární (celkem) Minimální	0	2	2	2	1	0

I ·' · • · gg _ ·♦··

Příklad 45

Další biologická zkouška, při které se používaly stejné zkušební vzorky jak je popsáno v příkladu 44 je popsána dále. Zvířata v této studii dostávala omezenou potravu, tj. zvířata dostávala potravu mezi 12. a 15. hod. denně. Toto se liší od všech biologických zkoušek prováděných až dosud, kde byla potrava krysám dostupná dle potřeby. Zvířata byla aklimatizována během sedmidenní periody (dny -7 až -1), dávkování bylo provedeno 0 až 6 den v 9,00 hod. orální žaludeční sondou. Perioda na zotavení probíhala 7. až 13. den. Dávkové skupiny jsou popsány v tabulce 1 dále. Je třeba poznamenat, že skutečná kontrolní skupina je skupina 9.

Skupina 5 je kontrolní skupina, která obdržela stejné množství potravy jako skupina 4. Účelem této zkoušky bylo vyhodnocení účinku omezené potravy na životy zvířat.

Výsledky

Výsledky získané během studie ukázaly, že aklimatizační perioda je velmi krátká. Krysy se krmily zejména během noci a náhlá změna na omezený přístup k potravě během denní doby vedla k nízké denní spotřebě. Denní příjem potravy se zvýšil u většiny skupin ke konci aklimatizační periody, kdy začalo dávkování testovanou sloučeninou. Výsledkem bylo, že účinek testovaných materiálů neměl podstatný účinek na příjem potravy u krys během dávkování.

Střední tělesná hmota pro různé skupiny pro dny -7 až -1 a dny 0 až 6 jsou uvedeny v tabulce Dl a v tabulce D2. Účinek různých dávek šťávy a látky získané sušením rozprašováním je uveden v doprovodných grafech jako % změny v tělesné hmotnosti 0 až 7 den (obrázek 5) a % změny tělesné hmotnosti -7 až 7 den (obrázek 6). Ztráta tělesné hmotnosti je závislá na dávce, zejména při vyšších dávkách.

I

100 ·· ·· ·· ·· · ·· • ·· · · ·· · · · · * ··· · · · · · · ·

Histopatologické zkoumání jater nevykázalo podstatnou patologii ve skupinách, které dostávaly testovanou sloučeninu.

Potrava

Spotřeba potravy byla měřena denně během aklimatizace a během studie. Potrava byla k dispozici po dobu 3 hodin denně, perioda začala ve 12,00 a končila v 15,00 hodin. Po zbývající čas se zvířata postila. Zvířata v 5. skupině dostala odměřené množství potravy 1. den, které bylo ekvivalentní průměrné spotřebě potravy jako u skupiny 4 den 0. Tento regulovaný model krmení pro 5. skupinu, jak bylo stanoveno z průměrné spotřeby 4. skupiny z předchozího dne, pokračoval 1. až 7. den.

Voda

Voda byla poskytována ve standardním zásobníku. Voda (Magalies Water Board Tap Water, vhodná pro potřebu lidí), byla dostupná dle potřeby. Spotřeba vody byla měřena jednou denně, ve stejný čas každý den, po stanovení spotřeby potravy.

Aklimatizace

Zvířata se aklimatizovala sedm dnů před začátkem studie, přičemž během této doby byla stanovena spotřeba potravy a vody. Tělesná hmotnost byla stanovována na denní bázi během této doby.

101 • · • ·

Návrh studie a postup

Tábulka 1 Návrh studie

skupina	zkouška	čísla	dávka	zkoušená látka
01	6o	001-006	100 mg/kg	mražená šťáva
02	6o	007-012	400 mg/kg	mražená šťáva
03	6o	013-018	1600 mg/kg	mražená šťáva
04	6o	019-024	3200 mg/kg	mražená šťáva
05	6o	025-030	kontrola	Elga Option 4 Čištěná voda
06	6o	031-036	2,2 mg/kg	sušení rozprašováním šťávy
07	6o	037-042	8,8 mg/kg	sušení rozprašováním šťávy
08	6o	043-048	35 mg/kg	sušení rozprašováním šťávy
09	6o	049-054	kontrola	Elga Option 4 Čištěná voda

Cesta podání

Testovaná látka se podávala na denní bázi po 7 dnů, za použití intragastrické sondy. Zvířata nedostávala potravu 18 hodin před podáním sloučeniny (začátek v 9,00).

Doba trvání ošetření

Zvířata byla ošetřována po sedm za sebou jdoucích dnů (den 0 až 6) . Tři zvířata z každé skupiny byla usmrcena 24 hodin po poslední dávce (7. den) . Zbývající tři zvířata byla usmrcena 7. den po poslední dávce (13. den) . Tento postup se provedl pro všechny skupiny, kromě skupiny 5, kde byla zvířata usmrcena 24 hodin po posledním kontrolovaném krmení (8. den), zbývající tři zvířata byla usmrcena 7 dnů po poslední dávce (13. den).

Tělesná hmotnost

Tělesná hmotnost byla stanovena denně, přibližně ve stejnou dobu každý den po dobu trvání studie, včetně během • ·

102 aklimatizační periody.

Euthanazie

Tři zvířata každé skupiny byla usmrcena 24 hodiny po poslední dávce (7. den).

Zbývající tři zvířata byla usmrcena 7. den po posledním ošetření. Tento postup následoval pro všechny skupiny, kromě skupiny 5, kde byla tři zvířata usmrcena 24 hodin po posledním kontrolovaném krmení (8. den) a zbývající tři zvířata byla usmrcena 7. den po posledním ošetření (13. den). Zvířata byla euthanázována ke konci periody studie s plynným co₂.

Oftalmoskopické zkoumání

Oftalmoskopické zkoumání, za použití oftalmoskopu, se provedlo u všech zvířat ve všech skupinách před prvním podáním testované látky a po skončení ošetření.

Makroskopická patologie

Plné zkoumání každého mrtvého zvířete se provádělo ke konci periody studie.

Histopatologie

Histopatologické vyšetření se provádělo na játrech každého zvířete.

9 99

9999

Tabulka D.1

Střední tělesná hmotnost/skupina/týden

-103-

• · ·· · · ·· • ·· · · · · · * · · · · · · • · 9 · 9 · · · • · · · · · · • 9 9 9 99 ·· · ·

Tabulka D.2

Střední tělesná hmotnost/skupina/týden (pokračování)

-104-

-105-

Tabulka D.3

Střední tělesná hmotnost/skupina/týden (pokračování)

99 ·· ·· ·· ··** · · · · · ··· ·· · ···· «φ · · · · ··· · · » • · · · · · · · · · ·*·· »· ·· ···· »· ··

-106Tabulka 1: Histologické hodnocení jater u samců krys Vzorek 1

Skupina 1:100 mg/kg Vzorek 1	Skupina 2:400 mg/kg Vzorek 1
	zvíře č.	Hepatické léze		zvíře č.	Hepatické léze
7. den	01	NPL		07	FHS1 +
	02	NPL		08	NPL C1+
	03	NPL C1+		09	NPL
13. den	04	NPL MLC	13. den	10	DHS1 +
	05	FHS1 +		11	NPL
	06	NPL		12	DHS1 +

Skupina 3:1600 mg/kg Vzorek 1	Skupina 2: 400 mg/kg Vzorek 1
	zvíře č.	Hepatické léze		zvíře č.	Hepatické léze
7. den	13	NPL		19	NPL
	14	NPL		20	NPL
	15	NPL		21	NPL
13. den	15	NPL	13. den	22	DHS1 +
	16	DHS1 +		23	FHS1 +
	17	NPL		24	NPL

Skupina 5: Skupina 5: Kontrola: Čištěná voda Elga Optin 4: omezená spotřeba potravy

Skupina 5: Kontrola: Čištěná voda Elga option 4
	zvíře č.	Hepatické léze
7. den	25	NPL MLC
	26	NPL
	27	NPL
13. den	28	DHS1 +
	29	DHS1 +
	30	NPL

Legenda:

C = Překrvení

DHS = Difusní hydropický buněčný otok FHS = Fokální hydropický buněčný otok NPL = Žádné parenchymální léze MLC = Minimální lymfocytická manžeta + = jemné + = mírné + = vážné

-107.

·»·· ··

99 99

9 9 · 9 1 • · · · <

• · 9 9 9 I • · · · I • •«t ·· ··

Tabulka 2: Histologické hodnocení jater u samců krys Vzorek 2

Skupina 6:2,2 mg/kg Vzorek 2	Skupina 7:8,8 mg/kg Vzorek 2
	zvíře č.	Hepatické léze		zvíře č.	Hepatické léze
7. den	31	NPL		37	NPL
	32	NPL MLC		38	NPL
	33	FHS 1+		39	NPL C1 +
13. den	34	NPL	13. den	40	DHS1 +
	35	DHS1 +		41	NPL
	36	NPL		42	MLC DHS1 +

Skupina 8: 35 mg/kg Vzorek 2
	zvíře 6.	Hepatické léze
7. den	43	NPL
	44	NPL
	45	NPL
13. den	46	NPL
	47	NPL C1 +
	48	MLC FHS1 +

Skupina 9: Kontrola: Čištěná voda Elga Option 4

Skupina 9: Kontrola: Čištěná voda Elga option 4
	zvíře č.	Hepatické léze
7. den	49	NPL
	50	NPL
	51	FHS1 +
13. den	52	DHS1 +
	53	NPL
	54	FHS1 +

Legenda:

C = překrvení

DHS = Difusní hydropický buněčný otok FHS = Fokální hydropický buněčný otok NPL = Žádné parenchymální léze MLC = Minimální lymfocytická manžeta + = jemné + = mírné + = vážné ·» ·* ·« ♦ « »· *· »··· 9 9 « · 9 9 9 9

99 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 · ·· 9 9 9 _{Λ Λ} ······ 9 9 9 9

108 -···· ........ ·· ··

Žádné specifické léze nebyly zaznamenány na játrech z experimentálních krys, které dostaly zmrzlou šťávu, rovněž látku získanou suchým rozprašováním šťávy, které by mohly být přisuzovány shora uvedeným chemickým látkám. Hydropický buněčný otok, zaznamenaný jak u kontrolních, tak experimentálních krys může indikovat metabolický buněčný otok a anoxické změny. U některých zvířat byla nalezena minimální ložiska lymfotických perivaskulárních změn, což je s největší pravděpodobností náhodné pozorování. U několika krys byla nalezena mírná kongesce v hepatických sinusoidách.

Důležitým rysem vynálezu ukázaným výsledky této studie je skutečnost, že nedošlo k vývoji žádné tolerance ke kterémukoliv ze vzorků. Tato skutečnost může poskytovat značný prospěch, zejména vzhledem k použití sloučenin a kompozic podle vynálezu k léčení obezity.

Sloučeniny a kompozice podle vynálezu byly zejména popsány vzhledem k jejich vlastnostem jako činidel snižujících chuť k jídlu. Je třeba uvést, že výraz činidlo snižující chuť k jídlu se zde používá k určení aktivity, která vede k omezené chuti a/nebo ke zvýšení pocitu sytosti a tak vede ke snížení celkové kalorické spotřeby potravy, což působí proti obezitě. Vynález se dále rozšiřuje na způsob ošetření, prevenci nebo boje proti obezitě u člověka nebo zvířete, které zahrnuje podání člověku nebo zvířeti množství sloučeniny vzorce 2, které léčí a je účinné při prevenci nebo boji proti obezitě. Výhodné provedení tohoto aspektu vynálezu využívá kompozici nebo extrakt obsahující sloučeninu vzorce 1.

Výraz zvíře jak se zde používá zahrnuje, nikoliv však s omezením, druh zvířat, například domácí ochočená zvířata; neomezující příklady takových zvířat zahrnují hovězí dobytek, ovce, fretky, vepře, slony, koně, drůbež, ryby, králíky, kozy, psy a kočky.

Sloučenina vzorce 2, výhodně vzorce 1, nebo kompozice ?

109 definovaná v kterémkoliv z nároků 9 a 25 až 31 shora, jako anoretické činidlo, nebo při léčbě nebo prevence obezity u člověka se výhodně podává uvedenému člověku v množství okolo od 0,01 mg/kg/den do okolo 10 mg/kg/den. Výhodná dávka je v rozsahu 0,05 mg/kg/den až 0,5 mg/kg/den. Pokud se použije prášek získaný sušením rozprašováním nebo extrakt podle vynálezu, výhodná dávka je v rozsahu 0,1 mg/kg/den až 20 mg/kg/den,· zejména výhodná dávka je 0,5 mg/kg/den až 5 mg/kg/den.

Claims

1. Způsob přípravy extraktu rostliny rodu Trichocaulon nebo rodu Hoodia, přičemž extrakt zahrnuje činidlo snižující chut k jídlu, vyznačující se tím, že postup zahrnuje stupně zpracování sebraného rostlinného materiálu rozpouštědlem k extrakci frakcí majících aktivitu snižující chut k jídlu, separaci extrakčního roztoku od zbytku rostlinného materiálu, odstranění rozpouštědla z extrakčního roztoku a získání extraktu.

2. Způsob přípravy jak je nárokováno v nároku 1, vyznačující se tím, že rostlina rodu

Trichocaulon je vybrána z druhu Trichocaulon piliferum a Trichocaulon officinale a rostlina rodu Hoodia je vybrána z druhu Hoodia currorii, Hoodia gordonii a Hoodia lugardii.

3. Způsob, jak je nárokován v nároku 1 nebo nároku 2, vyznačující se tím, že stupeň zahrnuje koncentraci aktivního činidla v extrahovaném materiálu další extrakcí s rozpouštědlem.

4. Způsob, jak je nárokován v nároku 1, nároku 2 nebo nároku 3,vyznačující se tím, že rozpouštědlo v rozpouštědlovém extrakčním stupni nebo stupních je jedno nebo více rozpouštědel vybraných ze souboru, který zahrnuje methylenchlorid, vodu, methanol, hexan, ethylacetát nebo jejich směsi.

5. Způsob, jak je nárokován v kterémkoliv z nároků 1 až 4 včetně, vyznačující se tím, že zahrnuje stupeň koncentrace aktivního činidla v extrahovaném materiálu chromatografickou separací.

6. Způsob, jak je nárokován v nároku 5, vyznačuj ící se t í m, že chromatografická separace zahrnuje jeden nebo « ·

- 111 více rozpouštědel vybraných ze souboru, který zahrnuje chloroform, methanol, ethylacetat, hexan nebo jejich směsi jako eluant.

7. Způsob, jak je nárokován v nároku 5 nebo nároku 6, vyznačující se tím, že se provede chromatografická separace na koloně, sebrání eluátu ve frakcích z kolony, hodnocení frakcí ke stanovení aktivity činidla snižující chuť k jídlu, a výběr alespoň jedné frakce obsahující činidlo snižující chuť k jídlu.

8. Způsob, jak je nárokován v kterémkoliv z předchozích nároků, vyznačující se tím, že extrakt se zpracuje na formu volně tekoucího prášku.

9. Extrakt vyznačující se tím, že zahrnuje činidlo snižující chuť k jídlu, který se produkuje podle postupu nárokovaném v kterémkoliv předchozích nároků.

10. Kompozice mající aktivitu snižující chuť k jídlu, vyznačující se tím, že zahrnuje extrakt nárokovaný v nároku 9.

11. Kompozice jak je nárokována v nároku 10, vyznačující se tím, se smíchá s farmaceutickým excipientem, ředidlem nebo nosičem.

12. Kompozice jak je nárokovaná v nároku 10 nebo 11, vyznačující se t ím, že se připraví v jednotkové dávkové formě.

13. Použití extraktu jak je nárokován v nároku 9 při přípravě léčiva mající aktivitu snižující chuť k jídlu.

14. Extrakt jak je nárokován v nároku 9, vyznačuj ící se t í m, že léčivo má aktivitu snižující chuť k jídlu.

• · • · ·· ·· ·♦ • · · · · · · · • · · · · · · • · · · · ·· · • · · · · · · ·· · · · · · · · ·

15. Způsob snížení chuti k jídlu, vyznačuj ící se t í m, že se člověku nebo zvířeti podá účinná dávka kompozice, jak je nárokována v nároku 10, nároku 11 nebo nároku 12 .

16. Způsob přípravy extraktu rostliny rodu Tríchocaulon nebo rodu Hoočlia, přičemž extrakt zahrnuje činidlo snižující chuť. k jídlu, vyznačující se tím, že postup zahrnuje stupně lisování sebraného rostlinného materiálu k oddělení šťávy z pevného rostlinného materiálu a získání šťávy, neobsahující pevný rostlinný materiál, za vzniku extraktu.

17. Způsob jak je nárokován v nároku 16, vyznačující se tím, že extrakt se suší na formu volně tekoucího prášku.

18. Extrakt zahrnující činidlo snižující chuť k jídlu, vyznačující se tím, že se připraví postupem jak je nárokován v nároku 16 nebo nároku 17.

19. Kompozice mající aktivitu snižující chuť k jídlu, vyznačující se tím, že zahrnuje extrakt jak je nárokován v nároku 18.

20. Kompozice jak je nárokována v nároku 19, vyznačující se tím, že se smíchá s farmaceutickým excipientem, ředidlem nebo nosičem.

21. Kompozice jak je nárokována v nároku 19 nebo nároku 20, vyznačující se tím, že se připraví v jednotkové dávkové formě.

22. Použití extraktu jak je nárokován v nároku 19 při přípravě léčiva mající aktivitu snižující chuť k jídlu.

• · • · • · • ·

113

23. Extrakt jak je nárokován v nároku 18, vyznačující se tím, že se použije jako léčivo mající aktivitu snižující chut k jídlu.

24. Způsob snížení chuti k jídlu, vyznačuj ící se t i m, že se podá člověku nebo zvířeti účinná dávka kompozice jak je nárokována v nároku 19, nároku 20 nebo nároku 21.

25. Extrakt který lze získat z rostliny rodu Trichocaulon nebo rodu Hoodia, vyznačující se tím, že zahrnuje činidlo snižující chut k jídlu mající vzorec

O

II

OMe

OMe (i)

26. Extrakt jak je nárokován v nároku 25 vyznačující se tím, že rostlina rodu Trichocaulon je vybrána z druhu Trichocaulon piliferum a Trichocaulon officinale a rostlina rodu Hoodia je vybrána z druhu Hoodia currorii, Hoodia gordonii a Hoodia lugardii.

27. Extrakt jak je nárokován v nároku 26, vyznačující se tím, že se všechny neaktivní nečistoty odstraní.

• · · • · • » • · • ·

114

28. Extrakt jak je nárokován v kterémkoliv z nároků 25 až 27, včetně, vyznačující se tím, že se zpracuje na volně tekoucí prášek.

29. Kompozice mající aktivitu snižující chuť k jídlu, vyznačující se tím, že zahrnuje extrakt jak je nárokován v kterémkoliv z nároků 25 až 28 včetně.

30. Kompozice jak je nárokována v nároku 29, vyznačující se tím, že se smísí s farmaceutickým excipientem, ředidlem nebo nosičem.

31. Kompozice jak je nárokována v nároku 29 nebo nároku 30, vyznačující se tím, že se připraví v jednotkové dávkové formě.

32. Použití extraktu jak je nárokován v kterémkoliv z nároků 25 až 28 včetně pro přípravu léčiva mající aktivitu snižující chuť k jídlu.

33. Extrakt jak je nárokován v nárocích 25 až 28 včetně pro použití jako léčiva mající aktivitu snižující chuť k jídlu.

34. Způsob snížení chuti k jídlu, vyznačuj ící se t i m, že se podá člověku nebo zvířeti účinná dávka kompozice jak je nárokována v nároku 29, nároku 30 nebo nároku 31.

35. Sloučenina obecného vzorce

115 r₂ (2) kde R = alkyl

R₄ = H, alkyl, tigloyl, benzoyl, nebo jiná organická esterová skupina;

36. Sloučenina jak je nárokována v nároku 35, kde je vazba mezi C5-C6, R = methyl, R-j_ = tigloyl, R₂ = 3-0-[-S-D-thevetopyranosyl-(l->4)-β-D-cymaropyranosyl-(l->4)-β-D-cymaropyranosyl], kde sloučenina má obecný vzorec (1) • ·· «3 · fc ··· • · ·· ··

116

37.

Sloučenina mající obecný vzorec (3) kde

R = alkyl; a

R^ = H, alkyl, tigloyl, benzoyl nebo jakákoliv jiná organická esterová skupina.

38 .

Sloučenina mající obecný vzorec (4) • · • · kde R = alkyl; a

R₁ = H, alkyl, tigloyl, benzoyl nebo jakákoliv jiná organická esterová skupina.

39. Sloučenina mající obecný vzorec • ·· · · · ·

9 9 Φ » · · 9 ΦΦ ΦΦ «ΦΦ ΦΦΦ ΦΦΦ

ΦΦΦΦ ΦΦ Φ<» ΦΦΦΦ Φ· Φ·

- 117 -

OH (5) kde R = alkyl; a

40. Sloučenina mající obecný vzorec

OMe í 6) • · • · kde R = alkyl; a

41. Sloučenina mající obecný vzorec

118 (7) kde R = alkyl; a = H, alkyl, tigloyl, benzoyl nebo jakákoliv jiná organická esterová skupina.

42. Sloučenina obecného vzorce (8) kde R = alkyl

R₁ = H, alkyl, tigloyl, benzoyl, nebo jiná organická esterová skupina;

a kde přerušovaná čára znamená případně přítomnost další

9 · · ♦ · · 9 · 9 9 9 9

9 99 99 9 9999 ♦ ····· 9 9 9 9 9 9 ¢ 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9999 99 99 9999 9 9 99

- 119 vazby mezi C4-C5 nebo C5-C6.

43. Sloučenina obecného vzorce kde R = alkyl

R-L = H, alkyl, tigloyl, benzoyl, nebo jiná organická esterová skupina;

44. Sloučenina obecného vzorce (10) • 4 • 4

4 4

120 kde R = alkyl

R₄ = H, alkyl, tigloyl, benzoyl, nebo jiná organická esterová skupina;

45. Sloučenina obecného vzorce r/ (11) kde R = alkyl

R₄ = H, alkyl, tigloyl, benzoyl, nebo jiná organická esterová skupina;

46. Sloučenina obecného vzorce • · (12) kde R = alkyl

R^ = H, alkyl, tigloyl, benzoyl, nebo jiná organická esterová skupina;

47. Sloučenina obecného vzorce (13) kde R = alkyl

R-L = H, alkyl, tigloyl, benzoyl, nebo jiná organická esterová skupina;

φ φ

122

R₂ = Η nebo jeden nebo více 6-deoxysacharidů nebo jeden nebo více 2,6-dideoxysacharidů, nebo molekuly glukózy nebo jejich kombinace;

48. Sloučenina obecného vzorce kde R = H, alkyl, aryl, nebo jakýkoliv steroid mající C14 beta hydroxylovou skupinu, C12 beta hydroxylovou skupinu a C17 acylovou skupinu, C5-C6 olefin nebo jejich kombinace.

49. Způsob přípravy steroidního meziproduktu vzorce vyznačující se tím, že zahrnuje stupně (a) zpracování sloučeniny • ·

123 • · · 9 · ♦

999 99 99 9·9 9 s redukčním činidlem za vzniku sloučeniny 3S,12S-dihydroxy-20,20-ethylendioxypregna-5,14-dřenu vzorce

OH (23) (b) zpracování sloučeniny 23 s N-bromacetamidem (NBA) a bází za vzniku sloučeniny 3S,12S-dihydroxy-14,15-epoxy-20,20-ethylendioxypregnen-5-enu vzorce (24)

Λ · « · « ·

- 124 (c) zpracování sloučeniny 24 s redukčním činidlem za vzniku sloučeniny 3S,12E,14E-trihydroxy-20,20-ethylendioxypregn-5-enu vzorce a (d) zpracování sloučeniny 25 s kyselinou a vodou za vzniku sloučeniny 15.

50. Způsob přípravy sloučeniny 15, vyznačuj ící se t í m, že zahrnuje stupně (a) zpracování sloučeniny 22 s p-toluensulfonylchloridem a bází za vzniku sloučeniny 3E,12E-dihydroxy-20,20-ethylendioxy pregna-5,14-dien-3-tosyl-12-acetátu vzorce (b) zpracování sloučeniny 26 octanem draselným v rozpouštědle za vzniku sloučeniny 6E,12E-dihydroxy-20,20-ethylendioxy« · ·· ·· ·· ·· ···· ♦ · · 9 9 9 9 9

9 99 · 9 9 9 9 9 9

125

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9999 99 99 9999 ·· *·

-3,5a-cyklopregnan-14-en-12-acetátu vzorce (27) (c) zpracováni sloučeniny 27 s redukčním činidlem za vzniku sloučeniny 6S,12B-dihydroxy-20,20-ethylendioxy-3,5a-cyklopregnan-14-enu vzorce (28) (d) zpracování sloučeniny 28 s N-bromacetamidem a bází za vzniku sloučeniny 6S,12E-dihydroxy-20,20-ethylendioxy14,15-epoxy-3,5a-cyklopregnanu vzorce (29)

OH • · • 9 « ·

126 ···· 99

9 9 9

99 9999 • 9 9 9

9 9 99 (e) zpracování sloučeniny 29 s redukčním činidlem za vzniku sloučeniny 6S,12S,14S-trihydroxy-20,20-ethylendioxy-3,5a-cyklopregnanu vzorce (30) a (f) zpracování sloučeniny 30 s kyselinou a rozpouštědlem za vzniku sloučeniny 15.

51. Způsob přípravy sacharidového meziproduktu ve formě monosacharid cymarozové části, vyznačující se tím, že zahrnuje stupně (i) zpracování sloučeniny vzorce (36)

127 s PhSSiMe^, Znl₂ a Bu4⁺I za vzniku sloučeniny 4-0-benzoyl-3-O-methyl-6-deoxy-aS-D-fenylthioaltrosidu vzorce

SPh (37) (ii) případně zpracování sloučeniny 37 s diethylaminosulfur trifluoridem (DAST) za vzniku sloučeniny 4-0-benzoyl-3-0-methyl -2 -f enylthio-2,6-dideoxy-aS-D-f luorcymaropyranosidu mající vzorec nebo (iii) případně zpracování sloučeniny 37 s terč.butyldimethyl silylchloridem a imidazolem v rozpouštědle za vzniku 4-0-benzoyl-3 -O-methyl-2-0-terč .butyldimethylsilyl-aE-D-fenylthioaltrosidu mající vzorec • ·

128

-fenylthioaltrosidu mající vzorec ·· ·· ·· ·· • · · · ···* • ·· · · 9 • 9 9 9 9 9

9999 99 99 9999

99 99

SPh (39) kde Z = TBDMS = terč.butyldimethylsilyl;

a (iv) zpracování sloučeniny 39 s bází za vzniku monosacharidu 3-O-methyl-2-0-terč.butyldimethylsilyl-αβ-D-fenylaltrosidu mající vzorec

SPh (40) kde Z = TBDMS = terč.butyldimethylsilyl.

52 Způsob přípravy sacharidového meziproduktu ve formě aktivované thevetosové části, vyznačující se tím, že zahrnuje stupně (i) zpracování sloučeniny

I

129 • fc ··

I fcfc <

• fcfc fc · « • · 4 ►··· ··

99 >« • 9 9 fc • fc · fc · · fcfc fcfc· ·· fcfc·· fc · • · • » (47) s fenylthiotrimethylsilanem a trimethylsilyltrifluormethansulfonátem za vzniku sloučeniny 4-0-benzoyl-3-0-methyl-l-fenylthi o-6-deoxy- αβ -glukopyranos idu majíc£m vzorec (48) (ii) zpracování sloučeniny 48 s pivaloylchloridem a rozpouštědlem za vzniku sloučeniny 4-0-benzoyl-3-0-methyl-2-0-pivaloyl-l-fenylthio-6-deoxy-afi-glukopyranosidu majícím vzorec

SPh (49) a (iii) zpracování sloučeniny 49 s bromačnim činidlem a diethylaminosulfur trioxidem za vzniku monosacharidové sloučeniny 4-0-benzoyl-3-0-methyl-2-0-pivaloyl-l-fluor-600 00 • 0

0 0 0

130 • 0 ··

W » 0 0 • 00

0 0 0 0000 0»

0 0 0 00 *···

00 *0

0 0 · ·

0 0 0 0

0 0 · 0

0 0 0 0

0* 00

-deoxy-S-glukopyranosidu vyskytujícím se mající vzorec jako stereoisomery

53. Steroidní meziprodukt vzorce 15, vyznačuj ící se t í m, že se připraví postupem jak je nárokováno v nároku 49 nebo nároku 50.

54. Sacharidový meziprodukt se t í m, že se připraví

51.

vzorce 40, vyznačuj ící postupem jak je nárokováno v nároku

55. Sacharidový meziprodukt vzorce 50 A nebo vzorce 50 B, vyznačující se tím, že se připraví postupem, jak je nárokováno v nároku 52.

56. Způsob kopulace monosacharidové cymarózy na steroidní meziprodukt, vyznačující se tím, že zahrnuje stupně (i) reakci cymarosové části vzorce 38 se steroidovým meziproduktem vzorce 15, jak je nárokováno v nároku 53 v přítomnosti chloridu cínatého v rozpouštědle za vzniku sloučeniny 3-0-[4-0-benzoyl-2-fenylthio-E-D-cymaropyranosyl]-12,14-S-dihydroxypregnan-5-en-20-onu vzorce

131

BzO (51) a (ii) zpracování sloučeniny 51 s chloridem tiglové kyseliny v pyridinu a poté s bází za vzniku sloučeniny 3-0- [4-0-benzoyl-2 -fenylthio-β-Ό-cymaropyranosyl]-12β-tigloyl-14fi-hydroxypregnan-5-en-20-onu vzorce (52)

57. Sloučenina vzorce 52,vyznačující se tím, že se připraví postupem, jak je nárokován v nároku 56.

58. Způsob kopulace monosacharidové cymarosové části na monosacharid thevetosovou část a kopulace vzniklého disacharidu na sloučeninu vzorce 52, jak je nárokováno v nároku 57, vyznačující se tím, že zahrnuje stupně (i) kopulaci selektivně chráněné cymarosové části vzorce 40 • · jak je nárokováno v nároku 54 a monosacharidové thevetosové části vzorce 50 A jak je nárokováno v nároku 55 za použití chloridu cínatého (SnCl₂) a trifluormethansulfonátu stříbrného za vzniku sloučeniny vzorce

OPv (53) kde Z = TBDMS = terč.butyldimethylsilyl (ii) zpracování sloučeniny 53 s tetrabutylamoniumfluoridem za vzniku sloučeniny vzorce (54) (iii) zpracování sloučeniny 54 s diethylaminosulfur trifluoridem za vzniku sloučeniny vzorce • · • · (iv) reakci v nároku 57 sloučeniny 55 se sloučeninou 52 jak je nárokováno za vzniku sloučeniny vzorce

OPv (56) a (v) zpracování sloučeniny 56 Raney-niklovou reakcí a potom s bází za vzniku sloučeniny 1 jak je nárokováno v nároku 36.

59. Způsob přípravy trisacharidu a kopulace vzniklého trisacharidu na steroidní meziprodukt, vyznačuj ící se t í m, že zahrnuje stupně

- 134 (i) kopulaci selektivně chráněné cymarosové části vzorce 40 jak je nárokováno v nároku 55 a sloučeniny 45 za použití chloridu cínatého, AgOTf, Cp₂ZrCl₂ za vzniku sloučeniny vzorce (57)

SPh kde Z = TBDMS = terč.butyldimethylsilyl;

(ii) zpracování sloučeniny 57 s tetrabutylamoniumfluoridem a diethylaminosulfur trifluoridem za vzniku trisacharidové sloučeniny mající vzorec (58) a (iii) kopulaci trisacharidu vzorce 58 se steroidovým meziproduktem vzorce . ·· . . ··..·· >,·.···· ···· ··· ··· ·· · · · * ······ ··· ···· ·· ·· ···· ·· ··

- 135 - za použiti chloridu cínatého, AgOTf, Cp₂ZrCl₂ za vzniku sloučeniny 1, jak je nárokováno v nároku 36.

60. Kompozice mající aktivitu snižující chuť k jídlu, vyznačující se tím, že zahrnuje sloučeninu jak je nárokována v kterémkoliv z nároků 35 až 48 včetně.

61. Kompozice jak je nárokována v nároku 60, vyznačující se tím, že sloučenina je sloučenina vzorce 1, jak je nárokována v nároku 36.

62. Kompozice jak je nárokována v nároku 60 nebo nároku 61, vyznačující se tím, že se smíchá s farmaceutickým excipientem, ředidlem nebo nosičem.

63. Kompozice jak je nárokována v nároku 60, nároku 61 nebo nároku 62, vyznačující se tím, že se připraví v jednotkové dávkové formě.

64. Použití sloučeniny jak je nárokována v kterémkoliv nároku 35 až 48 včetně pro přípravu léčiva mající aktivitu snižující chuť k j ídlu.

65. Použití jak je nárokováno v nároku 64 sloučeniny vzorce 1 jak je nárokována v nároku 36.

·· ··..·♦.

• · ' · »' »'

- 136

66. Sloučenina jak je nárokována v kterémkoliv z nároků 35 až 48 včetně pro použití jako léčiva mající aktivitu snižující chuť k j ídlu.

67. Sloučenina jak je nárokována v nároku 66, která je sloučeninou vzorce 1, jak je nárokována v nároku 36.

68. Způsob snížení chuti k jídlu, vyznačuj ící se t í m, že se podá člověku nebo zvířeti účinná dávka kompozice jak je nárokována v kterémkoliv z nároků 60 až 63 včetně.

69. Potravina nebo nápoj, vyznačující se tím, že zahrnuje účinné množství sloučeniny jak je nárokována v kterémkoliv z nároků 35 až 48 včetně která má při požití účinek snižující chuť k jídlu.

70. Potravina nebo nápoj, jak je nárokováno v nároku 69, vyznačující se tím, že sloučenina je sloučeninou vzorce 1, jak je nárokována v nároku 36.

71. Použití sloučeniny vzorce 1, jak je nárokována v nároku 36, izolovaná z rostliny rodu Trichocaulon nebo z rodu Hoodia pro přípravu léčiva mající aktivitu snižující chuť k jídlu.

72. Použití podle nároku 71,vyznačující se tím, že sloučenina je izolována z druhu Trichocaulon piliferum nebo Trichocaulon officinale nebo z druhu Hoodia currorii, Hoodia gordonii nebo Hoodia lugardii.

73. Kompozice mající aktivitu snižující chuť k jídlu, vyznačující se tím, že zahrnuje sloučeninu vzorce 1 izolovanou z rodu Trichocaulon nebo rodu Hoodia.

Ί4. Kompozice jak je nárokována v nároku 73, vyznačující se tím, že sloučenina se • ·.

- 137 izoluje a/nebo čistí z rostliny druhu Trichocaulon piliferum nebo Trichocaulon officinale a z druhu Hoodia currorii,

Hoodia gordonii nebo Hoodia lugardii.

75. Kompozice jak je nárokována v nároku 73, vyznačující se tím, že sloučenina se izoluje a/nebo čistí z extraktu odvozeném z rostliny druhu Trichocaulon piliferum nebo Trichocaulon officinale nebo z rostliny druhu Hoodia currorii, Hoodia gordonii nebo Hoodia lugardii.

76. Kompozice jak je nárokována v nároku 73, nároku 74 nebo nároku 75,vyznačující se tím, že se smíchá s farmaceutickým excipientem, ředidlem nebo nosičem.

77. Kompozice jak je nárokována v nároku 76, vyznačující se tím, že se připraví v jednotkové dávkové formě.

78. Sloučenina vzorce 1, jak je nárokována v nároku 35, izolovaná z rostliny rodu Trichocaulon nebo z rodu Hoodia, pro použití jako léčivo mající aktivitu snižující chuť k j ídlu.

79. Sloučenina jak je nárokována v nároku 78, vyznačující se tím, že sloučenina se izoluje z rostliny druhu Trichocaulon piliferum nebo Trichocaulon officinale nebo z rostliny druhu Hoodia currorii, Hoodia gordonii nebo Hoodia lugardii.

80. Způsob snížení chuti k jídlu, vyznačující se tím, že se podá člověku nebo zvířeti účinná dávka kompozice jak je nárokována v kterémkoliv z nároků 73 až 77 včetně.

81. Kompozice mající aktivitu snižující chuť k jídlu, ♦ · ♦· ·· ·· ·♦ • ·· 9 9 · 9 '9 9

99 9 9 · · · ·· ·· • 99 999 999

9999 99 99 9999 9·

- 138 vyznačující se tím, že zahrnuje agonist receptorů melanokortinu 4.

82. Kompozice jak je nárokována v nároku 81, vyznačující se tím, že agonist je extrakt jak je nárokován v nároku 9, nároku 18 nebo nároku 25 nebo sloučenina jak je nárokována v kterémkoliv z nároků 35 až 48 včetně.

83. Kompozice jak je nárokována v nároku 81 nebo nároku 82, vyznačující se tím, že sloučenina je sloučenina vzorce 1, jak je nárokována v nároku 36.

84. Kompozice jak je nárokována v nároku 81, nároku 82 nebo nároku 83,vyznačující se tím, že se smíchá s farmaceutickým excipientem, ředidlem nebo nosičem.

85. Kompozice jak je nárokována v kterémkoliv z nároků 81 až 84 včetně, vyznačující se tím, že se připraví v jednotkové dávkové formě.

86. Použití agonistů receptorů melanokortinu 4 při přípravě léčiva mající aktivitu snižující chuť k jídlu.

87. Použití jak je nárokováno v nároku 86 extraktu jak je nárokováno v nároku 9, nároku 18 nebo nároku 25 nebo sloučeniny jak je nárokována v kterémkoliv z nároků 35 až 48 včetně.

88. Použití jak je nárokováno v nároku 87 sloučeniny vzorce 1 jak je nárokováno v nároku 36.

89. Agonist receptorů melanokortinu 4 pro použití jako léčiva mající aktivitu snižující chuť k jídlu.

90. Agonist receptorů melanokortinu 4 jak je nárokován v

139 nároku 89, který je extrakt jak je nárokován v nároku 9, nároku 18 nebo nároku 25 nebo sloučenina jak je nárokována v kterémkoliv z nároků 35 až 48 včetně.

91. Agonist receptorů melanokortinu 4, jak je nárokován v nároku 90, který je sloučenina vzorce 1, jak je nárokována v nároku 3 6.

92. Způsob snížení chuti k jídlu, vyznačuj ící se t í m, že se podá člověku nebo zvířeti účinná dávka kompozice jak je nárokována v kterémkoliv z nároků 81 až 85 včetně.

93. Použití agonistů receptorů ke snížení chuti k jídlu a/nebo k boji proti obezitě u člověka nebo zvířete.

94. Použití jak je nárokováno v nároku 93 extraktu jak je nárokován v nároku 9, v nároku 18 nebo nároku 25 nebo sloučeniny jak je nárokována v kterémkoliv z nároků 35 až 48 včetně.

95. Použití jak je nárokováno v nároku 94 sloučeniny vzorce 1 jak je nárokována v nároku 36.

96. Sloučenina mající strukturní vzorec