CZ38923U1

CZ38923U1 - Sada gelotvorných roztoků určená pro přípravu implantabilního hydrogelu obsahujícího kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivátu hyaluronanu a infuzní léčivé přípravky

Info

Publication number: CZ38923U1
Application number: CZ2025-43177U
Authority: CZ
Inventors: Martin Pravda; Julie Bystroňová; Jaromír Kulhánek; Dagmar Čožíková; Erik Jirásek; Veronika Hekrlová; Vladimír Velebný
Original assignee: Contipro A.S.
Priority date: 2025-02-17
Filing date: 2025-02-17
Publication date: 2025-11-07

Description

Úřad průmyslového vlastnictví v zápisném řízení nezjišťuje, zda předmět užitného vzoru splňuje podmínky způsobilosti k ochraně podle § 1 zák. č. 478/1992 Sb.

Sada gelotvorných roztoků určená pro přípravu implantabilního hydrogelu obsahujícího kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivátu hyaluronanu a infuzní léčivé přípravky

Oblast techniky

Technické řešení se týká sady roztoků určené pro přípravu hydrogelu na bázi kovalentně zesítěného hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu. Roztoky sady lze kombinovat s infuzními léčivými přípravky, za účelem přípravy hydrogelu určeného k implantaci do organismu pacienta.

Dosavadní stav techniky

Chirurgické odstranění poškozených tkání, nefunkčních orgánů nebo solidních nádorů je důležitou součástí léčby řady onemocnění. Pro úspěšnou rekonvalescenci je důležité zajištění účinné hemostázy, zavedení profylaktických opatření proti infekci a podpora hojení tkání zasažených chirurgickým zákrokem. Obecným problémem rekonvalescence po chirurgických zákrocích je vznik srůstů vnitřních orgánů, které následně vedou k omezení funkce orgánů (ileus, neprůchodnost vaječníků, Ashermanův syndrom, perikarditida atd.). (1) V případě vytvoření anastomózy může pooperační komplikace způsobit její netěsnost či rozpad, které vedou k úniku obsahu dutých orgánů do okolních tělních dutin, což může způsobit vznik zánětů, či rozvoj infekce. (2) V případě odstranění solidních tumorů je závažnou komplikací lokální recidiva nádorů, popř. jeho metastáza. (3)

Polymerní hydrogely jsou důležitou skupinou materiálů, které slouží pro vývoj léčebných prostředků v oblasti prevence komplikací chirurgických zákroků. Polymerní hydrogely jsou v těchto oblastech využívány zejména jako bariéry pro prevenci vzniku pooperačních srůstů (4), nebo mohou sloužit jako adheziva podporující pevnost a těsnost chirurgických sutur. (5) Hydrogely schopné gelace přímo v místě aplikace, např. v místě chirurgického zákroku (in situ), mohou být snadno aplikovány i během miniinvazivních zákroků a mohou efektivně vyplnit anatomicky členité oblasti vzniklé po odstranění zasažené tkáně. (3) Hydrogely lokálně aplikované do místa po odstraněné části orgánu, nebo do bezprostředního okolí, mohou plnit několik funkcí:

• Mohou bránit vzniku srůstů povrchů orgánů poškozených chirurgickým zákrokem • Mohou bránit průsaku a šíření obsahu dutých orgánů (tenké střevo, tlusté střevo, žlučník, močovod apod.) v důsledku anastomického průsaku • Mohou sloužit jako matrice pro lokální podání léčivých látek (hemostatika, antibiotika, cytostatika, léčiva pro biologickou léčbu apod.)

Hyaluronan je polysacharid, který se skládá z disacharidických jednotek složených z D-glukuronové kyseliny a D-N-acetylglukosaminu vázaných alternujícími β-1,4 a β-1,3 glykosidickými vazbami. Hmotnostně střední molekulová hmotnost Mw (pokud bude v dalším textu zmiňována molekulová hmotnost, bude se vždy jednat o hmotnostně střední molekulovou hmotnost) in vivo bývá v rozsahu 3 x 10³ g/mol až 2 x 107 g/mol. Jedná se o polysacharid, který je snadno rozpustný ve vodném prostředí, kde v závislosti na molekulové hmotnosti a koncentraci vytváří viskózní roztoky. Hyaluronan je součástí téměř všech tkání a tělních tekutin obratlovců, přičemž se v hojné míře nachází především v pojivových tkáních. Jedná se o vysoce hygroskopickou molekulu, roztoky hyaluronanu jsou silně osmoticky aktivní a přítomnost hyaluronanu je mimo jiné důležitá pro hydrataci tkání. (6) Kromě toho je hyaluronan schopen modulovat zánětlivé reakce tkání, a to jednak prostřednictvím ovlivnění produkce cytokinů a jednak svým vlivem na adhesi cytokiny aktivovaných lymfocytů. Jeho antioxidační vlastnosti a schopnost vychytávat volné radikály působí snížení aktivity proteináz působících během zánětu, čímž hyaluronan přispívá ke stabilizaci postižené tkáně a podporuje její granulaci. Přípravky na

- 1 CZ 38923 U1 bázi hyaluronanu jsou využívány v oblasti prevence pooperačních srůstů. Přítomnost těchto prostředků má sloužit k mechanické separaci traumatizovaných povrchů vnitřních orgánů a tím bránit jejich srůstům. Nevýhodou využití je krátký biologický poločas nemodifikovaného hyaluronanu, který neposkytuje dostatečně dlouho trvající ochranu před vznikem srůstů. S cílem vyřešit tento problém byly v minulosti navrženy gely a filmy obsahující chemicky zesítěný hyaluronan, které v místě účinku působí jako bariéra proti vzniku srůstů po delší časový úsek. (7)

V minulosti byly rovněž vyvinuty různé typy derivátů hyaluronanu, které jsou schopny podstupovat přechod sol-gel za fyziologických podmínek in situ (6). Pro tyto účely lze využít např. fenolické deriváty hyaluronanu. (8) A Calabro et al. popisují ve spisech EP 1587945 B1 a EP 1773943 B1 metodu přípravy hydroxyfenylového derivátů hyaluronanu reakcí karboxylů přítomných ve struktuře D-glukuronové kyseliny hyaluronanu s aminoalkyl-deriváty fenolu např. tyraminem. Produktem této reakce jsou amidy hyaluronanu. Tyto dokumenty také popisují, že zesítění hydroxyfenylových derivátů hyaluronanu může být iniciováno přídavkem peroxidázy (např. křenové peroxidázy) a zředěného roztoku peroxidu vodíku. Křenová peroxidáza (Horseradish peroxidase, HRP, E.C.1.11.1.7) je v současné době široce využívána jako katalyzátor organických a biotransformačních reakcí. (9) Hydrogely na bázi hydroxyfenylových derivátů hyaluronanu mohou být využívány jako injekčně aplikovatelné matrice pro řízené uvolňování látek nebo jako materiály vhodné pro kultivaci a implantaci buněk (10). Spis WO/2017/197262 popisuje využití tyraminovaného derivátu hyaluronanu pro přípravu hydrogelové matrice obsahující více typů reservoárů biologicky aktivních látek. K zesítění hydrogelu rovněž využívá reakci zprostředkovanou křenovou peroxidázou. Wolfová et al. popisují ve spisu CZ 303879 konjugát hyaluronanu a tyraminu obsahující alifatický linker vložený mezi řetězec polymeru a tyramin. Přítomnost alifatického linkeru umožňuje vyšší efektivitu síťovací reakce a dodává síti vyšší elasticitu. Tento dokument rovněž popisuje možné využití hydrogelů na bázi příslušného derivátu jako biodegradabilní bariéry bránící vzniku pooperačních srůstů.

Spis CZ 308970 popisuje sadu gelotvorných roztoků určených pro přípravu hydrogelu na bázi kovalentně zesítěného hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu k prevenci pooperačních komplikací souvisejících s vytvořením kolorektální anastomózy, které vznikají následkem anastomického průsaku (leaku), a mezi které patří zejména rozevření (dehiscence) kolorektální anastomózy a rozvoj infekce. Sada se skládá z gelotvorných roztoků určených pro přípravu hydrogelu na bázi kovalentně zesítěného hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu, jejíž podstatou je, že obsahuje alespoň dva vodné roztoky A a B, z nichž roztok A obsahuje křenovou peroxidázu a roztok B obsahuje peroxid vodíku a zároveň roztok A a/nebo roztok B obsahuje triclosan a hydroxypropyl-β-cyklodextrin. Dále je popsáno použití sady k přípravě biodegradabilního hydrogelu na bázi kovalentně zesítěného hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu v místě jeho účinku v oblasti malé pánve, kde vzniklý hydrogel slouží k prevenci pooperačních komplikací souvisejících s vytvořením kolorektální anastomózy. Pooperační komplikace související s vytvořením kolorektální anastomózy jsou vybrány ze skupiny obsahující anastomický průsak, rozevření (dehiscence) kolorektální anastomózy, rozvoj infekce v oblasti malé pánve a peritonea. Nevýhodou řešení je možnost použití jedné konkrétní účinné látky - triclosanu. To vylučuje použití popisovaného prostředku u pacientů s přecitlivělostí na danou účinnou látku. Triclosan je antimikrobní látka, která je široce využívána i v kosmetickém průmyslu. Nadměrné využívání této antimikrobní přísady vede v poslední době k nárůstu vzniku resistencí vůči ní. Popisovaný prostředek rovněž neumožňuje kombinaci s jinými typy účinných látek.

Podstata technického řešení

Úkolem technického řešení je vyvinout prostředek, který je určen pro přípravu implantabilního biodegradabilního hydrogelu na bázi kovalentně zesítěného hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu, který má podpořit hojení tkání po chirurgickém odstranění vnitřních orgánů či jejich částí.

- 2 CZ 38923 UI

Tento úkol splňuje a uvedené nevýhody a nedostatky odstraňuje sada gelotvomých roztoků určená pro přípravu implantabilního hydrogelu, jehož podstatou je, že obsahuje alespoň tři vodné roztoky A, B a C, z nichž roztok A obsahuje křenovou peroxidázu, vápenaté ionty ve formě farmaceuticky přijatelné a ve vodě rozpustné soli nebo jejich směsi, roztok B obsahuje peroxid vodíku a roztoky A a C obsahují izotonizační přísadu a hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I

kde n je v rozmezí 2 až 5000, M je H⁺ nebo kation farmaceuticky přijatelné soli vybraný ze skupiny obsahující kation alkalického kovu, kovu alkalických zemin, a kde R je OH nebo substituent NHR2CONHRiArOH obecného vzorce II

O-. NH Ar ''R1 'OH

NH (Π), kde Ar je fenylen a Ri ethylen, nebo Ar je indoly den a Ri je ethylen, nebo Ar je hydroxyfenylen a Ri je karboxyethylen, a R2 je alkylen o počtu uhlíků 3 až 7.

Podle výhodného provedení technického řešení roztok A sady, jak je definována výše, dále obsahuje ve vodě rozpustné barvivo vybrané ze skupiny zahrnující brilantní modř FCF (E133), mety lenovou modř, brilantovou zeleň, krystalovou violeť, s výhodou brilantní modř FCF.

Podle ještě dalšího výhodného provedení technického řešení je izotonizační přísada obsažená v sadě, jak je definována výše, vybrána ze skupiny obsahující NaCl, sacharóza, glukóza, glycerol, manitol, xylitol, glycin s výhodou NaCl.

Podle j eště dalšího výhodného provedení technického řešení sada, j ak j e definována výše, zahrnuj e roztok A, který obsahuje:

- křenovou peroxidázu o aktivitě v rozsahu 0,3 až 0,6 U/ml, s výhodou 0,4 až 0,6 U/ml,

- vápenaté ionty nebo jejich směs o koncentraci v rozsahu 0,0001 až 0,01 mol/1, s výhodou 0,001 mol/1,

- hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o koncentraci v rozsahu 0,1 až 5 g/1, s výhodou o koncentraci 1 g/1, přičemž má hmotnostně střední molámí hmotnost v rozsahu 180 000 až 350 000 g/mol a stupeň substituce substituentu obecného vzorce II je v rozmezí 2 až 3 %,

- barvivo o koncentraci v rozsahu 0,01 až 0,1 g/1, s výhodou brilantní modř FCF o koncentraci 0,04 g/1,

-3 CZ 38923 U1

- izotonizační přísadu nebo jejich směs o koncentraci je v rozsahu 9 až 15 g/l, s výhodou NaCl o koncentraci 13,5 g/l;

roztok B, který obsahuje:

- peroxid vodíku o koncentraci v rozsahu 5 až 13 mmol/l, s výhodou 7 až 11 mmol/l, výhodněji 9 až 10 mmol/l;

a roztok C, který obsahuje:

- hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o koncentraci v rozsahu 35 až 45 g/l, přičemž má hmotnostně střední molární hmotnost v rozsahu 180 000 až 350 000 g/mol a stupeň substituce substituentu obecného vzorce II je v rozmezí 2 až 3 %,

- izotonickou přísadu nebo jejich směs o koncentraci je v rozsahu 9 až 15 g/l, s výhodou 13,5 g/l.

Podle ještě dalšího výhodného provedení technického řešení sada, jak je definována výše, dále obsahuje alespoň jeden infuzní roztok s obsahem léčivé látky nebo jejich směsi, přičemž léčivá látka je vybrána ze skupiny obsahující antibiotikum, lokální anestetikum, cytostatikum, léčivo pro biologickou léčbu, s výhodou je léčivá látka nebo jejich směs vybrána ze skupiny obsahující gentamicin, ciprofloxacin, klindamycin, metronidazol nebo kombinaci ciprofloxacinu a metronidazolu, kombinaci gentamicinu a metronidazolu.

Použití sady podle technického řešení umožňuje, aby hydrogel vznikal přímo v místě aplikace, například v místě chirurgického zákroku (in situ), a aby mohl být aplikován i během miniinvazivních zákroků (například endoskopické a robotické operace), tak aby mohl účinně vyplnit anatomicky členité oblasti vzniklé po odstranění tkání či části orgánů. Rychlost procesu vzniku hydrogelu v místě aplikace, homogenita zesítění vznikajícího hydrogelu a jeho finální viskoelastické vlastnosti jsou důležitými parametry, které se podílejí na účinnosti hydrogelu. Pomalý vznik elastického gelu může způsobit únik části materiálu z místa aplikace a snížit účinnost působení prostředku v požadovaném místě účinku. Příliš rychlý vznik hydrogelu může bránit aplikaci gelu pomocí endoskopických nástavců a může vést k nedokonalému vyplnění anatomicky členitých oblastí. Pro dosažení požadovaných vlastností připravovaných hydrogelů bylo nutné zvolit vhodnou kombinaci koncentrace derivátu hyaluronanu obecného vzorce I, jeho molekulové hmotnosti, stupně substituce, koncentrace peroxidu vodíku a aktivity křenové peroxidázy.

Hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I lze připravit podle postupů uvedených v CZ 303879, který je zde zahrnut tímto odkazem. Polysacharidy, včetně hyaluronanu a z něj připravovaných derivátů, patří mezi polymery tvořené směsí různě dlouhých makromolekul a tvoří tak neuniformní (polydisperzní) systémy. Molární hmotnost takových polymerů může být vyjádřena jako početně střední molární hmotnost (Mn) nebo hmotnostně střední molární hmotnost (Mw). Poměr těchto dvou typů středních molárních hmotností řetězců polymerů (Mw/Mn) vyjadřuje míru neunimorfity (polydisperzity) vzorku polymeru a je označován jako index polydisperzity (PI). Stupeň substituce (DS) je definován jako poměr molárního množství modifikovaných disacharadických jednotek hyaluronanu/molární množství všech disacharadických jednotek derivátu hyaluronanu. Stupeň substituce byl stanoven pomocí ¹H NMR spektroskopie.

Křenová peroxidáza slouží jako katalyzátor síťovací reakce. Přítomnost vápenatých iontů slouží ke stabilizaci molekuly křenové peroxidázy. Farmaceuticky přijatelné a ve vodě rozpustné vápenaté soli jsou vybrány ze skupiny obsahující chlorid vápenatý, mléčnan vápenatý, octan vápenatý, glukonát vápenatý, hydrogenuhličitan vápenatý nebo dihydrogenfosforečnan vápenatý, s výhodou jsou vybrány ze skupiny obsahující chlorid vápenatý, hydrogenuhličitan vápenatý, mléčnan vápenatý, octan vápenatý, hydrogenfosforečnan vápenatý nebo jejich kombinace. Hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I, jak je definován výše, slouží v roztoku A jako nosný polymer stabilizující křenovou peroxidázu během aseptické přípravy roztoku

- 4 CZ 38923 UI a zároveň slouží jako gelotvomá složka, kdy podstupuje síťovací reakci po smísení všech složek sady. Barvivo slouží k vizualizaci gelační směsi během aplikace v rámci chirurgického zákroku. Izotonizační přísada, s výhodou chlorid sodný, upravuje osmotický tlak vodných roztoků nebo vodných roztoků s obsahem účinné látky. Peroxid vodíku slouží po smísení složek sady jako iniciátor enzymatické síťovací reakce. Hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I přítomný v roztoku C slouží jako gelotvomá složka, která podstupuje síťovací reakci po smísení všech složek sady.

Infůzní léčivé přípravky mohou, ale nemusí být součástí sady podle technického řešení.

Sada roztoků podle technického řešení bez obsahu léčivé látky umožňuje přídavek předem definovaného objemu infůzního léčivého přípravku. Infusním léčivým přípravkem se rozumí infůsní roztoky, infůsní roztoky s obsahem léčivých látek, nebo koncentráty s obsahem léčivých látek určené pro přípravu infuzních roztoků a jejich směsi. Takové roztoky mohou obsahovat skupiny s různým terapeutickým účinkem a jejich kombinace například antibiotika, lokální anestetika, cytostatika, nebo léčiva pro biologickou léčbu.

Hydrogely patří mezi viskoelastické materiály, jejichž komplexní reologické vlastnosti, tedy chování látek, které v sobě zahrnuje jak viskózní, tak elastickou složku, lze vyjádřit tzv. komplexním modulem G*. V reologii se elastická složka deformace vyjadřuje tzv. elastickým (paměťovým) modulem (G') a viskózní složka tzv. viskózním (ztrátovým) modulem (G”). Matematicky lze tedy vyjádřit komplexní modul jako komplexní číslo skládajíce se z reálné a imaginární složky:

G* = G' + ÍG a vzájemný vztah mezi G', G'' a G* je dán rovnicí:

|G*| = ýG'² + G²

Proces vzniku gelu je označován jako gelace. V popisovaném případě dochází ke vzniku hydrogelu z prekurzového roztoku polymeru, který obsahuje lineární řetězce póly sacharidu. Probíhající chemickou reakcí dochází ke vzniku příčných vazeb mezi jednotlivými řetězci polymerů a tím ke vzniku polymemí sítě. Bodem gelace nazýváme okamžik, v němž se v systému právě objeví nekonečná trojrozměrná síť. Slovo „nekonečná“ je třeba chápat tak, že rozměry vzniklé sítě jsou totožné s rozměry makroskopické gelové fáze. Váhový podíl sítě je v bodě gelace ještě nepatrný, ale v dalším průběhu se rychle zvětšuje (hmotnost gelového podílu roste na úkor hmotnosti podílu rozpustného), což se projevuje postupným nárůstem elastického modulu vznikajícího hydrogelu.

Reologicky je tato změna vyjádřena tak, že v bodu gelace viskozita kapaliny limitně směřuje do nekonečna, zatímco modul pružnosti nabývá nenulové hodnoty. V bodě gelace mají elastický a viskózní modul stejnou hodnotu. Po dosažení bodu gelace není proces vzniku gelu dokončen. Jak pokračuje chemická reakce dochází k nárůstu polymemí sítě a ke zvyšování její rigidity, což se projevuje i nárůstem G' v čase. Po určité době však síťovací reakce ustane (např. z důvodů vyčerpání reaktantů) a polymemí síť se stabilizuje, dojde k dokončení procesu solidifikace gelu. Velikost elastického modulu po dokončení procesu tvorby gelu v tomto textu označujeme jako G'_s

Popisovaný způsob přípravy zahrnuje:

• Přípravu prekurzorového roztoku hydrogelu p(A), kdy je roztok A popisovaného prostředku smí sen v objemovém poměm 1:1 s infuzním léčivým přípravkem • Přípravu prekurozorového roztoku p(B+C), kdy jsou vzájemně smíseny roztoky B a C popisovaného prostředku v objemovém poměm 1:1.

-5CZ 38923 U1 • Smísení prekurzorových roztků p(A) a p(B+C) v objemovém poměru 1:1 za vzniku hydrogelu, ve kterých infuzní léčivý přípravek tvoří 25 obj. % z celkového objemu finálního hydrogelu.

Popsané použití sady roztoků podle technického řešení vede ke vzniku hydrogelu, který obsahuje infuzní léčivý přípravek a kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivát (crossSH-TA) v koncetraci 7 až 12 mg/ml, který vznikl působením křenové peroxidázy a peroxidu vodíku z hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu obecného vzorce I, jak je definován výše.

Po smísení roztoků p(A) a p(B+C) dosahuje vznikající hydrogel bodu gelace v rozmezí 5 až 70 s, s výhodou 15 až 60 s , výhodněji 25 až 50 s, přičemž dále nejdéle do 3 min (180 s) po smísení roztoků dosahuje hodnota jeho elastického modulu 100 až 1000 Pa, s výhodou 100 až 600 Pa, výhodněji 100 až 500 Pa, a ještě dále po dokončení procesu solidifikace je elastický modul hydrogelu v rozmezí 500 až 2000 Pa, s výhodou 600 až 1300 Pa, výhodněji 700 až 1200 Pa.

Termínem „hyaluronan“ se míní kyselina hyaluronová, nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.

Termínem „infuzní roztok s obsahem léčivé látky“ se míní fyziologicky přijatelný roztok obsahující izotonizační přísadu a alespoň jednu léčivou látku.

Objasnění výkresů

Obrázek 1: Příprava hydrogelu roztoků hydrogelu ze sady roztoky A, B a C a infuzních léčivých přípravků. A - sada roztoků připravená k použití; B - příprava roztoků p(A) a p(B+C) v nesterilní zoně; C - roztoky p(A) a p(B+C) připravené k použití; D - Přenos roztoků do sterilní zóny; E - smísení roztoků p(A) a p(B+C) před aplikací.

Obrázek 2: Endoskopický pohled na aplikaci gelu: A - aplikace pomocí flexibilní cévky; B - hydrogel obklopující kolorektální anastomózu.

Příklady uskutečnění technického řešení

DS = stupeň substituce = 100 % * molární množství modifikovaných disacharadických jednotek hyaluronanu / molární množství všech disacharadických jednotek derivátu hyaluronanu. Stupeň substituce byla stanoven pomocí Ή NMR spektroskopií.

Hmotnostně střední molární hmotnost (Mw) a index polydisperzity (PI) byly stanoveny metodou SEC-MALLS.

Stanovení dynamické viskozity roztoků SH-TA bylo provedeno pomocí rotačního reometru s geometrií kužel-deska (60 mm; 1°). Jako referenční hodnota byla zvolena viskozity při úhlové rychlosti 0,314 rad/s.

Příklad 1: Syntéza tyraminovaného derivátu HA (SH-TA)

Příkad 1A: Syntéza 6-amino-N- [2(4-hydroxyfenyl)ethyl]hexanamidu

6-[(terc. butoxykarbonyl)amino]hexanová kyselina (1,00 g, 4,3 mmol) byla rozpuštěna v 50 ml tetrahydrofuranu (THF). K roztoku kyseliny byl přidán 1,1'-karbodiimidazol (0,70 g, 4,3 mmol). Směs byla zahřívána na 50 ^oC po dobu šedesáti minut. Poté byla reakční nádoba promyta inertním plynem. K reakční směsi byl přidán tyramin (0,59 g, 4,3 mmol). Směs byla dále zahřívána další 2 hodiny. Poté byl destilací za sníženého tlaku odstraněn THF. Odparek byl rozpuštěn v 50 ml

- 6 CZ 38923 U1 ethylacetátu. Roztok byl promyt 150 ml čištěné vody (rozděleno do tří dílů). Organická vrstva byla vysušena nad molekulovým sítem. Ethylacetát byl odstraněn destilací za sníženého tlaku. Odparek byl rozpuštěn v 50 ml MeOH a k roztoku byly přidány 2 ml trifluoroctové kyseliny (TFA). Roztok byl zahříván 6 hodin pod zpětným chladičem. Rozpouštědlo bylo odstraněno destilací za sníženého tlaku. Odparek byl rozpuštěn v 50 ml ethylacetátu. Roztok byl promyt 150 ml čištěné vody (rozděleno do tří dílů). Organická vrstva byla vysušena nad molekulovým sítem. Ethylacetát byl odstraněn destilací za sníženého tlaku.

m = 0,75 g (70 % teoretického výtěžku)

1H NMR (D2O, ppm) δ: 1,17 (m, 2 H, γ-CH2-hexanové kyseliny); 1,48(m, 2 H, β-CH2-hexanové kyseliny); 1,58 (m, 2 H, δ-CH2-hexanové kyseliny); 2,17 (t, 2 H, -CH2-CO-); 2,73 (m, 2 H, -CH2-Ph); 2,91 (m, 2 H, -CH2-NH2); 3,42 (m, 2 H, -CH2-NH-CO-); 6,83 (d, 2 H, arom); 7,13 (d, 2 H, arom).

¹³C NMR(D?O, ppm) δ: 24 (γ-C-hexanové kyseliny); 26 (δ-C-hexanové kyseliny); 33 (β-C-hexanové kyseliny); 35 (-C-CO-); 39 (-C-NH2); 40 (C-Ph); 63 (-C-NH-CO-); 115 (C3 arom); 126 (C1 arom); 130 (C2 arom.); 153 (C4 arom); 176 (-CO-).

Příklad 1B: Příprava aldehydického derivátu (HA-CHO)

Hylauronan (10,00 g, Mw. = 2 MDa) byl rozpuštěn v 750 ml 2,5% (w/w) roztoku

N2HPO4 . 12 H2O. Roztok byl vychlazen na 5 ^oC. K vzniklému roztoku bylo přidáno 2,60 g NaBr a 0,05 g 4-acetamido-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-1-oxylu. Po důkladné homogenizaci roztoku byly k reakční směsi přidány 3 ml roztoku NaClO (10-15 % dostupného Q2). Reakce pokračovala za stálého míchání 15 min. Reakce byla ukončena přídavkem 100 ml 40% roztoku propan-2-olu. Produkt byl přečištěn ultrafiltrací a izolován precipitací propan-2-olem.

IČ (KBr): 3417, 2886, 2152, 1659, 1620, 1550, 1412, 1378, 1323, 1236, 1204, 1154, 1078, 1038, 945 ,893 cm'¹.

1H NMR (D2O) δ: 2,01 (s, 3 H, CH3-), 3,37 - 3,93 (m, skelet hyaluronanu), 4,46 (s, 1H, anomer), 4,54 (s, 1H anomer., -O-CH(OH)-), 5,27 (geminální glykol -CH-(OH)2).

Příklad 1C: Příprava tyraminovaného derivátu HA s C6 spacerem (Mw « 300 000 g/mol, DS ~ 2,5 %)

Aldehydický derivát HA (Mw ~ 3 x 10⁵ g/mol, DS « 9 %) (5,00 g) byl rozpuštěn v 500 ml demineralizované vody. Pomocí kyseliny octové bylo pH roztoku upraveno na 3. K roztoku HA-CHO byl přidán 6-amino-N-[2-(4-hydroxyfenyl)ethyl]hexanamid (meziprodukt (I)) (0,625 g, 2,5 mmol). Směs byla míchána 2 hodiny při pokojové teplotě. Poté byl do reakční směsi přidán komplex pikolin-boran (0,270 g, 2,5 mmol). Směs byla míchána dalších 12 hodin při pokojové teplotě. Produkt byl přečištěn ultrafiltrací a izolován z retentátu precipitací propan-2-olem. Precipitát byl zbaven vlhkosti a zbytkového propan-2-olu sušením v horkovzdušné sušárně (40 ^oC , 3 dny).

IČ (KBr): 3425, 2893, 2148, 1660, 1620, 1549, 1412, 1378, 1323, 1236, 1204, 1154, 1078, 1038, 945, 893 cm^-1.

'H NMR (D2O) δ: 1,25 (t, 2 H, γ -CH2- aminohexanové kyseliny), 1,48 (m, 2 H, δ -CH2- aminohexanové kyseliny)1,51 (m, 2 H, β -CH2- aminohexanové kyseliny), 2,01 (s, 3 H, CH3-), 2,65 (m, 2H, Ph-CH2-), 2,73 (m, 2H, ε-ίΉ:- aminohexanové kyseliny), 3,37 - 3,93 (m, skelet hyaluronanu), 4,46 (s, 1H, anomer), 4,54 (s, 1H anomer., -O-CH(OH)-), 6,59 (d, 2H, arom.), 7,01 (d, 2H. arom).

- 7 CZ 38923 UI

Příklad 2: Příprava roztoků sady

Příprava roztoku A

Rozpuštěním 14,8 g NaCl, 0,162 g CaC12.2H2O a 0,044 g Barviva - Brilliant blue FCF (E133) v 1085 g vody je připraven roztok NaCI/CaCF.

Rozpuštěním 0,004 g křenové peroxidázy o specifické aktivitě 250 U/mg ve 100 ml roztoku NaCI/CaCFjc připraven roztok ZR1.Přesná aktivita připraveného roztoku (Azri) je stanovena metodou podle B. Chance (11).

Rozpuštěním 1 g derivátu SH-TA, který byl připraven podle příkladu 1C v 499 g roztoku NaCI/CaCF vzniká roztok SH-TA 2 g/1.

Podle vzorce:

_ ^Roztok A'^Roztok A kde • W.ki - je hmotnost zásobního roztoku ZR1 potřebného k přípravě roztoku A, vypočítaná na základě skutečné aktivity roztoku ZR1.

• ARoztok a - požadovaná aktivita HRP roztoku A • mRoztok a - požadovaná hmotnost roztoku A zaokrouhlená na gramy Azri je vypočítáno množství roztoku ZR1 nutné pro přípravu roztoku A. Pro přípravu roztoku A o hmotnosti 1000 g je smí seno vypočítané množství roztoku mzRi s 500 g roztoku SH-TA 2g/l. Roztoky jsou dále smí seny s přídavkem roztoku NaCI/CaCF o hmotnosti mNaci/cacn, která je vypočítána podle vzorce.

^mNaCl/CaCl2 = 1000 — 500 — m_Zfil

Po smísení všech složek je roztok sterilizován filtrací a za aseptických podmínek rozplněn do lékovek.

Příprava roztoku B

V 1 1 vody je rozpuštněno 1,125 ml 30% roztoku peroxidu vodíku. Roztok je sterilizován filtrací a za aseptických podmínek rozplněn do lékovek.

Příprava roztoku C

Je připraven obsající derivát SH-TA v koncentraci 40 g/1 a NaCl o koncetraci 13,5 g/1. Roztok C je rozplněn do lékovek, které jsou terminálně sterilizovány v parním autoklávu.

Příklad 3: Sada roztoků pro přípravu gelu s obsahem infůzního roztoku, příprava hydrogelu

Roztoky sady byly připraveny podle postupu z příkladu 2. Následující tabulky popisují složení roztoků sady a vlastnosti derivátu SH-TA obsaženého v roztoku C po terminální parní sterilizaci.

-8CZ 38923 UI

Tabulka 1: Složení sady roztoků pro přípravu hydrogelu

Roztok A (20 g)	Množství (g)	koncentrace	jednotka
HRP	q.s.	0,3	U/ml
CaCl₂.2H₂O	0,0029	1	mmol/1
SH-TA	0,02	1	mg/g
Brilantní modř FCF (E133)	0,0008	0,04	mg/g
NaCl	0,27	13,5	mg/g
Voda	19,7
Roztok B (20 g)	Množství (g)	koncentrace	jednotka
H₂O₂	0,0062	9,13	mmol/1
Voda	20
Roztok C (20 g)	Množství (g)	koncentrace	jednotka
SH-TA	0,8	40	mg/g
NaCl	0,27	13,5	mg/g
Voda	18,9

Tabulka 2:Vlastnosti derivátu SH-TA po terminální parní sterilizaci

Vlastnosti roztoku C	Hodnota
M_w SH-TA (kDa)	214
DS SH-TA	2,4
Viskozita 4 % roztoku (mPa.s)	2162

Roztok A sady (20 g) je smísen s 20 ml léčivého přípravku Fyziologický roztok Viaflo infůzní roztok (NaCl 9 g/1) (výrobce Baxter SA) za vzniku prekurzorového roztoku gelu p(A). Roztok B sady (20 g) je smísen s 20 g roztoku C za vzniku prekurzorového roztoku p(B+C). Pro přípravu hydrogelu jsou prekurzorové roztoky p(A) a p(B+C) smíseny v objemovém poměru 1:1.

Takto připravený hydrogel obsahuje enzym křenovou peroxidázu, kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivát hyaluronanu (crossSH-TA), barvivo brilantní modř FCF, chlorid vápenatý a chlorid sodný. Finální složení hydrogelu včetně hodnot gelačního času (Tg) a hodnoty elatické modulu G'po 3 min (G's mm) a po ukončení solidifikace (G'_s) jsou uvedeny v následující tabulce.

Tabulka 3: Vlastnosti hydrogelu připraveného s přídavkem infůzního léčivého přípravku

Parametr	hodnota
HRP (U/ml)	0,075
crossSH-TA(mg/g)	10,25
CaCl₂ (pmol/ml)	0,25
Brilantní modř FCF (mg/g)	0,01
NaCl (mg/g)	9
Tg(s)	30,5
G'3 min (Pa)	215
G's (Pa)	788

-9CZ 38923 UI

Příklad 4: Sada roztoků pro přípravu gelu s obsahem léčivých látek ciprofloxacin a metronidazol, příprava hydrogelu

Tabulka 4: Složení sady roztoků pro přípravu hydrogelu

Tabulka 5: Vlastnosti derivátu SH-TA po terminální parní sterilizaci

Vlastnosti roztoku C	Hodnota
M_w SH-TA (g/mol)	2,16 x 10⁵
DS SH-TA	2,4
Viskozita 4 % roztoku (mPa.s)	2196

Roztok A sady (30g) je smí sen s 15 ml léčivého přípravku Ciprinol 100 mg/10 ml koncentrát pro infůzní roztok (výrobce KRKÁ, d.d.,) a 15 ml léčivého přípravku Metronidazole Noridem 5 mg/ml infůzní roztok (výrobce Noridem Enterprises Eimited) za vzniku prekurzorového roztoku gelu p(A). Roztok B sady (30 g) je smísen s 30 g roztoku C za vzniku prekurzorového roztoku p(B+C). Pro přípravu hydrogelu jsou prekurzorové roztoky p(A) a p(B+C) smí seny v poměru 1:1.

Takto připravený hydrogel obsahuje enzym křenovou peroxidázu, kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivát hyaluronanu (crossSH-TA), barvivo brilantní modř FCF, chlorid vápenatý, chlorid sodný a léčivé látky ciprofloxacin a metronidazol. Finální složení hydrogelu včetně hodnot gelačního času (Tg) a hodnoty elatické modulu G'po 3 min (G's mm) a po ukončení solidifíkace (G'_s) jsou uvedeny v následující tabulce.

-10 CZ 38923 UI

Tabulka 6: Vlastnosti hydrogelu připraveného s přídavkem infůzního léčivého přípravku

Parametr	hodnota
HRP (U/ml)	0,075
Cross SH-TA (mg/g)	10,25
CaCF (pmol/ml)	0,25
Brilantní modř FCF (mg/g)	0,01
NaCl (mg/g)	6,75
Ciprofloxacin (mg/g)	1,25
Metronidazol (mg/g)	0,625
Tg(s)	51
G'3 min (Pa)	102
G's (Pa)	581

Příklad 5: Sada roztoků pro přípravu gelu s obsahem léčivých látek gentamicin a metronidazol, 5 příprava hydrogelu

ίο Tabulka 7: Složení sady roztoků pro přípravu hydrogelu

-11 CZ 38923 UI

Tabulka 8: Vlastnosti derivátu SH-TA po terminální parní sterilizaci

Roztok A sady (20 g) je smísen s 2 ml léčivého přípravku Gentamicin Lek 80 mg/2 ml injekční/infůzní roztok (výrobce Lek Pharmaceuticals d.d.) a 18 ml léčivého přípravku Metronidazole Noridem 5 mg/ml infůzní roztok (výrobce Noridem Enterprises Limited) za vzniku prekurzorového roztoku gelu p(A). Roztok B sady (20 g) je smísen s 20 g roztoku C za vzniku prekurzorového roztoku p(B+C). Pro přípravu hydrogelu jsou prekurzorové roztoky p(A) a p(B+C) smí seny v objemovém poměru 1:1.

Takto připravený hydrogel obsahuje enzym křenovou peroxidázu, kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivát hyaluronanu (crossSH-TA), barvivo brilantní modř FCF, chlorid vápenatý, chlorid sodný a léčivé látky gentamicin a metronidazol. Finální složení hydrogelu včetně hodnot gelačního času (Tg) a hodnoty elatické modulu G'po 3 min (G's mm) a po ukončení solidifikace (G'_s) jsou uvedeny v následující tabulce.

Tabulka 9: Vlastnosti hydrogelu připraveného s přídavkem infuzního léčivého přípravku

Parametr	hodnota
HRP (U/ml)	0,075
crossSH-TA (mg/ml)	10,25
CaCF (pmol/ml)	0,25
Brilantní modř FCF (mg/g)	0,01
NaCl (mg/g)	6,75
Gentamicin (mg/g)	1
Metronidazol (mg/g)	1,125
Tg(s)	52
G'3 min (Pa)	111
G's (Pa)	511

Příklad 6: Sada roztoků pro přípravu gelu s obsahem infuzního roztoku, příprava hydrogelu

-12 CZ 38923 UI

Tabulka 10: Složení sady roztoků pro přípravu hydrogelu

Roztok A (20 g)	Množství (g)	koncentrace	jednotka
HRP	q.s.	0,4	U/ml
CaCl₂.2H₂O	0,0029	1	mmol/1
SH-TA	0,02	1	mg/g
Brilantní modř FCF (E133)	0,0008	0,04	mg/g
NaCl	0,27	13,5	mg/g
Voda	19,7
Roztok B (20 g)	Množství (g)	koncentrace	jednotka
H₂O₂	0,0062	9,13	mmol/1
Voda	20
Roztok C (20 g)	Množství (g)	koncentrace	jednotka
SH-TA	0,8	40	mg/g
NaCl	0,27	13,5	mg/g
Voda	18,9

Tabulka 11: +Vlastnosti derivátu SH-TA po terminální parní sterilizaci

Vlastnosti roztoku C	Hodnota
M_w SH-TA (g/mol)	2,14 x 10⁵
DS SH-TA	2,4
Viskozita 4 % roztoku (mPa.s)	2162

Roztok A sady (20 g) je smísen s 20 ml léčivého přípravku Fyziologický roztok Viaflo infůzní roztok (NaCl 9 g/1) (výrobce Baxter SA) za vzniku prekurzorového roztoku gelu p(A). Roztok B sady (20 g) je smísen s 20 g roztoku C za vzniku prekurzorového roztoku p(B+C). Pro přípravu hydrogelu jsou prekurzorové roztoky p(A) ap(B+C) smí seny v objemovém poměru 1:1.

Tabulka 12: Vlastnosti hydrogelu připraveného s přídavkem infuzního léčivého přípravku

Parametr	hodnota
HRP (U/ml)	0,1
crossSH-TA(mg/g)	10,25
CaCl₂ (pmol/ml)	0,25
Brilantní modř FCF (mg/g)	0,01
NaCl (mg/g)	9
Tg(s)	30
G'3 min (Pa)	200
G's (Pa)	899

-13 CZ 38923 UI

Příklad 7: Sada roztoků pro přípravu gelu s obsahem léčivých látek ciprofloxacin a metronidazol, příprava hydrogelu

Tabulka 13: Složení sady roztoků pro přípravu hydrogelu

Tabulka 14: Vlastnosti derivátu SH-TA po terminální parní sterilizaci

Vlastnosti roztoku C	Hodnota
M_w SH-TA (x 10³ g/mol)	214
DS SH-TA	2,4
Viskozita 4 % roztoku (mPa.s)	2162

Roztok A sady (20 g) je smí sen s 10 ml léčivého přípravku Ciprinol 100 mg/10 ml koncentrát pro infůzní roztok (výrobce KRKÁ, d.d.,) a 10 ml léčivého přípravku Metronidazole Noridem 5 mg/ml infůzní roztok (výrobce Noridem Enterprises Limited) za vzniku prekurzorového roztoku gelu p(A). Roztok B sady (20 g) je smí sen s 20 g roztoku C za vzniku prekurzorového roztoku p(B+C). Pro přípravu hydrogelu jsou prekurzorové roztoky p(A) a p(B+C) smí seny v objemovém poměru 1:1.

-14 CZ 38923 UI

Tabulka 15: Vlastnosti hydrogelu připraveného s přídavkem infuzního léčivého přípravku

Parametr	hodnota
HRP (U/ml)	0,1
Cross SH-TA (mg/g)	10,25
CaCF (pmol/ml)	0,25
Brilantní modř FCF (mg/g)	0,01
NaCl (mg/g)	6,75
Ciprofloxacin (mg/g)	1,25
Metronidazol (mg/g)	0,625
Tg(s)	44
G'3 min (Pa)	141
G's (Pa)	966

Příklad 8: Sada roztoků pro přípravu gelu s obsahem léčivých látek gentamicin a metronidazol, 5 příprava hydrogelu

to Tabulka 16: Složení sady roztoků pro přípravu hydrogelu

Tabulka 17:Vlastnosti derivátu SH-TA po terminální parní sterilizaci

Vlastnosti roztoku C	Hodnota
M_w SH-TA (x 10³ g/mol)	216
DS SH-TA	2,4
Viskozita 4 % roztoku (mPa.s)	2196

Roztok A sady (20 g) je smísen s 2 ml léčivého přípravku Gentamicin Lek 80 mg/2 ml injekční/infůzní roztok (výrobce Lek Pharmaceuticals d.d.) a 18 ml léčivého přípravku Metronidazole Noridem 5 mg/ml infůzní roztok (výrobce Noridem Enterprises Limited) za vzniku

-15 CZ 38923 UI prekurzorového roztoku gelu p(A). Roztok B sady (20 g) je smísen s 20 g roztoku C za vzniku prekurzorového roztoku p(B+C). Pro přípravu hydrogelu jsou prekurzorové roztoky p(A) ap(B+C) smíseny v objemovém poměru 1:1.

Tabulka 18: Vlastnosti hydrogelu připraveného s přídavkem infůzního léčivého přípravku

Parametr	hodnota
HRP (U/ml)	0,1
crossSH-TA (mg/ml)	10,25
CaCF (pmol/ml)	0,25
Brilantní modř FCF (mg/g)	0,01
NaCl (mg/g)	6,75
Gentamicin (mg/g)	1
Metronidazol (mg/g)	1,125
Tg(s)	53
G'3 min (Pa)	107
G's (Pa)	570

Příklad 9: Sada roztoků pro přípravu gelu s obsahem infůzního roztoku, příprava hydrogelu

Tabulka 19: Složení sady roztoků pro přípravu hydrogelu

Roztok A (20 g)	Množství (g)	koncentrace	jednotka
HRP	q.s.	0,54	U/ml
CaCl₂.2H₂O	0,0029	1	mmol/1
SH-TA	0,02	1	mg/g
Brilantní modř FCF (E133)	0,0008	0,04	mg/g
NaCl	0,27	13,5	mg/g
Voda	19,7
Roztok B (20 g)	Množství (g)	koncentrace	jednotka
H₂O₂	0,0062	9,13	mmol/1
Voda	20
Roztok C (20 g)	Množství (g)	koncentrace	jednotka
SH-TA	0,8	40	mg/g
NaCl	0,27	13,5	mg/g
Voda	18,9

-16 CZ 38923 UI

Tabulka 20: Vlastnosti derivátu SH-TA po terminální parní sterilizaci

Vlastnosti roztoku C	Hodnota
M_w SH-TA (x 10³ g/mol)	334
DS SH-TA	2,3
Viskozita 4 % roztoku (mPa.s)	5650

Tabulka 21: Vlastnosti hydrogelu připraveného s přídavkem infuzního léčivého přípravku

Parametr	hodnota
HRP (U/ml)	0,135
crossSH-TA(mgZg)	10,25
CaCF (pmol/ml)	0,25
Brilantní modř FCF (mg/g)	0,01
NaCl (mg/g)	9
Tg(s)	15
G'3 min (Pa)	528
G's (Pa)	1022

Příklad 10: Sada roztoků pro přípravu gelu s obsahem léčivých látek ciprofloxacin a metronidazol, příprava hydrogelu

- 17 CZ 38923 UI

Tabulka 22: Složení sady roztoků pro přípravu hydrogelu

Tabulka 23: Vlastnosti derivátu SH-TA po terminální parní sterilizaci

Vlastnosti roztoku C	Hodnota
M_w SH-TA (kDa)	334
DS SH-TA	2,3
Viskozita 4 % roztoku (mPa.s)	5650

-18 CZ 38923 UI

Tabulka 24: Vlastnosti hydrogelu připraveného s přídavkem infuzního léčivého přípravku

Parametr	hodnota
HRP (U/ml)	0,135
Cross SH-TA (mg/g)	10,25
CaCF (pmol/ml)	0,25
Brilantní modř FCF (mg/g)	0,01
NaCl (mg/g)	6,75
Ciprofloxacin (mg/g)	1,25
Metronidazol (mg/g)	0,625
Tg(s)	19
G'3 min (Pa)	323
G's (Pa)	729

Příklad 11: Sada roztoků pro přípravu gelu s obsahem léčivých látek gentamicin a metronidazol, 5 příprava hydrogelu

Tabulka 25: Složení sady roztoků pro přípravu hydrogelu

Roztok A (20 g)	Množství (g)	koncentrace	jednotka
HRP	q.s.	0,54	U/ml
CaCl₂.2H₂O	0,0029	1	mmol/l
SH-TA	0,02	1	mg/g
Brilantní modř FCF (E133)	0,0008	0,04	mg/g
NaCl	0,27	13,5	mg/g
Voda	19,7
Roztok B (20 g)	Množství (g)	koncentrace	jednotka
H₂O₂	0,0062	9,13	mmol/l
Voda	20
Roztok C (20 g)	Množství (g)	koncentrace	jednotka
SH-TA	0,8	40	mg/g
NaCl	0,27	13,5	mg/g
Voda	18,9

-19 CZ 38923 UI

Tabulka 26 Vlastnosti derivátu SH-TA po terminální parní sterilizaci

Roztok A sady (20 g) je smísen s 2 ml léčivého přípravku Gentamicin Lek 80 mg/2 ml injekční/infůzní roztok (výrobce Lek Pharmaceuticals d.d.) a 18 ml léčivého přípravku Metronidazole Noridem 5 mg/ml infůzní roztok (výrobce Noridem Enterprises Limited) za vzniku prekurzorového roztoku gelu p(A). Roztok B sady (20 g) je smísen s 20 g roztoku C za vzniku prekurzorového roztoku p(B+C). Pro přípravu hydrogelu jsou prekurzorové roztoky p(A) a p(B+C) smíseny v poměru 1:1.

Tabulka 27: Vlastnosti hydrogelu připraveného s přídavkem infuzního léčivého přípravku

Parametr	hodnota
HRP (U/ml)	0,135
crossSH-TA (mg/ml)	10,25
CaCF (pmol/ml)	0,25
Brilantní modř FCF (mg/g)	0,01
NaCl (mg/g)	6,75
Gentamicin (mg/g)	1
Metronidazol (mg/g)	1,125
Tg(s)	26
G'3 min (Pa)	429
G's (Pa)	857

Příklad 12: Sada roztoků pro přípravu gelu s obsahem infuzního roztoku, příprava hydrogelu

-20 CZ 38923 UI

Tabulka 28: Složení sady roztoků pro přípravu hydrogelu

Roztok A (20 g)	Množství (g)	koncentrace	jednotka
HRP	q.s.	0,6	U/ml
CaCl₂.2H₂O	0,0029	1	mmol/1
SH-TA	0,02	1	mg/g
Brilantní modř FCF (E133)	0,0008	0,04	mg/g
NaCl	0,27	13,5	mg/g
Voda	19,7
Roztok B (20 g)	Množství (g)	koncentrace	jednotka
H₂O₂	0,0062	9,13	mmol/1
Voda	20
Roztok C (20 g)	Množství (g)	koncentrace	jednotka
SH-TA	0,8	40	mg/g
NaCl	0,27	13,5	mg/g
Voda	18,9

Tabulka 29: Vlastnosti derivátu SH-TA po terminální parní sterilizaci

Roztok A sady (20 g) je smísen s 20 ml léčivého přípravku Fyziologický roztok Viaflo infůzní roztok (NaCl 9 g/1) (výrobce Baxter SA) za vzniku prekurzorového roztoku gelu p(A). Roztok B sady (20 g) je smísen s 20 g roztoku C za vzniku prekurzorového roztoku p(B+C). Pro přípravu 10 hydrogelu jsou prekurzorové roztoky p(A) ap(B+C) smí seny v objemovém poměru 1:1.

Takto připravený hydrogel obsahuje enzym křenovou peroxidázu, kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivát hyaluronanu (crossSH-TA), barvivo brilantní modř FCF, chlorid vápenatý a chlorid sodný. Finální složení hydrogelu včetně hodnot gelačního času (Tg) a hodnoty 15 elatické modulu G'po 3 min (G's mm) a po ukončení solidifikace (G'_s) jsou uvedeny v následující tabulce.

-21 CZ 38923 UI

Tabulka 30: Vlastnosti hydrogelu připraveného s přídavkem infuzního léčivého přípravku

Parametr	hodnota
HRP (U/ml)	0,15
crossSH-TA(mgZg)	10,25
CaCF (pmol/ml)	0,25
Brilantní modř FCF (mg/g)	0,01
NaCl (mg/g)	9
Tg(s)	11
G'3 min (Pa)	499
G's (Pa)	796

Příklad 13: Sada roztoků pro přípravu gelu s obsahem léčivých látek ciprofloxacin a metronidazol

Tabulka 31: Složení sady roztoků pro přípravu hydrogelu

Roztok A (20 g)	Množství (g)	koncentrace	jednotka
HRP	q.s.	0,6	U/ml
CaCl₂.2H₂O	0,029	1	mmol/1
SH-TA	0,02	1	mg/g
Brilantní modř FCF (E133)	0,0008	0,04	mg/g
NaCl	0,27	13,5	mg/g
Voda	19,7
Roztok B (20 g)	Množství (g)	koncentrace	jednotka
H₂O₂	0,0062	9,13	mmol/1
Voda	20
Roztok C (20 g)	Množství (g)	koncentrace	jednotka
SH-TA	0,8	40	mg/g
NaCl	0,27	13,5	mg/g
Voda	18,9

-22 CZ 38923 UI

Tabulka 32: Vlastnosti derivátu SH-TA po terminální parní sterilizaci

Roztok A sady (30 g) je smísen s 15 ml léčivého přípravku Ciprofloxacin KABI 200 mg/100 ml koncentrát pro infuzní roztok (výrobce Fresenius Kabi s.r.o.) a 15 ml léčivého přípravku Metronidazole Noridem 5 mg/ml infuzní roztok (výrobce Noridem Enterprises Limited) za vzniku prekurzorového roztoku gelu p(A). Roztok B sady (30 g) je smísen s 30 g roztoku C za vzniku prekurzorového roztoku p(B+C). Pro přípravu hydrogelu jsou prekurzorové roztoky p(A) a p(B+C) smíseny v objemovém poměru 1:1.

Tabulka 33: Vlastnosti hydrogelu připraveného s přídavkem infuzního léčivého přípravku

Parametr	hodnota
HRP (U/ml)	0,15
CrossSH-TA (mg/g)	10,25
CaCF (pmol/ml)	0,25
Brilantní modř FCF (mg/g)	0,01
NaCl (mg/g)	6,75
Ciprofloxacin (mg/g)	0,25
Metronidazol (mg/g)	0,625
Tg(s)	24
G'3 min (Pa)	356
G's (Pa)	942

-23 CZ 38923 UI

Příklad 14: Sada roztoků pro přípravu gelu s obsahem léčivých látek gentamicin a metronidazol, příprava hydrogelu

Tabulka 34: Složení sady roztoků pro přípravu hydrogelu

Tabulka 35: Vlastnosti derivátu SH-TA po terminální parní sterilizaci

Vlastnosti roztoku C	Hodnota
M_w SH-TA (kDa)	216
DS SH-TA	2,4
Viskozita 4 % roztoku (mPa.s)	2196

Roztok A sady (30g) je smísen s 3 ml léčivého přípravku Gentamicin Lek 80 mg/2 ml injekční/infůzní roztok (výrobce Lek Pharmaceuticals d.d.) a 27 ml léčivého přípravku Metronidazole Noridem 5 mg/ml infůzní roztok (výrobce Noridem Enterprises Limited) za vzniku prekurzorového roztoku gelu p(A). Roztok B sady (30 g) je smísen s 30 g roztoku C za vzniku prekurzorového roztoku p(B+C). Pro přípravu hydrogelu jsou prekurzorové roztoky p(A) a p(B+C) smíseny v objemovém poměru 1:1.

-24 CZ 38923 UI

Tabulka 36: Vlastnosti hydrogelu připraveného s přídavkem infuzního léčivého přípravku

Parametr	hodnota
HRP (U/ml)	0,15
crossSH-TA (mg/ml)	10,25
CaCF (pmol/ml)	0,25
Brilantní modř FCF (mg/g)	0,01
NaCl (mg/g)	6,75
Gentamicin (mg/g)	1
Metronidazol (mg/g)	1,125
Tg(s)	19
G'3 min (Pa)	424
G's (Pa)	686

Příklad 15: Sada roztoků pro přípravu gelu s obsahem léčivých látek clindamycin a gentamicin, 5 příprava hydrogelu

Tabulka 37: Složení sady roztoků pro přípravu hydrogelu

Roztok A (20 g)	Množství (g)	koncentrace	jednotka
HRP	q.s.	0,48	U/ml
CaCl₂.2H₂O	0,0029	1	mmol/1
SH-TA	0,02	1	mg/g
Brilantní modř FCF (E133)	0,0008	0,04	mg/g
NaCl	0,27	13,5	mg/g
Voda	19,7
Roztok B (20 g)	Množství (g)	koncentrace	jednotka
H₂O₂	0,0062	10,3	mmol/1
Voda	20
Roztok C (20 g)	Množství (g)	koncentrace	jednotka
SH-TA	0,8	40	mg/g
NaCl	0,27	13,5	mg/g
Voda	18,9

-25 CZ 38923 UI

Tabulka 38: Vlastnosti derivátu SH-TA po terminální parní sterilizaci

Roztok A sady (20 g) je smísen s 2 ml léčivého přípravku Gentamicin Uek 80 mg/2 ml injekční/infůzní roztok (výrobce Uek Pharmaceuticals d.d.), 2 ml léčivého přípravku Clindamycin Kabi 150 mg/ml injekční roztok a léčivého přípravku Fyziologický roztok Viaflo infůzní roztok (NaCl 9 g/1) (výrobce Baxter SA) za vzniku prekurzorového roztoku gelu p(A). Roztok B sady (20 g) je smísen s 20 g roztoku C za vzniku prekurzorového roztoku p(B+C). Pro přípravu hydrogelu jsou prekurzorové roztoky p(A) a p(B+C) smí seny v poměru 1:1.

Tabulka 39: Vlastnosti hydrogelu připraveného s přídavkem infuzního léčivého přípravku

Parametr	hodnota
HRP (U/ml)	0,15
crossSH-TA (mg/ml)	10,25
CaCT (pmol/ml)	0,25
Brilantní modř FCF (mg/g)	0,01
NaCl (mg/g)	6,75
Gentamicin (mg/g)	1
Clindamicin (mg/g)	3,75
Tg(s)	45
G'3 min (Pa)	171
G's (Pa)	633

Příklad 16: Sada roztoků pro přípravu gelu s obsahem léčivé láteky lidokain, příprava hydrogelu

-26 CZ 38923 UI

Tabulka 40: Složení sady roztoků pro přípravu hydrogelu

Tabulka 41:Vlastnosti derivátu SH-TA po terminální parní sterilizaci

Roztok A sady (20 g) je smísen s 18 ml léčivého přípravku Fyziologický roztok Viaflo infůzní roztok (NaCl 9 g/1) (výrobce Baxter SA), 2 ml léčivého přípravku Lidocaine Egis injekční roztok (výroce Egis Pharmaceuticals PLC) za vzniku prekurzorového roztoku gelu p(A). Roztok B sady 10 (20 g) je smísen s 20 g roztoku C za vzniku prekurzorového roztoku p(B+C). Pro přípravu hydrogelu jsou prekurzorové roztoky p(A) a p(B+C) smí seny v poměru 1:1.

Takto připravený hydrogel obsahuje enzym křenovou peroxidázu, kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivát hyaluronanu (crossSH-TA), barvivo brilantní modř FCF, chlorid 15 vápenatý, chlorid sodný a léčivé látky gentamicin a metronidazol. Finální složení hydrogelu včetně hodnot gelačního času (Tg) a hodnoty elatické modulu G'po 3 min (G's mm) a po ukončení solidifikace (G'_s) jsou uvedeny v následující tabulce.

-27 CZ 38923 UI

Tabulka 42: Vlastnosti hydrogelu připraveného s přídavkem infuzního léčivého přípravku

Parametr	hodnota
HRP (U/ml)	0,18
crossSH-TA (mg/ml)	10,25
CaCF (pmol/ml)	0,25
Brilantní modř FCF (mg/g)	0,01
NaCl (mg/g)	6,75
Lidokain
Tg(s)	45
G'3 min (Pa)	171
G's (Pa)	633

Příklad 17: Vliv vlastností derivátu SH-TA na přípravu hydrogelů s obsahem infůsního roztoku

Byl psán vliv vlastností derivátu (M_w a DS) a z něj připravených roztoků na rychlost vzniku gelu a viskoelastické parametry připravených hydrogelů. Pro popis tohoto vztahu byly vybrány sterilní roztoky C roztoky, které obsahovaly deriváty SH-TA s M_w v rozsahu 1,8 x 10⁵ g/mol až 3,34 x 10⁵ g/mol jejichž DS se pohyboval v rozmezí 2 až 3 %.

Roztoky sady byly připraveny podle postupu z příkladu 2. Následující tabulky popisují složení použitých roztoků A a B.

Tabulka 43: Složení sady roztoků pro přípravu hydrogelu

Roztok A sady (20 g) byl smísen s 20 ml léčivého přípravku Fyziologický roztok Viaflo infůzní roztok (NaCl 9 g/1) (výrobce Baxter SA) za vzniku prekurzorového roztoku gelu p(A). Roztok B sady (20 g) je smísen s 20 g roztoku C za vzniku prekurzorového roztoku p(B+C). Pro přípravu 20 hydrogelu jsou prekurzorové roztoky p(A) a p(B+C) smíseny v objemovém poměru 1:1.

Takto připravené hydrogel obsahuje enzym křenovou peroxidázu, kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivát hyaluronanu (crossSH-TA), barvivo brilantní modř FCF, chlorid vápenatý a chlorid sodný. Finální složení hydrogelu včetně hodnot gelačního času (Tg) a hodnoty

-28 CZ 38923 UI elatické modulu G'po 3 min (G's mm) a po ukončení solidifikace (G'_s) jsou uvedeny v následující tabulce.

Tabulka 44: Příklady přípravy hydrogelu s obsahem infusního roztoku s využitím roztoků C obsahující deriváty SH-TA lišícími se v parametrech M_w a DS

Infusní roztok	Koncentrace SH-TA (mg/ml)	Viskozita roztoku C (mPa.s)	M_wSH-TA roztoku C (xlO³g/mol)	DS (%)	Tg (s)	G'3 min (Pa)	G (Pa)
0,9 %NaCl	40	1183	181	2,5	16,6	660	1156
0,9 %NaCl	40	1212	188	2,4	18,3	575	1004
0,9 %NaCl	40	1598	193	2,4	15,9	514	850
0,9 %NaCl	40	2463	236	3	6,7	942	1503
0,9 %NaCl	40	3231	266	2,2	13,9	552	808
0,9 %NaCl	40	4681	304	2	10,8	456	697
0,9%NaCl	40	5650	334	2,3	14,6	528	1022

Připravené gely splňují podmínku, že po smísení alespoň dvou roztoků p(A) a p(B+C) dosahují bodu gelace v rozmezí 5 až 70 s, s výhodou 15 až 60 s , výhodněji 25 až 50 s, přičemž nejdéle do 3 min po smísení roztoků dosahuje hodnota jeho elastického modulu 100 až 1000 Pa, s výhodou 100 až 600 Pa, výhodněji 100 až 500 Pa, a po dokončení procesu solidifikace je jejich elastický modulus v rozmezí 500 až 2000 Pa, s výhodou 600 až 1300 Pa, výhodněji 700 až 1200 Pa.

Příklad 18: Vliv vlastností derivátu SH-TA na přípravu hydrogelů s obsahem léčivých látek ciprofloxacin a metronidazol

-29 CZ 38923 UI

Tabulka 45: Složení sady roztoků pro přípravu hydrogelu

Roztok A sady (20 g) je smísen s 10 ml léčivého přípravku Ciprinol 100 mg/10 ml koncentrát pro infůzní roztok (výrobce KRKÁ, d.d.,) a 10 ml léčivého přípravku Metronidazole Noridem 5 mg/ml infůzní roztok (výrobce Noridem Enterprises Limited) za vzniku prekurzorového roztoku gelu p(A). Roztok B sady (20 g) je smísen s 20 g roztoku C za vzniku prekurzorového roztoku p(B+C). Pro přípravu hydrogelu jsou prekurzorové roztoky p(A) a p(B+C) smí seny v objemovém poměru 1:1.

Tabulka 46: Příklady přípravy hydrogelu s obsahem léčivých látek ciprofloxacin a metronidazol s využitím roztoků C obsahující deriváty SH-TA lišícími se v parametrech M_w a DS

Léčivé látky	Koncentrace SH-TA (mg/ml)	Viskozita roztoku C (mPa.s)	M_w SHTA roztoku C (x 10³g/mol)	DS (%)	Tg (s)	G'3 min (Pa)	G (Pa)
CIP/MET	40	1183	181	2,5	33,8	284	519
CIP/MET	40	1212	188	2,4	32,7	301	551
CIP/MET	40	1598	193	2,4	28,0	398	837
CIP/MET	40	2463	236	3,0	17,3	696	832
CIP/MET	40	3231	266	2,2	24,6	382	659
CIP/MET	40	4681	304	2,0	22,1	363	823
CIP/MET	40	5650	334	2,3	18,8	323	729

-30 CZ 38923 UI

Příklad 19: Vliv vlastností derivátu SH-TA na přípravu hydrogelů s obsahem léčivých látek gentamicin a metronidazol

Tabulka 47: Složení sady roztoků pro přípravu hydrogelů

Roztok A sady (20 g) je smísen s 2 ml léčivého přípravku Gentamicin Lek 80 mg/2 ml injekční/infuzní roztok (výrobce Lek Pharmaceuticals d.d.) a 18 ml léčivého přípravku Metronidazole Noridem 5 mg/ml infuzní roztok (výrobce Noridem Enterprises Limited) za vzniku prekurzorového roztoku gelu p(A). Roztok B sady (20 g) je smísen s 20 g roztoku C za vzniku prekurzorového roztoku p(B+C). Pro přípravu hydrogelů jsou prekurzorové roztoky p(A) ap(B+C) smíseny v objemovém poměru 1:1.

Takto připravený hydrogel obsahuje enzym křenovou peroxidázu, kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivát hyaluronanu (crossSH-TA), barvivo brilantní modř FCF, chlorid vápenatý, chlorid sodný a léčivé látky gentamicin a metronidazol. Finální složení hydrogelů včetně hodnot gelačního času (Tg) a hodnoty elatické modulu G'po 3 min (G's mm) a po ukončení solidifikace (G'_s) jsou uvedeny v následující tabulce.

-31 CZ 38923 UI

Tabulka 48: Příklady přípravy hydrogelu s obsahem infusního roztoku s využitím roztoků C obsahující deriváty SH-TA lišícími se v parametrech M_w a DS

Léčivé látky	Koncentrace SH-TA (mg/ml)	Viskozita roztoku C (mPa.s)	M_w SHTA roztoku C (x 10³g/mol)	DS (%)	Tg (s)	G'3 min (Pa)	G (Pa)
GEN/MET	40	1183	181	2,5	24,7	387	727
GEN/MET	40	1212	188	2,4	27,4	380	651
GEN/MET	40	1598	193	2,4	23,5	426	710
GEN/MET	40	2463	236	3	13,7	660	1156
GEN/MET	40	3231	266	2,2	21,0	390	665
GEN/MET	40	4681	304	2	20,8	348	579
GEN/MET	40	5650	334	2,3	26,1	429	857
GEN/MET	40	1183	181	2,5	24,7	387	727
GEN/MET	40	1212	188	2,4	27,4	380	651
GEN/MET	40	1598	193	2,4	23,5	426	710

Příklad 20: Vliv aktivity roztoku A na přípravu hydrogelů s obsahem infusního roztoku

Byl psán vliv aktivity křenové peroxidázy v roztoku A na rychlost vzniku gelu a viskoelastické parametry připravených hydrogelů. Pro popis tohoto vztahu byly vybrány roztoky A o aktivitě HRP 15 v rozmezí 0,3 až 0,6 U/ml.

-32 CZ 38923 UI

Tabulka 49: Složení sady roztoků pro přípravu hydrogelu

Roztok A (20 g)	Množství (g)	koncentrace	jednotka
HRP	q.s.	0,3-0,6	U/ml
CaCl₂.2H₂O	0,0029	1	mmol/l
SH-TA	0,02	1	mg/g
Brilantní modř FCF (E133)	0,0008	0,04	mg/g
NaCl	0,27	13,5	mg/g
Voda	19,7
Roztok B (20 g)	Množství (g)	koncentrace	jednotka
H₂O₂	0,0062	9,13	mmol/l
Voda	20
Roztok C (20 g)	Množství (g)	koncentrace	jednotka
SH-TA	0,8	40	mg/g
NaCl	0,27	13,5	mg/g
Voda	18,9

Tabulka 50: Vlastnosti derivátu SH-TA po terminální parní sterilizaci

Vlastnosti roztoku C	Hodnota
M_w SH-TA (x 10³ Da)	216
DS SH-TA	2,4
Viskozita 4 % roztoku (mPa.s)	2196

Roztok A sady (20 g) byl smísen s 20 ml léčivého přípravku Fyziologický roztok Viaflo infůzní roztok (NaCl 9 g/l) (výrobce Baxter SA) za vzniku prekurzorového roztoku gelu p(A). Roztok B sady (20 g) je smísen s 20 g roztoku C za vzniku prekurzorového roztoku p(B+C). Pro přípravu 10 hydrogelu jsou prekurzorové roztoky p(A) a p(B+C) smíseny v objemovém poměru 1:1.

Takto připravené hydrogel obsahuje enzym křenovou peroxidázu, kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivát hyaluronanu (crossSH-TA), barvivo brilantní modř FCF, chlorid vápenatý a chlorid sodný. Finální složení hydrogelu včetně hodnot gelačního času (Tg) a hodnoty 15 elatické modulu G'po 3 min (G's mm) a po ukončení solidifikace (G'_s) jsou uvedeny v následující tabulce.

-33 CZ 38923 UI

Tabulka 51: Příklady přípravy hydrogelu s obsahem infůsního roztoku s využitím roztoků A obsahující křenovou peroxidázu o aktivitě 0,3 až 0,6 U/ml

Aktivita HRP roztoku A (U/ml)	Infusin' roztok	Koncentrace SH-TA (mg/ml)	M_w SHTA roztoku C (x 10³g/mol)	Tg (s)	G'3 min (Pa)	G (Pa)
0,3	0,9% NaCl	40	216	27,9	233	666
0,4	0,9% NaCl	40	216	29,0	226	848
0,6	0,9% NaCl	40	216	10,6	499	663

Příklad 21: Vliv aktivity roztoku A na přípravu hydrogelů s obsahem hydrogelů s obsahem léčivých látek ciprofloxacin a metronidazol

Byl psán vliv aktivity křenové peroxidázy v roztoku A na rychlost vzniku gelu a viskoelastické parametry připravených hydrogelů. Pro popis tohoto vztahu byly vybrány roztoky A o aktivitě HRP v rozmezí 0,3 až 0,6 U/ml.

Tabulka 52: Složení sady roztoků pro přípravu hydrogelu

Roztok A (20 g)	Množství (g)	koncentrace	jednotka
HRP	q.s.	0,3-0,6	U/ml
CaCl₂.2H₂O	0,0029	1	mmol/1
SH-TA	0,02	1	mg/g
Brilantní modř FCF (E133)	0,0008	0,04	mg/g
NaCl	0,27	13,5	mg/g
Voda	19,7
Roztok B (20 g)	Množství (g)	koncentrace	jednotka
H₂O₂	0,0062	9,13	mmol/1
Voda	20
Roztok C (20 g)	Množství (g)	koncentrace	jednotka
SH-TA	0,8	40	mg/g
NaCl	0,27	13,5	mg/g
Voda	18,9

-34 CZ 38923 UI

Tabulka 53: Vlastnosti derivátu SH-TA po terminální parní sterilizaci

Roztok A sady (20 g) je smí sen s 10 ml léčivého přípravku Ciprinol 100 mg/10 ml koncentrát pro infuzní roztok (výrobce KRKÁ, d.d.,) a 10 ml léčivého přípravku Metronidazole Noridem 5 mg/ml infuzní roztok (výrobce Noridem Enterprises Limited) za vzniku prekurzorového roztoku gelu p(A). Roztok B sady (20 g) je smí sen s 20 g roztoku C za vzniku prekurzorového roztoku p(B+C). Pro přípravu hydrogelu jsou prekurzorové roztoky p(A) a p(B+C) smí seny v poměru 1:1.

Tabulka 54: Příklady přípravy hydrogelu s obsahem léčivých látek ciprofloxacin a metronidazol s využitím roztoků A obsahující křenovou peroxidázu o aktivitě 0,3 až 0,6 U/ml

Aktivita HRP roztoku A (U/ml)	Léčivé látky	Koncentrace SH-TA (mg/ml)	M_w SH-TA roztoku C (x 10³ g/mol)	Tg (s)	G'3 min (Pa)	G (Pa)
0,3	CIP/MET	40	216	51,4	102	581
0,4	CIP/MET	40	216	44,0	139	797
0,6	CIP/MET	40	216	21,3	384	843

Připravené gely splňují podmínku, že po smísení alespoň dvou roztoků p(A) a p(B+C) dosahují bodu gelace v rozmezí 5 až 70 s, s výhodou 15 až 60 s , výhodněji 25 až 50 s, přičemž nejdéle do 3 min po smísení roztoků dosahuje hodnota jeho elastického modulu 100 až 1000 Pa, s výhodou 100 až 600 Pa, výhodněji 100 až 500 Pa, a po dokončení procesu solidifíkace je jejich elastický modulus v rozmezí 500 až 2000 Pa, s výhodou 600 až 1300 Pa, výhodněji 700 až 1200 Pa.

Příklad 22: Vliv aktivity roztoku A na přípravu hydrogelů s obsahem hydrogelů s obsahem léčivých látek gentamicin a metronidazol

-35 CZ 38923 UI

Tabulka 55: Složení sady roztoků pro přípravu hydrogelu

Tabulka 56: Vlastnosti derivátu SH-TA po terminální parní sterilizaci

Roztok A sady (20 g) je smísen s 2 ml léčivého přípravku Gentamicin Lek 80 mg/2 ml injekční/infůzní roztok (výrobce Lek Pharmaceuticals d.d.) a 18 ml léčivého přípravku Metronidazole Noridem 5 mg/ml infůzní roztok (výrobce Noridem Enterprises Limited) za vzniku 10 prekurzorového roztoku gelu p(A). Roztok B sady (20 g) je smísen s 20 g roztoku C za vzniku prekurzorového roztoku p(B+C). Pro přípravu hydrogelu jsou prekurzorové roztoky p(A) ap(B+C) smíseny v poměru 1:1.

Takto připravený hydrogel obsahuje enzym křenovou peroxidázu, kovalentně zesítěný 15 hydroxyfenylový derivát hyaluronanu (crossSH-TA), barvivo brilantní modř FCF, chlorid vápenatý, chlorid sodný a léčivé látky gentamicin a metronidazol. Finální složení hydrogelu včetně hodnot gelačního času (Tg) a hodnoty elatické modulu G'po 3 min (G's mm) a po ukončení solidifikace (G'_s) jsou uvedeny v následující tabulce.

-36 CZ 38923 UI

Tabulka 57: Příklady přípravy hydrogelu s obsahem hydrogelů s obsahem léčivých látek gentamicin a metronidazol s využitím roztoků A obsahující křenovou peroxidázu o aktivitě 0,3 až 0,6 U/ml

Aktivita HRP roztoku A (U/ml)	Léčivé látky	Koncentrace SH-TA (mg/ml)	M_w SH-TA roztoku C (x 10³ g/mol)	Tg (s)	G'3 min (Pa)	G (Pa)
0,3	GEN/MET	40	216	51,5	111	512
0,4	GEN/MET	40	216	53,0	107	570
0,6	GEN/MET	40	216	18,6	424	686

Příklad 23: Vliv aktivity koncentrace peroxidu na přípravu hydrogelů s obsahem infůsního roztoku

Tabulka 58: Složení sady roztoků pro přípravu hydrogelu

Roztok A (20 g)	Množství (g)	koncentrace	jednotka
HRP	q.s.	0,54-0,57	U/ml
CaCl₂.2H₂O	0,0029	1	mmol/1
SH-TA	0,02	1	mg/g
Brilantní modř FCF (E133)	0,0008	0,04	mg/g
NaCl	0,27	13,5	mg/g
Voda	19,7
Roztok B (20 g)	Množství (g)	koncentrace	jednotka
H₂O₂	0,0062	5,45-9,13	mmol/1
Voda	20
Roztok C (20 g)	Množství (g)	koncentrace	jednotka
SH-TA	0,8	40	mg/g
NaCl	0,27	13,5	mg/g
Voda	18,9

-37 CZ 38923 UI

Tabulka 59: Vlastnosti derivátu SH-TA po terminální parní sterilizaci

Vlastnosti roztoku C	Hodnota
M_w SH-TA (x 10³ g/mol)	334
DS SH-TA	2,3

Roztok A sady (20 g) byl smísen s 20 ml léčivého přípravku Fyziologický roztok Viaflo infůzní roztok (NaCl 9 g/1) (výrobce Baxter SA) za vzniku prekurzorového roztoku gelu p(A). Roztok B sady (20 g) je smísen s 20 g roztoku C za vzniku prekurzorového roztoku p(B+C). Pro přípravu hydrogelu jsou prekurzorové roztoky p(A) ap(B+C) smí seny v objemovém poměru 1:1.

Takto připravené hydrogel obsahuje enzym křenovou peroxidázu, kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivát hyaluronanu (crossSH-TA), barvivo brilantní modř FCF, chlorid vápenatý a chlorid sodný. Finální složení hydrogelu včetně hodnot gelačního času (Tg) a hodnoty elatické modulu G'po 3 min (G's mm) a po ukončení solidifikace (G'_s) jsou uvedeny v následující tabulce.

Tabulka 60: Příklady přípravy hydrogelu s obsahem infusního roztoku s využitím roztoků B obsahujících peroxid vodíku v rozsahu koncentrací 5 až 10 mmol/1

Aktivita HRP roztoku A (U/ml)	C H₂O₂(mmo 1/1)	Infusní roztok	Koncentrace SHTA (mg/ml)	Tg (s)	G'3 min (Pa)	G (Pa)
0,57	9,13	0,9% NaCl	40	10, 5	605	1286
0,54	9,13	0,9% NaCl	40	14, 6	528	1022
0,57	5,84	0,9% NaCl	40	10, 8	696	1332
0,54	5,45	0,9% NaCl	40	15, 6	578	1170

Příklad 24: Vliv aktivity koncentrace peroxidu na přípravu hydrogelů s léčivých látek gentamicin a metronidazol

-38 CZ 38923 UI

Tabulka 61: Složení sady roztoků pro přípravu hydrogelu

Tabulka 62: Vlastnosti derivátu SH-TA po terminální parní sterilizaci

Vlastnosti roztoku C	Hodnota
M_w SH-TA ( x 10³ g/mol)	334
DS SH-TA	2,3

Roztok A sady (20 g) je smísen s 2 ml léčivého přípravku Gentamicin Lek 80 mg/2 ml injekční/infůzní roztok (výrobce Lek Pharmaceuticals d.d.) a 18 ml léčivého přípravku Metronidazole Noridem 5 mg/ml infůzní roztok (výrobce Noridem Enterprises Limited) za vzniku 10 prekurzorového roztoku gelu p(A). Roztok B sady (20 g) je smísen s 20 g roztoku C za vzniku prekurzorového roztoku p(B+C). Pro přípravu hydrogelu jsou prekurzorové roztoky p(A) ap(B+C) smí seny v objemovém poměru 1:1.

-39 CZ 38923 UI

Tabulka 63: Příklady přípravy hydrogelu s obsahem léčivých látek gentamicin a metronidazol s využitím roztoků B obsahujících peroxid vodíku v rozsahu koncentrací 5 až 10 mmol/1

Aktivita HRP roztoku A (U/ml)	C H₂O₂(mmol /1)	Léčivé látky	Koncentrac e SH-TA (mg/ml)	Tg (s)	G'3 min (Pa)	G (Pa)
0,57	9,13	GEN/MET	40	20,9	574	870
0,54	9,13	GEN/MET	40	26,1	429	857
0,57	5,84	GEN/MET	40	19,8	490	1142
0,54	5,45	GEN/MET	40	23,7	363	930

Příklad 25: Složení sady roztoků pro hodnocení antiadhesivního účinku in vivo

Tabulka 64: Složení sady roztoků pro přípravu hydrogelu

Roztok A (20 g)	Množství (g)	koncentrace	jednotka
HRP	q.s.	0,5	U/ml
CaCl₂.2H₂O	0,0029	1	mmol/1
SH-TA	0,02	1	mg/g
Brilantní modř FCF (E133)	0,0008	0,04	mg/g
NaCl	0,27	13,5	mg/g
Voda	19,7
Roztok B (20 g)	Množství (g)	koncentrace	jednotka
H₂O₂	0,0062	9,13	mmol/1
Voda	20
Roztok C (20 g)	Množství (g)	koncentrace	jednotka
SH-TA	0,8	40	mg/g
NaCl	0,27	13,5	mg/g
Voda	18,9

-40 CZ 38923 UI

Tabulka 65: Vlastnosti derivátu SH-TA po terminální parní sterilizaci

Roztok A sady (0,5 g) je smísen s 20 ml léčivého přípravku Fyziologický roztok Viaflo infiizní roztok (NaCl 9 g/1) (výrobce Baxter SA) za vzniku prekurzorového roztoku gelu p(A). Roztok B sady (0,5 g) je smísen s 0,50 g roztoku C za vzniku prekurzorového roztoku p(B+C).

Příklad 26: Hodnocení antiadhesivního účinku gelů in vivo

Samci myší kmene C57BL/6J (stáří 12 až 18 týdnů) byly den před operací v místě zákroku zbaveni srsti pomocí depilačního krému. V den operace byla u myší navozena celková narkóza pomocí inhalační anestezie (Isoflurane 2,5 až 5%). Aby nedošlo k podchlazení organismu, byla operace prováděna na vyhřívané podložce. Břišní dutina myši byla otevřena, levá strana peritonea byla podrážděna jemným kartáčkem na zuby, následně byly podvazem peritonea chirurgickou nití (Ethicon Prolene™ 6-0, cat. no. 8706H) ve dvou místech vytvořeny tzv. ischemické uzlíky a poté bylo opatrně vyjmuto slepé střevo a kartáčkem na zuby podrážděn celý jeho povrch. Na závěr byly podrážděné povrchy peritonea a slepého střeva osušovány proudem CO? po dobu 2 min (120 s) a slepé střevo opatrně vráceno do břišní dutiny. Ihned po indukci srůstů byly na povrch slepého střeva aplikovány antiadhezivní prostředky takovým způsobem, aby po zašití rány došlo k oddělení poškozeného povrchu slepého střeva a ischemických uzlíků vytvořených na peritoneu. Prekurzorové roztoky gelu p(A) a p(B+C) připravené podle příkladu 24 byly smíseny v poměru 1:1 pomocí dvoj stříkačkového aplikátoru a statického mixéru a ihned nanseny na místo účinku. Aplikováno bylo cca 200 μΐ přípravku. Po aplikaci byly operační rány (peritoneum, kůže) zašity chirurgickým stehem a okolí rány bylo ošetřeno pomocí lokálního anestetika lidokain (EMLA krém 5%). U neléčené kontrolní skupiny byla dutina zašita ihned po indukci srůstů. Myši byly ponechány v klidu po dobu 14 dnů, následně byl pokus ukončen, přičemž byly hodnoceny vznik a pevnost srůstů a byly provedeny odběry vzorků pro případnou detailnější analýzu.

Hodnocení a odběr vzorků

Hodnocení adhezí bylo prováděno opět při celkové narkóze navozené inhalační anestezií (Isoflurane 2,5 až 5%) na vyhřívané podložce. Krev byla odebrána kardiopunkcí ze srdce a myši již nenabyly vědomí. Peritoneum myši bylo otevřeno vedle původní jizvy a detailním zkoumáním střev a orgánů bylo zjišťováno, zda došlo ke vzniku srůstů. V případě vzniku srůstů byla hodnocena jejich pevnost na základě kritérii zavedených v následující tabulce.

Tabulka 66: Stupnice pro hodnocení pevnosti srůstů

- bez srůstů_______________________________________________________________________________

- velmi jemné srůsty (blanka pojivové tkáně mezi orgány - povrchy k sobě nepřiléhají______

- srůsty oddělitelné tahem, aniž by došlo k viditelnému poškození přirostlých tkání (např. protržení střeva)

- srůsty, při jejichž oddělování tahem dojde k poškození přirostlých tkání (např. protržení střeva)

-41 CZ 38923 UI

Výsledky

Neléčená kontrola

V případě kontrolní neléčené skupiny byly srůsty u 6 ze 7 myší. Srůsty byly u všech myší lokalizovány mezi uzlíky a slepým střevem o ploše cca 1,5 až 2 cm², jejich pevnost byla hodnocena jako stupeň 2 .

Enzymaticky síťovaný hydrogel

Ve skupině, u které byl po aplikován gel podle příkladu 25, bylo 6 myší ze 7 myší bez srůstů. U jedné myši byl pozorován vznik srůstu mezi oblastí pod uzlíky a slepým střevem o ploše cca 1 cm², srůst byl detekován také v rámci slepého střeva a hodnocen stupněm 2. Materiál byl po 14 dnech u všech myší (bez ohledu na vznik srůstu) nerozložený na různých místech v břišní dutině ve více kusech , u 3 myší částečně nalepen na ischemických uzlících a jejich okolí, také v případě myši se srůstem. Materiál nebyl zapouzdřen.

Příklad 27: Použití sady roztoků pro vyplnění okolí kolorektální anastomózy

Následující příklad popisuje použití sady roztoků během chirurgického zákroku, při které je vytvořena kolorektální anastomóza a. hydrogel je aplikován do jejího okolí. Příklad demonstruje využitelnost sady roztoků během reálného robotického chirurgického zákroku. Pro tento účel byla použita sada roztoků rozplněných po 20 g v 50 ml lékovkách, které zároveň slouží k přípravě prekurzorových roztoků hydrogelů p(A) a p(B+C).

Tabulka 67: Složení sady roztoků pro přípravu hydrogelu

Roztok A (20 g)	Množství (g)	koncentrace	jednotka
HRP	q.s.	0,55	U/ml
CaCl₂.2H₂O	0,0029	1	mmol/1
SH-TA	0,02	1	mg/g
Brilantní modř FCF (E133)	0,0008	0,04	mg/g
NaCl	0,27	13,5	mg/g
Voda	19,7
Roztok B (20 g)	Množství (g)	koncentrace	jednotka
H₂O₂	0,0062	9,13	mmol/1
Voda	20
Roztok C (20 g)	Množství (g)	koncentrace	jednotka
SH-TA	0,8	40	mg/g
NaCl	0,27	13,5	mg/g
Voda	18,9

Příprava prekurzorových roztoků p(A) a p(B+C) z roztoků A, B a C sady a infůzních léčivých přípravků probíhá v nesterilní zóně operačního sálu. Následně jsou roztoky přeneseny pomocí sterilních stříkaček do kontejnerů umístněných ve sterilní zóně operačního sálu. Těsně před aplikací jsou roztoky postupně nasáty do výplachové stříkačky, kde dojde k jejich promísení a následně jsou aplikovány sterilní flexibilní cévkou přes endoskopický port do místa účinku.

-42 CZ 38923 U1

Příprava v nesterilní zóně operačního sálu

Materiál v nesterilní zóně

Sada roztoků A,B a C.......................................... 1ks

Sterilní stříkačka Luer Lock 50 ml............................. 2ks

Mini Spike....................................................... 2ks

Sterilní jehla..................................................... 1ks

KOMBI zátka, male / female Luer-Lock.................... 2ks

GENTAMICIN LEK 80 MG/2 ML 10X2ML/80MG Injekční roztok

Metronidazol Noriderm 5 mg/ml infuzní roztok

Postup přípravy

1) Pomocí injekční stříkačky (50 ml) a jehly bylo převedeno do lahvičky A (modrý roztok) 2 ml injekčního roztoku GENTAMICIN LEK 80 MG/2 ML a 18 ml infuzního roztoku Metronidazol Noriderm 5 mg/ml. Vznikl roztok p(A).

2) Obsah lahvičky A řádně byl promíchán a pomocí Mini-Spiku převeden do injekční stříkačky 50 ml, která byla uzavřena Kombi zátkou.

3) Obsah lahvičky B převeden pomocí čistého Mini-Spiku a stříkačky 50 ml do lahvičky C.

4) Vzniklý roztok p(B+C) řádně promíchán a převeden zpět do stříkačky 50 ml, která byla uzavřena Kombi zátkou.

Příprava ve sterilní zóně

Materiál sterilní zóna • Sterilní kelímek 100 ml - 2 ks • Sterilní stříkačka výplachová Janette 100 ml - s Luer adapterem - 1 ks

Postup přípravy

1) Roztok p(A), uchovávaný ve stříkačce 50 ml (modrý roztok), je převeden do kelímku ve sterilní zóně.

2) Roztok B+C, uchovávaný ve stříkačce 50 ml (bezbarvý viskózní roztok), je převeden do kelímku ve sterilní zóně.

3) Těsně před aplikací - do 100 ml výplachové stříkačky je nabrán roztok p(B+C)

4) Následně je do stejné stříkačky nabrán roztok p(A), který mírně promíchán a aplikován pomocí vhodné cévky přes endoskopický port.

Citovaná literatura

1. KRAMER, BERNHARD. Peritoneal Adhesions and their Prevention - Current Trends. SURGICAL TECHNOLOGY INTERNATIONAL. 2021, stránky 1-13.

2. Zavoral M, Grega T, Suchánek Š. Komplikace léčby kolorektálního karcinomu. Onkologie. 2016, Sv. 10, 41-47.

- 43 CZ 38923 U1

3. Zhong, Ziqiao, Gan, Lu, Feng, Ziyi, Wang, Wenhao, Pan, Xin, Wu, Chuanbin, & Huang, Ying. Hydrogel local drug delivery systems for postsurgical management of tumors: Status Quo and perspectives. . Materials Today Bio. 2024, 29,101308.

4. Akhlaghi, Sarah, Ebrahimnia, Maryam, Niaki, Darya Shokouhi, Solhi, Mehdi, Rabbani, Shahram, & Haeri, Azadeh. Recent advances in the preventative strategies for postoperative adhesions using biomaterial-based membranes and micro/nano-drug delivery . Journal of Drug Delivery Science and Technology. 2023, 85, 104539. .

5. Bouten, Petra J. M., Zonjee, Marleen, Bender, Johan, Yauw, Simon T. K., van Goor, Harry, van Hest, Jan C. M., & Hoogenboom, Richard. The chemistry of tissue adhesive materials. . Progress in Polymer Science, . 2014, 39(7), 1375-1405.

6. GD., Prestwich. Hyaluronic acid-based clinical biomaterials derived for cell and molecule delivery in regenerative medicine. . Journal of controlled release. 2011, 155:193-199.

7. Sikkink CJ, Zeebregts CJ, Reijnen MM. Hyaluronan-based antiadhesive agents in abdominal surgery: applications, results, and mechanisms of action. . Surgical technology international. 2007, 16:19-29.

8. Lee F, Chung JE, Kurisawa M. An injectable enzymatically crosslinked hyaluronic acidtyramine hydrogel system with independent tuning of mechanical strength and gelation rate. . Soft Matterials. 2008, 4:880-887.

9. NC., Veitch. Horseradish peroxidase: a modern view of a classic enzyme. Phytochemistry. 2004, 65:249-59.

10. Kurisawa M, Lee F, Wang L-S, Chung JE. Injectable enzymatically crosslinked hydrogel system with independent tuning of mechanical strength and gelation rate for drug delivery and tissue engineering. . Journal of Materials Chemistry. 2010, 20:5371-5375.

11. (Chance, B. and A. C. Maehly. Assay of catalases and peroxidases. . Methods in Enzymology, Academic Press. 1955, 2: 764-775.

Claims

1. Sada gelotvomých roztoků určená pro přípravu implantabilního hydrogelu, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň tři vodné roztoky A, B a C, z nichž roztok A obsahuje křenovou peroxidázu, vápenaté ionty ve formě farmaceuticky přijatelné a ve vodě rozpustné soli nebo jejich směsi, roztok B obsahuje peroxid vodíku a roztoky A a C obsahují izotonizační přísadu a hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I

O-. NH Ar

Nr ''R1 OH

2. Sada gelotvomých roztoků určená pro přípravu implantabilního hydrogelu, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň tři vodné roztoky A, B a C, z nichž roztok A obsahuje křenovou peroxidázu, vápenaté ionty ve formě farmaceuticky přijatelné a ve vodě rozpustné soli nebo jejich směsi, roztok B obsahuje peroxid vodíku a roztoky A a C obsahují izotonizační přísadu a hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I

-45 CZ 38923 UI

NH Ar 1 'OH __._-RNH (Π), kde Ar je fenylen a Ri ethylen, nebo Ar je indoly den a Ri je ethylen, nebo Ar je hydroxyfenylen a Ri je karboxyethylen, a FU jc alkylen o počtu uhlíků 3 až 7, přičemž roztok A dále obsahuje ve vodě rozpustné barvivo vybrané ze skupiny zahrnující brilantní modř FCF, metylenovou modř, brilantovou zeleň, krystalovou violeť, s výhodou brilantní modř FCF.

3. Sada gelotvomých roztoků určená pro přípravu implantabilního hydrogelu, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň tři vodné roztoky A, B a C, z nichž roztok A obsahuje křenovou peroxidázu, vápenaté ionty ve formě farmaceuticky přijatelné a ve vodě rozpustné soli nebo jejich směsi, roztok B obsahuje peroxid vodíku a roztoky A a C obsahují izotonizační přísadu a hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I

NH Ar 'R i ^OH

NH (II), kde Ar je fenylen a Ri ethylen, nebo Ar je indoly den a Ri je ethylen, nebo Ar je hydroxyfenylen a Ri je karboxyethylen, a R2 je alkylen o počtu uhlíků 3 až 7;

přičemž izotonizační přísada je vybrána ze skupiny obsahující NaCl, sacharózu, glukózu, glycerol, manitol, xylitol, glycin, s výhodou NaCl.

4. Sada gelotvomých roztoků určená pro přípravu implantabilního hydrogelu, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň tři vodné roztoky A, B a C, z nichž roztok A obsahuje křenovou peroxidázu, vápenaté ionty ve formě farmaceuticky přijatelné a ve vodě rozpustné soli nebo jejich směsi, roztok B obsahuje peroxid vodíku a roztoky A a C obsahují izotonizační přísadu a hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I

-46CZ 38923 UI

kde Ar je fenylen a Ri ethylen, nebo Ar je indoly den a Ri je ethylen, nebo Ar je hydroxyfenylen a Ri je karboxyethylen, a R2 je alkylen o počtu uhlíků 3 až 7, přičemž roztok A dále obsahuje ve vodě rozpustné barvivo vybrané ze skupiny zahrnující brilantní modř FCF, metylenovou modř, brilantovou zeleň, krystalovou violeť, s výhodou brilantní modř FCF a přičemž izotonizační přísada je vybrána ze skupiny obsahující NaCl, sacharózu, glukózu, glycerol, manitol, xylitol, glycin, s výhodou NaCl.

5. Sada gelotvomých roztoků určená pro přípravu implantabilního hydrogelu, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň tři vodné roztoky A, B a C, z nichž roztok A obsahuje křenovou peroxidázu, vápenaté ionty ve formě farmaceuticky přijatelné a ve vodě rozpustné soli nebo jejich směsi, roztok B obsahuje peroxid vodíku a roztoky A a C obsahují izotonizační přísadu a hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I

O-. NH Ar > R1 \H __._-RNH (Π),

-47CZ 38923 UI kde Ar je fenylen a Ri ethylen, nebo Ar je indoly den a Ri je ethylen, nebo Ar je hydroxyfenylen a Ri je karboxyethylen, a FU jc alkylen o počtu uhlíků 3 až 7;

přičemž roztok A obsahuje:

- hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o koncentraci v rozsahu 0,1 až 5 g/l, s výhodou o koncentraci 1 g/l, přičemž má hmotnostně střední molární hmotnost v rozsahu 180 000 až 350 000 g/mol a stupeň substituce substituentu obecného vzorce II je v rozmezí 2 až 3%,

- barvivo o koncentraci v rozsahu 0,01 až 0,1 g/l, s výhodou brilantní modř FCF o koncentraci 0,04 g/l,

roztok B obsahuje:

a roztok C obsahuje:

- hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o koncentraci v rozsahu 35 až 45 g/l, přičemž má hmotnostně střední molární hmotnost v rozsahu 180 000 až 350 000 g/mol a stupeň substituce substituentu obecného vzorce II je v rozmezí 2 až 3%,

6. Sada gelotvomých roztoků určená pro přípravu implantabilního hydrogelu, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň tři vodné roztoky A, B a C, z nichž roztok A obsahuje křenovou peroxidázu, vápenaté ionty ve formě farmaceuticky přijatelné a ve vodě rozpustné soli nebo jejich směsi, roztok B obsahuje peroxid vodíku a roztoky A a C obsahují izotonizační přísadu a hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I

-48CZ 38923 UI

NH Ar i 'OH

NH (Π), kde Ar je fenylen a Ri ethylen, nebo Ar je indoly den a Ri je ethylen, nebo Ar je hydroxyfenylen a Ri je karboxyethylen, a FU jc alkylen o počtu uhlíků 3 až 7, přičemž roztok A dále obsahuje ve vodě rozpustné barvivo vybrané ze skupiny zahrnující brilantní modř FCF, metylenovou modř, brilantovou zeleň, krystalovou violeť, s výhodou brilantní modř FCF;

a přičemž roztok A obsahuje:

- hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o koncentraci v rozsahu 0,1 až 5 g/l, s výhodou o koncentraci 1 g/l, přičemž má hmotnostně střední molámí hmotnost v rozsahu 180 000 až 350 000 g/mol a stupeň substituce substituentu obecného vzorce II je v rozmezí 2 až 3%,

roztok B obsahuje:

- peroxid vodíku o koncentraci v rozsahu 5 až 13 mmol/1, s výhodou 7 až 11 mmol/1, výhodněji 9 až 10 mmol/1;

a roztok C obsahuje:

- hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o koncentraci v rozsahu 35 až 45 g/l, přičemž má hmotnostně střední molámí hmotnost v rozsahu 180 000 až 350 000 g/mol a stupeň substituce substituentu obecného vzorce II je v rozmezí 2 až 3%,

7. Sada gelotvomých roztoků určená pro přípravu implantabilního hydrogelu, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň tři vodné roztoky A, B a C, z nichž roztok A obsahuje křenovou peroxidázu, vápenaté ionty ve formě farmaceuticky přijatelné a ve vodě rozpustné soli nebo jejich směsi, roztok B obsahuje peroxid vodíku a roztoky A a C obsahují izotonizační přísadu a hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I

-49CZ 38923 UI

O-. NH Ar ''R i

RNH (Π), kde Ar je fenylen a Ri ethylen, nebo Ar je indoly den a Ri je ethylen, nebo Ar je hydroxyfenylen a Ri je karboxyethylen, a R2 je alkylen o počtu uhlíků 3 až 7;

přičemž izotonizační přísada je vybrána ze skupiny obsahující NaCl, sacharózu, glukózu, glycerol, manitol, xylitol, glycin, s výhodou NaCl;

a přičemž roztok A obsahuje:

- hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o koncentraci v rozsahu 0,1 až 5 g/1, s výhodou o koncentraci 1 g/1, přičemž má hmotnostně střední molámí hmotnost v rozsahu 180 000 až 350 000 g/mol a stupeň substituce substituentu obecného vzorce II je v rozmezí 2 až 3%,

- izotonizační přísadu nebo jejich směs o koncentraci je v rozsahu 9 až 15 g/1, s výhodou NaCl o koncentraci 13,5 g/1;

roztok B obsahuje:

a roztok C obsahuje:

- hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o koncentraci v rozsahu 35 až 45 g/1, přičemž má hmotnostně střední molámí hmotnost v rozsahu 180 000 až 350 000 g/mol a stupeň substituce substituentu obecného vzorce II je v rozmezí 2 až 3%,

-50CZ 38923 UI

- izotonickou přísadu nebo jejich směs o koncentraci je v rozsahu 9 až 15 g/1, s výhodou 13,5 g/1.

8. Sada gelotvomých roztoků určená pro přípravu implantabilního hydrogelu, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň tři vodné roztoky A, B a C, z nichž roztok A obsahuje křenovou peroxidázu, vápenaté ionty ve formě farmaceuticky přijatelné a ve vodě rozpustné soli nebo jejich směsi, roztok B obsahuje peroxid vodíku a roztoky A a C obsahují izotonizační přísadu a hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I

O-. NH Ar NK ''R i 'OH

NH (Π), kde Ar je fenylen a Ri ethylen, nebo Ar je indoly den a Ri je ethylen, nebo Ar je hydroxyfenylen a Ri je karboxyethylen, a R2 je alkylen o počtu uhlíků 3 až 7, přičemž roztok A dále obsahuje ve vodě rozpustné barvivo vybrané ze skupiny zahrnující brilantní modř FCF, metylenovou modř, brilantovou zeleň, krystalovou violeť, s výhodou brilantní modř FCF a přičemž izotonizační přísada je vybrána ze skupiny obsahující NaCl, sacharózu, glukózu, glycerol, manitol, xylitol, glycin, s výhodou NaCl;

a přičemž roztok A obsahuje:

-51 CZ 38923 UI roztok B obsahuje:

a roztok C obsahuje:

9. Sada gelotvomých roztoků určená pro přípravu implantabilního hydrogelu, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň tři vodné roztoky A, B a C, z nichž roztok A obsahuje křenovou peroxidázu, vápenaté ionty ve formě farmaceuticky přijatelné a ve vodě rozpustné soli nebo jejich směsi, roztok B obsahuje peroxid vodíku a roztoky A a C obsahují izotonizační přísadu a hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I

(I), kde n je v rozmezí 2 až 5000, M je H⁺ nebo kation farmaceuticky přijatelné soli vybraný ze skupiny obsahující kation alkalického kovu, kovu alkalických zemin, a kde R je OH nebo substituent NHR2CONHRiArOH obecného vzorce II

O-. NH Ar > R i \Η __._-RNH (Π), kde Ar je fenylen a Ri ethylen, nebo Ar je indoly den a Ri je ethylen, nebo Ar je hydroxyfenylen a Ri je karboxyethylen, a R2 je alkylen o počtu uhlíků 3 až 7;

přičemž dále obsahuje alespoň jeden infuzní roztok s obsahem léčivé látky nebo jejich směsi, přičemž léčivé látky jsou vybrány ze skupiny obsahující antibiotika, lokální anestetika, cytostatika, léčiva pro biologickou léčbu, s výhodou jsou léčivé látky vybrány ze skupiny obsahující gentamicin, ciprofloxacin, klindamycin, metronidazol, kombinaci ciprofloxacinu a metronidazolu, kombinaci gentamicinu a metronidazolu.

10. Sada gelotvomých roztoků určená pro přípravu implantabilního hydrogelu, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň tři vodné roztoky A, B a C, z nichž roztok A obsahuje křenovou peroxidázu, vápenaté ionty ve formě farmaceuticky přijatelné a ve vodě rozpustné soli nebo jejich směsi, roztok B obsahuje peroxid vodíku a roztoky A a C obsahují izotonizační přísadu a hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I

-52CZ 38923 UI

O-. NH Ar ''R i ^SOH

RNH (Π), kde Ar je fenylen a Ri ethylen, nebo Ar je indoly den a Ri je ethylen, nebo Ar je hydroxyfenylen a Ri je karboxyethylen, a R2 je alkylen o počtu uhlíků 3 až 7, přičemž roztok A dále obsahuje ve vodě rozpustné barvivo vybrané ze skupiny zahrnující brilantní modř FCF, metylenovou modř, brilantovou zeleň, krystalovou violeť, s výhodou brilantní modř FCF;

a přičemž dále obsahuje alespoň jeden infůzní roztok s obsahem léčivé látky nebo jejich směsi, přičemž léčivé látky jsou vybrány ze skupiny obsahující antibiotika, lokální anestetika, cytostatika, léčiva pro biologickou léčbu, s výhodou jsou léčivé látky vybrány ze skupiny obsahující gentamicin, ciprofloxacin, klindamycin, metronidazol, kombinaci ciprofloxacinu a metronidazolu, kombinaci gentamicinu a metronidazolu.

11. Sada gelotvomých roztoků určená pro přípravu implantabilního hydrogelu, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň tři vodné roztoky A, B a C, z nichž roztok A obsahuje křenovou peroxidázu, vápenaté ionty ve formě farmaceuticky přijatelné a ve vodě rozpustné soli nebo jejich směsi, roztok B obsahuje peroxid vodíku a roztoky A a C obsahují izotonizační přísadu a hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I

-53 CZ 38923 UI

NH Ar

1 'OH __._-RNH (Π), kde Ar je fenylen a Ri ethylen, nebo Ar je indoly den a Ri je ethylen, nebo Ar je hydroxyfenylen a Ri je karboxyethylen, a FU jc alkylen o počtu uhlíků 3 až 7;

12. Sada gelotvomých roztoků určená pro přípravu implantabilního hydrogelu, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň tři vodné roztoky A, B a C, z nichž roztok A obsahuje křenovou peroxidázu, vápenaté ionty ve formě farmaceuticky přijatelné a ve vodě rozpustné soli nebo jejich směsi, roztok B obsahuje peroxid vodíku a roztoky A a C obsahují izotonizační přísadu a hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I

O-. NH Ar > 'R i ^OH __._-RNH (II), kde Ar je fenylen a Ri ethylen, nebo Ar je indoly den a Ri je ethylen, nebo Ar je hydroxyfenylen a Ri je karboxyethylen, a R2 je alkylen o počtu uhlíků 3 až 7, přičemž roztok A dále obsahuje ve vodě rozpustné barvivo vybrané ze skupiny zahrnující brilantní modř FCF, metylenovou modř, brilantovou zeleň, krystalovou violeť, s výhodou brilantní modř FCF a přičemž izotonizační přísada je vybrána ze skupiny obsahující NaCl, sacharózu, glukózu, glycerol, manitol, xylitol, glycin, s výhodou NaCl;

-54CZ 38923 UI a přičemž dále obsahuje alespoň jeden infuzní roztok s obsahem léčivé látky nebo jejich směsi, přičemž léčivé látky jsou vybrány ze skupiny obsahující antibiotika, lokální anestetika, cytostatika, léčiva pro biologickou léčbu, s výhodou jsou léčivé látky vybrány ze skupiny obsahující gentamicin, ciprofloxacin, klindamycin, metronidazol, kombinaci ciprofloxacinu a metronidazolu, kombinaci gentamicinu a metronidazolu.

13. Sada gelotvomých roztoků určená pro přípravu implantabilního hydrogelů, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň tři vodné roztoky A, B a C, z nichž roztok A obsahuje křenovou peroxidázu, vápenaté ionty ve formě farmaceuticky přijatelné a ve vodě rozpustné soli nebo jejich směsi, roztok B obsahuje peroxid vodíku a roztoky A a C obsahují izotonizační přísadu a hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I

O-. NH Ar y ''R 1 ΌΗ __._-RNH (Π), kde Ar je fenylen a Ri ethylen, nebo Ar je indoly den a Ri je ethylen, nebo Ar je hydroxyfenylen a Ri je karboxyethylen, a R2 je alkylen o počtu uhlíků 3 až 7;

přičemž roztok A obsahuje:

roztok B obsahuje:

-55CZ 38923 UI

a roztok C obsahuje:

- izotonickou přísadu nebo jejich směs o koncentraci je v rozsahu 9 až 15 g/1, s výhodou 13,5 g/1;

a přičemž dále obsahuje alespoň jeden infuzní roztok s obsahem léčivé látky nebo jejich směsi, přičemž léčivé látky jsou vybrány ze skupiny obsahující antibiotika, lokální anestetika, cytostatika, léčiva pro biologickou léčbu, s výhodou jsou léčivé látky vybrány ze skupiny obsahující gentamicin, ciprofloxacin, klindamycin, metronidazol, kombinaci ciprofloxacinu a metronidazolu, kombinaci gentamicinu a metronidazolu.

14. Sada gelotvomých roztoků určená pro přípravu implantabilního hydrogelu, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň tři vodné roztoky A, B a C, z nichž roztok A obsahuje křenovou peroxidázu, vápenaté ionty ve formě farmaceuticky přijatelné a ve vodě rozpustné soli nebo jejich směsi, roztok B obsahuje peroxid vodíku a roztoky A a C obsahují izotonizační přísadu a hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I

O-. NH Ar

NK ''R i ^SOH

RNH (II), kde Ar je fenylen a Ri ethylen, nebo Ar je indoly den a Ri je ethylen, nebo Ar je hydroxyfenylen a Ri je karboxyethylen, a R2 je alkylen o počtu uhlíků 3 až 7, přičemž roztok A dále obsahuje ve vodě rozpustné barvivo vybrané ze skupiny zahrnující brilantní modř FCF, metylenovou modř, brilantovou zeleň, krystalovou violeť, s výhodou brilantní modř FCF;

a přičemž roztok A obsahuje:

-56CZ 38923 UI

roztok B obsahuje:

a roztok C obsahuje:

15. Sada gelotvomých roztoků určená pro přípravu implantabilního hydrogelu, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň tři vodné roztoky A, B a C, z nichž roztok A obsahuje křenovou peroxidázu, vápenaté ionty ve formě farmaceuticky přijatelné a ve vodě rozpustné soli nebo jejich směsi, roztok B obsahuje peroxid vodíku a roztoky A a C obsahují izotonizační přísadu a hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I

O OM

HO (I), kde n je v rozmezí 2 až 5000, M je H⁺ nebo kation farmaceuticky přijatelné soli vybraný ze skupiny obsahující kation alkalického kovu, kovu alkalických zemin, a kde R je OH nebo substituent NHR2CONHRiArOH obecného vzorce II

-57CZ 38923 UI

NH Ar i 'OH

NH (Π), kde Ar je fenylen a Ri ethylen, nebo Ar je indoly den a Ri je ethylen, nebo Ar je hydroxyfenylen a Ri je karboxyethylen, a FU jc alkylen o počtu uhlíků 3 až 7;

a přičemž roztok A obsahuje:

roztok B obsahuje:

a roztok C obsahuje:

16. Sada gelotvomých roztoků určená pro přípravu implantabilního hydrogelu, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň tři vodné roztoky A, B a C, z nichž roztok A obsahuje křenovou peroxidázu, vápenaté ionty ve formě farmaceuticky přijatelné a ve vodě rozpustné soli nebo jejich směsi, roztok

-58CZ 38923 UI

B obsahuje peroxid vodíku a roztoky A a C obsahují izotonizační přísadu a hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I

O-. NH Ar > i ^OH __._-RNH (Π), kde Ar je fenylen a Ri ethylen, nebo Ar je indoly den a Ri je ethylen, nebo Ar je hydroxyfenylen a Ri je karboxyethylen, a R2 je alkylen o počtu uhlíků 3 až 7, přičemž roztok A dále obsahuje ve vodě rozpustné barvivo vybrané ze skupiny zahrnující brilantní modř FCF, metylenovou modř, brilantovou zeleň, krystalovou violeť, s výhodou brilantní modř FCF a přičemž izotonizační přísada je vybrána ze skupiny obsahující NaCl, sacharózu, glukózu, glycerol, manitol, xylitol, glycin, s výhodou NaCl;

a přičemž roztok A obsahuje:

roztok B obsahuje:

-59CZ 38923 U1 a roztok C obsahuje:

5 - izotonickou přísadu nebo jejich směs o koncentraci je v rozsahu 9 až 15 g/l, s výhodou 13,5 g/l;

a přičemž dále obsahuje alespoň jeden infuzní roztok s obsahem léčivé látky nebo jejich směsi, přičemž léčivé látky jsou vybrány ze skupiny obsahující antibiotika, lokální anestetika, cytostatika, léčiva pro biologickou léčbu, s výhodou jsou léčivé látky vybrány ze skupiny obsahující gentamicin, ciprofloxacin, klindamycin, metronidazol, kombinaci ciprofloxacinu a metronidazolu, kombinaci

10 gentamicinu a metronidazolu.