CZ391497A3

CZ391497A3 - Vakcíny obsahující konjugáty modifikovaných meningokokálních polysacharidů

Info

Publication number: CZ391497A3
Application number: CZ973914A
Authority: CZ
Inventors: Harold J. Jennings; Robert Pon; Michele Lussier; Francis Michon
Original assignee: National Research Council Of Canada
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-07
Publication date: 1998-05-13
Also published as: HUP9802664A2; CN1163270C; JP4171068B2; US5811102A; US5969130A; KR19990022748A; EP0831898B1; ES2196153T3; IL147121A; CN1187136A; AU5993796A; PL184125B1; HUP9802664A3; DE69627652D1; IL118604A0; HU224972B1; IL147121A0; AU706053B2; PL323862A1; KR100452475B1

Description

Oblast techniky

Vynález se týká chemicky modifikovaných polysacharidů skupiny B Neisseria meningitidis. Vynález poskytuje vakcíny, ve kterých jsou modifikované polysacharidy konjugovány s proteinovým nosičem, a tak podobně.

Dosavadní stav techniky

Meningitida způsobená skupinou B Neisseria meningitidis a E coli K1 zůstává velkým světovým zdravotním problémem. Meningitida skupiny B se vyskytuje jak v endemických, tak pandemických situacích a způsobuje přibližně polovinu všech zaznamenaných případů meningokokální meningitidy, zatímco K1 -pozitivní E. coli má hlavní podíl na meningitidě u neonatů . V současnosti není proti chorobám vyvolaným meningokokem skupiny B a E. coli K1 žádná komerčně dostupná vakcína. To je způsobeno zčásti faktem, že meningokokální polysacharid skupiny B (GBMP) je u lidí pouze nízce imunogenní. Bylo postulováno, že tuto nízkou imunogenitu nativního GBMP a výslednou imunitní odolnost způsobuje přítomnost obecného epitopu v lidské a zvířecí tkáni. Nedávno bylo popsáno několik kandidátních vakcín založených na komplexech GBMP s proteiny vnější membrány, ale dosud není žádný důkaz o jejich účinnosti u lidí.

Nedávno byl vytvořen nový koncept vakcíny založené na konjugátu synteticky chemicky modifikovaného (N-propionylovaného) polysacharidu skupiny B s proteinem (N-Pr-GBMP-protein). Vakcína indukuje u myší vysoké titry IgG protilátek, které nejen chrání, ale také křížově reagují s nemodifikovaným GBMP (tzn. N-acetyl-GBMP). Tento koncept byl popsán a nárokován v U.S. patentu No. 4,727,136, February 23, 1988, Harold J Jénings et al.

Usuzuje se, že vakcína, která vyvolává křížově reagující protilátky, jak popisuje U.S. patent 4,727,136, může být úspěšná pouze za cenu porušení imunitní odolnosti. Tato hypotéza se ospravedlňuje identifikací obecného epitopu skládajícího se z řetězce zbytků a-(2-8)-vázané sialové kyseliny (minimální požadavek je deset zbytků) jak v nativním N-Ac-GBMP, tak v lidské a zvířecí tkáni (Jennings, Contrib. Microbiol. lmmunol., Basel, Karger, 1989, Vol. 10, 151-165).

Tyto polysialové řetězce působí jako vývojové antigeny a jsou velkou měrou spojeny s fetálním stádiem adheze embryonálních nervových buněk (Finne et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.. 1983, 112,482). Během postnatální maturace je tento antigen omezen (Friedlander et al., J. Cell Biol.. 1985, 101, 412), aleje exprimován u dospělých lidí během regenerace nakažených svalů (Cashman et al, Ann. Neuron.. 1987, 21,481) v nádorových buňkách (Roth et al.. Proč, Nati. Acad. Sci.. 1988, 85, 299) a v přirozených zabíječských (NK) a CD3⁺T buňkách (Husmann et al., _v Eur. J. Immunol,, 1989, 19, 1761). Ačkoliv důsledky porušení odolnosti vůči těmto fetálním antigenům nebyly dosud stanoveny, je žádoucí vytvořit vakcíny, které mají potlačenou imunogenitu pro lidské epitopy.

Předmětem předkládaného vynálezu je vytvoření modifikovaných meningokokálních polysacharidů skupiny B, které jsou imunogenní, a přesto indukují protilátky, které mají redukovanou křížovou reaktivitu s nativními epitopy hostitele. Dalším předmětem je poskytnutí konjugátů polysacharid-protein, které obsahují tyto modifikované polysacharidy. Dalším předmětem vynálezu je poskytnutí vakcín s imunogenními vlastnostmi, které vykazují podstatně redukovanou křížovou reaktivitu s GBMP.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález obecně poskytuje chemicky modifikované polysacharidy skupiny B Neisseria meningitidis. Předkládaný vynález také poskytuje vakcíny, ve kterých jsou modifikované polysacharidy konjugovány s proteinovým nosičem

Vynález specificky poskytuje nenasycené N-acyl derivatizované polysacharidy skupiny B Neisseria meningitidis, konjugáty nenasyceného N-acyl derivatizováného polysacharidů kovalentně vázaného na proteiny, farmaceutické přípravky zahrnující konjugátové molekuly nenasycených N-acyl derivatizovaných polysacharidů skupiny B Neisseria meningitidis, a použití těchto přípravků jako vakcín.

V jednom provedení vynález poskytuje modifikovaný B polysacharid Neisseria v

meningitidis, kde jsou N-acetylové (C₂) skupiny zbytku sialové kyseliny nahrazeny nenasycenou C₃-Č₄ skupinou.

V jiném provedení se poskytuje antigenový konjugát zahrnující nenasycené C₂-C₄ N-acyl derivatizované polysacharidy konjugované s imunologicky vhodným proteinem, který má • · • · · · · · · · · · · · ····«« · · · «··« ·· ·· ···· ·· ·· zvýšenou imunogenitu při srovnání s nativními polysacharidy a redukovanou indukci křížově reagujících protilátek.

V dalším provedení se poskytuje vakcína zahrnující konjugát nenasyceného N-acyl derivatizovaného polysacharidu s proteinem ve spojení s vhodným nosičem nebo rozpouštědlem. Vakcíny podle vynálezu mohou také zahrnovat terapeuticky efektivní množství adjuvantu vhodného pro použití u lidí, na příklad fosfát hlinitý, hydroxid hlinitý nebo stearyl tyrosinu.

V dalším provedení se poskytuje způsob imunizace savců proti Neisseria meningitidjs a

E. coli K1 infekcím, který zahrnuje parenterální administraci savcům vystaveným takovým infekcím, včetně lidí, imunologicky efektivního množství vakcíny podle vynálezu. Typicky se vakcína administruje v množství 1 až 50 mikrogramů na kilogram tělesné váhy, na příklad 5 až 25 mikrogramů na kilogram tělesné váhy.

V dalším provedení vynález poskytuje sérum a gamaglobulinovou frakci schopnou chránit před meningitidou způsobenou skupinou B Neisseria meningitidis a E. coli Kl. Frakce se produkuje imunizací savců vakcínou podle vynálezu a s výhodou se gamaglobulinová frakce separuje od imunitního séra. Frakce se poté administruje jedinci pro poskytnutí ochrany před infekcí, nebo pro terapii již propuklé infekce způsobené výše zmíněnými organismy. U imunogenních vakcínových konjugátů podle vynálezu se ve světle jejich slibné imunogenity oceňuje, že jsou zdrojem terapeutického antiséra s minimální indukcí protilátek křížově reagujících s GBMP. Konjugáty podle vynálezu jsou také užitečné pro vyvolání monoklonálních protilátek a antidiotypických protilátek.

Zjistilo se, že většina baktericidnich a protektivních protilátek indukovaných konjugátem N-Pr-GBMP-protein, popsaným ve výše uvedeném IJ. S. patentu 4,727,136 (Jennings et al.), není asociovaná s GBMP křížově reagujícími protilátkmi. Ve skutečnosti je většina protektivňí aktivity obsažena v populaci N-Pr-GBMP-specifíckých protilátek, která křížově nereaguje s GBMP. Ve světle tohoto se usuzuje, že N-Pr-GBMP mi mi kuje unikátní baktericidní epitop na povrchu meningokoka skupiny B.

Předkládaný vynález je založen na objevu, že je možné syntetizovat chemicky modifikovaně GBMP, které mimikují baktericidní epitop a které v konjugované formě nejen vykazují zvýšenou imunogenitu, ale také se podstatně vyvarují indukce protilátek křížově reagujících s GBMP.

V rámci dosažení předkládaného vynálezu se syntetizovaly různé chemicky modifikované

GBMP a konjugovaly se s proteinem, následovala injekce konjugátů do myší a účinky se porovnaly s účinky konjugátu N-Pr-GBMP-protein. Překvapivě se ukázalo, že přítomnost nenasycené vazby v N-acylu vede k výjimečně imunogenním konjugátům.

Tyto a další rysy vynálezu budou Srozumitelné podle následujícího detailního popisu specifického provedení vynálezu. Šíře vynálezu je limitována pouze nároky k tomu připojenými.

Detailní popis vynálezu. Vynález obecně poskytuje nové nenasycené N-acyl derivatizované poiysacharidy skupiny B Neisseria meningitidis, nové konjugáty nenasycených N-acyl derivátu skupiny B, farmaceutické přípravky zahrnující konjugátové molekuly nenasycených N-acyl derivatizovaných polysacharidových fragmentů skupiny B Ňeisseria meningitidis kovalentně vázaných na proteiny, a použití těchto pří pravků jako vakcin.

Předkládaný vynález se týká nenasycených N-acyl derivatizovaných polysacharidů skupiny

B Neisseria meningitidis obecného vzorce I:

Ri-C^

NH—

Vzorec I kde Rje C₂-C₄ nenasycená alkylová skupina obsahující alespoň jednu dvojnou vazbu.

V jednom provedení vynálezu obsahuje R, podle obecného vzorce I tři nebo čtyři uhlíky a dvě nesousedící dvojně vazby.

V dalším provedení vynálezu obsahuje R, podle obecného vzorce I dva, tři nebo čtyři uhlíky a uhlík nejvzdálenější od acylového uhlíku je vázán dvojnou vazbou.

Následují specifické, ale nelimitující, příklady modifikovaných meningokokálních nenasycených N-acyl derivatizovaných polysacharidů skupiny B podle obecného vzorce I, použitých v předkládaném vynálezu, které obsahují:

N-pentenoyl (CH_r CH-CH₂-CH₂-CONH-);

a N-krotonoyl (3-butenoyl) (CHy=CH-CH₂-CONH-) • ·

CH₂=CH-CH2-C NHSkupina B meningokokálních polysacharidů se isoluje z N. meriingitidis způsoby známými podle stavu techniky. Podle jednoho způsobu se meningokoky skupiny B (vlákno 981B) pěstovaly při 37 °C ve fermentoru s použitím 30 g. dehydratovaného Todd Hewith Broth (Difco Laboratories, Detroit, Michigan) na litr destilované vody. Před růstem ve fermentoru se lyofilizované vlákno původně pěstovalo ve svíčkové nádobě při 37 °C na destičkách 5% (v/v) Sheeps' Blood Agar (Difco Laboratories, Detroit, Michigan). Bakterie se poté transferovaly do 1,0 litru Todd Hewith Broth (viz výše) v Erlenmayerově nádobě, která se třepala při 37 °C 7 hodin při 190 r.p.m. Toto inokulum se poté transferovalo do fermentoru. Po růstu ve fermentoru (16 hodin) se bakterie usmrtily přídavkem formalinu na konečnou koncentraci 0,75 %. Bakterie se oddělily kontinuální centrifugací a menjngokokální polysacharidy skupiny B se isolovaly ze supematantu a náležitě čistily, jak popisuje Bundle et al., J. Biol. Chem.. 249,4797-4801 (1974), s výjimkou, že protein se extrahoval mícháním roztoku surového polysacharidů s vychlazeným (4 °C) fenolem místo uváděným horkým (50-60 °C). Pozdější postup zajišťuje, že vznikají formy GBM P s vyšší molekulovou hmotností.

E. coli (018:Kl :H7) (NRCC 4283) se pěstovaly při 37 °C ve fermentoru v destilované vodě obsahující dehydratovanou Brain Heart Iníusion (BHI; 3 7 g/1) (Difco Laboratories, Detroit, Michigan). Před růstem ve fermentoru se lyofilizované vlákno původně pěstovalo v 50 ml BHI roztoku (viz výše) v Erlenmayerově nádobě, která se třepala při 37 °C 7 hodin při 200 r.p.m. Pěstování se poté transferovalo do 1,5 litru BHI (viz výše) a probíhalo 7 hodin za stejných podmínek jak se popisuje výše. Toto inokulum se poté transferovalo do fermentoru.

Postupy použité pro isolaci a čištění kapsulámího polysacharidů E. coli K1 byly identické r- s postupy popsanými výše pro isolaci meningokokálních polysacharidů skupiny B.

Ocení se, že postupy pro isolaci a čištění popsané výše nejsou jediné použitelné, přístupné jsou další publikované postupy, na příklad Watson et al., J. Immunol., 81, 331 (1958) a výše zmíněný U S. patent 4,727,136.

Kvůli získání reaktivní aminoskupiny na zbytcích sialových kyselin v molekule se nativní polysacharid N-deacyluje. N-deacylace se provádí jakýmkoli známým způsobem, na příklad v • ··· · · · ···· ······ · · ···· · · · · · · · · · · bazickém vodném prostředí při zvýšené teplotě, 90 až 110 °C, pH 13 až 14. Jako bazické vodné prostředí je vhodný vodný roztok hydroxidu alkalického kovu, na příklad hydroxidu sodného o koncentraci 2M. Alternativně se používá vodný roztok hydrazinu. Stupeň N-deacylace se liší od 30 % do 100 % v závislosti na podmínkách. Výhodnější je dosažení 90 až 100% N-deacylace. N-deacylovaný produkt se isoluje na příklad ochlazením, neutralizací, případným čištěním a lyofilizací.

Výsledkem N-deacylace jsou fragmenty polysacharidu o průměrné molekulové hmotnosti v rozmezí 3 000 až 50 000 Daltonů. V tomto vynálezu se používají fragmenty polysacharidu nebo polysacharidy o plné délce.

N-deacylované fragmenty polysacharidu nebo polysacharidy o plné délce se poté N-acylují pro získám odpovídajícího N-acetylovaného produktu. N-acylace se provádí rozpuštěním N-deacetylovaného polysacharidu ve vodném pufrovaném prostředí s pH 7,5 až 9, následným přídavkem odpovídajícího nenasyceného acylanhydridu, v nezávazné přítomností alkoholu pro zvýšení rozpustnosti, a chlazením na méně než 10 °C, dokud reakce není hotova. Případně se reakční médium purifikuje. Nelimitující příklady použitelných purifikačních metod zahrnují dialýzu následovanou isolací N-acylovaného produktu lyofilizací. Reakce je v podstatě hotova během 10 až 20 hodin. Stupeň N-acylace se měří analytickými technikami, běžně ’H NMR, a je nejméně 90 %, spise se blíží 100 %. N-acylační reakce nevede k žádné podstatné redukci molekulové hmotnosti fragmentů.

Konjugátové molekuly podle vynálezu mají obecný vzorec II r₂-c^ .

NH-protein

Vzorec II kde R₂ je nenasycená C₂-C₄acylová skupina Konjugáty proto zahrnuji nenasycené polysacharidy podle vynálezu a také akryloylderivát.

Předkládaný vynález pro konjugační účely s výhodou používá C₂-C₄ N-acylovaný materiál s průměrnou molekulovou hmotností odpovídající 10 až 200 zbytkům sialových kyselin. Výhodným konjugátem je N-akryloyl (2-propenoyl) derivát. Obecně se toho dosahuje pomocí gelové filtrace N-acylovaného GBMP s použitím sloupce Ultragelu (trademark AcA 44; průměr zrna 60 až 140 pm) a PBS jako eluantu. Alternativně se používá dimenzovaná membrána.

S výhodou še pro vynález používá nenasycenný N-acylovaný materiál s průměrnou molekulovou hmotností 30 000 až 40 000 Daltonů, na příklad 10 000 až 15 000 Daltonů. Získá se spojením frakcí eluátu ze sloupce obsahujícího N-acylovaný GBMP materiál s průměrnou molekulovou hmotností daného rozmezí. N-acylovaný materiál s vyšší průměrnou molekulovou hmotností, na příklad v oblasti 30 000 až 40 000 Daltonů, se také ukázal být použitelný pro vynález.

Molární poměr polysacharidu k proteinu v konjugátové molekule podle vynálezu je výhodně 1 mol proteinu na 20 molů polysacharidu. Výhodnější je poměr 1 mol proteinu na 2 až 15 molů polysacharidu. Nejvýhodnější je poměr 1 mol proteinu na 4 až 7 molů polysacharidu. Variace v poměru protein/polysacharid se dosahují adjustací poměru výchozích látek při konjugační reakci.

Kromě poskytnutí konjugátových molekul zahrnujících nenasycené N-acyl derivatizované polysacharidy konjugované s proteinem, vynález také uvažuje multivalentní konjugáty a vakcíny, kde jsou různé typy polysacharidů konjugovány k jedinému proteinu.

Vakcíny podle vynálezu vznikají konjugací nenasyceného N-acylovaného polysacharidu s imunologicky vhodným nosičovým proteinem. S výhodou je samotný nosičovy protein imunogenem. Nelimitující příklady vhodných nosičových proteinů jsou bakteriální proteiny nebo polypeptidy včetně toxoidu tetanu, toxoidu diphterie, křížově reagujících látek (CRMs), výhodně CRM₁₉₇ (Sclavo Ltd., Siena, Italy) a bakteriální proteinové nosiče jako meningokokální proteiny vnější membrány.

Pro konjugaci fragmentů modifikovaných polysacharidů s proteinovým nosičem je použitelný jakýkoliv způsob konjugace Výhodný je způsob popsaný v U.S. patentu 4,356,170, tzn. zavedení terminálních áldehydovýčh skupin (oxidací cis-vicinálriích •hytft-oxylóvých skupin) ___do N-acylovaného polysacharidu a spojení áldehydovýčh skupin s aminoskupinami proteinu reduktivní aminací. Polysacharid a protein jsou pak spojeny vazbou -CH₂-NH-protein.

Nicméně se rozumí, že konjugátové vakcíny podle vynálezu nejsou limitovány na konjugáty vzniklé reduktivní aminací. Vakcíny se mohou také připravit konjugací N-acylovaného polysacharidu s nosičovým proteinem s použitím raménka dihydrazidu kyseliny adipové, jak popisuje Schneerson R. et al., Preparation, Characterization and Immunogenicity of Haemophilus influenzae type b Polvsaccharide-Protein Conjugátes. J . Exp, Med.. 1952, 361-476 (1980) a US. patent 4,644,059, Laňce K. Gordon. Alternativně je použitelná technologie binárního raménka • 9

vyvinuta Merckem, jak popisuje Marburg S. et al., “Biomolecular Chemistry of Macromolecules: Synthesis óf Bacterial Polysaccharide conjugates with Neisšefia meningitidis Membrane Protein”, J. Am, Chem. Soc., 108, 5282-5287 (1986), nebo metoda redukování konců.

Konjugátové molekuly připravené podle vynálezu typicky zahrnují protein, na který se váže alespoň jeden fragment meningokokálního polysacharidu podle předkládaného vynálezu prostřednictvím jednoho vazebného místa na terminálním konci páteře polysacharidového fragmentu. Tento vynález umožňuje produkovat meningokokální konjugátové molekuly, kde je polysacharidová složka, s výjimkou jednoho konce, nekryta proteinem. Další způsoby konjugace meningokokálních polysacharidů s proteinem prostřednictvím rozvětvených terminálních sialových kyselin mohou vést k zesíťování a připojení polysacharidu k proteinu na více místech. Vynález také Uvažuje konjugátové molekuly, které vznikají kombinací metod.

Výsledné konjugáty N-acylovaný polysacharid-protein podle vynálezu se testovaly in vitro na myších a ukázalo se, že mají vylepšené imunogenní vlastnosti ve srovnání s N-propionylovaným polysacharidem. Navíc se pozoroval podstatně redukovaný vznik křížově reagujících protilítek. Nenasycený konjugát vykázal nečekaně vysoké baktericidní titry ve srovnání s jinými testovanými konjugáty. Ve světle toho se má za to, že vakcíny podle vynálezu budou užitečné proti meningitidě způsobené organismy skupiny Β N. meningitidis nebo E. coli Kl. Velký zájem je o vakcíny pro ochranu dětí, které jsou k bakteriální meningitidě nejnáchylnější.

Vakcíny podle vynálezu zahrnují standardní nosiče, pufry nebo stabilizační prostředky známé odborníkům jako vhodné pro vakcíny. Pro zvýšení imunogenní odpovědi se do formulace navíc dají začlenit adjuvanty jako alum nebo stearyl tyrosinu.

Vakcíny podle vynálezu se typicky tvoří disperzí konjugátu v jakémkoli farmaceuticky přijatelném nosiči, jako fyziologický roztok nebo jiné injektabiiní kapaliny. Vakcína podle předkládaného vynálezu se administruje jakýmkoliv známým způsobem, včetně, ale bez omezení, podkožního, intraperitonálního nebo intramuskulárního. Preferovaným způsobem administrace vakcíny je parenterální administrace. Mohou být přítomna obvyklá aditiva, na příklad stabilizátory jako laktóza nebo sorbitol a adjuvanty jako fosfát, hydroxid nebo síran hlinitý.

Vakcíny podle předkládaného vynálezu se administrují v množstvích dostatečných pro vyvolání imunogenní odpovědi. Typická dávka účinná pro vyvolání odpovědi je 1 až 50 pg polysacharidu. Dávkování se adjustuje na základě velikosti, váhy a věku jednotlivce dostávajícího vakcínu. Protilátková odpověď u jednotlivce se monitoruje na základě protilátkového titrů nebo ·· ···· ·· baktericidní aktivity a zvyšuje se v případe nutnosti zvýšení odpovědi.

Vhodná dávka vakcíny pro děti je obecně v rozmezí 5 až 25 pg, nebo I až 10 pg na kilogram tělesně váhy.

Příklady provedení vynálezu

Příklady ukazují různé aspekty provádění vynálezu a nijak nelimitují rozsah vynálezu.

Příklad 1

Syntéza N-akryloyl-GBMP. Syntézu N-akryloyl-GBMP popisuje Roy R. et al., Glycoconiugate J. 7, 3-12, 1990. N-deacylovaný GBMP (150 mg) se rozpustil v 2,0 ml destilované vody. Roztok se ochladil na 0 °C a po Částech 50 pl (1 ekv.) se přidával akryloylchlorid (Aldrich chemica! Co.) na celkový objem 500 pl. S použitím autotitrační jednotky se pH roztoku upravilo 4M NaOH na pH 8,5. Po úplném přídavku acylchloridu (2 hodiny) se pH zvýšilo na 12 a udržovalo na této úrovni 30 minut. Látka se čistila vyčerpávající dialýzou proti destilované vodě při 4 °C, následnou lyofilizací na 163 mg. H NMR látky prokázalo podle příslušného integračního vzoru pro akryloylový substituent 100% N-acylaci.

Příklad 2

Aktivace N-akryloyl-GBMP. N-akryloyl-GBMP (150 mg) se rozpustil v destilované vodě (1,25 ml), následovala adice 3,75 ml 0,2M vodného roztoku (~50 ekv.) NalO₄. Roztok se udržoval ve tmě při teplotě místnosti 1 hodinu, následovala adice ethylenglykolu (400 pl, 10 ekv). Po 1 hodině při teplotě místnosti se roztok přímo nanesl na sloupec Sephadexu G-10 (1,6 x 100) ekvilibrovaného ve vodě (Pharmacia Fine Chemicals). Aktivovaný produkt se eluoval ze sloupce v píku mezerového objemu, oddělil a lyofilizoval. Oxidovaný produkt se poté frakcionoval na sloupci BioGelu A. 5 (1,6 x 100) (BioRad) ekvilibrovaném fosfátovým fyziologickým pufrem (pH 7,6). Soubory molekulových vah se stanovily na základě HPLC (vusokoúčinná kapalinová chromatografie) analýzy (Pharmacia-Superose, 12 column) vybraných frakcí eluované látky. Srovnání relativní hodnoty Kav každé frakce s předem sestrojenou kalibrační křivkou umožnilo • · · · · ·

Selekci diskrétních 1IKD frakcí oxidovaného akryloyl-GBMP. Frakce se čistily dialýzou jak se popisuje výše. II NMR spektroskopie frakcionované látky byla konsistentní s N-akryloyl-GBMP.

Příklad 3

Příprava konjugátu toxoidu tetanu s N-akryloyi-GBMP Čerstvě čištěný monomer toxoidu tetanu (TT-m, 3,5 mg) se konjugoval v Piercově reakční vialce s 10,5 mg UKD frakce oxidovaného akryloyl-GBMP. Přidal se kyanborohydrid sodný (7,0 mg) a směs se rozpustila v 233 μΐ fosfátového pufru (O,1M, pH 7,5). Roztok se inkuboval při 37 °C celkem 5 dní. Konjugace se periodicky monitorovala pomocí velikostní vylučovací HPLC (Superose-12, Pharmacia) vizualizací posunu k vyšší molekulově váze s pokračující konjugací. Výsledný konjugát se čistil od výchozích látek frakcionací na sloupci BioGelu A 5 ekvilibrovaném v PBS a následnou dialýzou a lyofilizací. Kolorimetrické stanovení celkových sialových kyselin (Svennerholmova metoda) a proteinu (BCA metoda, Pierce) indikovalo konjugáty obsahující 12 až 30% sialové kyseliny.

Příklad 4

Imunizace myší. Deset myších samiček CF1 (8 až 10 týdnů stalých) se typicky imunizovalo intraperitoneálně (0,2 ml) množstvím konjugátu ekvivalentním 2 pg sialové kyseliny s nebo bez přídavku adjuvantů jako Alum (Alhydrogel, Superfos Biosector) nebo RIBI s kompletní nebo složkový adjuvantní systém (RIBJ Jmmunochem). Po počáteční vakcinaci následovaly pomocné vakcinace v 21. a 35. dni, a ve 45. dni exsanguinaee Krev se Oddělila pomocí srdeční punkce a sérum se uchovávalo v alikvotech při -86 °C.

Příklad 5

Baktericidní test. Baktericidni test se prováděl na tkáňové kultuře na 96-komůrkových mikrotitračních destičkách (Corning). Všechna aritiséra se před použitím tepelně inaktivovala 30 minut při 56 ^CC. Meningókok skupiny B (vlákno 80-165 B:2b:p.l) se pěstoval přes noc na čokoládových agarových miskách (QueLab) ph 37 °C v 5% CO₂ atmosféře, následovala inokulace ·· fafa·· • fa druhé misky a inkubace 5 hodin. Odpovídající ředění antiséra se prováděla přímo na misce s použitím Hankova vyváženého solného roztoku (IIBSS) jako diluentu s konečným objemem 50 μΐ na komůrku. Připravila se suspenze GBM v HBSS o absorbanci O.D. (λ₅₈₀) = 0,1. Tato suspenze se narodila 40 000 krát v HBSS za dosaženi konečného pracovního zředění bakterie pro test. Do každé jamky se přidal čerstvě rozpuštěný komplement králičího mláděte (Pel-Freeze Biologicals) a následně 30 μΐ pracovního ředění bakterie. Miska se třepala jednu hodinu při 37 °C. Obsahy každé jamky (35 μΐ) se před nanesením na čokoládové agarové misky promíchaly. Misky se potě inkubovaly přes noc při 37 °C v 5% CO₂ a spočítal se počet jednotek tvořících kolonii (CFU). Usmrcení se určilo v % vzhledem k průměrným hodnotám buď HBSS kontrolních jamek, nebo irelevantnímu antiséru následujícím způsobem:

% usmrcení - (CFU_kontrola - CFU_antlscnim / CFU_kontroIa) x 100

Příklad 6

Test pasivní ochrany. Myši antiséra získaná z imunizací N-acyl GBMP-TT se zředila sterilním fyziologickým roztokem nebo PBS (fosfátem pufrovaný fyziologický roztok). Skupinám pěti myších samiček CF1 starých 8 až 10 týdnů se intravenózně injektovalo 200 μ 1 zředěného antiséra. Po jedné hodině se každé skupině myší intraperitoneálně injektovalo (500 ·μ1; 800 až 1200 CFU/ml) suspenze skupiny B Neisseria meningiditis (GMB 80165 B:2b:P.l). Po pěti hodinách se jednotlivým myším odebrala krev srdeční punkcí a 10μ1 krve se vložilo na čokoládové agarové misky. Misky se inkubovaly při 37 °C v 5% CÓ₂ a o 15 až 20 hodin později se určil počet jednotek tvořících kolonii (CFU).

Test pasivní ochrany je založen na redukci vymizení bakterie v přítomnosti specifické protilátky a měří se vzhledem ke kontrolní skupině postrádající specifickou protilátku. Stupeň ochrany poskytnutý myším anti-N-acyl GBMP konjugátovým sérem se vyjadřuje v % redukce CFU pro každé antisérum vzhledem k irelevantnímu kontrolnímu séru nebo PBS.

····

·· ·· ·· • · ♦ · · ·· · · · · ·· · · ··· · · 9 ♦ · · ·· • 9 9 9 9 99

9999 99··

Příklad Ί

Syntéza a biologická aktivita vakcíny proti séroskupině B Neisseria meningiditis. Na základe unikátní modifikace nativního polysacharidů se navrhla a syntetizovala nová konjugátová vakcína proti séroskupině B Neisseria wenňigzďzízs. Nativní polysacharid (N-Ac GBMP) se derivatizoval na amino-konci kompletní substitucí N-acetylové skupiny N-akryloylskupinami (NM-CO-CI L CHj). Fyzikální metody jako Ή a ⁿC NMR spektroskopie s jistotou určily identitu a homogenitu nových látek a velikostní vylučovací I IPLC prokázala, že nedošlo k depolymerizaci a nezměnila se velikost molekul polysacharidů Konjugáty s proteiny se vytvořily podle popsaných postupů. Stručně řečeno, z připraveného výchozího N-akryloyl GBM polysacharidů se vytvořily dvě rozdílné šarže konjugátů N-akryloyl GBM-toxoid tetanu. Kolorimetrická analýza každého konjugátu prokázala 13%, respektive 20% poměr sialových kyselin ke konjugátu. ‘H NMR spektroskopie konjugátů prokázala nezměněnou přítomnost modifikovaného polysacharidů na proteinu.

V separátních animálních experimentech se N-akryloyl GBMP-TT konjugáty injektovaly myším společně s fyziologickým roztokem, hydroxidem hlinitým, nebo RIBl s kompletním adjuvantem (MPL + TDM + CWS) v jednom případě, a pouze s RIBl s adjuvantem v případě druhém. Vakcíny byly u myší viditelně tolerovány.

Serologické testování každého antiséra ukázalo, že oba konjugáty vyvolaly specifickou odpověď srovnatelnou nebo vyšší než jaká se pozorovala u N-propionyl GBMP-TT konstruktů s použitím RIBl s adjuvantního systému (viz Tabulka 1). Předběžné studie týkající se křížové reaktivity N-akryloyl GBMP-TT antiséra ukázaly podobné výsledky jako stupeň křížové reaktivity pozorovaný u N-propionyl GBMP-TT antiséra (viz Tabulka 2). Jedna ze dvou šarží N-akryloyl GBMP-TT antiséra ukázaka podstatně nižší křížovou reaktivitu s nativním GBMP ve srovnání s N-propionyl GBMP-TT konstruktem administrovaným ve stejném experimentu.

Obě šarže N-akryloyl GBMP-TT se testovaly na baktericidní aktivitu proti živým GBM a vykázaly signifikantní aktivitu ve srovnání s N-propionyl GBMP-TT antisérem. Tyto výsledky jsou shrnuty v Tabulkách 1 a 3, Výsledky v Tabulce 1 jsou z duplikátního baktericidního testu a jsou v souhlase s hodnotami ředění získanými z jiných testů prováděných se stejným materiálem. Údaje v Tabulce 1 jsou v souhlase s akryloylem vykazujícím zvláště efektivní baktericidní aktivitu. Tabulka 3 porovnává baktericidní aktivitu dvou šarží N-akryloyl GBMP-TT antiséra a

N-propionyl GBMP-TT antiséra získanou ve stejných animálních experimentech. Testy použily 15 násobné množství bakterií a tak se detekovala pouze antiséra vykazující silnou aktivitu. Ze srovnání N-akryloyl GBMP-TT antiséra a N-propionyl GBMP-TT antiséra se ukazuje, že baktericidní aktivity jsou skutečně ekvivalentní.

Studie pasivní ochrany se prováděly s raznými ředěními, z nichž všechna vykazovala signifikantní vymizení, z čehož se usuzuje na ochranu myší (viz Tabulka 1). Srovnání s N-propionyl GBMP-TT antisérem při razných ředěních dálo opět identické výsledky. Srovnání dvou šarží N-akryloyl GBMP-TT antiséra v testu pasivní ochrany ukázalo, že obě šarže chrání myši srovnatelně, v rámci experimentální chyby (viz Tabulka 3).

·· ···· ·* ·· ·· ·· • · · ···· · · · · • · · · ····· • · · · · 4 · ··· · · ··«··· ··· ·«·· ·· ··«« ·· ·«

Tabulka 1. Přehled experimentu RPV-1-63 srovnávajícího vlastnosti modifikovaných konjugátů meningokokálního polysacharidu skupiny B s toxoidem tetanu v různých adjuvantech.

% Vymizení GBM 80-165 při různém ředění antimodifikovaného GBMP-TT/RIBI séra vzhledem ke kontrolnímu HBSS.

kO		o	xt
		CM	O
5Γ		Ok	cn
tn	cn		00
cn	kO	kO	' ·-—<
CM	CO	t!	CM

r-	Ok	00	O
kO	1/Ί		00
\o-	po	CM	CM
óo	00	cn
•ťň	rv	t/Ί

-(

Tabulka 2. Křížová reakce modifikovaného N-acyl GBM-TT antiséra (RPV-1-63) s nativním N-acetyl GBMP antigenem

p	oó	CO
c		4-4	\0
•£3	o	4?	.-1—9
• i—	ctí	O
><D g	t Z	ctí 1 *7
O		1^-t

oo

O kO V-M o ox xt

CM 'n


>> O ctí	Um . -W	cn r-	AD	m AD	0 ^r
-4m>	en	CM	0	0
ž		•r—4	<O	CM	0
	7<A	SD		iři

ř#-»

>>

4-» OJ o ctf i

Z

Ch cn xr \©

kn	<0	O	vo
Ch	CM	aď	'T
r-	CM	r—¹	iC>

	Ch
Γ7	Γ-	'r—4	CM
	Ch	Ch	CM
CM	0	Tt	O
,<Ó		AO	m

4-»	σχ	CX in		\P ΤΓ
4> 8			co
Z

c*i		Ch

r-	00
	CM
	Ό
CM	CM
H H	H
	>
03 O	O
C .2	Ss 0 c
'o.	«3
0 l-	3
0-	03
ž	Z

tT Ό Γ- CM	00 cn cn
H	''Η
H
	H 1
O	Λ
K—f	O
	• H
0
c:	jO
Ctí
4-» .c	č?
<D
Ž	. 1 z

N-acetyl představuje konjugát N-acetyl GBMP s albuminem lidského séra jako povrchovým antigenem.

x>

Tabulka 3. Přehled ochranných vlastností dvou šarží N-Akryloyl GBMP-TT antiséra vzhledem kN-Propionyl GBMP-TT antiséru.

O ·*—¹ oó O oo r-

	'z*-s
tn	tn
1	t

> o-	i > o.
2	ž
H	f—' 1
<n	FS o
>> c 2	o c
Ή	ctí
o v-	5
icu
Z	ž

- ΛΟ .

I 1 z z

Ό 4?

• ··

Přiklad 8

Další studie s použitím N-acyl modifikovaných GBMP-TT konjugátů. Způsobem výše popsaným se syntetizovala série N-acyl modifikovaných GBMpolysacharidů, N-propionyl GBMP (NPr), N-butanoyl GBMP (NBu), N-pentanoyl GBMP (NPe) a N-akryloyl GBMP (Nakryl), s výjimkou použití kontrolovaného pH k omezení depolymerace polysacharidů. Ή a ¹³C NMR spektroskopie umožnila úplnou identifikaci modifikovaných polysacharidů a zjistilo se, že každý polysacharid byl 100% derivatizován S pomocí SEC-IIPLC na standardním sloupci se generovala série oxidovaných polysacharidových fragmentů se stejnou molekulovou hmotností (11 KD). Všechny konjugáty se syntetizovaly za přesně shodných podmínek. Kolorimetrická analýza konjugátů poskytla následující složení sialových kyselin: NPr-28 %, NBu-30 %, NPe-18 %, NAkryi-19%.

Myši se imunizovaly 2 pg sialové kyseliny/konjugátu buď ve fyziologickém roztoku absorbovaném na hydroxidu hlinitém, nebo emulsifikovaně v RIBIs adjuvantu. Všechny konjugáty byly v myších dobře tolerovány bez viditelných znaků malátnosti.

ELIS A titrace různých antisér proti homologním polysacharidovým antigenům jsou shrnuty v Tabulce 1. Adjuvant vykazující nej vyšší titry byl nalezen v RIBIs sérii a rostl od N-propionyl k N-pentanoyl a dokázal tak předchozí pozorování s jinými hydrofobními adjuvantními systémy. V adjuvantním systému jako alum se odpovídající trend v litrech nepozoroval. Specifita vůči imunizujícím polysacharidům také rostla se vzrůstající délkou acylového řetězce od N-propionylu k N-pentanoylu, což se nejvýrazněji projevilo v RIBI s sérii (viz Tabulka 2). Tento výsledek je také v souhlase s předchozími výsledky ukazujícími stejný trend. Navzdory nárůstu v litru a specifitě není společný nárůst v aktivitě proti nativní bakterii jak v baktericidních testech tak v testech pasivní produkce N-Pr antisérum vykazuje podstatně vyšší baktericidní titry (14 až 25 krát vyšší) na 50 a 90% úrovních vzhledem k N-Bu a N-Pe antisérum. V souhlase s tím studie pasivní ochrany při různých ředěních antiséra vykazují signifikantní vymizení bakterie u N-Bu a N-Pe pouze při nejvyšší koncentraci, naproti tomu N-Pr antisérum vykazuje signifikantní vymizení dokonce při ředění 1.6.

Průmysl ová využitelnost

Vynález poskytuje nové meningokokální nenasycené N-acyl derivatizované polysacharidy skupiny B Neissería meningitidis, nově konjugáty meningokokálních nenasycených N-acyl derivatizovaných polysacharidů skupiny B a farmaceutické přípravky zahrnující konjugátové molekuly fragmentu meningokokálních nenasycených N-acyl derivatizovaných polysacharidů skupiny B kovalentně vázaných na proteiny. Vynález dále poskytuje vakcíny, ve kterých jsou modifikované polysacharidy konjugovány s proteinovým nosičem.

·· ···· ·· ·

9 99 · · ·· • 9 9 9 99

999 9 9 9 9 99 9

Claims

PA T ENTO V É N Á ROK Y

1.

Modifikovaný meningokokální polysacharid skupiny B, vy znač u j í c í s e ti m, že N-acetylové skupiny jsou substituovány N-acyl derivátem podle obecného vzorce I:

7/°

R_rC

NH—

Vzorec 1 kde R, je C₃-C₄ nenasycená alkylová skupina obsahující alespoň jednu dvojnou vazbu.
2.

Polysacharid podle nároku 1, vyznačuj ící se tim,žeRj obsahuje čtyři uhlíky a dvě nesousedící dvojné vazby.
3.

Polysacharid podle nároku 1, vyznačuj ici se jednu dvojnou vazbu.

ti m, že R] obsahuje čtyři uhlíky a
4.

Polysacharid podle nároku 1, vy znač u j í c i s e t í m, že Rj obsahuje tři uhlíky.
5.

Polysacharid podle nároku 2, vyznač uj í číše
6.
7.
8.
9.

Polysacharid podle nároku 3, vy z n a č u j í c í s e t í m, že R; je CH₂=CH-CH₂.

Polysacharid podle nároku 1,vyznačuj i c í s e t í m, že uhlík nej vzdálenější od acylového uhlíku je vázán dvojnou vazbou.

Polysacharid podle nároku 7, vyznačující se t í m, že R₃ obsahuje čtyři uhlíky

Polysacharid podle nároku 7, v y z n a č uj ící se tím, že Rj obsahuje tři uhlíky.

Konjugátová molekula, v y z n a č u j í c í set i m, že zahrnuje alespoň jeden polysacharidový fragment obecného vzorce II:
10.

• · · · o

II

R₂-C—NH

Vzorec II kde R₂ je nenasycená acylová skupina, obsahující alespoň jednu dvojnou vazbu, a fragment se kovalentne váže na protein.
11. Konjugátová molekula podle nároku 10, vy značuj ící s e t í m, že protein se odvozuje od bakterie.
12. Konjugátová molekula podle nároku 11, vyzn a č u j i c i s e t í m, že bakterie je Neisseria meningiditis.
13. Konjugátová molekula podle nároku 10, v y z n a č uj í c i s e t i m, že protein se odvozuje od bakterie vybrané ze skupiny skládající se z toxoidu tetanu, toxoidu diphterie, CRM₎₉₇ a proteinů meningokokální vnější membrány OMP.
14. Konjugátová molekula podle nároku 10, v y z n a č uj í c í se t í m, že polysacharidový fragment je N-acyl derivatizovaný polysacharid, protein je toxoid tetanu a DMP a molekulová hmotnost polysacharidového fragmentu je 3 kDa až 50 kDa.
15. Konjugátová molekula podle nároku 10, v y z n a č u j i c i s e t í m, že polysacharidový fragment je N-acyl derivatizovaný polysacharid, protein je toxoid tetanu a DMP a molekulová hmotnost polysacharidového fragmentu je 10 000.
16. Konjugátová molekula podle nároku 19, v y z n a č u j i c i s e t í m, že molámí poměr mezi polysacharidem a proteinem je 20 polysacharidů na 1 protein.
17. Konjugátová molekula podle nároku 20, v y z n a č u j i c i s e t í m, že molámí poměr mezi polysacharidem a proteinem je 4 až 7 molů polysacharidu na 1 mol proteinu.
18. Konjugátová molekula podle nároku 10, v y z n a č u j í c í s e t í m, že obsahuje N-acyl derivátizované fragmenty.
19. Vakcinový přípravek zkonjugátové molekuly, v y z n ač u j í c í s e t í τη, že obsahuje meningokokální nenasycený C₃-C₅ N-acyl derivatizovaný polysacharidový fragment skupiny B kovalentně vázaný na protein.
20. Vakcinový přípravek podle nároku 19, v y z n a č u j í c í s e t í m, že proteinová složka se odvozuje od bakterie vybrané ze skupiny Skládající se z toxoidu tetanu, toxoidu diphterie, CRM₎₉₇ a proteinů meningokokální vnější membrány.
21. Vakcinový přípravek podle nároku 19, vy značují c í se t í m, že fragment je N-acyl derivatizovaný polysacharid a molekulová hmotnost polysacharidového fragmentu je 3kDaaž50kDa.
22. Vakcinový přípravek podle nároku 19, v y z nač u j ící s e t í m, že proteinová složka se odvozuje od Neisseria meningiditis.
23. Imunitní sérum, v y z n a č u j i c í s e t í m, že Obsahuje protilátky vyvolané v savci imunizovaném konjugátem podle nároku 10.
24. Imunitní sérum podle nároku 23, vy z n a č u j í c í setí m, že polysacharidy z konjugátu jsou fragmenty nenasycených C₃-C₅ N-acyl derivatizovaných polysacharidu.
25. Způsob imunizace savců proti Neisseria meningiditis aE. coli K1 infekcím, « v y z n a Č u j í c í s e t í m, že zahrnuje administraci savci imunizačního množství vakciny podle nároku 19.