CZ365099A3 - Prostředky pro ochranu rostlin - Google Patents

Description

Činidla pro diferenciaci buněk.

Oblast techniky

Vynález se týká činidel, která ovlivňují diferenciaci buněk; metod, ve kterých se taková činidla užívají a preparátů, jenž taková činidla zahrnují.

Dosavadní stav techniky

Buněčná diferenciace je proces, při kterém se buňky od sebe navzájem odlišují a specializují se na provádění určitých funkcí. Například specializace buněk sítnice je reakce na světlo a přenos této odezvy do mozku. Buňky kostry se specializují na stavbu kosti (osteoblasty) nebo chrupavky (chondrocyty) nebo opačně mohou resorbovat kosti (osteoklasty).

Podstata příčin, které spouští proces diferenciace a podstata markérů, které definují každý proces diferenciace, je v současné době ve fázi výzkumu. Odchylka v procesu diferenciace bude mít podstatný vliv na vývoj zárodku, mladých lidí nebo zvířat nebo na jakýkoliv organizmus, který se vyvíjí.

V případě tkáně, která se mění po celý život, odchylky v procesu diferenciace mohou vést k onemocnění. Například je známo, že kosti se aktivně mění po celý život a defekty v těchto změnách mohou vést k poškození kostry, jako je osteoporéza. Vzhledem k tomu, že kosti se tvoří z osteoblastů a resorbují se osteoklasty, předmětem pozornosti je diferenciace těchto dvou typů buněk. Je jasné, že odchylka v procesu diferenciace jednoho nebo druhého typu buněk povede k porušení rovnováhy ve změnách kostí. Pro proces diferenciace buněk existuje velmi málo markérů a tak současné znalosti jsou omezené. Vzhledem k této skutečnosti se předkládá názor.

že diferenciace osteoblastů z mezenchymálních kmenových buněk se jeví buď jako omezeni multipotenciality časných prekurzorů buněk během zráni nebo způsobuje, že buňky mezenchymálniho kmene na počátku vývoje se pevně drží průběhu diferenciace nebo své linie, ale znalosti tohoto procesu jsou omezené.

Uvažuje se, že diferenciovaným buňkám předchází prekurzorové buňky, které ve stejné fázi podléhají určitému průběhu diferenciace za vzniku zcela diferenciovaného fenotypu. Avšak věda zdůrazňujě hledisko multipotenciality a tak se uvažuje, že v závislosti na okolnostech, prekurzorová buňka může produkovat řadu různých fenotypů. Bohužel podstata těchto okolností zůstává nejasná.

Ze shora uvedených informací vyplývá, že bude výhodné porozumnět procesu diferenciace, což umožní účinnou obranu proti škodlivým důsledkům spojených s odchylkami v diferenciaci, většinou způsobem ujištění, že proces diferenciace probíhá správně, čímž se předejde stavům, které jsou spojené s chybějícím výsledným produktem zmíněného procesu.

Podstaty vynálezu

Za účelem výzkumu buněčné diferenciace se použily imortalizivané buněčné linie a zvláště imortalizivané buněčné linie popsané v podané UK patentové přihlášce číslo 9522562.9. Tyto linie se tvoří retrovirovou transdukcí imortalizovaných lidských prekurzorových buněk, jako jsou buňky stromatu lidské kostní dřeně, modulovatelným onkogenem. Tento postup je výhodný, protože imortalizace se vyvolává jednoduchými genetickými jevy a proto genotyp a následně fenotyp takových buněčných linií je jasně definován. Exprese aktivní formy produktu imortalizujícího onkogenu se může řídit. Takto se produkuje jedna velká homogenní populace prekurzorových buněk, které jsou předmětem zájmu. Protein onkogenu se může inaktivovat, což umožňuje buňkám vrátit se do jejich původního stádia diferenciace. Za použití těchto buněk se ukázalo, že buněčná diferenciace zahrnuje plasticitu a že prekurzorové buňky mají multipotencialitu, což znamená, že mohou rozlišit řadu různých diferencičních postupů, které poskytují různé buněčné fenotypy s ohledem na průběh diferenciace. Tato multipotencialita se řídí vnějším činidlem, které působí na prekurzorové buňky. Tímto činidlem je krev nebo její extrakt a/nebo extrabuněčné prostředí neurálních buněk nebo jeho extrakt. Toto pozorování má podstatné následky, protože jasně naznačuje, že kontrolou prostředí, kterému se prekurzorové buňky vystaví, se může řídit podstata fenotypu.

Zde se poprvé naznačuje, že multipotencialita prekurzorových buněk může být výhodná zvláště pak při léčbě klinických stavů.

V jednom příkladu se pozorovalo, že linie prekurzorových buněk lidských kostí se diferenciuje za normálních kultivačních podmínek, což znamená působením dexamethasonu/(OH)₂ vitaminu D₃, na fenotyp osteoblastů. Když na tyto buňky působí krev a zvláště sérum nebo jeho extrakt, diferencují se na fenotyp adipocytů. Toto pozorování souhlasí se skutečností, že u osteopenických pacientů a u pacientů s primární osteoporózou všech věkových kategorií se objem tukové tkáně kostní dřeně podstatně zvyšuje a objem kostí se redukuje. Ze studií na zvířatech je také známo, že vzrůst objemu dřeňového tuku se objevuje po redukci ztráty kostí imobilizací, vystavením nulové gravitaci nebo odstraněním vaječníků. Dodnes se neodhalil jiný než z buňkami spojený mechanizmus, který by zodpovídal za opačný vztah mezi objemem dřeňové tukové tkáně a kostí.

Zjistilo se, že osteoporóza nebo vzrůst objemu dřeňové tukové tkáně se může léčit použitím linií lidských buněk podle vynálezu. Takto se mohou identifikovat činidla, která blokuji aktivitu krve, zvláště pak séra nebo jeho extraktu. Taková činidla se pak používají in vivo.

V tomto vynálezu se poprvé využívá multipotencialita prekurzorových buněk k léčbě klinických stavů. Zde se také poprvé připravují lidské buněčné linie s představou, že budou použity pro určení činidel, které využívají multipotenciality prekurzorových buněk tak, že tyto prekurzorové buňky jsou směrovány na vybraný proces diferenciace.

Jiný příklad ukazuje, že prekurzorové buněčné linie lidských neurálních buněk se diferencují za normálních podmínek, což znamená, že se buňky vystaví působení neurotrofního faktoru (GDNF) získaného z gliové buněčné linie, na fenotyp nervových buněk. Když se však vystaví působení séra nebo jeho extraktu diferencují se na gliové buňky, jako je fenotyp astrocytů.

Tyto informace naznačují, že nemoci charakterizované nedostatkem neurální buněčné tkáně se mohou léčit použitím lidské buněčné linie podle vynálezu. Tak se určí činidla blokující aktivitu séra nebo jeho extraktu. Taková činidla používají in vivo.

Předmětem vynálezu jsou způsoby a prostředky vhodné pro regulaci, řízení nebo předpovídání diferenciace prekurzorových buněk.

Vynález zahrnuje využití multipotenciality prekurzorových buněk za účelem selektivního předem určeného průběhu diferenciace s ohledem na výběr podstaty fenotypu zralé buňky.

Za prvé vynález poskytuje způsob regulace a řízení diferenciace prekurzorových buněk na nejméně jeden specifický fenotyp. Při zmíněném způsobu diferenciace se na buňky působí krví a zvláště sérem nebo jeho extraktem a/nebo jsou buňky vystaveny vnějšímu prostředí neurálních buněk nebo jeho extraktu. Tento způsob probíhá za podmínek, které selektivně řídí diferenciaci s ohledem na její účel poskytnout předem vybraný fenotyp zralé buňky.

Za druhé vynález poskytuje způsob regulace nebo řízení diferenciace prekurzorových buněk nejméně na jeden specifický fenotyp. Zmíněné buňky jsou vystaveny působení činidla, které blokuje aktivitu krve a zvláště séra nebo jeho extraktu, a/nebo vnějšímu prostředí neurálních buněk nebo jeho extraktu za podmínek, které podporují diferenciaci.

U prvního předmětu vynálezu zmíněná krev a zvláště sérum nebo jeho extrakt a/nebo zmíněné extracelulární prostředí neurálních buněk nebo jeho extrakt se používají pro indukci tzv. sérem řízené diferenciace nebo diferenciace řízené extracelulárním prostředím neurálních buněk. Respektive, poskytují sérem řízený fenotyp nebo fenotyp řízený extracelulárním prostředím neurálních buněk.

U druhého předmětu vynálezu se používá zmíněné činidlo k blokování tzv. sérem řízené diferenciace nebo diferenciace řízené extracelulárním prostředím neurálních buněk za účelem poskytnutí alternativního tzv. na séru nezávislého fenotypu nebo fenotypu nezávislého na extracelulárním prostředí nervových buněk.

Vynález dále poskytuje třetí předmět vynálezu, což je farmaceutický přípravek, který obsahuje účinné množství krve a zvláště séra nebo/a jeho extraktu a/nebo extracelulárního prostředí nervových buněk nebo jeho extraktu a jenž se používá k řízení diferenciace vybraných prekurzorových buněk na nejméně jeden specifický fenotyp.

Vynález za čtvrté popisuje farmaceutický přípravek, který obsahuje účinné množství činidla, které blokuje aktivitu krve a zvláště séra nebo jeho extraktu a/nebo extracelulárního prostředí neurálních buněk nebo jeho extraktu za účelem poskytnutí tzv. na séru nezávislého fenotypu nebo fenotypu nezávislého na extracelulárnim prostředí nervových buněk.

Podle třetího aspektu vynálezu zmíněný přípravek se může použít ve spojení s prekurzorovými buňkami kostí za účelem poskytnutí fenotypu adipocytů; nebo ve spojení s neurálními prekurzorovými buňkami za účelem poskytnutí gliového fenotypu, který přispívá k ochraně proti nemocím, jako je roztroušená skleróza charakterizovaná úbytkem oligodendrocytických gliových buněk.

Podle čtvrtého aspektu vynálezu se může zmíněná farmaceutická kompozice použít ve spojení s prekurzorovými buňkami kostí za účelem poskytnutí fenotypu osteoblastů a tak přispívá k ochraně proti osteoporéze, osteopaenii, osteoartritidě, zlomeninám kostí, křivici a jiným onemocněním páteře souvisejících s redukcí tvorby kostí a dále obezitou a jinými stavy spojenými se vzrůstem tukové tkáně a (kardio)vaskulárním onemocněním, při kterém dochází ke tvoření tuku (buněk) ve vaskulárním systému, což může vést ke změnám, krevního toku. Modifikace diferenciace může způsobit u starých lidí poškození svalů. V dalším příkladu se používá čtvrtý předmět vynálezu ve spojení s neurálními prekurzorovými buňkami z důvodu zvýšení produkce neuronových buněk a ty se mohou použít k ochraně proti nemocím spojených s úbytkem neuronových buněk, k čemuž dochází při mozkových příhodách, Alzheimrově nemoci, Parkinsonově nemoci, amyotrofní laterální skleróze nebo onemocnění motorických neuronů nebo Hungtingtonově choree.

Vzhledem k pátému předmětu vynálezu, vynález poskytuje způsob prevence nebo zmírnění osteroporézy nebo obezity. Tento způsob zahrnuje aplikaci farmaceutického přípravku jednotlivcům. Farmaceutický přípravek obsahuje účinné množství krve a zvláště séra a/nebo činidla blokující extracelulárního prostředí neurálních buněk. Zmíněný farmaceutický přípravek blokuje sérem řízenou diferenciaci a/nebo diferenciaci řízenou extracelulárním prostředím neurálních buněk za účelem vzniku fenotypu, který souvisí s tvorbou kostí.

Ideální zmíněný fenotyp je fenotyp osteoblastů.

V preferovaném provedení vynálezu se zmíněný farmaceutický přípravek aplikuje do místa, kde je nutná léčba.

Za šesté se vynález týká způsobu zavedení nebo zvýšení množství tukové tkáně u jednotlivců, kteří jsou léčeni aplikací jednotlivých farmaceutických přípravků obsahujících účinné množství séra nebo jeho extraktu a/nebo extracelulárního prostředí neurálních buněk nebo jeho extraktu za účelem indukce sérem řízené diferenciace a/nebo diferenciace řízené extracelulárním prostředím neurálních buněk prekurzorových tukových buněk za vzniku sérem řízeného tukového fenotypu.

Při použití vynálezu ve spojení s neurálními prekurzorovými buňkami se zjistilo, že extracelulární prostředí nervových buněk může selektivně řídit diferenciaci za vzniku tzv. fenotypu extracelulárního prostředí nervových buněk.

Za sedmé vynález popisuje způsob prevence a zmírnění nemocí spojených se snížením počtu neuronových buněk. Tento způsob zahrnuje aplikaci farmaceutického přípravku jednotlivcům. Farmaceutický přípravek obsahuje účinné množství blokačního činidla, které blokuje sérem řízenou diferenciaci a/nebo diferenciaci řízenou extracelulárním prostředím neurálních buněk a tak potvrzuje skutečnost, že neurální prekurzorové buňky se diferencují způsobem nezávislým na séru a/nebo na extracelulárním prostředí neurálních buněk. Tak vzniká fenotyp neurálních buněk.

V preferovaném provedeni vynálezu se farmaceutický přípravek zavádí do centrálního nervového systému.

Farmaceutický přípravek slouží ke zvýšení produkce neuronových buněk a tak se může použít k ochraně proti nemocím spojených s úbytkem neuronových buněk, k jakému dochází při mozkových příhodách, Alzheimrově nemoci, Parkinsonově nemoci, amyotrofní laterální skleróze nebo onemocnění motorických neuronů nebo Hungtingtonově choree.

Za osmé vynález popisuje způsob určení činidla, které je účinné při prevenci a nebo obraně proti sérem řízené diferenciaci a/nebo diferenciaci řízené extracelulárním prostředím neurálních buněk. Tento způsob zahrnuje tyto kroky: na populaci prekurzorových buněk se působí účinným množstvím

a) krve a zvláště séra nebo jeho extraktu a/nebo extracelulárního prostředí neurálních buněk nebo jeho extraktu; a/nebo

b) testovacího činidla po dobu, která je nutná, a za podmínek, jenž podporují diferenciaci. Pak se populace buněk podrobí zkoumání, zda sérem řízená diferenciace nebo diferenciace řízená extracelulárním prostředím neurálních buněk proběhla nebo jaký je její stupeň.

Tento způsob podle vynálezu probíhá in vitro a in vivo.

V preferovaném provedení vynálezu zmíněná populace buněk je v ideálním případě buněčná linie lidského původu, jako je linie buněk stromatu lidské kostní dřeně nebo linie lidských neurálních buněk.

Je zřejmé, že činidlo určené použitím metody podle vynálezu, bude blokovat sérem řízenou diferenciaci a/nebo diferenciaci řízenou extracelulárním prostředím neurálních buněk. Když se toto činidlo použije ve spojení s neurálními prekurzorovými buňkami zabezpečí produkci neuronových buněk.

Vynález dále poskytuje činidlo, které se určilo shora uvedeným způsobem identifikace.

Vynález dále popisuje způsob určeni činidel, které účinně zesiluji sérem řízenou diferenciaci a/nebo diferenciaci řízenou extracelulárnim prostředím neurálnich buněk. Tento způsob zahrnuje kroky: na populaci prekurzorových buněk se působí účinným množstvím

a) krve a zvláště séra nebo jeho extraktu a/nebo extracelulárniho prostředí neurálnich buněk nebo jeho extraktu; a/nebo

b) testovacího činidla po dobu, která je nutná, a za podmínek, jenž podporují diferenciaci. Pak se populace buněk podrobí zkoumání, zda sérem řízená diferenciace nebo diferenciace řízená extracelulárnim prostředím neurálnich buněk proběhla nebo jaký je její stupeň.

Tento způsob podle vynálezu probíhá in vitro a in vivo.

V preferovaném provedení vynálezu zmíněná populace buněk je v ideálním případě buněčná linie lidského původu, jako je linie buněk stromatu lidské kostní dřeně nebo linie lidských neurálnich buněk.

Vynález dále poskytuje činidlo, které se určilo shora uvedeným způsobem identifikace.

Činidlo, které se určilo shora uvedeným způsobem identifikace, při použití ve spojení s kostními prekurzorovými buňkami zabezpečuje zesílenou diferenciaci tukového fenotypu a když se použije ve spojení s neurálními prekurzorovými buňkami, zabezpečuje zesílenou diferenciaci gliového fenotypu, který zahrnuje fenotyp astrocytů.

Dále vynález popisuje způsob zesílení tvoření kostí a při nejmenším relativně zmírňuje tvorbu tuku. Tento způsob zahrnuje krok: na populaci prekurzorových buněk se působí účinným množstvím činidla, které blokuje sérem řízenou diferenciaci a/nebo diferenciaci řízenou extracelulárnim prostředím neurálních buněk zmíněných prekurzorových buněk na tukový fenotyp.

V preferovaném provedení tohoto předmětu vynálezu relativní rovnováha mezi tkání kostí a tukovou tkání se může zvrátit odstraněním zmíněného činidla a/nebo vystavením buněk působení séra nebo jeho extraktu a/nebo extracelulárního prostředí neurálních buněk a/nebo jeho extraktu, který podporuje řízenou diferenciaci tkáňových buněk.

Tento způsob může probíhat in vivo nebo in vitro.

Vynález dále poskytuje způsob zvyšující tvorbu tkáně neuronových buněk a při nejmenším snižuje objem gliové nebo přesněji astrocytové tkáně. Tento způsob zahrnuje krok: na populaci prekurzorových buněk se působí účinným množstvím činidla, které blokuje sérem řízenou diferenciaci a/nebo diferenciaci řízenou extracelulárnim prostředím neurálních buněk zmíněných prekurzorových buněk na fenotyp neuronových buněk.

V preferovaném provedení tohoto předmětu vynálezu rovnováha mezi neuronovou tkání a astrocytovou nebo oligodendrocytovou tkání se může zvrátit odstraněním zmíněného činidla a/nebo vystavením buněk působení séra nebo jeho extraktu a/nebo extracelulárního prostředí neurálních buněk a/nebo jeho extraktu, který podporuje řízenou diferenciaci za vzniku gliového nebo přesněji astrocytového fenotypu.

Tento způsob může probíhat in vivo nebo in vitro.

Zde použité odkazy na krev a zvláště na sérum a jeho extrakt zahrnuje odkazy na séra různých druhů, jako jsou lidská, králičí, plodu telat, nově narozených telat, plodu koní, dospělých koní, koz a oslů.

Zde použité odkazy na krev a zvláště na extrakt zahrnuje odkazy na prostaglandiny sérum a jeho a zvláště metabolity prostaglandinu, jako je prostaglandin J2 a jeho metabolity a/nebo kyselinu retionickou a/nebo různé trofické faktory, jako jsou ciliárni neurotrofický faktor CNTF, neurotrofický faktor získaný z linie gliových buněk GDNF, fibroblastový růstový faktor FGF a jiné molekuly, jako jsou hydrokortizony a analogy a/nebo homology výše zmíněných činidel.

Zde zmiňované extracelulární prostředí neurálních buněk nebo jeho extrakt zahrnuje odkazy na prostředí u různých biologických druhů, jako je člověk, králík, plod telete, nově narozené tele, plod koně, dospělý kůň, koza a osel.

Zde použité odkazy na extracelulární prostředí neurálních buněk a jeho extrakt zahrnuje odkazy na různé faktory, který se v tomto prostředí vyskytují, jako jsou ciliárni neurotrofický faktor CNTF, a/nebo neurotrofický faktor získaný z linie gliových buněk GDNF, a/nebo neutrofický faktor získaný z mozku BDNF a/nebo retinoická kyselina, steroidní hormony, jako jsou hydrokortizony a analogy a/nebo homology výše zmíněných činidel.

Zde uvedená činidla, blokující sérum a/nebo extracelulární prostředí neurálních buněk, zahrnují činidla, která specificky blokují aktivitu CNTF, retinoické kyseliny, FGF a PG_J2a.

V dalších experimentech se ukázalo, že v případě osteoblastových/adipocytových prekurzorových buněk se může účinek řízený sérem odstranit stripováním na aktivním uhlí, což naznačuje, že za řízenou diferenciaci odpovídá komponent s nízkou molekulovou hmotností. Dále se ukázalo, že tato řízená diferenciace se může blokovat odstraněním molekul větších něž 30 kD, přesněji 100 kD. Tato tendence naznačuje, že existuje diferenciční činidlo s malou molekulovou hmotností, které se váže na velké proteinové nosiče.

Vynález popisuje způsob určeni extraktu, který zabezpečuje sérem řízenou diferenciaci. Tento způsob zahrnuje rozdělení krve a zvláště séra na frakce. Pak se populace prekurzorových buněk vystaví působení účinného množství nejméně jedné frakce zmíněného séra po dostatečný časový úsek za podmínek, které podporují diferenciaci. Pak se určí, zda ve zmíněné populaci buněk proběhla sérem řízená diferenciace a nebo jakého stupně dosáhla.

Tento způsob probíhá in vivo nebo in vitro.

Dále vynález zahrnuje extrakt určený shora popsaným způsobem.

Vynález dále poskytuje způsob určení extraktu extracelulárního prostředí neurálních buněk, který zabezpečuje diferenciaci řízenou extracelulárním prostředím neurálních buněk. Tento způsob zahrnuje frakcionaci faktorů nacházejících se ve zmíněném prostředí a další krok je vystavení populace prekurzorových buněk nejméně jedné frakci po nutný časový úsek za podmínek, které podporují diferenciaci. Pak se určuje, zda ve zmíněné populaci buněk proběhla sérem řízená diferenciace a nebo jakého stupně dosáhla.

Tento způsob probíhá in vivo nebo in vitro.

Dále vynález zahrnuje extrakt určený shora popsaným způsobem.

Z dříve preferovaných metod určení extraktu podle vynálezu se může použít frakcionace s ohledem na velikost. Komponenty séra lišící se v molekulové váze se separují a testují se výše uvedeným způsobem. Určení extraktu se může provést ionickou separací nebo libovolnou metodou známou v oboru, která se popisuje v následujících publikacích:

1. Hider, B.C. and Barlow D., Polypeptide and Protein DrugsProduction, Characterization and Formulation, (1991) Ellis Horword, New York.

2. Hook, JB & Poste, G, Protein Design and the Development of New Therapeutic and Vaccines, (1990) Plenum Press, New York.

3. Smith, CG, The Process of New Drug Discovery and Development, (1992) CRC Press.

4. Tyle, P and Ram BP, Targeted Therapeutic Systems, (1990) Marcell Dekker, New York.

5. Palfreyman, Mg, McCann, PP, Lovenberg, W, Temple, JG and Sjoerdsma, A, Enzymes as Targets for Drug Design, (1989) Academic Press, San Diego.

6. Matoren, GM, The Clinical Research Process in the Pharmaceutical Industry, (1984) Marcell Dekker, New York.

7. Smythies, JR and Bradley, RJ, Receptors in Pharmacology, (1978) Marcel Dekker, New York.

8. Smith, RB, The Development of a Medicine, (1985), Stockton Press .

Když se určí jedno činidlo, které zabezpečuje oba shora uvedené typy řízené diferenciace, bude možné určit použitím shora uvedených metod další činidla, která blokují tento účinek. Tímto způsobem bude možné určit antagonisty činidla, které zabezpečuje řízenou diferenciaci.

Zde používané prekurzorové buňky zahrnují buňky, které nemají vyvinutý svůj zralý fenotyp a v ideálním případě zahrnují buňky, jenž jsou ve velmi ranném stádiu vývoje, čili se ještě nediferencují. To znamená, že tyto buňky neobsahují tkáňově specifické markéry nebo je obsahují ve velmi malém množství.

Zde používané podmínky podporující diferenciaci se samozřejmě liší s ohledem na podstatu buněčné populace. Každý rys těchto podmínek je známý v oboru. Podmínky podporující diferenciaci v případě prekurzorových buněk lidských kostí zahrnují působení dexamethasonu/(OH)₂ vitaminu D₃.

Diferenciace podle vynálezu zahrnuje transdiferenciaci, při niž typ zrálých buněk se před tím, než projde celým procesem diferenciace za vzniku zcela zralého typu buňky, dediferenc uje na prekurzorový typ buněk. Transdiferenciace může probíhat bez zmíněného de-diferenciačního kroku.

Dále vynález poskytuje způsob určení existence, dostupnosti nebo predispozice k sérem řízené diferenciaci populace prekurzorových buněk za účelem vytvoření sérem řízeného fenotypu, který zahrnuje odebrání vzorku krve a zvláště séra od jedinců, kteří jsou testováni a působení zmíněného vzorku na prekurzorové buňky za podmínek, které podporuji diferenciaci, a dále zjištěni podstaty diferenciovaného fenotypu zmíněných prekurzorových buněk.

Vynález popisuje způsob určení existence, dostupnosti nebo predispozice k sérem řízené diferenciaci populace prekurzorových buněk za účelem vytvoření sérem řízeného fenotypu, který zahrnuje odebráni vzorku prekurzorových buněk z jedinců, kteří jsou testováni, a vystavení zmíněných prekurzorových buněk působení krve a zvláště séru nebo jeho extraktu za podmínek, které podporují diferenciaci. Dále uvedený způsob zahrnuje pozorování podstaty diferenciovaného fenotypu zmíněných prekurzorových buněk.

Vynález popisuje způsob určení existence, dostupnosti nebo predispozice k diferenciaci populace prekurzorových buněk řízené extracelulárním prostředím za účelem vytvoření fenotypu řízeného extracelulárním prostředím, který zahrnuje odebrání vzorku prekurzorových buněk z jedince, který je testován, a vystavení zmíněných prekurzorových buněk extracelulárnímu prostředá nervových buněk nebo jeho extraktu za podmínek, které podporují diferenciaci. Dále uvedený způsob zahrnuje zjištění podstaty diferenciovaného fenotypu zmíněných prekurzorových buněk.

V preferovaném způsobu diagnózy, kde zmíněné sérum nebo zmíněné prostředí je zmíněným testovacím vzorkem, se používají lidské buněčné linie, jako jsou zde popsané linie stromálních buněk kostní dřeně nebo linie lidských neurálních buněk. Shora popsaný proces pozorování zahrnuje test pro určení počtu buněk podílejících se na tvorbě kostí nebo počtu neuronových nebo gliových buněk.

Vynález také popisuje jak, poněkud nevšedně, adipo/osteoprogenitorové prekurzorové buňky exprimují to, co bylo do dnešní doby považováno za marker fenotypu zralého adipocytu; tj . receptor známý jako receptor γ aktivovaný peroxizomálním profilerátorem (PPARy) . Na základě tohoto překvapivého pozorování a také na základě skutečnosti, že ligandy pro tento receptor vyvolávají diferenciaci adipo/osteoprogenitorových prekurzorových buněk na adipocytový fenotyp se uvažuje, že tento receptor a k němu se vztahující ligandy hrají důležitou úlohu v regulaci a/nebo v kontrole diferenciace těchto prekurzorových buněk. Zde zmiňované sérum a/nebo extracelulární prostředí neurálních buněk nebo jeho extrakt zahrnuje ligandy, které se váží na receptor; a činidla blokující sérem řízenou diferenciaci a/nebo diferenciaci řízenou extracelulárním prostředím neurálních buněk zahrnují antagonisty těchto ligandů a/nebo činidla, která působí nefunkčnost zmíněného receptoru.

Přehled obrázků na výkrese

Na obrázku č. 1 je znázorněna fluorescenční imunolokalizace na teplotu citlivé formy velkého nádorového antigenu odvozeného z opičího viru-40 (SV40) exprimovaného v imortalizovaných buňkách stromatu lidské dřeně klon 7.

Na obrázku č. 2 je zakreslena růstová křivka buněk pro tři různé buněčné hustoty imortalizovaných buněk stromatu lidské dřeně klon 7 během časového úseku čtyř dnů. Buňky se nanesly na plotnu při hustotách 2 500 (otevřené čtverce), 5 000 (otevřené kosočtverce) a 10 000 na cm² (otevřený kruh) a inkubuji se při permisivni teplotě (33°C) . Každý bod křivky představuje průměr čtyř vzorků zatížený standardní chybou.

Na obrázku č. 3a je znázorněna aktivita buněčné alkalické fosfatázy v imortalizovaných buňkách stromatu lidské dřeně klon 7 jako odezva na sedmi denní léčbu dexamethasonem (10~⁷) . Každý bod křivky představuje průměr šesti vzorků zatížený standardní chybou. Pro statistickou analýzu se použil studentský t-test.

Na obrázku č. : 3b je vyobrazena exprese osteokalcinového proteinu v imortalizovaných buňkách stromatu lidské dřeně klon 7 během období čtyř dnů. Na buňky se aplikoval po dobu čtyř dnů 1,25 (OH)₂D₃ za přítomnosti vitaminu K. Pak se odstranilo médium a osteokalcin se měřil radioimunotestem. Hladina osteokalcinu se normalizovala na hodnotu nanogramy na 10 000 buněk. Výsledky se vyjadřují jako průměr čtyř vzorků ⁺/~ standardní chyba pro každý bod. Pro statistickou analýzu se použil studentský t-test.

Na obrázku č. 4 se ukazuje účinek působení dvou agonistů na hladinu cAMP v imortalizovaných buňkách stromatu lidské dřeně klon 7. Buňky se inkubovaly s lmM IBMX po dobu 5 minut a pak se aplikoval po dobu 20 minut agonist. Hladina cAMP se kvantifikovala testem ELISA a množství cAMP pro každou aplikaci se srovnávalo z kontrolou (pouze IBMX). Výsledky se vyjadřují jako průměr čtyř vzorků ⁺ /- standardní chyba pro každý bod. Pro statistickou analýzu se použil studentský ttest.

Na obrázku č. 5 se ukazuje účinek působení dexamethasonu (10-7M) na mineralizaci imortalizovaných buněk stromatu lidské dřeně klon 7. Buňky se inkubovaly po dobu 28 dní v médiu obsahujícím 10 % fetální bovinné sérum a β glycerofosforečnan při teplotě 39 °C, což není permisivní teplota pro onkogen. Mineralizace buněk, na které se aplikoval dexamethason, se prokázala barvením podle vonKossa. Analýza světelným mikroskopem ukázala, že v kultuře se tvoří stejné uzlíkaté formace, ale také prokázala mineralizaci. Minerální sedliny se jasně lokalizovaly v extracelulární matrici.

Na obrázku č. 6 je ukázán účinek normálního králičího séra na imortalizované buňky stromatu lidské dřeně klon 7. Buňky se inkubovaly buď v médiu, které obsahuje fetální bovinné sérum nebo v médiu s fetálním bovinním sérem a s normálním králičím sérem. Jestliže není přítomno normální králičí sérum, nelze prokázat lipidy. Avšak inkubace s králičím sérem vyvolává dramatické změny v obsahu lipidů, jak ukazuje barvení olejovou červení-O.

Obrázky 7a a 7b ukazují účinky normálního králičího séra (NRS) na diferenciaci imortalizovaných buněk stromatu lidské dřeně. Obrázek č. 7a ukazuje, že exprese kolagenu typu lal (dráha 2) se ztratí (dráha 3) po jednotýdenní aplikaci NRS (v dráze 1 je 123 bp velký žebříčkový marker). Naopak sedmi denní léčba pomocí NRS (obrázek č. 7b) vyvolává expresy časného markéru adipogeneze, což je lipoproteinová lipáza (dráha 2), které není přítomna (dráha 3) bez NRS (v dráze 1 je 123 bp velký žebříčkový marker).

Obrázek č. 8 demonstruje účinek různých typů séra na adipogenezi imortalizovaných buněk stromatu lidské dřeně klon 7 .

Obrázek č. 9 demonstruje účinek séra před a po menopauze na adipogenezi imortalizovaných buněk stromatu lidské dřeně klon 7.

Obrázek č. 10 demonstruje účinek 15-deoxy PGJ₂ a retinoické kyseliny na diferenciaci buněk LOP-7. Všechny skupiny se srovnávaly s kontrolou pomoci studentského t testu.

Příklady provedeni vynálezu

Příklad 1: Faktory ovlivňující volbu způsobu diferenciace lidské kostní linie.

Materiál

Pro kultivaci buněčné kultury se použilo plastikové nádobí pro tkáňové kultury firmy Costar (High Wycombe, UK) . Firma Life Technologies (Paisley, UK) poskytla minimální esenciální médium-alfa (a-MEM), Dulbeccovo modifikované Eagle médium (DMEM), HAM'S F12, fetálníbovinné sérum (FCS), glutamin, penicilin/streptomycin, G418 (geneticin), trizolové činidlo a Taq DNK polymerázu. Firma Sigma Chemicals Co. (Dorset, UK) poskytla kyselinu askorbovou, vitamin K, PTH fragment 1-34, PGE₂, forskolin, dexamethason, polybren, alkalickou fosfatázu, histochemickou detekční soupravu, fosforečnan para-nitrofenylu, para-nitrofenylový standard, olejovou červeň 0, trypanová modř, dimethylsulfoxid (DMSO),

3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-difenyltetrazolium bromid (MTT), perkol a konjugované protilátky proti myšímu IgC FITC.

Membrána na imunoblot se získala od firmy Life Sciences International (UK) Ltd. (Basingstoke, UK) . Specifické monoklonální protilátky k SV40 T antigenu pochází od firmy Cambridge Bioscience (Cambridge, UK) a souprava pro test RIA lidského osteokalcinu je z Nichols Institute (Ca., USA), reverzní transkriptáza viru moloneyové leukémie (M-MLV RT) a dNTP se získaly u firmy Promega (Southampton, UK) . Primery pro PCR interleukinů Ια, 1β, 3, 4, 6 a 8, GM-CSF a TNFa jsou dárek od Dr. W. Wishart (Sandoz Pharma, Basilej, Švýcarsko) a

PCR primery pro kolagen typu 1 jsou dárek od Dr.K.A.Hart (Zeneca, Macclesfield, UK). Primery pro lipoproteinovou lipázu se vytvořily podle publikovaných dat (Gotoda et al., 1989). Anfotropicky zbalený retrovirový vektor, který obsahuje mutantní velký T antigen viru SV40 (tsA58) a gen nesoucí rezistenci na neomycin, jsou dárek od Prof. P.H.Gallimora (Institute of Cancer Studies, Birmingham, UK).

Izolace a transdukce buněk stromatu lidské kostní dřeně.

Od šedesátosmi leté pacientky, která prodělala operaci hrudníku, se získalo žebro. Pacientka neprodělala žádné onemocnění kostí. Žebro se bezprostředně dvakrát opláchlo sterilním fosforečnanem pufrovaným fyziologickým roztokem (PBS) a seškrábala se veškerá přichycená tkáň. Žebro se rozdělilo na dvě poloviny, aby se otevřela kostní dutina, a rozkrájela se trabekulární kost. Z trabekulární kosti se získaly buňky kostní dřeně promytím s a-MEM za použití stříkačky o objemu 10 ml a jehly 19. Po několikanásobném promytí médiem výsledná buněčná suspenze se přenesla do univerzální nádoby a nechala se stát po dobu 10 minut. Během této doby se odstranily usazeniny tuku, které pluly na povrchu. Buňky získané z kostní dřeně se přenesly do centrifugačních zkumavek a centrifugovaly se při lOOxg po dobu 5 minut. Vznikl pelet buněk. Odstranily se tukové sedliny a médium a pelet se resuspendoval v 5 ml čerstvého média. Resuspendované buňky se nanesly na 70 % perkolový gradient a centrifugovaly se při 460xg po dobu 15 minut. Následující centrifugací se oddělila horní část gradientu tvořící 25% objemu, která obsahuje osteoblastové prekurzorové buňky o nízké hustotě (Haynesworth et al 1992). Ke suspenzi se přidal ekvivalentní objem čerstvého média a suspenze se centrifugovala při lOOxg po dobu 10 minut. Výsledný pelet buněk se resuspendoval v čerstvém médiu a shluky buněk se rozdělily na jednotlivé buňky tím, že suspenze opakovaně procházela jehlou 19. Buňky se obarvily 1 % (w/v) trypanovou modří a spočítal se počet viditelných buněk.

Buňky stromatu kostní dřeně se pak centrifugovaly při lOOxg po dobu 5 minut a pelet buněk se resuspendoval ve vhodném objemu média, které obsahuje amfotroficky zabalený retrovirový pendlující vektor s ts-SV40-T a se selekčním markérem, a polybren o konečné koncentraci 8 gg/ml. Buňky a médium se inkubovaly po dobu 2 hodin. Pak se buněčná suspenze opět centrifugovala a buněčný pelet se resuspendoval v příslušném objemu normálního média. Buňky se inokulovaly do nádoby T75 vhodné pro tkáňové kultury v konečné koncentraci 4xl0⁷ buněk na kultivační nádobu. Buňky se inkubovaly při teplotě 33°C a po třech dnech se buňky přichytily na plast vhodný pro tkáňové kultury. Když se většina buněk zachytila na nádobě, zbytek neadherovaných buněk se odstranil promytím a médium se nahradilo normálním médiem, které obsahuje G418 v konečné koncentraci 400 pg/ml.

Po dvou týdnech kultivace v G418 přežily pouze buňky s geneticinovou rezistencí. Z každé takové buňky vznikla diskrétní kolonie homologní s SV40-T imortalizovanými buňkami. Izolovaly se jednotlivé rezistentní kolonie pomocí kruhového klonování a buněčné populace se rozrostly v kultivačních nádobách pro tkáňové kultury. Homogenní buněčné populace se získaly inokulací 96-ti komůrkových ploten jednotlivými buňkami, které jsou odvozené z individuálních kolonií. Pro podpoření růstu jednotlivých buněk během časných fází nárůstu počtu buněk bylo nutné médium zvláště upravené pro tento účel.

Vytvořeni růstových křivek.

Plotny s 24-ti komůrkami vhodné pro tkáňové kultury se inokulovaly 2 500, 5 000 nebo 10 000 buněk/cm² a buňky se inkubovaly při teplotě, která je permisivni pro onkogen (33 °C) . Použitím haemocytometru se určilo rozpětí počtu viditelných buněk na cm² dokud se nedosáhlo konfluentnosti. Buňky se vizualizují vylučováním toluidinové modři.

Imunocytochemie

Imunobarvení velkého T antigenu proběhlo po zafixování subkonfluentních buněk směsí metanolu a acetonu (1:1) při teplotě -20 °C po dobu 20 minut. K buňkám se přidaly primární IgC myší monoklonální protilátky proti SV40-T ředěné v PBS 1:20 a inkubovaly se při teplotě 37 °C po dobu 1 hodiny. Kontrolní buňky se inkubovaly v samotném PBS. Buňky se dvakrát promyly s PBS a přidaly se sekundární protilátky (konjugované kozí protilátky proti myšímu IgC FITC) ředěné 1:20 v PBS a inkubovaly se dalších 60 minut při teplotě 37 °C. Nadbytečné protilátky se odstranily několikanásobným promytím s PBS a buňky se před fluorescenční mikroskopií zalily přípravkem immu-mount.

Barvení mineralizovaných matric.

Médium s postkonfluentními buňkami, kde je nebo není přítomen 10~⁷M dexamethason, se doplnilo 50 μg/ml kyseliny askorbové a 10“⁵M β-glycerofosforečnanem. Buňky se dále inkubovaly při teplotě 39°C po dobu 28 dní. Dále se promyly PBS a zafixovaly se 10 % pufrovaným fyziologickým roztokem s formalínem po dobu 10 minut při teplotě místnosti. Buňky se obarvily podle modifikované metody van Kossa (Cook 1974). Na buňky se aplikoval dusičnan stříbrný a vystavily se působení ultrafialovému světlu po dobu jedné hodiny. Nadbytečný dusičnan stříbrný se odstranil promýváním destilovanou vodou a na buňky se aplikoval 5 % thiosíran sodný po dobu 5 minut při teplotě místnosti. Buňky se následně dvakrát promyly destilovanou vodou a nechaly se usušit na vzduchu.

Testování proteinů kostních buněk.

Buňky se inokulovaly o hustotě 10 000 buněk/cm² a nechaly se růst až dosáhly konfluentnosti při permisivní teplotě (33 °C) a pak se aplikovala dexamethason a 1,25(OH)₂D₃. Buňky se inkubovaly při nepermisivní teplotě (39 °C) a každé tři dny se doplňovalo čisté kultivační médium bez vhodných činidel. Před měřením osteokalcinu se médium izolovalo a skladovalo se při teplotě -80°C. Obsah osteokalcinu se zjišťoval soupravou pro imunoradiometrickou analýzu (Nicholl's Institute), která je schopna určit jak neporušený osteokalcin tak i jeho velký střední fragment Nkonce. 20 μΐ upraveného média nebo média se známými standardy osteokalcinu se smíchalo s protilátkami proti lidskému osteokalcinu značených ¹²⁵I. Plastikové lože se potáhlo neznačenými osteokalcinovými protilátkami, které vznikly proti alternativním místům molekuly osteokalcinu. Směs se inkubovala po dobu 3 hodin při teplotě místnosti. Pak se lože několikrát promyla promývacím pufrem (je součástí soupravy). Na promytém loži se pomocí gama počítače stanovilo množství navázaného “⁵I. Kontrolní a měřené vzorky se za účelem stanovení množství osteokalcinomu porovnaly se standardními křivkami pro osteokalcin.

Obsah alkalické fosfatázy se určil v buněčné vrstvě pozměněnou metodou, jejíž původní verze se popisuje v publikaci Bessey et al (1946). Buněčný lyzát se připravil takto: buňky se několikrát promyly PBS a seškrabaly se do

200 μΐ ledem chlazeného 0,1 % Tritonu-X 100 a vzorky se slabě sonifikovaly. Alikvóty vzorků se inkubovaly předehřátým substrátovým roztokem (0,lM dietanolamin, ImM MgCl₂ a 2 mM pNPP pH 10,5) po dobu 1 hodiny. Reakce se zastavila přidáním 0,lM NaOH. Obsah p-NP se určil spektrofotometricky při vlnové délce 410nm a konečná koncentrace se odhadla ze standardní křivky pro p-NP standard.

Určení obsahu osteokalcinu a alkalické fosfatázy se standardizoval na jednotku proteinu. Obsah proteinu v buněčné vrstvě se získal Βίο-Rad proteinovým testem, který je založen na způsobu navázání barviva podle Bradforda (Bradford 1976).

Stimulace syntézy cAMP parathyroidním hormonem.

Kultivační médium obsahující 10 % FCS se inokulovalo buňkami a inkubovalo se při permisivní teplotě až dosáhlo 60% konfluentnosti. Médium se pak nahradilo médiem, které obsahuje 10% králičího séra, a buňky se dále inkubovaly při nepermisivní teplotě (39°C) po dobu třech dnů. Kultura buněk se dvakrát promyla s PBS a fixovala se 10 % pufrovaným fyziologickým roztokem s formalínem. Za účelem určení obsahu lipidů se buňky obarvily olejovou červení, jak popisuje Cook (1974).

RT-PCR

Buňky se inokulovaly o hustotě 10 000 buněk/cm² a nechaly se růst při permisivní teplotě až dosáhly konfluentnosti. Médium se odstranilo a buňky se dvakrát promyly PBS s trizolovým činidlem (Iml na 10 cm²) a izolovala se RNA podle návodu výrobce. První řetězec cDNA se syntetizoval z 5 μρ RNA za použití 0,2 μg oligo (dT) primeru, směsi dNTP (koncentrace každého byla 0,5 mM) a MMLV-RT (100 jednotek) . Konečný objem směsi byl 20 μΐ. RNA a primery se inkubovaly při teplotě 70 °C po dobu 10 minut, pak se rychle zchladily na ledu a přidal se zbytek komponentů. Reakčni směs se inkubovala při teplotě 37 °C po dobu jedné hodiny. Enzymy ve vzorcích se pak inaktivovaly po dobu 5 minut při teplotě 95°C. cDNA se amplifikovala v reakčnim objemu 100 μΐ za použití amplifikační metody horkého startu, jak popisuje D'Aquilla et al (1991) . Reakčni směs obsahuje směs dNTP (koncentrace každého byla 0,2 mM) , specifické primery (koncentrace každého byla 0,5 mM) , Taq DNA polymerázu (2,5 jednotek), 20 mM Tris-HCl (pH 8,4), 50 mM KC1 a 1,5 mM MgCl₂. Primery a amplifikační podmínky, které se používaly v PCR reakcích jsou uvedeny v Tab. 1.

Objasnění mechanizmu adipo/osteoprogenitorové prekurzorové diferenciace.

Pomocí faktorů, o kterých se ví, že regulují expresy adipocytů, se vysvětluje jeden možný mechanizmus diferenciace určených lidských adipo/osteoprogenitorových prekurzorů. Zvláště se studovala exprese adipocytového markeruperixozómového proliferátoru-aktivovaného receptoru gamma, PPARy.

RNA izolovaná z uvedených adipo/osteoprogenitorových buněk se amplifikovala polymerázovou řetězovou reakcí za použití reverzní transkriptázy (rt-PCR). Použily se oligonukleotidové primery, které jsou specifické pro PPARy. Překvapivě tento experiment ukázal, že prekurzorové buňky exprimují PPARy. Do dneška se myslelo, že PPARy, stejně jako jiné specifické jaderné receptory adipocytů (C/EBP jako je CEBPa), se exprimovaly pouze v diferenciovaných adipocytech.

Také inkubace buněk se známými ligandy PPARy, 15-deoxydelta, 12,14-prostaglandin J₂, vyvolávají diferenciaci adipo/osteoprogenitorových buněk na adipocytový fenotyp (obrázek č.10). To ukazuje, že 15-deoxy-delta, 12,14prostaglandin J₂, které se vyskytují v krvi, jsou specifické faktory, jenž mohou modulovat diferenciaci adipo/osteoprogenitorových prekurzorů.

To mělo značný význam, protože do té doby nikdo neukázal, že PPARy a jeho ligandy se mohou podílet na řízení a nebo přímo řídit tvorbu osteogenních buněk. Činidla, která působí proti adipogennímu účinku deoxy-delta 12,14prostaglandinu J₂, se mohou použít k obraně proti např. osteoporéze. Je zajímavé, že kyselina retionická, která je také obsažena v krvi, má adipogenní schopnost (obrázek č. 10) a působí v souladu s metabolitem PGJ₂. Zdá se, že blokování aktivity kyseliny retionické by mělo podpořit diferenciaci prekurzorových kostních buněk na osteoblastový fenotyp.

Shora uvedená metoda, která se používá pro vysvětlení mechanizmu adipo/osteoprogenitorové diferenciace se popisuje buď přímo nebo nepřímo v následujících publikacích.

1) Hu, E. et al, Transdiferenciace of myoblastů by the adipogenic transcription factors PPARy a C/ΕΒΡα, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, Vol. 92, pp. 9856-9860, October 1995.

2) Kliewer, S A et al, A Prostaglandin J₂ etabolite Binds Peroxisome Proliferator-Activated Receptor y and Promotes Adipocyte Differentiation, Cell, Vol. 83, 813-819, 1 December 1995.

3) Forman, B M et al, 15-Deoxy-Ai2,14-Prostaglandin J₂ is a Ligand for the Adipocyte Determination Factor PPARy, Cell, Vol. 83, 803-812, 1 December 1995.

4) Greene et al., Isolation of the Human PPARy cDNA: Expression in Haematopoetic Cells and Chromosomal Mapping, Gene Expression, Vol. 4, 281-299, 1995.

Příklad 2: Faktory ovlivňující volbu způsobu diferenciace u linií krysích neurálních buněk.

Použité způsoby a dosažené výsledky

Neurální buňky z 12 až 13 dnů starých embryonálních krysích jader rhaphe se imortalizovaly transdukcí na teplotu citlivým onkogenem (ts)SV40T, který je zbalen v retroviru (Stringer et al., 1994). Po izolaci a pomnožení klonů odvozených od jednotlivých prekurzorových buněk při teplotě, která je permisivní pro onkogen, se buňky nechaly diferenciovat při zvyšující se teplotě až na hodnotu, která není permisivní. Za těchto základních podmínek buňky vzniklé z několika klonů vykazují podobnou neuronovou charakteristiku, což je pozitivní neuron specifickou enolázu a enolázu nervových vláken (NSE). Projevily se i markéry serotoninergického fenotypu. Inkluze různých sér (lidské, králičí, plodu telete, nově narozeného telete, plodu koně, dospělého koně, kozy a osla) zabraňuje expresy tohoto fenotypu. Morfologie buněk je podobná astrocytům a buňky exprimuji gliový fibrilárni kyselý protein (GFAP). Když se sérum aplikuje opožděně až po posunu teploty, vede to ke snížení počtu buněk, které se mohou plně vyvinout v astrocytický fenotyp. Podobně, když se sérum přestane používat po jeho více jak dvoudenní aplikaci, umožňuje to nebo to vyprovokuje návrat k serotinergickému neuronovému fenotypu.

Fetální telecí sérum se dělilo na frakce použitím ultrafiltračních zkumavek firmy Amicon. Při přeměně na gliový fenotyp se uplatňují pouze frakce obsahující faktory s molekulovou hmotnosti větší jak 30 kD. Mikromolární koncentrace retinoické kyseliny (tisíckrát vyšší než je hladina, která se nachází ve 100% séru) také způsobuje expresy GFAP. Hydrokortizon v okamžiku posunu teploty ovlivnil fenotyp vyvíjejících se buněk rhaphe gliovým způsobem.

Společná kultivace krysích buněk z míchy (tj . neurální buňky bez neuronových buněk s klony imortalizovaných prekurzorových buněk rhaphe vede k tomu, že imortalizované buňky se mění z neuronového fenotypu, který vzniká za základních podmínek, na fenotyp s pozitivní GFAP, buňky jsou ploché, což je typická morfologie pro astrocyty; použilo se základní médium bez přidání séra. GDNF (5 ng/ml) nevykazuje tento účinek. Volba způsobu diferenciace je proto regulována, alespoň částečně, přítomností faktorů odvozených od extracelulárního prostředí, ve kterém neurální buňky rostou, stejně jako faktory, které se nacházejí v séru. Tyto faktory zahrnují retinoickou kyselinu a látku(y) s vysokou molekulovou hmotností, která se nachází v séru.

Z toho lze vyvodit, že jednotlivé buňky v embryonálním krysím rhaphe jsou schopny se diferenciovat in vitro nejméně dvěma způsoby. Volba způsobu diferenciace se řídí přinejmenším částečně faktory přítomnými v séru, jeden z nich může být retinoická kyselina. Zvrácení diferenciace oběma způsoby je stále obtížnější až se úplně ztratí schopnost buněk převzít alternativní serotoninergický fenotyp podobný neuronovému nebo astrocytovému.

Příklad 3: Faktory ovlivňující volbu způsobu diferenciace v lidských neurálních buněčných líniiích.

Použité způsoby a dosažené výsledky

Neurálni prekurzorové buňky z lidského kortexu ošum týdnů starého embrya se imortizovaly shora popsaným způsobem. Pomnožily se z jednotlivých buněk. Buňky se nanesly na plotny se 24 komůrkami, které jsou potaženy fibronektinem. Po dobu 3 až 4 dnů se udržovaly při teplotě 33 °C až dosáhly 70 % konfluentnosti. Léky se přidaly buď před zvýšením teploty na 39 °C nebo v okamžiku teplotního skoku. Po dalších 7 až 10 dnech se kultura zafixovala a obarvila pomocí protilátek. Specifické faktory a léky značně ovlivnily konečný fenotyp linií kortikálních buněk. Například (pomnožení Hcort5b) neurotrofický faktor (GDNF) získaný z linie gliových buněk způsobil, že některé buňky vykazují neuronální charakteristiky, jako je imunoreaktivita neuron-specifické enolázy a na rozhraní jasná morfologie. Pokud jsou stejné kultivační podmínky s výjimkou, že je přítomen ciliární neurotrofický faktor (CNTF) , pak GFAP barvení je patrné v některých plochých na rozhraní tmavých buňkách podobných astrocytům. V případě, že oba tyto faktory chybí nevyskytují se žádné charakteristické rysy gliových buněk neuronového fenotypu. V jiné linii kortikálních buněk (pomnožení Hcort3b) se při základních kultivačních podmínkách projeví slabé imunobarvení v některých buňkách, ale po odstranění fibroblastového růstového faktoru (FGF) ze zásobního média a po přidání dexamethasonu se u velké části buněk vyvinula morfologie podobná neuronům a silná imunoreaktivita podobná NSE. FGF bránil účinku dexamethasonu.

Zjistilo se, že neznámé faktory obsažené v některých sérech, známé trofické faktory a některé malé molekuly jsou schopné řídit neuronový versus astrocytový fenotyp lidských a krysích neurálních prekurzorů.

Dosažené výsledky

1*5

Experimenty ukazují retrovirovou transdukci primárních buněk stromatu lidské kostní dřeně vektorem, který obsahuje onkogen (ts) -SV4 0-T (A58) řízený MLV, jenž je odvozen od LTR promotoru, a gen neo^r, který propůjčuje řadě populací buněk kostní dřeně z různých zdrojů rezistenci na geneticin.

Pomocí imunocytochemie se ukazuje exprese velkého T antigenu viru SV40 ve všech buňkách imortalizovaného klonu (obrázek č. 1) . Protein se lokalizoval, jak se očekávalo, v jádrech buněk. Kontrolní buňky, na které se neaplikovaly primární protilátky, se neobarvily. Dále pomocí elektroforézy na polyakrylovém gelu a westernového přenosu se určil v těchto buňkách T antigen. Očekávaná molekulová hmotnost plné délky T antigenu, její stanovení se obešlo bez předchozí precipitace a selekce antigenu, je okolo 96 kD (data nejsou uvedena) .

Všechny tři použité hustoty buněk vykazují stejnoměrný nárůst počtu buněk při permisivní teplotě (33 °C) . Nejvyšší rychlost růstu je u buněk, které se inokulovaly při hustotě 10 000 buněk na cm². Z grafu je jasné (obrázek č. 2), že konfluentnosti buněk se dosáhne právě, když na jednom centimetru čtverečním je 30 000 buněk. Pak rychlost růstu buněk klesne, ačkoli se nemůže vyloučit možný nárůst rychlosti hynutí buněk. Čas se přibližně dvojnásobně snížil s rostoucí buněčnou hustotou z přibližně 36 hodin při vysoké hustotě na 45 hodin při nejnižší hustotě buněk. V případě, že se použilo normální kultivační médium buňky nevykazují proliferaci při nepermisivní teplotě (39 °C) (data se neuvádí).

Buněčné vzorky z původního klonu se víc jak 21 krát pasážovaly (přibližně 84 populací se zdvojilo). Ve vzorku z klonu 7 se buňky množily po 21 pasážích (přibližně 84 populaci se zdvojilo, což se odhaduje na celkové množství buněk 10²⁴) .

V imortalizovaném klonu se testovala aktivita alkalické fosfatázy (obrázek č. 3a) a exprese osteokalcinového proteinu (obrázek č. 3b), za účelem určit, zda buňky exprimují tyto dva proteiny trvale nebo se jejich exprese dá vyvolat, což je charakteristické pro osteoblastový fenotyp.

K expresi alkalické fosfatázy dochází při permisivní teplotě a její aktivita se zvýší aplikací dexamethasonu v dávce 10~^;M. Nárůst aktivity způsobený dexamethasonem je podstatně zpomalen přítomností aktivního produktu onkogenu. Aktivita při permisivní teplotě je 0,848+/-0,21 pmolů p-NP/mg proteinu/hodinu a při nepermisivní teplotě to je 7,441+/-1,97 pmolů p-NP/mg proteinu/hodinu. Když se teplota kultivace konfluentních buněk změnila na nepermisivní a buňky se kultivovaly v normálním médiu po dobu 7 dnů, pozoroval se nárůst aktivity alkalické fosfatázy. Aktivita měřená při permisivní teplotě je 0,236+/-0,09 pmolů p-NP/mg proteinu/hodinu a při nepermisivní teplotě je 0,985+/-0,18 pmolů p-NP/mg proteinu/hodinu. Při obou teplotách je aplikace dexamethasonu spojena s podstatným nárůstem aktivity alkalické fosfatázy (p je menší než 0,05 při 33°C a p je menší než 0,01 při teplotě 39°C) . V některých uvedených imortalizovaných klonech získaných ze stromatu kostní dřeně se prokázala aktivita alkalické fosfatázy, ne však detekovatelná hodnota, před stimulací dexamethasonem nebo 1,25(OH)2 vitaminem D₃.

Syntéza osteokalcinu nebyla detekovaná v buňkách kultivovaných v základním médiu po tři týdny, ale když se do média přidal 1,25 (OH)₂ vitaminu D₃ doprovázeného vitaminem k, produkce osteokalcinu se detekovala v druhém týdnu kultivace. Odezva produkce osteokalcinu na 1,254 (OH)₂ vitaminu D₃ je závislá na dávce. Nejnižší dávka stimulující produkci osteokalcinu v množství 0,41+/-0,17 ng na 10⁴ buněk je 10^-11M a nej vyšší dávka stimulující produkci osteokalcinu v množství 6, 37 + /-0, 55 ng na 10⁴ buněk je 10’⁷M. Jak se očekávalo vystavení buněk dexamethasonu nevedlo k syntéze měřitelného množství osteokalcinu.

Studovaly se cAMP odezvy na forskolin, PGE₂ a PTH (1-34) za účelem zjistit, zda tyto známé kostní agonisty indukují zvýšení hladiny cAMP. Je jasné, že všechny tři agonisty mají stimulující účinek na hladinu cAMP (obrázek č.:4). Nejlepší odezva, jak se očekávalo, je při dávce 10”⁵M, která zvyšuje hladinu více jak dvakrát. Obě látky PTH a PGE₂ zvyšují v závislosti na dávce hladinu cAMP. V případě PGE₂ při dávce 10^-9M je nárůst cAMP 38,7 + /-8,4 % ve srovnání s nárůstem 79+/-4,2 % při dávce 10’⁸M. Dávka 10^-9M 1-34 PTH dává 50 + /11,6 % nárůst v hladině cAMP a při dávce 10”⁸M je nárůst 58+/-11,02 %.

Po 28 denní kultivaci v přítomnosti βglycerofosforečnanu a s nebo bez přítomnosti dexamethasonu o koncentraci 10’⁷M, se buňky klonu 7 barvily podle metody van Kossa, za účelem ukázat mineralizaci extracelulární matrice. Jak ošetřené tak neošetřené buňky vykazují mineralizaci své extracelulární matrice. Silnější mineralizaci lze spatřit u buněk, kde se aplikoval dexamethason (obrázek č. 5. a) . V těchto kulturách se mohou spatřit stejné uzlíkaté formace, ale je jasné, že mineralizace se objevuje i v oblastech bez uzlíků. Analýza světelnou mikroskopií jasně prokázala přítomnost minerálních usazenin v extracelulární matrici (obrázek č. 5.b).

Buňky klonu 7 kultivované v přítomnosti 10 % normálního králičího séra po dobu třech dnů vykazují dramatické změny v obsahu lipidů, jak dokazuje barvení olejovou červení-0.

Buňky, které nebyly takto ošetřeny, nevykazuji detekovatelný obsah lipidů. Když se však kultivují s králičím sérem, zvýší se poměrná část obarvených buněk na 100% (obrázek č. 6a, b). V buňkách imortalizovaných s ts-SV40-T, které jsou pdobné osteoblastům získaných z úlomků trabekulární kosti dospělého člověka, není možné vyvolat diferenciaci adipocytickou cestou (data nejsou uvedena).

Aplikace normálního králičího séra na imortalizované buňky stromatu po dobu jednoho týdne při teplotě 39°C také vyvolala expresy lipoproteinové lipázy, což je časný marker adipocytické linie (obrázek č. 7a) . Dále po kultivaci s 10% normálním králičím sérem po dobu 7 dnů se ztratila exprese kolagenu typu I, což je marker linie osteoblastových buněk (obrázek č. 7).

Osteoporéza, která se charakterizuje nárůstem tukové tkáně v kostní dřeni a úbytkem objemu kostí, se vyskytuje u žen po menopauze. Naše výsledky naznačují, že sérum nebo jeho extrakt je odpovědný za adipogenní změnu. Imortalizované buňky stromatu lidské kostní dřeně klonu 7 se vystavily působení králičího séra, o kterém se ví, že obsahuje činidlo odpovědné za řízení diferenciace tak, že vznikají adipocyty. Uvažuje se, že sérum žen před menopauzou obsahuje relativně malé množství takového činidla nebo takové činidlo neobsahuje vůbec, sérum žen po menopauze obsahuje uvedené činidlo. Výsledky jsou na obrázku č. 8 a 9.

Na obrázku č. 8 je možné vidět, že, jak se předpovídalo, vystavení lidské buněčné linie působení králičího séra vede přibližně k 90 % produkci adipocytů. Jestliže vystavíme stejnou linii buněk séru žen před menopauzou, má to za následek produkci pouhých 10% adipocytů. To naznačuje, že činidlo odpovědné za změnu adipocytů je buď méně aktivní nebo je přítomno v menším množství nebo není přítomno vůbec. Jestliže vystavíme stejnou linii buněk séru žen po menopauze, vede to k produkci přibližně 40% adipocytů, což naznačuje, že probíhá sérem řízená diferenciace na adipocytní fenotyp a že činidlo odpovědné za změnu adipocytů je buď více aktivní nebo je přítomno ve větším množství.

Na obrázku č. 9 je možné vidět, že v podstatě stejný experiment se opakoval za použití séra od skupiny žen před menopauzou a od skupiny žen po menopauze. Získaly se stejné výsledky.

S odvoláním na obrázek č. 10 je zřejmé, že adipo/osteoprogenitorové prekurzory se diferencují způsobem, který zahrnuje receptor γ PPARy aktivovaný peroxizómovým profilátorem. Uvažuje se, že tento receptor během diferenciace slouží jako marker diferenciovaného a tedy zcela dozrálého fenotypu. Data naznačují, že činidla, která aktivují/deaktivuji receptor PPARy, mají určitou úlohu v diferenciaci těchto prekurzorových buněk.

Tyto data naznačují, že v séru existuje činidlo odpovědné za řízení diferenciace a že, když se buňky stromatu lidské kostní dřeně vystaví působení zmíněného činidla, vzniká fenotyp adipocytů. Výsledky jasně ukazují, že použitím lidských nebo zvířecích buněčných linií, které se retrovirálně transdukovaly vektorem exprimujícím modulovatelnou formu SV40-T, je možné získat prekurzorové buňky, jenž se mohou při teplotě permisivní pro onkogen replikovat za vzniku homogenní populace prekurzorových buněk. Tyto buňky se pak mohou využít ke studiu diferenciace. Za použití těchto buněk je možné ukázat, že prekurzorové buňky mohou být multipotenciálni a tak závisí na povaze procesu diferenciace, kterým projdou. Mohou se diferenciovat na více než jeden fenotyp. Například se ukázalo, že prekurzorové buňky kostí se mohou upravit tak, aby proběhla diferenciace za vzniku buď buněk kostí nebo adipocytů. Nervové prekurzorové buňky se mohou upravit tak, aby se diferencovaly za vzniku buď neuronových buněk nebo astrocytů. Výsledky naznačují, že volba postupu diferenciace se reguluje přinejmenším rozpustnými faktory přítomnými v séru a/nebo v extracelulárním prostředí nervových buněk. Uvažuje se, že rozpustné faktory s nízkou molekulovou hmotností jsou zahrnuty v proteinových nosičích s vysokou molekulovou vahou a nebo je pravděpodobnější, že jsou těmito proteiny neseny. Také se ukázalo, že při postupující diferenciaci probíhající alternativním způsobem je stále obtížnější proces zvrátit až je zřejmé, že se zcela ztratila schopnost převzít něco jiného, než danou cestu diferenciace.

Naše zjištění a vynález popsaný v této přihlášce mají velký technický význam. Ustanovilo se: že prekurzorové buňky se mohou vyvinout více než jednou cestou; jakým způsobem se tento vývoj řídí; a jak se tento vývoj reguluje.

Claims (21)

1. Způsob regulace a řízení diferenciace nejméně bipotenciálních lidských prekurzorových buněk na specifický zralý fenotyp, vyznačující se tím, že zmíněné buňky se vystaví působení krve a zvláště séra nebo jeho extraktu a/nebo extracelulárnímu prostředí neurálních buněk nebo jeho extraktu za podmínek, které podporují diferenciaci tak, aby selektivně řízenou diferenciací vznikl předem zvolený zralý fenotyp.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že zmíněné prekurzorové buňky se buď alternativně nebo dodatečně vystaví působení činidla, které blokuje aktivitu uvedeného séra nebo uvedeného prostředí.

3. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství krve nebo zvláště séra nebo jeho extraktu a/nebo extracelulárního prostředí neurálních buněk nebo jeho extraktu pro řízení diferenciace přinejmenším bipotenciálních lidských prekurzorových buněk za vzniku předem vybraného zralého fenotypu.

4. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství činidla, které blokuje aktivitu krve a zvláště séra nebo jeho extraktu a/nebo extracelulárního prostředí neurálních buněk nebo jeho extraktu tak, aby došlo k diferenciaci vybraných přinejmenším bipotenciálních lidských prekurzorových buněk, která není závislá na séru nebo na extracelulárním prostředí nebo jeho extraktu, přičemž vzniká předem vybraný zralý fenotyp nezávislý na séru nebo extracelulárním prostředí neurálních buněk.

5. Způsob určení činidel, které účinně předcházejí nebo interferují se sérem řízenou diferenciaci a/nebo diferenciaci řízené extracelulárním prostředím neurálních buněk, vyznačující se tím, že se alespoň bipotenciální lidská prekurzorová populace buněk vystaví působení účinného množství

a) krve a zvláště séra nebo jeho extraktu a/nebo extracelulárního prostředí neurálních buněk nebo jeho extraktu; a/nebo

b) testovacího činidla, po dostačující časový úsek a za podmínek, které podporují diferenciaci na zralý fenotyp, přičemž zmíněná populace se testuje, aby se zjistilo, zda proběhla sérem řízená diferenciace nebo diferenciace řízená extracelulárním prostředím neurálních buněk za vzniku zralého fenotypu a/nebo jakého stupně dosáhla.

6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že zmíněná populace je buněčná linie.

i.

Způsob podle nároku 5 nebo 6, vyznačuj ící se tím, že zmíněná buněčná linie je linie buněk stromatu lidské kostní dřeně.

8. Způsob podle nároku 5 nebo 6, vyznačuj i c i se tím, že zmíněná buněčná linie je linie lidských neurálních buněk.

9. Způsob určení činidel, která účinně zesilují sérem řízenou diferenciaci a/nebo diferenciaci řízenou extracelulárnim prostředím neurálních buněk, s e vyznačuje tím, že při nejmenším bipotenciální lidská prekurzorová populace buněk se vystaví působení účinného množství

a) krve a zvláště séra nebo jeho extraktu a/nebo extracelulárního prostředí neurálních buněk nebo jeho extraktu; a/nebo

b) testovacího činidla, po dostačující časový úsek a za podmínek, které podporují diferenciaci na zralý fenotyp, a potom se zmíněná populace testuje, aby se zjistilo, zda proběhla sérem řízená diferenciace a diferenciace řízená extracelulárnim prostředím neurálních buněk za vzniku zralého fenotypu a/nebo jakého stupně dosáhla.

10. Činidla určená způsoby podle nároků 5 až 9.

11. Způsob určení krve a zvláště extraktu séra, který je účinný při sérem řízené diferenciaci, vyznačuj ící se tím, že zahrnuje dělení zmíněné krve a zvláště séra na frakce a že se nejméně bipotenciální populace lidských prekurzorových buněk vystaví působení účinného množství nejméně jedné frakce zmíněného séra po dostatečný časový úsek za podmínek, které podporují diferenciaci na předem určený zralý fenotyp, a potom se zmíněná populace testuje, aby se zjistilo, zda proběhla sérem řízená diferenciace na zralý fenotyp a/nebo jakého stupně dosáhla.

12. Způsob určení extraktu extracelulárního prostředí neurálních buněk, který je účinný při diferenciaci řízené extracelulárnim prostředím neurálních buněk, vyznačující se tím, že zahrnuje dělení zmíněného prostředí na frakce a že se nejméně bipetenciální populace lidských prekurzorových buněk vystaví působení účinného množství nejméně jedné frakce zmíněného prostředí po dostatečný časový úsek za podmínek, které podporují diferenciaci na předem určený zralý fenotyp, přičemž se zmíněná populace testuje, aby se zjistilo, zda proběhla diferenciace řízená extracelulárním prostředím na zralý fenotyp a/nebo jakého stupně dosáhla.

13. Extrakt určený způsobem podle nároků 11 a 12.

14. Způsob diagnostikování existence, náchylnosti nebo predispozice k sérem řízené diferenciaci alespoň bipotencionální populace lidských prekurzorových buněk tak, že vzniká sérem řízený předem zvolený zralý fenotyp, vyznačují cí se tím, že se pro testování získá z jednotlivce vzorek krve a zvláště séra nebo jeho extraktu a že se nejméně bipotenciální lidské prekurzorové buňky vystaví působení zmíněného testovaného vzorku za podmínek, které podporují diferenciaci na předem zvolený fenotyp, a pak se zjišťuje podstata diferenciovaného fenotypu zmíněných prekurzorových buněk.

15. Způsob diagnostikování existence, náchylnosti nebo predispozice k sérem řízené diferenciaci alespoň bipotencionální populace lidských prekurzorových buněk tak, že vzniká sérem řízený předem zvolený zralý fenotyp, vyznačující se tím, že se pro testování získá z jednotlivce vzorek nejméně bipotencionálních lidských prekurzorových buněk a zmíněné prekurzorové buňky se vystaví působení krve a zvláště séra nebo jeho extraktu za podmínek, které podporují diferenciaci na předem zvolený fenotyp, a pak se pozoruje podstata diferenciovaného fenotypu zmíněných prekurzorových buněk.

16. Způsob diagnostikováni existence, náchylnosti nebo predispozice k diferenciaci alespoň bipotencionálni populace lidských prekurzorových buněk, která je řízená extracelulárním prostředím neurálních buněk tak, že vzniká předem zvolený zralý fenotyp řízený extracelulárním prostředím neurálních buněk, vyzná čující se tím, že se pro testování získá z jednotlivce vzorek extracelulárního prostředí neurálních buněk nebo jeho extrakt a že se nejméně biopotenciální prekurzorové buňky vystaví působení zmíněného testovaného vzorku za podmínek, které podporují diferenciaci na předem zvolený fenotyp, a pak se pozoruje podstata diferenciovaného fenotypu zmíněných prekurzorových buněk.

17. Způsob diagnostikování existence, náchylnosti nebo predispozice k diferenciaci alespoň bipotencionálni populace lidských prekurzorových buněk, která je řízená extracelulárním prostředím neurálních buněk tak, že vzniká předem zvolený zralý fenotyp řízený extracelulárním prostředím neurálních buněk, vyznačující se tím, že se pro testování získá z jednotlivce vzorek nejméně bipotencionálních lidských prekurzorových buněk a že se zmíněné prekurzorové buňky vystaví působení extracelulárního prostředí nervových buněk nebo jeho extraktu za podmínek, které podporují diferenciaci na předem zvolený fenotyp, a pak se zjišťuje podstata diferenciovaného fenotypu zmíněných prekurzorových buněk.

18. Způsob diagnostikování existence, náchylnosti nebo predispozice k sérem řízené diferenciaci alespoň bipotencionálni populace lidských prekurzorových buněk tak, že vzniká sérem řízený předem zvolený zralý fenotyp, přičemž tento způsob se vyznačuje tím, že se z jednotlivce získá vzorek krve a zvláště séra nebo jeho extraktu a že se ve vzorku určuje předem zvolené činidlo.

19. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, že zmíněné činidlo zahrnuje libovolnou jednu nebo více látek ze skupiny obsahující prostaglandin zvláště pak metabolit prostaglandinu, jako je prostaglandin J2 a jeho metabolity, retinoickou kyselinu, trofický faktor, jako je ciliární neurotrofický faktor CNTF, neurotrofický faktor získaný z linie gliových buněk GDNF, fibroblastový růstový faktor FGF, hydrokortizon; a/nebo analogy nebo homology výše uvedených látek.

20. Způsob diagnostikování existence, náchylnosti nebo predispozice k diferenciaci alespoň bipotencionální populace lidských prekurzorových buněk, která je řízená extracelulárním prostředím neurálních buněk tak, že vzniká předem zvolený zralý fenotyp řízený extracelulárním prostředím neurálních buněk, vyznačující se tím, že se z jednotlivce získá vzorek extracelulárního prostředí neurálních buněk nebo jeho extrakt a že ve vzorku se určí předem zvolené činidlo.

21. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že zmíněné činidlo zahrnuje libovolnou jednu nebo více látek ze skupiny obsahující retinoickou kyselinu, ciliární neurotrofický faktor CNTF, neurotrofický faktor získaný z linie gliových buněk GDNF, neurotrofický faktor získaný z mozku BDNF, hydrokortizon; a/nebo analogy nebo homology výše uvedených látek.