CZ373799A3

CZ373799A3 - Zlepšené způsoby zpracování aktivovaného proteinu C

Info

Publication number: CZ373799A3
Application number: CZ19993737A
Authority: CZ
Inventors: Andrew David Carlson; Theodore Arsay Sheliga; Jeffrey Clayton Baker; Lihua Huang
Original assignee: Eli Lilly And Company
Priority date: 1998-04-24
Filing date: 1998-04-24
Publication date: 2000-06-14

Abstract

Způsob snižování autodegradace aktivovaného proteinu C v průběhu zpracování a čištění. Složení vodných roztoků aktivovaného proteinu C a zlepšený způsob zpracování takových roztoků, zahrnující provádění těchto způsobů při iontové síle větší než 150 mM a při pH asi 5,5 až méně než 6,3.

Description

Zlepšené způsoby zpracování aktivovaného proteinu C

Oblast techniky

Vynález je zaměřen na způsob snižování autodegradace aktivovaného proteinu C během jeho zpracování a čištění.

Dosavadní stav techniky

Protein C je serin proteázový a přirozeně se vyskytující antikoagulant, který hraje roli při regulaci homeostázy inaktivaci faktorů V_a a VIIl_a koagulační kaskády. Lidský protein C je in vivo produkován primárně v játrech jako jediný polypeptid, který má 461 aminokyselin. Tato prekursorová molekula podstupuje několik posttranslačních modifikací, mezi které patří:

1) štěpení 42 aminokyselinové signální sekvence;

2) proteolytické odstranění lysinového zbytku v poloze 155 a argininového zbytku v poloze 157 z jednoho zymogenového řetězce, takže vznikne molekula, tvořená dvěma řetězci (t.j. lehký řetězec se 155 aminokyselinami, připojený disulfidovým můstkem k těžkému řetězci s 262 aminokyselinovými zbytky, který obsahuje serin proteázu);

3) vitaminem K ovlivněná karboxylace devíti zbytků glutamové kyseliny, seskupených v prvních 42 aminokyselinách lehkého řetězce, jejímž výsledkem je 9 funkčních skupin kyseliny gamakarboxyglutamové (GLA); a

4) připojení karboxyhydrátu na čtyřech místech (jednom na lehkém řetězci a třech na těžkém řetězci).

Φ φ φ φ · · · φ · φ φ φφφφ φφ φ φφφ

- 2 φφ φφφ φφ φφ φ ·

Těžký řetězec obsahuje dobře potvrzenou proteázovou triádu Asp 257, His 211 a Ser 360. Závěrem se zymogen, obsahující dva řetězce, aktivuje trombinem na fosfolipidovém povrchu za přítomnosti vápenatého iontu. Aktivace je výsledkem odstranění dodekapeptidu na N-zakončení těžkého řetězce, přičemž vzniká aktivovaný C-protein (aPC), vykazující enzymatickou aktivitu. Za přispění dalších proteinů působí aktivovaný protein C jako patrně nejvýznamnější negativní regulátor koagulace krve, která má za následek trombózu.

Naneštěstí však podléhá aPC autodegradaci, která vede ke snižování antikoagulační účinnosti. Průběh degradace byl v rámci dosavadního stavu techniky rozpoznán jako odtržení na lysinovém členu v poloze 308 těžkého řetězce, při kterém vzniká fragment, obsahující 111 aminokyselin. Tento degradační produkt byl v rámci dosavadního stavu techniky určen jako EAK fragment.

Dosud známé snahy o zpomalení autodegradace byly zaměřeny na minimalizaci tvorby zmíněného EAK fragmentu. Nejvýznamnější je Prouty et al.: EP 0 666 513, 12.7.1995, kde se uvádí minimalizace autodegradace aPC úpravou pH na hodnotu zhruba 6,3 až 7,0; inkubace aPC ve 3M močovině nebo vystavení aPC extrémním koncentracím solí, které jsou definovány nad 0,4 M a pod 0,05 M.

Přihlašovatelé zjistili, že existuje druhá důležitá cesta degradace, a to autodegradace N-zakončení lehkého řetězce, která vede k roztržení tohoto řetězce na některé straně histidinového zbytku v poloze 10. Tento průběh degradace vede ke dvěma inaktivním produktům. Buď se odtrhne na N-zakončení prvních devět zbytků lehkého řetězce, což pak vede ke vzniku

- 3 des(1-9)aktivovaného proteinu C (dále též des(1-9)aPC), nebo se odtrhne na N-zakončení prvních deset zbytků lehkého řetězce, čímž vznikne jako degradační produkt des( 1-10)akti vovaný protein C (dále též des(1-10)aPC). Tato degradační cesta, která dosud nebyla popsána, vede ke ztrátě antikoagulační aktivity v důsledku odstranění významných zbytků GLA v polohách 6 a 7. Z těchto důvodů je minimalizace úrovně autodegradačních produktů des(1-9)- a des(1-10)- aktivovaného proteinu C důležitá při přípravě aktivovaného proteinu C pro dosažení účinného preparátu vysoké čistoty. Tyto možnosti degradace byly dosud neznámé a odstranění jejich produktů známými metodami čištění by bylo nesmírně obtížné, ne-li zcela nemožné. Podmínky, za jakých se dá minimalizovat jejich vznikání, byly neznámé.

Rozpoznání této významné cesty autodegradace aktivovaného proteinu C umožnilo přihlašovatelům objevit postup a formulovat podmínky zvýšení čistoty a účinnosti aktivovaného proteinu. Přihlašovatelé prokázali, že nízké pH (např. menší než 6,3) podporuje cestu, jejíž produkty jsou des(1-9)aPC nebo des(1-10)aPC na úkor autodegradační cesty 308-309, avšak použití vyšších koncentrací chloridu sodného (nad 150 mM) při pH pod 6,3 výrazně omezuje rozsah autodegradační reakce, která má jako produkty jmenované des(1-9)aPC a des(1-10)aPC.

V souladu s tím řeší vynález zpracování aktivovaného proteinu C působením koncentrace iontů větší než 150 mM při pH asi 5,5 až 6,3. Za těchto podmínek je vznik autodegradačních produktů des(1-9)aPC a des(1-10)aPC signifikantně omezen. Tento vynález tudíž řeší zlepšený způsob zpracování vodného roztoku aktivovaného proteinu C bez nežádoucí degradace.

to · to · · · toto to ···· to · to · · · « · · « • to ···· ······ • to · · · · · · · · · toto ·to· ·· ·· toto «·

- 4 Popis obrázků na přiložených výkresech

Obrázek 1 ukazuje primární strukturu aktivovaného lidského proteinu C, pro ilustraci zde popsaných autodegradačních cest. Zde použitá nomenklatura je založena na číslování primární sekvence lidského aktivovaného proteinu C. Pro odborníka v oboru je zřejmé, že jiné druhy aktivovaného proteinu C, které se mírně liší v primární sekvenci, by měly podle příslušné posuny v názvech podle tohoto zde použitého názvosloví.

Podstata vynálezu

Vynález řeší vodné roztoky aktivovaného proteinu C a zlepšený způsob zpracování takovýchto roztoků, který zahrnuje působení iontovou silou větší než 150 mM a působení pH asi 5.5 přičemž pH je menší než 6,3.

Vynález dále řeší způsob čištění aktivovaného proteinu C chromatografickým dělením, v průběhu kterého je zahrnuto vymývání proteinu C pomocí vodného elučního roztoku, který má iontovou sílu nad 150 mM a pH asi 5,5 až menší než

6,3.

Vynález dále řeší způsob zvýšení koncentrace aktivovaného proteinu C v roztoku filtrací, který zahrnuje přivádění aktivovaného proteinu C na filtrační membránu ve formě vodného roztoku, který má iontovou sílu větší než 150 mM a pH asi 5,5 až menší než 6,3.

Předmětem vynálezu je dále aktivovaný protein C, připravený zde popsaným způsobem.

4 4 444444 44 44

4444 44 4 444 4

- 5 4 4 * 4 4 44 * 44 4

4 4 0 44 4 4 4·

444 40 44 4 · 44

Konečně předmětem vynálezu jsou také farmaceutické přípravky obsahující aktivovaný protein C, které mají obsah des(1-9)aPC a/nebo des(1-10)aPC menší než 10 % hmot.

Podrobný popis vynálezu

Veškeré zkratky aminokyselin, používané v tomto popisu jsou tytéž, které byly přijaty Americkým patentovým úřadem jako zavedené zkratky v 37 C.F.R. § 1.822 (B) (2).

Pro účely popisu předloženého vynálezu, jak je zde popsán a chráněn patentovými nároky, jsou definovány následující termíny takto:

Výraz „aPC“ nebo „aktivovaný protein C“ - znamená protein C, který je rekombinační nebo je odvozen od plasmy. Výraz aPC zahrnuje a zejména znamená lidský protein C, ale může taky zahrnovat jiné druhy nebo deriváty, které mají proteolytickou, amidolytickou, esterolytickou a biologickou (antikoagulační nebo profibrinolytickou) aktivitu proteinu C. Příklady derivátů proteinu C jsou popsány Gerlitzem, et al., v US patentu 5 453 373 a Fosterem, et al., v US 5 516 650, jejichž veškeré poznatky se zde tímto začleňují do popisu formou odkazu.

„APTT“ - parciální doba aktivace tromboplastinu.

„Vodný“ - zahrnuje kromě použití samotné vody jako rozpouštědla i systémy, kde se voda vyskytuje v kombinaci s kosolventem. Nejčastěji výraz „vodný znamená, že rozpouštědlem je samotná voda.

• 9 « «····· ·* a· • a a a · · · < » a a • a a a a a · a a v a a a a a a « « a a a a aa a a · a a a a a a •· «aa ·a ·· aa «9

- 6 „Chromatografická separace“ - tento termín zahrnuje chromatografické techniky, které jsou popsány a zavedeny v rámci dosavadního stavu techniky, včetně dělení podle velikosti částic, aniontové, kationtové a hydrofobní chromatografie, chromatografie na reverzní fázi a podobně.

„Filtrace s příčným tokem“ - (Cross-flow fiitration) znamená dělení tangenciálním tokem podél filtrační membrány, přičemž žádaný produkt může být bud zadržován membránou (jako při zahušťování nebo při diafiltraci) nebo může být membránou propouštěn (jako při filtračním odstraňování virů).

„PC“ - protein C jako zymogen.

„Zpracování“ - znamená jednotkovou operaci, používanou při výrobě aktivovaného proteinu C, jako je například sloupcová chromatografie, filtrace (tangenciální, příčná, kontinuální), lyofilizace, čerpání nebo skladování.

Zkratka „r-aPC“ - znamená rekombinační aktivovaný protein C, získávaný aktivací PC in vitro nebo přímou sekrecí aktivované formy proteinu C z prokaryotických buněk, eukaryotických buněk nebo transgenních zvířat včetně například sekrece z buněk lidských ledvin 293 ve formě zymogenu a následného čištění a aktivace pomocí metod známých odborníkům v oboru, například těch, které jsou popsány v patentech: Yan, US 4 981 952 a Cottingham, WO 97/20043.

Vynález se také týká zlepšených způsobů zpracování aktivovaného proteinu C. Vynález se zejména týká zpracování aktivovaného proteinu C pomocí obohacení proteinem nebo

- 7 zvýšení koncentrace a operací čistících protein, při snížení autodegradace. Vynález se vyznačuje takovým procesem a zejména takovým provedením, při kterých se obohacovací a čistící operace provádějí s použitím vodného roztoku proteinu za podmínek zde popsaných.

Kombinací podmínek, která je zde chráněna, se dosahuje minimalizace vzniku des(1-9)aPC a des(1-10)aPC. Tím je možno podle vynálezu dosáhnout nížení koncentrace des(1-9)aPC a des(1-10)aPC na požadovanou hodnotu, která byla až dosud známými způsoby a metodami čištění při výrobě farmaceutických přípravků na bázi aPC nesmírně obtížně dosažitelná. Obecně, farmaceutické přípravky aPC, vyráběné za těchto podmínek podle vynálezu, jsou v podstatě zcela prosty des(1-9)aPC a des(1-10)aPC, přičemž obecně mají méně než 10 %, výhodně méně než 8 %, ještě výhodněji méně než 5 % a nejvýhodněji méně než 3 % těchto variant, jednotlivě nebo v kombinaci, vždy počítáno hmotnostně. Lyofílizované farmaceutické prostředky připravené z aPC podle zde uvedeného a v patentových nárocích chráněného vynálezu vykazují zlepšenou stabilitu v roztoku (před lyofilizací) a 24 až 48 hodin po rekonstituci. Do pěti dnů při teplotě 2 až 8 °C, do 50 hodin při teplotě 15 °C a do 40 hodin při teplotě 25 °C se ztráta pohybuje pod 5 %. Před tímto vynálezem byla takováto stabilita nedosažitelná.

Pečlivým hlídáním a upravováním pH, iontové síly a zejména teploty v průběhu výroby a v preparátech lze omezit autodegradaci aktivovaného proteinu C ve vodných roztocích na takovou míru, která byla prakticky nedosažitelná - zejména bez přítomnosti močoviny či jiných denaturačních činidel, histidinu, lysin hydrochloridu nebo albuminu.

e · «· «· · ···· « « « · · · «··· « W · · · · Φ Γ » · · · • · · » · · · » » · ·

9 9 9· 9 9 9 9 9 · 9 9

- 8 V široké praxi zpracování proteinu C podle vynálezu zahrnuje řadu jednotlivých operací, fyzikálních separací a čistících postupů, včetně chromatografického zpracování a filtrace s příčným tokem, jaká se používá pro čištění směsí proteinů, zahušťování proteinových roztoků nebo pro výměnu rozpouštědla, popřípadě včetně chemických a enzymatických postupů. Zpracování proteinu podle vynálezu popřípadě zahrnuje čištění standardními chromatografickými metodami jako je chromatografie na iontoměničích, hydrofobní chromatografie a podobně a zahušťování ultrafiltrací a podobnými metodami. Zpracování proteinu podle vynálezu popřípadě zahrnuje zadržování roztoku proteinu v zásobních nádržích a podobné přípravné operace pro čistící a zahušťovací stupně. Za účelem snížení nestability se všechny procesy provádějí za podmínek, popsaných zde v popisu vynálezu. Postupně se tyto procesy vedou až k úplné izolaci proteinu, obvykle jako lyofilizovaného prášku, pro přípravu farmaceutických preparátů.

Reakce pH vodného roztoku, který se používá při zpracování je od asi 5,5 přičemž horní hranice je pod 6,3. Výhodně je toto pH 5,7 přičemž horní hranice je menší než 6,3. Výhodnější je pH asi 5,6 až asi 6,2. Ještě výhodnější je pH asi 5,8 až asi 6,2. Dokonce ještě výhodnější je pH asi 5,8 až asi 6,1. Nejvýhodnější pH je asi 6,0. Jako reprezentativní příklady pufrovacích systémů pro udržení lze uvést Tris-acetát, citrát sodný, citrát draselný, citrát glycinu a fosforečnan sodný. Mezi výhodnější pufrovací systémy patří citrát sodný a fosforečnan sodný. Nejvýhodnějším pufrem je citrát sodný. Výhodná molární koncentrace pufrovacího systému je 10 mM až 50 mM. Nejvýhodnější molární koncentrace pufrovacího systému je 20 až 40 mM. Odborník v oboru může rozpoznat, že dostupné jsou

- 9 mnohé další pufry, které se také dají k udržení rozmezí pH, které je definováno patentovými nároky, použít.

Iontová síla zpracovávaného roztoku je druhým podstatným prvkem vynálezu. Iontová síla je obecně ovlivňována přidáváním farmaceuticky přijatelných solí - výhodně chloridu sodného nebo chloridu draselného. Iontová síla je obecně větší nebo rovna 150 mM, což je důsledkem koncentrace solí nad 150 mM v pufrovaném roztoku. Aby byl zajištěn průběh reakce v žádaném směru, je výhodně koncentrace soli nižší než asi 1000 mM. Nejvýhodněji je koncentrace soli od asi 200 mM do 1000 mM. Koncentrace větší než 50 mM a menší než 400 mM byly dosud považovány za nepoužitelné.

Další podmínkou pro zajištění minimální autodegradace je teplota. Výhodně se mohou při způsobu zpracování roztoku použít teploty mezi 0 °C a 10 °C, výhodněji 2 °C až 8 °C. Mimo tyto teploty se projevuje signifikantní autodegradace aktivovaného proteinu C, nicméně překročení 10 °C na krátkou dobu lze tolerovat bez porušení struktury aktivovaného proteinu C.

Koncentrace aktivovaného proteinu C není pro vynález kritická. Průkazné je, že za podmínek podle vynálezu, které jsou zde popsány, se zlepší výsledek zpracování proteinu C i při vysokých koncentracích. Výhodná koncentrace proteinu je od asi 1 mg/ml do asi 50 mg/ml, výhodněji 1 až 30 mg/ml, ještě výhodněji 1 až 20 mg/ml a nejvýhodněji 1 až 10 mg/ml, nicméně je možno pracovat i při nižších nebo vyšších koncentracích.

Aktivovaný protein C, připravený podle zde podaného popisu, je použitelný pro léčení řady chorobných stavů, týkajících w · ΦΦΦΦ • · · « · · · φφφφ • φ « φφφ φ * · · φ φ φφφφ « φ * φ · φ φφφ φ » φ · · · » · φφ φφφ «φ « φ φφ «φ

- 10 se i ntravaskulárn ί koagulace, včetně trombotických záchvatů mrtvice, trombózy hlavních tepen, plicní embolie, trombózy vnějších tepen, akutního infarktu myokardu, roztroušené intravaskulární koagulace a akutních pre- nebo post- kapilárních okluzí, včetně transplantací či trombózy sítnice.

Aktivovaný protein se do prostředku zapracovává nejlépe v lyofilizovaném stavu se sypkou přísadou. Přísada se volí nejlépe podle toho, zda zvyšuje stabilitu molekuly v pevném stavu. Příklady vhodných excipientů k tomuto účelu jsou sacharóza, trehalóza a rafinóza. Odborník v oboru rozpozná, že je k dispozici mnoho dalších sypkých přísad, které se mohou použít v přípravku aktivovaného proteinu C. Koncentrace sypkého prostředku v prostředku je důležitou proměnnou při vymrazovacím sušení. Výhodnou sypkou přísadou je sacharóza přičemž její koncentrace v roztoku, který se podrobuje lyofilizaci, je 15 mg/ml při koncentraci aPC 5,0 mg/ml.

Následující příklady se uvádějí pro ilustraci a vysvětlení vynálezu. Rozsah vynálezu by neměl být chápán jako omezující se na tyto příklady. Pokud není uvedeno jinak, veškeré uváděné díly a veškerá uváděná procenta jsou hmotnostní a veškeré teplotní údaje jsou ve stupních Celsia.

Příprava 1

Příprava lidského proteinu C

Rekombinační lidský protein C (zymogen) byl produkován buňkami lidských ledvin 293, přičemž bylo použito technik, které jsou odborníkům v oboru známé, jako jsou například ty, které jsou popsány v Yan, U.S. Patent No. 4,981,952, jehož celý obsah je sem tímto vložen formou odkazu.

·· 4 ♦···♦· ·· 9 4 • •44 4 4 · 4 · 4 4 • 4 4 44 4 4 4 4 ·

4444 44444 4

9 9444 4994

449 4 4 44 4 9 44

Gen, kódující lidský protein C, je popsán a chráněn v Bang et al., U.S. Patentu 4,775,624, jehož celý obsah je sem tímto vložen formou odkazu. Plasmidem použitým k expresi lidského proteinu C v buňkách 293 byl plasmid pLPC, který je popsán v Bang et al., U.S. Patentu 4,992,373, jehož celý obsah je sem tímto vložen formou odkazu. Konstrukce plasmidu pLPC je také popsána v Evropské patentové publikaci EP 445 939 a v publikaci Grinnell et al., 1987, Bio/Technology 5:1189-1192, jejíž celý obsah je sem tímto vložen formou odkazu. Krátce, plasmid byl transfektován do buněk 293, pak byly identifikovány stabilní transformanty, subkultivovány a množeny v prostředí bez obsahu séra. Po fermentaci byl mikrofiltrací oddělen kultivační roztok od buněk.

Lidský protein C zymogen byl oddělen od kultivační tekutiny modifikovanou technikou Yan, U.S. Patentu 4,981,952, jehož celý obsah je do popisu tímto vložen formou odkazu. Vyčiřený roztok byl upraven na koncentraci 4 mM v EDTA a pak adsorbován na iontoměničovou pryskyřici (Fast-Flow Q, Pharmacia). Po promytí 4 objemy kolony 20 mM Tris, 200 mM NaCl, pH 7,4 a 2 objemy kolony 20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH

7,4, byl navázaný rekombinační lidský protein C zymogen eluován 20 mM pufru Tris, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,4. Eluovaný protein měl čistotu vyšší než 95%, což bylo stanoveno elektroforézou SDS na polyakrylamidovém gelu.

Další čištění proteinu bylo prováděno tak, že byl nejprve připraven roztok proteinu v NaCl o koncentraci 3 M, a následně adsorpcí na hydrofobní interakční pryskyřici (Toyopearl Phenyl 650M, TosoHaas) uvedenou nejprve do rovnováhy s 20 mM roztokem Tris, 3 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,4. Po promytí 2 objemy kolony téhož pufru, jen bez CaCU, byl rekombinační lidský protein C zymogen eluován 20 mM Tris, pH 7,4. Eluovaný • · 4 ·

4 4 4

4 4 4 · «4 protein byl připraven pro aktivaci odstraněním zbytkového vápníku. Zymogen byl ponechán projít přes kolonu s afinitou ke kovu (Chelex-100, Bio-Rad) pro odstraněnní vápníku a opět byl navázán aniontový iontoměnič (Fast Flow Q, Pharmacia). Obě tyto kolony byly uspořádány za sebou a vyrovnány 20 mM pufru Tris, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 7,4. Následovalo nanesení proteinu na Chelex-100 v kolloně, která byla před tím promyta jedním objemem kolony stejného pufru, jaký byl použit před rozpojením kolon ze série. Aniontová iontoměničová kolona byla před eluováním promyta 3 objemy kolony rovnovážného pufru a protein byl pak eluován 0,4 M NaCl, 20 mM Trisacetátem, pH 6,5. Koncentrace proteinu v recombinačním lidském proteinu C bylo měřeno UV extinkcí při 280 nm E =1,81.

Příprava 2

Aktivace rekombinačního lidského proteinu C

Hovězí trombin byl při 4°C a za přítomnosti 50 mM HEPES, pH 7,5 navázán na aktivovanou CHSepharosu 4B (Pharmacia). Tato reakce byla provedena na pryskyřici, která již byla naplněna do kolony, přičemž množství bylo zhruba 5000 jednotek trombinu/ml pryskyřice. Roztok trombinu byl opakovaně proléván kolonou asi 3 hod a pak byl k němu přidán 2-amÍnoethanol (MEA) v množství, které odpovídalo koncentraci 0,6 ml/l cirkulovaného roztoku. Tento roztok s obsahem MEA byl cirkulován dalších 10-12 hodin aby bylo zajištěno úplné blokování nezreagovaných aminů na pryskyřici. Po blokování byla pryskyřice s navázaným trombinem promyta 10 objemy kolony pufru 1 M NaCl, 20 mM Tris, pH 6,5, aby se odstranil všechen nespecificky vázaný protein a po uvedení do rovnováhy s aktivačním pufrem na ní byly provedeny aktivační reakce.

• · «· · · · · · · · • « · · · * · · · · • · · * · · · · · ·· 9 • · · ·«·· · · * ♦ • 9 · · · «· Μ «·

- 13 Vyčištěný rHPC byl upraven na 5 mM v EDTA (aby se veškerý zbývající vápník převedl na chelát) a rozpuštěn na koncentraci 2 mg/ml působením pufru 20 mM Tris, pH 7,4 nebo 20 mM Tris-acetátu, pH 6,5. Tento materiál byl prolit přes trombinovou kolonu uvedenou do rovnováhy 37°C s 50 mM NaCl a buď 20 mM pufru Tris pH 7,4 nebo 20 mM Tris-acetátu pH 6,5. Průtok kolonou byl nastaven tak, aby umožňoval zhruba 20 minut kontaktu mezi rHPC a trombinovou pryskyřicí. Effluent byl spojen a ihned testován na amidolytickou aktivitu. Jestliže tento materiál neměl specifickou aktivitu (amidolytickou) srovnatelnou se stanoveným standardem aPC, byl recyklován přes trombinovou kolonu, aby se dosáhlo úplné aktivace rHPC. Poté následovalo zředění získaného materiálu v poměru 1:1 20 mM pufrem, který je uveden shora.

Antikoagulační atkivita aktivovaného proteinu C se stanovuje měřením prodloužení srážecí doby při testu APTT. Standardní křivka se získá v ředícím pufru (radioimmunologocká zkouška BSA, 1 mg/ml, 20 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,02% NaN₃) při koncentraci proteinu C, pohybující se v rozmezí od 125 do 1000 ng/ml, přičemž vzorky se připravují vždy v několika různých zředěních v rámci tohoto rozmezí. Do každé kyvety pro měření vzorků se přidá 50 studené koňské plasmy a 50 pl rekonstituovaného aktivovaného APTT reagentu (APTT Reagent, Sigma) a pak se obsah inkubuje při 37°C po dobu 5 min. Po inkubaci se přidá do každé kyvety 50 μΙ příslušného měřeného vzorku či standardu. Ředící pufr se také použije samotný jako by to byl vzorek nebo standard aby se stanovila základní srážecí doba. Stopky fibrometru (CoA Screener Hemostasis Analyzer, American Labor) se spustí ihned po přidání 50 μΙ 30 mM roztoku CaCU při 37°C k příslušnému vzorku nebo standardu. Koncentrace aktivovaného proteinu C ve vzorcích se vypočítá

9 9 9 9 9

9999 99 * 9···

999 999 9999

9999 99999 · • 9 9 9999 9999 . . 99 999 9· 99 99 9·

- 1 4 lineární regresí rovnice pro standardní křivku. Každá doba srážení je průměrem minimálně tří opakování, včetně vzorků pro stanovení standardní křivky. Koncentrace proteinu rekombinačního aktivovaného proteinu C byla měřena extinkcí při

UV záření o vlnové délce 280 nm přičemž E °-^1% =1,85.

Příklad 1

Chromatografická separace aPC

Roztok aPC s vodivostí zhruba 14 mMho a pH = 5,7 byl nanesen na kolonu o rozměrech 9,5 cm x 9 cm (hxd) naplněnou kationtovou iontoměničovou pryskyřicí „S-Sepharose Fast Flow“ napojenou v tandemu na kolonu o rozměrech 25cm x 14 cm (hxd) naplněnou aniontovou iontoměničovou pryskyřicí „Q Sepharose Fast Flow“. Obě kolony byly před tím uvedeny do rovnováhy s roztokem citrátu sodného o koncentraci 20 mM, pH 6,0 s přísadou 150 mM NaCl. Zatížení kolony byla 10 gramů aPC na litr aniontové iontoměničové pryskyřice. Kolona byla promyta >2 objemy kolony vyrovnávacího pufru a stupňovitě eluován 20 mM roztokem citronanu sodného o pH 6,0 s přísadou 400 mM NaCl. Všechny operace byly prováděny při 2-8°C a při lineárním průtoku 60 cm/hod.

Přestože aPC měl vysokou aktivitu (539 jednotek/mg podle testu APTT) a při chromatografií byl v dost vysoké koncentraci (>20 g/l v píku) a v hlavní frakci (10 gramů/l), zůstal produkt stabilní.

Tato zjištění byla potvrzena a hmotnostní spektrometrií degradací či nedegradací triády lehkého řetězce, která zjistila, že nejsou přítomny žádné detegovatelné (<2%) isoformy obsahující 308-309 endoproteolytický úsek ani des(1-9)aPC a des(1-10) (<5%).

φφ φφφφ φ · φφ φ φ φ φφφφ • φ φ φφφ φφφφ • · φ φ φ φ φφφφφφ • Φ φ φφφφ φφφφ

Φ· φφφ φφ φφ φφ φφ

- 15 Příklad 2 Filtrace viru

Aktivovaný protein C (4 mg/ml) v 20 mM pufru Tris, 150 mM NaCl a 20 mM EDTA, se podrobí filtraci s tangenciálním tokem (membrána „Millipore Virusolve™ 180“). Průchod aPC tímto filtrem se podpoří použitím d i af i I tračn í ho pufru. Tímto diafiltračním pufrem je 20 mM citrát sodný a 150 mM NaCl. Roztok (10 litrů), 4 mg/ml aPC v 20 mM pufru Tris, 150 mM NaCl a 20 mM EDTA byl zfiltrován. Jako diafiltrační pufr byl použit pufr s obsahem citronanu sodného a chloridu sodného v takovém množství, aby se získal finální objem roztoku aPC 21,5 I.

Příklad 3 Mrazové sušení

Roztok se připravuje v ampulce přidáním požadovaného množství sacharózy, chloridu sodného a citronanu sodného k předem určenému objemu r-aPC, aby koncentrace byly 2,5 mg/ml aPC, 15 mg/ml sacharózy, 325 mM chloridu sodného a 20 mM citronanu sodného při pH 6,0. Tento roztok se lyofilizuje pomocí běžného zařízení typu mrazící sušičky, až se získají ampulky s lyofilizovaným aPC, který lze rekonstituovat a podávat pacientům. Tyto lyofilizované přípravky obsahují méně než 10% des(1-9)aPC a des(1-10)aPC.

• 9 9 99·

9 9

9 9 9

9 9

9 9 • 99 9

9 9 9

9 9

Příklad 4 Mrazové sušení

Roztok se připravuje v ampulce přidáním požadovaného množství sacharózy, chloridu sodného a citronanu sodného k předem určenému objemu r-aPC, aby koncentrace byly 5 mg/ml aPC, 30 mg/ml sacharózy, 650 mM chloridu sodného a 40 mM citronanu sodného při pH 6,0. Tento roztok se lyofilizuje pomocí běžného zařízení typu mrazící sušičky, až se získají ampulky s lyofilizovaným aPC, který lze rekonstituovat a podávat pacientům. Tyto lyofilizované přípravky obsahují méně než 10% des(1-9)aPC a des(1-1 0)aPC.

V předchozím popisu byly popsány principy, výhodná provedení a možnosti konkrétních postupů podle vynálezu. Nicméně tento vynález, který je zde chráněn, nelze omezovat na konkrétní formy, které jsou zde uvedeny, neboť ty mají pouze ilustrativní a nikoliv restriktivní význam. Odborník v oboru může udělat variace a obměny aniž by se odchýlil od myšlenky vynálezu.

Β Β Β ······ ·· · ·

Β Β ΒΒ · Β · Β · Β « ·· · · Β Β ΒΒΒΒ

Β · ΒΒΒ Β ΒΒΒ ΒΒ Β

ΒΒ Β ΒΒΒΒ ΒΒΒΒ

ΒΒ ΒΒΒ ΒΒ ΒΒ ΒΒ ΒΒ

Pl/ S73P

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Zlepšený způsob zpracování vodného roztoku rekombinačního aktivovaného proteinu C, zahrnující provádění tohoto procesu při iontové síle větší než 150 mM a pH asi 5,5 až méně než 6,3, přičemž tento proces je vybrán ze skupiny zahrnující aniontovou chromatografii, mrazové sušení nebo filtraci.
2. Způsob podle nároku 1, ve kterém protein C je lidský aktivovaný protein C.
3. Způsob podle nároku 2, ve kterém pH je od 5,6 do

6,2.
4. Způsob podle nároku 3, ve kterém roztok obsahuje chlorid sodný.
5. Způsob podle nároku 4, ve kterém koncentrace chloridu sodného je 200 mM až 1000 mM.
6. Způsob podle nároku 5, ve kterém je proces zvolený ze skupiny zahrnující mrazové sušení nebo filtraci.
7. Způsob podle nároku 6 ve kterém pH je pufrováno citronanem sodným.
8. Způsob zpracování vodného roztoku rekombinačního aktivovaného proteinu C, zahrnující provádění ve vodném roztoku, který má koncentraci chloridu sodného 150 mM až 1000 »<t 9 99 9
9 9

- 18 mM a pH asi 5,8 až asi 6,2, pufrovaném citronanem sodným a při teplotě asi 0°C až asi 10°C.

9. Vodný roztok rekombinačního aktivovaného proteinu C, obsahující rekombinační aktivovaný protein C, přičemž roztoku, který má iontovou sílu větší než 150 mM a pH asi 5,5 až méně než 6,3, který obsahuje méně než 10% des(1-9)aktivovaného proteinu C a des(1-10)aktivovaného proteinu C hmotnostně.
10. Farmaceutický prostředek obsahující aktivovaný protein C a sypkou přísadu, přičemž uvedený prostředek obsahuje méně než asi 10% des(1-9)aktivovaného proteinu C a des(1-10)aktivovaného proteinu C hmotnostně.
11. Farmaceutický prostředek podle nároku, který obsahuje méně než asi 5% des(1-9)aktivovaného proteinu C a des(1-1 0)aktivovaného proteinu C hmotnostně.