CZ374399A3 - Prostředek obsahující pektin-methylesterasu a dva substráty - Google Patents
Prostředek obsahující pektin-methylesterasu a dva substráty Download PDFInfo
- Publication number
- CZ374399A3 CZ374399A3 CZ19993743A CZ374399A CZ374399A3 CZ 374399 A3 CZ374399 A3 CZ 374399A3 CZ 19993743 A CZ19993743 A CZ 19993743A CZ 374399 A CZ374399 A CZ 374399A CZ 374399 A3 CZ374399 A3 CZ 374399A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- pme
- pectin
- substrate
- plant
- substrates
- Prior art date
Links
- 239000000758 substrate Substances 0.000 title claims abstract description 217
- 108020004410 pectinesterase Proteins 0.000 title claims description 357
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 27
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 claims abstract description 217
- 239000001814 pectin Substances 0.000 claims abstract description 216
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 claims abstract description 216
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 54
- 239000002002 slurry Substances 0.000 claims description 51
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 claims description 45
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 34
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 15
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 13
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 claims description 11
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 claims description 4
- 239000011343 solid material Substances 0.000 claims 1
- 238000000782 polymeric membrane extraction Methods 0.000 abstract description 32
- 235000013305 food Nutrition 0.000 abstract description 23
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 86
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 78
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 56
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 49
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 48
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 31
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 30
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 26
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 25
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 25
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 24
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 24
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 24
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 23
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 21
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 21
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 19
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 19
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 16
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 16
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 16
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 13
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 13
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 13
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 12
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 12
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 12
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 11
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 10
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 9
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 8
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 8
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 8
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 235000021395 porridge Nutrition 0.000 description 7
- AEMOLEFTQBMNLQ-YMDCURPLSA-N D-galactopyranuronic acid Chemical group OC1O[C@H](C(O)=O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-YMDCURPLSA-N 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010059820 Polygalacturonase Proteins 0.000 description 6
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 6
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 6
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 6
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 6
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- KJFMBFZCATUALV-UHFFFAOYSA-N phenolphthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2C(=O)O1 KJFMBFZCATUALV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 5
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 235000012041 food component Nutrition 0.000 description 5
- 239000005417 food ingredient Substances 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 5
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 4
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 4
- 241000167854 Bourreria succulenta Species 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 244000070406 Malus silvestris Species 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 4
- 235000019693 cherries Nutrition 0.000 description 4
- 235000020971 citrus fruits Nutrition 0.000 description 4
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 235000019640 taste Nutrition 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 241000228215 Aspergillus aculeatus Species 0.000 description 3
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 241000207199 Citrus Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 240000009088 Fragaria x ananassa Species 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 3
- 235000016954 Ribes hudsonianum Nutrition 0.000 description 3
- 240000001890 Ribes hudsonianum Species 0.000 description 3
- 235000001466 Ribes nigrum Nutrition 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 235000021016 apples Nutrition 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 3
- 108010093305 exopolygalacturonase Proteins 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 229960004903 invert sugar Drugs 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 235000021012 strawberries Nutrition 0.000 description 3
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N (+)-Galactose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N 0.000 description 2
- BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N (S)-malic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 241000589156 Agrobacterium rhizogenes Species 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 108700005088 Fungal Genes Proteins 0.000 description 2
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 2
- 229920002230 Pectic acid Polymers 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000281247 Ribes rubrum Species 0.000 description 2
- 235000002355 Ribes spicatum Nutrition 0.000 description 2
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 2
- FKNQFGJONOIPTF-UHFFFAOYSA-N Sodium cation Chemical compound [Na+] FKNQFGJONOIPTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 2
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 2
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 2
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric Acid Chemical compound [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- AEMOLEFTQBMNLQ-BKBMJHBISA-N alpha-D-galacturonic acid Chemical compound O[C@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-BKBMJHBISA-N 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-QMKXCQHVSA-N alpha-L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1CO[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-QMKXCQHVSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- FNAQSUUGMSOBHW-UHFFFAOYSA-H calcium citrate Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O.[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O FNAQSUUGMSOBHW-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- -1 citric acid Chemical class 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 2
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 2
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 2
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 2
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 2
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 2
- 235000007983 food acid Nutrition 0.000 description 2
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 2
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 235000015203 fruit juice Nutrition 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 2
- 239000001630 malic acid Substances 0.000 description 2
- 235000011090 malic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 2
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000003375 plant hormone Substances 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 2
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 2
- QRBLKGHRWFGINE-UGWAGOLRSA-N 2-[2-[2-[[2-[[4-[[2-[[6-amino-2-[3-amino-1-[(2,3-diamino-3-oxopropyl)amino]-3-oxopropyl]-5-methylpyrimidine-4-carbonyl]amino]-3-[(2r,3s,4s,5s,6s)-3-[(2s,3r,4r,5s)-4-carbamoyl-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)- Chemical compound N=1C(C=2SC=C(N=2)C(N)=O)CSC=1CCNC(=O)C(C(C)=O)NC(=O)C(C)C(O)C(C)NC(=O)C(C(O[C@H]1[C@@]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)(C)O[C@H]1[C@@H]([C@](O)([C@@H](O)C(CO)O1)C(N)=O)O)C=1NC=NC=1)NC(=O)C1=NC(C(CC(N)=O)NCC(N)C(N)=O)=NC(N)=C1C QRBLKGHRWFGINE-UGWAGOLRSA-N 0.000 description 1
- 108010013043 Acetylesterase Proteins 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000005254 Allium ampeloprasum Nutrition 0.000 description 1
- 240000006108 Allium ampeloprasum Species 0.000 description 1
- 244000291564 Allium cepa Species 0.000 description 1
- 235000002732 Allium cepa var. cepa Nutrition 0.000 description 1
- 244000144730 Amygdalus persica Species 0.000 description 1
- 101710152845 Arabinogalactan endo-beta-1,4-galactanase Proteins 0.000 description 1
- 241001480052 Aspergillus japonicus Species 0.000 description 1
- 241000351920 Aspergillus nidulans Species 0.000 description 1
- 241000228257 Aspergillus sp. Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000016068 Berberis vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 241000335053 Beta vulgaris Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 235000011299 Brassica oleracea var botrytis Nutrition 0.000 description 1
- 240000003259 Brassica oleracea var. botrytis Species 0.000 description 1
- 235000004936 Bromus mango Nutrition 0.000 description 1
- 108010084185 Cellulases Proteins 0.000 description 1
- 102000005575 Cellulases Human genes 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- YASYEJJMZJALEJ-UHFFFAOYSA-N Citric acid monohydrate Chemical compound O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O YASYEJJMZJALEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000008733 Citrus aurantifolia Nutrition 0.000 description 1
- 244000248349 Citrus limon Species 0.000 description 1
- 235000005979 Citrus limon Nutrition 0.000 description 1
- 241000675108 Citrus tangerina Species 0.000 description 1
- 240000000560 Citrus x paradisi Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 240000008067 Cucumis sativus Species 0.000 description 1
- 235000009849 Cucumis sativus Nutrition 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 1
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 1
- 101001096557 Dickeya dadantii (strain 3937) Rhamnogalacturonate lyase Proteins 0.000 description 1
- 101710147028 Endo-beta-1,4-galactanase Proteins 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710089384 Extracellular protease Proteins 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 108010058643 Fungal Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101150094690 GAL1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100028501 Galanin peptides Human genes 0.000 description 1
- 108010073178 Glucan 1,4-alpha-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 102100022624 Glucoamylase Human genes 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 101150069554 HIS4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100295959 Halobacterium salinarum (strain ATCC 700922 / JCM 11081 / NRC-1) arcB gene Proteins 0.000 description 1
- 101100121078 Homo sapiens GAL gene Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N L-rhamnopyranose Chemical group C[C@@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N 0.000 description 1
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 description 1
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 description 1
- 235000011430 Malus pumila Nutrition 0.000 description 1
- 235000015103 Malus silvestris Nutrition 0.000 description 1
- 235000014826 Mangifera indica Nutrition 0.000 description 1
- 240000007228 Mangifera indica Species 0.000 description 1
- 102100036617 Monoacylglycerol lipase ABHD2 Human genes 0.000 description 1
- 240000005561 Musa balbisiana Species 0.000 description 1
- 235000018290 Musa x paradisiaca Nutrition 0.000 description 1
- 244000288157 Passiflora edulis Species 0.000 description 1
- 235000000370 Passiflora edulis Nutrition 0.000 description 1
- 108010029182 Pectin lyase Proteins 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- LTQCLFMNABRKSH-UHFFFAOYSA-N Phleomycin Natural products N=1C(C=2SC=C(N=2)C(N)=O)CSC=1CCNC(=O)C(C(O)C)NC(=O)C(C)C(O)C(C)NC(=O)C(C(OC1C(C(O)C(O)C(CO)O1)OC1C(C(OC(N)=O)C(O)C(CO)O1)O)C=1NC=NC=1)NC(=O)C1=NC(C(CC(N)=O)NCC(N)C(N)=O)=NC(N)=C1C LTQCLFMNABRKSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010035235 Phleomycins Proteins 0.000 description 1
- 108010064851 Plant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000009827 Prunus armeniaca Nutrition 0.000 description 1
- 244000018633 Prunus armeniaca Species 0.000 description 1
- 235000006040 Prunus persica var persica Nutrition 0.000 description 1
- 235000014443 Pyrus communis Nutrition 0.000 description 1
- 240000001987 Pyrus communis Species 0.000 description 1
- 244000088415 Raphanus sativus Species 0.000 description 1
- 235000006140 Raphanus sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- 235000001537 Ribes X gardonianum Nutrition 0.000 description 1
- 235000001535 Ribes X utile Nutrition 0.000 description 1
- 235000016919 Ribes petraeum Nutrition 0.000 description 1
- 235000016911 Ribes sativum Nutrition 0.000 description 1
- 235000016897 Ribes triste Nutrition 0.000 description 1
- 102100030852 Run domain Beclin-1-interacting and cysteine-rich domain-containing protein Human genes 0.000 description 1
- 101150014136 SUC2 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 235000009184 Spondias indica Nutrition 0.000 description 1
- 101100370749 Streptomyces coelicolor (strain ATCC BAA-471 / A3(2) / M145) trpC1 gene Proteins 0.000 description 1
- 235000011941 Tilia x europaea Nutrition 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 1
- CPGKMLVTFNUAHL-UHFFFAOYSA-N [Ca].[Ca] Chemical compound [Ca].[Ca] CPGKMLVTFNUAHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 1
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 1
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 1
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxysuccinic acid Natural products OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 101150069003 amdS gene Proteins 0.000 description 1
- 229940126575 aminoglycoside Drugs 0.000 description 1
- 235000021120 animal protein Nutrition 0.000 description 1
- 101150008194 argB gene Proteins 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- RIOXQFHNBCKOKP-UHFFFAOYSA-N benomyl Chemical compound C1=CC=C2N(C(=O)NCCCC)C(NC(=O)OC)=NC2=C1 RIOXQFHNBCKOKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MITFXPHMIHQXPI-UHFFFAOYSA-N benzoxaprofen Natural products N=1C2=CC(C(C(O)=O)C)=CC=C2OC=1C1=CC=C(Cl)C=C1 MITFXPHMIHQXPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021028 berry Nutrition 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 235000019658 bitter taste Nutrition 0.000 description 1
- 239000001354 calcium citrate Substances 0.000 description 1
- AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L calcium dihydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Ca+2] AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000920 calcium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 229910001861 calcium hydroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 238000012669 compression test Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 235000008504 concentrate Nutrition 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- WQMLFJWIKARBFW-BKKMTDGVSA-N evomonoside Chemical group O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1C[C@@H](CC[C@H]2[C@]3(CC[C@@H]([C@@]3(C)CC[C@H]32)C=2COC(=O)C=2)O)[C@]3(C)CC1 WQMLFJWIKARBFW-BKKMTDGVSA-N 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 235000013332 fish product Nutrition 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 235000013569 fruit product Nutrition 0.000 description 1
- 238000004362 fungal culture Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000003349 gelling agent Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 108010002430 hemicellulase Proteins 0.000 description 1
- 235000019534 high fructose corn syrup Nutrition 0.000 description 1
- BHEPBYXIRTUNPN-UHFFFAOYSA-N hydridophosphorus(.) (triplet) Chemical compound [PH] BHEPBYXIRTUNPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000416 hydrocolloid Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009655 industrial fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 235000015110 jellies Nutrition 0.000 description 1
- 238000004898 kneading Methods 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 239000004571 lime Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 101150039489 lysZ gene Proteins 0.000 description 1
- 238000003760 magnetic stirring Methods 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 235000013622 meat product Nutrition 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004492 methyl ester group Chemical group 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 101150095344 niaD gene Proteins 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 235000015205 orange juice Nutrition 0.000 description 1
- 238000009928 pasteurization Methods 0.000 description 1
- 235000014594 pastries Nutrition 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229920003175 pectinic acid Polymers 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 235000011007 phosphoric acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 235000021118 plant-derived protein Nutrition 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 235000021018 plums Nutrition 0.000 description 1
- 239000010318 polygalacturonic acid Substances 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 235000013613 poultry product Nutrition 0.000 description 1
- 101150054232 pyrG gene Proteins 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000006748 scratching Methods 0.000 description 1
- 230000002393 scratching effect Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000003352 sequestering agent Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 235000021262 sour milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 235000015113 tomato pastes and purées Nutrition 0.000 description 1
- 235000013337 tricalcium citrate Nutrition 0.000 description 1
- 101150016309 trpC gene Proteins 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000021119 whey protein Nutrition 0.000 description 1
- 235000008924 yoghurt drink Nutrition 0.000 description 1
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Prostředek schopný tvořit gel, kterýje vhodný pro použitíjako
potravinanebo vhodný pro zlepšení stabilitypotravin,
obsahuje pektin-methylesterasuPME; prvnísubstrát pro PME;
a druhý substrát pro PME, kde první a druhý substrát pro
PME nejsou odvozeny od sebe navzájem. Výhodněje
substrátempro PME pektin nebojeho derivát.
Description
Prostředek obsahující pektin-methylesterasu a dva substráty
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká prostředku. Přesněji se předkládaný vynález týká prostředku použitelného jako potravina nebo použitelného v přípravě potravin. Přesněji se předkládaný vynález týká prostředku použitelného jako potravina nebo použitelného v přípravě potravin, který obsahuje nebo který je vyroben z pektinu nebo derivátu pektinu.
Dosavadní stav techniky
Pektin je v současnosti významnou průmyslovou komoditou. Například je používán v potravinářském průmyslu jako zahuštovací nebo gelotvorné činidlo, například při přípravě džemů.
Pektin je strukturální polysacharid, který se běžně nalézá ve formě protopektinu ve stěně rostlinných buněk. Skelet pektinu obsahuje a-1-4 vázané zbytky kyseliny galakturonové, které jsou přerušeny malým počtem 1,2-vázaných a-L-rhamnosových jednotek. Kromě toho pektin obsahuje vysoce rozvětvené regiony tvořené téměř alternujícím rhamno-galakturonanovým řetězcem. Tyto vysoce rozvětvené regiony také obsahují jiné cukerné jednotky (jako je D-galaktosa, L-arabinosa a xylosa) navázané glykosidickými vazbami na C3 nebo C4 atomy rhamnosových jednotek, nebo na C2 nebo C3 atomy jednotek kyseliny galakturonové. Dlouhé řetězce a-1-4 vázaných zbytků kyseliny galakturonové se běžně označují jako hladké regiony, zatímco vysoce rozvětvené regiony se běžně označují jako vlasaté regiony.
Některé karboxylové skupiny galakturonových zbytků jsou esterifikované (například jsou karboxylové skupiny methylované).
• ·
Obvykle probíhá esterifikace karboxylových skupin po polymerizaci zbytků kyseliny galakturonové. Nicméně, mimořádně vzácně jsou esterifikovány všechny karboxylové skupiny (například methylované). Obvykle je stupeň esterifikace v rozmezí od 0 do 90%. Pokud je esterifikováno více než 50% karboxylových skupin, pak se výsledný pektin označuje jako vysoce esterifikovaný pektin (HE pektin) nebo vysoce methoxylovaný pektin. Pokud je esterifikováno méně než 50% karboxylových skupin, pak se výsledný pektin označuje jako nízko esterifikovaný pektin (LE pektin) nebo nízko methoxylovaný pektin. Pokud je esterifikováno 50% karboxylových skupin, pak se výsledný pektin označuje jako středně esterifikovaný pektin (ME pektin) nebo středně methoxylovaný pektin. Pokud pektin neobsahuje žádné - nebo obsahuje pouze několik - esterifikovaných skupin, pak se obvykle označuje jako kyselina pektinová.
Struktura pektinu, zejména stupeň esterifikace (například methylace) určuje mnoho výsledných fyzikálních a/nebo chemických vlastností pektinu. Například, gelování pektinu závisí na chemickém charakteru pektinu, zejména na stupni esterifikace. Nicméně, tvorba pektinového gelu závisí také na obsahu pevných -rozpustných látek, na pH a na obsahu vápníkových iontů. Předpokládá se, že vápníkové ionty tvoří komplexy s volnými karboxylovými skupinami, zejména se skupinami na LE pektinu.
Enzymy působící na pektin jsou klasifikovány podle způsobu, kterým působí na galakturonanovou část pektinové molekuly. Přehled některých enzymů štěpících pektin je uveden v Pilník a Voragen (Food Enzymology, Ed., P.F. Fox, Elsevier; (1991), str. 303-337). Konkrétně, pektin-methýlesterasy (EC 3.1.1.11), jinak označované jako PME, deesterifikuji HE pektiny na LE pektiny nebo kyseliny pektinové. Naopák, a například, • · • · · · pektin-depolymerasy štěpí glykosidové vazby mezi galakturonosylmethylesterovými zbytky.
Konkrétně produkuje aktivita PME volné karboxylové skupiny a volný methanol. Zvýšení obsahu volných karboxylových skupin může být snadno monitorováno automatickou titrací. Dřívější studie ukázaly, že některé PME deesterifikují pektin náhodným způsobem v tom smyslu, že deesterifikují jakýkoliv esterifikovaný (například methylovaný) zbytek kyseliny galakturonové na jednom nebo na více než jednom pektinovém řetězci. Příklady PME, které náhodně deesterifikují pektiny, mohou být získány z hub jako je Aspergillus aculeatus (viz WO 94/25575) a Aspergillus japonicus (Ishii et al., 1980, J. Food Sci. 44, str. 611-614). Baron et al., (1980, Lebensm. Wiss. M-Technol. 13, str. 330-333) izoloval PME z Aspergillus niger. Tato mykotická PME má podle popisu molekulovou hmotnost 39000 Da, isoelektrický bod 3,9, optimální pH 4,5 a Km (mg/ml) 3.
Naopak, je známo, že některé PME deesterifikují pektin blokovým způsobem, t.j. působí na pektiny buď na neredukujících koncích, nebo za volnými karboxylovými skupinami, a potom pokračuji podél pektinových molekul podle jednoho řetězce, což vytváří bloky neesterifikovaných jednotek kyseliny galakturonové, které mohou být citlivé na vápník. Příklady takových PME, které blokově deesterifikují pektin, jsou rostlinné PME. Bylo uvedeno, že existuje více než 12 izoforem PME u citrusů (Pilník a Voragen A., G., J., (Food Enzymology,
Ed., P.F. Fox, Elsevier; (1991), str. 303-337). Tyto izoformy mají odlišné vlastnosti.
Náhodná nebo bloková distribuce volných karboxylových skupin může být rozlišena iontoměničovou chromatografií s vysokou rozlišovací schopností (Schols et al., Food Hydrocolloids, 1989, • · · · • φ • · • · ·· · ·· · · * · · 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 · ···· ··«· · · · ·
6, str. 115-121). Tyto testy jsou často používány k testování nežádoucí, zbytkové PME aktivity v citrusových džusech po pasterizaci, protože zbytková PME může způsobit v pomerančovém džusu jev zvaný ztráta zákalu, kromě toho, že může zvyšovat obsah methanolu v džusu.
PME substráty, jako jsou pektiny z přirozených rostlinných zdrojů, jsou obyčejně ve formě vysoce esterifikovaného pektinu majícího DE přibližně 70%. K extraktům obsahujícím tyto vysoce esterifikované PME substráty musí být přidáván cukr, aby se dosáhlo dostatečně vysokého obsahu rozpuštěných pevných látek pro tvorbu gelu. Obvykle je nutno dosáhnout minimálně 55% rozpuštěných pevných látek. Synereze se vyskytuje častěji tehdy, je-li obsah rozpuštěných pevných látek nižší než 55%. Pokud dojde k synereze, tak musí být pro indukci tvorby gelu přidávána nákladná aditiva.
Versteeg et al., (J. Food Sci. 45 (1980) str. 969-971) izoloval PME z pomerančovníku. Tato rostlinná PME má podle popisu izoformy různých vlastností. Izoforma I má molekulovou hmotnost 36000 Da, isoelektrický bod 10,0, optimální pH 7,6 a Km (mg/ml) 0,083. Izoforma II má molekulovou hmotnost 36200 Da, isoelektrický bod 11,0, optimální pH 8,8 a Km (mg/ml) 0,0046. Izoforma III (HMW-PE) má molekulovou hmotnost 54000 Da, isoelektrický bod 10,2, optimální pH 8,0 a Km (mg/ml) 0,041. Nicméně, dosud je dostupno velmi málo dat o sekvenci takových PME.
Podle Pilník a Vooragen (výše) mohou být PME nalezeny v mnoha dalších vyšších rostlinách, jako jsou jabloně, meruňkách, banánech, bobulovinách, citronovníkách, grapefruitech, mandarinkách, třešních, rybízu, vinné révě, mangu, papae, plodech mučenky, broskvích, hrušních, slívách, fazolích, mrkvi,
999 · •9 9999
9 květáku, okurkách, pórku, cibuly, bramborách, ředkvičkách a rajčatech. Nicméně, dosud je dostupno velmi málo dat o sekvenci takových PME.
Rostlinná PME byla popsána ve WO-A-97/03574 (jejíž obsah je zde uveden jako odkaz). Tato PME má následující charakteristiky: molekulovou hmotnost od přibližně 36 kDa do přibližně 64 kDa; optimum pH 7-8 při měření s 0,5% limetovým pektinem v 0,15 M NaCl; teplotní optimum alespoň 50 °C; teplotní stabilitu v rozmezí od 10 °C do alespoň 40 °C; Km 0,07%; maximum aktivity při přibližně 0,25 M NaCl; maximum aktivity při přibližně 0,2 M Na2SO4; a maximum aktivity při přibližně 0,3 M NaNO3.
Jiná PME byla popsána ve WO 97/31102 (jejíž obsah je zde uveden jako odkaz).
PME mají významné použití v průmyslu. Například mohou být použity jako sekvestrační činidla pro vápníkové ionty. Podle Pilník a Voragen (výše) může být krmivo pro dobytek připraveno přidáním kašovitého hydroxidu vápenatého ke slupkám citrusů po extrakci šúávy. Po adici aktivují vysoké pH a vápníkové ionty jakékoliv přirozené PME ve slupkách, což způsobí rychlou deesterifikaci pektinu a proběhne koagulace pektatu vápníku. Navázaná kapalná fáze se uvolní a snadno se vytlačí, takže nákladným tepelným sušením musí být odstraněna pouze frakce původního vodného obsahu. Vytlačená kapalina může být potom použita jako krmivo pro zvířata.
Jak bylo uvedeno výše, PME byla získána z Aspergillus aculeatus (WO 94/25575). Tato PME může být použita pro zlepšení pevnosti materiálů obsahujících pektin, nebo pro demethylaci pektinu, nebo pro zvýšení viskozity materiálů obsahující pektin.
9 9 9 9 9 • ·
9 • 9
Také je běžné použití pektinu pro přípravu potravin připravovaných z ovoce nebo zeleniny obsahujících pektin - jako jsou džemy nebo konzervační činidla. Například, WO-A-94/25575 dále popisuje přípravu pomerančové marmelády a rajčatové pasty za použití PME získané z Aspergillus aculeatus.
JP-A-63/209553 popisuje gely, které jsou získaný působením pektin-methylesterasy, za přítomnosti polyvalentního iontu kovu, na pektinový polysacharid obsahující jako hlavní složku vysoce methoxylovaný poly-a-l,4-D-galakturonidový řetězec a dále popisuje způsob přípravy takových gelů.
Pilník a Voragen (výše) uvádějí seznam použití endogenních PME, který obsahuje jejich přidání k ovocným džusům pro snížení viskozity džusu, pokud obsahuje příliš mnoho ovocného pektinu, přidání ve formě pektinásového roztoku do plynových bublin v albedu citrusových plodů, které byly zahřátý na vnitřní teplotu 20 °C až 40°C pro odstranění slupek a jiných membrán z intaktních segmentů (US-A-4284651) a jejich použití v ochraně a zlepšení struktury a pevnosti zpracované zeleniny a ovoce, jako jsou jablka (Wiley and Lee, 1970, Food Technol. 24: 1168-70), konzervovaná rajčata (Hsu et al., 1965, J. Food Sci. 30, str. 583-588) a brambor (Bartolome and Hoff, 1972, J. Agric. Food Chem. 20, str. 262-266).
Glahn and Rolin (1994, Food Ingredients Europe, Conf. Proceedings str. 252-256) popisují hypotetické použití průmyslového GENU pektinu typu YM-100 pro interakci s nápoji připravenými z kyselého mléka. Nejsou uvedeny žádné podrobnosti týkající se přípravy GENU pektinu typu YM-100.
EP-A-0664300 popisuje chemickou frakcionační metodu pro přípravu pektinu sensitivního na vápník. Je uvedeno, že tento φ
• · · φφ pektin sensitivní na vápník je výhodný pro potravinářský průmysl.
Proto mají pektiny a deesterifikované pektiny, kromě PME, průmyslový význam.
Podstata vynálezu
Nyní jsme zjistili, že výhody spojené s použitím PME v přípravě například potravin závisí v určitém stupni na kvalitě, množství a typu použité PME a na kvalitě, množství a typu použitých PME substrátů - zejména pektinu - který může být přítomen v materiálu použitém pro přípravu potravin. Například, pokud je substrátem ovoce nebo zelenina, tak budou množství a/nebo struktura přirozeného pektinu v tomto substrátu různé pro různé typy ovoce nebo zeleniny. Toto odpovídá datům uvedeným ve WO-A-94/25575, zejména obr. 7, kde je jasně vidět, že PME systém není ideální.
Nyní jsme zjistili, že přidání dalších substrátů pro PME umožňuje získání větších výhod souvisejících s použitím PME při přípravě například potravin.
Přidání dalšího substrátu pro PME umožní překonání jakýchkoliv problémů souvisejících s odlišnými množstvími a kvalitami PME substrátů, které mohou být přítomny v materiálech použitých v přípravě potravin.
V prvním aspektu předkládaný vynález obsahuje prostředek obsahující pektin-methylesterasu (PME); první substrát pro PME; a druhý substrát pro PME; kde první a druhý substrát pro PME nejsou odvozeny od sebe navzájem.
• · •Φ φφφφ φ φ φφφφ φφφφφφ φ φφ φ φ φφ φ · φ · · φφ φφ φφ φφ φφ φφ
V druhém aspektu předkládaný vynález obsahuje způsob přípravy prostředku, který obsahuje výrobu směsi PME; prvního substrátu pro PME; a druhého substrátu pro PME; kde první a druhý substrát pro PME nejsou odvozeny od sebe navzájem.
Ve třetím aspektu předkládaný vynález obsahuje způsob obsahující přidání PME a druhého substrátu pro PME do prvního substrátu pro PME; kde první a druhý substrát pro PME nejsou odvozeny od sebe navzájem.
Ve čtvrtém aspektu předkládaný vynález obsahuje potravinu obsahující prostředek podle předkládaného vynálezu nebo připravenou způsoby podle předkládaného vynálezu.
V pátém aspektu předkládaný vynález také obsahuje prostředek připravený z pektin-methylesterasy (PME); prvního substrátu pro PME; a druhého substrátu pro PME; kde první a druhý substrát pro PME nejsou odvozeny od sebe navzájem.
V šestém aspektu předkládaný vynález obsahuje způsob pro přípravu stabilního reakčního media, které obsahuje první substrát pro PME, kde uvedený způsob obsahuje přidání alespoň PME a druhého substrátu pro PME; kde první a druhý substrát pro PME nejsou odvozeny od sebe navzájem.
Obecněji předkládaný vynález obsahuje prostředek obsahující PME; první substrát pro PME; a druhý substrát pro PME; kde první a druhý substrát pro PME nejsou odvozeny od sebe navzájem.
V předkládaném vynálezu nejsou první a druhý substrát pro PME odvozeny od sebe navzájem. Termín první a druhý substrát pro PME nejsou odvozeny od sebe navzájem znamená, že první substrát pro PME není odvozen od druhého substrátu pro PME a/nebo druhý • · φφφφ
ΦΦ ···· φφ φ φ • · · φ φ φ φφφφ • · · · · · φφφφ • φ φφφφ φ φ φ φ φ φ • φ φ φ φ φ φ φ · φ φ · • · · · φ φ φφ φ φ · · substrát pro PME není odvozen od prvního substrátu pro PME. Proto v předkládaném vynálezu není první substrát pro PME odvozen od druhého substrátu pro PME a naopak. Proto například neobsahuje prostředek podle předkládaného vynálezu množství PME substrátu, kde část tohoto PME substrátu byla částečně modifikována PME enzymem. Naopak, druhý substrát pro PME musí být také přítomen, a tento druhý substrát pro PME není odvozen od prvního substrátu pro PME.
V prostředku podle předkládaného vynálezu mohou být přítomny jiné, odlišné substráty pro PME.
Substráty pro PME v prostředcích podle předkládaného vynálezu nebo pro prostředky podle předkládaného vynálezu mohou býtzískány z různých zdrojů a/nebo mohou mít různé chemické složení.
Podobně mohou být v prostředcích podle předkládaného vynálezu přítomny jiné odlišné PME enzymy.
Pokud je přítomna více než jedna PME, tak mohou být tyto PME enzymy získány z různých zdrojů a/nebo mohou mít různé složení a/nebo mohou mít různý profil reaktivity (například jiné optimální pH a/nebo jiné teplotní optimum).
V předkládaném vynálezu může PME enzym deesterifikovat substráty pro PME náhodně nebo blokově. Pokud je použito více než jedné PME, tak je každá PME nezávisle vybrána z PME, které mohou deesterifikovat substráty pro PME náhodně, nebo z PME, které mohou deesterifikovat substráty pro PME blokově.
V jednom výhodném provedení deesterifikuje (alespoň jeden)
PME enzym substráty pro PME blokově.
«· ·*·· ·· ·»»· 94 94
4 4 4 4 · ···*
4 9 4 4 9 9 4 4 4 • · ···· ·««··· ···· · · · · 4 9 4 9
Pokud je přítomna více než jedna PME, tak mohou být tyto PME vybrány z PME enzymu, který je citlivý na ionty sodíku (Na-sensitivní), nebo z PME enzymu, který je necitlivý na ionty sodíku (Na-insensitivní). Ve výhodném provedení je (alespoň jeden) PME enzym Na-sensitivní.
PME může být získána z přirozených zdrojů nebo může být syntetizována chemicky.
Například může být PME získána z hub, jak je tomu například u PME pocházejících z hub (t.j. PME, jejichž zdrojem jsou houby).
Alternativně může být PME získána z bakterií, jak je tomu například u PME pocházejících z bakterií (t.j. PME, jejichž zdrojem jsou bakterie).
Alternativně může být PME získána z rostlin, jak je tomu například u PME pocházejících z rostlin (t.j. PME, jejichž zdrojem jsou rostliny).
V jednom výhodném provedení je PME! připravena pomocí technik rekombinantní DNA.
Například může být PME rekombinantní PME, jak je popsána v WO-A-97/03574 nebo PME popsaná v WO-A-94/25575 nebo WO-A-97/311102, stejně jako to může být varianta, derivát nebo homolog sekvencí popsaných v těchto patentových přihláškách.
V jednom výhodném provedení je PME rekombinantní PME podle WO-A-97/03574 (jejíž obsah je zde uveden jako odkaz) - jako je PME SEQ ID NO: 1 nebo SEQ ID NO: 2 (které jsou kódované nukleotidovými sekvencemi uvedenými jako SEQ ID NO: 3 nebo SEQ ID NO: 4, v příslušném pořadí, nebo její varianta, derivát nebo ·· ····
9999
99 • · · · 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
99 99 99 99 99 homolog; a/nebo PME pod WO-A-94/25575 (jejíž obsah je zde uveden jako odkaz) nebo její varianta, derivát nebo homolog.
Termín varianta, homolog, nebo fragment v souvislosti s rekombinantním enzymem podle předkládaného vynálezu zahrnuje jakékoliv substituce, změny, modifikace, náhrady, delece nebo adice jedné nebo více aminokyselin sekvence s podmínkou, že vzniklá aminokyselinová sekvence má PME aktivitu, výhodně alespoň stejnou aktivitu jako rekombinantní enzym obsahující jednu nebo více ze sekvencí uvedených jako SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 2. Termín homolog označuje homologii s ohledem na strukturu a/nebo funkci s podmínkou, že výsledný rekombinantní enzym má PME aktivitu. Z hlediska homologie sekvence (t.j. podobností) je výhodná homologie alespoň 75%, lépe alespoň 85% a ještě lépe alespoň 90% se sekvencí uvedenou v připojeném seznamu sekvencí. Výhodnější je homologie alespoň 95%, nejlépe alespoň 98% se sekvencí uvedenou v připojeném seznamu sekvencí.
Termín varianta, homolog, nebo fragment v souvislosti s nukleotidovou sekvencí kódující rekombinantní enzym podle předkládaného vynálezu zahrnuje jakékoliv substituce, změny, modifikace, náhrady, delece nebo adice jedné nebo více nukleové kyseliny ze sekvence s podmínkou, že vzniklá nukleotidová sekvence kóduje rekombinantní enzym mající PME aktivitu, výhodně alespoň stejnou aktivitu jako rekombinantní enzym obsahující jednu nebo více ze sekvencí uvedených jako SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 2. Termín homolog označuje homologii s ohledem na strukturu a/nebo funkci s podmínkou, že výsledná nukleotidová sekvence kóduje rekombinantní enzym mající PME aktivitu.
Z hlediska homologie sekvence (t.j. podobnosti) je výhodná homologie alespoň 75%, lépe alespoň 85% a ještě lépe alespoň 90%. Výhodnější je homologie alespoň 95%, nejlépe alespoň 98%.
·· ιηι ·♦ ···£
* « · • · · • · · • · · * ·* ♦· ·* *· * 9 9 9 • t · ·
Výše uvedené termíny jsou synonyma s termínem alelická variace sekvence.
Ve výhodném provedení je alespoň jeden substrát pro PME pektin nebo substrát získaný nebo získatelný z pektinu (například derivát pektinu).
Termín získaný z pektinu označuje derivátizovaný pektin, degradovaný (například částečně degradovaný) pektin a modifikovaný pektin. Příkladem modifikovaného pektinu je pektin, který byl předem zpracován enzymem jako je PME. Příkladem derivátu pektinu je pektin, který byl zpracován chemicky například amidován.
Výhodně jsou první substrát pro PME a druhý substrát pro PME nezávisle vybrány z pektinu, substrátu, který je možno získat z pektinu nebo substrátu, který je získán z pektinu.
V jednom výhodném provedení je první substrát pro PME a druhý substrát pro PME pektin.
V jiném výhodném provedení je první substrát pro PME nebo druhý substrát pro PME modifikovaný pektin - konkrétně enzymaticky modifikovaný pektin, výhodně pektin zpracovaný PME.
Ve výhodném provedení je druhý substrát pro PME takový modifikovaný pektin.
Ve jiném výhodném provedení je prvním substrátem pro PME a druhým substrátem pro PME takový modifikovaný pektin.
Výhodně je první substrát pro PME přítomen v (t.j. in šitu) rostlině nebo rostlinném materiálu. Rostlinou může být • · • · · · transgenní rostlina, například, rostlina, která byla geneticky modifikována tak, aby produkovala různá množství a/nebo typy pektinu. Podobně může být rostlinný materiál získán z transgenní rostliny, například rostliny, která byla geneticky modifikována tak, aby produkovala různá množství a/nebo typy pektinu.
Rostlina nebo rostlinný materiál mohou být získány ze zeleniny, ovoce nebo jiného typu rostliny obsahující nebo produkující pektin.
Výhodně je rostlinným materiálem materiál získaný ze zeleniny a/nebo ovoce.
Výhodně je materiálem získaným ze zeleniny a/nebo ovoce kaše.
První substrát pro PME a/nebo druhý substrát pro PME mohou být vybrány z nízko esterifikovaného pektinu, středně esterifikovaného pektinu nebo vysoce esterifikovaného pektinu.
Výhodně je druhý substrát pro PME nízko esterifikovaný pektin, středně esterifikovaný pektin nebo vysoce esterifikovaný pektin. Protokol pro stanovení stupně esterifikace substrátu pro PME je uveden na straně 58 WO-A-97/03574 (jejíž obsah je zde uveden jako odkaz). Tento protokol je uveden v příkladech provedení vynálezu (dále).
V jednom výhodném provedení je druhým substrátem pro PME vysoce esterifikovaný pektin.
Pro předkládaný vynález jsou první substrát pro PME a druhý substrát pro PME vybrány ze substrátu pro PME, který je citlivý na ionty vápníku (Ca-sensitivní) nebo který není citlivý na ionty vápníku (Ca-nesensitivní). Protokol pro stanovení
4 4·« 4
Λ Λ Λ Λ sensitivity na vápník je uveden na straně 57 WO-A-97/03574 (jejíž obsah je zde uveden jako odkaz). Tento protokol je také uveden v příkladech provedení vynálezu.
V jednom výhodném provedení je druhý substrát pro PME Ca-sensitivní.
• ·
Výhodně je druhý substrát pro PME přidán k prvnímu substrátu pro PME. Termín přidán označuje fyzikální přidání druhého substrátu pro PME k prvnímu substrátu pro PME a naopak.
PME může být přidána ve stejné době jako druhý substrát pro PME, nebo před přidáním druhého substrátu pro PME nebo po přidání druhého substrátu pro PME.
Proto předkládaný vynález zahrnuje alespoň následující možnosti: přidání PME k prvnímu substrátu pro PME ve stejnou dobu jako je přidán druhý substrát pro PME; přidání PME k druhému substrátu pro PME ve stejnou dobu jako je přidán první substrát pro PME; přidání druhého substrátu pro PME k PME a ve stejnou dobu přidání prvního substrátu pro PME; přidání PME a prvního substrátu pro PME a druhé substrátu pro PME do reakční nádoby ve stejnou dobu; inkubaci prvního substrátu pro PME s PME před přidáním druhého substrátu pro PME; inkubaci druhého substrátu pro PME s PME před přidáním prvního substrátu pro PME; inkubaci prvního substrátu pro PME s PME před přidáním druhého substrátu pro PME a potom přidání další PME (která může být stejná nebo jiná než první PME); inkubaci druhého substrátu pro PME s PME před přidáním prvního substrátu pro PME a potom přidání další PME (která může být stejná nebo jiná než první PME); inkubaci prvního substrátu pro PME s PME před přidáním druhého substrátu pro PME a potom přidání dalších substrátů pro PME (které mohou být stejné nebo jiné než další substráty pro • · · · • · · ·
PME); inkubaci druhého substrátu pro PME s PME před přidáním prvního substrátu pro PME a potom přidání dalších substrátů pro PME (které mohou být stejné nebo jiné než další substráty pro PME); přidání prvního substrátu pro PME při inkubaci PME do druhého substrátu pro PME inkubovaného s PME (která může být stejná nebo jiná než první PME); přidání prvního substrátu pro PME po jeho inkubaci s PME (volitelně může být reakce ukončena - například pomocí působení tepla) do druhého substrátu pro PME, který byl inkubován s PME, která může být stejná nebo jiná než první PME) (volitelně může být reakce ukončena - například pomocí působení tepla); stejně jako ostatní kombinace.
Výhodně vynález obsahuje jakékoliv z následujících provedení: přidání PME k prvnímu substrátu pro PME a ve stejnou dobu přidání druhého substrátu pro PME; přidání PME k druhému substrátu pro PME a ve stejnou dobu přidání prvního substrátu pro PME; přidání druhého substrátu pro PME k PME a ve stejnou dobu přidání prvního substrátu pro PME; přidání PME, prvního substrátu pro PME a druhého substrátu pro PME do reakční nádoby ve stejnou dobu; inkubaci prvního substrátu pro PME s PME před přidáním druhého substrátu pro PME; inkubaci druhého substrátu pro PME s PME před přidáním prvního substrátu pro PME; inkubaci prvního substrátu pro PME s PME před přidáním druhého substrátu pro PME a potom přidání další PME (která může být stejná nebo odlišná od první PME); inkubaci druhého substrátu pro PME s PME před přidáním prvního substrátu pro PME a potom přidání další PME (která může být stejná nebo odlišná od první PME); inkubaci prvního substrátu pro PME s PME před přidáním do druhého substrátu pro PME a potom přidání dalšího substrátu pro PME (který může být stejný nebo jiný než ostatní substráty pro PME); inkubaci druhého substrátu pro PME s PME před přidáním do prvního substrátu pro PME a potom přidání dalšího substrátu pro PME (který může být stejný nebo jiný než ostatní substráty pro • * · « • · · ·
PME); přidání prvního substrátu pro PME po jeho inkubaci s PME do druhého substrátu pro PME (která může být stejná nebo jiná než první PME).
Tak může být v jednom provedení připraven vysoce esterifikovaný druhý substrát pro PME zpracovaný PME, který může být potom přidán do prvního substrátu pro PME. V tomto postupu je možno použít různé PME (jako jsou například rekombinantní rostlinné, mykotické a bakteriální PME) pro modifikaci druhého substrátu pro PME, pokud je to vhodné z hlediska použití PME substrátů s různou funkcí v kombinovaném systému.
To znamená, že toto provedení předkládaného vynálezu obsahuje prostředek obsahující PME; první substrát pro PME; a druhý substrát pro PME; kde první a druhý substrát pro PME nejsou odvozeny od sebe navzájem; a kde byl alespoň druhý substrát pro PME zpracován PME.
V jiném provedení je možné přidat substrát pro PME k vysoce esterifikovanému prvnímu substrátu pro PME zpracovanému PME.
V tomto postupu je možno použít různé PME (jako jsou například rekombinantní rostlinné, mykotické a bakteriální PME) pro modifikaci druhého substrátu pro PME, pokud je to vhodné z hlediska použití PME substrátů s různou funkcí v kombinovaném systému.
V jiném provedení je možné připravit vysoce esterifikovaný druhý substrát pro PME zpracovaný PME, který může být potom přidán k vysoce esterifikovanému prvnímu substrátu pro PME zpracovanému PME. V tomto postupu je možno použít různé PME (jako jsou například rekombinantní rostlinné, mykotické a bakteriální PME) pro modifikaci druhého substrátu pro PME, pokud je to vhodné z hlediska použití PME substrátů s různou • · · · • · · ·
funkcí v kombinovaném systému.
Prostředek může obsahovat jiné složky, jako jsou potravinové přísady. Mezi obvyklé potravinové přísady patří kyseliny, jako je například kyselina citrónová, nebo cukry, jako je například sacharosa, glukosa nebo invertní cukr, nebo ovoce, nebo jiné enzymy, konzervační činidla, barviva a jiné vhodné přísady.
Prostředek podle předkládaného vynálezu může být použit při přípravě potravin. Například může být výchozím činidlem nebo meziproduktem při přípravě potravin.
Alternativně může být prostředek podle předkládaného vynálezu sám o sobě potravinou.
Termín potravina označuje jídlo pro člověka a/nebo zvíře. Mezi obvyklé potraviny patří džemy, marmelády, želé, mléčné výrobky (jako je mléko nebo sýry), masové výrobky, drůbeží výrobky, rybí výrobky a pečivo. Potravinou může být také nápoj. Nápojem může být jogurt určený k pití, ovocný džus nebo nápoj obsahující syrovátkový protein.
Jakákoliv PME může být použita s jinými typy enzymů.
Příklady jiných typů enzymů jsou pektinasy, pektin-depolymerasy, poly-galakturonasy, pektat-lyasy, pektin-lyasy, rhamno-galakturonasy, galaktanasy, celulasy, hemicelulasy, endo-E-glukanasy, arabinasy, acetylesterasy nebo enzymy uvolňující pektin nebo jejich kombinace.
Tyto jiné typy enzymů mohou být přidány ve stejnou dobu jako PME, nebo mohou být přidány před nebo po přidání PME.
• · • · 9 · • · 9 9 9 9
9
V jednom výhodném provedení je PME použita společně s jednou nebo více poly-galakturonasamy, jako jsou endo-poly-galakturonasy (například podle WO-A-89/12648, jejíž obsah je zde uveden jako odkaz) a/nebo exo-poly-galakturonasy (například podle WO-A-94/14966, jejíž obsah je zde uveden jako odkaz). Toto provedení je výhodné pro výrobu džemů a marmelád, protože substráty zpracované PME mají lépe kontrolovatelnou citlivost na vápník. Jak bylo uvedeno výše, WO-A-97/03574 obsahuje některé užitečné znalosti pro přípravu vhodných PME pro použití v předkládaném vynálezu týkající se použití technik rekombinantní DNA. Některé z těchto popisů jsou uvedeny dále.
Rekombinantní organismus pro expresi PME může být prokaryotický nebo eukaryotický organismus. Mezi vhodné prokaryotické organismy patří E. coli a Bacillus subtilis. Transformace prokaryotických hostitelů je v oboru dobře známá, viz například Sambrook et al., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydání, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Při použití prokaryotického organismu musí být gen před transformací vhodně modifikován - například musí být odstraněny introny.
V jednom provedení může být organismem organismus rodu Aspergillus, například Aspergillus niger. Transgenní Aspergillus může být připraven technikou, kterou popisují Rambosek, J., a Leach, J., 1987, (Recombinantn DNA in filamentous fungi:
Progress and Prospects. CRC Crit. Rev. Biotechnol. 6: 357-393), Davis R.W., 1994 (Heterologous gene expresion and protein secretion in Aspergillus, v Martinelli, S.D., Kinghorn, J.R. (vydavatelé) Aspergillus: 50 years on. Progress in industrial microbiology, svazek 29. Elsevier Amsterdam 1994, str. 525-560), Ballance, D.J., 1991 (Transformation systems for Filamentous Fungi and an OverView of Fungal Gene structure. v Leong, S.A., • * *· ·· ·· 99 99
Berka, R.M., (vyd.), Molecular Industrial Mycology. Systems and
Applications for Filamentous fungi, Marcel Dekker lne., New York 1991, str. 1-29) a Turner G., 1994 (Vectors for genetic manipulation, v Martinelli, S.D., Kinghorn, J.R. (vydavatelé) Aspergillus: 50 years on. Progress in industrial microbiology, svazek 29. Elsevier Amsterdam 1994, str. 641-666). Nicméně, následující popis uvádí souhrn znalostí nutných pro přípravu transgenních Aspergillus.
Po dobu téměř sta let jsou filamentosní houby používány v mnoha typech průmyslové výroby pro produkci různých organických sloučenin a enzymů. Například, tradiční japonské fermentace kojí a sóji využívaly Aspergillus sp. V tomto století byl také Aspergillus niger používán pro výrobu organických kyselin, zejména kyseliny citrónové, a pro výrobu různých enzymů pro průmyslové použití.
Pro použití filamentosních hub v průmyslové výrobě existují dva hlavní důvody. Prvním je ten, že filamentosní houby mohou produkovat značná množství extracelulární produktů, například enzymů a organických sloučenin jako jsou antibiotika a organické kyseliny. Druhým je ten, že filamentosní houby mohou růst na levných substrátech, jako je mláto, otruby, řepná dřeň atd. Stejné důvody činí filamentosní houby atraktivními organismy pro použití v heterologní expresi rekombinantní PME.
Pro přípravu transgenních organismů rodu Aspergillus jsou připraveny expresní konstrukty, pomocí inserce požadovaných nukleotidových sekvencí do konstruktu určeného pro expresi ve filamentosní houbě.
Bylo vyvinuto několik konstruktů pro heterologní expresi. Tyto konstrukty mohou obsahovat promotor, který je aktivní v • φ φφφφ
ΦΦΦ φφφ · · φ · • · φφφ · φ · φ φ φ φ • φφ · φ φφ φ φ φφ φ • Φ φφ φφ φφ φφ φφ houbě. Příklady promotorů jsou mykotické promotory pro intenzivní expresi extracelulárních enzymů, jako je například glukoamylasový promotor nebo a-amylasový promotor. Nukleotídová sekvence může být fúsována na signální sekvenci, která způsobí sekreci proteinu kódovaného nukleotidovou sekvencí. Obvykle je použita mykotická signální sekvence. Terminátor aktivní v houbách je umístěn na konci expresního systému.
Jiným typem expresního systému pro expresi v houbách je systém, ve kterém může být nukleotídová sekvence fúsována na menší nebo větší část genu houby, který kóduje stabilní protein. Tento protein může stabilizovat protein kódovaný nukleotidovou sekvencí. V takovém systému může být mezi vlastní protein houby a protein kódovaný nukleotidovou sekvencí vloženo štěpící místo rozpoznávané specifickou proteasou, takže produkovaný fúsní protein může být štěpen v této pozici specifickou proteasou, což uvolní protein kódovaný nukleotidovou sekvencí. Například je možno vložit místo rozpoznávané KEX-2 podobnou peptidasou, která je nacházena alespoň v některých organismech rodu Aspergillus. Taková fúze vede ke štěpení in vivo, které vede k ochraně exprimovaného produktu a k tomu, že nevzniká větší fúsní protein.
Heterologní exprese v organismech rodu Aspergillus byla popsána pro několik genů kódujících bakteriální, mykotické, živočišné a rostlinné proteiny. Proteiny mohou být deponovány intracelulárně, pokud není kódující sekvence fúsovaná na signální sekvenci. Takové proteiny se akumulují v cytoplasmě a obvykle nejsou glykosylovány, což může být výhodné pro některé bakteriální proteiny. Pokud je nukleotídová sekvence fúsována na signální sekvenci, tak se protein akumuluje extracelulárně.
Z hlediska stability produktu a modifikací hostitelem nejsou • 4 · · ··* ·
některé heterologní proteiny příliš stabilní při sekreci do kultivačního media pro houby. Většina hub produkuje několik extracelulárních proteas, které degradují heterologní proteiny. Pro překonání tohoto problému byly pro produkci heterologních proteinů použity speciální kmeny hub s redukovanou produkcí proteas.
Pro transformaci vláknitých hub bylo vyvinuto několik transformačních protokolů (Ballance, 1991, výše). Mnoho z těchto protokolů je založeno na přípravě protoplastů a na vložení DNA do protoplastů pomocí PEG a iontů Ca2*. Transformované protoplasty potom regenerují a transformované houby jsou selektovány pomocí různých selektivních markérů. Mezi markéry používané pro transformaci patří auxotrofní markéry jako je argB, trpC, niaD a pyrG, markéry resistence na antibiotika jako je resistence na benomyl, resistence na hygromycin a resistence na phleomycin. Běžně používaným transformačním markérem je amdS gen A. nidulans , který - je-li přítomen v mnoha kopiích umožňuje růst houby na akrylamidu jako jediném zdroji dusíku.
V jiném provedení může být transgenním organismem kvasinka. Kvasinky jsou také používány jako organismy pro expresi heterologních genů. Kmen Saccharomyces cerevisiae má dlouhou historii průmyslového použití, včetně použití pro expresi heterologních genů. Exprese heterologních genů v Saccharomyces cerevisiae je uvedena v Goodey et al. (1987, Biotechnology, D.R. Berry et al., vyd., str. 401-429, Allen and Unwin, London), a v King et al. (1989, Molecular and Cell Biology of Yeast, E.F. Walton and G.T. Yarronton, vyd., str. 107-133, Blackie,
Glasgow).
Saccharomyces cerevisiae se hodí pro expresi heterologních genů z několika důvodů. Prvním je ten, že je nepatogenní pro • · · ♦ • · · • « • · • · • to člověka a není schopna produkce některých endotoxinů. Druhým je ten, že má dlouhou historii bezpečného průmyslového využití pro různé účely. Toto vede k tomu, že je široce přijímána. Třetím je ten, že rozsáhlé komerční využití a výzkum organismu vedl k dobrým znalostem genetiky a fyziologie, stejně jako ke stanovení charakteristik průmyslové fermentace Saccharomyces cerevisiae.
Přehled principů exprese heterologních genů v Saccharomyces cerevisiae a sekrece genových produktů je uveden v E. Hinchcliffe, E. Kenny (1993, Yeast as a vehicle for the expresion of heterologous genes, Yeasts, svazek 5, Anthony H. Rose and J. Stuart Harrison, 2. vydání, Academie Press, Ltd.).
Existuje několik typů kvasinkových vektorů, včetně integračních vektorů, které vyžadují rekombinaci s genomem hostitele pro udržení, a automně se replikujících plasmidových vektorů.
Pro přípravu transgenních organismů rodu Saccharomyces jsou připraveny expresní konstrukty pomocí inserce nukleotidové sekvence do konstruktu určeného pro expresi ve kvasinkách. Bylo vyvinuto několik typů konstruktů pro heterologní expresi. Konstrukty obsahují promotor aktivní ve kvasinkách fúsovaný na nukleotidovou sekvenci, obvykle je použit kvasinkový promotor, například GAL1 promotor. Obvykle je použita kvasinková signální sekvence, jako je například sekvence kódující SUC2 signální peptid. Terminátor aktivní ve kvasinkách je umístěn na konci expresního systému.
Pro transformaci kvasinek bylo vyvinuto několik transformačních protokolů. Například, transgenní organismy rodu Saccharomyces mohou být připraveny podle Hinnen et al. (1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 75:
• · · · · ·
1929); Beggs, J.D. (1978, Nátuře, London, 275: 104); a Ito, H. et al., (1983, J. Bacteriology 153: 163-168).
Transformované kvasinky jsou selektovány za použití různých selektivních markérů. Mezi markéry používané při transformaci patři auxotrofní markéry jako je LEU2, HIS4 a TRPÍ, dominantní markéry resistence na antibiotika jako jsou markéry resistence na aminoglykosidy, například G418.
Jiným hostitelským organismem jsou rostliny. V oboru neexistuje mnoho odkazů týkajících se přípravy transgenních rostlin. Existují dva dokumenty uvádějící techniky, které mohou být použity pro přípravu transgenních rostlin, EP-B-0470145 a CA-A-2006454 - některé z těchto technik jsou uvedeny dále.
Základním principem konstrukce geneticky modifikovaných rostlin je inserce genetické informace do genomu rostliny tak, že dojde ke stabilnímu udržení insertovaného genetického materiálu.
Pro inserci genetického materiálu existuje několik technik, kde hlavním principem je buď přímé zavedení genetické informace, nebo nepřímé zavedení genetické informace pomocí vektorového systému. Přehled technik je uveden v Potrykus (Annu. Rev. Pian. Physiol. Plant Mol. Biol. (1991), 42: 205-225) a Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech (March/April 1994, 17-27).
Vhodný rostlinný transformační systém může obsahovat jeden vektor, ale může také obsahovat dva vektory. V případě dvou vektorů je vektorový systém obyčejně označován jako binární vektorový systém. Binární vektorové systémy jsou podrobněji popsány v Gynheung An. et al., (1980), Binary Vectors, Plant Molecular Biology Manual A3, 1-19.
• * φφφφ ·· Φφφφ φφ φ φ φ * · • φ φφ φ · φ φ φ φ • · φ φ • φ φ
Jedním používaným systémem pro transformaci rostlinných buněk s uvedeným promotorem nebo nukleotidovou sekvenci je konstrukt založený na použití Ti plasmidu z Agrobacterium tumefaciens nebo Ri plasmidu z Agrobacterium rhizogenes, jak jsou popsány v An et al., (1986), Plant Physiol. 81: 301-305 a Butcher, D.N. et al. (1980) Tissue Culture Methods for Plant Pathologist, vyd.: D.S. Ingrams and J.P. Helgeson, 203-208.
Bylo konstruováno několik různých Ti a Ri plasmidů, které jsou vhodné pro konstrukci rostlin nebo rostlinných buněčných konstruktů popsaných výše. Příkladem takového plasmidu je Ti plasmid pGV3850.
Nukleotidová sekvence nebo konstrukt by měly být insertovány do Ti-plasmidu mezi terminálními sekvencemi T-DNA nebo sousedními T-DNA sekvencemi tak, aby nedošlo k narušení sekvencí bezprostředně sousedících s T-DNA, alespoň těch sekvencí, které jsou patrně zásadní pro inserci modifikované T-DNA do rostlinného genomu.
Z výše uvedeného popisu je jasné, že pokud je organismem rostlina, tak je vektorovým systémem výhodně takový systém, který obsahuje sekvence nezbytné pro infekci rostliny (například vir region) a alespoň jednu koncovou část T-DNA sekvence, která je umístěna na stejném vektoru, jako genetický konstrukt.
Výhodně je vektorovým systémem Ti-plasmid Agrobacterium tumefaciens nebo Ri-plasmid Agrobacterium rhizogenes nebo jejich derivát, protože tyto plasmidy jsou dobře známé a jsou značně používány při konstrukci transgenních rostlin a existuje mnoho vektorových systémů, které jsou založeny na těchto plasmidech nebo jejich derivátech.
Při konstrukci transgenní rostliny může být nukleotidová
4444
4 4 4 4·
sekvence nejprve konstruována v mikroorganismu, ve kterém se může vektor replikovat a kde je možno snadno provádět úpravy vektoru před insercí do rostliny. Příkladem takového organismu je E. coli, ale mohou být použity i jiné mikroorganismy mající vhodné vlastnosti. Pokud byl vektor vektorového systému, jak je definovaný výše, připraven v E. coli, tak je přenesen, pokud je to nutné, do vhodného organismu kmene Agrobacteríum, například Agrobacteríum tumefaciens. Ti-plamsid nesoucí nukleotidovou sekvenci nebo konstrukt je tak přenesen do vhodného organismu kmene Agrobacteríum, například Agrobacteríum tumefaciens, takže je získána buňka organismu kmene Agrobacteríum nesoucí nukleotidovou sekvenci, která je potom přenesena do rostlinné buňky, která má být modifikována.
Jak je uvedeno v CA-A-2006454, existuje velké množství klonovacích vektorů, které obsahují replikační systém pro E. coli a markér, který umožňuje selekci transformovaných buněk. Vektory obsahují například pBR322, pUC sérii, M13 mp sérii, PACYC184 atd.
V tomto postupu může být nukleotidová sekvence vložena do vhodného restrikčního místa ve vektoru. Plasmid je potom použit pro transformaci E. coli. Buňky E. coli se kultivují ve vhodném živném mediu a potom se provede sklízení buněk a lýza buněk. Takto se získá plasmid. Jako analýza je obvykle použita analýza sekvence, restrikční analýza, elektroforesa a další biochemické - molekulárně biologické techniky. Po každé manipulaci může být DNA sekvence štěpena a navázána na jinou DNA sekvenci. Každá sekvence může být klonována ve stejném nebo v jiném plasmidu.
V každém způsobu pro vložení požadovaného promotoru nebo konstruktu nebo nukleotidové sekvence do rostliny může být nutná přítomnost a/nebo inserce dalších DNA sekvencí. Pokud je pro ·· ···· • φ ·»·· ·· « 4 4 • 4 4 • ♦ · < • · ♦·
4 4 4 ·· 44 transformaci použit například Ti- nebo Ri-plasmid, tak mohou být navázány alespoň pravá hranice a často pravá a levá hranice Tia Ri-plasmidové DNA, jako oblasti obklopující vložené geny. Použití T-DNA pro transformaci rostlinných buněk bylo intenzivně studováno a je popsáno například v EP-A-120516; Hoekema, v: The Binary Plant Vector System Offset-drukkerij, Kanters, B.B., Alblasserdam, 1985,. kapitola V; Fraley et al., Crit. Rev.
Plant. Sci., 4: 1-46; a An et al., EMBO J. (1985), 4: 277-284.
Přímá infekce rostlinné tkáně Agrobacterii je jednoduchá technika, která je běžně používána a která je popsána v Butcher D.N. et al., (1980) Tissue Culture Methods for Plant
Pathologist, vyd.: D.S. Ingrams and J.P. Helgeson, 203-208. Pro další popis těchto technik viz Potrykus (Annu. Rev. Pian. Physiol. Plant Mol. Biol. (1991), 42: 205-225) a Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech (March/Apríl 1994, 17-27) . Při použití této techniky může být infekce rostliny provedena na některých částech nebo tkáních rostliny, t.j. na části listu, kořenu, kmenu nebo na jiné části rostliny.
Obvykle je při přímé infekci rostlinných tkání Agrobacterii nesoucími promotor a/nebo GOI infikovaná rostlina poraněna, například naříznutím nožem nebo napíchnutím jehlou nebo oškrábáním. Rána je potom inokulována Agrobacterii. Naočkovaná rostlina nebo část rostliny je potom kultivována na vhodném kultivačním mediu a vyvíjí se do zralé rostliny.
Při konstrukci rostlinných buněk mohou být tyto buňky kultivovány a udržovány pomocí běžných kultivačních metod, jako jsou metody kultivace buněk ve vhodném kultivačním mediu doplněném nezbytnými růstovými faktory, jako jsou aminokyseliny, rostlinné hormony, vitaminy atd. Regenerace transformovaných buněk na geneticky modifikované rostliny může být provedena za ·· *·«· • ··· »· ·· > ♦ · · • · · použití známých technik pro regeneraci rostlin z buněk nebo tkáňových kultur, například pomocí selekce transformovaných výhonků za použití antibiotik nebo pomocí subkultivace výhonků na mediu obsahujícím vhodné živiny, rostlinné hormony atd.
Další podrobnosti týkající se transformace rostlin mohou být nalezeny v EP-A-0449375.
Závěrem, je popsán prostředek vhodný pro použití jako potravina nebo vhodný pro použití v přípravě potravin. Prostředek obsahuje PME; první substrát pro PME; a druhý substrát pro PME; kde první a druhý substrát pro PME nejsou odvozeny od sebe navzájem.
Jak bylo uvedeno výše, substráty pro PME, jako jsou pektiny získané z rostlinných zdrojů, jsou obyčejně ve formě vysoce esterifikovaného pektinu s DE vyšším než 70%. K extraktům obsahujícím tyto vysoce esterifikované PME substráty musí být přidán cukr, aby se dosáhlo takového obsahu rozpuštěných pevných látek, který indukuje tvorbu gelu. Obvykle je nutný obsah 55% rozpuštěných pevných látek. Synereze se vyskytuje častěji tehdy, je-li obsah rozpuštěných pevných látek nižší než 55%. Pokud dojde k synereze, tak musí být pro indukci tvorby gelu přidávána nákladná aditiva.
V předkládaném vynálezu jsme překvapivě zjistili, že je možné indukovat tvorbu gelu v extraktu obsahujícím vysoce esterifikovaný PME substrát přidáním druhého vysoce esterifikovaného substrátu pro PME. Vyšší schopnost tvorby gelu těchto kombinovaných vysoce esterifikovaných PME substrátů při obsahu rozpuštěných pevných látek nižším než 55% je zcela neočekávaná. Dříve se v oboru vždy uvádělo, že vysoce esterifikované pektiny obvykle vyžadují minimálně 55% obsah • φ φφφφ φφ φφφφ • Φ · · φ φ φ φ φ φ φ · φ φ φφφφ φ φφφφ φ φ φ · • Φ φφ * φ φ ♦ φ φ φ φ φ φ φ φ φ ♦ φ φ rozpuštěných pevných látek, aby mohlo dojít ke tvorbě gelu.
Proto v je obecnějším aspektu předkládaný vynález obsahuje vodný systém ve stavu solidifikovaného gelu, který má obsah solubilních pevných látek nižší než 50% hmot./hmot.; kde tvorba gelu je vyvolána použitím vysoce esterifikovaného substrátu pro PME. V tomto aspektu může být stav solidif ikovaného gelu určen postupem uvedeným v příkladech provedení vynálezu (dále).
Předkládaný vynález se liší od WO-A-94/25575, protože tato patentová přihláška nepopisuje ani nenaznačuje prostředek obsahující PME; první substrát pro PME a druhý substrát pro PME; kde první a druhý substrát pro PME nejsou odvozeny od sebe navzájem. Toto platí i pro JP-A-63/209533.
Mělo by být také uvedeno, že popis uvedený na str. 12 (řádky 6-14) WO-A-94/25575 se liší od předkládaného vynálezu. Termín rostlinné nebo ovocné výrobky, jak je použit na řádcích 7 a 8 WO-A-94/25575 nepopisuje explicitně substrát pro PME. Kromě toho, následující věta Alternativně (podle našeho přesvědčení), může být přirozený pektin demethylován pomocí enzymu... na řádcích 12 až 14 WO-A-94/25575 jasně ukazuje, že reakční medium navrhované WO-A-94/25575 obsahuje pouze jeden substrát pro PME, nikoliv dva substráty pro PME, jak je tomu v předkládaném vynálezu.
Popis obrázků na připojených výkresech
Obr. 1 je sloupcový graf ukazující efekt PPME modifikace, přidání pektinu a +/- vápníku.
Obr. 2 je sloupcový graf ukazující efekt zpracování ovoce a pektinu (P66) PPME.
·* ···« • · ♦ · • · • · · * · · · • · · • » · · · • · · · · ·· »« •
9
Příklady provedení vynálezu
Protokol 1: Index sensitivity na vápník (CF)
Sensitivita na vápník je měřena jako viskozita pektinu rozpuštěného v roztoku s 57,6 mg vápníku na g pektinu, která je dělena viskozitou přesně stejného množství pektinu v roztoku, ale v nepřítomnosti vápníku. Pektin necitlivý na vápník má CF = 1.
4,2 g pektinu se rozpustí v 550 ml horké vody za dostatečného míšení. Roztok se ochladí na teplotu přibližně 20 °C a pH se upraví na 1,5 pomocí 1 N HC1. Objem pektinového roztoku se upraví na 700 ml vodou a mísí se. 145 g tohoto roztoku se odměří do 4 zkumavek pro měření viskozity. Do dvou zkumavek se přidá 10 ml vody (dvojité měření) a za míšení se do dalších dvou zkumavek přidá 10 ml 250 mM roztoku CaCl2.
ml octanového pufru (0,5 M, pH přibližně 4,6) se přidá do všech čtyř zkumavek pro měření viskozity za magnetického míchání, což způsobí vzestup pH pektinového roztoku na více než 4,0. Potom se magnety odstraní a zkumavky se nechají stát přes noc při 20 °C. Viskozita se měří následující den pomocí Brookfieldova viskozimetru. Index sensitivity na vápník se vypočítá následujícím způsobem:
viskozita roztoku s 57,6 mg Ca2+/g pektinu CF = —viskozita roztoku s 0,0 mg Ca2*/g pektinu
Protokol 2: Stupeň esterifikace (% DE)
Do 50 ml 60% isopropanolu a 5% roztoku HC1 se přidá 2,5 g
30/ φ» φφφφ • φ φφ♦ · • · φ φφ φ φφφφ φφφ φφφ φφφφ • ♦ φφφφ φ φ φ φ φ φ •φφφ φφφφ φφφφ pektinu a provede se míchání po dobu 10 minut. Pektinový roztok se filtruje přes skleněný filtr a promyje se 6-krát 15 ml roztoku 60% isopropanolu/5% HC1 a potom se promývá 60% isopropanolem, dokud se z filtrátu neodstraní chloridy. Filtrát se suší přes noc při 80 °C.
ml 0,5 N NaOH a 20,0 ml HC1 se smísí v konické zkumavce a přidají se 2 kapky fenolftaleinu. Tento roztok se titruje s 0,1 N NaOH, dokud se nezíská trvalá změna barvy. 0,5 N roztok HC1 by měl být o něco silnější než 0,5 N NaOH. Přidaný objem 0,1 N NaOH je označen V .
o
0,5 g sušeného pektinu (filtrátu) se přidá do konické zkumavky a zvlhčí se 96% ethanolem. Přidá se 100 ml převařené a ochlazené destilované vody a výsledný roztok se mísí do té doby, dokud není všechen pektin zcela rozpuštěn. Potom se přidá 5 kapek fenolftaleinu a roztok se titruje s 0,1 N NaOH (dokud se nezmění barva roztoku a pH není 8,5). Množství použitého 0,1 N NaOH je zde označeno jako νχ. Přidá se 20,0 ml 0,5 N NaOH a zkumavka se důkladně protřepe a potom se nechá 15 minut odstát. Přidá se 20,0 ml 0,5 N HC1 a zkumavka se třepe do té doby, než zmizí růžové zbarvení. Přidají se 3 kapky fenolftaleinu a roztok se titruje s 0,1 N NaOH. Množství použitého 0,1 N NaOH je zde označeno jako V .
Stupeň esterifikace (% DE: % karboxylových skupin) se vypočítá následujícím způsobem:
V - V
O % DE = + (V2 - vo) ·· ftft·· ·· • ft ♦· • · · · • · · · ♦ · ftft 9 • · ft · ·· ·«
Potravinové přípravky
Úvod
Potravinové přípravky podle předkládaného vynálezu mohou obsahovat jiné složky, jako jsou potravinové přísady. Mezi obvyklé potravinové přísady patří kyseliny, jako je například kyselina citrónová, nebo cukry, jako je například sacharosa, glukosa nebo invertní cukr, nebo ovoce, nebo jiné enzymy, konzervační činidla, barviva a jiné vhodné přísady.
Například, ovoce způsobuje v gelu nejen jeho chuť, barvu a strukturu, ale také přispívá pektinem a malým množstvím pevných látek. Podle kvality a množství chuti a barviv v ovoci tvoří ovoce obvykle od 25% do 60% džemu. Obsah pevných látek v běžném ovoci je přibližně 10% brix, ale může být použit také ovocný koncentrát, který obsahuje přibližně 65-70% brix. pH ovoce je různé, podle druhu ovoce, ale většina ovoce má pH mezi 3,0 a
3,5.
Obsah pektinu je také různý, podle druhu ovoce. Například, červený rybíz, černý rybíz a pomeranče mají vysoký obsah pektinu a z tohoto ovoce mohou být získány uspokojivé gely za přidání pouze malých množství dalšího pektinu. Volba GRINDSTED™ pektinu závisí na typu džemu. Například, GRINDSTED-™ Pectin SS 200 je použit v džemech neobsahujících kousky ovoce nebo obsahujících pouze velmi málo kousků ovoce. Separace ovoce v takových džemech není problémem a proto může být použit pomaleji tuhnoucí pektin a nižší plnící teplota. GRINDSTED™ Pectin RS 400 je použit v džemech obsahujících velké kousky ovoce nebo celé plody, například třešně nebo jahody. V džemech obsahujících celé plody může být problémem separace plodů a proto je nutno použít rychle tuhnoucího pektinu jako je GRINDSTED™ Pectin RS 400.
»0 0000
0000
· « • » 0 • * · · »0 00 • 0 0 0 ·0 0
0 0 0
Volba pektinu je také závislá na typu použité nádoby. Pokud jsou použity standardní zavařovací sklenice, tak je plnící teplota méně důležitá s ohledem na stabilitu pektinu, protože sklenice se po naplnění ochladí relativně rychle a nedojde k degradaci pektinu. Nicméně, pokud jsou džemy plněny do velkých nádob, například 500 nebo 1000 kg, pak je doba chladnutí velmi dlouhá. V centru takové velké nádoby bude docházet k degradaci pektinu a gel bude méně hustý v centru než na okrajích. Proto je pro větší nádoby obvykle používán pomaleji tuhnoucí pektin, který umožňuje plnění při nižších teplotách a proto ochranu před degradací pektinu.
Cukr se přidává do džemů z různých důvodů, jako například:
1. pro dodání solubilních pevných látek - HE pektiny mohou vyžadovat přítomnost obsahu minimálně 55% pevných látek, aby došlo ke tvorbě gelu;
2. pro slazení;
3. pro zvýšení fyzikální, chemické a mikrobiologické stability;
4. pro zlepšení pocitu v ústech;
5. pro zlepšení barvy a lesku.
Obvykle se používá sacharosa, ale mohou být použity také jiné cukry, podle požadavků na chuť, podle sladící účinnosti, podle požadované krystalizace a struktuře. Výběr cukru může také ovlivňovat cena.
Invertní cukr má stejnou sladící účinnost jako sacharosa, zatímco glukosový sirup, glukosa a sorbitol mají nižší sladící účinnost. Kukuřičný sirup s vysokým obsahem fruktosy a fruktosa mají vyšší sladící účinnost než sacharosa.
Struktura a tuhost gelu, stejně jako teplota nutná pro tvorbu gelu jsou - v určitém rozsahu - ovlivněny změnami složení cukru.
·* »«·· ·· ···· • · · · ♦ 9
9 9 9 9 9 ·· 9 9·· 9 • 9 9 9 9 9 9 9 ·· ·· 99 99
99
9 9 9
9 9 9 • 9 9 9
9 9 9
99
Kyselina se přidává ze dvou důvodů: (1) částečně redukuje pH na 3,0-3,2, což umožňuje získání uspokojivého gelu z pektinu; a (2) částečně zesiluje chuť ovoce. Optimální pH pro tvorbu gelu při použití HE pektinu závisí na typu pektinu a na obsahu pevných látek.
Pokud je v džemu s 65-68% Brix použit GRINDSTED™ Pectin SS 200, tak je optimální pH 3,0-3,2.
Pokud je obsah pevných látek vyšší, tak je optimální pH 3,1-3,3 .
Naopak, pokud je obsah pevných látek nižšší, tak je optimální pH 2,8-3,0.
Pokud je použit GRINDSTED™ Pectin RS 400, tak je optimální pH o přibližně 0,2 jednotek vyšší než pH pro GRINDSTED™ Pectin SS 200.
Nej častěji používanou kyselinou je kyselina citrónová, monohydrat, v 50% (hmot./objem) roztoku.
Mohou být použity jiné kyseliny (jako je kyselina jablečná, vinná nebo fosforečná), ale musejí již být v roztoku.
Volba kyseliny závisí na předpisech, ceně a sladkokyselosti konečného výrobku.
Kyselina citrónová způsobuje relativně silnou kyselost konečného výrobku, zatímco kyselina jablečná vede ke vzniku slabší, ale déle trvající chuti.
Kyselina vinná může způsobit mírně nahořklou chuť a kyselina
fosforečná způsobí sladší chuť..
Enzymaticky zpracovaný pektin může zabránit synereze, ke které často dochází při výrobě marmelád a džemů s nízkým obsahem solubilních pevných látek.
Džem s nízkým obsahem cukru a marmeláda s 25% SS
Prostředek
| Složky | % | % solubilních pevných látek |
| Předem připravený roztok pektinu | ||
| Enzymaticky zpracovaný pektin1 | 0,6-0,8 | 0,6-0,8 |
| (vysoce reaktivní s Ca) | ||
| Cukr | 3,6 | 3,6 |
| Voda | 18,0 | |
| Ovocný základ | ||
| PME2 | 7-8 jednotek | |
| Ovoce s přirozeným pektinem* | 45,0 | 4,5 |
| Cukr | 15,9 | 15,9 |
| Voda | 21,1 | |
| Konzervační činidla | podle potřeby | |
| Kyselina citrónová** | podle potřeby | |
| Celkem | •*104 | |
| Odpař | -4 | |
| Výtěžek | 100,0 | |
| Konečný obsah solub. pevných látek | 25 | -25 |
| Konečné pH | 3,2 |
* Obvyklým ovocem jsou jahody, jablka, třešně, pomeranče a černý rybíz.
** nebo jakákoliv jiná potravinářská kyselina.
1 Enzymaticky modifikovanným pektinem může být pektin podle WO-A-97/03574.
2 PME může být PME podle WO-A-97/03574.
Postup
Příprava pektinového roztoku:
1. Smísení enzymaticky modifikovaného pektinu a cukru za sucha.
2. Rozpuštění směsi pektin-cukr v horké vodě (80 °C) za důkladného míšení.
Džem
1. Smísí se ovoce, cukr a voda.
2. Ovocná směs se krátce povaří a ochladí se na 40 °C.
3. Po ochlazení na 40 °C se přidá roztok PME.
4. Reakční doba pro ovocnou směs jej edna hodina.
5. Ovocná směs se po dobu několika minut zahřívá při 85 °C a džem se nechá odpařit na požadovaný obsah solubilních pevných látek.
6. Přidá se pektinový roztok.
7. Přidají se konzervační činidla a upraví se pH.
8. Džem se ochladí na plnící teplotu, plní se a ochladí se na teplotu okolí.
Tento příklad může být modifikován adicí nebo substitucí alespoň jedné potravinové přísady a/nebo adicí jiného vhodného enzymu (jako je například glukanasa).
• · • · · · ·
Džem s nízkým obsahem cukru a marmeláda s 50% SS
Prostředek
| Složky | % | % solubilních pevných látek |
| Předem připravený roztok pektinu | ||
| Enzymaticky zpracovaný pektin1 | 0,4-0,7 | 0,4-0,7 |
| (vysoce reaktivní s Ca) | ||
| Cukr | 2,2 | 2,2 |
| Voda | 11,0 | |
| Ovocný základ | ||
| PME2 | 7-8 jednotek | |
| Ovoce s přirozeným pektinem* | 45,0 | 4,5 |
| Cukr | 42,7 | 42,7 |
| Voda | 3,1 | |
| Konzervační činidla | podle potřeby | |
| Kyselina citrónová** | podle potřeby | |
| Celkem | -105 | |
| Odpař | -5 | |
| Výtěžek | 100,0 | |
| Konečný obsah solub. pevných látek | 50 | -50 |
| Konečné pH | 3,2 |
* Obvyklým ovocem jsou jahody, jablka, třešně, pomeranče a černý rybíz.
** nebo jakákoliv jiná potravinářská kyselina.
1 Enzymaticky modifkovanným pektinem může být pektin podle WO-A-97/03574.
2 PME může být PME podle WO-A-97/03574.
• · · ·
POStUp
Příprava pektinového roztoku:
1. Smísení enzymaticky modifikované pektinu a cukru za sucha.
2. Rozpuštění směsi pektin-cukr v horké vodě (80 °C) za důkladného míšení.
Džem
1. Smísí se ovoce, cukr a voda.
2. Ovocná směs se krátce povaří a ochladí se na 40 °C.
3. Po ochlazení na 40 °C se přidá roztok PME.
4. Reakční doba pro ovocnou směs je jedna hodina.
5. Ovocná směs se po dobu několika minut zahřívá při 85 °C.
6. Přidá se pektinový roztok a zbývající cukr a džem se potom nechá odpařit na požadovaný obsah rozpuštěných pevných látek.
7. Džem se ochladí na plnící teplotu, plní se a ochladí se na teplotu okolí.
Tento příklad může být modifikován adicí nebo substitucí alespoň jedné potravinové přísady a/nebo adicí jiného vhodného enzymu (jako je například glukanasa).
Modifikace předkládaného vynálezu budou odborníkům v oboru zřejmé. Například, jak bylo uvedeno v příkladech uvedených výše, může být použita jak glukanasa, tak PME pro získání pektinu s nízkým stupněm esterifikace (například pomalu tuhnoucího pektinu).
Příprava pomerančové kaše zpracované rostlinnou PME
Stupeň 1
Kousky pomerančů se homogenizují v hnětacím stroji a vaří se • · · podobu 15 minut pro inaktivaci endogenních enzymů. Po zmrazení/rozmražení se přidá 20% (hmot./hmot.) cukr a pomerančová kaše se ředí 1:1 předehřátou (95-100 °C) deionizovanou vodou. Kače se přenese do skleněných kádinek a její pH se upraví na 7,0 (pomocí 10% NaOH) a teplota se upraví na 40 °C.
Přečištěná rostlinná PME (300 μπιοΐ/min/ml) v koncentraci 113 μ1/200 g pomerančové kaše se inkubuje s kaší při 40 °C po dobu 15 minut a potom se pomocí kyseliny citrónové (50% hmot./obj.) upraví pH kaše na 3,2 (± 0,6). Pro inaktivaci přidané rostlinné PME se kaše zahřívá po dobu 3 minut při 85 °C. Zatímco rostlinná PME obvykle vyžaduje pro svou aktivitu přidání NaCl, tento přípravek enzymaticky modifikované pomerančové kaše nevyžaduje přidání jakéhokoliv exogenního NaCl, protože je přítomno dostatečné množství endogenního NaCl (24 ppm) pro zajištění PME aktivity.
Kaše zpracovaná rostlinnou PME (přibližně 90 g) se uskladní v krystalizačních kádinkách (průměr 60 mm, hloubka 35 mm) při 5 °C. Všechna měření gelování pektinu byly provedeny během tří dnů zpracování a byly získány reprodukovatelné výsledky.
Stupeň 2: Výběr, příprava a adice pektinových substrátů
Výběr: Pro použití byly vybrány tři pektinové substráty. Všechny tři substráty, GRINDSTED™ pectin SS 200, P66 a P60, měly vysoký stupeň esterifikace (%DE). Tyto stupně esterifikace byly 65%, 66% a 60%, v příslušném pořadí. P60 a P66 byly připraveny zpracováním GRINDSTED™ Ultra Rapid Set (URS) pektinu rostlinou PME, zatímco GRINDSTED™ pectin SS200 byl nezpracován. Dva ze tří substrátů, P60 a P66, byly sensitivní na vápník, zatímco GRINDSTED™ pectin SS200 byl nesensitivní na vápník.
Pouze jeden substrát, GRINDSTED™ pectin SS200, byl komerčně dostupný.
Příprava: P60 a P66 byly připraveny zpracováním GRINDSTED™ URS pektinu rostlinou PME za použití následujícího postupu: GRINDSTED™ URS pektin byl solubilizován v 0,15 M NaCl a byl zpracován rostlinou PME během několika hodin při pH 7,0 při 40 °C. Po upravení pH na 3,0 byl solubilizovaný pektin zahříván při 100 °C po dobu 5-10 minut, pro inaktivaci jakékoliv přítomné PME, a potom byl vysrážen isopropanolem a sušen před použitím. Všechny tři pektinové substráty byly připraveny jako 8% roztoky a byly úplně rozpuštěny v předem ohřáté (80 °C) deionizované vodě za použití magnetického míchadla.
Adice: Adice pektinových substrátů ke kaši enzymaticky modifikované PME byla provedena za použití vysokorychlostní magnetické míchačky pro zajištění homogenity roztoku.
Stupeň 3: Příprava a adice citrátu vápenatého
Gelování pektinu může být indukováno přidáním vápníku, ve formě kaše nebo ve formě hydrátu, při vysoké teplotě. Ca-citrat (C H Ca 0 4H O) byl do směsi přidán na konečnou koncentraci
IO 3 2 mm.
Stupeň 4: Měření tuhosti gelu
Stupeň tvorby gelu/tuhost gelu byly určeny kompresními testy za použití analyzátoru struktury. Postup je popsaný v The Chemistry and Technology of Pectin, vyd. Reginald H. Walker; Academie Press; (1991), str. 240 (jejíž obsah je zde uveden jako odkaz).
• · · · • · • · · · • ·
Měření viskozity, indukované stlačením, byla provedena na SMS TA-XT2 Textuře Analyser (Reciproter) za použití sondy uskladně v chladu (5 °C) , při rychlosti 2,0 nun/s a penetraci 30%. Teplota vzorku byla 5 °C. Píková síla v kompresní křivce ukazuje pevnost gelu v newtonech (N).
Stupeň 5: Testy na synerezu a tuhnutí
Synereza je definována jako neschopnost pektinového gelu tvořit pevnou hmotu. Gel vykazoval synerezu, pokud nezůstával intaktní po překlopení reakční nádoby obsahuj ící gel. Gel vykazoval tuhnutí, pokud zůstával intaktní po překlopení reakční nádoby obsahuj ící gel. Intaktní gel měl velmi rovný povrch ve srovnání s neintaktním gelem.
Výsledky
Charakterizace pomerančové kaše zpracované rostlinou PME
Zpracování pomerančové kaše rostlinnou PME vedlo k zisku vysoce esterifikovaného pektinu s průměrným stupněm esterifikace (%DE) 55,2% (%DE bylo určeno postupem podle protokolu 2).
• ·
Tabulka 1: Efekt vápníku (0,096/g Ca-citratu/100 g pomerančové kaše) a/nebo zpracování rostlinnou PME na tuhost gelu pomerančové kaše.
| Zpracování rostlinnou PME | Ca-citrat (5 mM) | Tuhost gelu (N) | Tuhnutí gelu (Ano/Ne) |
| - | - | 0,175 | ne |
| - | + | 0,234 | ne |
| + | - | 0, 227 | ne |
| + | + | 0,226 | ne |
Tuhost gelu extrahované pomerančové kaše byla mírné ovlivněna zpracováním rostlinnou PME nebo přidáním vápníku (tabulka 1). Nicméně, sekvenční zpracování pomerančové kaše rostlinnou PME, po kterém následovalo přidání vápníku, nemělo synergní účinek na tuhost gelu. Vizuální prohlídka gelů ukázala, že všechny byly v kapalné formě.
Tyto výsledky ukazují, že ačkoliv vede zpracování pomerančové kaše rostlinnou PME k zisku více homogenního produktu ve smyslu stupně esterifikace (%DE je 55,2%) a citlivosti na nízké koncentrace endogenního vápníku, neodpovídá enzymaticky modifikovaná kaše na exogenní vápník ve smyslu tvorby gelu vyvolané vápníkem nebo ve smyslu vyšší tuhosti gelu.
Tyto výsledky také prokazují, že reakce pomerančové kaše zpracované PME s endogenními nebo exogenními vápníkovými ionty není dostatečná pro uspokojivé zvýšení tuhosti gelu.
Přidání druhého pektinového substrátu, jako je P60 nebo P66, do kaše zpracovené rostlinnou PME, za přítomnosti nebo za • Φ φφφφ • · · · φ φ φ φ φ φ • φ nepřítomnosti vápníku, indukuje významné zvýšení tuhosti gelu ve srovnání s na zpracovanou kontrolní pomerančovou kaší (tabulka 2, obr. 1). Konkrétně, jak P66, tak P60 pektinové substráty indukovaly 3- a 5-násobné zvýšení tuhosti gelu, v příslušném pořadí, po přidání každého substrátu do pomerančové kaše zpracované rostlinnou PME, v přítomnosti vápníku. Zvýšení tuhosti gelu je o něco méně výrazné pro oba pektinové substráty za nepřítomnosti vápníku v reakční směsi.
Přidání GRINDSTED™ pectin SS200 substrátu do pomerančové kaše zpracované rostlinnou PME neindukovalo zvýšení tuhosti gelu, protože GRINDSTED™ pectin SS200 substrát nebyl předem zpracován PME a kombinované substráty proto netvořily gel.
Tabulka 2: Vliv kombinovaných pektinových substrátů a vápníku na dosaženou tuhost gelu
| Pektin | % pektinu | % solub. částic | PH | Zprac. rostl. PME | Citrát vápe- natý (5 mM) | Tuhost gelu (N) | Relat. zvýšení tuhosti gelu | Tuhnutí gelu A/N |
| Kaše | 0 | 0,175 | 100 | Ne | ||||
| SS200 | 0,8 | 20 | 3,1 | + | 0 | 0,195 | 111 | Ne |
| SS200 | 0,8 | 20 | 3,2 | + | + | 0,223 | 127 | Ne |
| P66 | 0,8 | 20 | 3,1 | + | 0 | 0,316 | 180 | Viskozní |
| P66 | 0,8 | 20 | 3,1 | + | + | 0,457 | 312 | Ano |
| P60 | 0,8 | 20 | 3,1 | + | 0 | 0,530 | 302 | Ano |
| P60 | 0,8 | 20 | 3,1 | + | + | 0,782 | 446 | Ano |
Tuhnoucí gel byl získán po smísení P66 pektinového substrátu s pomerančovou kaší zpracovanou rostlinnou PME za přítomnosti, • 999
9999
ale ne za nepřítomnosti vápníku. Naopak, tuhnoucí gel byl získán po smísení P60 pektinového substrátu s pomerančovou kaší zpracovanou rostlinnou PME za přítomnosti i za nepřítomnosti vápníku.
Aditivní efekt zpracování PME a přítomnosti vápníku na gelování pektinu je ilustrován na obr. 2. Tento obr. ukazuje procento relativního zvýšení tuhosti gelu (nebo tvrdosti) pozorovaného po přidání P66 pektinového substrátu do nezpracované a PME zpracované pomerančové kaše za přítomnosti nebo nepřítomnosti vápníku. Absolutní hodnoty tuhosti gelu (N) jsou uvedeny vedle každého sloupce a procentuelní zvýšení tuhosti gelu je uvedeno nad každým sloupcem. Při čtení zleva doprava ukazuje první sloupec to, že nezpracovaná pomerančová kaše má nízkou tuhost gelu, který je při vizuální prohlídce v kapalné formě. Po přidání druhého pektinového substrátu, jako je P66, do nezpracované pomerančové kaše za nepřítomnosti vápníku není dosaženo žádného ovlivnění tuhosti gelu (sloupec 2). Nicméně, je-li P66 přidán do pomerančové kaše zpracované rostlinou PME, je pozorována vyšší viskozita gelu (sloupec 3). Podobné zvýšení viskozity gelu je pozorováno při smísení P66 s nezpracovanou pomerančovou kaší za přítomnosti vápníku (sloupec 4) . Nakonec, pokud je P66 přidán do pomerančové kaše zpracované rostlinou PME, je získán tuhý gel (sloupec 5). Tyto výsledky jsou získány bez ohledu na pořadí, ve kterém bylo provedeno smísení a zpracování PME. Tak je získán tuhý gel tehdy, jsou-li GRINDSTED™ URS pektinový substrát a přípravek pomerančové kaše smíseny a zpracovány PME za přítomnosti vápníku, nebo jsou-li GRINDSTED™ URS pektinový substrát a přípravek pomerančové kaše zpracovány PME odděleně a potom jsou smíseny za přítomnosti vápníku.
Pokusy popsané na obr. 1 a 2 byly opakovány a výsledky jsou φφ φφφφ
ΦΦ ΦΦΦΦ • Φ φ • φ φ φ φ φ φ φ φ φ • φ ·· • φ φ φφφ • · · · φ · φ 9 • · · · φφ Φ· • · · φ • φ · φ φ φ φ · · • φ φ φ φφ Φ· uvedeny v tabulce 3. Vizuální prohlídka gelů získaných v těchto pokusech potvrdila dřívější zjištění, že:
(i) pomerančová kaše samotná nebo po zpracování rostlinnou PME a vápníkem, samostatně nebo v kombinaci, neindukuje zvýšení tuhosti gelu;
(ii) přidání vápníku samotného k GRINDSTED™ URS pektinu nemění funkci pektinu. Podobně, pokud není GRINDSTED™ URS pektin zpracován rostlinou PME, tak je po smísení s pomerančovou kaší zpracovanou PME za přítomnosti nebo za nepřítomnosti vápníku pozorováno zvýšení viskozity, ale ne tuhnutí;
(iii) zpracováním GRINDSTED™ URS pektinu rostlinnou PME se získá P66, který je účinější při smísení s pomerančovou kaší zpracovanou PME za přítomnosti vápníku. Tato vyšší účinnost se projeví indukcí tuhnutí gelu ve vzorku;
(iv) zpracování dvou pektinových substrátů, jako je pomerančová kaše a GRINDSTED™ URS pektin, rostlinnou PME vede k více účinným vysoce esterifikovaným pektinům, které jsou schopné, za přítomnosti vápníku, indukovat tuhnutí džemu s nízkým obsahem pevných látek.
Tabulka 3: Vliv kombinovaných pektinových substrátů a vápníku na tuhost gelu
| Pektin | Rostlin. % | % solub. | zpracování | Citrát | Stav |
| PME pektinu | solidních | kaše PME | vápenatý | gelu | |
| částic | (+/-) | ||||
| Kaše | 0 | kapalný | |||
| Kaše | + | + | kapalný/ viskózní | ||
| Kaše | 0 | + | kapalný |
·· φφφφ
9999 • φ φ • φ φ • * φ • · φ φ • φ φφ • φ · • Φ 9
9 9 Φ • 9 φ φ ·»
ΦΦ ΦΦ • Φ Φ Φ • · Φ Φ • · · Φ « • · · Φ
Φ Φ ΦΦ
Tabulka 3: Vliv kombinovaných pektinových substrátů a vápníku na tuhost gelu - pokračování
| Pektin Rostlin. | % pektinu | % solub. solidních částic | zpracování kaše PME (+/-) | Citrát vápenatý | Stav gelu | |
| PME | ||||||
| Kaše | + | + | kapalný/ viskozní | |||
| URS* | 0 | 0,8 | 20 | - | 0 | kapalný |
| URS* | 0 | 0,8 | 20 | - | + | kapalný/ viskozní |
| URS* | 0 | 0,8 | 20 | + | 0 | kapalný/ viskozní |
| URS* | 0 | 0,8 | 20 | + | + | kapalný/ viskozní |
| P66* | - | 0,8 | 20 | - | 0 | viskozní |
| P66* | - | 0,8 | 20 | - | + | viskozní |
| P66* | - | 0,8 | 20 | + | 0 | tuhý |
| P66* | - | 0,8 | 20 | + | + | tuhý |
* je GRINDSTED™ URS pektin
Diskuse
Pokud, je džem s nízkým obsahem solubilních pevných látek připravován z homogenátu pomerančové kaše, není pozorována tvorba gelu ani po zpracování rostlinnou PME, ani po přidání exogenního vápníku. Podobně, pokud je druhý vysoce esterifikovaný pektinový substrát, jako je P66, přidán do nezpracované pomerančové kaše, nemá vliv na schopnost tvorby gelu ani tehdy, když je druhý pektinový substrát předem zpracován rostlinou PME. Nicméně, zvýšení viskozity gelu je ·· ··4·
4 pozorováno tehdy, když je druhý vysoce esterifikovaný pektinový substrát, jako je P66, kombinován s nezpracovanou pomerančovou kaší za přítomnosti vápníku. Podobný efekt, ve smyslu zvýšení viskozity gelu, je pozorován tehdy, je-li stejný vysoce esterfikovaný pektinový substrát (P66) kombinován s pomerančovou kaší zpracovanou PME za nepřítomnosti vápníku.
Tyto výsledky naznačují, že zvýšení viskozity gelu může být indukováno jak zpracováním pomerančové kaše rostlinnou PME před smísením s vysoce esterifikovaným pektinovým substrátem, jako je P66, tak smísením nezpracované pomerančové kaše s P66 za přítomnosti vápníku. Tyto výsledky také ukazují, že smísení pomerančové kaše zpracované PME s P66 za přítomnosti vápníku povede ke vzniku tuhého gelu. Tento efekt je pozorován bez ohledu na pořadí, ve kterém proběhne smísení a zpracování PME. Tak je tuhnutí gelu pozorováno jak při zpracování pektinových substrátů PME před smísením, tak při zpracování smíšených substrátů PME za přítomnosti vápníku.
Závěr
Pokud je džem s nízkým obsahem solubilních pevných látek připravován z pomerančové kaše, není pozorována tvorba gelu ani po zpracování pomerančové kaše rostlinnou PME, ani po přidání exogenního vápníku.
Pokud je druhý vysoce esterifikovaný pektinový substrát přidán do nezpracované pomerančové kaše, nemá vliv na schopnost tvorby gelu ani tehdy, když je druhý substrát předem zpracován rostlinnou PME.
Při smísení pomerančové kaše zpracované rostlinou PME s vysoce esterifikovanými pektinovými substráty předem ·· ·♦··
• · · • 9 9 · ·· »· ·· ·· • » · ♦ • · · « • · · · • · 9 9 ·· ·· zpracovanými PME, za přítomnosti nebo za nepřítomnosti vápníku, se získají gely s významně vyšší tuhostí a lepší funkcí. Proto zlepšuje zpracování pektinových substrátů PME, samostatně nebo v kombinaci, jejich schopnost tvorby gelu tím, že jsou připraveny pektinové substráty, které jsou účinějšími vysoce esterifikovanými substráty v přítomnosti vápníku.
Sekvence ssq.i.d. no. i
MIKNMTDTDM MIMRTSNNRK LIESTSTVDG WPAWL3TGDR RLLQSSSVTP 50 NVWAADGSG NFXTVAAAVA AAPQGGTKRY IIRIKAGVYR ENVEVTKKHK 100 NIMFIGDGRT RTIITGSRNV VDGSTTFKSA TVAWGEGFL ARDITFQNTA 15 0 GPSKHQAVAL RVGADLSAFY NCDMLAYQDT LYVHSNRQFF VNCLIAGTVD 200 FIFGNAAAVL QNCDIHARKP NSGQKNMVTA QGRADPNQNT GIVIQKSRIG 250
ATSDLKPVQG SFPTYLGRPW KEYSRTVIMQ LNTLFYGEHQ NAGAGAGTSG RVKWKGFRVI LGSTGFPFSL GL
SSQ.I.D. NO. 2
MTRIKEFFTK LSESSTNQNI SNIPKKKKKL VNSRKNSGDN GNEPHKAILK SSC3STRYPD DVIEMSLNIT TTAVEHNYFG IQKLLKRTNL ELHKAVEDLE EYPNKKSLSQ HADDLKTLMS HVRDALSDGQ VHVEKMCSNA LAMIKNMTDT DGWPAWLSTG DRRLLQSSSV TPNVWAADG RYIIRIKAGV YRENVEVTKK HKNIMFIGDG SATVAWGEG FLARDITFQN TAGPSKHQAV DTLYVHSNRQ FFVNCLIAGT VDFIFGNAAA TAQGRADPNQ NTGIVIQKSR IGATSDLKPV MQSSITDVIH PAGWHEWDGN FALNTLFYGE VITSATEAQA FTPGSFIAGS SWLGSTGFPF
| SSITDVIHPA | GWHEWDGNFA | 300 |
| TSATEAQAFT | PGSFIAGSSW | 350 |
| 362 |
| FLALFATLLV | VAAVIGIVAG | 50 |
| LCFSAIAAVP | EASXKVTSQK | 100 |
| TKREKVALHD | CLETIDETLD | 150 |
| AAMTNQGTCL | DGFSHDDANK | 200 |
| DMMIMRTSNN | RKLIEETSTV | 250 |
| SGNFKTVAAS | VAAAPQGGTK | 300 |
| RTRTIITGSR | NWDGSTTFK | 350 |
| ALRVGADLSA | FYNCDMLAYQ | 400 |
| VLQNCDIHAR | KPNSGQKNMV | 450 |
| QGSFPTYLGR | PWKEYSRTVI | 500 |
| HQNAGAGAGT | SGRVKWKGFR | 550 |
SLGL
584 • * · * 9 9 « · • 9 » · · » ·· •9 99 * 9 9 9
9 9 • · 9
9 9
99
SEQ.I.D. NO. 3
| GTAGCAATGG | GCTTGCTATG | ATCAAGAACA | TGACTGACAC | TGACATGATG | 50 | |
| ATCATGAGGA | CTTCAAACAA | CAGGAAGCTG | ATAGAGGAGA | CCAGTACGGT | 100 | |
| TGATGGGTGG | CCGGCGTGGC | TGTCCACCGG | AGACAGGAGG | CTGTTGCAGT | 150 | |
| CCTCGTCGGT | GACACCGAAC | GTGGTGGTGG | CAGCAGATGG | CAGCGGAAAC | 200 | |
| TTTAAGACGG | TGGCGGCAGC | GGTGGCGGCG | GCTCCTCAGG | GAGGCACTAA | 250 | |
| GCGGTATATT | ATTAGGATTA | AAGCCGGTGT | TTATCGGGAA | AATGTTGAGG | 300 | |
| TGACAAAGAA | GCATAAAAAT | ATAATGTTCA | TCGGTGACGG | GAGGACTAGA | 350 | |
| ACTATCATCA | CAGGAAGTAG | AAATGTGGTT | GATGGAAGCA | CAACTTTCAA | 400 | |
| GTCTGCTACA | gttgctgttg | TTGGTGAAGG | ATTCTTGGCC | CGAGACATTA | 450 | |
| 5 | CATTCCAAAA | CACAGCCGGC | CCCTCAAAGC | ACCAGGCGGT | GGCACTACGA | 500 |
| GTGGGAGCTG | ACCTTTCAGC | ATTTTACAAT | TGCGATATGT | TAGCTTACCA | 550 | |
| AGACACACTC | TACGTCCACT | CGAACCGCCA | GTTCTTTGTG | AACTGCTTAA | SOO | |
| TTGCTGGCAC | GGTTGATTTT | ATTTTTGGTA | ACGCTGCAGC | CGTGTTACAA | 650 | |
| AATTGTGACA | TCCATGCACG | AAAGCCCAAT | TCCGGCCAAA | AAAATATGGT | 700 | |
| 10 | CACAGCCCAA | GGCAGGGCTG | ACCCTAACCA | AAACACCGGC | ATTGTCATTC | 750 |
| AAAAATCTAG | GATTGGTGCC | ACCTCCGATT | TAAAACCGGT | TCAGGGTAGT | 800 | |
| TTCCCGACGT | ACCTCGGCAG | GCCCTGGAAG | GAGTACTCGA | GGACGGTGAT | 850 | |
| CATGCAGTCA | TCGATTACTG | ACGTGATCCA | CCCTGCCGGG | TGGCACGAGT | 900 | |
| GGGATGGTAA | CTTCGCGTTG | AACACATTGT | TTTACGGAGA | GCATCAGAAC | 950 | |
| 15 | GCCGGAGCCG | GTGCCGGAAC | TTCAGGGAGA | GTGAAATGGA | AGGGATTTAG | 1000 |
| GGTTATTACA | AGTGCTACCG | AGGCTCAAGC | TTTTACTCCT | GGAAGCTTCA | 1050 | |
| TTGCTGGTAG | TAGCTGGCTG | GGCTCCACTG | GTTTCCCATT | CTCCCTTGGT | 1100 | |
| TTGTAATATT | CACTAGGAGT | TTTAATTAAT | ATGTTTTGTA | TTAGTGGATC | 1150 | |
| CATAGGTCTC | TGGTCTTTCA | ATTTGTAATA | TTTGATTGAG | CGTGTCTTAT | 1200 | |
| 20 | TCGTGGCTTC | GATTTCACAA | ATACTATTGT | GTGATTAACA | AGAAATAAAA | 1250 |
| TAGCATGGGA | AGAATAATAA | TTTCCGGCTT | CTTTAAAAAA | AAAAAAAAAA | 1300 | |
| AAAAAAAAAA | AAAAAAAAAA | AAA | 1323 | |||
| SEQ.I.D. NO. 4 | ||||||
| CTTTTGTTCT | CTCTTATCGA | GAAAAAAAAT | GACCCGCATA | AAAGAATTCT | 50 | |
| TCACAAAACT | TTCTGAATCT | TCTACCAACC | AAAACATTTC | CAATATTCCC | 100 | |
| AAGAAAAAAA | AGAAACTATT | CTTAGCTCTT | TTTGCAACGC | TACTCGTTGT | 150 | |
| CGCTGCCGTA | ATCGGCATTG | TCGCCGGAGT | GAACTCAAGA | AAAAACTCCG | 200 | |
| 30 | GCGACAACGG | CAACGAGCCT | CATCATGCTA | TCCTCAAATC | ATCATGTAGC | 250 |
| AGCACAAGGT | ACCCGGACTT | ATGCTTTTCG | GCTATTGCTG | CCGTTCCAGA | 300 | |
| GGCCTCCAAA | AAGGTGACAA | GCCAAAAGGA | CGTTATTGAG | ATGTCCTTAA | 350 | |
| ACATCACAAC | AACAGCCGTG | GAACACAACT | ACTTCGGGAT | TCAGAAGCTC | 400 | |
| TTGAAGAGAA | CGAATCTCAC | CAAACGGGAA | AAGGTTGCTC | TCCATGACTG | 450 | |
| 35 | TCTTGAGACG | ATCGATGAGA | CTCTTGATGA | GTTACACAAA | GCCGTCGAGG | 500 |
44··
44
4 4 4
4 4 4
4 4 4 4 • 4 4 4
4 44 ··*«
| ATCTTGAGGA | GTACCCGAAC | AAGAAATCTT | TATCACAGCA | TGCGGATGAT | 550 |
| CTCAAAACCC | TAATGAGTGC | CGCGATGACC | AATCAGGGGA | CGTGTCTTGA | 600 |
| TGGGTTCTCT | CATGATGATG | CTAATAAGCA | CGTGCGGGAT | GCGTTGTCAG | 650 |
| ACGGCCAGGT | TCATGTTGAG | AAGATGTGTA | GCAATGCGCT | TGCTATGATC | 700 |
| AAGAACATGA | CTGACACTGA | CATGATGATC | ATGAGGACTT | CAAACAACAG | 750 |
| GAAGCTGATA | GAGGAGACCA | GTACGGTTGA | TGGGTGGCCG | GCGTGGCTGT | 800 |
| CCACCGGAGA | CAGGAGGCTG | TTGCAGTCCT | CGTCGGTGAC | ACCGAACGTG | 850 |
| GTGGTGGCAG | CAGATGGCAG | CGGAAACTTT | AAGACGGTGG | CGGCATCGGT | 900 |
| GGCGGCGGCT | CCTCAGGGAG | GCACTAAGCG | GTATATTATT | AGGATTAAAG | 950 |
| CCGGTGTTTA | TCGGGAAAAT | GTTGAGGTGA | CAAAGAAGCA | TAAAAATATA | 1000 |
| ATGTTCATCG | GTGACGGGAG | GACTAGAACT | ATCATCACAG | GGAGTAGAAA | 1050 |
| TGTGGTTGAT | GGAAGCACAA | CTTTCAAGTC | TGCTACAGTT | GCTGTTGTTG | 1100 |
| GTGAAGGATT | CTTGGCCCGA | GACATTACAT | TCCAAAACAC | AGCCGGCCCC | 1150 |
| TCAAAGCACC | AGGCGGTGGC | ACTACGAGTG | GGAGCTGACC | TTTCAGCATT | 1200 |
| TTACAATTGC | GATATGTTAG | CTTACCAA.GA | CACACTCTAC | GTCCACTCGA | 1250 |
| ACCGCCAGTT | CTTTGTGAAC | TGCTTAATTG | CTGGCACGGT | TGATTTTATT | 1300 |
| TTTGGTAACG | CTGCAGCCGT | GTTACAAAAT | TGTGACATCC | ATGCACGAAA | 1350 |
| GCCCAATTCC | GGCCAAAAAA | ATATGGTCAC | AGCCCAAGGC | AtíGGCTGACC | 1400 |
| CTAACCAAAA | CACCGGCATT | GTCATTCAAA | AATCTAGGAT | TGGTGCCACC | 1450 |
| TCCGATTTAA | AACCGGTTCA | GGGTAGTTTC | CCGACGTACC | TCGGCAGGCC | 1500 |
| CTGGAAGGAG | TACTCGAGGA | CGGTGATCAT | GCAGTCATCG | ATTACTGACG | 1550 |
| TGATCCACCC | TGCCGGGTGG | CACGAGTGGG | ATGGTAACTT | CGCGTTGAAC | 1600 |
| ACATTGTTTT | ACGGAGAGCA | TCAGAACGCC | GGAGCCGGTG | CCGGAACTTC | 1650 |
| AGGGAGAGTT | AAATGGAAGG | GATTTAGGGT | TATTACAAGT | GCTACCGAGG | 1700 |
| CTCAAGCTTT | TACTCCTGGA | AGCTTCATTG | CTGGTAGTAG | CTGGCTGGGC | 1750 |
| TCCACTGGTT | TCCCATTCTC | CCTTGGTTTG | TAATATTCAC | TAGGAGTTTT | 1300 |
| AATTAATATG | TTTTGTATTA | GTGGATCCAT | AGGTCTCTGG | TCTTTCAATT | 1850 |
| TGTAATATTT | GATTGAGCGT | GTCTTATTCG | TGGCTTCGAT | TTCACAAATA | 1900 |
| CTATTGTGTG | ATTAACAAGA | AATAAAATAG | CATGGGAAGA | ATAATAATTT | 1950 |
1975
Claims (18)
1. Prostředek schopný tvorby gelu vyznačující se tím, že obsahuje pektin-methylesterasu (PME), substrát pro PME a pektin nebo pektinový derivát zpracovaný PME; kde první a druhý substrát pro PME nejsou odvozeny od sebe navzájem.
2. Prostředek podle nároku lvyznačující se tím, že PME je rekombinantní.
3. Prostředek podle nároku 1 nebo 2vyznačující se tím, že substrát pro PME je pektin nebo jeho derivát.
4. Prostředek podle jakéhokoliv z předešlých nároků vyznačující se tím, že substrát pro PME je přítomen v rostlině a/nebo rostlinném materiálu.
5. Prostředek podle nároku 4vyznačující se tím., že rostlinou nebo rostlinným materiálem je zelenina, materiál získaný ze zeleniny, ovoce nebo materiál získaný z ovoce.
6. Prostředek podle nároku Svyznačující se tím, že materiálem získaným ze zeleniny a/nebo materiálem získaným z ovoce je kaše.
7. Prostředek podle jakéhokoliv z předešlých nároků vyznačující se t. i m, že pektin nebo jeho derivát zpracovaný PME je vysoce esterifikovaný pektin.
8. Prostředek podle jakéhokoliv z předešlých nároků vyznačující se tím, že substrát pro PME je vysoce esterifikovaný substrát.
• · • · β λ
9. Prostředek podle jakéhokoliv z předešlých nároků vyznačující se tím, že je ve stavu tuhého gelu a má obsah solubilního pevného materiálu menší než 50% (hmot./hmot.).
10. Prostředek podle jakéhokoliv z předešlých nároků vyznačující se tím, že je potravinou nebo že je používán pro přípravu potravin.
11. Způsob přípravy prostředku obsahujícího substrát pro PME a pektin nebo derivát pektinu zpracovaný PME vyznačuj ící se t í m, že obsahuje zpracování substrátu pro PME a pektinu nebo pektinového derivátu PME před, během a/nebo po smísení uvedeného substrátu a pektinu nebo pektinového derivátu v prostředku; kde substrát pro PME a pektin nebo pektinovy derivát nejsou odvozeny od sebe navzájem.
12. Způsob podle nároku 11 vyznačující se tím, že PME j e rekombinantní.
13. Způsob podle nároku 11 nebo 12 vyznačuj ící se tím, že PME substrát je stejný, jak je definováno v jakémkoliv z nároků 3 až 6.
14. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 11 až 13 vyznačující se tím, že je určen pro přípravu potravin.
15. Způsob pro zlepšení stability reakčního media obsahujícího substrát pro PME vyznačující se tím, že obsahuje přidání alespoň PME a pektinu nebo pektinového derivátu; kde substrát pro PME a pektin nebo pektinový derivát nejsou odvozeny od sebe navzájem.
• ·
16. Způsob podle nároku 15 vyznačující se tím, že reakční medium je potravina nebo je určeno pro přípravu potravin.
17. Prostředek vyznačující se tím, že jej lze získat způsobem podle jakéhokoliv z nároků 11 až 13.
18. Prostředek podle nároku 17 vyznačující se tím, že je ve stavu tuhého gelu a má obsah solubilního pevného materiálu menší než 50% {hmot./hmot.).
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ19993743A CZ374399A3 (cs) | 1998-04-24 | 1998-04-24 | Prostředek obsahující pektin-methylesterasu a dva substráty |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ19993743A CZ374399A3 (cs) | 1998-04-24 | 1998-04-24 | Prostředek obsahující pektin-methylesterasu a dva substráty |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ374399A3 true CZ374399A3 (cs) | 2000-06-14 |
Family
ID=5467181
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19993743A CZ374399A3 (cs) | 1998-04-24 | 1998-04-24 | Prostředek obsahující pektin-methylesterasu a dva substráty |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ374399A3 (cs) |
-
1998
- 1998-04-24 CZ CZ19993743A patent/CZ374399A3/cs unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU714570B2 (en) | Process for stabilizing proteins in an acidic environment with a high-ester pectin | |
| US6368642B2 (en) | Composition comprising pectin methyl esterase and two substrates | |
| AU760118B2 (en) | Process for enzymatically modifying pectin | |
| CZ374399A3 (cs) | Prostředek obsahující pektin-methylesterasu a dva substráty | |
| MXPA99009761A (en) | Composition comprising pectin methyl esterase and two substrates | |
| NL1012028C2 (nl) | Aminozuursequentie. | |
| WO2000017368A1 (en) | Orange fruit pectinacetylesterase | |
| HK1035846B (en) | Use of a high-ester pectin in acidic, protein-containing foodstuffs |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic |