CZ391299A3

CZ391299A3 - Tkáňový faktor pro ovlivňování tvorby cév

Info

Publication number: CZ391299A3
Application number: CZ19993912A
Authority: CZ
Inventors: Peter Nawroth; Katsumi Nakagawa; Youming Zhang
Original assignee: Merckle Gmbh, Chem.-Pharm. Fabrik
Priority date: 1997-05-09
Filing date: 1998-05-08
Publication date: 2000-04-12
Also published as: DK0980251T3; NO995459L; IS5231A; ES2184299T3; WO1998051321A9; NO995459D0; PL336662A1; CZ293005B6; EP0980251A1; PT980251E; AU746782B2; HUP0003831A2; EP0980251B1; WO1998051321A1; HUP0003831A3; JP2001527555A; AU8331598A; SI0980251T1; DE19719652A1; CA2288117A1

Description

Tkáňový faktor pro ovlivňování tvorby cév

Oblast techniky

Vynález se týká použití tkáňového faktoru pro ovlivnění tvorby cév, zvláště při aktivaci tvoření cév, a to především při hojení ran.

Dosavadní stav techniky

Tělo je zásobováno krví prostřednictvím cév. Cévy obsahují endoteliální buňky a buňky hladkého svalstva. Při mnoha onemocněních jsou poškozovány cévy, resp. jejich tvorba.

Dochází k tomu například při poruše hojení ran jako v případě cukrovky, vaskulitidy, arteriálního okluzivního onemocnění, chronických venózních a infikovaných vředů. Velké problémy související s hojením ran se vyskytují také v případě porušení inervace, jako je paraplegie, lepra, neuropatie atd. a gangréna z proleženin u ležících pacientů. Známé je také slabé sešití a poruchy hojení ran v případě operací, zvláště při operaci střev, resp. transplantacích kůže nebo jiných orgánů. Doposud neexistují uspokojivé produkty nebo způsoby, kterými je možné ošetřovat onemocnění cév, zvláště pak poruchy hojení ran.

Podstata vynálezu

Účelem vynálezu je nalézt produkt, kterým lze dosáhnout výše uvedeného cíle.

Podle vynálezu toho lze dosáhnout předměty definovanými v patentových nárocích.

Předmět vynálezu se vztahuje k použití tkáňového faktoru při ovlivnění tvorby cév, zvláště pak při aktivaci tvoření cév, a to především při hojení ran.

Vynález se zakládá na zjištění přihlašovatele, že při poranění tkáně zvířat vede tkáňový faktor k tvorbě cév. Přitom bylo zjištěno, že cévy obsahují endoteliální buňky a buňky hladkého svalstva. Dále se zjistilo, že hojení ran lze φφ φ φ φ φ φ φφφ φ φ φ • · « φφφ

ΦΦ φφ • · · φ • · · φφφφ φφφ φφ φφφφ φφφ φ

φ φ dosáhnout pomocí tkáňového faktoru. Navíc bylo zjištěno, že tvorbě cév se může předcházet inhibici tkáňového faktoru.

Tkáňový faktor je transmembránový glykoprotein, který váže faktory srážení krve VII, resp. Vila. Tato vazba ovlivňuje aktivaci faktorů srážení krve X, resp. IX tak, že krevní koagulace začíná prostřednictvím vnější respektive vnitřní dráhy. Tkáňový faktor má molekulovou hmotnost 43 000 až 46 000. Jeho primární struktura je známa stejně jako gen tkáňového faktoru a jeho poloha na chromosomu (Scarpati, E.M., a spol., Biochemistry 26, (1987), 5234-5238).

Podle vynálezu se tkáňový faktor používá při aktivaci tvorby cév, zvláště pak při hojení ran. Termín „tkáňový faktor,, se vztahuje na tkáňový faktor libovolného druhu a původu. Může to být faktor zvířecí nebo lidské tkáně. Může nebo nemusí být glykosylován. Také to může být fragment tkáňového faktoru, který je schopen tvořit cévy, zvláště při hojení ran. Tkáňový faktor může mít sekvenci divokého typu. Jeho sekvence se může také lišit od sekvence divokého typu jednou nebo několika aminokyselinami. Navíc tkáňový faktor může být součástí fúzního proteinu.

V preferovaném provedení je tkáňový faktor přítomen ve formě exprimovatelné nukleové kyseliny. Může to být DNA a/nebo RNA, přičemž výhodná je DNA, zvláště genomová DNA nebo cDNA, resp. její fragmenty. Shora uvedená tvrzení ohledně tkáňového faktoru zde platí odpovídajícím způsobem také pro nukleovou kyselinu.

Exprese nukleové kyseliny lze dosáhnout obvyklým způsobem. V případě nukleové kyseliny, například DNA, zvláště pak cDNA, může být výhodné, aby byla přítomna ve vektoru, který je vhodný pro expresi ve zvířecích buňkách. Takové expresivní vektory jsou odborníkům známy. Mohou to být například virové nebo plasmidové vektory. Pro vektory je výhodné, aby se v buňkách nezačleňovaly do genomu, ale zůstaly v buňce episomálně. Tím se dosáhne dočasné exprese tkáňového faktoru, což je výhodné. Nukleová kyselina, jako je DNA, zvláště cDNA, se může řídit konstitutivním nebo indukovatelným promotorem. Indukovatelný ·*· *·· ·· ···· ·· ·· promotor může být například specifický pro určitou tkáň, určitý orgán a/nebo nádor. V případě nukleové kyseliny, jako je DNA, zvláště cDNA, může být výhodné, když je řízena promotorem CMV, například v expresivním vektoru pcDNA3 (Invitrogen) nebo je řízena promotorem SV40, například v expresivním vektoru pSVK3 (Pharmacia). Takové expresívní plasmidy, označované jako pcDNA3-TF (tkáňový faktor), resp. pSVK3-TF, rovněž představují předmět vynálezu. V případě DNA, zvláště v případě cDNA, může být zvlášť výhodné, když je přítomna v replikonovém vektoru viru Sindbis. Takový vektor umožňuje extrémně vysokou expresi nukleové kyseliny. Příkladem takového vektoru je vektorový systém ELVS od Viagene lne. Expresívní plazmid, označovaný jako ELVS-TF (tkáňový faktor), rovněž představuje předmět vynálezu. Pro přípravu uvedeného vektoru může odborník použít známé metody. Odkazuje se na Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982.

Podle vynálezu se tkáňový faktor používá pro aktivaci tvoření cév, zvláště při hojení ran. Termín „tvorba cév„ se vztahuje ke tvoření cév libovolného druhu na libovolném místě. Například se vztahuje ke tvoření cév, které slouží pro nahrazení poškozených například starých cév. Ty se mohou nacházet například v mozku nebo v srdci, takže je možno předcházet nebo léčit apoplexii nebo infarkt. Může se také předcházet presbyfrenii. Navíc se vztahuje k tvorbě cév při léčbě arteriosklerózy, Crohnovy nemoci a vředové kolitidy, diabetické retinopatie a trombózy hlubokých žil nohou/bercových vředů stejně jako při prevenci recidiv těchto onemocnění. Zvláště se vztahuje ke tvoření cév a hojení ran. Termín „hojeníran„ znamená hojení ran libovolného druhu a na libovolném místě. Může to být normální hojení ran i porucha hojení ran. K posléze uvedenému dochází zejména v případě onemocnění, jako je cukrovka, vaskulitida, arteriální okluzivní onemocnění, chronické venózní a/nebo infikované vředy, stejně jako špatně se hojící žaludeční vředy. K poruchám hojení ran dochází také inervace, jako je paraplegie, lepra, u lidí trpících gangrénou z proleženin.

v případě poruchy neuropatie atd., a • · • fc • · * · • · • fc • · « fc fc # * · • fc ·· • · · · • · · · • · · fc · r · fc · • · ·>

K poruchám hojení ran také dochází, objeví-li se slabé sešití a zhoršené hojení po operacích, zvláště po operaci střev a při transplantacích kůže nebo jiných orgánů. K poruše hojení ran také dochází v případě zlomenin kostí, při popáleninách a při léčbě, kdy se používají steroidy.

Podle vynálezu se tkáňový faktor aplikuje ve formě proteinu nebo exprimovatelné nukleové kyseliny za účelem aktivace tvoření cév zvláště při hojení ran. V případě tkáňového faktoru může být výhodné, aby se aplikoval v kombinaci s dalšími faktory, které podporují tvoření cév, zvláště při hojení ran, jako je například vaskulární endoteliální růstový faktor (VEGF). Tyto faktory mohou být přítomny rovněž ve formě proteinů a/nebo exprimovatelných nukleových kyselin. Tkáňový faktor a uvedené faktory se mohou aplikovat společně nebo následně. Druh aplikace samotného tkáňového faktoru, resp. v kombinaci s uvedenými faktory se může orientovat podle místa působení, to znamená místa, kde má dojít ke tvoření cév, zvláště pro hojení ran. Například je zřejmé, že léčba na povrchu těla se provádí místní aplikací a léčba uvnitř těla se provádí systémově. Pro aplikaci samotného tkáňového faktoru, resp. jeho kombinace s dalšími faktory mohou být použity běžné metody. V případě lokální aplikace je například výhodné zabalit faktor nebo faktory do liposomů nebo je absorbovat na nosiče, zvláště na částice zlata, a zavádět liposomy do odpovídajícího místa těla, resp. vstřikovat nosiče, zvláště částice zlata, injekcí do tkáně. Dále jsou k dispozici farmaceutické přípravky pro aplikaci tkáňového faktoru samotného, resp. společně s uvedenými faktory, které mohou obsahovat běžné pomocné látky, jako jsou nosiče, rozpouštědla atd. Takové kompozice jsou také předmětem vynálezu.

Podle vynálezu se tkáňový faktor také používá při inhibici tvoření cév. Pro tyto účely se tkáňový faktor může vyskytovat ve formě protilátky, která jej inhibuje. Tkáňový faktor může být také přítomen ve formě nukleové kyseliny, která má antisense účinek na expresi tkáňového faktoru. Zvláště zhoubné bujení lze léčit inhibici tvorby cév.

«4 ·· • · · · · • 4 · • « · ·· ···· · • 4 4 · · · • · « 4 4 · • ·· · · · » · ·<· ··« • · · • ♦ ♦·· 44 44

Na základě vynálezu je možné ovlivnit tvorbu cév. Zvláště je možné aktivovat tvorbu cév. Výsledné krevní cévy obsahují endoteliální buňky a buňky hladkého svalstva. Vynález je tak vhodný pro prevenci a léčbu nejrůznějších onemocnění. Příklady uvedených onemocnění jsou uvedeny shora v textu. Vynález je zvláště vhodný při léčbě a/nebo profylaxi poruch hojení cév především v případě cukrovky, kde je možné zahojení velkých otevřených ran nacházejících se na končetinách. Kromě toho je možno způsobem podle vynálezu inhibovat tvorbu cév. Vynález je tedy vhodný pro léčbu onemocnění, jako je zhoubné bujení. Vynález je velkým přínosem pro moderní medicínu.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek č. vytvořených

Na obrázku č. 1 je zobrazena tvorba cév v ranách transfikovaných vektorem exprimujícím tkáňový faktor (a), (b) je vektor, který kóduje antisense tkáňový faktor, a (c) je kontrola.

Na obrázku č. 2 je zobrazena tvorba cév v ranách transfikovaných vektorem exprimujícím tkáňový faktor (a) . (b) je vektor, který kóduje antisense tkáňový faktor, a (c) je kontrola. Cévy jsou zviditelněny barvením hematoxylinem/eosinem (obrázek č. 2A) . Na obrázku č. 2B je zobrazen na grafu počet krevních cév.

zobrazuje buňky cévách v ranách exprimujícím tkáňový faktor (a), antisense tkáňový faktor, a (c) jsou zviditelněny barvením α-aktinem (obrázek č. 3A). obrázku č. 3B je intenzita zbarvení zobrazena v grafu.

hladkého svalstva v nově transfikovaných vektorem (b) je vektor, který kóduje je kontrola. Buňky svalstva Na

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Příprava plasmidu exprimujícího tkáňový faktor a jeho použití při ovlivnění tvorby cév, zvláště při aktivaci tvorby cév především při hojení ran.

• ·

« * • · • ’ · · • ·	• · · · • · ♦ · • · ·· · • ·

(A) Celá překládaná oblast (1,8 kb) genu myšího tkáňového faktoru se začlenila do restrikčního místa BamHI vícenásobného klonovacího místa pcDNA3 (Invitrogen) . Tato oblast se tak řídila promotorem CMV. Byl získán exprsivní plasmid pcDNA3-TF. Stejným způsobem se začlenila kódující oblast (0,7 kb) genu myšího tkáňového faktoru v antisense orientaci do restrikčního místa EcoRI vícenásobného klonovacího místa pcDNA3. Tato oblast se také řídila promotorem CMV. Získal se expresívní plasmid pcDNA3-TF-AS.

Na zádech tří samic myší NOD (Bomholtgaard, Dánsko) se vytvořily 6 mm silné rány ve vzdálenosti 8 až 10 mm. Tyto rány se ošetřily směsí obsahující 2 pg pcDNA3-TF (a), pcDNAF3-TF-AS (b) a pcDNA3 (kontrola (c)) a 12 pg transfekčního činidla DOTAP (Boehringer Mannheim). Rány se zakryly pomocí Ohmann Opraflex.

Aby se prokázalo v ranách tvoření cév, zavedlo se 6., resp. 8. den po aplikaci směsi do kaudální cévy 300 pl inkoustu (Nigrosin, Sigma). Poté se zvířata usmrtila a oblast kůže s ránami se zkoumala pod mikroskopem.

Ukázalo se, že, jestliže se. aplikuje vektor exprimující tkáňový faktor (a), v ránách se tvoří cévy, a tak je podporováno hojení ran. Rovněž se ukázalo, že antisense tkáňový faktor může inhibovat tvorbu cév.

Jak se popisuje v odstavci (A) ošetřilo se šest NOD myší. Po 6, resp. 8 dnech se zvířata usmrtila a odpovídající oblasti kůže se testovaly pod mikroskopem poté, co se obarvily aaktinem (pomocí protilátek proti Sm-aktinu od Dianova). Ukázalo se, že vytvořené cévy obsahují buňky hladkého svalstva.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použití tkáňového faktoru nebo jeho fragmentu pro cílené terapeutické ovlivňování tvorby cév vyvoláním místní exprese nukleové kyseliny tkáňového faktoru nebo místní aplikací funkčního proteinu tkáňového faktoru.
2. Použití podle nároku 1, kde uvedeným ovlivňováním je aktivace tvorby krevních cév.
3. Použití tkáňového faktoru nebo jeho fragmentu pro ovlivňování hojení ran vyvoláním místní exprese nukleové kyseliny tkáňového faktoru nebo místní aplikací funkčního proteinu tkáňového faktoru.
4. Použití podle nároku 3, kde se jedná o hojení ran v případě cukrovky, vaskulitidy, arteriálního konkluzivního onemocnění, chronického venózního a infikovaného vředu, poruchy inervace, gangrény z proleženin a slabého sešití v případě operací.
5. Použití podle nároku 1 nebo 2, kde se jedná o tvorbu cév v případě arteriosklerózy, Crohnovy nemoci a vředové kolitidy, diabetické retinopatie a trombózy hlubokých žil nohou/bércových vředů.
6. Použití podle nároku 1 nebo 2, kde se jedná o tvorbu cév při nahrazování poškozených cév.
7. Použití podle kteréhokoli z nároků 1 až 6, kde tkáňový faktor nebo jeho fragment je přítomen jako exprimovatelná nukleová kyselina.
8. Použití podle nároku 7, kde exprese nukleové kyseliny je dočasná.
9. Použití podle nároku 7 nebo 8, kde nukleovou kyselinou j e DNA.
10. Použití podle kteréhokoli z nároků 7 až 9, kde nukleová

kyselina je řízena promotorem. konstitutivním nebo indukovatelným 11. Použití podle kteréhokoli z nároků 7 až 10, kde nukleová Sindbis. kyselina je přítomna v replikonovém vektoru viru 12. nukleová Použití podle kteréhokoli z kyselina je řízena promotorem nároků 7 až '10, CMV nebo SV 40. kde
13. Použití podle kteréhokoli z nároků 1 až 12, kde tkáňový faktor je přítomen v liposomu nebo na nosiči, zvláště na částicích zlata.
14. Použití podle libovolné z nároků 1 až 13, kde tkáňový faktor je přítomen v kombinaci s dalšími faktory, podporujícími tvorbu cév.
15. Použití podle nároku 14, kde faktory jsou přítomny jako exprimovatelné nukleové kyseliny nebo funkční proteiny.
16. Použití podle nároku 14 nebo 15, kde jedním z faktorů je VEGF.
17. Použití podle kteréhokoli z nároků 1 až 16, kde tkáňový faktor je přítomen ve farmaceutickém přípravku.