CZ378397A3

CZ378397A3 - Sekvence DNA a kódovaný protein specifický pro rakovinu prsu

Info

Publication number: CZ378397A3
Application number: CZ973783A
Authority: CZ
Inventors: Mark A. Watson; Timothy P. Fleming
Original assignee: Washington University
Priority date: 1995-05-31
Filing date: 1996-05-31
Publication date: 1998-06-17
Also published as: US5855889A; DE69607001T2; NO975508L; PL323632A1; HUP9900873A3; JPH11507212A; TR199701462T1; US6677428B1; ATE190313T1; DE69607001D1; CA2741641A1; CA2222747C; DK0833834T3; PT833834E; EA199700447A1; US5968754A; JP2007145855A; KR19990022122A; US6004756A; WO1996038463A1

Description

Vynález spadá do oblasti patogeneze rakoviny prsu, konkrétně se týká sekvence cDNA a kódovaného proteinu specifického pro prsní tkáň, použitelného pro detekci a léčbu rakoviny prsu.

Dosavadní stav techniky

Rakovina prsu je jeden z nejběžnějších a potenciálně letálních typů rakoviny. Ačkoli časná diagnóza a léčba může snížit rozvoj a úmrtnost na toto onemocnění, pozitivní predikativní hodnota mammografie se odhaduje na pouhých 25 % (Halí et al., N Engl J Med 327:319-328, 1992, uvedeno v odkazech). Proto by bylo vhodné mít k dispozici prostředky pro detekci dřívějšjího stadia rakoviny/ než umožňuje mammografie. Takovýmito prostředky by mohly být genetické nebo biochemické markéry a doplňovat či zvýšovat predikativní hodnotu mammografie (Hayes, Hematol Oncol Clin N Am 8:485, 1994, uvedeno v odkazech).

Rozvoj rakoviny prsu je doprovázen řadou genetických změn (viz přehledný článek Porter-Jordan, Hematol Oncol Clin N Am

8:73, 1994, uvedeno v odkazech). Mezi tyto změny patří celkové chromozomální alterace a ztráta genetických markérů (Deviles et al., Biochim Bíophys Acta 1198:113, 1994; Callahan et al. , j Cell Biochem Suppl 17:167, 1993, uvedeny v odkazech). Rozvoj rakoviny prsu vede rovněž ke kvalitativním i kvantitativním změnám exprese genů identifikovaných již dříve, které kódují růstové faktory a jejich receptory (Zajchowski et al., Cancer Res 48:7041, 1988, uvedeno v odkazech), strukturních proteinů (Trask et al., Proč Nati Acad

Sci 87:2319 1990, uvedeno v odkazech), druhotných

26:2511, messenger proteinů (Ohuchi et al.,

Cancer

Res

1986, uvedeno odkazech), a transkripčních faktorů (Harris,

Ad v Cancer

Res

59:69:1992, uvedeno v odkazech). Tyto změny genové exprese jsou možným • · ···· · · · · · ·· • ······ · · · ···· · • · ♦ · · · ··· ·· ·· ·· ···· ·· ··

- 2 východiskem vývoj markérů rakoviny prsu, ač jejich přesný význam z bioptických vzorků při studování patogeneze karcinomu prsu, není znám.

Kromě genetického nebo biochemického markéru pro časnou detekci rakoviny prsu, by bylo rovněž vhodné mít k dispozici nádorový markér, který by umožňoval odhadnout prognózu onemocnění, výběr a hodnocení terapie, nebo byl prostředkem cílené terapie. Ačkoliv již byla identifikována řada markérů, žádný z nich není dostatečně citlivý nebo nádorově specifický, aby ideálně splňoval požadavky pro diagnózu nebo screening celé populace. (Id.). Z uvedeného vyplývá trvalá poptávka po markérech rakoviny prsu na bázi genu a příslušného expresního proteinu, které by bylo možno použít pro specifickou a selektivní identifikaci výskytu a patogenního rozvoje rakoviny prsu.

S využitím modifikované diferenční zobrazovací PCR techniky k izolaci různě exprimovaných sekvenčních tagů z karcinomu prsu, bylo izolováno několik fragmentů exprimovaných výhradně v neoplastické prsní epitheliální tkáni, po porovnání s kontrolami z normální tkáně (Watson, Fleming, Cancer Res 54:4598-4602, 1994, uvedeno v odkazech). Objev jednoho z těchto sekvenčních tagů označeného DEST002 vedl k objevu a izolaci nové cDNA plné délky a kódovaného proteinu, nyní označovaného jako mammaglobin. Zmiňovaná cDNA a protein jsou nové.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká identifikace nových genů, jejichž exprese se při rakovině prsu zvyšuje a izolace cDNA z mRNA těchto genů. Přihlašovatel objevil novou cDNA a kódovaný sekretorický protein specifický pro rakovinu prsu, mammaglobin. Purifikovaná a izolovaná cDNA má sekvenci č. 1 a kódovaný protein v purifikované a izolované formě má sekvenci č. 2.

U primárních rakovinných nádorů prsu při stadiu I, dochází ke zvýšení exprese mammaglobinu o 27 %.. Z toho vyplývá, že ke změně regulace mammaglobinového genu dochází při rakovině prsu časně a běžně. Objev mammaglobinu a příslušné cDNA se proto může stát východiskem pro vývoj nových postupů a přípravků detekce a léčby rakovinného onemocnění prsu u člověka i dalších savců.

Předkládaný vynález se rovněž týká nových postupů detekce prsních neoplastických buněk ve vzorku. V jednom provedení předkládaného vynálezu se používá cDNA kódující mammaglobin nebo její derivát pro detekci mammaglobinové mRNA ve vzorku. Postup je třístupňový: (a) příprava polynukleotidu obsahujícího sekvenci č. 1 nebo jeho derivátu, (b) inkubace polynukleotidu se vzorkem ve vhodných podmínkách pro hybridizaci polynukleotidu s mRNA prsních neoplastických buněk, a (c) detekce hybridizačního komplexu DNA-RNA.

Předkládaný vynález dále poskytuje kit pro detekci prsních neoplastických buněk ve vzorku. Kit jako součást detekční soupravy obsahuje polynukleotid obsahující nukleotidovou sekvenci č. 1 nebo jeho derivát.

V jiném provedení předkládaného vynálezu se používá mammaglobin nebo jeho derivát k detekci cDNA reverzně transkribávané z mammaglobinové mRNA ze vzorku. Postup je třístupňový: (a) příprava cDNA z mRNA reverzní transkripcí ve vzorku odebraném pacientovi, (b) příprava dvou oligonukleotidových primerů pro polymerázovou řetězcovou reakci, které lemují nebo leží uvnitř sekvence cDNA kódující mammaglobin a (c) amplifikace cDNA kódující mammaglobin postupem PCR. Dva zmiňované oligonukleotidy obsahují sekvence č. 3 a č. 4.

Jiné provedení předkládaného vynálezu poskytuje kit pro detekci prsních neoplastických buněk ve vzorku. Kit jako součást detekční soupravy obsahuje dva oligonukleotidové primery pro polymerázovou řetězcovou reakci, které lemují nebo leží uvnitř sekvence cDNA kódující mammaglobin. Dva zmiňované oligonukleotidy obsahují sekvence č. 3 a č. 4.

9 9 9 9 9 * · · 9 · • · 999 9 9« · · ··· 9 · ·· 9··· 9 9 9 «· ·· ·· 9··· 99 »9

- 4 Podle jiného provedení předkládaného vynálezu je ve vzorku detekován mammaglobin exprimovaný nádorovými buňkami pomocí specifických protilátek. Specifické protilátky jsou polyklonální nebo monoklonální.

Mezi ostatními přínosy předkládaného vynálezu je nutno zdůraznit poskytnutí nukleotidové sekvence, která může sloužit jako markér pro prsní rakovinné buňky, poskytnutí postupu ranné detekce prsních neoplastických buněk; poskytnutí prostředků k detekci rakovinný prsu doplňující mammografii a zvyšující její predikativní cenu; poskytnutí postupů umožňujících odhad prognózy onemocnění; a poskytnutí markérů umožňujících cílenou terapii.

Stručný popis obrázků

Obr. 1 ilustruje strategii izolace plné délky mammaglobinové cDNA pomocí postupu RACE/PCR (rychlá amplifikace cDNA konců/polymerázová řetězcová reakce) a následné subklonování do vektorů pGEM7Z a pCEV27.

Obr. 2 ilustruje lidskou cDNA o sekvenci č. 1 (nukleotidy jsou číslovány shora) a aminokyselinovou sekvenci kódovaného proteinu specifického pro rakovinu prsu mammaglobinu o sekvenci č. 2 aminokyseliny jsou číslovány dole), plná čára označuje fragment 403 bp (sekvence č. 5) izolovaný postupem RACE/PCR, nevyplněná čára označuje sekvenci DEST002 206 bp (sekvence č. 6).

Obr. 3 ilustruje aminokyselinovou sekvenci proteinu specifického pro rakovinu prsu mammaglobinu (hMAM) (sekvence č. 2) a její přirovnání k vazebné proteinové podjednotce C3 pro krysí prostatický steroid (rPSC3) (sekvence č. 7) a k proteinu 10 kD z lidských clara buněk (hCCIO) (sekvence č. 8). Shodné úseky jsou označeny tučnými písmeny a zdvojenými čarami, strukturně podobné úseky jsou značeny jednoduchými čarami.

Obr. 4 ilustruje (A) northernovou blotovou analýzu hybridizace lidské cDNA sekvence kódující protein specifický pro rakovinu prsu mammaglobin (hMAM) s mRNA exprimovanou v tkáni prsních neoplastických buněk, s mRNA exprimovanou ·· · · v normálních prsních buňkách i v jiných dospělých tkáních a (B) analýzu vzorků tkání z prsních neoplastických buněk, normálních prsních buněk a jiných dospělých tkání po amplifikaci RT/PCR.

Obr. 5 ilustruje in vitro translaci sekvence cDNA specifické pro prsní tkáň v testovacím systému králičího retikulocytárního lyzátu.

Obr. 6 ilustruje detekci mRNA v nádoru 2410, tří z osmi dalších pacientů míře v normální prsní tkáni v nádorech pocházejících od tučně), v menší kurzívou), pomocí (vytištěno (vytištěno northernového blotování hybridizace s cDNA kódující mammaglobin. Testy jsou provedeny vždy pro dva případy, exprese mammaglobinu v nádorové tkáni a porovnání s normální tkání.

Obr. 7 ilustruje westernovou blotovou analýzu s využitím polyklonální protilátky k C-koncovému peptidu o 16ti aminokyselinách (sekvence č. 14) z upraveného media (S) a buněčného lyzátu (C) z prsních nádorových buněk MDA-MB—415 v nepřítomnosti (-) a přítomnosti (+) peptidu použitého ke generaci polyklonální protilátky.

Obr. 8 ilustruje westernovou blotovou analýzu buněčného lyzátu z lidských prsních nádorových buněk ukazující detekci mammaglobinu pomocí polyklonální protilátky k C-koncovému peptidu o 16ti aminokyselinách (sekvence č. 14) a kozí protikráličí protilátky, po vizualizaci enzymově vázanou chemoluminiscencí.

Obr. 9 ilustruje barevně vrstvu prsních rakovinných buněk fixovanou parafínem ze vzorku odebraném pacientovi, zbarvení imunohistochemicky s využitím polyklonální aminokyselinách protilátky tagované exprimuj íc í

C-koncovému

14) a kozí křenu a DAB peptidu o 16ti protikráličí jako substrátu. Buňky bylo provedeno protilátky k (sekvence č. peroxidázou z mammaglobin vykazují hnědé zbarvení.

Obr. 9A ilustruje černobíle vrstvu prsních ze vzorku odebraném buněk fixovanou zbarvení bylo polyklonální parafínem provedeno protilátky rakovinných pacientovi, s využitím imunohistochemicky k C-koncovému peptidu o 16ti aminokyselinách (sekvence č. 14) a kozí protikráličí protilátky tagované peroxidázou z křenu a DAB jako substrátu; hnědé zbarvení buněk exprimujících mammaglobin je popsáno.

Popis výhodných provedení

Jeden aspekt předkládaného vynálezu je založen na identifikaci a sekvenování cDNA o sekvenci č. 1 kódující sekretorický protein specifický pro rakovinu prsu, mammaglobin, o sekvenci č. 2 (obr. 2). Jak bude uvedeno dále, izolace mammaglobinové cDNA plné délky zahrnuje reverzní transkripci mRNA z nádorových buněk, amplifikaci postupem PCR a subklonování do expresních vektorů. Dále byl charakterizován a identifikován protein mammaglobin, kódovaný cDNA.

S použitím anonymní sekvence tag, původně značené DEST002, bylo ukázáno, že odpovídající produkt genové exprese, dosud neznámý, zde však identifikovaný jako mammaglobin, je hojně přítomen zejména v prsních nádorových buňkách linie MDA-MB-415. Při izolaci plné délky cDNA, byla reverzně transkribována mRNA právě z této buněčné linie a klonována postupem RACE/PCR (Edwards et al. Nucleic Acids Research 19:5227-52232, 1991, uvedeno v odkazech). Tento postup vychází ze strategie ligace jednovláknového oligodeoxyribonukleotidu ke 3' konci jednovláknové cDNA. Postup izolace mammaglobinové cDNA je schematicky znázorněn na obr. 1. Plná délka 503 bp CDNA sekvence (sekvence č. 1) byla vydedukována ze sekvence fragmentu 403 bp (sekvence č. 5) izolovaného stejným postupem a z již dříve objevené sekvence odpovídající sekvenci DEST (DEST002, sekvence č. 6) (Watson, Fleming, Cancer Res 54:4598-4602, 1994, uvedeno v odkazech) (obr. 2). Na obr. 2 je uvedena plná délka mammaglobinové cDNA a kódovaný polypeptid. cDNA o délce 503 bp zahrnuje otevřený čtecí rámec délky 279 bp, který kóduje polypeptid o délce 93 aminokyselin a předpokládané molekulové hmotnosti 10,5 kD (obr. 2). Prvních 19 zbytků tohoto čtecího rámce zároveň předpovídá hydrofóbní peptidovou signální sekvenci. Počáteční methionin otevřeného čtecího rámce zahajuje sekvenci prakticky shodnou s Kozákovou sekvencí (Kozák, Cell 22:7-8, 1980, uvedeno v odkazech).

bp v protisměru od této sekvence se již v rámci nevyskytuje žádný další methionin nebo translační stop signál. 3' nepřeložená sekvence cDNA je dlouhá 163 bp a zahrnuje polyadenylační signál, AATAAA, 12 bp v protisměru od počátku původní sekvence DEST002. Z těchto údajů vyplývá, že se podařilo izolovat plnou délku mammaglobinové cDNA.

cDNA

Vyhledávání podobných DNA sekvencí k mammaglobinové i algoritmu BLAST (Benson et al., Nud 1993; Altschul et al. , J Mol uvedeny v odkazech) neodhalilo žádnou homologii. Mammaglobinová cDNA je velmi dosud neznámá sekvence DNA.

v Genbank s využitím

Res 21:2963-2965,

Acid

Biol

215:403-410, 1990, zřejmou sekvenční pravděpodovbě nová,

Vyhledávání jiných polypeptidických sekvencí příbuzných mammaglobinu odhalilo aminokyselinovou sekvenční homologii mezi mammaglobinem a dalšími polypeptidy. Mammaglobin vykazoval 42% shodu aminokyselin (58% včetně konzervativních substitucí) s vazebnou proteinovou podjednotkou C3 (rPSC3) pro sekvence krysí prostatický steroid (prostatein), (obr. 3, č. 7). Vazebný protein pro krysí prostatický steroid sekretorický protein krysí ventrální tetramerní protein pódjednotek; C3/C1 je hlavní obsahuje dimerních krysí ventrální prostaty a sestávající z dvou různých a C3/C2 (Parker et al., Ann N Y Parker et al.,J Steroid Biochem odkazech).

sekretorické proteiny duplikací genu. Geny méně podobné genu homologii s proteiny Cl protein je tedy a jeho exprese al. , al.,J Steroid Biochem 20:67-71, v odkazech). Jiný protein, lidský vazebný estramustin (hEMBP) je exprimován v prostatě, prsu a maligních melanomech u člověka. (Bjork et al., Cancer Res 11:1173-82 (1991), uvedeno v odkazech). Lidský vazebný

438:115-124, 1984;

1984, uvedeny v

Vazebný (prostatein) ventrální prostaty steroidy (Parker et Parker et al.,J

Acad Sci

Geny přibližně 6 kD

Cl a C2 jsou

C 3. Mammag1ob i n ani C2.

20:67-71,

Cl, 02 a C3 kódují a vznikly pravděpodobně silně homologní a mnohem nevykazuje sekvenční pro hlavní prostatický steroid protein krysí sekretorický protein krysí je regulována androgenními Ann N Y Acad Sci 438:115-124, 1984;

1984, uvedeny protein pro v karcinomech protein pro estramustin je podobný krysímu vazebnému proteinu pro estramustin a tento krysí protein je totožný s krysím vazebným proteinem pro prostatický steroid (prostatein). Jak již bylo uvedeno, mammaglobin vykazuje 42$ shodu aminokyselin a 58$ shodu včetně konzervativních substitucí, s vazebnou proteinovou podjednotkou C3 pro prostatein. Je tedy pravděpodobné, že mammaglobin je nějak příbuzný s hEMBP. Zatímco však lze prostatein i hEMBP detekovat v prostatě, mammaglobinová mRNA se v této tkáni nevyskytuje vůbec. Mammaglobin tedy není shodný s hEMBP ani jeho podjednotkou a protože sekvence hEMBP dosud nebyla stanovena, nelze ani nalézt případnou podobnost mezi mammaglobinem a fragmentem nebo podjednotkou hEMBP.

Ačkoli nedávno bylo ukázáno, že promotor rPSC3 fúzovaný k antigenu SV40T vede ke vzniku karcinomu prostaty i prsu u transgenních myší (Maroulakou et al., Proč Nat Acad Sci U.S. 91:11236-11240, 1994; Sandmoller et al., Oncogen 9:2805-2815, 1994, uvedeny v odkazech), skutečný biologický význam tohoto proteinu není dosud znám. S přihlédnutím k případné hypotetické příbuznosti mezi krysím vazebným proteinem pro prostatein a lidským EMBP, však nebyl identifikován žádný lidský polypeptid nebo gen odpovídající rPSC3. Mammaglobin a kódující cDNA představují tedy nové dosud nepopsané sekvence.

Při ručním porovnání sekvencí, které měly méně významné BLAST skóre s mammaglobinem a rPSC3 proteinem, byly identifikovány další homologie s proteinem 10 kD z lidských clara buněk (hCCIO) (sekvence č. 8) (Peri et al., J Clin Invest 92:2099-2109, 1993, uvedeno v odkazech) (obr. 3) a dále s králičími a myšími uteroglobinovými proteiny (Miele et al., Endocrine Rev 8:474-90, 1987; Cato, Beato, Anticancer Pes 5:65-72, 1985; Miele et al., J Endocrinol Invest 17:679-692, 1994; uvedeny v odkazech). Nalezené homologie, v závislosti na druhu, představovaly 26$ identitu, nebo 40$ identitu včetně konzervativních substitucí, zejména počet aminokyselin, vytvářejí disulfidické vazby

Všechny proteiny zachovávaly včetně Cys-3 a Cys-69, které mezi podjednotkami uteroglobinu ·· ·· ·» ·· ·· ·· ·*·· · · · · · · · · ···· · · · · · ·· • · ··· · · « · · ··· · · • · · <Β · « «·· ~ · · #· ·· · ··· ♦ » (viz dále). Tyto homologie naznačují, že mammaglobin je novým členem malé rodiny buňkami (Miele et al.

Gen hCCIO je proteinů sekretovaných epitheliálními J Endocrinol Invest 17:679-692, 1994). lidský homolog králičího a myšího uteroglobinového genu (Peri

J Clin Invest

92:2099-2109,

1993, uvedeno v odkazech). Původně byl uteroglobin charakterizován jako sekretorický protein králičí dělohy, ale později byl identifikován í v jiných epitheliálních orgánech včetně plic, prsu a prostaty. Narozdíl od krysího prostateinu je uteroglobin homodimerní protein vázaný dvěma disulfidickými vazbami konzeratívních zbytků Cys-2 a Cys-69 (Miele et al., J Endocrinol Invest 17:679-692, 1994). Ačkoliv je transkripce uteroglobinového genu regulována steroidními hormony, schopnost samotného proteinu vázat progesteron nebo jiné steroidní hormony je sporná a opět skutečný biologický význam tohoto proteinu není dosud znám. (Miele et al., J Endocrinol Invest 17:679-692, 1994).

Exprese mammaglobinu probíhá výhradně v prsní žláze.

Tento fakt je v protikladu s expresí rPSC3 pozorovanou v krysí ventrální prostatě (Parker et al., Ann N Y Acad Sci 438:115-124, 1984) a s expresí hCCIO/uteroglobinu probíhající v řadě tkání včetně plic, dělohy, prostaty a prsu (Miele et al., Endocrine Rev 8:474-90, 1987; Cato, Beato, Anticancer Res

5:65-72, 1985; Miele et al., J Endocrinol Invest 17:679-692, 1994; uvedeny v odkazech). Kvůli sekvenční homologii mammaglobinu s uvedenými proteiny, byl vypracován model tkáňově specifické exprese. Hláška o přítomnosti mammaglobinu, sekvence o délce 500 bp byla dobře detekovatelná v nádorovém vzorku 2410 (tkáň, z níž byl izolován původní tag), ve výrazně nižší míře v normální prsní tkáni (obr. 4A). Hláška o přítomnosti mammaglobinu nebyla vůbec detekována v nesmrtelné linii prsních epitheliálních buněk B5-589, ani v lidské děloze a plicích, kde probíhá exprese uteroglobinu.

Amplifikací s využitím RT/PCR byla detekována mammaglobinová mRNA jak v nádoru 2410, tak v normální prsní tkáni, ale vůbec nebyla detekována v ostatních 15 testovaných tkáních, včetně tkání, které normálně exprimují rPSC3 • · ·· ♦» ·· ι*· « • 444 4 4 4 4 4 · ·4 • 4 4 · 44 · · 4· ·

4 44444 4 4 4 444«4 • 4 44««·«« ~· · «· ·· ···· 4««· a uteroglobin (plíce, děloha, prostata), hormonálně vnímavých a steroidogenních tkání (vaječníky, varlata, placenta) a jiných sekretorických epitheliálních orgánů (tlusté střevo) (obr. 4). Z uvedeného vyplývá, že exprese mammaglobinové mRNA je specifická pro prsní tkáň.

Mammaglobin je tedy relativně specifický protein prsní tkáně. Dva další geny, u nichž dochází ke zvýšené expresi při karcinomu prsu jsou erb-B a cyclin D (Jardines et al., Pathobiology 61:268-282, 1994; Keyomars, Pardee Proč Nat Acad Sci U.S. 90:1112-1116, 1993, uvedeny v odkazech). Narozdíl od zvýšené exprese erb-B nebo cyclinu D, zvýšená exprese mammaglobinu odráží specifičtější změnu v prsní epitheliální buňce, než jsou obvyklé změny doprovázející zvýšení růstu nebo zrychlení mitózy. Výskyt chybné regulace mammaglobinového genu, může tedy mít specifický význam pro terapeutickou zasažitelnost nádoru nebo pro jeho klinický postup.

Exprese mammaglobinu nebyla detekována v normálních lymfatických uzlinách nebo v periferních lymfocytech při citlivosti jednoho kroku RT/PCR testu. Z toho vyplývá, že by analýza transkriptů mammaglobinu v periferních lymfatických uzlinách mohla napomoci při vyhledávání skrytých metastáz rakoviny prsu, podobně jako u jiných epitheliálně specigfických genů. (Schoenfeld et al., Cancer Res 54:2986-90, uvedeno v odkazech).

Pro ověření zda mammaglobinové cDNA skutečně kóduje přeložitelný protein, byl použit klon cDNA pro test translace in vitro. Obr. 5 ukazuje proteinový produkt z králičího retikulocytárního lyzátu programovaného s mammaglobinovou cDNA. Působením mammaglobinové cDNA byl generován protein přibližně 6 kD. Molekulová hmotnost tohoto proteinu je nižší než hmotnost předpovězená na základě překladu otevřeného čtecího rámce, ale tento jev je běžně pozorován také u translačních produktů králičho a lidského uteroglobinu.

Ačkoli byla detekována zvýšená exprese mammaglobinové mRNA u jednoho vzorku nádoru (tj. 2410), nebylo jasné s jakou frekvencí k tomuto jevu dochází u jiných prsních karcinomů. Proto byla testována řada patnácti primárních prsních karcinomů ve stadiu I, různých histologických typů. Testy byly prováděny northernovým blotem hybridizací s mammaglobinovou cDNA probou. Vzhledem k možné proměnlivosti exprese způsobené vlivem prostředí (např. hormonální status pacienta), bylo rovněž uvažováno srovnání vzorků nádorových tkání se vzorky normální prsní tkáně, i když v mnoha případech porovnání nebylo uskutečnitelné. Jak ukazuje obr. 6, mammaglobinová mRNA 500 bp byla opět detekována v normální prsní tkáni a v nádoru 2410. Mammaglobin byl také detekován ve třech dalších nádorech, z čehož ve dvou případech při testování vykazovaly paralelní normální tkáně nízkou nebo nulovou expresi. Celkově 4 z 15 nádorů (27 %) vykazovaly zvýšenou expresi mammaglobinové mRNA. Tyto údaje naznačují, že zvýšená exprese mammaglobinu není zvláštním rysem jednoho typu nádoru, že ve skutečnosti jde o relativně častý jev u primárních karcinomů prsu. Skutečnost, že všechny testované nádory byly v prvním stadiu, napovídá, že k chybné regulaci dochází při rozvoji neoplazie prsu velmi časně.

Vzhledem k předpokladu, že mammaglobin je sekretorický protein, lze očekávat jeho detekovatelnou přítomnost v séru pacientů, u nichž působením nádoru dochází ke zvýšené produkci tohoto genového produktu. Mammaglobin jako takový by mohl být klinicky významný jako prostatický specifický antigen (PSA) nebo spolehlivý markér i pro jiné nádory při léčbě pacientů s rakovinou prsu. (Tumor markers in diagnostic pathology, Clin Lab Med 10:1-250, 1990, uvedeno v odkazech).

Využití jevu prevalence mammaglobinu jako nádorového markéru bylo stanoveno na základě výzkumu exprese mammaglobinu u několika primárních karcinomech prsu. Ačkoliv studie vycházela pouze z malého počtu vzorků, 27 % nádorů vykázalo zvýšenou expresi mammaglobinu. Tato procentuální hodnota je srovnatelná s prevalencí jiných genetických alterací jako je amplifikace erb-B a mutace p53 (Slamon et al. , Sci 244:707-712, 1989; Thor et al., J Mat'1 Cancer Inst 84:845-855, 1992, uvedeny v odkazech). Navíc, protože analýza byla omezena na nádory v počátečním stadiu, mohla by zvýšená exprese mammaglobinu v této podskupině být ve skutečnosti

	- 12	·· 9 9 99 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 999 999 9 9 9 9 9 9 9 9 99 99 99 9999	♦ · 9 9 9 9 9 9 99 99 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
ještě významnější,	než	jakákoliv	jiná genetická	alterace
(AIHerd et al., J	Nat '1	Cancer Inst	84:200-206, 1993,	uvedeno

v odkazech).

Zjištění, že mammaglobin může fungovat jako markér rakoviny prsu, je základem dalšího předmětu předkládaného vynálezu týkajícího se způsobu detekce rakoviny prsu u pacienta. Termín detekce užívaný ve smyslu detekce neoplastického onemocnění prsu, je souhrnný výraz zahrnující zjištění rakoviny prsu u pacienta, rozlišení rakoviny prsu od jiných onemocnění, odhad prognózy ve smyslu pravděpodobného průběhu onemocnění a perspektivy uzdravení, monitorování stavu onemocnění nebo nebezpečí jeho opakování, stanovení terapeutického režimu výhodného pro pacienta a cílení protinádorové terapie.

Způsob detekce rakoviny prsu zpočívá v hybridizaci polynukleotidu k mRNA z prsních neoplastických buněk. Zmíněný polynukleotid obsahuje sekvenci č. 1 nebo derivát sekvence č. 1. Derivatizovanou formou sekvece je míněna sekvence velmi blízká sekvenci původní a dostatečně sekvenčně komplementární k sekvenci, z níž byla odvozena, tak že hybridizuje s mRNA prsních neoplastických buněk ve stejně přísných podmínkách jako jsou podmínky při nichž s mRNA prsních neoplastických buněk hybridizuje původní sekvence.

Odvozená nukleotidová sekvence nemusí být nezbytně fyzicky odvozena od původní nukleotidové sekvence, může být získána jiným způsobem, např. chemickou syntézou nebo replikací DNA nebo reverzní transkripcí, nebo transkripcí.

Pro detekci mRNA kódující mammaglobin při stanovování diagnózy rakoviny prsu je nutno odebrat od pacienta vzorek. Vhodnými vzorky jsou vzorek tkáňové biopsie, vzorek krve, plazmy, séra a pod. Ze vzorku jsou extrahovány nukleové kyseliny. Tyto jsou dále děleny gelovou elektroforézou nebo jinou separační technikou využívající rozdílné velikosti dělených látek.

Detekce zpočívá v hybridizaci nukleových kyselin, konkrétně mRNA z testovaného vzorku a sekvence DNA ve funkci

•99 ♦ •9

9«

9· «9

9 : r • •9 proby a vytvoření hybridního duplexu. Výrazem proba je míněn polynukleotid, který je schopen vytvořit hybridní strukturu s cílovou sekvencí na základě vzájemné komplementarity proby se sekvencí cílové oblasti.

Detekce výsledného duplexu je zpravidla založena na použití značených prob.

Alternativně jsou proby neznačené, ale mohou být detekovány na základě specifické vazby se značeným ligandem, přímo i nepřímo. Vhodné typy značení i způsoby značení prob a ligandů jsou v oblasti techniky známé. Vhodné je například radioaktivní značení, které lze provést popsanými postupy (např. nick translací nebo kinázou), značení biotinem, fluorescentními skupinami, chemiluminiscentními skupinami (např. dioxetany, zejména aktivované dioxetany), pomocí enzymů nebo protilátek a pod.

Při použití cDNA kódující mammaglobin nebo jejího derivátu jako proby, lze pracovat ve vysoce přísných hybridizačních podmínkách, které vylučují falešnou pozitivitu. Při použití sekvencí odvozených od mammaglobinu lze použít méně přísné podmínky. Přísnost hybridizačních podmínek je dána řadou faktorů v průběhu hybridizace a během promývacích operací, včetně teploty, iontové síly, času a koncentrace formamidu. Tyto faktory jsou načrtnuty např. v práci Sambrooka et al.

Manual, (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory

2. vyd.

cílem , 1989). zvýšit vzorku, transkripce/polymerázová amplifikaci cDNA přepsané citlivost je vhodné řetězcová detekce použít reakce mRNA kódující postup reverzní (RT/PCR) pro z mRNA kódující mammaglobin. Postup

RT/PCR je v oblasti techniky známý (např. Watson, Fleming, Cancer Res 54:4598-4602, 1994, uvedeno v odkazech).

Možný způsob provedení RT/PCR:

Totální buněčná RNA je izolována např. standartním guanidin isothiokyanátovým postupem a veškerá RNA je reverzně transkribována. Reverzní transkripce zahrnuje syntézu DNA na templátu RNA pomocí reverzní transkriptázy a 3’-koncového primeru.

Primer typicky obsahuje sekvenci oligo(dT).

·· «· • · · · • · · · • · · · · ♦ · · ·· ♦ ♦

- 14 Připravená cDNA je dále amplifikována PCR s využitím specifických mammaglobinových primerů. (Belyavsky et al., Nud Acids Res 17:2919-2932 (1989); Krug, Berger, Methóds in Enzymology, Academie Press, N.Y., vol.152, pp 316-325, 1987, uvedeno v odlazech).

Polymerázová řetězcová reakce se provádí s využitím dvou primerů, které jsou komplementární ke dvěma hraničním oblastem segmentu DNA, který má být amplifikován. Protisměrové i posměrové primery obsahují typicky 20 až 30 bp a hybridizují s hraničními oblastmi replikované nukleotidové sekvence. Polymerace je katalyzována DNA polymerázou a probíhá v přítomnosti deoxynukleotid trifosfátů nebo jejich analogů za vzniku dvouvláknové molekuly DNA. Obě vlákna připravené DNA jsou dále odděleny fyzikální, chemickou či enzymatickou denaturací. Fyzikální denaturace se obvykle provádí zahřátím nukleové kyseliny na teplotu 80 až 105 °C, 1 až 10 min. Postup se opakuje požadovaný počet cyklů.

Primery jsou voleny tak, aby byly v podstatě komplementární s amplifikovaným řetězcem cDNA. Nemusí přesně odrážet sekvenci templátu, ale musí být dostatečně komplementární, aby zajistily selektivní hybridizaci s amplifikovaným řetězcem.

Po amplifikaci je produkt PCR detekován ethidium bromidovým zbarvením (Sambrook et al., Molecular Cloning: Ά Laboratory Manual, 2. vyd., 1989).

V jiném provedení předkládaného vynálezu lze mammaglobinovou sekvenci cDNA nebo její derivát použít k charakterizaci alterace mammaglobinového genu (tj. genového přesmyku, amplif lka.ee, nebo delece) ve vzorku odebraném pacientovi s onemocněním rakoviny prsu. Tento postup umožňuje detekovat změny v genové struktuře i ve vzorcích, které již neobsahují intaktní mRNA.

Podle jednoho provedení tohoto postupu byla mammaglobinová sekvence cDNA nebo její derivát, hybridizovány ke genomové DNA pacienta, izolované z jeho nádoru, normální tkáně nebo lymfocytů a štěpené jednou nebo několika restrikčními endonukleázami. Na základě Southernova blotu, ·· 99 99 99 9999

9 9 9 9 9 9 9 9 9 99

9 9 9 9 9 9 9 999 • · 999 9 9 9 9 9 999 99

9 9 9 9 9 9 99

99 99 9999 9999 známého v oblasti techniky, provedený test umožnil stanovit, zda se u pacienta nebo v jeho prsním nádoru vyskytuje pozměněný gen pro mammaglobin, např. deletovaný, přesmyknutý nebo amplifikovaný. Případná detekce takových změn poskytuje důležitou informaci pro prognózu onemocnění a léčbu pacienta.

Podle jiného provedení uváděného postupu byl jeden nebo několik párů oligonukleotidových primerů vycházejících z mammaglobinové sekvence cDNA nebo jejího derivátu použito v postupu PCR při amplifikaci segmentů mammaglobinového genu pocházejících z odebraného vzorku. Z analýzy výsledných produktů PCR vyplynulo, zda byl studovaný segment mammaglobinového genu deletován či přesmyknut.

Předkládaný vynález dále poskytuje postupy detekce polypeptidu mammaglobinu ve vzorku odebraném pacientovi. Předládané poustupy mohou využít kterýkoliv způsob detekce proteinů, známý v oblasti techniky. Vhodnými postupy jsou například imunodifúze, imunoelektroforéza, imunochemické postupy, testy založené na ligandové vazbě, imunohistochemické techniky, aglutinační a komplementové testy (např. viz Basic and Clinical Immunology, Sites and Terr, eds., Appleton & Lange, Norwalk, Conn. pp 217-262, 1991, uvedeno v odkazech). Výhodné jsou postupy založené na ligandové vazbě, včetně reakce protilátek s epitopem či epitopy mammaglobinu a kompetitivního nahrazení značeného mammaglobinu nebo jeho derivátu.

Derivátem mammaglobinu obsahující aminokyseliny či křížově reaguje s reakce protilátky s produkci .

V oblasti techniky i nekompetitivních vazebných v těchto testech mohou v aglutinačních testech, nebo Vhodným značením je fluorescentními skupinami, enzymovými substráty nebo se zde modifikované mammaglobinem. Křížovou jiným antigenem, rozumí polypeptid aminokyseliny, který reakcí se rozumí než který vyvolal její je známa řada kompetitivních imunoesejí. Protilátky používané být neznačené, například značené, v řadě dalších postupů, značení radionuklidy, enzymy, chemiluminiscentními skupinami, kofaktory, enzymovými inhibitory.

·· • ·· •·

9· ·· ···· ··

9 · částicemi, barvivý a pod., v postupech jako je radioimunoesej (RIA), enzymová imunoesej, např. enzymová imunosorbentní esej (ELISA), fluorescentní imunoesej a pod.

Pro práci s polyklonálními nebo monoklonálními protilátkami k mammaglobinu nebo jeho epitopu v imunoesejích, existuje v oblasti techniky řada postupů. Epitop vtiskne charakteristiku antigenní determinantě polypeptidu. Může být tvořen třemi aminokyselinami v charakteristickém unikátním prostorovém uspořádání. Epitop obvykle obsahuje nejméně pět takových aminokyselin. Způsoby stanovení prostorové konformace aminokyselin jsou v oblasti techniky známé, zahrnují např. rentgenovou krystalografii a dvourozměrnou nukleární magnetickou rezonanci.

Jeden ze způsobů přípravy protilátek k proteinu zahrnuje selekci a přípravu aminokyselinové sekvence celého proteinu nebo jeho části, chemickou syntézu této sekvence a naočkování do příslušného zvířete, obvykle králíka nebo myši.

Mezi způsoby přípravy mammaglobinu nebo epitopu patří, ne výhradně, chemická syntéza, rekombinantní technologie DNA nebo izolace z biologického materiálu. Chemickou syntézu peptidu lze provést klasickým Merrifeldovým postupem syntézy na pevném nosiči (Merrifeld, J Am Chem Soc 85:2149, 1963, uvedeno v odkazech), nebo strategií FMOC s využitím systému rychlé automatizované multiplitní peptidové syntézy (DuPont Company, Wilmington, DE)(Caprino, Han, J Org Chem 37:3404, 1972, uvedeno v odkazech).

Polyklonální protilátky se připravují imunizací králíků antigenem injikovaným do podkolenních lymfatických uzlin. Naočkovaným králíkům jsou pak ve dvoutýdenních intervalech dávány posilovači dávky intraperitoneální injekcí antigenu. Zvířatům je odebrána krev a sérum testováno proti purifikovanému mammaglobinu, obvykle testem ELISA.

Monoklonální protilátky se obvykle připravují postupem dle Milsteina a Kohlera, fúzí splenocytů z imunizovaných myší s kontinuálně se replikujícími nádorovými buňkami, např. z myelomu nebo lymfomu. (Milstein, Kohler, Nátuře 256:495-497, 1975; Gufre, Milstein, Methods in Enzymology: Immunochamical ·· ·· • · · ·· • ♦ · ·· • · ··· ·· • · *· ·· ··

17·· ·· • · · · · · * • · * · ·· • · * ···· · • · · · · ·· ···· ·» ·· ··

Techniques 73:1-46, Langone, Banatis eds. , Academie Press, 1981; uvedeny v odkazech). Vzniklé hybridomové buňky jsou klonovány postupem s omezeným ředěním a supernatanty testovány na produkci protilátek postupem ELISA nebo RIA.

Unikátní schopnost protilátek rozpoznávat a specificky se vázat k cílovým antigenům otevírá cestu pro terapii produkovaným nádorovými buňkami, rakoviny. (Přehledný článek viz

LoBuglio,

Pharmacol

Saleh, Am J Med Sci

24:99-121, 1993, předkládaného vynálezu je rakovinného onemocnění prsu proti exprimován na mammaglobinu,

304:214-224, 1992; Bagshawe, Adv v odkazech). Dalším tedy postup prevence u zvířat. Postup je mammaglobinu, který je vysoké hladině, polyklonální uvedeno předmětem a léčby založen na využití protilátek v prsních rakovinných buňkách Specifické protilátky proti i monoklonálhí, se připravují známými postupy oblasti techniky. Myší nebo lidské monoklonální protilátky lze například produkovat hybridomovou technologií. Alternativně mammaglobin nebo jeho imunologicky aktivní fragment, nebo antiidiotypová protilátka nebo její fragment po podání zvířeti vyvolají produkci protilátkek, které rozpoznávají buňky exprimující mammaglobin.

Na takto vyprodukované protilátky nebo jejich fragmenty se naváže jedno nebo několik onkolytických činidel, např. radionuklidy, toxiny nebo cytotoxická léčiva a podají se pacientovi s podezřením na nádorové onemocnění prsu. Navázání konjugátu protilátky s činidlem na mammaglobin, který je v prsních rakovinných buňkách exprimován na vysoké hladině, vede k zániku těchto buněk.

Na protilátky lze vázat libovolné onkolytické substance známé v oblasti techniky. Například imunotoxiny se připravují navázáním rostlinných a bakteriálních toxinů na protilátky. Jako toxiny jsou vhodné např. ricin, difterický toxin a exotoxin A z Pseudomonas. Konjugáty léčiva s protilátkou lze rovněž připravit navázáním chemoterapeutika na protilátku. Vhodnými chemoterapeutiky jsou např. tomoxifen, doxorubicin, methotrexat, chlorambuci1, Vinca alkaloidy a mitomycin. Dále lze připravit radioimunokonjugáty, v nichž jsou radionuklidy ·♦

- 18 trvale vázány k protilátce. Vhodnými radionuklídy jsou např. β-zářiče ¹³¹I, ¹⁸⁸Re, ¹⁸⁶Re, ⁶⁷Cu, ⁹⁰Y a ⁴⁷Sc; a-zářiče ²¹¹At, ²¹²Bi a ²¹²Pb; Augerovy elektronové zářiče ¹²⁵I a ⁷⁷Br; a štěpná jádra jako ¹⁰B.

Příklady provedení vynálezu

Výhodná provedení vynálezu jsou popsána v následujících příkladech. Ostatní provedení spadající do rozsahu nároků budou odborníkovi v oboru zřejmá z popisné části vynálezu nebo příkladů. Popisná část i příklady slouží jako ukázka, rozsah a idea vynálezu jsou dány níže uvedenými nároky.

Buněčné linie, používané v příkladech, byly získány v Američan Type Culture Collection a napěstovány v Dulbeccově minimálním základním mediu doplněném 10 % fetálního telecího séra.

Vzorky tkáňových biopsií byly získány v

Human

Cooperative Tissue Network (LiVolsi et al.,

Cancer

71:1391-1394, 1993, uvedeno v odkazech).

Příklad 1

Izolace mammaglobinové cDNA

Totální buněčná RNA z buněčné linie MDA-MB415 byla izolována standartním guanidin isothiokyanátovým postupem. (Belyavsky et al., Nud Acid Res 17:2919-2932, 1989). Tato RNA byla použita pro postup RACE PCR s použitím Amplifinder kitu (Clonetech) podle protokolu výrobce.

Sytnéza prvního řetězce cDNA byla provedena standartní reakcí s obsahující 1 ug RNA, 10 umol specifického primeru pro mammaglobin D2R (sekvence č. 4, 5'- ATA AGA AAG AGA AGG TGT GG -3' ), 4 ul 5xRT pufru (250 mmol.I^-1 TrisCl pH 8,3; 375 mmol.I¹ KC1; 15 mmol.1~¹ MgC12), 2 ul 100 mmol.I¹ DTT, 1 ul 10 mmol.1¹ dNTP a 200 jednotek reverzní transkriptázy Superscript^TM II (Gibco/BRL) v reakčním objemu 20 ul. Reakce probíhala 1 h při 45 °C a byla ukončena inkubací při 95 °C, • «

min. RNA byla hydrolyzována 400 umol NaOH pro 65 °C, 30 min a neutralizována 400 umol kyseliny octové. Reakční směs byla dále zředěna trojnásobným objemem 6 mol.1~¹ Nal a vnesena na 10 ul aktivovaných skleněných kuliček. Skleněné kuličky byly třikrát promyty 80% ethanolem a nukleová kyselina eluována 45 ul vody. Nukleová kyselina byla dále vysrážena a resuspendována v 10 ul vody. Purifikovaný první řetězec cDNA byl ligován ke kotevnímu oligonukleotidu (sekvence č. 9, 5'-CAC GAA TTC ACT ATC GAT TCT GGA ACC TTC AGA GG-3’), který byl poskytnut výrobcem, s využitím T4 RNA ligázy při 27 °C, 20 h. Jedna desetina ligační reakce byla použita pro PCR amplifikaci v 50 ul reakce obsahující 1 umol kotevního primeru od výrobce (sekvence č. 10, 5’-CTG GTT CGG CCC ACC TCT GAA GGT TCC AGA ATC GAT AG-3'), 1 umol specifického primeru pro mammaglobin D2R (sekvence č. 11, 5'-AAT CCG TAG TTG GTT TCT CAC C-3'), 200 umol dNTP, 5 jednotek DNA polymerázy Vent™ a lx polymerázový pufr (10 mmol.1“¹ KC1, 20 mmol.l“¹ TrisCl, 10 mmol.l-¹ (NH4)2SO₄, 2 mmol.1¹ MgSO4, 0,1% Triton X-100). Reakce byla inkubována při 94 °C, 2 min a pak 94 °C 45 s, 50 °C 1 min, 72 °C 90 s, celkem 40krát.

Byly použity dva mammáglobin-specifické vnitřní oligonukleotidy D2R (sekvence č. 4) a D2Rb (sekvence č. 11), z oblasti po směru. Dle doporučení výrobce byl rovněž použit protisměrový mammaglobin-specifický kontrolní oligonukleotid D2F (sekvence č. 12, 5'-CTT TCT GCA AGA CCT TTG GC-3’). Všechny PCR amplifikace byly prováděny s DNA polymerázou Vent (New England Biolabs). Produkt RACE amplifikace byl naštěpen EcoRl a ligován do EcoRl a Smál míst plazmidového vektoru pGEM7Z (Promega).

Všechny sekvenační reakce byly prováděny s Taq DNA polymerázovým sekvenačním kitem s teplotními cykly podle protokolu výrobce (Promega). Stručný postup:

Sekvenčně specifický oligonukleotid (10 pmol) byl označen na konci reakcí s 10 pmol ³²P-gama ATP (3000 Ci/mmol a 10 mCi/ml) a T4 polynukleotid kinázou v 10 ul reakční směsi, při 37 °C, 30 min. Polymerizace byla provedena v 17 ul sekvenačního pufru od výrobce a obsahovala 100 ng plazmidového ·· ·· ·· ·« «· • · · · « · · · · · · « ···· 9 · · · ·· · · ·*· 999 99 999 99

9 9 9 9 9 9 99

99 99 9999 9999

- 20 templátu, 1,54 pmol značeného sekvenačního primeru a 5 jednotek Tag polymerázy o sekvenační jakkosti. Reakční směs byla alikvotně rozdělena do čtyř reakčních zkumavek obsahujících směs deoxynukleotidů od výrobce a jednotlivě dideoxynukleotidy - A, C, G nebo T. Sada čtyř zkumavek byla inkubována při 95 °C, 2 min a pak 94 °C 45 s, 45 °C 30 s a 72 °C 1 min, celkem 30krát. Po zkončení reakcí byly do každé zkumavky přidány 3 u'1 80% formamid/bromfenolového modrého barviva. Vzorky byly zahřátý na 70 °C, 2 min, naneseny na sekvenační gel (6% akrylamid/7,5 mol.I^-1 močovina) a provedena elektroforéza při konstantním napětí 60 W, 2-4 h. Gel byl vysušen a exponován s rentgenovým filmem Kodak XAR5, 2-24 h.

Takto získanou sekvencí byl fragment 403 bp (sekvence č. 5), viz obr. 2, plná čára. Ve starší práci (Watson, Fleming,

Cancer Pes 54:4598-4602, 1994, uvedeno v odkazech) byla izolována Tag sekvence DEST002.

Šlo o fragment 206 bp (sekvence č.

6), viz obr. 2, nevyplněná čára. Spojení informací z těchto dvou sekvencí umožnilo vydedukovat plnou délku 503 bp cDNA pro mammaglobin (obr. 2).

Příklad 2

Exprese mammaglobinu probíhá převážně v nádorových buňkách prsní žlázy, v menším rozsahu v normálních buňkách prsní žlázy.

Vzorky totální buněčné RNA byly izolovány guanidin isothiokyanátOvým postupem a štěpeny DNázou neobsahující RNázu (Promega). Pro analýzu RT/PCR byl 1 ug indikované totální RNA reverzně transkribován s oligo dTž1 (sekvence č. 13) a reverzní transkriptázou Supersript II (Gibco/BRL) podle protokolu výrobce.

200 ng oligo dT2 1 (sekvence č. 13) a 1 ug totální RNA byly inkubovány při 65 °C, 5 min v objemu 10 ul. Vzorek byl ochlazen v ledu a přidány 4 ul 5xTR pufru (250 mmol.I^-1 TrisCl pH 8,3; 375 mmol.1~¹ KC1; 15 mmol.l^-1 MgC12), 2 ul 100 mmol.l^-1 DTT, 1 ul 10 mmol.l^-1 dNTP a 200 jednotek ·♦ ·· • · * ·· ·· ♦· ·· • · · · « · · · tt • · · · · · a · · ·· • · ··· · · · · · «·· » · • · · · · · ··· ·· ♦· ·· «··· ·· a· reverzní transkriptázy Superscript™ II (Gibco/BRL). Reakce probíhala 1 h při 45 °C a byla ukončena inkubací při 95 °C, 5 min.

Na jedné desetině každé RT reakce byla provedena PCR analýza s využitím primerů specifických na mammaglobin D2R (sekvence č. 4, 5'- ATA AGA AAG AGA AGG TGT GG -3') a d2102 sekvencve č. 3; 5'-CAG CGG CTT CGT TGA TCC TTG-3') ve standartních reakčních podmínkách ve čtyřiceti cyklech při 94 °C x 30 s/55 °C x 60 s/72 °C x 60 s.

Northernova analýza byla provedena na 20 ug totální RNA, jak bylo uávedeno výše (flatson, Fleming, Cancer Res 54:4598-4602, 1994, uvedeno v odkazech) s využitím plné délky mammaglobinové proby cDNA. Integrita a rovnocenné nasnesení každého vzorku RNA bylo odhadnuto podle ethidium bromidového zbarvení.

Jak vyplývá z obr. 4A, hláška o přítomnosti mammaglobinu, sekvence o délce 500 bp, byla dobře detekovatelná v nádorovém vzorku 2410 (tkáň, z níž byl izolován původní DEST), ve výrazně nižší míře v normální prsní tkáni a vůbec nebyla detekována v nesmrtelné linií prsních epitheliálních buněk B5-589, nebo v lidských plicích, placentě, děloze a vaječnících (obr. 4A).

Po amplifikaci RT/PCR nebyla exprese mammaglobinu detekována ani v dalších 15 testovaných tkáních (obr. 4B). Detekce sekvence pro glyceraldehyd 3-fosát dehydrogenázu (GADPDH) (obr. 4B) a sekvence pro EGF receptor (data neuvedeny) v uvedených reakcích potvrzují, že nepřítomnost exprese mammaglobinu nebyla výsledkem degradace RNA nebo jiné triviální příčiny. Exprese mammaglobinu je proto relativně specifický jev prsní tkáně.

Příklad 3

Tento příklad ukazuje, že mammaglobinová cDNA kóduje přeložitelnou nukleotidovou sekvenci, která vede k expresi proteinu o předpokládané molekulové hmotnosti. Translace in vitro byly provedeny na TNT™ králičím retikulocytárním

44	«4	44	44	44	44
•	9	• 4	4	•	» 4	4 4	4	4
•	•	• ·	• 4	•	• 4	• ·
•	•	··· 4	4 4	4 A	444	4	4
	•	4	4	4	4	4	•	4
··	44	44	*···	44	44

translačním kitu s T7 RNA polymerázou (Promega) a ³⁵S-methioninem (>1000 Ci/mmol; 10 mCi/ml, Amersham) podle protokolu výrobce.

Ke 25 izl TNT™ králičího retikulocytárního lyzátu byly přidány 2 ul reakčního pufru od výrobce, T7 RNA polymeráza, 20 umol.l^-1 směs aminokyselin neobsahující methionin, 40 uCi ³⁵S-methioninu (1000 Ci/mmol a 10 mCi/ml), 40 jednotek inhibitoru ribonukleázy, 1 ug plazmidu mammaglobin/pGEM7 a dostatečné množství DEPC vody na konečný objem 50 ul. Reakce byla inkubována při 30 °C, 60 min. 5 ul reakční směsi bylo vneseno do 20 ul SDS gelového pufru, zahřáto k varu na 2 min a naneseno na 17 SDS-polyakrylamidový gel.

Králičí retikulocytární lyzát programovaný s mammaglobinovou cDNA vedl ke vzniku proteinu 6 kD, lyzát programovaný bez cDNA nevedl k žádnému proteinovému produktu.

Příklad 4

Tento příklad ilustruje převládající zvýšenou expresi mammaglobinu při primárním karcinomu prsu.

Stanovení frekvence zvýšené exprese mammaglobinu při karcinomu prsu bylo provedeno na řadě patnácti primárních karcinomů prsu v prvním stadiu, různých histologických typů, pomocí northernového blotu hybridizace s cDNA mammaglobinovou probou. U dvou pacientů bylo rovněž provedeno porovnání se vzorky normálních tkání (obr. 6). Mammaglobinová mRNA 500 bp byla detekována v normální prsní tkáni a v nádoru 2410 a v dalších třech nádorech, z čehož ve dvou případech při testování vykazovaly paralelní normální tkáně nízkou nebo nulovou expresi (B015 v. B016; B022 v. B023) (obr. 6). Celkově 4 z 15 nádorů (27 %) vykazovalo zvýšenou expresi mammaglobinové mRNA. Tyto údaje naznačují, že zvýšená exprese mammaglobinu není zvláštním rysem jednoho typu nádoru, že ve skutečnosti jde o relativně častý jev u primárních karcinomů prsu. Skutečnost, že všechny testované nádory byly v prvním stadiu napovídá, že k chybné regulaci dochází při rozvoji neoplazie prsu velmi časně.

• · ···· ·· · e

Příklad 5

Tento příklad ilustruje detekci mammaglobinu pomocí polyklonální protilátky.

Polyklonální protilátka byla připravena spojením peptidu odpovídajícího C-koncovému peptidu o 16ti aminokyselinách (sekvence č. 14; Glu-Val-Phe-Met-Gln-Leu-Ile-Tyr-Asp-Ser-Ser~ -Leu-Cys-Asp-Leu-Phe) s Keyhole Limpet Hemócyanin a naočkováním do králíků ve Freundově adjuvans. Naočkovaným králíkům byly v třítýdenních intervalech dávány posilovači dávky, dvanáctý týden byla odebrána krev a sérum bylo testováno na schopnost detekovat mammaglobin. Upravené medium neobsahující sérum bylo odebráno z linie prsních nádorových buněk MDA-MB-415 a MCF-7 (24 hodinový odběr). Linie MDA-MB-415 byla již dříve identifikována jako linie se zvýšenou expresí mammaglobinu a MCF-7 byla identifikována jako linie neprodukující detekovatelné množství mammaglobinu. Upravené medium bylo rozděleno na 12% SDS akrylamidovém gelu v redukujících podmínkách, blotováno na filtr Nyran a analyzováno standartním westernovým blotem s využitím popsané protilátky k C-koncovému peptidu jako primární protilátky. Po navázání primární protilátky byl blot opláchnut a vystaven působení sekundární protilátky (kozí protikráličí). Komplexy mammaglobinu s protilátkou byly vizualizovány enzymově vázanou chemoluminiscencí (ECL Western Blotting Detecting Reagent, Amersham, Arlington Heights, IL). U upraveného media pro buněčnou lini MDA-MB-415 byl pozorován mammaglobinový pás o zřejmé molekulové hmotnosti 20 kD, tento pás nebyl přítomen v upraveném mediu buněčné linie MCF-7. Linie MDA-MB-415 tedy exprimuje mammaglobin, linie MCF-7 nikoli.

Pro další ilustraci specificity mammaglobinu byl proveden další test Westernovým blotem na upraveném mediu a buněčném lyzátu buněčné linie MDA-MB-415 s protilátkou k C-koncovému peptidu v přítomnosti a nepřítomnosti kompetujíčího peptidu používaného ke generaci protilátky. Vizualizace komplexu

- 24 ·· • · • · • · • ·

mammaglobin-protilátka byla provedena jako ve výše diskutovaném případě. Jak vyplývá z obr. 7, v nepřítomnosti kompetujícího peptidu (-) byl u upravedného media (S) přítomen mammaglobinový pás 20 kD. V buněčném lyzátu (C) lze pozorovat několik pásů 14 kD, 20 kD a výše. Pás 14 kD je pravděpodobně neopracovaný mammaglobin. cDNA pro mammaglobin obsahuje místo pro N-glykosylaci a pozorovaný sekretovaný je pravděpodobně opracovaná forma westernového blotu v přítomnosti pozorována sekretorická což znamená, že byla syntetizována protilátka proti podobné pásy v karcinomů prsu (obr.

nádorovými nebyla mammaglobinu proti němuž :

Tato detekovala mammaglobin 20 kD proteinu. Při provedení kompetujícího peptidu (+) ani nitrobuněčná forma tyto protilátka.

C-koncovému peptidu lyzátech ze proteiny obsahují buněčných

8). Navíc buňkami podle primárních s prsními zbarvení vrstvy prsních přiravené ze vzorku od zbarvení bylo provedeno s využitím a kozí protikráličí protilátky 3,3'-diaminobenzen tetrahydrochloridem peptid, rovněž vzorků protilátka reagovala imunohistochemického rakovinných buněk fixované parafínem, pacienta (obr. 9). Imunohistochemické protilátky k mammaglobinu tagované peroxidázou z křenu a (DAB) jako substrátem.

Buňky exprimující mammaglobin byly zbarveny hnědě.

Uvedené výsledky dokazují, že mammaglobin je sekretorický protein, že mammaglobin je syntetizován jako prekursor a post-translační modifikace zvyšují jeho molekulovou hmotnost před sekrecí; a že mammaglobin lze detekovat v lidských karcinomech prsu. Detekci proteinu mammaglobinu lze aplikovat v diagnostice rakoviny využitím mammaglobinu jako markéru nádoru prsu, v odhadování pravděpodobosti recidivy nádoru, při monitorování autologních transplantátů buněk kostní dřeně nebo kmenových buněk z hlediska kontaminace nádorovými buňkami, ve vakcínách proti nádoru prsu, a při adresování terapeutického účinku do prsních nádorových buněk pomocí konjugátů s protilátkou.

Ve světle výše uvedených skutečností je zřejmé, že vynález přináší řadu pozitivních výsledků souvisejících inovac í.

- 25 • · · · · · · · · • · · ···«· • ······ · · · ··· · · • · · · · · · · · • · · · ·· ···· «· ··

Protože vynález umožňuje různé způsoby provedení nepřesahující jeho rámec, je vhodné považovat výše uvedený popis a doprovodné obrázky za ilustrativní a neomezující rozsah vynálezu.

Průmyslová využitelnost

Práce má farmaceutické využití v oblasti detekce rakoviny prsu. Detekce i terapeutické postupy jsou založené na zvýšené expresi a sekreci mammaglobinu v prsních rakovinných buňkách. Práce uvádí postupy detekce a/nebo kvantifikace proteinu mammaglobinu nebo příslušné kódující mRNA. Rovněž jsou uvedeny příklady kitů obsahujících příslušné markéry.

Seznam sekvencí (2) Informace k sekvenci č. 1:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 503 párů hází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednovláknový (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA na mRNA (iii) hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (xi) popis sekvence: sekvence č. 1:

GACAGCGGCT TCCTTGATCC TTGCCACCCG CGACTGAACA CCGACAGCAG CAGCCTCACC 60

ATGAAGTTGC TGATGGTCCT CATGCTGGCG GCCCTCTCCC AGCACTGCTA CGCAGGCTCT 120

GGCTGCCCCT TATTGGAGAA TGTGATTTCC AAGACAATCA ATCCACAAGT GTCTAAGACT 180 gaatacaaag aacttcttca agagttcata gacgacaatg ccactacaaa tgccatagat 240

GAATTGAAGG AATGTTTTCT TAACCAAACG GATGAAACTC TGAGCAATGT TGAGGTGTTT 300

ATGCAATTAA TATATGACAG CAGTCTTTGT GATTTATTTT AACTTTCTGC AAGACCTTTG 360

GCTCACAGAA CTGCAGGGTA TGGTGAGAAA CCAACTACGG ATTGCTGCAA ACCACACCTT

420

CTCTTTCTTA TGTCTTTTTA CTACAAACTA CAAGACAATT GTTGAAACCT GCTATACATG 480

ΤΤΤΑΊΤΤΤΑΑ TAAATTGATG GCA

503

(2) Informace k sekvenci č. 2:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 93 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (C) řetězec: jednovláknový (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (iii) hypotetická: ne (xi) popis sekvence: sekvence č. 2:

Met Lys Leu Leu Met Val Leu Met Leu Ala Ala Leu Ser Gin Hi g 1 510

Cys

Tyr Ala Gly Ser Gly Cys Pro Leu Leu Glu Afin Val Ile Ser Lys Th-r 20 2530

Ile Asn Pro Gin Val Ser Lys Thr Glu Tyr Lys Glu Leu Leu Gin Glu 35 4045

Phe Ile Asp Asp Asn Ala Thr Thr Asn Ala Ile Asp Glu Leu Lys Glu 50 5560

Cys Phe Leu Asn Gin Thr Asp Glu Thr Leu Ser Asn Val Glu Val Phe €5 70 7580

Met Gin Leu Ile Tyr Asp Ser Ser Leu Cys Asp Leu Phe

8590

- 28 (2) Informace k sekvenci č. 3:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 21 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednovláknový (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (xi) popis sekvence: sekvence č. 3:

CAGCGGCTTC CTTGATCCTT G (2) Informace k sekvenci č. 4:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 20 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednovláknový (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (xi) popis sekvence: sekvence č. 4:

ATAAGAAAGA GAAGGTGTGG (2) Informace k sekvenci č. 5:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 405 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednovláknový (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (xi) popis sekvence: sekvence č. 5:

GACAGCGGCT TCCTTGATCC TTGCCACCCG CGACTGAACA CCGACAGCAG CAGCCTCACC 60

ATGAAGTTGC TGATGGTCCT CATGCTGGCG GCCCTCTCCC AGCACTGCTA CGCAGGCTCT 120

GGCTGCCCCT TATTGGAGAA TGTGATTTCC AAGACAATCA ATCCACAAGT GTCTAAGACT 180

GAATACAAAG AACTTCTTCA AGAGTTCATA GACGACAATG CCACTACAAA TGCCATAGAT 240

GAATTGAAGG AATGTTTTCT TAACCAAACG GATGAAACTC TGAGCAATGT TGAGGTGTTT 300

ATGCAATTAA TATATGACAG CAGTCTTTGT GATTTATTTT AACTTTCTGC AAGACCTTTG 360

GCTCACAGAA CTGCAGGGTA TGGTGAGAAA CCAACTACGG ATT

403

(2) Informace k sekvenci č. 6:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 206 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednovláknový (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA na mRNA (iii) hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (xi) popis sekvence: sekvence č. 6:

TTTATGCAAT TAATATATGA 60

TTGGCTCACA GAACTGCAGG 120

CTTCTCTTTC TTATGTCTTT 180

ATGTTTATTT TAATAAATTG

206

CAGCAGTCTT TGTGATTTAT GTATGGTGAG AAACCAACTA TTACTACAAA CTACAAGACA ATGGCA

TTTAACTTTC TGCAAGACCT

CGGATTGCTG CAAACCACAC

ATTGTTGAAA CCTGCTATAC

- 31 • ·

(2) Informace k sekvenci č. 7:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 95 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (C) řetězec: jednovláknový (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (iii) hypotetická: ne (xi) popis sekvence: sekvence č. 7:

Met Lys 1

Leu Val

Phe Leu 5

Phe

Leu

Val

Thr Ile Pro Ile Cys Cys

10

15

Tyr

Ala

Ser

Gly Ser

Gly

Cys

Ser

Ile

Leu

Asp

Glu

Val

Ile

Arg

Gly

20

25

30

Thr

Tle

Asn

Ser

Thr

Val

Thr

Leu

His

Asp

Tyr

Met

Lys

Leu

Val

Lys

35

40

45

Pro

Tyr

Val

Gin

Asp

His

Phe

Thr

Glu

Lys

Ala

Val

Lys

Gin

Phe

Lys

50

5S

60

Gin

Cys

Phe

Leu

Asp

Gin

Thr Asp Lys

Thr

Leu

Glu

Asn

Val

Gly

Val

65

70

75

80

Met

Glu

Ala

Ile

Phe

Asn

. Sex

Glu

i Ser Cys

Gin Gin Pro Ser

85

90

95

- 32 (2) Informace k sekvenci č. 8:

(i) charakteristiky sekvence:

(Ά) délka: 91 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (C) řetězec: jednovláknový (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (iii) hypotetická: ne (xi) popis sekvence: sekvence č. 8:

Met Lys 1

Leu

Ala

Val 1

Thr 5

Leu

Thr

Leu

Val

Thr 10

Leu

Ala

Leu

Cys

Cys 15

Ser

Ala

Ser

Ala 20

Glu

Ile

Cys

Pro

Ser 25

Phe

Gin

Arg Val

Ile 30

Glu

Thr

Leu

Met 35

Asp

Thr

Pro

Ser

Ser 40

Tyr

Glu

Ala

Met 45

Glu

Leu

Phe

Ser í

Pro 50

Asp

Gin

Asp

Met

Arg 55

Glu

Ala

Gly

Ala

Gin 60

Leu

Lys

Leu Val Asp 65

Thr

Leu

Pro Gin Lys 70

Pro

Arg

Glu Ser 75

Ile

Lys

Leu 80

Met

Glu

Lys

Ile

Ala

Gin 85

Ser

Leu

. Cys

; As n 90

• ·

- 33 (2) Informace k sekvencí č. 9 (i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 35 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednovláknový (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (xi) popis sekvence: sekvence č. 9:

CACGAATTCA CTATCGATTC TGGAACCTTC AGAGG (2) Informace k sekvenci č. 10:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 38 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednovláknový (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (xi) popis sekvence: sekvence č. 10:

CTGGTTCGGC CCACCTCTGA AGGTTCGAGA ATCGATAG

- 34 ··

(2) Informace k sekvenci č. 11:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 22 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednovláknový (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (xi) popis sekvence: sekvence č. 11:

AATCCGTAGT TGGTTTCTCA CC (2) Informace k sekvenci č. 12:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 20 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednovláknový (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (xi) popis sekvence: sekvence č. 12:

CTTTCTGCAA GACCTTTGGC

- 35 (2) Informace k sekvenci č. 13:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 21 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jednovláknový (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA na mRNA (iii) hypotetická: ne (iv) anti-sense: ne (xi) popis sekvence: sekvence č.

13:

TTTTTTTTTT (2) Informace k sekvenci č. 14:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 16 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (C) řetězec: jednovláknový (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: peptid (iii) hypotetická: ne (xi) popis sekvence: sekvence č. 14:

Claims

Izolovaný mammagobin specificky k sekvenci nebo purif ikovaný tohoto fragment hybridizuj í

1.

polynukleotid kódující polynukleotidu, které se sekvencí komplementární

Polynukleotid podle nároku

1 obsahující sekvenci č. 1.

Polynukleotid podle nároku 1 kódující aminokyselinovou sekvenci č.
2.

4.

Izolovaný a purifikovaný polypeptid mammaglobin obsahující aminokyselinovou sekvenci č. 2 nebo jeho derivát.

5 . Derivát polypeptidu podle nároku 4 obsahující aminokyselin ze sekvence č. 2. nejméně pět 6 . Způsob detekce rakoviny prsu u pacienta. v y z n ačující se tím. že zahrnuje detekci a/nebo kvantifikaci mRNž l kódující polypeptid

mammaglobin ve vzorku odebraném pacientovi, přičemž polypeptid mammaglobin obsahuje aminokyselinovou sekvenci č. 2 nebo její derivát a zvýšená hladina sledované mRNA nad koncentraci obvyklou pro zdravého jedince indikuje přítomnost prsních rakovinných buněk.

7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že stupeň detekce a/nebo kvantifikace dále zahrnuje kroky:

(a) příprava polynukleotidu, který specificky hybridizuje se sekvencí sekvenci č. 1, (b) inkubace polynukleotidu se vzorkem ve vhodných podmínkách pro hybridizaci polynukleotidu s mRNA prsních neoplastických buněk, a (c) detekce hybridizačního komplexu polynukleotid-mRNA.

8.

Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že polynukleotid je komplementární k sekvenci č. 1.

9. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že polynukleotid je cDNA kódující polypeptid mammaglobin tvořený aminokyselinovou sekvencí č. 2.

10. Kit pro detekci prsních neoplastických buněk ve vzorku, vyznačující se tím, že jako součást detekční soupravy obsahuje polynukleotid specificky hybridizující se sekvencí č. 1.

11 . Kit podle nároku 10, v y značuj íc í s e tím , že polynukleotid je komplementární k sekvenci č. 1. 12. Kit podle nároku 10, v y značuj íc í s e tím , že polynukleotid je cDNA kódující polypeptid

mammaglobin tvořený aminokyselinovou sekvencí č. 2.

13. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že stupeň detekce a/nebo kvantifikace dále zahrnuje kroky:

(a) příprava cDNA kódující polypeptid mammaglobin z mRNA reverzní transkripcí ve vzorku odebraném pacientovi, (b) příprava dvou oligonukleotidů, které specificky hybridizují s cDNA a definují oblast cDBA která má být amplifikována polymerázovou řetězcovou reakcí, přičemž tyto oligonukleotidy specificky hybridizují s cDNA kódující sekvenci č. 2.

(c) amplifikace oblasti cDNA polymerázovou řetězcovou reakcí s využitím dvou oligonukleotidů jako primerů, a (d) detekce amplifikované oblasti cDNA.

14. Způsob podle nároku 13, vyznačující se t í m , že jeden z oligonukleotidů obsahuje sekvenci č.

3 a druhý sekvenci č. 4. 15. Kit pro detekc i prsních neoplastických buněk ve vzorku, v y z n a č u jící se tím. že jako

součást detekční soupravy obsahuje dva oligonukleotidové primery pro polymerázovou řetězcovou reakci, které specificky hybridizují s cDNA kódující sekvenci č. 2 a definují amplifikovanou oblast.

16. Kit podle nároku 15, vyznačující se t i m , že jeden z oligonukleotidů obsahuje sekvenci č.
3 a druhý sekvenci č. 4.

17. Způsob detekce rakoviny prsu u pacienta, vyznačující se tím, že zahrnuje detekci a/nebo kvantifikaci polypeptidu mammaglobinu ve vzorku odebraném pacientovi, přičemž polypeptid mammaglobin obsahuje aminokyselinovou sekvenci č. 2 nebo její derivát a zvýšená koncentrace polypeptidu mammaglobinu nad koncentraci obvyklou pro zdravého jedince indikuje přítomnost prsních rakovinných buněk.

18. Způsob podle nároku 17, vyznačující se tím, že krok detekce a/nebo kvantifikace dále zahrnuje reakci polypeptidu mammaglobinu s purifikovanou protilátkou a detekci vazby polypeptidu mammaglobinu s protilátkou, přičemž protilátka je specifická k mammaglobinovému epitopu tvořenému nejméně pěti aminokyselinami ze sekvence č. 2.

19. Způsob podle nároku 18,vyznačující se tím, že purifikovaná protilátka je polyklonální protilátka a epitop mammaglobinu obsahuje sekvenci č. 14.

20. Způsob podle nároku 19, vyznačující tím, že purifikovaná protilátka je monoklonální protilátka a epitop mammaglobinu obsahuje sekvenci č. 14.

21. Kit pro detekci prsních vzorku, v y z n a č u j í c í součást detekční soupravy

rakovinných buněk ve se tím, že jako obsahuje purifikovanou protilátku, která reaguje s polypeptidem mammaglobinem, přičemž polypeptid mammaglobin obsahuje sekvenci č. 2 nebo její derivát a protilátka je specifická k mammaglobinovému epitopu tvořenému nejméně pěti aminokyselinami ze sekvence č. 2.

22. Kit podle nároku 21, v y z n a č u j í c í se tím, že purifikovaná protilátka je polyklonální protilátka a epitop mammaglobinu obsahuje sekvenci č. 14.

23. Způsob podle nároku 21,vyznačuj ící se tím, že purifikovaná protilátka je monoklonální protilátka a epitop mammaglobinu obsahuje sekvenci č. 14.

24. Polynukleotid komplementární izolovanému a purifikovanému polynukleotidu podle nároku 1.

25. Izolovaný a purifikovaný polynukleotid, který specificky hybridizuje se sekvencí č. 1, nebo komplementární polynukleotid k tomuto polynukleotidu.