CZ361697A3 - Virová agens asociovaná se záhadnou chorobou prasat - Google Patents

Description

1 7Ψ 3616 -?7> 94 9 94 94 • · · « Μ ····

Virová agens asociovaná se záhadnou chorobou prasat

Oblast techniky Předkládaný vynález se týká oblasti imunologie a virologie, přesněji, vakciny odvozené od patogenního virového izolátu. Přesněji, patogenní forma viru je modifikována nebo atenuována na avirulentní formu podle metody produkce vakciny pro použití proti ničivé nové chorobě prasat.

Dosavadní stav techniky

Nové onemocnění prasat, různě označované jako "záhadná choroba prasat", "syndrom prasečí neplodnosti a respirační syndrom", "onemocnění modrých uší", "respirační a reprodukční syndrom prasat" (PRRS) je příčinou těžkých ztrát v chovných stádech ve Spojených státech a v Kanadě. Podobná choroba se také objevila ve většině Evropy. Choroba se manifestuje ve dvou formách, jedna způsobuje reprodukční selhání, a druhá způsobuje respirační tíseň u mladých selat. Reprodukční forma onemocnění je popsána v Kaffaber, K.K., "Reproductive Failure of Unknown Etiology", American Association of Swine Practitioners Newsletter, l: 109 (1989).

Nevýznamnějšími klinickými příznaky reprodukční formy onemocnění jsou spontání pozdní potraty, předčasné porody (které mohou tvořit až 20 - 30% všech porodů) a porody mumifikovaných plodů, mrtvě narozených nebo nemocných selat. Takové klinické příznaky budou typicky pozorovány ve stádech od 4-16 týdnů, nebo i déle. Mrtvě narozené plody v postižených vrzích jsou často v časných stadiích mumifikace, jak je ukázáno ♦ · P • · · • · · · • « ···· ·

♦ ··♦· 2 ·♦ » i ·· světlehnědým zabarvením kůže a post-mortem autolýzou. Někdy jsou také pozorovány kupolovíté malformace fetálních lebek. Infekce sviní nemusí být zaznamenána, nebo se může sama manifestovat poruchou celkového stavu trvající více než několik dní. Například, svině mohou trpět nechutenstvím a mohou mít tělesnou teplotu nad nebo pod normálem. V období, kdy mají mladé, mohou prasata vykazovat depresi, letargii, pyrexii a příležitostně zvracení. V některých postižených stádech může být ztraceno až 75% všech selat. Ekonomické následky onemocnění jsou proto ničivé.

Respirační formy onemocnění vykazují klinické příznaky, které jsou nejvýraznější u selat ve věku 3-8 týdnů, ale je popsáno, že se vyskytují u prasat všeho věku v postižených stádech. Nemocná selata pomalu rostou, mají hrubou srst, respirační tíseň ("sípání") a zvýšenou mortalitu (více než 80% před odstavením).

Zjištění velkých a mikroskopických lésí v předběžných studiích selat postižených respirační formou onemocnění naznačují, že mikroskopické plicní léze jsou významnou klinickou vlastností tohoto onemocnění. I přes zvýrazněné respirační příznaky onemocnění jsou plíce, které se zdají být nekomplikovány sekundární bakteriální infekcí makroskopicky bud' normální, nebo mají mírné, difusní světle hnědé zabarvení na povrchu plic. Nicméně, mikroskopické vyšetření plicní tkáně PRRS nemocných selat odhalí charakteristické vzorky intersticiální pneumonitidy, podle Collins, J. E. et al., "Respirátory Disease in Swine Herd Experiencing a Reproductive Failure Syndrome", Proceedings, Minnesota Swine Conference for Veterinarians, str. 254, St. Paul, MN (10.- 18.10.1990). 3 3 ·· * · · * · · · · · · • « · #·»· · ···· · · · · • ······· · · · • · * · · · II · ·· ·#·· V souladu s tím v oboru existuje reálná potřeba účinné vakciny, která může eliminovat nebo alespoň zmírnit účinky PRRS .

Oblast vynálezu Předkládaný vynález překonává problémy uvedené výše tím, že poskytuje vakcinu, která účinně redukuje nebo zabraňuje onemocnění způsobenému PRRS virem u prasat.

Obecně řečeno, vynález zahrnuje biologicky nebo virově čistou kulturu PRRS spolu se všemi jejími mutanty a metody pro produkci a použití těchto virionů. Přirozený virus je schopen způsobit PRRS u prasat, ale modifikované formy viru, nebo jejich nepatogenní mutanty, poskytují účinnou vakcinu proti tomuto onemocnění. Vakcina preferovaně obsahuje živý modifikovaný nebo atenuovaný virus a farmaceuticky účinný nosič. Modifikovaný virus je preferovaně propagován a udržován v buněčné linii opičích ledvin, a tato buněčná linie je preferovaně MA-104, což jsou Afričan Green Monkey Kidney buňky pasážované dvacet a více krát.

Patogenní virové agens bylo odebráno z tkáňového homogenátu infikovaných prasat a bylo potvrzeno způsobením PRRS choroby u mnoha selat a březích sviní. Depozitum izolovaného virového agens bylo uloženo 18.6.1991 v American Type Culture Collection v Rockville, Maryland, pod přírůstkovým číslem ATCC-VR2332. Virové agens je náročný, nehemaglutinující obalený RNA virus. Přirozený typ viru je preferovaně modifikován do v podstatě 4 ΦΦ · ♦· « » · · · • Φ · · · ♦ • ····· · · Φ Φ φ Φ β Φ φ· Φ ΦΦ ΦΦ • Φ φ · Φ φ Φ Φ * Φ φ Φ φ Φ * φ ΦΦΦ φ Φ Φ Φ • Φ φ φ Φ φ Φ φ Φ avirulentní formy na plné nebo parciální vrstvě opičích buněk za přítomnosti séra ve vhodném kultivačním mediu; inkubováním inokulované plochy buněk při teplotě okolo 35 °C až 37 °C dokud není pozorován cytopatický efekt a opakovaným pasážováním viru přes opičí buněčnou linii na kultivačním mediu za přítomnosti séra a za vhodných podmínek pasážování.

Vakcina obsahuje nosič, jako je sacharosový želatinový stabiliser, který je smísen s živým modifikovaným virem, který je produkován tak, jak bylo popsáno výše. Vakcina je preferovaně použita pro zabránění PRRS imunizací prasat lokálním (horní sliznice) způsobem nebo parenterálním způsobem vakcinace. Imunizovaná prasata typicky zůstávají bez příznaků onemocnění po expozici přirozenému typu viru.

Vakcina může být produkována v komerčních množstvích procesem obsahujícím kroky přípravy expansních kultur opičí buněčné linie; přípravy produkčních kultur infikováním expansních kultur atenuovaným virem; získáním produkčních kultur; stabilizací a lyofilizací viru.

Popis obrázků na připojených výkresech

Obrázek 1 je schematický diagram procesu pro použití ve výrobě komerčních množství PRRS vakciny. Následující nelimitující příklady podávají preferované metody a materiály pro použití v provádění předkládaného vynálezu. 5 ·· I • · · • « I « • ·«··· • · · ·· · * · · · • · · · • « · mé mě m m m m % ·mm m mm mm m mm m m m m m Příklady provedení vynálezu Příklad 1 izolace, identifikace a atenuace PRRS viru a produkce modifikované živé vakciny A. Izolace a identifikace

Tkáňový homogenát byl získán od selat z PRRS infikovaných stád. Tento homogenát pravidelně reprodukoval respirační a reproduktivní formy PRRS, pokud byl intranasálně inokulován gnotobiotickým selatům a březím sviním. Gnotobiotická selata takto inokuovaná buď nefiltrovaným, nebo filtrovaným (0,45, 0,22 nebo 0,1 μπι) inokulem se stávala anorektickými a vyvíjely se u nich mikroskopické plicní léze podobné lézím pozorovaným v PRRS postižených stádech. Stejné inokulum také způsobovalo reprodukční selhání identické tomu, které je pozorováno v PRRS postižených stádech.

Tkáňové homogenáty, ze kterých byl virus izolován, obsahovaly plicní tkáň (skupina 1) a kombinaci mozkové -slezinné - jaterní - ledvině tkáně (skupina 2) získaných od infikovaných selat v PRRS infikovaných stádech. Oddělené homogenátové skupiny byly každá centrifugována při 4000 x g po 25 minut. Vzniklý supernatant byl odebrán a byl filtrován za použití 0,45 mikronového sterilního injekčního filtru. Filtrované supernatanty byly potom kombinovány. Jeden ml kombinovaného filtrovaného supernatantu byl potom použit jako inokulum pro infikování každé z příslušných buněčných linií jak je popsáno dále.

Filtrovaný supernatant byl přidán do kultivačního media obsahujícího buněčnou linii jak je popsáno dále, modifikované Eaglovo medium ("MEM") od JRH Biosciences a gentamicin v koncentraci asi 100 μg na ml.

Byly provedeny dva testy pro každou buněčnou linii za použití 75 ml plastových nádob. V testu číslo 1 byl filtrovaný supernatant inokulován do dvou nádob, kdy každá nádoba měla plnou bněčnou vrstvu každé z buněčných linií uvedených dále. Dále, do první nádoby bylo přidáno asi 2,5 mg trypsinu. Všechny další podmínky byly stejné pro obě kultivační nádoby. V testu číslo 2 byl materiál kombinovaného tkáňového homogenátu inokulován do nádoby obsahující stejné buněčné linie jako byly použity v testu číslo 1; nicméně, buněčné vrstvy byly pouze 20 - 40% konfluentní v době inokulace. Medium dále obsahovalo asi 10% fetální hovězí sérum, které nebylo přítomno v mediu v testu 1. Inokulum bylo znovu podáno v množství asi 1 ml a kultura byla inkubována při asi 34 °C po přibližně 7 dní. Všechny nádoby byly inkubovány po dobu asi 7 dní při přibližně 34 °C. Výsledky byly zaznamenávány po asi 7 dnech. Po zmražení a roztáni byl vzorek odebrán pro druhou pasáž ve stejné buněčné linii. Zbylý materiál byl zmražen v kapalném dusíku a byl uskladněn při asi -60 °C. Výsledky testu 1 a testu 2 jsou shrnuty v tabulce 1: 7 ·· · *· ·· ·· ·· • · · · · · · * · · · ···· ♦ · · · · ♦· • · ♦··· · · · · · ··· · · • · · · « t · · · ·· · 4· ···· ·· ··

Tabulka 1

Testování buněčných linií pro virové hostitele

Použitá buněčná linie

Test č. 1 Test č. 2

Hovězí Turbinate (BV)

Feline ledvina (CRFK)

Opičí (Věro) ledvina Opičí (Věro) plíce Psí ledvina (MDCK)

Prasečí (PK2A) ledvina

Norčí plíce

Fretčí plíce

Hovězí plíce

Bizoní plíce

Hovězí ledvina (MDBK)

Prasečí varle (ST)

Opičí ledvina (MA-104) - +

Lidský rektální tumor (HRT-18) - NT

Lidská plíce NT + = CPE efekt - = bez CPE efektu NT= netestováno Žádný cytopatický efekt ("CPE") nebyl pozorován v testu č. 1 v žádné hodnocené buněčné linii. V testu Č. 2, nicméně, se malé shluky MA-104 buněk stávaly zbobtnalými a tvořily "malé dírky" v monovrstvě okolo okrajů nádoby. Kapalina byla separována z nádoby a pasážována do nové nádoby s MA-104 buňkami (znovu 20 - 8 ··· · · · · Μ «· • « * · · · · · · · · « · · « ·· · ···· • ······· · · · ···· · ··· «·« · · · * · · ♦ · ···· · · ·· 40% buněčná vrstva) a potom následně pasážována potřetí. Tento zřetelný CPE se stával silnějším s každou pasáží. Pasáž 3 zachovala jeho virulenci. Tato pasáž byla deponována v American Type Culture Collection v Rockville, Maryland, pod přírůstkovým číslem ATCC-VR2332. ATCC VR2332 virus pravidelně způsobuje klinickou symptomatologii PRRS, plicní léze u gnotobiotických prasat a pozitivní ImF výsledky. ATCC-VR2332 virus může representovat neidentifikovaný rod Togaviridae. ATCC-VR2332 není také známý patogen prasat, protože specifická antiséra k mnoha běžným patogenům prasat selhala jak při neutralizaci viru, tak při detekci antigenů v infikovaných buňkách. ATCC-VR2332 virus je náročný nehemaglutinující obalený RNA virus. ATCC-VR2332 virus roste v kontinuální buněčné linii, konkrétně MA-104 a jiných opičích buněčných liniích. ATCC-VR2332 virus roste do vysokých titrů (107 TCIDso/l ml) v komerční buněčné linii MA-104. ATCC-VR2332 virus obsahuje lipidový obal jak je ukázáno ztrátou infektivity po ošetření chloroformem. Lipidový obal může být také vizualizován jako elektronový transucentní kroužek obklopující prázdné částice. Morfologii PRRS viru není možné odlišit přímou elektronovou mikroskopií (DEM) a bude extremně obtížné ho identifikovat v přípravcích obsahujících buněčnou drti. Morfologie gradientně purifikovaných ATCC-VR2332 částic a průměrný průměr 62 nm jsou velmi podobné k virionům koňské Arteritidy a laktát dehydrogenasovým virům.

Virus koňské arteritidy má popsanou velikost v rozmezí 50 -

• t · 44 44 44 ti • I · 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 44 44 4 4444444 4 4 # 4444 4 444 444 444 44 4 44 4444 44 44 73 nm, což je podobné velikosti 48 - 84 nm pro ATCC-VR2332 virus. V několika částicích ATCC-VR2332 bylo pozorováno 30 - 35 nm jádro, které se podobá nukeleokapsidovému jádru popsanému pro virus košké arteritidy. Tak, morfologicky, ATCC-VR2332 virus se nejvíce podobá skupině virů arteritidy. Přítomnost RNA genomu v ATCC-VR2332 byla potvrzena schopností viru pokračovat v replikaci za přítomnosti 5-bromo-2 deoxyuridinu a mitomycinu C, o kterých je známo, že inhibují replikaci DNA a jedné rodiny RNA virů (Retroviridae), ale ne jiných RNA virů. Nicméně, stanovená klasifikace ATCC-VR2332 virus jako RNA viru je v souladu s pozorováním, že tento virus se replikuje v cytoplasmě buněk, jak je ukázáno přítomností virových antigenů detekovaných ImF. Také Aktinomycin D, který interferuje s DNA dependentním RNA přepisem, nemá žádný účinek na replikaci ATCC-VR2332 viru. Tyto výsledky ukazují, že ATCC-VR2332 virus nevyžaduje jaderné funkce pro replikaci.

Shrnuté, velikost, morfologie, přítomnost RNA genomu a další biologické vlastnosti předběžně umísčují ATCC-VR2332 virus do rodiny Togaviridae. ATCC-VR2332, nicméně, nemůže být definitivně umístěn do známé třídy této rodiny. Ačkoliv morfologicky velmi připomíná ATCC-VR2332 virus arteriviry, nemůže být virus definitivně umístěn do této třídy, dokud nejsou dostupné další informace o DNA a proteinové struktuře. B. Atenuace

Zisk z VR2332 pasáže číslo 3 byl podroben dalším dvěma pasážím podrobněji popsaným dále a sklizeň z pasáže číslo 5 byla poslána mimo laboratoř k purifikaci. Přesněji, ATCC-VR2332 10

+ · ·· • · · * • · ·· ·· · • · • · · ··

viriony byly identifikovány po purifikaci v CsCl gradientech (centrifugovaných při 200000 x g) po extrakci 1,1,2-trichloro-trifluoroethanem. Purifikované viriony byly značeny "immuno-gold" kitem využívajícím anti-ATCC-VR2332 hyperimunitní sérum a konjugát zlata. Vztlaková hustota ATCC-VR2332 virionů v CsCl gradientech byla 1,18 - 1,19 g/ml. Sacharosové gradienty pravidelně vedly ke ztrátě titru viru a nebyly použity jako vhodný gradient pro purifikaci.

Purifikovaná sklizeň z pasáže 5 byla potom podrobena dalším 65 pasážím jak je popsáno dále. Výsledná sklizeň z pasáže 70 byla atenuovaná a byla označena jako Master Seed Culture. Tato avirulentní Master Seed Culture byla uložena v American Type Culture Collection pod přírůstkovým číslem ATCC-VR2495.

Konečně, dalších 5 pasáží bylo provedeno pro získání ATCC-VR2332 pasáže 75 (další pasáže mohou být také provedeny, pokud je to požadováno).

Pasáže 4-75 ATCC-VR2332 virů byly provedeny v kultivačních nádobách hostitelské tkáně komerčně dostupné Ma-104 Green Monkey ledvinné buněčné linie. Tyto tkáňové kultivační nádoby byly připraveny následujícím způsobem. Kultivační medium bylo připraveno tak, aby obsahovalo Eaglovo minimální esenciální medium ("MEM") od JRH Biosciences (katalogové č. 200-2041) a 10% fetální telecí sérum od JRH Biosciences. Asi 1 ml ATCC-VR2332 inokulum bylo přidáno do nádoby o objemu 75 cm3 obsahující 50 ml tohoto kultivačního media. Nádoba byla uchovávána po asi 7 dní a inkubována při teplotě v rozmezí od asi 35 °C do asi 37 °C.

vK Táňové kultivační zásobní nádoby byly připraveny • * • ·· • · ·· ·· • · • • 0 • · • · • · • » • · • ♦ • • * • · • · • * · · • · · • · • · · • · • · • • · • • • · • · • • · ···· • · • · expandováním vzniklé inkubované kultury, která byla rozdělena 1:4 následujícím způsobem. Kultivační medium, které mělo objem asi 50 ml, bylo odstraněno. Buněčná vrstva byla odstraněna přidáním 10 ml trypsin-versen IX a inkubací při 37 po 5-10 minut. Poté byly buňky odebrány z nádoby a byly centrifugovány při 270 x g po 5 - 10 minut. Supernatant byl scezen a peleta byla resuspendována v 5 - 10 ml MEM media obsahujícího 10% fetální telecí sérum stejně jako předtím. Buňky byly umístěny do 200 ml kultivačního media, které bylo potom rozděleno do čtyřech 75 ml nádob po 50 ml na nádobu, čímž bylo dosaženo rozdělení 1:4.

Vzniklé kultury byly udržovány při teplotě v rozmezí mezi 35 - 37 °C až do použití. Po asi 3 až 4 dnech inkubace se v nádobách vyvinul úplný potah vrstvou buněk a byly připraveny pro použití. PRRS virus ATCC-VR2332 byl propagován v kontinuálních kulturách buněčné linie MA-104, které byly produkovány jak je popsáno výše. pH kultivačního media bylo upraveno na 7,2 a kultury byly inkubovány při teplotách v rozsahu 35 °C až 37 °C. Virus byl inokulován na MA-104 buňky přidáním l ml zmrazeného inokula z předchozí pasáže do kapalného kultivačního media.

Viru byla umožněna absorpce na buňky po 24 hodin.

Kultivační medium bylo zcezeno asi 24 hodin po inokulaci ATCC-VR2332 viru a nádoba byla znovu naplněna 50 ml udržovacího media, kde byla provedena substituce 4% fetálního telecáího séra za 10% fetální telecí sérum v kultivačním mediu. Udržovací medium mělo pH 7,6. Po této výměně media byla kultura inkubována při teplotě mezi 35 - 37 °C. Byl umožněn růst viru, 12 12 ·♦ · • · · · • · · · · • ····· · · • · · ·

• ·♦♦ · · • · · ♦ · «· ·· ·· • · · I • · ·· ·· · dokud nebylo asi 50-60% Ma-104 buněk v kultuře destruováno virem. Vzorek byl potom zmrazen v kapalném dusíku a byl připraven pro pasáž do jiné nádoby MA-104 buněk.

Zkřížená reaktivita pasáží 3-70 byla také demonstrována. PRRS ATCC-VR2332 pasáž 3 virus byl použit pro imunizaci prasat, králíků a koz pro produkci anti-séra k PRRS. Sérum bylo použito pro neutralizaci PRRS viru v různých pasážích od pasáže 3 do pasáže 70. Kromě toho byly připraveny dvě monoklonální protilátky (SDOW-12 a SDOW-17) za použití slezinných lymfocytů od myší imunizovaných VR-2332 PRRS virem. Monoklonální protilátky reagovaly proti znovu všem U.S. a Evropským izolátům jako v Prosinci 1992. Monoklonální protilátky byly použity pro identifikaci nebo detekci PRRS viru z pasáží 3-70. C. Produkce modifikované živé vakciny

Dva vakcinové přípravky byly formulovány inkorporováním, v příslušném pořadí, Master Seed Cultire (sklizeň z ATCC-VR2332 pasáže 70) a sklizně z ATCC-VR2332 pasáže 75. Virus Master Seed Culture a pasáže 75 jsou v podstatě avirulentní, t.j., vakciny, pokud jsou podány prasatům nebo jiným savcům s rizikem PRRS kontaktu, nezpůsobují klinické příznaky PRRS onemocnění, ale jsou schopné indukovat imunitní odpověď, která imunizuje zvířata proti patogenním formám PRRS viru. Vakcina byla produkována konvenčními prostředky. Normální stabilizery a nosiče byly přidány před lyofilizací.

·· »· • · ♦ · • · ·· ··· · · ·· ·· 13 ι· · ·· ·· • · · · · · · • · · · · · · • · ···· « · · · • · · · · · ·· · ·· ·*♦· Příklad 3 Ιη vivo testování virového izolátu

Virulentní třetí pasáž sklizně ATCC-VR2332 viru z příkladu 3 byla použita pro inokulaci dvou tři dny starých gnotobiotických selat. Obě selata byla infikována intranasálně, jedno 1 ml a druhé 2 ml. Selata byla klinicky pozorována po sedm dní, potom byla usmrcena a byly provedeny nekropsie.

Byly odebrány tkáňové vzorky od každého selete pro histopatologii a pro získání virového agens. Histopatologická zpráva potvrdila, že plicní léze u infikovaných selat byly identické s plicními lézemi od selat, o kterých bylo známo, že mají PRRS. Vzorky tkáně byly zpracovány stejně jako v příkladu 1, a potom byly kultivovány na 20-40% a 100% monovrstvě MA-104 buněčné linie s hovězím fetálním sérem. Virové agens byly opět získáno. Třetí pasáž virové sklizně byla také použita pro inokulaci sviní, aby se potvrdilo, že reprodukční účinek onemocnění může být duplikován a potvrzen. Dvě vícerodivší svině byly inokulovány intranasálně v asi den 93 gestace. Svině porodily vrhy s 50% mrtvě narozených selat (8/13 a 6/14 mrtvě narozené/živé) v den 112 a 114 gestace, v příslušném pořadí. Sedm mrtvě narozených selat bylo částečně mumifikováno a živě narozená selata byla slabá a slabě sála. Virové agens bylo získáno ze tkání mrtvě narozených selat stejným způsobem jako v příkladu 1.

Virové agens bylo získáno ze tří stád, o kterých bylo známo,

44 • 4 4 44 44 44 4 4 • • • 4 4 4 4 4 4 • 4 • 4 4 4 4 4 4 44 • • 4*44 4 4 4 4 4 444 4 4 4 • 4 4 4 4 4 4 4 44 • • 4 4444 4# 44 že mají PRRS. Titry protilátek k ATCC-VR2332 agens byly identifikovány v těchto stejných stádech. Příklad 3 Účelem této studie byla identifikace minimální protektivní dávky PRRS viru (VR-2332 pasáž 75) vybrané pro použití jako modifikované živé virové vakciny. Toto bylo provedeno analyzováním stupně, kterým byly schopné dvě vybrané dávky vakciny (4,0 + 0,5 log/dávku a 2,0 + 0,5 log/dávku) kontrolovat nástup abnormálního stavu po expozici virulentními PRRS viru (VR-2332 pasáž 3, 3,5+0,5 log/dávku) a srovnáním vakcinovaných/infikovaných prasat s nevakcinovanými/infikovanými a normálními (neinfikovanými) prasaty.Modifikovaná živá vakcina byla produkována za použitím viru pasáže 75 jak bylo vysvětleno výše. Šedesát dva seronegativních selat bylo vybráno pro použití z farmy a bylo rozděleno do čtyřech studovaných skupin, označených skupina 1, 2, 3 a 4. Dvacet jedna selat ve skupině 1 bylo vakcinováno 2,0 ml PRRS vakciny L-4 intramuskulárně (4,0 log/dávku). Dvacet jedna selat ve skupině 2 bylo vakcinováno 20 ml PRRS vakciny L-2 (2,0 log/dávku). Deset selat ve skupině 3 a deset selat ve skupině 4 nebylo vakcinováno. Selata v kontrolních skupinách 3 a 4 byla umístěna separátně pro zajištění citlivosti na infekci virem. Skupiny 1, 2 a 3 byly infikovány 2,0 ml PRRS viru VR-2332 pasáže 3 intranasálně ve 28 den pokusu. Selata ve skupině 4 nebyla infikována. Selata ve všech čtyřech studovaných skupinách byla pozorována a pravidelně monitorována 31 dní před infikováním a 21 dní po 15 15 ·« ·· • · · · • · ·· • · · f · • · · ·· Μ « · ♦ · • · · ♦ • # · • · * » • · · ·· · ··· infikování. Parametry použité pro hodnocení studie byly klinické příznaky, tělesná hmotnost, tělesná (rektální) teplota, počet bílých krvinek, izolace viru a sérologie. Účinnost vakciny byla demonstrována redukcí počtu dní, kdy byla vakcinovaná selata viremická, zabráněním leukopenie a teploty a zachováním normální rychlosti růstu po infekci. Tělesná (rektální) teplota byla měřena před a po vakcinaci. Průměrná teplota skupiny byla pro skupinu č. 1 zvýšená na 2 DPV a 3 DPV, zatímco u skupiny 2 se zvýšila na 3 DPV. Doba vzestupu teploty byla pro obě skupiny krátká, 2 dny pro skupinu 1 a 1 den pro skupinu 2. U ani jedné z vakcinovaných skupin nedošlo k poklesu počtu bílých krvinek po ošetření. Dřívější studie ukázaly, že infikování virulentním PRRS virem by mělo způsobovat leukopenii během 72 hodin po infekci. Výsledky měření přírůstku hmotnosti během postvakcinačního období ukázaly, že ošetření neovlivňuje nepříznivým způsobem stav vakcinovaných prasat. V průběhu 29 dnů po vakcinaci nebyl hmotnostní přírůstek pro ani jednu z vakcinovaných skupin signifikantně odlišný při intervalu spolehlivosti 0,05 od hmotnostního přírůstku ve skupinách 3 a 4.

Konická pozorování ukázala mírné odchylky od normy většině kategorií kromě stolice a nozder. Srovnání fekálního skoré vakcinovaných skupin s fekálním skoré kombinovaných kontrolních skupin (skupiny 3 a 4) za použití dvojitého t-testu neukázalo signifikantní rozdíl při hladině spolehlivosti 0,05. p hodnota mezi skupinou 1 a kombinovanými kontrolními skupinami byla 16 # · ♦ · · • ····· t · • · · ·

• · · * • · ·· • · · · · · • · · 0,47, zatímco mezi skupinou 2 a kombinovanou kontrolní skupinou byla 0,87. Srovnání skoré nozder mezi skupinou 1 a kombinovanou kontrolní skupinou mělo p hodnotu 0,41. Pouze u dvou z 21 prasat ve skupině 2 bylo pozorováno, že mají klinické skoré pro nozdry. Analýza t-testem pro celková jednotlivá kinická skoré skupin 1 a 2 se skoré kombinované kontrolní skupiny měla hodnotu p 0,53 a 0,74, v příslušném pořadí. Tyto srovnání demonstrují chybění rozdílů mezi zvířaty, která dostala vakcinu v obou dávkách a nevakcinovanými kontrolami. Výsledky izolace viru z krve ukázaly, že 100% (21 z 21) skupiny 1 se stalo pozitivní, zatímco skupina 2 měla 90% (19 z 21) pozitivně testovaných. Během postvakcinačního období zůstávala kontrolní skupina 3 a 4 negativní. Výsledky IPT (imunoperoxidasového) testu dávaly stejný obraz, kdy 100% skupiny jedna bylo seroogicky pozitivní, stejně jako 90% skupiny 2. Obě skupiny zůstávaly negativní pro sérové neutralizační protilátky do 21 DPV. Neutralizační protilátky byy detekovány v obou skupinách při 29 DPV (0 DPC - viz post-infekční výsledky). Kontrolní skupiny zůstávaly negativní v obou testovacích postupech až do doby infikování.

Analýza post-vakcinačních pozorování ukazuje, že se enobjevují žádné nežádoucí účinky vzniklé z ošetření dávkami vakcin použitými v této studii. Nicméně, vyšší dávka způsobila serologickou konversi všech (21 z 21) selat, zatímco nižší dávka konvertovala 19 z 21 selat, 90%.

Po infekci virulentním PRRS virem dávaly klinické parametry, které byly monitorovány ve vakcinované a nevakcinované infikované skupině důkazy ochrany dvěma testovanými dávkami 17 17 *· · • · · • · · · • « «··« * · ♦ «< * • ♦ · · • · · t « · • · « #« ··· · • · · · « « «« ··· · * * * « «· ·· vakciny. Výsledky testování viremie posytují jasný důkaz užitku vakciny. nevakcinovaná skupina (skupina 3) byla 100% viremická na 3 DPC, 5 DPC a 7 DPC, zatímco incidence viremie pro stejné dny pozorování ve skupině 1 (3,65 log/dávku) a skupině 2 (1,85 log/dávku) byla 15,5 a 10% a 30%, 20% a 15%, v příslušném pořadí. Také nebyl žádný virus získán ze vzorků krve od skupiny 1 po 9 DPC a ze skupiny 2 po 13 DPC, zatímco 30% skupiny 3 bylo stále pozitivní v 19 DPC. Výsledky monitorování tělesných (rektálních) teplot také poskytují důkaz pro účinnost vakcin. Během 21 dnů pozorování přesahovaa průměrná teplota skupiny 3 104 °F v 5 dnech.

Průměrné teploty skupin 2 a 3 nepřesahovaly 104 °F. Kromě toho, průměrná teplota skupiny 3 přesahovala 104,5 °F ve dvou dnech, 2 DPC a 6 DPC.

Po infikování, výsledky počtu bílých krvinek ukazují, že u skupiny 3 proběhla leukopenie, která měla 16% pokles v den 5 po infikování. Ani u jedné z vakcinovaných skupin se nevyskytl pokles vyšší než 6% během pozorovacího období.

Monitorování hmotnostních přírůstků různých ošetřených skupin během 21 dnů po infekci ukázalo, že vakcinace v obou dávkách zachovává normální rychlost růstu. Dvě vakcinované skupiny, 1 a 2, měly průměrný procentuální hmotnostní přírůstek 74 a 73, v příslušném pořadí. Skupina 4, normální kontrolní zvířata, měla průměrné zvýšení hmotnosti 75%. Oproti tomu, průměrný procentuální přírůstek hmotnosti ve skupině 3, u nevakcinovaných - infikovaných kontrol, byl 69%. Toto bylo signifikantně odlišné od skupin 1, 2 a 4 při P = 0,009 za použití dvojitého t-Testu a intervalu spolehlivosti 0,05. 18 18 Μ «I Μ • · ♦ · · • ♦ · Μ • · · · · · · 4 · · · ·»·· ·· ** • »· • · · · · · • · · · · · • ·····♦♦ · • · · · · • · « · ♦ Ačkoliv výsledky klinických testů nemusí být definitivní v demonstraci účinnosti, stále ještě ilustrují přínos vakcin. Po infikování vykazovaly skupiny 1, 2 a 3 signifikantní zvýšení incidence respirační příznaků. Denní průměrné skoré jednotlivých zvířat pro skupiny 1, 2 a 3 bylo 0,39, 0,64 a 0,53, v příslušném pořadí. Toto ilustruje přínos vyšších dávek (3,65 log/dávku) vůči nižším dávkám (1,85 log/dávku) a žádné vakcinaci. Ačkoliv pozorování stolice bylo dramatické po infekci, nebylo signifikantně odlišné (za použití hladiny spolehlivosti 0,05) od pozorování po vakcinaci a před infikováním. Tak v tomto pokusu se nezdálo, že by měla infekce PRRS virem účinek na dolní gastrointestinální trakt. Celkově, zbývající klinická pozorování nevykazovala signifikantní změny jako výsledek infekce. Pro parametry nozder a úst ve skupině 1, jedno prase mělo 25% celkového skupinového skoré nozder a jiné prase mělo 94% skupinového skoré pro kategorii úst. Podobně, ve skupině 2, jedno prase mělo 22% celkového skupinového skoré nozder a jiné prase mělo 43% skupinového skoré pro kategorii úst. Celkem, incidence postinfekčních klinických pozorování pro tyto dva parametry nebyla signifikantně odlišná od postvakcinačních pozorování. Podobné závěry mohou být učiněny pro tyto dva klinické parametry pro skupinu 3. Skupina 4 zůstávala relativně normální po tělesné stránce. V konci pozorovacího období byla všechna prasata usmrcena a byly makroskopicky vyšetřovány plíce na přítomnost patologického postižení. Šedesát procent (6 z 10) skupiny 3 vykazovalo zaznamenání hodné postižení. Při srovnání, 10% skupiny 1 a 19% skupiny 2 jevilo znatelné postižení. Při srovnání se skupinou 4, normální kontrolou, 80% skupiny 1, 81% skupiny 2 a 30% skupiny 3 bylo popsáno jako makroskopicky 19 • · · • · • · · # Μ· • · *· · • « · · • · * · • t · • · · · • # · · · · «« ♦* Λ · · · • · t · • · · · · • · · • * · · nerozlišitelné.

Byla provedena izolace viru z plicní tkáně. Žádný virus nebyl izolován z plicních tkání prasat skupiny 1. Jeden vzorek z 21 prasat skupiny 2 byl pozitivní na virus. Virus byl izolován ze tří z deseti vzorků prasat skupiny 3 a od žádného z prasat skupiny 4. Závěr učiněný z těchto výsledků je ten, že obě hladiny dávky (3,65 ogs/2,0 ml a 1,85 log/2,0 ml dávku) modifikované živé PRRS virové vakciny obsahující VR-2332 pasáž 75 byly účinné proti respiračnímu onemocnění u 3 až 5 týdnů starých selat, které byly infikovány v 29 DPV virulentním PRRS virem.

Tato studie ukázala, že preferovaná minimální protektivní dávka je 3,65 log/2 ml dávku. V několika parametrech použitých pro hodnocení účinnosti dávek vakciny, jako je viremie, klinické respirační příznaky, patologické postižení plic a izolace viru z plicní tkáně, byla lépe chráněna ta zvířata, která byla vakcinována vyšší dávkou. Také 21 z 21 prasat vakcinovaných 3,65 log/dávku serokonvertovalo v 21 DPV. Oproti tomu, pouze 19 z 21 selat vakcinovaných nižší dávkou serokonvertovalo v 29 DPV (0 DPC). Příklad 4 V tomto příkladu bylo zkoumáno trvání imunity za použití modifikované živé vakciny PRRS pasáže 75 popsané v příkladech 1 a 3. Vykrmovaná prasata normálně dosáhla porážkové hmotnosti v šesti měsících věku. V tomto příkladu byla prasata vakcinována v asi 1 měsíci věku (4-5 týdnech) a potom byla infikována 110 20 20 ·· ·· • · · 4·· 4 « • ♦ 4 ·· ·· Μ ♦ *· ·· » » « · · · * • · · · · · * • #····*· · * » · · · · * *· 4 ·· ···· dní po vakcinaci. Toto trvání imunity by mělo pokrýt většinu očekávaného života normálních vykrmovaných prasat. Šedesát dva PRRS seronegativních selat bylo získáno a rozděleno do čtyřech studovaných skupin označených skupina 1, 2, 3 a 4. Dvacet jedna selat ve skupině 1 bylo vakcinováno 2,0 ml PRRS-MLV pasáž 75 vakciny mající 3,32 log na dávku. Dvacet jedna selat ve skupině 2 bylo vakcinováno 2,0 ml této vakciny mající 1,64 log na dávku. 10 selat ve skupině 3 a ve skupině 4 nebylo vakcinováno a bylo umístěno v oddělených místnostech pro zachování seronegativního stavu.Při ukončení studie popsané v příkladu 3 byly prasata ze skupiny 2 v tomto příkladu odstraněna ze studie a usmrcena, protože bylo uzavřeno, že minimální protektivní dávka byla 3,68 log a nikoliv 1,87 log na dávku. Skupiny 1 a 3 byly infikovány intranasálně v den 110 po vakcinaci (DPV) za použití viru VR-2332 pasáž 3 (3,9 log/ml). Selata ve skupině 4 nebyla infikována. Selata byla monitorována 21 dní po infekci (DPC) na klinické příznaky, změnu tělesné hmotnosti, tělesnou (rektální) teplotu, počet bílých krvinek, viremii a sérologii. Protektivní imunita v den 110 po vakcinaci byla demonstrována absencí viremie, prevencí leukopenie horečky a lepším přírůstkem hmotnosti ve srovnání s infikovanými nevakcinovanými selaty.

Po vakcinaci byla vakcinovaná selata pozorována na jakékoliv nežádoucí reakci vakcinace. Parametry, které byly pozorovány, obsahovaly tělesnou (rektální) teplotu, počet bílých krvinek, hmotnostní přírůstek, klinické příznaky, sérologii a viremii. Tělesná (rektální) teplota byla monitorována denně od -1 DPV do +4 DPV. Analýza skupinových průměrů neukazovala žádné 21 21 • « ·« ·« ··

• « · • * » · • ♦ ··· • · · ·· O 9 9 · · · 9 « • · ♦ · ·· • · # · · · · · • · · · · ·· ···» ·· ·· signifikantní zvýšení v teplotách ošetřených skupin jako výsledek vakcinace. Vakcinovaná selata skupiny 1 vykazovala maximální zvýšení 0,2 °F ve srovnání s pre-vakcinačním průměrem.

Počty bílých krvinek byly monitorovány různou dobu před a po podání vakciny. Skupina 1 vykazovala 14% pokles ve srovnání s pre-vakcinačním průměrem v 4 DPV. Všechny jiné poklesy v počtu pro skupinu 1 zůstávaly nižší než 9%. Zbylé skupiny (3 a 4) nevykazovaly žádný pokles v počtech WBC vyšší než 11% během postvakcinační periody sledování. Výsledky hmotnostních přírůstků od 0 DPV do 28 DPV byly konfliktní v tom, že změna hmotnosti ve skupině 1 byla signifikantně odlišná od skupiny 4 (P=0,02). Není žádné vysvětlení pro tento rozdíl, protože všechny ostatní parametry, které byly monitorovány, nevykazovaly větší rozdíly mezi skupinou 1 a skupinou 4.

Statistická analýza postvakcinačních klinických skoré neukazovala žádný rozdíl mezi vakcinovanými skupinami a nevakcinovanými kontrolními skupinami. Ačkoliv fekální skoré mělo nejvyšší incidenci, nebyl zde signifikantní rozdíl mezi skupinou 1 a skupinami 3 a 4, P=0,75, P=0,59, v příslušném pořadí. Stejně tak, klinické vzorky nozder nebyly signifikantní. Srovnání mezi skupinou 1 a skupinou 3 mělo P hodnotu vyšší než 0,8. p hodnota pro srovnání mezi skupinou 1 a skupinou 4 byla 0,02, kdy skupina 4 měla vyšší incidenci. Žádný z jiných klinických parametrů nevykazoval signifikantní stupeň výskytu. 22 ··· ·· ·· ·· ·· • * · · · · t ···* 4 4 4 4 ·· · ♦ · ♦· • · ··#· · · · 4 0 400 0 0 4 0 0 0 4 0 0 0 4 00 4 04 4040 00 04

Postvakcinační serologické výsledky ukazují, že dávka vakciny úspěšně imunizovala ošetřená zvířata. V 14 DPV měla skupina 1 48% testovaných pozitivních podle IPT testu. O sedm dní později v 21 DPV bylo 100% ošetřené skupiny testováno jako pozitivní podle IPT. Skupina l zůstávala negativní pro sérové neutralizační (SN) protilátky do 28 DPV. Všechna prasata zůstávala serologicky pozitivní podle obou testů déle než do doby infekce v 110 DPV. Selata ve skupinách 3 a 4 zůstávala v průběhu postvakcinační periody serologicky negativní. Výsledky postvakcinační izolace viru naznačují, že 100% z ošetřené skupiny bylo úspěšně inokulováno. Toto podporuje dříve popsaná serologická data. Obě kontrolní skupiny 3 a 4 zůstávají negativní po dobu postvakcinační periody pozorování.

Postvakcinační pozorování ukazují, že ošetření nemělo žádné nežádoucí účinky na ošetřená zvířata a kontrolní zvířata byla bez PRRS viru.

Po infekci virulentním PRRS virem byly pozorovány různé klinické parametry pro hodnocení přínosu vakcinace. Vakcinovaná skupina (skupina 1) byla srovnávána s nevakcinovanou infikovanou skupinou (skupina 3) a nevakcinovanou neinfikovanou skupinou (skupina 4).

Postvakcinační serologické výsledky ukazují, že infikování úspěšně stimulovalo imunitní odpověď ve skupině 3. Skupina 1 nevykazovala anamnestickou protilátkovou odpověď po infekci virulentním virem. Serologické výsledky ukazují, že skupina 4 zůstávala negativní po dobu pozorování 21 dní. ·· • • · ·· • · • • • • · • ♦ • · « • • • • · • · • • · #« • • ···· • · · • · • t* • • « • • • 9 • • • • • · • • · • · · · « · • ·

Nejdramatičtější byly výsledky izolace viru. 100% skupiny 3 bylo pozitivně testováno v den 3, 5 a 7 po vakcinaci a v den 21 po vakcinaci bylo 20% této skupiny pozitivních v testu. Skupina 1 byla negativní v den 0 DPC a zůstávala negativní do 21 dne pozorování. Neočekávaným výsledkem byla pozitivní izolace PRRS viru ze vzorků krve skupiny 4. První pozitivní izolace viru ze skupiny 4 byla v den 15 DPC. Toto pozorování koreluje s jinými parametry, které budou uvedeny dále. I když skupina 4 přišla do kontaktu s PRRS virem, mohou být shromážděná data stále považována za validní, protože expozice proběhla v poslední třetině pozorovacího období a primární interval se týkal dnů 1 DPC až 11 DPC. To znamená, že během tohoto období byla provedena většina srovnání mezi skupinami l a 3.

Nejdůlěžitějším výsledkem bylo jasné zabránění infekci, jak je ukázáno chyběním izolace viru ve vakcinou ošetřené skupině. Význam postinfekčních klinických skoré se zdá být omezený v hodnocení účinku ošetření vakcinou. Ačkoliv klinické respirační příznaky byly pozorovány ve skupinách 1 a 3, příznaky nebyly rovnoměrně rozloženy. V případě skupiny 1, dvě prasata vykazovala 88% celkového skoré pro skupinu. Podobně, dvě prasata ze skupiny 3 vykazovala 71% celkového skupinového skoré 49. Celkové fekální skoré pro skupinu 1 je signifikantní, když je srovnáváno s jinými skupinami. Nicméně, pouze u 9 z 21 prasat bylo pozorováno, že mají jakékoliv klinické příznaky této kategorie a z 9 prasat vykazovala 3 prasata více než 55% celkového skoré pro skupinu, žádná fekální skoré nebyla pozorována pro skupinu 3 a pouze 1 prase ze skupiny 4 mělo klinické fekální příznaky. Klinická skoré pro nozdry a hubu mohou mít omezený význam, pokud jsou bez asociace s jinými parametry jako např. respiračními. Incidence pozorování nozder 24

Μ ·· • · · · • · ·· • *♦· ♦ · • · · ·· ·· byla omezena v obou skupinách 1 a 3 a byla menší než 50% pro každou skupinu mající skoré. Skoré pro pozorování tlamy mělo vysokou incidenci 90% pro skupinu 3 a 76% pro skupinu 1. Nebyl zde signifikantní rozdíl pro tyto dvě skupiny pro klinická skoré úst, P=0,45. Všechny ostatní pozorované parametry byly normální. Během postinfekčního pozorovacího období dosáhla skupina 1 průměrně 42,62 liber. Skupina 3 měla průměrný hmotnostní přírůstek 36,5 liber a skupina 4 dosáhla průměrně 37,1 liber. Nebyl zde signifikantní rozdíl mezi skupinami 3 a 4, P=0,9, a toto může být způsobeno tím, že skupina 4 byla dodatečně infikována PRRS virem. Nicméně, toto neovlivňuje srovnání dat mezi skupinou 1 a 3, protože zde byl statisticky signifikantní rozdíl mezi těmito dvěma skupinami. Hodnocení stavu prasat během doby poskytlo vynikající prostředek pro hodnocení celkového stavu těchto prasat. Tato data spolu s jinými parametry ukazují přínos testované vakciny z hlediska experimentální infekce.

Post infekční teploty ukázaly přínos ošetření vakcinou z hlediska pokusné infekce. Infikovaná kontrolní skupina, skupina 3, měla 8 dní, ve kterých byla průměrná teplota skupiny alespoň o 1 °F nad průměrnou teplotou před infekcí. Skupina 1 neměla průměrný nárůst teploty o 1 °F v jakoukoliv dobu. Ačkoliv byla skupina 4 kontaminována PRRS virem, průměrná teplota skupiny se nezvýšila o stupeň. Toto bylo díky tomu, že šíření viru ve skupině bylo postupné a že nepostihlo celou skupinu jako tomu je u pokusné infekce. Nicméně, analýza teplot jednotlivých prasat od dne 15 DPC do 21 DPC ukázala, že 4 prasata ze skupiny 4 měly vzestup teploty po infekci PRRS virem. Analýza teplot 25 • · ··♦♦ · • · « ·· ·

jednotlivých prasat ve skupinách 1 a 3 dále potvrzuje přínos ošetření vakcinou. Deset z deseti prasat ve skupině 3 vykazovalo zvýšení o 1 °F po dobu dvou následujících dní nebo více. Oproti tomu, prasata ze skupiny 1 neměla podobné výsledky.

Další důkaz účinnosti vakciny byl demonstrován výsledky postvakcinačního počtu bílých krvinek. Skupina 1 měla průměrný WBC počet snížený po infekci. Snížení 14%, 19%, 14%, 21% a 13% proběhlo v dny 1, 3, 5, 7 a 9 po infekci, v příslušném pořadí. Ve stejné dny testu měla skupina 3 průměrná snížení 15%, 37%, 43%, 31% a 28%. Skupina 4, neinfikovaná kontrolní skupina, měla pokles mezi 11% a 17% v průběhu stejného období. Analýza počtů u jednotlivých prasat dále dokazuje ochranu dodanou vakcinou. 10 z 10 prasat ve skupině 3 vykazovalo 25% nebo vyšší pokles v počtu WBC po dva nebo více následující dny testu. Skupina 1 měla 2 z 21 prasat vykazujících leukopenii 25% nebo vyšší po dva následující dny. Infikovaná prasata ve skupině 4 vykazovala podobné výsledky jako skupina 3. Incidence leukopenie se stala zřetelnou podle toho, jak se virus šířil ve skupině. Mezi dny 15 a 21 DPC vykazovalo 50% skupiny pokles počtu bílých krvinek o 25% ve dvou následujících dnech testu. Tyto výsledky ukazují, že u vakcinovaných prasat nedošlo k leukopenii, ke které došlo u nevakcinovaných prasat.

Analýza nakroskopických vyšetření plic v den 21 DPC byla rozdělena do parenchymového a pleurálního skoré, které byly potom spojeny do celkového plicního skoré. Analýza vyšetření byla obtížněji provedena pro dodatečnou expozici neinfikované kontrolní skupiny PRRS viru, protože nemohla být stanovena negativní základní hodnota. Tak je nezbytné omezit srovnání 26 26 ·· • · ·· ··♦ ♦ · • ♦ · ♦ ♦ ♦· ·· · ·♦ ·· # · · · · ♦ · • «· · · · · • «···· · · · · · • ♦ · · · · ·· · ♦· ···· mezi skupinami 1 a 3, protože obě skupiny měly expozici stejníé virové infekci v stejnou dobu. Parenchymové skoré pro skupinu 3 bylo vyšší v závažnosti u 4 z 10 prasat majících individuální skoré 200. Nejvyšší skoré ve skupině 1 bylo 100. Jak procento postižení v ošetřené skupině, tak závažnost parenchymových lézí byla snížena při vakcinaci. Podobně, vakcinace snižovala incidenci a závažnost pleurálních lézí. Skupina 1 měla 24% (5 z 21) majících pleurální skoré 100; zatímco skupina 3 měla 50% (5 z 10) majících pleurální skoré 100. Většina prasat (9 z 21) ve skupině 1 měla doprovodné pleurální skoré 15 nebo nižší. Korelace plicního skoré s repiračními problémy neexistovala. Například, jedno prase ze skupiny 3 mělo klinické respirační skoré 23 a celkové plicní skoré 287,5, zatímco jiné prase ze skupiny 3 mělo klinické respirační skoré 0 a celkové plicní skoré 300. Je zde několik dalších příkladů chybění korelace mezi plicním skoré a klinickým respiračním skoré. Bez ohledu na to, zda je makroskopické pozorování validní pro analýzu přínosu vakciny může být uzavřeno, že ve vakcinované skupině 1 bylo málo zvířat s lézemi a závažnost těchto lézí byla snížena. Závěrem, mnoho z parametrů použitých pro hodnocení účinku vakciny z hlediska pokusné infekce v den 110 po vakcinaci korelovalo dobře jeden s druhým. Během periody (3-9 DPC), ve které je viremie nej zřetelnější, se vyskytla signifikantní leukopenie a vzestup tělesné teploty. V době infekce byla prasata asi 20 týdnů stará nebo o 12 týdnů starší než prasata infikovaná v příkladu 3. Mnoho klinických příznaků zaznamenávaných v této studii bylo více závažných. Například, vzestup tělesné (rektální) teploty byl zvýšen po dobu 8 dnů v této studii proti 5 dnům ve studii imunogenicity. Závažnost leukopenie v nevakcinované infikované kontrolní skupině 27 Μ · ·· «· ·· ·· ··· I Μ · · Μ · ···· · · · · · ·· • ······· · · · ···· · • · · · · · · · · ·· · ·· ···· ·· ·· (skupina 3) v této studii byla mnohem více dramatická než v infikované kontrolní skupině ve studii imunogenicity. V pozdější studii vykazovala infikovaná kontrolní skupina pokles počtu WBC o 43% až 27% (3-9 DPC). Ve studii imunogenicity vykazovala infikovaná kontrolní skupina snížení o 15 - 21% od 2 - 9 dne po infekci. Počet dní, ve kterých byla detekována viremie během post infekční periody (1-14 DPC) pro vakcinovanou infikovanou skupinu ve studii imunogenicity byl 0 z možných 110 dní ve srovnání s 45 ze 110 dní v infikované kontrolní skupině v této studii. Tak zvýšení závažnosti klinických příznaků nebylo plně způsobeno zvýšením trvání viremie.

Post-infekční výsledky této studie ukazují, že vakcinace PRRS-MLV vakcinou v dávce 3,32 log na 2,0 ml dává ochranu před infekcí virulentním PRRS virem v den 110 po vakcinaci. Tyto výsledky jsou: 1) vakcinovaná zvířata byla zcela negativní pro viremii během 21 denního obpdobí pozorování po infekci, 2) kromě minoritního výskytu respiračních, fekálních, nasálních nebo orálních příznaků byla vakcinovaná prasata pozorována jako normální z hlediska klinických příznaků, 3) hmotnostní přírůstek nevakcinovaných prasat byl signifikantně vyšší než hmotnostní přírůstek nevakcinovaných infikovaných selat, 4) vakcinovaná selata nevykazovala zaznamenání hodný vzestup tělesné teploty, 5) žádné významné snížení počtu bílých krvinek se nevyskytlo u vakcinovaných prasat, 6) výskyt a závažnost parenchymových a pleurálních lézí byl nižší u vakcinovaných prasat. 28 ·· * ·· ·· ·· ·· f II ♦ ♦ · · · · ♦ · ···· · · · ·«·· • · ···· · » · · · ··· · · ··· · · · · · · ·· « ·· ···« ·· ·· Příklad ξ" V tomto příkladu byla vakcina PRRS-MLV pasáž 75 popsaná v příkladu 1 a 3 testována pro určení nástupu imunity. Sedm dní před začátkem studie bylo 35 prasat testováno na PRRS protilátky za použití imunoperoxidasového testu (IPT) a na přítomnost PRRS viru v krvi izolací viru na MA-104 buňkách. Prasata ve skupině 1 byla vakcinována intramuskulárně 2,0 ml vakciny PRRS-MLV pasáž 75 v den 0 pokusu. 10 prasat ve skupině 2 bylo vakcinováno stejným způsobem v den pokusu 7. Deset prasat skupiny 3 a 5 prasat skupiny 4 bylo udržováno v separátních místnostech, ale ve stejném prostředí a sloužili jako nevakcinované současné kontroly. Prasata ve skupině 1, 2a 3 byla infikována v den 14 pokusu. Infekční inokulum, skládající se z virulentního PRRS viru (VR-2332, pasáž 3, 3,7 logio viru na 1,0 ml) bylo podáno intranasálně {2,0 ml/prase). Prasata skupiny 4 zůstala neinfikována. Všechna prasata byla monitorována po dobu 10 dní na klinické příznaky respiračního onemocnění. Všechna prasata byla usmrcena v závěru studie pro hodnocení plicních lézí. V době infekce byla prasata skupiny 1 serologicky pozitivní podle IPT testu, ale nikoli na sérum neutralizační aktivitu. Oproti tomu, všechna ostatní prasata obsahující prasata skupiny 2 byla negativní podle obou postupů. 50% prasat ze skupiny 2 bylo pozitivní při testu IPT v den 7 DPC a 100% v den 10 DPC. U jednoho prasete ze skupin l a 2 se vyvinula SN aktivita v den 10 DPC a v den 7 DPC, v příslušném pořadí. SN výsledky nejsou signifikantně odlišné při p=0,05. Výsledky této studie ukazují, že ochrana byla zvýšena v důsledku ošetření, i když byla prasata v době infekce bud' serologicky negativní, nebo bez 29 ·· · • I I • · · · • · ···· • · · ·· · ·· ·· • I t · • · · • · · · • · · ·· ···· ·· ·· • · · » • · ·· • ···· · ·· ·· sérum neutralizační aktivity. Ochrana nemusí být přímo vázána na protilátkovou imunitu. Buňkami zprostředkovaná imunita v odpovědi na vakcinaci modifikovanou živou vakcinou může hrát hlavní roli v ochraně proti virulentní infekci. V příkladu 4 bylo chybění viremie po infekci významným kriteriem pro demonstraci ochrany před vakcinaci. Nicméně, krátká doba mezi vakcinaci a infekcí v předkládané studii vakcinovaných zvířat neřešila post-vakcinační viremii. Také, protože infekce byla homologní infekce, nebylo možné rozlišit infekční virus od vakcinačního viru. 4 prasata ze skupiny 1 a 1 prase ze skupiny 2 bylo testováno jako negativní v alespoň jednom testu od 3 do 9 DPC. 100% skupiny 3 bylo testováno jako pozitivní na viremii během stejného období.

Oproti předešlým příkladům byla v této studii detekována signifikantní přítomnost klinických respiračních příznaků. Skupina 3 měla 9 z 10 zvířat vykazujících respirační obtíže jeden nebo více dní (průměrný počet dnů = 3,6) . Počet zvířat pro skupiny 1 a 2 vykazujících dechové obtíže po dobu jednoho nebo více dnů byl jedna a nula, v příslušném pořadí (p < 0,001). Incidence klinických příznaků pro nozdry byla podobná incidenci respiračních příznaků. Skupina 3 měla 8 z 10 vykazujících klinické příznaky pro nozdry jeden nebo více dní. Průměrná doba trvání klinických příznaků byla 3,1 dne. Oproti tomu, skupiny 1 a 2 se signifikantně lišily s průměrnou dobou trvání 1,3 dny a 0,1 dne, v příslušném pořadí (p < 0,001) . Výskyty zbylých klinických parametrů byly normální.

Obě vakcinované skupiny dosáhly vyšší hmotnosti než infikované kontrolní skupiny. Skupina 2 dosáhla průměru 10,6 • r?· • t ** * * • • · » · * · • · • * • 1 • · « • « ·· • · ···♦ ♦ · · • • »4* • ♦ ♦ · • • · • • • · ·« • # · • » · * ·· ·· liber během 10 denního období pozorování ve srovnání s 7,8 librami pro skupinu 3 (p=0,01). Průměrný přírůstek hmotnosti pro skupinu 1 byl 9,6 liber, což není signifikantně odlišné ve srovnání se skupinou 3. Tato skupina měla dvě nejmenší selata, které vážily 7 a 12,5 liber, v příslušném pořadí, v den 0 pokusu a 6 a 12 liber, v příslušném pořadí, v den infekce. Průměrný přírůstek hmotnosti pro skupinu po odstranění dvou nejmenších selat je 12,3 libry, což je signifikantně odlišné od skupiny 3 (P < 0,001). Špatný přírůstek hmotnosti pro dvě prasata může být přisouzen jejich neschopnosti soutěžit s většími prasaty ve skupině. Tato prasata také měla průjem v průběhu postvakcinačního období pozorování. Prasata ve skupině 4 měla průměrný přírůstek hmotnosti 15,5 liber během 10 denního období. U prasat tohoto věku může být očekáván průměrný denní přírůstek hmotnosti 1,0 až 1,5 libry. Tyto výsledky ukazují, že vakcinace 7 a 14 dní před infekcí poskytuje ochranu, která umožňuje normální rychlost růstu.

Po infekci měla prasata ze skupiny 3 zvýšenou teplotu o 1 °F vůči průměru před infekcí po dobu průměrně 4,6 dne. Průměrný počet dní, po které měla prasata ve skupině 1 a 2 srovnatelné zvýšení teploty byl 0,5 a 1,1 dne, v příslušném pořadí (p < 0,001). Pouze l z 20 vakcinovaných selat mělo vzestup o 1 °F po dva po sobě následující dny ve srovnání s 8 z 10 ve skupině 3. Statistický rozdíl mezi vakcinovanými a kontrolami byl p < 0,001. Tyto výsledky ukazují, že vakcinace prasat ve skupině 1 a 2 bránila výskytu horečky v důsledku expozice virulentnímu PRRS viru.

Prasata ve skupině 3 vykazovala dramatické snížení počtu bílých krvinek v den 3, 5 a 7 po infekci. Tyto výsledky přesně odpovídají vzestupu teploty, který zvířata vykazovala během stejného období. Prasata ve vakcinovaných skupinách měla mírnou leukopenii trvající 1-2 dny před návratem na hodnoty před infekcí. Hodnoty pro vakcinovaná prasata byly signifikantně odlišné od infikovaných kontrol (p =< 0,001). Tyto výsledky zdůrazňují hladinu ochrany poskytnutou vakcinací 7 nebo 14 dní před infekcí redukcí hladiny a trvání leukopenie.

Vakcinace 14 nebo 7 dní před infekcí redukovala závažnost plicních lézí. Obě vakcinované skupiny byly signifikantně odlišné od infikované kontrolní skupiny (P = 0,01). Skoré pro vakcinovaná zvířata jsou podobná jako skoré pro skupinu 4, normální kontrolní skupinu. Průměrné plicní skoré pro skupinu 3 bylo 97,1 ve srovnání s 9,3 a 7 pro skupiny 1 a 2, v příslušném pořadí. Léze pozorované v posledních dvou skupinách jsou považovány za normální a očekávané u zdravých běžně chovaných prasat. Výsledky předkládané studie ukazují, že protektivní imunita byla stimulována během 7 dní vakcinace vakcinou modifikovaného živého viru. Signifikantní rozdíly byly pozorovány v teplotní odpovědi, přírůstku hmotnosti, leukopenii, plicních lézích a klinických příznaků po pokusné infekci u vakcinovaných prasat ve srovnání s nevakcinovanými infikovanými prasaty. Příklad 6 V tomto příkladu byly dvě skupiny (A a B) po 100 tři týdny starých odstavených prasat ze PRRS pozitivních stád vakcinovány buď vakcinou PRRS-MLV pasáž 70 podle příkladu 1, nebo placebem (sterilní vodou). Třicet prasat z každé skupiny bylo 32 32 99 99 t · · · • · · · • · 9 ·· ·« • · · ·» · · « t » · · * · • · · · 9 · * • 9 9999 9 · · * • · · 9 9 9 ·· 9 · · ···· monitorováno na přítomnost nežádoucích účinků sledováním tělesné teploty, přírůstku hmotnosti a reakce v místě injekce. Tyto prasata a zbývajících 70 prasat z každé skupiny bylo také sledováno na jejich zdravotní stav po dobu 28 dnů po léčbě, výsledky této studie ukazují, že vakcina nezpůsobuje žádné nežádoucí účinky a je bezpečná, pokud je správně použita v PRRS pozitivních stádech.

Rektální teploty před vakcinací (-2 DPV) ukázaly, že prasata použitá v tomto pokusu byla normální zdravá prasata. Teploty skupiny A byly signifikantně vyšší než teploty skupiny B v den -2 a -1 pokusu (p < 0,05). Nebyly zde žádné signifikantní rozdíly mezi oběma skupinami v den 0, 1, 2 a 3 pokusu (p < 0,05). Tyto výsledky ukazují, že vakcinace modifikovanou živou PRRS vakcinou neexacerbuje stavy způsobující existující zvýšenou teplotu. Žádné prase v žádné skupině nevykazovalo jakoukoliv poléčebnou reakci v místě inokulace. Tyto výsledky dále demonstrují bezpečnost vakciny, pokud je podána vhodným způsobem. Během 29 dnů od dnu -2 pokusu do 27 pokusu mělo 30 prasat skupiny A přírůstek hmotnosti průměrně 21,02 liber a 29 prasat skupiny B mělo průměrný přírůstek hmotnosti 18,18. Tento rozdíl je signifikantní při P < 0,05. Protože tento pokus byl proveden při aktivní PRRS infekci, ukazují výsledky bezpečnost stejně jako účinnost. Výsledky klinických pozorování ukazují, že vakcinace signifikantně redukuje incidenci několika klinických parametrů. 33 33 • · • · · 9 · · · · 9*9 · · ·····«· t • · · · » ·♦ · ·· I· • · · · * • · · · · • ····., · • · · t · · 99

Redukované parametry zahrnují vzhled z 62 na 6, stolici z 48 na 24, oči ze 162 na 89, nozdry z 30 na 0, ústa ze 30 na 0, chuč k jídlu z 91 na 13, léčbu z 37 na 14 a úmrtí z 5 na 0. Snížení počtu ošetření ve skupině 1 ve srovnání se skupinou B bylo signifikantní (p < 0,05). Redukce klinických příznaků dává další důkaz, že modifikovaná živá PRRS vakcina je bezpečná, pokud je použita ve stádech vykazujících klinické známky asociované s PRRS virem. závěrem, bylo ukázáno, že vakcina je bezpečná, pokud je správně použita ve stádech vykazujících aktivní klinické onemocnění asociované s infekcí PRRS virem. Vakcina nezvýrazňuje klinické příznaky, at asociované s s PRRS virem nebo se sekundárními patogeny, o kterých je známo, že jsou přítomny u těchto stavů u prasat. Za podmínek, které existují v tomto místě testu tyto výsledky také ukazují benefiční účinek ve skupině, která dostala vakcinu. Příklad 7 V tomto příkladu byl určován účinek vakcinace 20 "Dutch landrace breed" selat, prostých specifického patogenu, smíšeného pohlaví, 5 týdnů starých, nízkou dávkou vakciny ATCC VR-2332 pasáž 75 (ATCC VR-2495) na šíření Lelystad viru (LV). 0 přirozeném kmenu LV se soudí, že je významný pro predispozici prasat pro sekundární respirační infekce a že způsobuje špatný stav a vysoký stupeň mortality. Tento příklad poskytuje data týkající se účinku vakciny na přenos evropského antigenního typu LV viru.

Prasata byla separována do dvou skupin o 10 prasatech, jedna 34 ·· « ·# ·· Μ ·· t · · · · * · · · · · • · · 9 · · · · · ·« • · ·«·· · · 9 « 9 ··· ·., · • 99 · · 9 9 9 9 »« 9 99 ···· 99 99 byla pokusná skupina a druhá byla kontrolní skupina. Každé prase pokusné skupiny bylo vakcinováno intramuskulárně 2 ml ředěné vakciny obsahující asi 103 TCIDso vakciny ATCC VR-2332 pasáž 75. 0 šest týdnů později bylo 5 zvířat z každé skupiny infikováno iintranasální inokulací přirozenému evropskému kmenu LV (kod CDl-NL-2.91, Ter Huurne, 5. pasáž na prasečích alveolárních makrofágách) za použití infekční dávky 10s-3 TCIDso/2 ml. Po jednom dnu byla infikovaná prasata vrácena do svých ohrad.

Pokus testoval zda, kdy a kolik z vakcinovaných a nevakcinovaných prasat vykazovalo klinické příznaky onemocnění nebo bylo viremických, a zda a kolik kontaktem infikovaných prasat bylo infikováno Lelystad virem. Infekce ve vakcinované a kontrolní skupině byla kvantifikována a stupeň přenosu Lelystad viru byl počítán ve vakcinované a kontrolní skupině. Pro úspěšnou vakcinaci musela být závažnost a trvání onemocnění a viremie a stupeň přenosu nižší než v kontrolní skupině.

Tato studie, testovaná za extremních podmínek nízké vakcinační dávky a heterologní infekce ukázala protektivní hodnotu vakciny.

Vakcinace redukovala klinické známky onemocnění po infekci. Signifikantně redukovala průměrnou rektální teplotu po infekci; signifikantně redukovala počet dní, po které byla infikovaná prasata viremická; a signifikantně redukovala závažnost viremie u infikovaných prasat. Dále, ačkoliv se přenos z přímo infikovaných na kontaktem infikovaná prasata vyskytoval u všech prasat ve vakcinované i nevakcinované skupině, byl zde signifikantní rozdíl v přenosu přirozeného typu LV mezi 35 • · ·· ·· ·· » t · · · · · · ♦ ♦ · • · · · · · · · · · · • « ···· · · · ♦ # ··· ··* · ··· · ♦ · ♦ · · «· Λ ·« ···♦ *· ·· vakcinovanou a nevakcinovanou skupinou.

Vakcinace vakcinou amerického antigenního typu PRRS ATCC VR-2332 pasáž 75 byla proto účinná v navození ochrany před infekcí evropským antigenním typem Lelystad viru. Příklad 8

Produkce vakciny v komerčním rozsahu

Obrázek l ukazuje schematický diagram procesu pro použití v produkci komerčních množství živého modifikovaného Master Seed Culture viru z příkladu 1. Proces P10 začíná krokem P12, což je sterilizace všech kontainerů. Sterilizace je preferovaně provedena radiací, ale může být také provedena termálně nebo chemicky. Typy kontainerů zahrnují inokulační nádoby, např. 75 až 150 ml, pěti litrové nádoby, otočné kultivační zkumavky a nádoby ocelového bioreaktoru se vzduchovým mícháním.

Krok P14 obsahuje přípravu expansních kultur hostitelských MA-104 buněk. Zásoba MA-104 buněčné linie, v pasáži 58, je uskladněna v kapalném dusíku a je použita pro dodání hostitelských buněk pro virovou kulturu do pasáže 78. Zásobní MA-104 kultury jsou kultivovány v nádobách o objemu 75 až 150 ml a obsahujících 50 až 150 ml media. Medium preferovaně obsahuje MEM smísené s 10% hovězím nebo fetálním telecím sérem a okolo 30 μg/ml neomycinu. Sterilní nádoby a media jsou preferovaně inokulovány asi 1 ml dřívější pasáže MA-104 kultury a jsou inkubovány při 35 °C až 37 °C po tři až sedm dní.

Expanse zásobních buněčných kultur preferovaně probíhá ve od 150 ml nádob až asi do 400 - 600 ml media v poměru 1:5 36 ·· · ·· ·· ·· ·· • · · · · · · ···· ···· · · · * · ·· • ······« · · * ····<· • · · * · · ··· ·« · Μ ···· · # · · (objem:objem). Po asi 4-7 dnech inkubace při asi 35 - 37 °C může být těchto 400 - 600 ml media subkultivováno do pětilitrových nádob naplněných mediem. Alternativně, inokulum může být aplikováno v poměru 1:3,4 do otočné kultury mající kultivační plochu okolo 670 až 850 cm2 a 150 ml media,které je potom subkultivováno do jiných otočných kultivačních nádob v poměru od asi 1:9 do 1:11. Subkultury jsou inkubovány po asi 4 - 7 dní při asi 35 - 37 °C.

Krok 16 obsahuje přípravu produkčních kultur virem infikovaných MA-104 buněk. Expansní kultury kroku P14 jsou typicky dále expandovány do bioreaktorových nádob o větším objemu v poměru od asi 1:3 do asi 1:5 (objem:objem). Produkční nádoby mohou zahrnovat, například, pětilitrové nádoby expansních kultur nebo 40 litrové kultivační nádoby z nerez oceli vybavené vzduchovým mícháním, kontrolou teploty a kontrolou pH. Nádoba je naplněna vhodným množstvím kultivačního media, inokulována MA-104 buňkami, inkubována při asi 35 °C po 4 až 7 dní a infikována virem MAster Seed Culture podle příkladu 1. tento virus bude mít preferovaně titr alespoň 106 TCIDso na ml podle CPE a bude přidán do nádob produkčních kultur v poměru alespoň okolo 0,1 až 10 ml na 100 ml media. Produkční kultury jsou inkubovány při asi 35 °C až asi 37 °C po 2 až 3 dny po infekci atenuovaným virem.

Krok P18 obsahuje sklízení produkčních kultur kroku P16 po postinfekční inkubační periodě. Správná doba pro objemovou sklizeň by měla být určena pozorováním CPE jak je ukázáno asi 10% makroskopickými změnami (okrouhlé buňky a degradace buněčné vrstvy) nebo 10% změnou pH. Produkční kultura podle kroku P16 je sklízena odsávačem s laminárním prouděním nalitím do 37 »· · ·· ·· ·· ·· • · · · t I · · * · · ···· · · · · · ·· • · MM · t 9 I * ····*'· « 9 · · 9 9 ··· 19 I 99 9999 99 99 sterilního kontaineru nebo v uzavřeném sklízecím systému za pozitivního tlaku. Objemově sklízený virus je zmrazen a uskladněn při teplotě od asi -40 °C do asi -70 °C.

Jsou získány aliquoty pro kontrolní měření kvality podle požadavků. Vzorky každé sklizně jsou testovány v thioglykolátu a sojovém kaseinovém trávícím mediu, které je inkubováno při asi 36 °C a 20 °C, v příslušném pořadí, po 14 dní při každé teplotě. Tento očkovací virus je použit pro potěr následujících kultur pokud testování ukazuje titr alespoň okolo 105 TCIDso/ml podle CPE. Nedostačující materiál je sterilizován 5% chlornanem sodným po 24 hodin a autoklavován.

Krok P20 obsahuje stabilizaci a lyofilizaci zmrazeného viru získaného v kroku P18. Objem zmrazeného viru je potom rozmražen a preferovaně smísen s farmakologicky kompatibilním stabilizátorem, jako je konvenční sacharosový želatinový stabilizátor, v poměru asi tři části rozmražené MAster Seed Culture na asi jednu část stabilizátoru. Fyziologický roztok může být přidán pro úpravu konečné koncentrace viru.

Směs je potom rozdělena do subobjemů dávek po asi 0,28 ml kapaliny pro každou dávku, kdy každá dávka obsahuje asi 0,20 ml PRRS kultury na dávku v minimálním titru 1049 TCIDso na dávku. Je zde uvedeno, že preferované množství stabilizované produkční kultury, které vzniklo z krokuů P16, P18 a P20 bude dostatečné pro zisk asi 150000 a 500000 stabilizovaných dávek. Nappříklad, 25 dávek bude obsahovat asi 7,0 ml subobjemu. Tyto subobjemy jsou nárazově zmrazený, preferovaně v kapalném dusíku. Sušící komůrka je udržována ve vakuu, zatímco teplota je zvýšena na maximum asi 30 °C a subobjem je udržován po maximálně 18 hodin 38 • · · • · 38 • · · • · » · · • ·· ····** · • · · ·· ·♦ • · · • · · · • · · · · · · • · · ·· * pro sublimaci vlhkosti ve vzorku.

Krok 22 obsahuje kontinuální monitorování vakcinového produktu, který vzešel z kroku P20. Kontainer konečných vzorků nebo serie jedné lázně PRRS vakciny je testována ve skvrnách pro zjištění toho, že obsah vlhkosti klesl pod 5%. Serie s obsahem vlhkosti vyšším než 4% nebo nižším než 1% budou testovány na svou sílu v šestiměsíčních intervalech. Pro měření bezpečnosti jsou morčata injikována hmotnostními ekvivalenty 10 dávek vakciny a pozorována po dobu 21 dní na známky nežádoucí klinické reakce. VR-2332 virus byl také za chladu adaptován paralelně s atenuací popsanou v příkladu 1. Toto bylo provedeno proto, aby se vyvinul vakcinový kmen, který brání odpuzení viru infikovaným zvířetem. Taková chladová adaptace byla provedena postupným pasážováním při teplotě 31 - 35 °C. Vzniklé kmeny budou také stimulovat imunitní odpověď.

Claims (1)

1. 39 ♦ ·

   Patent o λτ éi nároky (zrušeno) p/. (zrušeno) ή,ϋ. Vakcinová kompozice obsahující živý virus reprodukčního a respiračního syndromu prasat v modifikované a v podstatě avirulentní formě a ve směsi s farmakologicky kompatibilním nosičem, kde uvedený modifikovaný a v podstatě avirulentní virus obsahuje ATCC-VR2.332 virus pasážovaný alespoň 70 krát na buněčné kultuře tak, že pokud je modifikovaný a v podstatě avirulentní virus podán prasatům nebo jiným savcům citlivým na PRRS, nezpůsobuje klinické příznaky PRRS onemocnění, ale je schopen indukovat imunitní odpověď, která imunizuje savce proti patogenním formám PRRS. Kompozice podle nároku 3, kde uvedený virus zahrnuje ATCC VR-2495. ý. (zrušeno) Kompozice podle nároku 3, kde uvedený nosič obsahuje sacharosový želatinový stabilizer. y. Způsob pro imunizaci prasat proti reprodukčnímu a respiračnímu syndromu prasat (PRRS) vyznačuj ící se t í m, že obsahuje krok podání vakcinové kompozice obsahující živý virus reprodukčního a respiračního syndromu změněný list • · 40 • · · · · • ····· · · • · · · ·· · • · • · • · · · · · ·· ·· • · · I • · · · • · · · · I • · · ·· ·· prasat ve směsi s farmakologicky akceptovatelným nosičem prasatům, kde uvedený virus obsahuje ATCC-VR2332 virus pasážovaný alespoň 70 krát na buněčné kultuře pro modifikaci viru a vytvoření v podstatě avirulentního viru, takže pokud je modifikovaný a v podstatě avirulentní virus podán prasatům nebo jiným savcům citlivým na PRRS, nezpůsobuje klinické příznaky PRRS onemocnění, ale je schopen indukovat imunitní odpověď, která imunizuje savce proti patogenním formám PRRS. j/. (zrušeno) (zrušeno)

   Způsob produkce komerčních množství PRRS vakciny vyznačující se tím, že obsahuje kroky: přípravu produkční kultury v podstatě avirulentní formy ATCC VR2332 viru, což obsahuje kroky pasážování ATCC VR-2332 viru alespoň 70 krát na buněčné kultuře pro modifikaci viru a vytvoření v podstatě avirulentního viru, takže pokud je modifikovaný a v podstatě avirulentní virus podán prasatům nebo jiným savcům citlivým na PRRS, nezpůsobuje klinické příznaky PRRS onemocnění, ale je schopen indukovat imunitní odpověď, která imunizuje savce proti patogenním formám PRRS, a generování produkční kultury z modifikovaného a v podstatě avirulentního ATCC-VR2332 viru; sklízení produkční virové kultury; přidání stabilizačního agens do produkční virové kultury; a změněný list 41 41 ·· · • · · ♦ · ♦♦ ·· ·· • ♦ ♦ · ···· ···· ·· · ···· • · ···· · · · · · ··· ♦ · ··· · · · · ♦ » ·· · ·· ·»·· Μ ·· lyofilizaci produkční virové kultury. 6‘ yí. Způsob podle nároku 10 vyznačující se tím, že krok přípravy obsahuje infikování opičí buněčné linie uvedeným virem a inkubování výsledné kultury při teplotě od asi 35 °C do asi 37 °C. f. yí. Způsob podle nároku 10 vyznačující se tím, že krok sklízení obsahuje zmrazení virové kultury. 3· y$ · Způsob podle nároku 10 vyznačující se tím, že krok přidání zahrnuje smísení asi jednoho díli sacharosového želatinového stabilizátoru s asi třemi částmi virové kultury. Způsob podle nároku 10 vyznačující se tím, že krok lyofilizace obsahuje sublimaci vlhkosti ze zmrazeného vzorku virové kultury. ^Q,yé. Způsob podle nároku 10 vyznačující se tím, že uvedená kultura obsahuje sériový objem od 150000 do 500000 dávek 0,28 ml na dávku. //, Způsob podle nároku 15 vyznačující se tím, že dále obsahuje podrozdělení sériového objemu před krokem lyofilizace. yí. Způsob podle nároku 10 vyznačující se tím, že uvedený v podstatě avirulentní virus je ATCC 2495 virus. /3·}^· Vakcina produkovaná způsobem podle nároku 10. změněný list 42 « « • I · ·· • · · • · · · • ···«· • · · ·· · ·· • t · • · • · · • · ···· • · ·· ·· • · yé. Způsob podle nároku 7vyznačující se tím, že uvedený virus byl pasážován 75 krát. Kompozice podle nároku 3, kde byl uvedený virus pasážován 75 krát. Způsob podle nároku 10 vyznačující se tím, že uvedený virus byl pasážován 75 krát.

   změněný list