CZ360498A3 - Kočičí vakcína obsahující Chlamydia psittaci, způsob její přípravy a způsob prevence chlamydiové infekce u koček - Google Patents

Description

Oblast vynálezu

Vynález se týká deaktivované, iraunogenicky účinné a nereaktivní kočičí vakcíny proti Chlamydia psittaci, dále postupu výroby této vakcíny a způsobu prevence chlamydiové infekce u koček za použití této vakcíny.

Dosavadní stav techniky

Kočičí chlamydiáza je častým onemocněním spojivek a dýchacího traktu koček, známá pod názvem kočičí pneumonitida (FPn). Charakteristickým rysem tohoto vysoce nakažlivého onemocnění je kýchání a kašlání s přidruženými mukopurulentními výtoky z očí a čenichu (hlen a hnis). Na toto onemocnění jsou citlivé kočky všech věkových skupin, a i když mortalita není vysoká, toto onemocnění infikovaná koťata a starší kočky značně oslabuje. Vzhledem k extrémně infekční povaze představuje FPn závažný problém pro nemocnice, kliniky pro domácí zvířata i chovné stanice pro kočky. Předpokládá se zároveň, že perzistentní infekce pohlavního ústrojí Chlamydia psittaci je příčinou neúspěšného rozmnožování v chovných stanicích pro kočky.

Výsledky studií vakcinace s přípravky, obsahujícími modifikované živé Chlamydia psittaci, nebyly jednoznačné a poskytly rozporuplné výsledky. V publikaci : Cello, Am. J. Vet. Med. Assoc. 158:932-938, 1971, bylo prokázáno, že tyto vakcíny nepředstavují pro kočky významný způsob ochrany.

V publikaci : Shewen a kol., Can. J. Com. Vet. Res. 44:244-251, 1980, byl popsán způsob částečné ochrany pomocí této vakcíny, zatímco v publikaci : McKercher (Am. J. Vet. Res. 13;557-561, 1952, a v dalších publikacích autoři uvádí téměř 100 % ochranu, poskytovanou těmito vakcínami. Protože však vakcinované kočky dostávají živé Chlamydia psittaci, mohou se některé z těchto mikroorganismů přenést na jiné kočky a výsledkem může být opačný proces.

Studie s deaktivovanými chlamydiovými vakcínami vedly k různorodým výsledkům a k nepřijatelným lokálním a systémovým reakcím u vakcinovaných koček. Studie se srovnatelnými typy expozice, provedené se čtyřmi přípravky deaktivovaných vakcin a sériově vyráběnou modifikovanou živou vakcinou ukázaly, že deaktivované přípravky nezajišťují prakticky žádnou ochranu proti chlamydiovým infekcím u koček (viz. publikace : Shewen a kol., Can. J. Comp. Med. 44:244-251, 1980). Vakcína s deaktivovanou Chlamydia psittaci je popisována v patentu Spojených států amerických č. 5 242 686 (autoři Chu a kol.). Tato vakcína však není čištěná a po podání kočkám způsobuje nepřijatelné lokální reakce (COMPENDIUM).

Jestliže je známo, že vakcíny s modifikovanými živými chlamydiovými viry mohou být vzhledem k možnosti přenosu virů nebezpečné pro jiná zvířata, dále, že se mohou rekombinovat s divokými kmeny Chlamydia psittaci a může dojít k obnově jejich virulence, a jestliže je rovněž známo, že vakcíny s deaktivovanými chlamydiemi, které j sou v současné době na trhu, jsou buď neúčinné nebo způsobují nepřijatelné lokální reakce, potom je zřejmé, že v tomto oboru existuje potřeba účinných, nereaktivních vakcin proti chlamydiovým infekcím.

• β · · • 4» · * • » ·· • · · · · · • · ·

Podstata vynálezu

Cílem předloženého vynálezu je nabídnout přípravek, obsahující deaktivovanou chlamydii, s vysokou imunogenitou bez vysokého podílu antigenové hmoty, určený pro použití u koček. Dalším cílem tohoto vynálezu je nabídnout jednoduchý způsob výroby vhodné čištěné Chlamydia psittaci pro výrobu nereaktivni, účinné vakcíny jako monovalentního přípravku nebo v kombinaci s dalšími kočičími antigeny.

Tento vynález se týká deaktivované, imunogeneticky účinné Chlamydia psittaci, inkorporované do vakcín proti chlamydii ve velmi malých množstvích (nízká antigenová zátěž neboli nízký podíl antigenové hmoty), která se čistí mimo buňky, v nichž se pěstuje, přičemž tímto způsobem se získává vakcína, která po podání kočkám je nereaktivni, avšak vysoce účinná. V této vakcíně je imunogenicky účinná, čištěná Chlamydia psittaci o nízké antigenové hmotě, kombinovaná s účinným množstvím adjuvans a farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředidlem pro tyto látky. Proces čištění při výrobě Chlamydia psittaci zahrnuje několik kroků, mezi něž patří použití membrány žloutkového vaku, omytí žloutkového materiálu jako výchozího produktu k inokulaci linie savčích buněk, jako například linie buněk Buffalo Green Monkey (BGM) (ATCC č. ) načež po skončení destrukce buněk chlamydii (cytopatický účinek neboli CPE) následuje odstranění buněk a jejích zbytků z přípravku před deaktivací. Jedním z hlavních požadavků tohoto vynálezu je, aby linie buněk, použitá k pěstování Chlamydia psittaci, byla mikroorganismem zničena do 7 dnů od infekce Chlamydii psittaci (průkaz minimálně 80 % CPE do 7 dnů od infekce chlamydii).

• · · • · ··· • · · · · • · · ·

• · · ·

Popis přiloženého obrázku

Na přiloženém obrázku 1 je znázorněn graf, představující skupinový přehled klinických skóre (průměrné skóre/den, který je dále uveden v tabulce 1, ukazující, že pokud se do vakcíny inkorporovala velmi malá množství Chlamydia psittaci (méně než 50 pg/dávku), zajišťovala tato dávka stejnou ochranu jako velká množství Chlamydia psittaci (50 až 1000 pg/mililitr, jak je uvedeno v publikaci Chu a kol.).

Podle předmětného vynálezu byla vyvinuta kompozice vakcíny obsahující velmi malé množství čištěné, deaktivované, imunogenicky účinné Chlamydia psittaci v kombinaci s účinným množstvím adjuvans, a farmaceuticky přijatelného nosiče nebo ředidla těchto látek, kterou lze kombinovat s jinými kočičími antlgeny. Po podání kočkám je vakcína nereaktivní, avšak vysoce účinná.

Termín imunogenicky účinné množství, ve smyslu, v něž se používá v tomto textu, označuje schopnost Chlamydia psittaci, obsažené ve vakcíně, chránit po vakcinaci kočky před infekcí Chlamydia psittaci. Termín velmi malé množství se týká množství Chlamydia psittaci, přidaného k vakcíně, které je menší než 50 pg/dávku. Termín čištěný se týká procesů, při nichž dochází k odstranění přítomnosti žloutkového materiálu v konečné vakcíně. Mezi tyto procesy patří (tento výčet však není úplný) inokulace tkáňové kultury membránou žloutkového vaku, která byla omytím zbavena žloutkového materiálu, fyziologickým roztokem, umletí a opětné suspendování ve fosfátovém pufru s použitím linie buněk zničených Chlamydii psittaci, a odstranění buněk a jejich zbytků před deaktivací Chlamydia psittaci.

··

9 9

9 999

9 9 9 9

9 9 9

99

Dó rozsahu předmětného vynálezu náleží i postup přípravy vakcíny proti chlamydiovým infekcím, při němž se provede kultivace Chlamydia psittaci ve žloutkovém vaku, odběr membrány žloutkového vaku z tohoto žloutkového vaku a jejím zmražení jako základního výchozího produktu k inokulaci, kultivace tohoto základního výchozí produktu k inokulaci nebo pasážováni tohoto základního výchozího produktu k inokulaci vysoce senzitivní buněčnou linií, pěstované na povrchu až do doby, kdy je minimálně 80 % této buněčné linie zničeno Chlamydii psittaci, odběr zničené senzitivní buněčné linie a média obsahujícího Chlamydia psittaci, doprovázející uvedenou buněčnou linii, odstraněni zničené buněčné linie z Chlamydia psittaci, deaktivace Chlamydia psittaci a smícháni deaktivované Chlamydia psittaci s adjuvans a fyziologicky přijatelnou nosičovou látkou.

Chlamydia psittaci má vývojový cyklus z odlišnými reprodukčními (retikulárními tělísky) a infekčními (základní tělíska) formami. Pokud se pěstuje v buněčných liniích, nejčastěji používaných k pěstování chlamydií (například buňky psích jater, McCoyovy buňky a buňky CRFK), nemá tento mikroorganismus úplný cytopatický účinek na desku s buňkami. Při výrobě se tak obtížně stanovuje optimální doba odběru. Dochází i k produkci chlamydií s nízkou imunogenitou, takže je nutno provádět opakovaně jejich odběr z buněk nebo je po odběru vysoce koncentrovat. V některých případech (popsaných v patentu Spojených států amerických č. 5 242 686) je nutno provádět jejich deaktivaci v subkultuře. Výsledkem těchto procedur je vakcína s vysokou antigenovou zátěží (vysoká antigenová hmota o hodnotě 50 až 1000 pg/dávku) a s reaktivitou u koček po vakcinaci. Infikování buněk, jako • · · · • 9 999 • · · · · • · · · ·· ·· · ·· 99 • 9 9 9

9 99

999 9 9

9 9

99 je například buněčná linie Buffalo Green Monkey, které jsou vysoce senzitivní vůči infekci mikroorganismem Chlamydia psittaci, vede k úplné destrukci desky s buňkami, kdy je pak počet infekčních mikroorganismů v kultuře velmi vysoký. Tyto mikroorganismy lze snadno odstranit (vyčistit) z buněk a zbytků (debris) buněk filtrací, centrifugací nebo ultracentrifugací a, pokud se formuluje do vakcíny obsahující adjuvans a přijatelný farmaceutický nosič je velmi malé množství odebraných vyčištěných Chlamydia psittaci (< 50 gg/dávku) imunogenicky účinné.

Podle vynálezu se izolát Chlamydie, jako je kmen Cello Chlamydia psittaci, nejdříve šířil v membráně žloutkového vaku vajec s kuřecími embryi. Izolát Chlamydia psittaci byl inokulován do žloutkového vaku vajec s kuřecími embryi a inkuboval se 5 až 7 dní při teplotě 37 °C. Počínaje pátým dnem byla vejce byla každý den prohlížena proti světlu, aby se určila jejich viabilita. V den, kdy bylo zjištěno uhynutí embryí u 25 % vaj ec, byly membrány žloutkových vaků stále ještě viabilních vajec odebrány, vymyty fosfátovým pufrem, aby se zbavily přebytečného proteinu ve žloutku a asepticky smíchány, načež následovalo opětné suspendování těchto smíchaných membrán ve fosfátovém pufru. Jednomililitrové alikvótní podíly tohoto smíchaného a resuspendovaného výchozího produktu k inokulaci byly uloženy ve zmraženém stavu při teplotě -70 °C. Stejným postupem jako je uvedeno shora se provádí až 5 pasáží tohoto zárodečného materiálu (výchozí produkt), čímž se získá zárodečný produkt, použitelný k inokulaci buněk tkáňové kultury.

Při výrobě antigenu vakcíny s Chlamydia psittaci se začíná přípravou kultury tkáňových buněk. Buňky Buffalo Green Monkey se pěstovaly v Dulbeccově médiu MEM s vysokým ·· ·· • · · · • · ··· • · · · ♦ • · · · ♦ · ·· · ·· ·· » · · 4

I · ·· «·· · 1 • · « ·« ·· obsahem glukózy (DMEM/H)obsahuj ícím 5 % fetálního bovinního séra, 10 mM pufru HERPES a neomycin. Jakmile byly buňky konfluentni, byly infikovány Chlamydií psittaci v DMEM/H s neomycinem. Chlamydia psittaci se absorbovala do buněk s malým objemem média a pak bylo přidáno další DMEM/H médium. Infikované buňky byly inkubovány po dobu 5 až 7 dní při teplotě 37 °C. Za normálních okolností bylo 6. den po infikování 90 až 100 % desek s buňkami zničeno. V této fázi byl proveden odběr Chlamydia psittaci (odběrová tekutina), což bylo provedeno protřepáváním s nádobami, aby se odstranily veškeré zbylé buňky. Buňky a zbytky (debris) buněk byly z odběrových tekutin odstraněny pomocí filtrů schopných zachytit částice o velikosti přes 5 mikrometrů nebo centrifugací. Poté se provedla deaktivace vyčištěných odběrových tekutin. Mezi deaktivační činidla patří binární ethylenimin, formalin, thimerosal a betapropiolakton, přičemž ovšem tento výčet není na tato činidla omezen. Hodnota pH byla upravena na neutrální hodnotu a vyčištěné odběrové tekutiny byly adjustovány na imunogenicky účinné množství pro přípravek s adjuvans zředěním ve fosfátovém pufru. Imunogenicky účinné množství Chlamydia psittaci bylo obvykle menší, než 50 gg/dávku a ve výhodném provedení nižší než 10 gg/dávku. Pro tyto účely je možno použít libovolného adjuvans. Mezi možné adjuvans, které byly použity v případě předmětného vynálezu, patří polymery a kopolymery, polymery a kopolymery kyseliny akrylové, kyselina polyakrylová jako Carbopol, povrchově aktivní činidla jako hexadecylamin, saponin, Quil A, hydroxid hlinitý, fosforečnan hlinitý, peptidy jako je muramyldipeptid, olejové emulze, imunomodulátory jako jsou interleukiny a interferony, induktory interferonů, kopolymery ethylenu a anhydrid kyseliny maleinové jako jsou EMA-31, NEOCRYL A640 a POLYGEN^ (které je možno získat od firmy MVP Laboratories), přičemž • · • · • ··· • · I • · ( ·· • · · · • ··· · · ·· ·· ovšem tímto výčtem není rozsah použitelných látek nijak omezen. Lze též použít směsí libovolných výše uvedených adj uvans nebo kombinaci adj uvans.

Podle předmětného vynálezu bylo zjištěno, že popsané adjuvans působ! v účinných množstvích mezi 0,01 % a 50 % obj./obj. celkové dávky vakcíny. Ve výhodném provedeni se nastaví koncentrace adj uvans na hodnotu mezi 1 % a 15 %. Podle j eště výhodněj šího provedení se POLYGEN používá v koncentracích mezi 1 % a 5 % a Carbopol se používá v koncentracích mezi 0,1 % a 0,5 %.

Kompozice vakcíny v případě předmětného vynálezu rovněž zahrnuje i farmaceuticky přijatelný nosič nebo ředidlo a může obsahovat i další kočičí antigeny, jako jsou antigeny pro kočičí rinotracheitidu, kočičí leukémii, kočičí kalicivirus a kočičí panleukopénii, virus imunodeficience koček, kočičí infekční peritonitidu, Toxoplasma gondti a vzteklinu.

·· • · · • · ··· · · ·

4 4 4 • 4 *· » 4 4 4 ··· · ·

4 4 • 4 44

TABULKA 1

Přehled výsledků pro jednotlivé skupiny (klinická skóre) a průměrné výsledky za den (průměrné skóre/den)

Den	Kontrolní skupina	25 μΐ antigenová hmota	50 μΐ antigenová hmota	100 μΐ antigenová hmota
-3	0,00	0,00	0,00	0,00
1	0,05	0,00	0,00	0,05
5	2,63	0,78	1,00	0,85
9	3,38	0,88	0,75	0,63
13	3,60	0,93	0,63	0,58
17	3,23	0,90	1,00	0,73
21	3,76	0,68	0,98	0,93
25	3,15	0,20	0,65	0,60
Průměr 5.-28.den	3,29	0,73	0,83	0,72

V následující tabulce č. 2 je demonstrována účinnost multikomponentní vakcíny, obsahující deaktivovaný virus kočičí rinotracheitidy, kočičí kalicivirus, virus kočičí panleukopénie, virus kočičí leukémie a kočičí Chlamydia psittaci, připravená podle tohoto vynálezu.

·· ·· • · · · • · · · ··· · · • · · ·· ··

TABULKA 2

Výsledky testování účinnosti pětisložkové kočičí vakcíny, obsahující kočičí Chlamydia psittaci, viry kočičí rinotracheitidy, leukémie, kočičí kalicivirus a virus kočičí panleukopénie

Antigen při expozici	Odpověď titru č. > l:8/celkem	Ochrana
Kočičí panleukopénie SC	4/4	100%
IM	4/4	100 %
CONT	0/4	0%
Kočičí leukémie SC	NA	80%
IM	NA	90%
CONT	NA	22%
Kočičí rinotracheitida SC	NA	vynikající „T“ = 34
IM	NA	vakc. C.M. = 9,7 cont. C.M. = 49,3 vynikající „T“ = 34
CONT	NA	vakc. C.M. = 8,3 kont. C.M. = 49,3 žádná
Kočičí kalcivirus SC	NA	vynikající „T“ = 34
IM	NA	vakc. C.M. = 9,0 cont. C.M. = 20,0 vynikající „T“ = 34
		vakc. C.M. = 4,7 kont. C.M. = 20,0
CONT	NA	žádná
Kočičí Chlamydia psittaci SC	NA	vynikající, AV M.S. = 0,54
IM	NA	vynikající; AV M.S. = 0,49
CONT	NA	žádná, prům. AV M.S. = 2,04

C.M. - kumulativní skóre

A V M.S. - průměrné skóre „T“ - statistický výpočet (jednosměrná modifikace Wilcoxonova testu o dvou vzorcích v modifikaci Mann-Whitney) srovnávající klinická skóre vakcino váných versus kontrolních koček (definované pomocí hodnot 9 CFR 115.130, 113.149, 113.131, 115.150, SAM 310 a SAM 311. Hodnota „T“ > 31 se rovná ochraně).

Φ* Φ· • · · « ♦ · »·

Jako další možné aplikace předloženého vynálezu lze vakcínu podávat ve formě přípravku s pozvolným uvolňováním, například přípravek s laktid-glykolidovým kopolymerem, ve formě mikročástic, umožňující pozvolné uvolňováni nebo ve formě implantátu.

Do rozsahu předmětného vynálezu náleží i způsob prevence vzniku chlamydiové infekce u koček, kdy se kočce podává imunogenicky účinné množství vakcíny, která je blíže popsána výše. Při použití předloženého vynálezu se jedná o parenterální způsoby aplikace (subkutánní, intramuskulární, intraperitoneálni a intradermální) nebo perorální/nasální způsob aplikace. Výhodnými způsoby aplikace j sou subkutánní a intramuskulární. Ukázalo se, že účinným léčebným režimem je minimálně dvojitá aplikace vakcíny, přičemž interval mezi každou aplikací je 2 až 4 týdny, ideálně 14 až 30 dni.

Příklady provedení vynálezu

Kočičí vakcína obsahující Chlamydia psittaci, postup její přípravy a použití a aplikace jsou blíže vysvětleny v následujících konkrétních příkladech, přičemž tyto příklady jsou pouze ilustrativní a nijak neomezují rozsah předmětného vynálezu.

Příklad 1

Monovalentní vakcína proti Chlamydia psittaci u kočky

Uchovávaný podíl buněk Buffalo Green Monkey se rozmrazil, načež byl tento podíl přidán do růstového média obsahujícího DMEM/H + 5% fetálního hovězího séra, 10 mM HERPES pufru a 30 gg/ml neomycinu a tento podíl byl odstřeďován po dobu 10 až 15 minut při 400 až 600 g. Odstředěný podíl buněk se poté převedl do suspenze v čerstvém růstovém médiu a potom byl vložen do otáčecích lahví. Otáčecí lahve se inkubovaly při teplotě 37 °C, až buňky dozrály do konfluence (splynutí)

Subkultury buněk se získávaly až do doby, kdy byl k dispozici požadovaný počet otáčecích lahví pro výrobní účely. Velikost výrobních šarží obvykle dosahuje 50 až 500 otáčecích lahví. Ve fázi kdy byly produkční kultury buněk BGM v otáčeních lahvích 3 až 5 dní staré a konfluentni z minimálně 95 %, odstranilo se růstové médium a přidal se výchozí produkt k inokulaci Chlamydia psittaci při multiplicitě infekce (MOI) od 0,01 do 0,1. Médiem, použitým k pěstování Chlamydie, bylo DMEM/H plus 30 gg/ml neomycinu. Otáčení lahve se znovu inkubovaly pro absorbci Chlamydie při teplotě 36 až 38 °C podobu 1 hodiny a pak se do každé otáčení lahve přidalo 200 mililitrů dalšího média. Inkubace při teplotě 36 až 38 °C pokračovala dalších 5 až 7 dní až do dosažení hodnoty CPE > 80 %. Tekutina z otáčecích lahví se odebrala třepáním otáčecích lahví, aby se z povrchu odstranily všechny zbývající buňky a přenesly se odběrové tekutiny do nádoby. Odběrová tekutina se vyčistila filtrací přes polypropylenový filtr (5 mikronů), aby se odstranily přebytečné zbytky (debris) buněk. Vyčištěné buňky se deaktivovaly pomocí 0,01 M binárního ethyleniminu (BEI) po dobu 72 hodin při teplotě 2 až 8 °C. Po deaktivaci se BEI neutralizoval thiosulfátem sodným na konečnou koncentraci 0,02 M.

Vyčištěný, deaktivovaný produkt Chlamydia psittaci se zředil na tři různé hladiny antigenu (tři různé antigenové hmoty). Nejvyšší zkoušená antigenová hmota byla « · • ··

100 gl/dávku, což se rovnalo přibližně hodnotě 100 gg/dávku, středně vysoká zkoušená antigenová hmota dosahovala hodnoty 50 gl/dávku, což se přibližně rovnalo hodnotě 50 gg/dávku, a nejnižší zkoušená antigenová hmota činila 25 gl/dávku, neboli přibližně 25 gg/dávku. Všechny antigenové hmoty byly zředěny fosfátovým pufrem tak, aby celkový objem každého přípravku byl 0,95 mililitru.

K získání hotových vakcín se do každého přípravku přidal n

POLYGEN o objemu 0,05 mililitru jako adjuvans. Tyto vakcíny v dávce 1 mililitr byly podávány skupinám 5 séronegativních koček v intervalu 3 týdnů. První dávka byla podána v den 0, druhá dávka v 21.den. Skupina 5 séronegativních koček stejného věku a ze stejného prostředí nebyla vakcinována a tvořila nevakcinované kontroly. Všechny kočky byly infikovány intranasálně a intraokulárně virulentním kmenem Chlamydia psittaci 2 až 8 týdnů po pomocné druhé dávce. Všechny kočky byly sledovány po dobu 28 dní na přítomnost klinických známek onemocnění Chlamydia psittaci včetně teploty, . výtoku z očí, konjunktivity, exsudátu z čenichu, kýchání, kašláni, dyspney, anorexie, dehydratace a depresí. Analýza dat se prováděla technikou vyhodnocování skóre vážením. Vážnější známky onemocnění dostávaly vyšší číselné hodnoty. Všechna data byla statisticky analyzována ve čtyřdenním intervalu a jsou uvedena v tabulce 1. Tyto data jsou v grafické formě uvedena na obr.l.

Výsledky, uvedené v tabulce 1 a na obr.l, jasně ukazují, že Chlamydia psittaci, pokud byla připravena podle tohoto vynálezu, je účinná při antigenové hmotě již 25 gg/dávku. Protože vakcínou s tak nízkou antigenovou hmotou zajišťovala ochranu odpovídající ochraně, kterou poskytovala vakcína s vysokou antigenovou hmotou, lze předpokládat, že hodnoty nižší než 25 gg/dávku, pokud se • · * · « a · · · · · * · ·· * 1 a a · · · • · ·♦· ? »«····· • · · · · * _A ··· připraví podle předloženého vynálezu, by též měly ochranný účinek.

Příklad 2

Deaktivovaná kočičí Chlamydia psittaci, připravená podle příkladu 1 tohoto vynálezu, byla smíchána se čtyřmi dalšími deaktivovanými kočičími antigeny, aby vznikla vícesložková vakcína. Chlamydia psittaci (10^’® Τϋΐϋ^θ/πιΐ) s 35 mililitrů POLYGENu jako adjuvans bylo smícháno s virem kočičí leukémie při antigenové dávce 1,25 ELISA relativní potence jednotka/dávka s POLYGENem jako adjuvans, 10®’® TCID^o/dávku viru kočičí rinotracheitidy s POLYGENem jako adjuvans, 10^’® TCID^g/dávku kočičího kaliciviru s POLYGENem jako adjuvans a 10^’^ TCID^g/dávku viru kočičí panleukopénie s POLYGENem jako adjuvans. Tato pětisložková vakcína byla zkoušena na účinnost při vakcinaci/infekci u koček. Na začátku experimentu byla všem kočkám odebrána krev na získání vzorků séra a plné krve. U sér byly stanoveny titry protilátek proti virům kočičí rinotracheitidy, kaliciviru a panleukopénie. U všech koček bylo testování zahájeno s titry menšími než 1 : 2 pro tyto viry. Kočky použité v protokolu FeLV vykazovaly negativitu na antigen p27. Pět skupin koček (n = 74) ve věku 13 až 15 týdnů bylo vakcinováno a o tři týdny později dostaly pomocnou dávku 1,0 mililitr pětisložkové vakcíny. Přibližně polovina koček byla vakcinována subkutánně a polovina dostala vakcínu intramuskulárně.

Osm vakcinovaných (čtyři subkutánně a 4 intramuskulárně) koček a jedna kontrolní kočka bylo hodnoceno na sérologickou odpověď na vakcinaci a pomocnou dávku proti kočičí panleukopénii. Sérologická odpověď 1 : 8 • · » ·4 • · « · ·· • · • · < » ·· se u tohoto přípravku považuje za hodnotu znamenající ochranu. Výsledky po vakcinaci jsou uvedeny v tabulce 2.

Dvanáct koček, jimž byla aplikována pětisložková vakcína (6 subkutánně a 6 intramuskulárně) a čtyři nevakcinované kontrolní kočky byly infikovány virulentním virem kočičí rinotracheitidy. Před infikováním byly odebrány krční stery a krevní vzorky. Po infikování byly všechny kočky sledovány na známky onemocnění. Klinické známky onemocnění a teplota byly zaznamenávány a analyzovány s použitím průměrných skóre, uvedených v tabulce 2. Účinnost se prokazuje statisticky významným rozdílem v klinických skóre mezi vakcinovanými kočkami a kontrolami.

Dvanáct koček, jimž byla jimž byla aplikována pětisložková vakcína (6 subkutánně a 6 intramuskulárně) a čtyři nevakcinované kontrolní kočky byly infikovány virulentním kočičím kalicivirem. Po infikování byly odebrány krční stěry a krevní vzorky. Kromě toho byly kočky sledovány na známky onemocnění. Dále byly zaznamenávány klinické známky, bylo vyhodnoceno skóre a byla provedena analýza dat, jejíž výsledky jsou uvedeny v tabulce 2. Účinnost se prokazuje statisticky významným rozdílem v klinických skóre mezí vakcinovanými kočkami a kontrolami.

Dvanáct koček, j imž byla j imž byla aplikována pětisložková vakcína (10 subkutánně a 10 intramuskulárně) a deset nevakcinovaných kontrolních koček bylo infikováno virulentním virem Chlamydia psittaci a sledováno na přítomnost klinických známek onemocnění, jak uvedeno v příkladu 1. Těmto klinickým známkám onemocnění bylo přidělováno skóre. Účinnost se prokazuje statisticky významným rozdílem mezi skóre vakcinovaných koček a kontrol.

• · ·· ·· • · · • · ···

Souhrnné výsledky tohoto experimentu jsou též uvedeny v tabulce 2.

Dvacetdva koček, jimž byla aplikována pětisložková vakcína (11 subkutánně a 11 intramuskulárně) a devět nevakcinovaných kontrolních koček, bylo infikováno virulentním virem FeLV. Tento pokus vyžaduje provést nejprve imunosupresi koček a poté je po následující dva dny infikovat. Kočky byly po 3. týdnu až do 12. týdne po infekci kontrolovány na přítomnost virémie na základě detekce antlgenu p27 v krvi s použitím techniky nepřímé imunofluorescence (IFA). Ochrana byla stanovena podle zásad, popsaných v publikaci : Shibley a kol. (JAVMA 1991, 199: 1402-1406) a uvedených v tabulce 2.

Z tabulky 2 je zřejmé, že všech pět složek této vícesložkové vakcíny, obsahující kočičí Chlamydia psittaci podle tohoto vynálezu, bylo účinných. Je třeba si též uvědomit, že žádná vakcinovaná kočka v této studii, ani žádné vakcinované kočky v jiných studiích, provedených s vakcínou Chlamydia psittaci nebo s vícesložkovými vakcínami obsahujícími Chlamydia psittaci, neprokázaly lokální ani systémové reakce na vakcínu. Hlavním důvodem pro tuto absenci reaktivity byla nízká antigenová hmota Chlamydia psittaci.

I když se v popisu předmětného vynálezu uvádějí konkrétní aplikace předloženého vynálezu, je třeba si uvědomit, že lze použít různých modifikací a změn, které jsou zřejmé odborníkům pracujícím v tomto oboru a obeznámené se současným stavem techniky, a které též spadají do rámce vynálezu podle následující definice patentových nároků • ·· .! ·· «

W ΘΘ PRAHA 2, Hí

Claims (14)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Deaktivovaná, imunogenicky účinná a nereaktivní vakcína proti Chlamydia psittaci, vyznačující se tím, že obsahuje velmi malé množství Chlamydia psittaci.
2. 2. Deaktivovaná, imunogenicky účinná a nereaktivní vakcína proti Chlamydia psittaci podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedené velmi malé množství Chlamydia psittaci je množství nižší než 50 pg/dávku.
3. 3. Deaktivovaná, imunogenicky účinná a nereaktivní vakcína proti Chlamydia psittaci podle nároku 1, vyznačující se tím, že dále obsahuje kočičí antigen jiný, než Chlamydia psittaci.
4. 4. Deaktivovaná, imunogenicky účinná a nereaktivní vakcína proti Chlamydia psittaci podle nároku 3, vyznačující se tím, že jiný kočičí antigen je vybrán ze skupiny zahrnující kočičí rinotracheitis, kočičího kalcivir, vir kočičí leukémie, Toxoplasma gondii, vir vztekliny, vir kočičí panleukopénie, vir kočičí imunodeficience a vir kočičí infekční peritonitidy.
5. 5. Způsob přípravy vakcíny proti chlamydiovým infekcím, vyznačující se tím, že zahrnuje:

   - kultivaci Chlamydia psittaci ve žloutkovém vaku,

   - odběr membrány žloutkového vaku z uvedeného žloutkového vaku a zmrazení odběrového materiálu jako základního zárodečného produktu k inokulaci, ·· ·9 » 9 · ·

   - kultivaci uvedeného základního zárodečného produktu k inokulaci nebo pasáže uvedeného základního zárodečného produktu ve vysoce senzibilní buněčné linii pěstované na povrchu tak dlouho, dokud není minimálně 80 % buněčné linie zničeno Chlamydií psittaci,

   - odebrání zničené senzibilni buněčné linie a média obsahujícího Chlamydia psittaci a doprovázejícího uvedenou buněčnou linii,

   - odstranění zničené buněčné linie z Chlamydia psittaci,

   - deaktivaci Chlamydia psittaci,

   - smíchání deaktivované Chlamydie psittaci s adjuvans a fyziologicky přijatelným nosičem.
6. 6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že vysoce senzibilní buněčnou linií je buněčná linie Buffalo Green Monkey.
7. 7. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že uvedená deaktivace zahrnuje přidání účinného množství deaktivační látky k deaktivaci Chlamydia psittaci, která si stále ještě podržuje imunogenitu.
8. 8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že se uvedená deaktivační látka volí ze skupiny látek zahrnující binární ethylenimin, beta-propiolakton, formalin, merthiolát, thimerosal, glutaraldehyd a detergenty.
9. 9. Způsob podle nároku 7, vyznačujíc! se tím, že deaktivační látkou je binární ethylenimin.
10. 10. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že se adjuvans volí ze skupiny zahrnující polymery a kopolymery, polymery a kopolymery kyseliny akrylové, kyselinu polyakrylovou jako Carbopol, povrchově aktivní látky jako hexadecylamin, saponin, Quil A, hydroxid hlinitý, fosforečnan hlinitý, peptidy, jako je muramyl dipeptid, olejové emulze, imunomodulátory jako jsou interleukiny a interferony, induktory interferonu, kopolymery ethylenu a anhydridu kyseliny maleinové, jako je EMA-31, NEOCRYL A640 a POLYGEN® a jejich směsi.
11. 11. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že adjuvans je POLYGEN^.
12. 12. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že se fyziologicky přijatelný nosič je zvolen ze skupiny zahrnující fosfátový fyziologický pufr, fyziologický roztok a minimální základní médium.
13. 13. Způsob prevence chlamydiové infekce u koček, vyznačující se tím, že zahrnuje aplikaci imunogenicky účinného množství vakcíny podle nároku 3 kočce.
14. 14. Způsob prevence chlamydiové infekce u koček, vyznačující se tím, že zahrnuje aplikaci imunogenicky účinného množství vakcíny podle nároku 5 kočce.

    Zastupuje :

    Dr. Miloš Všetečka ·· *· ·· ·♦ • · · · · • · *·· . · · · i · · i · ;

    .· ··. • ·· ··· · «

    Klinické skóre