CZ394297A3 - Streptokokové proteiny teplotního šoku ze skupiny HSP70 - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález popisuje nové proteiny teplotního šoku (HSP) bakterií Streptoccocus pneumoniae, Streptoccocus pyogenes a Streptoccocus agalactiae a imunologicky příbuzné polypeptidy, které tvoří základ nových imunoterapeutických, profylaktických a diagnostických činidel použitelných pro léčbu, prevenci a diagnostiku nemocí. Tento vynález se zejména týká proteinů teplotního šoku bakterií S. pneumoniae,

S. pyogenes a S. agalactiae, které patří do rodiny proteinů HSP70, jejichž zdánlivá molekulová hmotnost je 70 až 72 kilodaltonú. Vynález se dále týká odpovídajících nukleotidů a odvozených sekvencí aminokyselin, produkce HSP70/HSP72 a imunologicky příbuzných polypeptidů za použití metod genového inženýrství, protilátek, které vážou zmíněné proteiny HSP a způsobů a kompozic vhodných pro diagnostikování, prevenci a léčbu nemocí, které způsobují bakterie S. pneumoniae a jim příbuzné bakterie, jako jsou Streptoccocus pyogenes a Streptoccocus agalactiae.

Dosavadní stav techniky

Bakterie S. pneumoniae jsou důležité agens lidských nemocí, zvláště u kojenců, starých lidí a u osob se sníženou imunitou. Tyto bakterie se často izolují u pacientů z celého světa, kteří mají invazivní onemocnění s vysokou nemocností a úmrtností, jako je bakteriémie/septikémie, pneumonie a meningitida.

Ačkoli příchod antimikrobiálních léků snižil celkovou úmrtnost v případě pneumokokových onemocnění, hlavní problém dnešních dnů po celém světě je existence rezistentních • Φ φφφφ pneumokokových organizmů. Účinné pneumokokové vakciny mohou mít hlavni vliv na nemocnost a úmrtnost spojenou s onemocněním, které je způsobeno bakteriemi S.pneumoniae. Takové vakciny se také mohou použít při prevenci otitid u kojenců a malých dětí.

Je zřejmé, že řada pneumokokových faktorů hraje důležitou úlohu při patogenitě onemocnění (G.J.Boulnois, J.Gen.Microbiol., 138, pp. 249-259 (1992); C.J.Lee et al.,

Crit. Rev. Microbiol., 18, pp. 89-114 (1991)). Kapsule pneumokoků, navzdory chybějící toxicitě, se považují za bezpodmíněčně nutné v případech pneumokokové virulence. Na základě antigenní rozdílnosti se určilo více jak 80 pneumokokových kapsulárních sérotypů. Protilátky slouží jako mechanizmus ochrany a je dobře známa důležitá úloha antikapsulárních protilátek v ochranném systému hostitele proti bakteriím S.pneumoniae. (R.Austrian, Am.J.Med., 67, pp. 547-549 (1979)). Přesto současně dostupná pneumokokové vakcína, která obsahuje 23 kapsulárních polysacharidů, jež jsou nej častější příčinou onemocnění, má podstatné nedostatky, jako jsou nízká imunogenita kapsulárních polysacharidů, diverzita sérotypů a výskyt různých sérotypů v různém čase, v různých geografických oblastech a v různých věkových skupinách. Zvláště neúspěch existujících vakcín při ochraně malých dětí proti většině sérotypů je trnitým ohodnocením jiných komponentů bakterií S.pneumoniae. Vyskytuje se stále více důkazů, které potvrzují, že určité pneumokokové proteiny jsou aktivní, jak při ochraně proti onemocnění tak i při jeho patogenitě (J.C.Paton, Ann. Rev. Microbiol., 47, pp.89-115 (1993)). Avšak, studovalo se pouze několik proteinů S.pneumoniae. Výsledkem může být nedostatek proteinově specifických protilátek, proto je obtížné studovat úlohu proteinových antigenů při ochraně a patogenitě. Věří se, že pneumokokové proteinové antigeny nejsou příliš

• · imunogenni a že většina odezev protilátek je na fosfocholin a kapsulárni polysacharidy (L.S.McDaniel et al., J.Exp.Med., 160, pp. 389-397 (1984); R.M.Krause, Adv.Immunol., 12, pp. 156 (1970); D.G.Braun et al., J.Exp.Med., 129, pp. 809-830 (1969)). Při studii na imunodeficitnich myších, jejichž odezva na sacharidové antigeny a na fosfocholin je slabá, ale které vykazují relativně normální odezvy na proteinové antigeny, se zjistilo, že frekvence výskytu monoklonálních protilátek reagujících s pneumokokovými proteinovými antigeny je méně než 10%. Tato skutečnost naznačuje, že proteiny bakterií S. pneumoniae jsou slabými imunogeny (McDaniel et al., citace uvedena shora).

Bakterie Streptoccocus agalactiae, které se také nazývají streptokoky skupiny B (GBS), nejběžněji způsobují sepse (krevní infekce) a u novorozenců mengitidu. U kojenců jsou GBS také často příčinou pneumonie. V USA každý rok přibližně 8 000 kojenců onemocní GBS infekcí; 5 až 15% těchto dětí zemře. Kojenci, kteří tuto infekci přežijí, zvláště jdeli o meninigitidu, mohou mít dlouho přetrvávající problémy, jako jsou ztráta sluchu a zraku nebo poruchy učení. V případě těhotných žen GBS mohou způsobit infekce močových cest, infekce vnitřních genitálií (amnionitida, endometritida) a narození mrtvého plodu. U žen, které nejsou těhotné, a mužů nejběžnějším onemocněním způsobeným GBS je infekce krve, kůže nebo měkké tkáně a pneumonie. Přibližně 20% žen, které nejsou těhotné, a mužů s onemocněním způsobené GBS zemře. Infekce způsobené GBS jsou obvykle u novorozenců i u dospělých léčeny antibiotiky (například penicilín nebo ampicilin), které se aplikují intravenozně. Jestliže těhotným ženám během porodu intravenozně aplikujeme antibiotika, můžeme se u novorozenců předejít onemocnění, které způsobují GBS. Vyvíjejí se vakcíny pro prevenci onemocnění, které způsobují GBS. V budoucnosti se očekává, že vakcinované ženy budou tvořit protilátky, • · které projdou placentou a tak ochrání novorozence během porodu a těsně po narození.

Od osmdesátých let se Streptoccocus pyogenes, který se také nazývá streptokokus skupiny A (GAS) , znovu objevuje jako agens vážných onemocnění, příčinou čehož je zvýšení virulence bakteriálního organizmu. GAS způsobují faryngitidu, běžně nazývanou streptokoková angína, a infekce kůže (impetigo, erysipel/celulitida). Streptokoková angína a impetigo mohou vést k onemocnění nazývanému glomerulonefritida (poškození ledvin). Přibližně 3% onemocnění streptokokové angíny vede k onemocnění nazývanému revmatická horečka (migrující artritida), jejíž komplikace zahrnují chorea (neurologické symptomy), a v 50% případů dochází k revmatickému onemocnění srdce (poškození srdeční chlopně) s možnou následnou dlouho trvající endokarditidou. Aby se předešlo komplikacím je důležité léčit impetigo a streptokokovou angínu antibiotiky. Infekce kmeny, které produkují toxíny vede k onemocnění, které se nazývá spála (difúzní vyrážka a teplota) nebo k velmi vážnému onemocnění, kterým je streptokokový toxický.šok (TSS; GAS se nazývají masožravé bakterie), jež se charakterizuje rychlým vývojem šoku a systémovým selháním více orgánů. Úmrtnost v případě TSS je 30 až 70% a agresivní léčba zahrnuje odstranění ložiska bakteriální infekce a aplikaci antibiotik. Četnost výskytu tohoto onemocnění je 10 až 20 případů na 100 000. V současné době neexistuje dostupná vakcína.

Proteiny teplotního šoku nebo stresové proteiny (HSP) patří k nej konzervativnějším proteinům, které se v hojném množství vyskytují v přírodě (F.C.Neidhardt et al., Ann.Rev.Genet., 18, pp. 295-329 (1984); S.Lindquist, Ann.Rev.Biochem., 55, pp. 1151-1191 (1986)). Tyto proteiny produkují všechny buňky jako odezvu na různé fyziologické i nefyziologické stimuly. Ze stresových odezev je nejlépe

·.· · · studována odezva na teplotní šok, kdy náhlé zvýšeni teploty indukuje syntézu HSP. Další podmínky prostředí, jako je nízké pH, nedostatek železa a peroxid vodíku, mohou také indukovat syntézu HSP. HSP se definují svou velikostí. Proteiny, které patří do rodin hsp90, hsp70 a hsp60, se spolu s hlavními HSP nacházejí ve všech prokaryontech a eukaryontech. Tyto proteiny plní řadu doprovodných funkcí tím, že přispívá//k balení proteinů a napomáhají jejich transportu přes membránu (C.Georgopoulos and W.J.Welch, Ann. Rev. Cell. Biol., 9, pp.601-634 (1993); D. Ang et al., J.Biol .Chem. , 266, pp. 24233-24236 (1991)). Jako molekulový chaperon a pravděpodobně pomocí jiných mechanizmů jsou HSP zahrnuty do mechanizmu ochrany buněk před škodlivými účinky stresu. Skutečnost, že podmínky prostředí ovlivňují několik faktorů virulence naznačuje úlohu HSP v patogenitě mikrobů (J.J.Mekalanos, J.Bacteriol., 174, pp. 1-7 (1992); P.J. Murray and R.A.Young, J.Bacteriol., 174, pp. 4193-4196 (1992)). S ohledem na tyto skutečnosti poslední studie specie Salmonella naznačuje, že odezva na stres může být kriticky spojena se schopností intracelulárních patogenů vyvolat a udržovat infekci (N.A.Buchmeir and F.Hoffron, Sciences, 248, pp. 730-732 (1990); K.Z.Abshire and F.C.Neidhardt, J.Bacteriol., 175, pp. 3734-3743 (1993)); B.B. Finlay et al., Science, 243, pp. 940943 (1989)). Další studie ukázaly, že lysteriolysin, který je podstatný faktor virulence u D. monocytogenes, se indukuje za podmínek teplotního šoku (Z.Sokolovic and W.Goebel, Infect.Immun., 57, pp. 295-298 (1989)).

Současné důkazy ukazují, že HSP jsou hlavními antigeny mnoha patogenů. Členové proteinové rodiny hsp60, které se také nazývají CroEL-příbuzné proteiny, pro jejich podobnost s proteinem CroEL z E.coli, jsou hlavními antigeny různých bakteriálních patogenů, mezi něž patří Mycobacterium leprae a Mycobacterium tuberculosis (D.Young et al., Proč. Nati. Acad.

Sci. USA, 85, pp. 4267-4270 (1988)), Legionella pneumophila (B.B. Plikaytis et al., J.Clinic.Microbiol., 25, pp. 20802084 (1987)), Borrelia burg^dorferi (B.J.Luft et al., J.Immunol., 146, pp. 2776-2782 (1991)) a Chlamydia trachomatis (E.A.Wagar et al., J.Infect.Dis., 162, pp. 922927 (1990)). Tento antigen je homolog všude se vyskytujícího běžného antigenu a věří se, že zmíněný antigen se vyskytuje v každé bakterii (J.E.Thole et al., Microb.Pathogen., 4, pp. 71-83 (1988)). V případě několika bakteriálních a parazitových infekcí se také popisují protilátky proti členům rodiny proteinů hsp70 nebo proteiny vztahující se k DnaK (Young et al., citace shora uvedena; Luft et al., citace shora uvedena; D.M.Engman et al., J.Immunol., 144, pp. 39873991 (1990); N.M.Rothstein et al., Molec.Biochem.Parasitol., 33, pp.229-235 (1989); V.Nussenzweig and R.S. Nussenzweig, Adv.Immunol., 45, pp. 283-334 (1989)). HSP mohou vyvolat silné odezvy B- a T-buněk a ukázalo se, že 20% CD4⁺ Tlymfocytů z myší, které se naočkovaly M. tuberculosis, jsou reaktivní se samotným proteinem hsp60 (s.H.E. Kaufman et al., Eur.J.Immunol., 17, pp. 351-357 (1987)). Podobně 7 ze 24 monoklonálních protilátek určených proti proteinům M. leprae rozeznalo determinanty na hsp60 (H.D.Engers et al., Infect. Immun., 48, pp. 603-605 (1985)). Zdá se, že imunitní odezva na stresové proteiny může mít důležitou úlohu při ochraně proti infekci. V souladu s tím se ukázalo, že protilátky a T buňky reaktivní s mikrobiálními HSP mohou vykazovat neutralizaci a ochrannou aktivitu (A.Noll etal., Infect. Immun., 62, pp. 2784-2791 (1994); a S.L.Danilition et al., Infect. Immun., 58, pp. 189-196 (1990)). Stresové proteiny jsou atraktivní svými imunologickými vlastnostmi v souvislosti s jejich využitím jako komponent vakciny a současně se uvažuje, že několik HSP najde uplatnění při prevenci mikrobiálních infekcí a léčbě rakoviny. Zatím se • 9 9 ·

Φ · · · však studie soustředily na intracelulárni patogen, jako jsou Mycobacteria, Salmonella, Chlamydia a několik parazitů. Informace popisující antigeny proteinů teplotního šoku v extracelulárních gram-pozitivních bakteriích jsou dokumentovány daleko méně. U bakterií S.pneumoniae, S.pyogenes a S.agalactiae se neprokázaly ani proteiny teplotního šoku ani jejich genové struktury.

Podstata vynálezu

Vynález se týká problémů, které jsou shora popsány tak, že poskytuje proteiny teplotního šoku z bakterií S.pneumoniae, S.pyogenes a S.agalactiae a imunulogicky příbuzné peptidy. Také poskytuje sekvence DNA, které kódují předchozí polypeptidy, vektory obsahující polypeptidy, jednobuněčné hostitele, kteří jsou transformováni těmito vektory, a postup pro přípravu v podstatě čistých rekombinantních polypeptidů. Vynález dále poskytuje protilátky, které jsou specifické k předchozím polypeptidům. Polypeptidy, sekvence DNA a protilátky podle vynálezu poskytují základ pro nové způsoby a farmaceutické kompozice, které se hodí pro detekci, prevenci a léčbu nemocí. Vynález zvláště poskytuje novou vakcínu založenou na fragmentech těchto polypeptidů, které jsou specifické pro kmeny streptokoků.

Mezi nové proteiny teplotního šoku patří protein teplotního šoku bakteií Streptococcus pneumonia (HSP72) , jehož molekulová hmotnost je 72kDa (SEQ ID č. 5), přibližně 70kDa velký protein teplotního šoku z bakterií Streptococcus pyogenes (HSP70) (SEQ ID č. 20) a přibližně 70kDa velký protein teplotního šoku z bakterií Streptococcus agalactiae (HSP70) (SEQ ID č. 22), dále jejich analogy, homology a deriváty a fragmenty předchozích polypeptidů, které obsahují nejméně jeden imunogenní epitop. Preferují se fragmenty • · • ·

HSP70/72, které zahrnují oblast C-konce polypeptidů HSP70/72. Zvláště zahrnují C-koncový fragment 169 zbytků (C-169) (zbytky 439-607, SEQ ID č. 5), C-koncový fragment 151 zbytků (C-151) (zbytky 457-607, SEQ ID č. 5) a menší fragmenty obsahující epitopy polypeptidu v oblasti C-169. Zvláště se preferují fragmenty v oblasti C-169 HSP72, které zahrnují peptidové sekvence GFDAERDAAQAALDD (zbytky 527-541 SEQ ID č. 5) a AEGAQATGNAGDDW (zbytky 586-600 SEQ ID č. 5), jež se vyskytují pouze v HSP72 bakterií Streptococcus pneumoniae. Dokonce více preferovanými jsou fragmenty, které vyvolávají imunní reakci proti S. pneumoniae, S. pyogenes a S. agalactiae, ale nevyvolávají auto-imunní reakci v lidském hostiteli. Takové fragmenty se mohou vybrat ze skupiny následujících peptidů: CS870, CS873, CS874, CS875, CS876, CS877, CS878, CS879, CS800, CS882, MAP1, MAP2, MAP3 a MAP4 (tabulka č. 5, shora uvedeno).

Preferovanými protilátkami podle vynálezu jsou monoklonální protilátky (MAb) Fl-Pn3.1, F2-Pn3.2 a F2-Pn3.4, které jsou specifické k HSP72.

Více se preferují monoklonální protilátky F2-Pn3.2 a F2Pn3.4, které jsou specifické k HSP70 a HSP72. Ještě více se preferují protilátky Fl-Pn3.1, které jsou specifické pro Streptococcus pneumoniae.

Preferované polypeptidy a protilátky podle vnálezu poskytují základ pro nové metody a farmaceutické kompozice, které jsou vhodné pro detekci, prevenci a léčbu pneumokokových onemocnění.

Vynález popisuje nové proteiny teplotního šoku bakterií S. pneumoniae, S. pyogenes a S. agalactiae, jejich analogy, homology, deriváty a fragmenty, které obsahují nejméně jeden imunogenní epitop. Termín protein teplotního šoku znamená přirozeně se vyskytující protein, který vykazuje za podmínek teplotního šoku přednostní transkripci. Protein teplotního šoku podle

	• · · · '· · • · · · · ·	• · · 9 9 9 9 9 99 9 9 99	• · · · · • · · • · · ·
vynálezu	9 může být přirozeného původu nebo	se může	získat
aplikací	způsobů genového inženýrství nebo	způsobů	běžné
chemické	syntézy.
Termín imunogenní znamená schopnost	vyvolat	imunní

odezvu. Nové proteiny teplotního šoku podle vynálezu se charakterizují svou schopností vyvolat ochrannou imunní odezvu proti streptokokovým infekcím, zvláště proti letálním bakteriím S.pneumoniae, S.pyogenes a S. agalactiae.

Vynález zvláště popisuje protein teplotního šoku bakterií Streptococcus pneumoniae, který je přibližně 72 kDa velký (HSP72) a jeho odvozená aminokyselinová sekvence je uvedená v SEQ ID č. : 5, jeho analogy, homology, deriváty a fragmenty, jež obsahují nejméně jeden imunogenní epitop.

Termín analogy HSP72 jsou ty proteiny S.pneumoniae, kde jeden nebo více aminokyselinových zbytků v aminokyselinové sekvenci HSP72 (SEQ ID č.: 5) je nahrazeno zbytkem jiné aminokyseliny, přičemž veškerá funkčnost a imunogenní vlastnosti analogického proteinu se zachovaly. Takové analogy se mohou vyskytovat přirozeně nebo se mohou produkovat synteticky nebo způsoby genového inženýrství, například mutagenezí sekvence HSP72. Analogy HSP72 mají nejméně jeden antigen, který je schopný vyvolat tvorbu protilátek, jež reagují s HSP72, například Streptococcus pyogenes a Streptococcus agalactiae.

Termín homology HSP72 jsou proteiny z jiných druhů streptokoků než jsou pyogenes, pneumoniae a agalactiae nebo z jiných rodů než je Streptococcus, kde jeden nebo více aminokyselinových zbytků v aminokyselinové sekvenci (SEQ ID č.:5) je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, přičemč veškerá funkčnost a imunogenní vlastnosti homologického proteinu se zachovaly. Takové homology se mohou vyskytovat přirozeně nebo se mohou produkovat synteticky nebo způsoby genového inženýrství. Homology HSP72 mají nejméně jeden antigen, který ·· MM je schopný vyvolat tvorbu protilátek, jež reagují s HSP72, např. u bakterií Enterococcus faecalis.

Termín derivát je polypeptid, kde se změnila jedna nebo více fyzikálních, chemických nebo biologických vlastností. Takové změny například zahrnují: substituce aminokyselin, modifikace, adice a delece; změny glykosylace nebo fosforylace; reakce v paternu lipidace, volných aminokyselin, karboxylových nebo hydroxylových postranních skupin aminokyselinových zbytků, které se nacházejí v polypeptidu spolu s jinými organickými a anorganickými molekulami; a jiné změny, přičemž libovolná z nich může vést ke změnám primární, sekundární nebo terciální struktury.

Fragmenty podle vynálezu mají nejméně jeden imunogenní epitop. Termín imunogenní epitop je epitop, který je nápomocný při vyvolání imunní odezvy. Výhodné fragmenty podle vynálezu vyvolají imunní odezvu, která je dostatečná pro prevenci nebo zmírnění síly infekce, například infekce bakteriemi S. pneumoniae. Preferované fragmenty HSP72 zahrnují oblast C-konce polypeptidu. S výhodou preferované fragmenty zahrnují C-koncový fragment 169 zbytků (C-169) (SEQ ID č.:5, zbytky 439 až 607), C-koncových 151 zbytků (C-151) (SEQ ID č.:5, zbytky 457 až 607) a menší fragmenty obsahující epitopy peptidu z oblasti C-169. Zvláště preferované fragmenty z oblasti C-169 HSP72 zahrnují peptidové sekvence GFDAERDAAQAALDD (zbytky 527 až 541 SEQ ID č. : 5) a AEGAQATGNAGDDW (zbytky 586 až 600 SEQ ID č.: 5), které se vyskytují pouze u HSP72 bakterií Streptococcus pneumoniae nebo odpovídají zkráceným fragmentům z bakterií S. pyogenes nebo S. agalactiae (obrázek, č. 25) . Více preferované jsou fragmenty, které vyvolávají specifické imunní reakce proti kmenům streptokoků. Takové fragmenty se mohou vybrat ze skupiny peptidů, která obsahuje: CS870, CS873, CS874,

CS875, • · • · · ·

CS876, CS877, CS878, CS879, CS880, CS882, MAP1, MAP2, MAP 3 a ΜΆΡ4 (tabulka č. 5, uvedena shora) nebo jejich homology.

Vynález dále poskytuje polypeptidy, které jsou imunologicky příbuzné HSP70/72. Imunologicky příbuzné polypeptidy jsou charakterizovány jednou nebo více z následujících vlastností:

a) jsou imunologicky reaktivní s protilátkami, které vznikají při infekci savčího hostitele buňkami Streptococcus pneumoniae. Tyto protilátky jsou imunologicky reaktivní s HSP72 (SEQ ID č.: 5) a HSP70 (SEQ ID č.: 20 a SEQ ID č.: 22);

b) jsou schopny vyvolávat tvorbu protilátek, které jsou imunologicky reaktivní s HSP72 (SEQ ID č.:5) a HSP70 (SEQ ID č.: 20 a SEQ ID č. 22);

c) jsou imunologicky reaktivní s protilátkami vyvolanými imunizací savce s proteinem HSP72 (SEQ ID č.: 5).

Podle definice, analogy, homology a deriváty HSP70/72 jsou imunologicky příbuznými polypeptidy. Avšak, všechny imunologicky příbuzné polypeptidy obsahují nejméně jeden HSP70/72 antigen. Proto antigeny proteinu HSP70/72 se mohou nacházet v samotném HSP70/72 nebo v imunologicky příbuzných polypeptidech.

Vynález dále poskytuje polypeptidy, které jsou imunologicky příbuzné s HSP72. Imunologicky příbuzné polypeptidy jsou charakterizovány jednou nebo více z následujících vlastností:

(a) jsou imunologicky reaktivní s protilátkami, které vznikají při infekci savčího hostitele buňkami Streptococcus pneumoniae. Tyto protilátky jsou imunologicky reaktivní s HSP72 (SEQ ID č.: 5);

(b) jsou schopny vyvolávat tvorbu protilátek, které jsou imunologicky reaktivní s HSP72 (SEQ ID č.:5);

• · · · ·· ···· ·· ···· • · · ·· ' ·· (c) jsou imunologicky reaktivní s protilátkami vyvolanými imunizací savce s proteinem HSP72 (SEQ ID č.: 5) .

Podle definice, analogy, homology a deriváty HSP72 jsou imunologicky příbuznými polypeptidy. Avšak, všechny imunologicky příbuzné polypeptidy obsahují nejméně jeden HSP72 antigen. Proto antigeny proteinu HSP72 se mohou nacházet v samotném HSP72 nebo v imunologicky příbuzných polypeptidech.

Termín příbuzné bakterie znamená bakterie, které mají antigeny schopné vyvolávat tvorbu protilátek, jež reagují s HSP72. Příklady příbuzných bakterií zahrnují Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus mutans, Streptococcus sanguis, Streptococcus agalactiae a Enterococcus faecalis.

Rozumí se, že na základě následujících příkladů podle vynálezu může odborník bez provádění experimentů určit, zda určitý analog, homolog, derivát, imunologicky příbuzný polypeptid nebo fragment je použitelný pro diagnostiku, prevenci nebo léčbu onemocnění. Použitelné polypeptidy a fragmenty vyvolávají tvorbu protilátek, které jsou imunoreaktivní s HSP72 (Příklad 4). Použitelné polypeptidy a fragmenty s výhodou vykazují schopnost vyvolat ochranou imunní odezvu proti letální bakteriální infekci (Příklad 5).

Vynález dále zahrnuje polymerní formy polypeptidů. Tyto polymerní formy zahrnují například jeden nebo více polypeptidů, které jsou síťované se siťovadly, jako jsou avidin/biotin, glutaraldehyd nebo dimethylsuberimidát. Takové polymerní formy také zahrnují polypeptidy obsahující dva nebo více tandemových nebo obrácených přilehlých proteinových sekvencí, produkovaných prostřednictvím multicistronové mRNA, která vzniká metodou genového inženýrství.

• · »· ···· • · · · ·« • · · ·♦♦ φ · • · · · · · ·· Φ··· ·9 ·Φ

Vynález popisuje v podstatě čistý HSP72 a imunologicky příbuzné polypeptidy. Termín v podstatě čistý znamená, že polypeptidy podle vynálezu a sekvence DNA, které je kóduji, jsou v podstatě bez dalších bakteriálních proteinů. Podstatně čisté proteiny se mohou získat řadou různých běžných postupů, například postupy, které se popisují v příkladu 3 a 5.

Tento vynález poprvé popisuje sekvenci DNA kódující protein teplotního šoku bakterií S.pneumoniae, přesněji HSP72 (SEQ ID č.: 4, nukleotidy 682-2502).

Sekvence DNA podle vynálezu také zahrnují sekvence DNA kódující polypeptidové analogy a homology HSP72, sekvence DNA kódující imunologicky příbuzné polypeptidy, sekvence DNA, které se degenerují na libovolnou s předchozích sekvencí DNA, a fragmenty libovolné z předchozích sekvencí DNA. Lze snadno ocenit, že odborník, když je polypeptid určen a izolován, je schopen určit sekvenci DNA libovolného z polypeptidů podle vynálezu za použití běžných metod sekvenace DNA.

Oligonukleotidové primery a jiné sondy nukleových kyselin odvozené od genů, které kódují polypeptidy podle vynálezu, se mohou také použít pro izolaci a klonování jiných příbuzných proteinů z bakterií S.pneumoniae a příbuzných bakterií, jenž mohou obsahovat oblasti bakteriální DNA homologickou se sekvencemi DNA podle vynálezu. Navíc, sekvence DNA podle vynálezu se mohou používat při reakcích PCR k detekci přítomnosti S.pneumoniae nebo příbuzných bakterií v biologickém vzorku.

Polypeptidy podle vynálezu se mohou připravovat různými postupy, například frakcionací proteinu z vhodných buněčných extraktů za použití běžných separačních metod, jako je iontoměničová a gelová chromatografie a elektroforéza, nebo za použití metod genového inženýrství. Použití metod genového inženýrství je zvláště vhodné pro přípravu v podstatě čistých polypeptidů podle vynálezu.

.

Předmětem vynálezu je dále způsob výroby proteinu HSP72, imunologicky příbuzných polypeptidů a jejich fragmentů, sestáváj ící (1) z kultivace jednobuněčného hostitelského organismu transformovaného vektorem, který obsahuje sekvenci DNA kódující zmíněný polypeptid nebo fragment a jednu nebo více sekvencí řídících expresi, které jsou operativně spojeny se sekvencí DNA, a (2) ze získání v podstatě čistého polypeptidu nebo fragmentu.

Jak je v oboru známo, za účelem dosáhnout vysoké exprese genu transfikovaného do hostitele musí být gen operativně spojen s transkripčními a translačními sekvencemi, jež řídí expresi, které jsou funkční ve zvoleném expresním hostiteli. Sekvence řídící expresi a gen, který je předmětem zájmu, budou s výhodou začleněny do expresního vektoru, který dále obsahuje bakteriální selekční markér a počátek replikace. V případě, že hostitelem exprese je eukaryontní buňka, expresní vektor by měl dále obsahovat markér exprese, kterého je možné použít v eukaryontním expresním hostiteli.

Sekvence DNA kódující polypeptidy podle vynálezu mohou nebo nemusí kódovat signální sekvenci. Jestliže expresní hostitel je eukaryont, obecně se preferuje, aby byla signální sekvence kódována tak, že se v eukaryontním hostiteli -vylučuje maturovaný protein.

Na exprimovaných polypeptidech podle vynálezu může nebo nemusí být přítomen N-koncový methionin. V případě, že koncový methionin není štěpen expresním hostitelem, může být, je-li to nutné, odstraněn chemicky standardním způsobem.

K expresi sekvencí DNA podle vynálezu se používají rozličné kombinace expresivního hostitele/vektoru. Expresní vektory použitelné v eukaryontních hostitelích zahrnují například vektory obsahující sekvence řídící expresi z viru SV40, bovinního papilomaviru, adenoviru, adeno-asociovaného viru, cytomegaloviru a retrovirů. Expresivní vektory použitelné v bakteriálních hostitelích zahrnují bakteriální plazmidy, jako jsou plazmidy z bakterií E.coli, mezi něž patří pBluescript, pGEX2T, vektory pUC, col El, pCRl, pBR322, pMB9 a jejich deriváty, plazmidy vhodné pro široké rozmezí hostitelů, jako jsou RP4, fágová DNA, například řada derivátů fágu lambda (X_gt 10 a λ-gtii, NM989) a jiné fágové DNA, jako je M13 a vlákno fágové jednořetězcová DNA. Expresivní vektory, které se používají v buňkách kvasinek, zahrnují plazmid o velikosti 2μ a jeho deriváty. Vektorem, který je použitelný ve hmyzích buňkách, je vektor pVL941.

Pro expresi sekvencí DNA podle vynálezu se může v těchto vektorech použit libovolná z řady sekvencí řídících expresi. Mezi použitelné sekvence řídící expresi patří sekvence spojené se strukturálními geny předchozích expresivních vektorů. Příklady sekvencí, které řídí expresi, zahrnují například časný a pozdní promotor SV40 nebo adenovirů, lac systém, trp systém, TAC a TRC systém, promotory T3 a T7, což je hlavní operátor a promotor oblastí fágu λ, řídící oblasti fd obalového proteinu, promotor 3-fosfoglycerátové kinázy nebo jiných glykolytických enzymů, promotory kyselé fosfatázy, například Pho5, promotory kvasinkového alfamatového systému a další konstitutivní a indukovatelné promotorové sekvence, které jsou známy, že řídí expresi genů prokaryontních a eukaryontních buněk nebo jejich virů a různé jejich kombinace. T7 promotor RNA polymerázy φ10 je zvláště použitelný při expresi HSP72 v E.coli (Příklad 3).

Vynález dále popisuje hostitelské buňky transformované uvedenými vektory. Pro expresi sekvencí DNA podle vynálezu se používá široká škála jednobuněčných hostitelských buněk. Mezi tyto hostitele patří dobře známí eukaryontní a prokaryontní

hostitelé, jako jsou kmeny E.coli,

Pseudomonas, Bacillus,

Streptomyces, houby, kvasinky, hmyzí buňky, jako jsou

Spodoptera frugiperda (SF9), zvířecí buňky, jako jsou CHO a myší buňky, buňky africké zelené opice, jako jsou COS 1, COS

7, BSC 1, BSC 40 a BMT 10, lidské buňky a rostlinné buňky v tkáňových kulturách. Preferované hostitelské organizmy zahrnují bakterie, jako jsou E.coli a B.subtilis, a buňky savců v tkáňových kulturách.

Samozřejmě se rozumí, že ne všechny vektory a sekvence řídící expresi fungují stejně dobře při expresi sekvencí DNA podle vynálezu. Ani všichni hostitelé nebudou fungovat stejně dobře se stejným expresivním systémem. Avšak odborník je schopen si vybrat mezi těmito vektory, sekvencemi řídícími expresi a hostiteli bez nutnosti dalších experimentů, aniž překročí rozsah tohoto vynálezu. Například při výběru vektoru se musí zvažovat volba hostitele, protože vektor se musí v tomto hostiteli replikovat. Dále se musí také zvažovat počet kopií vektoru, schopnost řídit počet kopií a expresi libovolných jiných proteinů, které jsou kódovány vektorem, jako jsou antibiotikové markéry. Při výběru sekvence řídící expresi by se měly také zvažovat různé faktory. Mezi zmíněné faktory patří relativní pevnost sekvence, její kontrolovatelnost a její kompatibilita se sekvencemi DNA podle vynálezu, zvláště co se týče potencionálních sekundárních struktur. Při výběru jednobuněčných hostitelů by se měla zvažovat jejich kompatibilita s vybraným vektorem, toxicita produktu, který kóduje sekvence DNA podle vynálezu, jejich charakteristiky sekrece, jejich schopnost správně zabalit protein, jejich požadavky na fermentaci a kultivaci a jednoduchost izolace produktů, které kódují sekvence podle vynálezu. Podle těchto parametrů odborník může vybrat různé kombinace vektoru/sekvence řídící expresi/hostitele, které • to • · · · · · ·· ···· budou při fermentaci nebo při kultivaci zvířat ve velkém měřítku exprimovat sekvence DNA podle vynálezu.

Polypeptidy kódované sekvencemi DNA podle vynálezu se mohou izolovat z fermentačních nebo buněčných kultur. Čistí se libovolnými běžnými způsoby, mezi něž patří kapalná chromatografie s normální nebo obrácenou fází, HPLC, FPLC a podobně; afinitní chromatografie (s anorganickými ligandy nebo s monoklonálními protilátkami); vylučovací chromatografie na základě velikosti; imobilizovaná metalchelátová chromatografie; gelová elektroforéza a podobně. Odborník může vybrat nejvhodnější izolační a čistící metodu, aniž překročí rozsah vynálezu.

Navíc polypeptidy podle vynálezu se mohou tvořit libovolnou z několika chemických metod. Například se mohou připravovat použitím syntézy na pevné fázi, kterou původně popsal R.B.Merrifield, Solid Phase Peptide Synthesis. I. The Synthesis Of A Tetrapeptide, J.Am.Chem.Soc., 83, pp. 2149-54 (1963) nebo se mohou připravovat syntézou v roztoku. Shrnutí způsobů syntézy peptidů se může najít v publikacích E.Gross a H.J.Meinhofer, 4 The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology; Modern Techniques Of Peptide And Amino Acid Analysis, John Wiley and Sons, (1981) and M.Bodanszky, Principles Of Peptide Synthesis, Springer-Verlag (1984).

Preferované kompozice a metody podle vynálezu obsahují polypeptidy, které vykazují zvýšenou imunogenitu. Takové polypeptidy mohou vzniknout v případě, že přirozené formy polypeptidů nebo jejich fragmentů jsou modifikovány nebo se podrobí manipulaci za účelem zvýšit imunogenní charakter v zamýšleném recipientu. Preferované polypeptidy jsou fragmenty, které jsou specifické pro bakterie druhu

Streptococcus, jde o fragmenty vybrané z oblasti C-konce nativních polypeptidů. Odborníkům je známá a dostupná řada technik, které se mohou použít bez nutnosti dalších • . .

• · * ·· · · · ···· · « · · . · . ««· ·· ···· ···· ·· ·» experimentů za účelem zvýšit imunogenitu polypeptidů. Například polypeptidy se mohou modifikovat reakcí s dinitrofenolovými skupinami nebo kyselinou arsanilovou nebo denaturací teplem a/nebo SDS. Zvláště v případě, že polypeptidy jsou malé polypeptidy, které se syntetizují chemicky, může se požadovat jejich navázání na imunogenní nosič. Takové navázání nesmí samozřejmě interferovat se správnou funkcí buď polypeptidu nebo nosiče. Některé obecné úvahy strategie navázání jsou uvedeny v publikaci Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, ed. E. Harlow and D. Lané (1988) . Odborník dobře zná použitelné imunogenní nosiče. Mezi takové nosiče patří hemocyanin kuželnatky (KLH; keyhole limpet hemocyanin); albuminy, jako jsou albumin bovinního séra (BSA) a ovalbumin, PPD (čištěný proteinový derivát tuberkulinu), červené krvinky; toxoid tetanu; toxoid cholery; zrna agarozy, aktivní uhlí nebo bentonit.

Také způsob změny stavu lipidace modifikací aminokyselinové sekvence polypeptidů podle vynálezu se může použít za účelem zvýšení imunogenity polypeptidů a ovlivnění jejich biochemických vlastností. Například polypeptidy a jejich fragmenty se mohou exprimovat s nebo bez signálních sekvencí, které řídí adici lipidových skupin.

V souladu s vynálezem se deriváty polypeptidů mohou připravovat různými způsoby. Mezi tyto metody patří in vitro manipulace DNA kódující přirozené polypeptidy a následující exprese modifikované DNA, chemická syntéza odvozených sekvencí DNA nebo chemická nebo biologická manipulace exprimovaných aminokyselinových sekvencí.

Například deriváty se mohou produkovat náhradou jedné nebo více aminokyselin za odlišnou přirozenou aminokyselinu, aminokyselinový derivát nebo umělou aminokyselinu. Preferuje se konzervativní substituce, například 3-methylhistidin β · ··· · • · · · · e · ·· · · 9 9 9 9

9999 99 9999 99 99 může nahrazovat histidin, 4-hydroxyprolin může nahrazovat prolin, 5-hydroxylysin může nahradit lysin a podobně.

Substituce aminokyseliny, která je méně konzervativní, může vést ke vzniku požadovaných derivátů, například změnami náboje, změnami konformace a jiných biologických vlastností. Takové substituce například zahrnují substituci hydrofilního zbytku za hydrofóbní zbytek, substituce cysteinu nebo prolinu za jiný zbytek, substituce zbytku, který má malý postranní řetězec za zbytek, který má velký postranní řetězec, nebo substituce zbytku, který má pozitivní náboj, za zbytek s negativním nábojem. V případě, že 'výsledek substituce se nemůže s jistotou předpovědět, požadované charakteristiky derivátů se mohou snadno zjistit testem podle zde doložené metody.

Polypeptidy se mohou také připravovat s cílem zvýšit jejich stabilitu nebo získat molekuly, které jsou přístupnější čištění nebo izolaci. Jedna taková metoda je exprese polypeptidů, jako fúzních proteinů, které obsahují jiné sekvence bakterií S. pneumoniae nebo sekvence, které nepocházejí z bakterií S. pneumoniae. Je výhodné, když se fúzní proteiny, obsahující polypeptidy podle vynálezu, produkují na úrovni DNA, což například probíhá konstrukcí molekuly nukleové kyseliny kódující fúzi, transformací hostitelských buněk touto molekulou, indukcí exprese fúzního proteinu v buňkách a izolací fúzního proteinu z buněčné kultury. V jiném případě fúzní proteiny mohou vznikat známými metodami po expresi genu. Například fúzní protein podle vynálezu je protein Fucl/HSP72(C169), který se popisuje v příkladu 3.

Polypeptidy podle vynálezu mohou být také částí větších multimerních molekul, které se mohou produkovat rekombinantně nebo se mohou syntetizovat chemicky. Takové multimery mohou také zahrnovat polypeptidy fúzované nebo kondenzované se skupinami • · jinými než jsou aminokyseliny, které zahrnují například lipidy nebo sacharidy.

Polypeptidy podle vynálezu jsou zvláště vhodné pro tvorbu protilátek a pro dosažení ochranné odezvy proti onemocnění. Vynález dále popisuje protilátky nebo jejich fragmenty, které jsou imunologicky reaktivní s HSP72. Vznik protilátek podle vynálezu je vyvolán buď imunizací s HSP72 nebo imunologicky příbuzném' polypeptidem nebo jsou určeny svou reaktivitou s HSP72 nebo imunologicky příbuzným polypeptidem. Rozumí se, že protilátky podle vynálezu nezahrnují ty protilátky, které normálně vznikají ve zvířatech na základě infekce přirozeně se vyskytujících bakterií S.pneumoniae a které se ze zvířat neodstraňují ani nedochází k jejich změně.

Protilátkami podle vynálezu mohou být intaktní molekuly imunoglobulinu nebo jeho fragmenty, které obsahují vazebné místo intaktního antigenu. Mezi tyto protilátky lze zahrnout fragmenty, které jsou v oboru známy jako F(v), Fab, Fab a F(ab)^z2. Protilátky se mohou připravovat způsoby genového inženýrství nebo se mohou produkovat synteticky. Protilátka nebo její fragment může pocházet ze zvířete, přesněji ze savce ještě přesněji z myši, krysy, opice nebo člověka. Může to být přírodní protilátka nebo fragment nebo v případě nutnosti, to může být rekombinantní protilátka nebo fragment. Protilátka nebo fragmenty protilátek mohou být polyklonální, upředňostňuji protilátky monoklonální. Protilátky mohou být specifické pro řadu epitopů, ale upředňostňuje se specifita pro jeden epitop. Specificky preferované jsou protilátky FlPn3.1, F2-Pn3.2, F2Pn3.3 a F2-Pn3.4, které se popisují v Příkladu 2 (uvedeno dále). Odborník může použít polypeptidy podle vynálezu k produkci jiných monoklonálních protilátek, které se testují, zda jsou schopny poskytnout ochranu proti bakteriím S.pneumoniae, S.pyogenes, S.agalactiae nebo proti infekcím, které způsobí jiné bakterie, jež jsou příbuzné streptokokům, v případě, že se tyto polypeptidy použijí pro imunizaci zvířat, s kterými nebyl zatím podniknut žádný experiment. Jestliže se najdou monoklonální protilátky, které poskytují uvedenou ochranu, může se zjistit ten epitop, jež protilátky rozeznávají. Odborníci dobře znají způsob produkce polyklonálních a monoklonálních protilátek. Tyto metody jsou například popsány v publikaci Antibodies, A Laboratory Manual, citace uvedeni shora, a D.E.Yelton, et al., Ann. Rev. of Biochem., 50, pp. 657-80 (1981). Určení imunoreaktivity s polypeptidem podle vynálezu se může provést libovolnou metodou, která je v oboru dobře známa. Sem se zahrnují i imunoblotační test a ELISA.

Protilátka podle vynálezu může také být hybrid molekuly, který se tvoří ze sekvencí imunoglobinu z různých živočišných druhů (například myš nebo člověk) nebo z částí sekvencí imunoglobulinového lehkého nebo těžkého řetězce ze stejného živočišného druhu.

Může to být molekula, která má více vazebných specifit, jako je bifunkční protilátka připravená libovolnou z řady metod, které jsou známy odborníkům a zahrnují: produkci hybridních hybridomů; záměnu disulfidu; chemické zesítění; adici peptidových linkerů mezi monoklonální protilátky; zavedení dvou sad imunoglobulinových těžkých a lehkých řetězců do určité buněčné linie; a tak dále.

Protilátky podle vynálezu mohou také být lidské monoklonální protilátky, například ty protilátky, které produkují imortalizované lidské buňky, myši SCID-hu nebo jiná zvířata, je ž jsou schopná produkovat Ú-idské*'protilátky, nebo se produkují expresí klonovaných lidských imunoglobulinových genů.

Lze shrnout, že pro odborníka, který je obeznámen s tímto vynálezem, je dostupná řada metod, které se mohou

použit za účelem změnit biologické vlastnosti protilátek podle vynálezu. Zmíněné metody zahrnují ty, které jsou schopny zvýšit nebo snížit stabilitu nebo poločas rozpadu, imunogenitu, toxicitu, afinitu nebo výtěžek molekul danné protilátky nebo změnit tuto molekulu jiným způsobem, který ji učiní dostupnější pro další použití.

Polypeptidy, sekvence DNA a protilátky podle vynálezu jsou použitelné při tvorbě profylaktických, terapeutických a diagnostických kompozic, které jsou vhodné pro prevenci, léčbu a diagnostiku onemocnění.

V případě, že polypeptidy a protilátky podle vynálezu se použijí jako imunogeny a vakcíny, je možné použít standardní imunologické metody.

Zvláště pak libovolnému vhodnému hostiteli se může aplikovat farmaceuticky účinné množství polypeptidu za účelem vzniku monoklonálních nebo polyvalentních protilátek nebo za účelem indukce vzniku ochranné imunologické odezvy proti onemocnění. Upředňostňuje se selekce polypeptidů ze skupiny, která zahrnuje HSP72 (SEQ ID č.:5), HSP70 (SEQ ID č.:20 a SEQ ID č. : 22) a jejich fragmenty.

Termín farmaceuticky účinné množství polypeptidu nebo protilátky je množství, které v případě, že se podá pacientovi, vyvolá imunní odezvu, jež je účinná při prevenci nebo ztlumení sily infekce způsobené streptokoky nebo jim příbuznými bakteriemi.

Aplikace polypeptidů nebo protilátek podle vynálezu se může uskutečnit libovolným způsobem, který se popisuje v Příkladu 10 (uvedeno dále) nebo jinými standardnímy postupy. Tyto způsoby se uvádějí v publikace Antibidies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, ed. E. Harlow and D. Lané (1988). V případě použití polypeptidů se upředňostňuje jejich aplikace v přítomnosti farmaceuticky přijatelného adjuvans, jako je úplné nebo neúplné Freundovo adjuvans, RIBI • · · 9 · · · · ···· · • ^- · · · · · ··· • · · · W · ·· · ·,· · · · · · (muramylové dipeptidy) nebo ISCOM (imunostimulující komplexy). Kompozice bude jako adjuvans s výhodou zahrnovat emulzi voda-olej nebo hydroxid hlinitý a bude se aplikovat do svalu. Během léčení se bude pacientovi vakcínová kompozice aplikovat pouze jednou nebo opakovaně. Nejúčinější způsob aplikace a režim dávek závisí na úrovni imunogenity, na druhu kompozice a/nebo adjuvans, která se používá k léčbě, na síle a průběhu očekávané infekce, předchozí terapie, pacientově celkové zdravotní situaci a imunizační odpovědi a rozhodnutí lékaře. Například u imunokompetentního pacienta, čím je polypeptid imunogeWhější, tím je potřeba nižší dávka a počet imunizací. Podobně, jestliže polypeptid se aplikuje s adjuvans, dávka nezbytná pro léčbu bude nižší a čas bude kratší.

Obecně dávka se skládá z počáteční injekce, která zahrnuje okolo 0,01 až lOmg adjuvans a 0,1 až 1,0 mg antigenů HSP72 pro jednoho pacienta. Pak bude následovat jedna nebo možná více injekcí. Preferuje se, aby se další injekce aplikovaly po přibližně jednom a šesti měsících od první inj ekce.

Pro přípravu farmaceuticky přijatelné soli se použije libovolný polypeptid podle vynálezu. Odborník dobře zná vhodné sole a zásady, které jsou schopny tvořit sole s polypeptidy podle vynálezu. Mezi ně patří organické a anorganické kyseliny a zásady.

Odborníkovi je známo, že za účelem testování schopností polypeptidů a protilátek podle vynálezu, poskytnutí ochrany proti onemocnění, které působí bakterie S.pneumoniae nebo příbuzné bakterie, nebo ztlumení síly takové infekce, je možné použít řadu zvířecích modelů. Může se použít jakékoli zvíře, které je náchylné k infekci bakteriemi S.pneumoniae nebo jim příbuznými bakteriemi. Preferovaným zvířecím modelem, který je vhodný pro aktivní testování imunoochrany, • · ····, • · · · jsou Balb/c myši popsané v Příkladu 5 dále v textu. Preferovaným zvířecím modelem pro pasivní testování jsou přísně kombinované imunodeficientní myši popsané v Příkladu 5. Aplikací určitého polypeptidů nebo protilátky na uvedené zvířecí modely pak může odborník stanovit bez nutnosti experimentů, zda polypeptid nebo protilátku je možné použít v metodách nebo v kompozicích, které se zde nárokují.

Další provedení vynálezu popisuje způsob, který zahrnuje kroky léčby pacienta vakcínou, zahrnující farmaceuticky přijatelné množství libovolného polypeptidů podle vynálezu, způsobem postačujícím k prevenci nebo ztlumení síly infekce způsobené streptokoky nebo jim příbuznými bakteriemi na určitou dobu. HSP70/72 nebo jejich fragmenty jsou preferovanými peptidy pro použití v takových metodách.

Polypeptidy, sekvence DNA a protilátky podle vynálezu mohou také tvořit základ diagnostických metod a souprav vhodných pro detekci patogenních organismů. Je možných několik diagnostických metod. Vynález například umožňuje způsob detekce bakterií Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae nebo příbuzných bakterií v biologickém vzorku, zahrnující tyto kroky:

(a) izolace biologického vzorku z pacienta;

(b) inkubace protilátky podle vynálezu nebo jejího fragmentu s biologickým vzorkem za vzniku směsi; a (c) detekce specificky vázané protilátky nebo fragmentu ve směsi, což detekuje přítomnost bakterií Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae nebo příbuzných bakterií. Při této metodě se s výhodou používají monoklonální protilátky Fl-Pn3.1, F2-Pn3.2, F2-Pn3.3 a F2-Pn3.4.

V jiném případě vynález popisuje způsob detekce protilátek specifických pro bakterie Streptococcus • · · · ♦ · pneumoniae nebo příbuzná bakterie v biologickém vzorku. Tento způsob zahrnuje tyto kroky:

(a) izolace biologického vzorku z pacienta;

(b) inkubace polypeptidu podle vynálezu nebo jeho fragmentu s biologickým vzorkem za vzniku směsi; a (c) detekce specificky vázaného polypeptidu ve směsi, což ukazuje na přítomnost protilátek, které jsou specifické pro bakterie Streptococcus pneumoniae nebo příbuzné bakterie. HSP72 (SEQ ID č.:5), jeho fragment C-169 (zbytky 439 až 607 SEQ ID č.: 5), jeho fragment C-151 (zbytky 457 až 607 SEQ ID č.: 5) a fragmenty peptidů GFDAERDAAQAALDD (zbytky 527 až 541 SEQ ID č.:5) a AEGAQATGNAGDDW (zbytky 586 až 600 SEQ ID č.

5) je polypeptid a fragmenty, které se s výhodou používají ve shora uvedené metodě detekce protilátek.

Odborník ví, že tyto diagnostické testy mohou mít několik forem, které zahrnují ELISA-test (enzyme-linked immunosorbent assay), radioimunotest nebo test latexové aglutinace.

Diagnostická činidla mohou být součástí souprav, jež dále obsahují instrukce na použití soupravy a jiná vhodná činidla. Tyto soupravy se mohou použít pro detekci navázání polypeptidů nebo protilátek. Polypeptidy nebo protilátky se například mohou označit látkou, která umožňuje detekci polypeptidu v případě navázání na protilátku nebo detekci protilátky, když se naváže na bakterie S.pneumoniae nebo příbuzné bakterie. Pro takovou detekci se používá fluorescenční značící činidlo, jako je izokyanát fluoresceinu (FIC), isothiokyanát fluoresceinu (FITC) a podobně, dále enzym, jako je peroxidáza křenu (HRP), oxidáza glukózy nebo podobně, radioaktivní element, jako je ¹²⁵I nebo ⁵¹Cr, které produkují emisi gamma záření, nebo radioaktivní element, který emituje positrony, jež produkují gamma záření při ♦ .· · setkání s elektrony, které se nacházejí v testovacím roztoku, jako jsou ^X1C, ¹⁵0 nebo ¹³N. Navázání se také může detekovat jinými metodami, například prostřednictvím komplexů avidinbiotin. Navázání detekčního činidla je v oboru dobře známo. Molekuly monoklonální protilátky produkované hybridomem se mohou například metabolicky značit inkorporací aminokyselin, které obsahují radioizotopy, do kultivačního média nebo je možno s detekčním činidlem konjugovat nebo kondenzovat polypeptidy prostřednictvím aktivovaných funkčních skupin.

Sekvence DNA podle vynálezu se mohou použít pro přípravu sond DNA, které se používají pro detekci bakterií Streptococcus pneumoniae nebo příbuzných bakterií v biologickém vzorku. Způsob detekce podle vynálezu založený na použití sond zahrnuje tyto kroky:

(a) izolaci biologického vzorku z pacienta;

(b) inkubaci sondy DNA, která má sekvenci DNA podle vynálezu, s biologickým vzorkem za vzniku směsi; a (c) detekci ve směsi specificky navázané sondy DNA, což ukazuje na přítomnost bakterií Streptococcus pneumoniae nebo příbuzných bakterií.

Sondy DNA podle vynálezu se mohou také použít při detekci nukleových kyselin přítomných v biologickém vzorku, například za použití polymerázové reakce jako diagnostické metody bakterií Streptococcus pneumoniae nebo příbuzných bakteriálních infekcí. Sondy se mohou syntetizovat za použití běžných postupů a mohou se imobilizovat na pevné fázi nebo se mohou značit detekovatelnými značkami. Pro tuto aplikaci se s výhodou jako sonda používá oligomer, jehož sekvence je komplementární k nejméně přibližně 6 sousedícím nukleotidům HSP72 (SEQ ID č.:4, nukleotidy 682 až 2502).

Polypeptidy podle vynálezu se mohou také použít při čištění protilátek určených proti epitopům, které jsou • · přítomny na proteinu, například při použití imunoafinitního čištění protilátek na antigenní koloně.

Protilátky nebo fragmenty protilátky podle vynálezu se mohou použít při přípravě v podstatě čistých proteinů podle vynálezu, například při použití imunoafinitního čištění protilátek na antigenní koloně.

Přehled obrázků na výkrese

Obrázek č. 1 zobrazuje fluorogram, který ukazuje účinek teplotního šoku na syntézu proteinu bakterií S. pneumoniae. Buněčné extrakty v části A pochází z kmene 64 S. pneumoniae typ

6. Buněčné extrakty v části B pochází z kmene 53 S. pneumoniae typ 4. Buněčné extrakty v dráhách označených lichými čísly se inkubovaly při teplotě 37 °C. Buněčné extrakty v dráhách označených sudými čísly se inkubovaly při teplotě 45 °C po dobu 5 minut. Buněčné extrakty se pak značily [³⁵S]methioninem po dobu 10 minut (dráha 1, 2 a 7, 8), 30 minut (dráhy 3, 4 a 9, 10) nebo 60 minut (dráhy 5,6). Markéry molekulových hmotností v kilodaltonech se nacházejí na levé straně. Polohy HSP80, HSP72 a HSP62 jsou označeny šipkami na pravé straně každého panelu.

Na obrázku č. 2 je grafické znázornění porovnání elektroforetických profilů proteinů značených [³⁵S]methioninem bakterií S. pneumoniae v při (----) nebo bez (____) vystavení teplotnímu šoku. Denzitometrický záznam se určil měřením relativní optické hustoty (osa Y) versus mobilita pásů značeného proteinu (osa X) . Je zde ukázán denzitometrický záznam SDS PAGE dráhy 1 a 2 obrázku č. 1.

Na obrázku č. 3 je znázorněn fluorogram, který ukazuje proteinové antigeny bakterií S. pneumoniae imunoprecipitované sérem z myší, které se imunizovaly proteinovým extraktem S.

pneumoniae, který je rozpustný v detergentu. Proteiny značené • ·

[³⁵S]methioninem z bakterií S. pneumoniae kultivovaných při teplotě 37°C se inkubovaly při teplotě 37°C (dráhy 3, 5, 7 a 9) nebo se vystavily teplotnímu šoku při teplotě 45°C (dráhy

4, 6, 8 a 10). Proteiny se dále imunoprecipitovaly se séry z myši 1 (dráha 3 až 6) nebo myši 2 (dráha 7 až 10) a pak se analyzovaly pomocí SDS PAGE a fluorografii. Séra se testovala po první (dráha 3, 4 a 7, 8) a po druhé (dráha 5, 6 a 9, 10) imunizaci. Buněčné lyzáty značené [³⁵S]methioninem z bakterií

5. pneumoniae, které se nevystavily nebo vystavily teplotnímu šoku jsou v dráze 1 a 2. Poloha HSP je označena šipkami na levé straně fluorogramu.

Obrázek č. 4 zobrazuje fluorogram, který ukazuje proteinové antigeny S.pneumoniae imunoprecipitované séry z myší, které se imunizovaly teplem usmrcenými bakteriemi S. pneumoniae. Proteiny značené [³⁵S]methioninem z bakterií S. pneumoniae kultivovaných při teplotě 37°C se inkubovaly při teplotě 37°C (dráhy 3, 5 a 7) nebo se vystavily teplotnímu šoku při teplotě 45°C (dráhy 4, 6 a 8). Tyto proteiny se dále imunoprecipitovaly se séry z myši 1 (dráha 3, 4) nebo myši 2 (dráha 5, 7) nebo myši 3 (dráha 7, 8) a pak se analyzovaly pomocí SDS PAGE a fluorografii. Séra se testovaly pouze po druhé imunizaci. Buněčné lyzáty značené [³⁵S]methioninem z bakterií S. pneumoniae, které se nevystavily nebo vystavily teplotnímu šoku jsou v dráze 1 a 2. Poloha HSP je označena šipkami na levé straně fluorogramu.

Obrázek č. 5 zobrazuje fotografii, která ukazuje antigeny S.pneumoniae detekované westernovým přenosem. Celé buněčné extrakty se testovaly se séry z 15 myší (dráha 1 až

15), které se imunizovaly teplem usmrcenými bakteriemi

S.pneumoniae. Dráha 16 ukazuje protein HSP72, který se detekoval MAb Fl-Pn3.1. Na panelu A se testovala séra po druhé imunizaci. Na panelu B je zobrazena reaktivita 4 sér z testovaných sér po první imunizaci. Polohy odpovídající pruhům proteinů o velikosti 53,5kDa a 47kDa jsou označeny na levé straně čárou. Poloha HSP72 je označena šipkami na pravé straně každého panelu.

Obrázek č. 6 ukazuje fluogram znázorňující specifitu MAb Fl-Pn3.1 k HSP72. Proteiny značené [³⁵S]methioninem z bakterií S. pneumoniae, které nebyly (dráha 1, 3 a 5) nebo byly (dráha

2, 4 a 6) vystaveny teplotnímu šoku, se imunoprecipitovaly s MAb IgG2a, které se použily jako kontrola (dráha 3,4), nebo s

Fl-Pn3.1 (dráha 5, 6) a pak fluorografii. Buněčné lyzáty bakterii S. pneumoniae, které teplotnímu šoku jsou v dráze 1 označena šipkami na levé straně se analyzovaly SDS PAGE a značené [³⁵S]methioninem z se nevystavily a vystavily a 2. Poloha všech tři HSP je fluorogramu.

Obrázek č. 7 panel A znázorňuje imunoblot, který ukazuje reakci buněčných extraktů z bakterii S. pneumoniae značených [³⁵S]methioninem, jenž byly a nebyly vystaveny teplotnímu šoku, s MAb Fl-Pn3.1. Dráha 1 obsahuje buněčné lyzáty po teplotním šoku (45°C) . Dráha 2 obsahuje buněčné lyzáty, které nebyly vystaveny teplotnímu šoku (37°C) . Panel B zobrazuje fluogram imunoblotu ukázaného na panelu A.

Obrázek č. 8 znázorňuje westernův přenos, který ukazuje subcelulární lokalizaci HSP72 z S. pneumoniae. Vzorek obsahující 15μg proteinu membránové frakce (dráha 1) a cytoplazmatické frakce (dráha 2) z S. pneumoniae se podrobily elektroforéze na SDS PAGE, přenesly se na nitrocelulózovou membránu a testovaly se MAb Fl-Pn3.1.

Obrázek č. 9 je fotografie imunoblotu znázorňující reaktivitu rekombinantnich fúznich proteinů obsahujících oblast C-169 HSP72 S. pneumoniae s MAb Fl-Pn3.1. Dráha 1 obsahuje celobuněčné extrakty z kmene 64 S. pneumoniae, který se testoval HSP72 specifickými MAb Fl-Pn3.1.

·· ···· • · ·

Dráhy 2 a 3 obsahují fágové lyzáty z E.coli, které se infikovaly ÁJBD17 kultivovaným v přítomnosti (+) nebo v nepřítomnosti (-) IPTG. Lyzáty se testovaly HSP72 specifickými MAb Fl-Pn3.1. Dráhy 4 a 5 obsahují fágové lyzáty z E.coli infikované ÁJBD17 kultivovaným v přítomnosti (+) nebo v nepřítomnosti (-) IPTG. Tyto lyzáty se testovaly SP72 specifickými MAb Fl-Pn3.1. Markéry molekulové hmotnosti jsou znázorněny na levé straně. Polohy reaktivních proteinů o velikosti 74kDa a 160 kDa jsou označena na levé respektive na pravé straně.

Obrázek č. 10 znázorňuje schéma restrikční mapy HSP72 (DnaK), loky Fuc a inzerty rekombinantních klonů. Vztah mezi jednotlivými fragmenty DNA se zobrazuje s ohledem na každý z nich. Obrázek č. 10A a 10C ilustruje restrikční mapu HSP72 (DnaK) a ícgúy Fuc. Obrázek č. 10B ukazuje inzertyý-ůzných fágů a plazmidů popsaných v příkladu 3. Zkratky H(HindlII); E(EcoRV); P(Pstl); a X(XhoI) označuji polohy míst, které rozeznávají restrikční endonukleázy. Na obrázku jsou označeny fragmenty DNA na lokusu HSP72/DnaK () ; lokus Fuc {///}; a fragmenty, které se používaly jako sondy při analýze Southernovým přenosem (i|) .

Obrázek č. 11 zobrazuje SDS-PAGE a analýzu westernovým přenosem rekombinantního proteinu o velikosti 74 kDa. Celobuněčné extrakty z buněk E.coli transformované plazmidy pJBD179 (dráha 1), pJBDf51 (dráha 2 a 3) a pJBDf62 (dráha 4 a 5) a kultivované v přítomnosti (+) a v nepřítomnosti (-) IPTG se analyzovaly na elektroforéze na 10% polyakrylamidovém gelu. Proteiny se pak zviditelnily barvením Coomassieovou modří (A) nebo westernovým přenosem (B) za použití MAb FlPn3.1, které jsou specifické k HSP. Markéry molekulové hmotnosti (velikost se uvádí v kilodaltonech) jsou uvedeny na levé straně. Šipky na levé straně každého panelu označují proteinový markér o velikosti 74kDa.

• · ♦ ·· · · · ···· · • · · ·'·· ··· ♦ · ···· ·· ···· ·· ··

Obrázek č. 12 znázorňuje detekci přirozených nebo rekombinantních antigenů HSP72 analýzou westernovým přenosem. Celobuněčné lyzáty z buněk E.coli transformované plazmidy pJBDk51 (dráha 1 a 3) a pJBD291 (dráha 2) a buněčné lyzáty z bakterii S.pneumoniae kmene 64 (dráha 4) se analyzovaly elektroforézou na 10% polyakrylamidovém gelu a a přenesly se elektrotransferem na nitrocelulózovou membránu. Imunoblot se testoval MAb Fl-Pn3.1, které jsou specifické k HSP72.

Obrázek č. 13A až 13D srovnává předpovídanou aminokyselinovou sekvenci otevřeného čtecího rámce (HSP72 SPNEU) HSP72 z bakterií S.pneumoniae s těmi, které byli dříve uvedeny pro následující HSP70/DnaK proteiny: ECOLI, Escherichia coli; BORBU, Borrelia burgdorferi; BRUOV, Brucella ovis; CHLPN, Chlamydia pneumonia; BACME, Bacillus megatorium; BACSU, Bacillus subtilis; STAAU, Staphylococcus aureus; LACLA, Lactococcus lactis; a MYCTU, Mycobacterium tuberculosis. Jsou označeny pouze chybné aminokyseliny. Stejné aminokyseliny jsou v rámečku a konzervativní aminokyseliny jsou stínovány.

Na obrázku č. 14 je fotografie SDS-PAGE, která ukazuje rekombinantní HSP72 čištěný afinitní chromatografií. Frakce supernatantu z lyzátu z bakterií E.coli (pJBDk51) (dráha 2) a 20gg imunoafinitně čištěného HSP72_rec (dráha 3) se podrobily analýze elektroforézou na 10% polyakrylamidovém gelu. Proteiny se pak vizualizovaly barvením Comassieovou modří. Dráha 1 ukazuje migraci markérů molekulové hmotnosti (106kDa, 80kDa, 49,5kDa, 32,5kDa, 27,5kDa a 18,5kDa).

Na obrázku č. 15 je zobrazena fotografie SDS-PAGE, která zobrazuje rekombinantní fragment C-169 z S.pneumoniae čištěný solubilizací inkluzních tělísek. Různá množství čištěného proteinu C-169 (dráha 1, 5μg; dráha 2, 2,5gg; a dráha 3, lgg) a celobuněčný lyzát z buněk E.coli transformovaných plazmidy ·♦ ····

Μ ···# • · ··· · pDELTAl (dráha 4) a pJBDÁl (dráha 5) se analyzoval elektroforézou na 10% polyakrylamidovém gelu. Proteiny se pak vyzualizovaly barvením Coomassieovou modří.

Obrázek č. 16 je grafické znázornění křivky přežití myší Balb/c, které jsou chráněny před infekcí bakteriemi S.pneumoniae imunizací s HSP72_rec. Data jsou uvedena jako procento (%) myší, které přežily údobí 14 dnů, z celkového počtu 10-ti myší, jenž tvořily experimentální skupinu.

Obrázek č. 17 je grafické znázornění křivky přežití myší Balb/c, které jsou chráněny před infekcí bakteriemi S.pneumoniae imunizací s C-169_rec. Data jsou uvedena jako procento (%) myší, které přežily údobí 14 dnů, z celkového počtu 10-ti myší, jenž tvořily experimentální skupinu.

Obrázek č. 18 je mapa plazmidu pURV3 obsahující C-151_rec_ř kódující oblast 151 aminokyselin na C-konci HSP72 bakterií S.pneumoniae; Ampi^R, oblast kódující rezistenci na ampicilin; ColEl ori, počáteční místo replikace; cI857, gen represoru citlivého na teplotu bakteriofága λ cI857; λ PL, promotor transkripce bakteriofága λ; TI, terminátor transkripce TI. Směr transkripce je označen šipkami. BglII a BamHI jsou místa, která rozeznávají restrikční enzymy, užívaná pro inzerci kódující oblasti pro C-151_rec HSP72 bakterií S .pneumoniae.

Obrázek č. 19 ukazuje rozložení anti-S.pneumoniae titrů v séru z myší Balb/c imunizovaných HSP72_rec. Séra se získala po první, druhé a třetí injekci, které obsahují Ιμς (O) nebo 5μg (·) HSP72_rec a hodnotily se jednotlivě testem ELISA pro anti-S.pneumoniae protilátky. Titry se definovaly jako nejvyšší ředění, kde hodnoty získané při A410 byly o 0,1 vyšší než je pozadí. Jednoduchá čára označuje střední reciprokou hodnotu titrů protilátek pro každou skupinu myší, * * · · · · φ φ φ φ φ φ . φ • · · φφφ φφφ φφ φφφφ φφ Φ··· φφ φφ zatímco přerušovaná čára označuje střední hodnotu titrů protilátek preimunních sér.

Obrázek č. 20 zobrazuje rozložení anti-S.pneumoniae titrů v séru z myší Balb/c imunizovaných C-169_rec. Séra se získala po první, druhé a třetí injekci, které obsahují Ιμς (O) nebo 5μς (·) C-169_rec a hodnotily se jednotlivě testem ELISA pro anti-S.pneumoniae protilátky. Titry se definovaly jako nejvyšší ředění, kde hodnoty získané při A410 byly o 0,1 vyšší než je pozadí. Jednoduchá čára označuje střední reciprokou hodnotu titrů protilátek pro každou skupinu myší, zatímco přerušovaná čára označuje střední hodnotu titrů protilátek preimunních sér.

Obrázek č. 21 ukazuje rozložení anti-S.pneumoniae titrů v séru z myší Balb/c imunizovaných C-151_rec. Séra se získala po první, druhé a třetí injekci, které obsahují 0,5μς C-151_rec a hodnotily se jednotlivě testem ELISA pro anti-S.pneumoniae protilátky. Titry se definovaly jako nejvyšší ředění, kde hodnoty získané při A410 byly o 0,1 vyšší než je pozadí. Jednoduchá čára označuje střední reciprokou hodnotu titrů protilátek pro každou skupinu myší, zatímco přerušovaná čára označuje střední hodnotu titrů protilátek preimunních sér.

Obrázek č. 22 zobrazuje odpověď protilátek opic cynomolgus, které se imunizovaly antigeny rekombinantního HSP72. Skupiny po dvouch opicích se imunizovaly 1. den, 22. den a 77. den buď proteinem HSP72_rec nebo C-169_rec. Sera se získávala pravidelnými odběry během imunizace a v každém séru se hodnotila analýzou westernovým přenosem přítomnost protilátek specifických k pneumokokovému HSP72. Titry se definovaly jako nejvyšší ředění, při kterém se objevil pruh HSP72.

Obrázek č. 23 ukazuje navázání hyperimunního séra na peptidy při testu ELISA v pevné fázi. Testovala se reaktivita králičích, myších a opičích sér získaných ze zvířat, která se ···· imunizovala buď proteinem HSP72_rec nebo C-169_rec, s peptidy. Hodnoty optické hustoty se získaly se séry testovanými při ředěni 1:100 mimo hodnot odpovídající reaktivitě králičích sér s peptidem MAP2 a myších sér s peptidy MA.P2 a MAP4, které se získaly při ředění sér 1:1 000.

Obrázek č. 24 ukazuje konsensus sekvence vytvořené z DNA sekvencí otevřeného čtecího rámce hsp70/dnak bakterií

Streptococcus pneumoniae (spn-orf), Streptococcus pyogenes (sga-orf) a Streptococcus agalactiae (sgb-orf) a označuje substituce a inzerce nukleotidů, které jsou specifické pro každý druh.

Obrázek č. 25 znázorňuje konsensus sekvence vytvořené z proteinových sekvencí Hsp70 bakterií Streptococcus pneumoniae (spn-prot), Streptococcus pyogenes (sga-prot) a Streptococcus agalactiae (sgb-proí) a označuje substituce a inzerce aminokyselin specifických pro každá druh.

Obrázek č. 26 zobrazuje fluorogram, který ukazuje účinek teplotního šoku na syntézu proteinu bakterií S. agalactiae . Dále ukazuje antigen proteinu bakterií S. agalactiae , který se imunoprecipitoval s MAb F2-Pn3.4. Buněčné lyzáty s proteiny značenými [³⁵S]methioninem z bakterií S. agalactiae kultivovaných při teplotě 37°C, inkubované při teplotě 37°C (dráhy označené lichými čísly) nebo vystavené teplotnímu šoku při teplotě 43°C (dráhy označené sudými čísly) se analyzovaly SDS-PAGE a fluorografií. Dráhy 3 a 4 ukazují imunosraženiny získané použitím MAb F2-Pn3.4.

Příklady provedeni vynálezu

Příklad 1 popisuje identifikací HSP72, imunoreaktivní/?,?

proteinu teplotního šoku podle vynálezu. Příklad 2 popisuje izolaci monoklonálních protilátek proti epitopům proteinu

HSP72. Příklad 3 popisuje přípravu rekombinantního HSP72 a • · jeho fragmentů podle vynálezu. Přiklad 4 popisuje antigenní specifitu a imunoreaktivitu monoklonálnich protilátek určených proti HSP72 a identifikaci imunologicky příbuzných proteinů podle vynálezu. Příklad 5 popisuje postup získaání v podstatě čistého HSP72 a použiti HSP72 nebo protilátek proti HSP72 na ochranu proti experimentální infekci způsobené bakteriemi S.pneumoniae. Příklad 6 popisuje přípravu rekombinantúho fragmentu C-151 proteinu HSP72 podle vynálezu. Příklad 7 popisuje humorálni imunní odezvu, která následuje po imunizaci rekombinantním HSP72 nebo fragmenty HSP72 podle vynálezu. Příklad 8 popisuje polohu lineárních epitopů Bbuňky na proteinu HSP72. Přiklad 9 popisuje geny hsp70 a proteiny HSP70 z bakterií S.agalactiae a S. pyogenes. Příklad 10 popisuje použití antigenu HSP72 v lidské vakcíně.

Příklad 1: Identifikace imunoreaktivních proteinů bakterií

S.pneumoniae.

A. Postup

Pokud není uvedeno jinak následující postupy se použily ve zde uvedených příkladech.

1. Bakterie

Kmeny bakterií S.pneumoniae poskytla instituce Laboratoire de la Santé Publique du Québec, Sainte-Annejde Bellevue. Kmeny bakterií S.pneumoniae zahrnují typ 4 kmen 53 a typ 6 kmen 64. Jestli není specifikováno jinak, použily se bakterie S.pneumoniae typ 6 kmen 64. Bakteriální kmeny se kultivovaly přes noc při teplotě 37°C v atmosféře 5 % CO₂ na plotnách s čokoládovým agarem.

2. Příprava antigenu

• · · · ·'·

Za účelem imunizace a imunotestů se připravily různé antigeny bakterií S. pneumoniae. Antigeny celých buněk usmrcených teplem se získaly inkubací bakteriálních suspenzí ve vodní lázni předehřáté na teplotu 56 °C po dobu 20 minut. Proteiny rozpustné v detergentu se izolovaly z bakterií S. pneumoniae následujícím způsobem. Bakterie usmrcené teplem se suspendovaly v lOmM pufru Hepes (4-(2-hydroxyethyl)-1piperazinsulfonová kyselina) (Boehringer Mannheim GmbH, Německo) při pH 7,4 a sonifikovaly se 20 000 Kz/vteřinu, čtyřikrát po dobu 30 vteřin. Intaktní buňky a velký odpad se odstranil centrifugací při 1 700 ot./min. po dobu 20 minut. Shromážděný supernatant se centrifugoval při 100 000 g po dobu 60 minut. Pelet se resuspendoval v lml pufru Hepes a přidal se lml 2 % N-lauroylsarkosinu (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo). Směs se inkubovala po dobu 30 minut při teplotě místnosti a frakce rozpustná v detergentu se izolovala centrifugací při 100 000 g po dobu 60 minut.

3. Aplikace teplotního šoku

Bakterie S. pneumoniae (typ 4, kmen 53 a typ 6, kmen 64) se resuspendovaly v Eagleově minimálním esenciálním médiu bez methioninu (ICN Biomedicals lne., Costa Mesa, CA) doplněném 1 % BIO-X® (Quelab Laboratories, Montreal, kanada), inkubovaly se po dobu 15 minut při teplotě 37 °C a pak se rozdělily do dvou frakcí o stejném objemu. Vzorky se inkubovaly buď při teplotě 37 °C nebo 45 °C a pak se značily 100 gCi/ml [³⁵S]methioninu (ICN) po dobu 10, 30 nebo 60 minut při teplotě 37 °C. Bakterie se shromáždily a připravily se buněčné extrakty za použití Tris-HCl lyzačního pufru, jak se popisuje shora, nebo pufru na SDS-PAGE.

• ·

4. Imunizace myší

Samice Balb/c myší (Charles River Laboratories, StConsíant, Québec, kanada) se imunizovaly antigeny bakterií

5. pneumoniae. Imunní séra proti bakteriím S.pneumoniae typ 6 kmen 64 se získaly z myší imunizovaných ve dvou „týdenních intervalech aplikací podkožních injekcí, které obsahují 10⁷ teplem usmrcených bakterií nebo 2(^g pneumokokových proteinů absorbovaných na adjuvans, kterým je hydroxid hlinitý (Alhydrogel®; Cedarlane Laboratories Ltd., Horný, Ontario, Vanada). Vzorky krve se odebíraly před imunizací a sedmý den po první a druhé imunizaci.

5. SDS-PAGE a imunotest

Inkubací bakteriálních suspenzí v Tris-HCL lyzačním pufru (50mM Tris, 150mM NaCl, 0,1 % dodecylsulfát sodný, 0,5% deoxycholát sodný, 2 % Triton® X-100, 100μg/ml fenylmethylsulfonylfluoridu a 2μg/ml aprotininu) při ρΗδ,Ο po dobu 30 minut na ledu se připravily buněčné extrakty pro SDSPAGE, westernův přenos a radioimunoprecipitační test. Lyžované buňky se vyčeřily centrifugací a supernatanty se rozdělily na alikvoty a ty se zmrazily na teplotu -70°C.

SDS-PAGE proběhla na 10 % polyakrylamidovém gelu podle metody Laemmli (Natufe, 227, pp. 680-685 (1970)), za použití systému Mini Protean® (Bio-Rad Laboratories Ltd., Mississauga, kanada). Vzorky se denaturovaly povařením po dobu 5 minut ve vzorkovém pufru, který obsahuje 2 % 2merfcaptoe tanoln. Proteiny se rozlišily barvením polyakrylamidového gelu s PhastGel Blue® (Pharmacia Biotech lne., Baie s'Urfé, Kanada). Radioaktivně značené pro dukty se vizualizovaly fluorografii. Fluorogramy se snímaly za použití laserových densitometrů.

Τϊ—ΓΤ

Postup imunoblotu se provedl podle metody popsané Towbin et al. (Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 76, pp. 4350-4354 (1979)). Detekce antigenů reaktivních s protilátkami se uskutečnila metodou imunotestu s nepřímou protilátkou za použiti anti-myšich imunoglobulinů značených peroxidázou a substrátu barveného o-dianisidinem.

Radioimunoprecipitačni testy se uskutečnily podle způsobu, který popisuje J.A.Wiley et al. (J.Virol., 66, pp. 5744-5751 (1992)). K radioaktivně značeným vzorkům, které obsahuji stejné množství [³⁵S]methioninu, se přidaly supernatanty kultury séra nebo hybridomu. Směsi se nechaly inkubovat po dobu 90 minut při teplotě 4°C za konstantního míchání. Imunní komplexy se pak srážely po dobu 1 hod. při teplotě 4°C proteinovou A sefarozou (Pharmacia), která byla ošetřena bovinnim sérovým albuminem. Zrna se shromáždila v peletu a třikrát se promyla fyziologickým roztokem pufrovaným Tris při pH8,0. Komplexy antigenů se pak povařením ve vzorkovém pufru. Antigeny se elektroforézou na SDS-PAGE. Gel se zafixoval disociovaly analyzovaly a použitím

Amplify® (Amersham Canada Limited, Oakville, Ontario, Kanada) připravil pro fluorografii, gel se pak film X-paprsky.

se se sušil a exponoval

B. Charakterizace odezvy na teplotní šok u bakterií

S.pneumoniae

Testováním paternu syntézy proteinu před a po skoku z teploty 37°C na teplotu 45°C se studovala odezva na teplotní šok u bakterií S.pneumoniae. Obrázek č. 1 ukazuje výsledky situace, kdy bakterie S.pneumoniae typ 6 kmen 64 (panel A) a typ 4 kmen 53 (panel B) se kultivovaly při teplotě 37°C. Dále následovala inkubace při teplotě 37°C (dráha 1,3,5,7 a 9) nebo při teplotě 45°C (dráha 2,4,6,8, a 10) po dobu 5 minut a pak se bakterie značily [³⁵S]methioninem po dobu 10 minut p · · ·· · · · · · • · · · · · · · ···· ·.

• · · · · · ··· ·· ···· ·· ···· · · *· (dráha 1,2 a 7,8), 30 minut (dráha 3,4, a 9,10) nebo 60 minut (dráha 5,6).

Fluorogram odvozený z SDS-PAGE ukazuje, že zvýšením teploty se zvýšila i syntéza nejméně tří proteinů (obrázek č. 1) . Velikost nejnápadnějšího indukovaného proteinu je okolo 72 kDa (HSP72), zatímco další dva proteiny byly přibližně 80kDa (HSP80) a 62kDa (HSP62) velké. Zvýšení syntézy proteinu bylo zřejmé už po 10 minutách značení (obrázek č.l, dráha 1,2 a 7,8) a stalo se podstatnějším, když doba značení se prodloužila na 30 minut (obrázek č.l, dráhy 3,4 a 9,10) a 60minut (obrázek č.l, dráhy 5,6). Účinek zvýšené teploty na profil syntézy proteinu u dvou rozdílných kmenů bakterií S.pneumoniae byl podobný. Syntetizovaly se proteiny HSP podobné molekulové hmotnosti (srovnání se nachází na panelu A (typ 6 kmen 64) a panelu B (typ 4 kmen 53) na obrázku č. 1)).

Analýza denzitometrického záznamu při zkoumání profilů syntézy proteinu umožnila odhad relativního množství proteinů. S ohledem na bakterie S.pneumoniae typ 6 kmen 64, které byly vystaveny teplotnímu šoku, se po 10 minutách značení připravilo 2,9% a 6,8% značených proteinů HSP80 a HSP62. Při teplotě 37°C to bylo méně jak 0,1% (obrázek č.2). Při obou teplotách 37°C a 45 °C se detekovaly značené proteiny, které mají zjevnou molekulovou váhu 72kDa, což je zřejmé z obrázku č. 2. Radioimunoprecipitační analýza však ukázala, že HSP72 se nedetekoval při teplotě 37°C (shora uvedeno, obrázek č. 3,4 a 6), což naznačuje, že pík 9, který se nachází na obrázku č. 2 odpovídá obsahu(ům) proteinu, jež migruje dohromady s HSP72. Jestliže předpokládáme, že značení zmíněného materiálu proběhlo stejným způsobem, výsledky naznačují, že množství HSP72 reprezentuje 8,7% celkového značeného proteinu po teplotním šoku. Srovnání densitometrického záznamu ukazuje, že buněčné proteiny odpovídající pikům 4,10,13,17,19 a 21 se syntetizovaly skoro

4 · · 4 · · 4 · · • · 4 · 4 · · 4,4444 · • 44 444 4 4 ·

444444 4····· · » *· stejnou rychlostí bez ohledu na teplotní šok (obrázek č. 2). Avšak syntéza několika proteinů (píky 1,2,3,15,20,22,24 a 26) ukazuje, že jde o odezvu na teplotní šok (obrázek č. 2).

C. Imunní odezvy na proteiny HSP bakterií S.pneumoniae

Za účelem hodnocení protilátkové odpovědi na pneumokokové HSP se myší séra nejprve testovala radioimunoprecipitací. Repertoár značených proteinů, které rozeznávají séra myší, jež se imunizovaly antigenem S.pneumoniae, je na obrázku č. 3 a 4. Obrázek č. 3 se týká izolace proteinu, který je rozpustný v detergentu. Obrázek č. 4 se týká izolace teplem usmrcených bakterií. Ačkoli řada pruhů se detekovala většinou antisér, HSP72 byl hlavní produkt srážení. Detekcí pouhých proteinů mezi produkty teplotního šoku (obrázek č. 3, dráha 4,6,8 a 10; obrázek č.4, dráha 4,6 a 8) se ukázala specifita protilátek proti HSP72. Je zajímavé, že všechny imunizované myši shodně rozeznaly HSP72. Protilátky reaktivní s HSP72 nebyly specifické pro kmen, který se používal během imunizace, protože se pozorovala silná reaktivita s heterologními HSP72 bakterií S.pneumoniae. Musí se poznamenat s ohledem na HSP72, že navíc jedno sérum precipitovalo s ko-migrujícím produktem značeným při teplotě 37°C a 45°C (obrázek č. 4, dráha 4) . Tento 72kDa velký produkt pravděpodobně odpovídá obsahu píku 9 na obrázku č. 2 a nebyl detekován imunobloty. HSP62 je další imunní cíl, který se srážel s některými, ale ne se všemi, imunními séry (obrázek č.3, dráha 6; obrázek č.4, dráha 4 a 6) . Žádné z testovaných sér nereagovalo s HSP80. Žádný protein se nesrážel v případě, že se testovala reaktivita protilátek preimunního séra z myší užívaných v této studii se značenými produkty.

Jak ukazuje obrázek č. 3 a 5, protilátky proti HSP72 se mohou detekovat po jedné imunizaci s buď proteiny rozpustnými • · « · « · · · v detergentu nebo s celobuněčnými extrakty bakterii S.pneumoniae. Navíc se po druhé imunizaci pozorovalo znatelné zvýšeni protilátkové odezvy na HSP72 (obrázek č. 3, srovnej dráhu 4 a6 a dráhu 8 a 10).

Imunoblotové paterny 15 myši, které se imunizovaly teplem usmrcenými bakteriemi S.pneumoniae, byly překvapivě konzistentní s výsledky dříve popsané radioimunoprecipitace. Ačkoli se vyskytla různá protilátková odezva na řadu proteinů, HSP72 byl hlavni imunoreaktivni antigen, který dal po první imunizaci vzniknout 8 (53%) pozitivním sérům (obrázek č. 5) . Protilátky proti HSP72 se detekovaly ve 13 imunních sérech z celkového počtu 15 sér, které se testovaly po druhé imunizaci (87%). V 5 (33%) a v 7 (47%) sérech se detekovaly dva další prominentní antygeny, které mají zjevnou molekulovou hmotnost 53,5 a 47kDa (obrázek č. 5). Použitím rekombinantnich antigenů HSP72 v imunoblotovém testu se určilo, že reaktivní pruh o velikosti 72kDa je pneumokokový HSP72 (Příklad 3, uvedeno dále v textu). Preimunní séra neuspěla při detekci libovolného pneumokokového proteinu.

Příklad 2: Izolace monoklonálnich protilátek proti epitopům

HSP72

A. Postupy

1. Imunizace myši a fúze

Samičky Balb/c myši (Charles River Laboratories) se imunizovaly antigeny bakterií S.pneumoniae. Jedna sada myši (fúzní experiment 1) se imunizovala peritonálni injekcí, která obsahuje antigen z 10⁷ celých bakterii usmrcených formaldehydem kmene MTL suspendovaných ve Freundově celém adjuvans. Injekce obsahující stejný antigen se opakovaly ve dvou týdenich intervalech a pak se aplikovaly injekce obsahující sonikát teplem usmrcených bakterií ve Freundově • · • · •· «··» « 9 « · · · « · ···· · · · · neúplném adjuvans. Druhá skupina myší (fúzní experiment 2) se imunizovala třikrát ve tří, týdenním intervalu se 75μς pneumokokových antigenů, které jsou rozpustné v detergentu a extrahovaly se z kmene 64 (typ 6) a jsou obsaženy v 25μg adjuvans Quil A (Cedarlane Laboratories Ltd., Hornby, Ontario, Kanada). Tři dny před fúzí se všem myším aplikovala intraperitonálně injekce s antigenem suspendovaným v samotném PBS. Fúzi buněk sleziny s nesekretujícimi SP2/0 buňkami myelomu se produkovaly hybridomy podle popisu J.Hamel et al. (J.Med. Microbiol., 23, pp. 163-170 (1987)). Specifický hybridom se klonoval následnými limitujícími ředěními, nechal se pomnožit a zamrazil se v kapalném dusíku. Testem ELISA se určila třída, podtřida a typ lehkého řetězce MAbs podle popisu D.Martin et al, (Eur.J.Immunol., 18, pp. 601-606 (1988)) za použití činidel získaných z Southern Biotechnology Associates lne. (Birmingham, AL).

2. Subbuněčná frakcionace

Pneumokok*j se separovaly do subbuněčných frakci na základě způsobu, který popisuje Pearce et al.(Mol.Microbiol., 9, pp. 1037-1050 (1993)). Bakterie S.pneumoniae kmen 64 (typ

6) se kultivovaly v půdě Todd Hewitt, která je doplněna 0,5 % (hmotnost/objemem) kvasinkovým extraktem po dobu 6 hodin při teplotě 37°C a izolovaly se centrifugací. Buněčné pelety se resupendovaly v 25mM Tris-HCl pH8, 0, ImM EDTA, ImM fenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) a sonikovaly se po dobu 4 minut s 15 vteřinovými rázy. Buněčný odpad se odstranil centrifugací. Bakteriální membrány a cytoplazmatický obsah se oddělil centrifugací při 98 OOOg po dobu 4 hodin. Cytoplazmatická frakce (supernatant) a membránové frakce (pelet) se upravily tak, aby obsahovaly koncentraci proteinu do lmg/ml a podrobily se analýze SDS-PAGE a imunoblotu.

• ······ · ♦ · · · * « · · · · ···· • · , · · · · · · · · · · ♦ « · '« ··· ··· • · · · · · ·· · ·· · ¹ ·· · ·

B. Identifikace a charakterizace MAbs proti HSP72 bakterii

S.pneumoniae

Supernatanty kultury hybridomů se testovaly enzymovým imunotestem za použití celých buněk bakterií S.pneumoniae kmen 65 (typ 4) postupem, který popisuje D.Martin et al. (citace uvedena shora). Pozitivní hybridomy se pak znovu testovaly imunoblotací za účelem určení hybridomů, které vylučují MAbs reaktivní s HSP72. Z celkového počtu 26 hybridomů, které vykazují v imunoblotu anti-reaktivitu s S.pneumoniae, čtyři rozeznávají epitopy přítomné v pruhu s proteinem o molekulové hmotnosti 72kDa. Čtyři hybridomy se označily Fl-Pn3.1 (pochází z fúzního experimentu 1) a F2Pn3.2, F2-Pn3.3 a F2-Pn3.4 (pochází z fúzního experimentu 2). Izotypová analýza ukázala, že hybridom Fl-Pn3.1 (pochází z fúzního experimentu 1) vylučuje imunoglobiny IgG__2ak< zatímco všechny hybridomy F2-Pn3.2, F2-Pn3.3 a F2-Pn3.4 (pochází z fúzního experimentu 2) vylučovaly IgG_ik. Chybějící radioimunoprecipitační aktivita proti proteinům bakterií S .pneumoniae značených [³⁵S]methioninem jasně ukazuje specifitu MAbs na HSP72. Uvedené proteiny se získaly z kultur inkubovaných při teplotě 37°C a imunoprecipitace proteinu o velikosti 72kDa s lyzáty získanými aplikací teplotního šoku inkubací při teplotě 45°C. Obrázek č. 6 (dráha 5 a 6) ukazuje výsledky získané s MAb F2-Pn3.2, F2-Pn3.3 a F2-Pn3.4.

Lyzáty z buněk bakterií S.pneumoniae, které nebyly respektive byly vystaveny teplotnímu šoku, byly značeny [³⁵S]methioninem a byly testovaný MAb, se elektoforezovaly na SDS-PAGE gelech a pak se podrobily analýze westernovým přenosem. Výsledné imunobloty ukazují na přítomnost antigenů HSP72 v obouch vzorcích. Panel A na obrázku č. 7 ukazuje výsledky získané MAb Fl-Pn3.1. Stejné výsledky se získaly u MAbs F2-Pn3.2, F2-Pn3.3 a F2-Pn3.4. Vzhledem ke stresovým podmínkám teplotního šoku se podstatně nezvýšila reaktivita • · « ·· · • >

anti-HSP72 monoklonálních protilátek. Fluorograf imunoblotů však jasně ukazuje odezvu na teplotní šok (obrázek č.7, panel B). Tyto experimenty ukazují, že zvýšení rychlosti syntézy HSP72 bakterií S.pneumoniae je odezva na teplotní šok, ale že absolutní množství HSP72 se po teplotním šoku nezvyšuje.

C. Buněčná lokalizace HSP72

Za účelem zjistit lokalizaci HSP72 v buňkách se lyzáty buněk bakterií S.pneumoniae rozdělily na frakce diferenciální centrifugací. Vzniká rozpustná frakce a částicová frakce obohacené membránovými proteiny, uvedeno shora. Vzorek obsahující 15μς proteinu membránové frakce (dráha 1) a cytoplazmové frakce (dráha 2) bakterií S.pneumoniae se elektroforetizoval na SDS-PAGE, přenesl se na nitrocelulozu a testoval se s MAb Fl-Pn3,l. Na základě výsledků analýzy westernovým přenosem se zjistilo, že HSP72 se nachází v obou frakcích. Většina proteinu je spojena s frakcí cytoplazmy (obrázek č. 8).

Příklad 3: Molekulové klonování, sekvenování a exprese genů kódující antigeny HSP72.

A. Postupy

1. Kmeny a plazmidy

Kmeny a plazmidy používané v této studii se uvádí v tabulce č. 1.

Tabulka č. 1: BAKTERIÁLNÍ KMENY, FÁGY A PLAZMIDY

Kmen, fág, plazmid	Relevantní charakteristiky	Reference nebo zdroj e
Kmeny E.coli JM109	Δ (lac-	BRL

• ·· ·

	proAB)[F'traD proAB lacP ZA M15]	Amersham
Y1090 BL21(ED3)	rk-mk-1 on supF [pMC9] lacUV5-T7 RNA polymeráza	Studier et al, (infra)
Fágy
Xgtll	CJ857 S100 klonovaci vektor	Amersham
XJBD7	LacZ-HSP72 fúze; 2, 3kb EcoRI fragment v Xgtll	tato studie
ÁJBD17	FucI-HSP72 chimérický; 2,4 kb EcoRI a 2,3kb EcoRI fragmenty v Xgtll	tato studie
Plazmidy
pWSK29	Ampr; klonovaci vektor s nízkým počtem kopií	Wang et al. (infra)
pWKS30	stejné jako u pWSK29, ale opačné multi-klonovaci místo	Wang et al. (infra)
PJBD171	stejné jako u ÁJBD17, ale v pWSK29	tato studie
PJBD177	2,8kb Xhol-EcoRI fragment v pWKS30 neexprimuje se rekombinant. protein HSP72	tato studie
PJBD179	FucI-HSP72 fúze; 2,4kb EcoRI a 0,8kb EcoRI-EcoRV fragmenty v pWSK29	tato studie
pT7-5	Ampr; T7 promotor Φ10	Tábor et al. (infra)
pT7-6	stejné jako u pT7-	Tábor et al (infra)

«· • · · · » • · · · · · « · • · · · • · β ·

	5, ale opačné multi-klonovací místo
pJBDf51	stejné jako pJBD179, ale v pT75	tato	studie
pJBDf62	stejné jako u PJBD179, ale v pT76	tato	studie
pDELTAl	Ampr; Tn 1000	BRL
pJBDAl	stejné jako u pJBD179, ale v pDELTAl	tato	studie
PJBD291	HSP72; 3, 2kb HindlII fragment v pWSK29	tato	studie
pJBDk51	stejně jako u pJBD291, ale v pT75	tato	studie
pJBDÁ4	stejné jako pJBD291, ale v pDELTAl	tato	studie
Kmen E.coli se	kultivoval v L půdě	nebo	na L agaru při

teplotě 37°C. Je-li to nezbytné přidá se do média ampicilin, aby jeho koncentrace byla 50gg/ml. Plazmidy se izolovaly za použiti soupravy Magic/Wizard® Mini Preps (Promega, Fisher Scientific, Ottawa, kanada).

2. Obecné způsoby rekombinace DNA

Od firem Boehringer Manhcim Canada, Laval, Quebec nebo Pharmacia Biotech, Uppsala, se získaly restrikčni endonukleázy, T4 DNA ligáza a standardy molekulové váhy DNA. Štěpeni restriktázami a ligace se uskutečnila podle způsobu, který popisuje J.Sambrook et al. v publikaci (Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory . · · ♦ · ·· • · • ·

Press, N.Y. (1989)) . Elektroforéza na agarozovém gelu fragmentů DNA se uskutečnila následujícím způsobem, který popisuje J.Sambrook et al. (uvedeno shora) za použití TAE pufru (0,04M Tris-acetát; 0,002M EDTA) od firmy Boehringer Man '.nheim. Fragmenty DNA se izolovaly z agarozového gelu za použiti DNA izolační soupravy Prep-A-Gene® (Bio-Rad Laboratories Ltd., Mississauga, Ontario). Transformace se provedla na zařízeni Gene Pulser® (Bio-Rad) podle protokolu, který poskytl výrobce.

3. Konstrukce a screening genomové knihovny

K vytvořeni genomové knihovny DNA bakterii S.pneumoniae se použil bakteriofágový expresivní vektor Xgtll (Xgtll klůnovací systém, Amersham). Tato knihovna se vytvořila způsobem, který doporučuje výrobce. Chromozomálni DNA bakterií S.pneumoniae typu 6 kmene 64 se připravila způsobem, který popisuje J.C.Paton et al. (Infect. Immun., 54, pp. 5055 (1986)). Chromozomálni DNA bakterií S.pneumoniae se částečně trávila restriktázou EcoRI a fragmenty 4 až 7 kb se frakcionaovaly a izolovaly z agarozového gelu. Fragmenty se ligovaly do ramen fága Xgtll, zabalily se a výsledná směs fága se použila k infekci E.coli Y1090. Imunotestování plaků exprimujících antigeny rekombinantního HSP72 se uskutečnilo za použití HSP72-specifických monoklonálních protilátek FlPn3.1, uvedeno shora. Plakové klony exprimující peptidy, které jsou rozeznávány MAb Fl-Pn3.1, se izolovaly a čistily. Připravily se kapalné lyzáty a DNA se izolovala z fágového absorbentu Promega LambdaSorb podle popisu výrobce. Po té následoval běžná izolace DNA.

4. Analýza Southernovým přenosem

K southernové analýze uvedených vzorků se použilo neradioaktivní značení DNA soupravou DIG Labelling and • · » » * * · » 9 9 999 9 * ··· 9 9 9 9 9'9 ···» ·· ···· ·· · ·

Detection kit, která se získala od firmy Boehringer Manheim. Fragmenty DNA vybrané jako sondy (uvedeno dále v textu) se izolovaly elektroforezou na agarozovém gelu a pak se značily digoxigeninem (DIG)-11-dUTP. Chromozomální DNA pneumokoků se .štěpila restriktázou HindlII a vzniklé fragmenty se oddělily elektroforézou na 0,8 % SDS-PAGE gelu a přenesly se na pozitivně nabité nylonové membrány (Boehringer Mannheim) jak popisuje J.Sambrook et al. (uvedeno shora). Membrána se pak blotovala s DNA probami, které jsou značené DIG, podle protokolu výrobce.

5. Sekvenování DNA a analýza sekvence

V tomto příkladu se sekvenované fragmenty DNA nejdříve klonovaly do plazmidu pDELTAl (GIBCO BRL Life Technologies, Burlington, Ontario). Na obouch řetězcích se vytvořily hnízdové delece in vivo delecí zprostředkovanou transpozicí transpozonu Tn 100 (Deletion Factory Systém, GOBCO BRL) , přičemž se postupovalo podle instrukcí, které poskytl výrobce. Velikost těchto delecí se určila elektroforezou na agarozovém gelu a sekvenováním terminační metodou dideoxynukleotidového řetězce (F.Sanger et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 74, pp. 5463-5467 (1977)) se určily příslušné deleční deriváty. Za účelem sekvenování rozdílů delečních templátů se syntetizovaly oligonukleotidy na oligonukleotidovém syntetizátoru 392 (ABI, Applied Biosystems lne., Foster City, CA). Sekvenační reakce se uskutečnila PCR (DNA Thermal Cycler 480®, Perkin Elmer) za použití soupravy Taq DyeDeoxy Terminátor Cycle Sequencing kit (ABI) a elektroforeza DNA se provedla na automatizovaném sekvenátoru 373A (ABI) .

• · ·.· · · • · • 9 99 9 • · • ·

6. Exprese klonovaného genu v systému E.coli T7 RNA pol/promotor

Vysoké exprese klonovaného genu se v tomto případě dosáhlo použitím bakteriofágového T7 RNA polymeráza/promotor systému v E.coli. Fragment DNA specifikující rekombinantní protein se ligoval ve správné orientaci, která zaručuje expresi genu, do plazmidu pT7-5 nebo pT7-6 (S.Tábor and C.C.Richardson, Proč.

Nati. Acad. Sci. USA, 82, pp.1074-1078 (1985)). Exprese uvedeného genu se řídila promotorem Φ10 specifickým pro T7 RNA polymerázu. Výsledný plazmid se vnesl do kmene BL21(DE3) E.coli (F.W.Studier, and B.A.Moffatt, J.Mol.Biol., 189, pp. 113-130 (1986)), který nese na svém chromozómu strukturální gen T7 RNA polymerázy. Tento gen řídí indukovatelný promotor lacUV5. Při indukci IPTG T7 RNA polymeráza indukovaná v transformantech BL21(DE3) specificky přepisuje gen za řízení T7 promotoru Φ10. Nadměrně exprimované rekombinantní proteiny se vizualizovaly buď westernovým přenosem nebo barvením Coomassieovou modří.

7. Analýza N-terminální aminokyselinové sekvence HSP72

Pneumokokový HSP72 se izoloval imunoprecipitací za použití MAb Fl-Pn3.1 (uvedeno shora) a jako antigen se použily vzorky extraktů buněčné stěny bakterií S.pneumoniae kmen 64, které se připravily jak popisuje L.S.Daniels et al. (Microb. Pathogen.,

1. Pp. 519-531 (1986)). Imunní sraženiny se oddělily pomocí

SDS-PAGE a pak se přenesly na polyvinylidendifluoridovou membránu (PVDF) způsobem podle P.Matsudaira (J. Biol. Chem.,

262, pp. 10035-10038 (1987)). PVDF membrána se obarvila

Coomassieovou modří, pruh odpovídající HSP72 se vyřízl a pak se analyzoval na automatizovaném proteinovém sekvenátoru (ABI) podle standardních postupů.

B. Konstrukce plazmidů obsahujících genové fragmenty HSP72

S.pneumoniae odpovídající C-169.

Genomová knihovna DNA Xgtll bakterií S.pneumoniae se testovala MAb Fl-Pn3.1 specifickými pro HSP72. Izolovalo se 17 imunoreaktivních klonů izolovaných a čištěných z celkového počtu 1 500 testovaných fágů. Za účelem potvrdit specifitu proteinů exprimovaných rekombinantními fágy se uskutečnila analýza westernovým přenosem rekombinantních fágových lyzátů. Mezi 17 pozitivními klony, které rozeznaly MAb Fl-Pn3.1 se určily dvě skupiny klonů a jejich reprezentanti se za účelem další charakterizace označili. jako ÁJBD7 a ÁJBD17. Jak ukazuje obrázek č. 9 celobuněčné extrakty z bakterií S.pneumoniae kmen 64 (dráha 1) a fágové lyzáty z E.coli infikované ÁJBD17 (dráhy 2 a 3) nebo XJBD7 (dráhy 4 a 5) kultivované v přítomnosti (+) nebo bez (-) IPTG se podrobily elektroforéze na 10 % polyakrylovém gelu a přenesly se elektropřenosem na nitrocelulozu. Imunoblot se testoval MAb Fl-Pn3.1 specifickými pro HSP72. Klón ÁJBD17 obsahuje dva vnesené EcoRI-EcoRI fragmenty o velikostech 2,4kb a 2,3kb (obrázek č. 10) a exprimoval chimérického rekombinantní protein, jehož zdánlivá molekulová hmotnost na SDS-PAGE gelu je 74kDa. (obrázek č.9, dráha 2 a 3) . Zjistilo se, že klůn ÁJBD7 obsahuje vložený EcoRI fragment o velikosti 2,3kb a produkuje jasný fúzní protein, který se skládá z LacZ a 74kDa velkého chimérického proteinu produkovaného klonem %JBD17. Fúzní protein měl zdánlivou molekulovou hmotnost 160kDa, což se odhadlo z SDS-PAGE (obrázek č. 9, dráha 5) . Exprese chimérického rekombinantního proteinu kódovaného fágem ÁJBD17 je nezávislá na indukci pomocí IPTG (obrázek č. 9, dráhy 2 a

3), zatímco exprese rekombinantního fúzního proteinu

• · kódovaného fágem XJBD7 je závislá na indukci lac promotoru (obrázek č. 9, dráha 4 a 5).

Za účelem subklonovat gen HSP72 se izolovala pneumokoková DNA vnesená do klonu XJBD17, čistila se a ligovala se do plazmidu pWSK29 s nízkým počtem kopií (R.F.Wang and S.R.Kushner, Gene, 100, pp. 195-199 (1991)) za vzniku plazmidu pJBD171. Inzert z plazmidu pJBD171 se charakterizoval restrikčním mapováním (obrázek č. 10B). Za účelem definovat hranice genu, který kóduje antigen reaktivní s MAb Fl-Pn3.1 se provedla řada subklonování a imunoblotování. Zjistilo se, že oblast odpovídající za expresi chimérického proteinu o velikosti 74kDa se nachází na 3,2kb velkém EcoRI-EcoRV fragmentu, který zahrnuje intaktní 2,4kb velký EcoRI-EcoRV fragment a 0,8kb velkou EcoRI-EcoRV část 2,3kb velkého EcoRI-EcoRI fragmentu. Plazmid, který nese 3,2kb velký EcoRI-EcoRV inzert se označil jako pJBD179.

C. Exprese a analýza DNA sekvence chimérického genu kódujícího C-169

Za účelem zjištění směru transkripce genu kódujícího 74kDa velký chimérický protein na 3,2kb velkém EcoRI-EcoRV fragmentu a zvýšení výtěžku 74kDa velkého chimérického proteinu určeného pro imunologickou se rozhodlo, že 74kDa velký chimérický protein se bude exprimovat v systému E.coli T7 RNA a T7 promotor. 3,2kb velký EcoRI-EcoRV fragment, který se získal z pJBD179, se ligoval do plazmidů pT7-5 a pT7-6, ve kterých multi-klonovací místa se umístila v opačné orientaci s ohledem na T7 promotor Φ10 specifickým pro T7 RNA polymerázu. Bakterie kmene E.coli JM109 se transformovaly ligační směsí a určili se pozitivní transformanti reaktivní s MAb Fl-Pn3.1 pomocí metody colony lifting, kterou popisuje J.Sambrook et al. (citace uvedena shora). Výsledné rekombinantní plazmidy získané z plazmidů pT7-5 a pT7-6 se

označily pJBDf51 respektive pJBDf62. Restrikčním mapováním se podařilo v těchto rekombinantních plazmidech určit jejich orientaci a přítomnost intaktního 3,2kb velkého EcoRI-EcoRV inzertu. Za účelem dosažení nadměrné exprese 74kDa velkého chimérického proteinu se plazmidy pJBDf51 a pJBDf62 odděleně zavedly do E.coli BL21(DE3). Transformanti se indukovali pomocí IPTG(lmM) po dobu 3hodin při teplotě 37°C. Buňky se shromáždily, promyly, resuspendovaly v 1 % SDS a povařily se po dobu 10 minut. Lyzáty se pak analyzovaly SDS-PAGE a imunoblotem. Jak se očekávalo, oba transformanti produkovali chimérický protein, který se snadno detekoval westernovým přenosem monoklonálníml protilátkami Fl-Pn3.1 (obrázek č. 11). Při podmínkách indukce pomocí IPTG pouze transformanti BL21(DE3) (pJBDf51) nadměrně exprimovalí chimérický protein o velikosti 74kDa (obrázek č. 11A a 11B, dráha 2), což indikuje, že směr transkripce genu kódujícího 3,2kb velký EcoRI-EcoRV fragment je od konce EcoRI na EcoRV konec (obrázek č. 10A).

Za účelem zvýšit výtěžek plazmidu pJBDÁl se 3,2kb velký EcoRI-EcorV fragment klonoval do plazmidu pDELTAl. Provedla se řada přesahujících delecí a DNA se použily jako templáty pro sekvenaci. Sekvence DNA celého 3,2kb velkého inzertu EcoRI-EcoRV je uvedená v SEQ ID č.:l. Nalezly se dva otevřené čtecí rámce (ORF) a jejich orientace je znázorněna na obrázku č.10 (ORF27 a FucI-HSP72 (C—169) ) . Před těmito dvěma ORF se našla putativní místa vhodná pro navázání na ribozóm (SEQ ID č.:l, nukleotidy 18-21 a 760-763). Určily se ne příliš zřejmé promotorové sekvence -10 a -35. ORF27 postrádá nukleotidy 30 až 755 (SEQ ID č.:l) a kóduje protein s 242 aminokyselinami, jehož molekulová hmotnost se vypočítala na hodnotu 27 066 daltonů. Dedukovaná aminokyselinová sekvence tohoto proteinu je uvedená v SEQ ID č.:2. Tento gen se označil orf27 a porovnal se s dalšími známýni sekvencemi. Nenašel se žáadný a· ·· ⁷ a * · homologní gen nebo protein. Velký ORF (nukleotidy 771-2912, SEQ ID č.:l) specifikuje protein, který se skládá ze 714 aminokyselin a jehož předpovězená molekulová hmotnost je 79 238 daltonů. Dedukovaná aminokyselinová sekvence tohoto proteinu je uvedená v SEQ ID č.:3. Za účelem určit vztah ORF k dalším aminokyselinovým sekvencím se tento ORF porovnal s dalšími známými sekvencemi. Tato analýza odhalila vysoký stupeň podobnosti kódovaného proteinu a sekvence izomerázy fukozy bakterií E.coli (Fučí) a několika členů rodinu genů HSP70, které jsou také známy jako geny DnaK. Získání SEQ ID č.:3 a sekvencí proteinů Fučí E.coli a HSP70 (Dnak) ukazuje, že oblast N-konce odpovídající aminokyselinám 1 až 545 (SEQ ID č.: 3) chimérického proteinu o velikosti 74 kDa je vysoce homologní s Fučí E.coli, zatímco oblast C-konce odpovídající aminokyselinám 546 až 714 (SEQ ID č. : 3) je podobná jako proteiny HSP70 (DnaK). Je pozoruhodné, že na spojení těchto dvou oblastí genu, který kóduje 74kDa velký protein leží restrikční místo EcoRI (SEQ ID č.: 1, mezi nukleotidy 2404 až 2405) . Jiná restrikční místa leží mezi nukleotidy 971 a 972 (Pstl), nukleotidy 1916 a 1917 (Pstl), nukleotidy 1978 a 1979 (Xhol) a nukleotidy 3164 a 3165 (EcoRV). Vycházejíc z těchto dat se zjistilo, že protein o velikosti 74kDa byl chimérický a byl kódován dvěma kusy chromozomální DNA bakterií S.pneumoniae, což jsou 2,4kb velký EcoRI-EcoRV velký fragment získaný z homologního genu Fučí a 2,3kb velký EcoRI-EcoRI fragment získaný z genu HSP72.

D. Analýza Southernovým přenosem

Southernův přenos se uskutečnil za účelem potvrdit, že

74kDa velký protein je chimérický protein a pokusit se klonovat celý pneumokokový gen HSP72. Chromozomální DNA bakterií S.pneumoniae se zcela štěpila restriktázou HindlII, separovala se na 0,8 % agarózovém gelu a přenesla se na Z ·♦· ·· 9 9 9 9 ·· ♦·· · · 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9999 99 9999 99 ·♦ pozitivně nabité nylonové membrány (Boehringer Manheim). Membrány se pak testovaly buď s 0,8kb velkou EcoRI-EcoRV sondou získanou z 2,3kb velkého fragmentu EcoRI-EcoRI nebo lkb velkou Pstl-Pstl sondou získanou z 2,4kb velkého EcoRIEcoRV fragmentu. Obě sondy se před tím značily digoxigeninemdUTP. Tyto dvě sondy hybridizovaly se dvěmi individuálními HindlII fragmenty různé velikosti (obrázek č. 10B a 10C) . Sonda EcoRI-EcoRV o velikosti 0,8kb rozeznala 3,2kb velký HindlII fragment a lkb velká Pstl-Pstl sonda reagovala s 4kb velkým HindlII fragmentem. Tento výsledek dále ukázal, že gen odpovědný za expresi 74kDa velkého chimérického proteinu vznikl fúzí dvou kusů EcoRI fragmentů. Jeden pochází z fragmentu, který obsahuje část 5'-konce homologu proteinu Fučí bakterií S.pneumoniae, druhý vznikl ze segmentu, který nese C-169 fragment genu pneumokokového HSP72. Skutečnost, že 0,8kb EcoRI-EcoRV sonda hybridizovala s jedním 3,2kb velkým fragmentem naznačuje, že v bakteriích S.pneumoniae existuje pouze jedna kopie genu HSP72.

E. Produkce rekombinantního HSP72

Částečná pneumokoková genomová knihovna se vytvotřila ligací HindlII fragmentů z chromozomální DNA, jejichž velikosti jsou v rozmezí od 2,8 do 3,7kb, do plazmidů pWSK29, který se štěpil restriktázou HindlII. Ligační směsí se transformovaly bakterie E.coli kmene JM 109 a transformanti se testovali' hybridizací s 0,8kb velkou EcoRI-EcoRV sondou. Jeden reprezentativní plazmid ze čtyř pozitivně hybridizujících klonů se nazval pJBD291. Restrikční analýza inzertu a westernův přenos buněčného lyzátu transformantů se použil za účelem potvrdit, že plazmid pJBD291 skutečně nese 3,2kb velký HindlII fragment, který obsahuje gen HSP72 a který exprimuje rekombinantní protein HSP72 (obrázek č. 109). Protein HSP72 exprimovaný transformanty (pJBD291) migroval na • · • ·

SDS-PAGE gelu do stejné polohy jako přirozený protein HSP72 (obrázek č. 12) . Za účelem sekvenace celého genu HSP72 a nadměrné exprese celého proteinu HSP72 se z plazmidu pJBD291 izoloval 3,2kb velký HindlII fragment a subklonoval se do plazmidů pDELTAl a pT7-5 za vzniku plazmidů pJBDÁ4 a pJBDk51.

Sekvenoval se celý 3,2kb velký HindlII fragment DNA, který nese plazmid pJBDÁ4, a 2,3kb velký EcoRI-EcoRI fragment DNA obsažený na plazmidu pJBD177. Nukleotidové sekvence obsahovala 4 320 párů baží a ukázala dva otevřené čtecí rámce (SEQ ID č.:4). První otevřený čtecí rámec (ORF) začínající nukleotidem 682 a končící nukleotidem 2502 (SEQ ID č.:4) se určil jako pneumokokový gen HSP72. Druhý otevřený čtecí rámec (ORF) začínající nukleotidem 3 256 a končící nukleotidem 4 320 (SEQ ID č.:4) se nachází 764 párů baží po směru transkripce strukturálního genu HSP72 a určil se jako část 5'-konce pneumokokového genu DnaJ. Putativní ribozómové vazebné místo (AGGA) se nachází 9 párů baží proti směru transkripce od startovacího kodonu strukturálního genu HSP72, zatímco typické ribozomové vazebné místo (AGGA) se nachází 66 párů baží proti směru transkripce startovacího kodonu strukturálního genu DnaJ. V poloze před těmito dvěma geny nebyla určena žádná typická 5'regulační oblast. Restrikční místa se nachází mezi nukleotidy 1 a 2 (HindlII), nukleotidy 1318 a 1319 (EcoRI), nukleotidy 1994 a 1995 (EcoRI) , nukleotidy 3343 a 3344 (HindlII) a nukleotidy 4315 a 4316 (EcpRI) . Organizace genu HSP72 (DnaK) a DnaJ v bakteriích S. pneumoniae je podobná organizaci genů v bakteriích E. coli (Saito, H. a Uchida, Mol. Gen. Genet. 164, 1-8 (1978)) stejně jako u několika jiných gram-pozitivních bakterií (Wetzstein, M. et al., J.Bacteriol. 174, 3300-3310 (1992)). Avšak intragenní oblast bakterií S. pneumoniae je podstatně větší a proti směru transkripce strukturálního genu HSP72 (DnaK) se nenašel žádný ORF pro gen grpE.

Předpovídaný protein HSP72 má 607 aminokyselin a spočítaná molekulová hmotnost má hodnotu 64 755 daltonů, což se porovnalo s molekulovou hmotností 72kDa odhadnutou z SDSPAGE. Předpovězený protein HSP72 je kyselý a jeho izoelektrický bod (pí) je 4,35. Automatizovaná Edmanova degradace izolavaného přírodního proteinu HSP72 extrahovaného z bakterií S.pneumoniae kmen 64 odhalila sekvenci 19 aminokyselin N-konce proteinu SKIIGIDLGTTN-AVAVLE. Methionin N-konce nebyl určen, což pravděpodobně způsobila in šitu úprava, která se objevuje u mnoha proteinů. V poloze 13 se určil zbytek, který není aminokyselina. Sekvence 19 aminokyselin N-konce, která se získala z přirozeného proteinu HSP72, se celá shoduje se sekvencí 19 aminokyselin N-konce odvozené z nukleotidové sekvence rekombinantního genu HSP72 bakterií S.pneumoniae (SEQ ID č. : 5), čímž se potvrdilo klonování. Tato sekvence N-konce ukazuje úplnou shodu s proteinem DnaK z bakterií Lactococcus lactis a 68,4 % shodu s proteinem DnaK z bakterií Escherichia coli. Podobně, srovnání předpovězené sekvence aminokyselin HSP72 (SEQ ID č.: 5) s těmi z ostatních bakteriálních proteinů HSP70 (DnaK) také odhalilo vysokou homologii (obrázek č. 13A až 13D). Například protein HSP72 vykazuje 54 % shodu s proteinem DnaK bakterií E.coli. Nej vyšší shody se dosáhlo při srovnání z grampozitivními bakteriemi Lactococcus lactis, které vykazují 85 % shodu s HSP72. Podobně jako další proteiny HSP70 grampozitivnich bakterií proteiny HSP72 nemají protažení 24 aminokyselin blízko N-konce, které se nachází u proteinů z gram-negativních bakterií (obrázek č. 13A až 13D).

Ačkoli HSP72 je homologní s proteiny HSP70 (DnaK) z jiných organizmů, má některé unikátní rysy. Sekvenční divergence proteinů HSP72 (DnaK) je většinou lokalizována ve dvou oblastech (zbytky 244 až 330 a 510 až 607, SEQ ID č.:5).

Přesněji peptidové sekvence GFDAERDAAQAALDD (zbytky 527 až

541, SEQ ID č.: 5) a AEGAQATGNAGDDW (zbytky 586 až 600, SEQ ID č.: 5) se nacházejí pouze u proteinů HSP72. Skutečnost, že oblast C-konce HSP72 je vysoce variabilní naznačuje, že tato oblast nese antigenní determinanty, které jsou specifické pro bakterie S.pneumoniae. V souladu s touto hypotézou monoklonální protilátky určené proti fragmentu C-169 proteinu HSP72 (uvedeno dále v textu) nejsou reaktivní s bakteriemi

E. coli a S.aureus, o nichž se ví, že exprimují proteiny DnaK, jež jsou podobné proteinu HSP72.

Zkrácený protein DnaJ bakterií S.pneumoniae (SEQ ID č.:6) má 352 aminokyselin, které ukazují vysoký stupeň podobnosti s odpovídajícími oblastmi proteinu DnaJ bakterií L.lactis (72 % shoda) a proteinu DnaJ bakterií E.coli (51 % shoda). Předpovězený zkrácený protein DnaJ obsahuje vysoký obsah glycinu (15%) . Mezi aminokyselinami 148 a 212 DnaJ proteinu bakterií S.pneumoniae (SEQ ID č.:6) se určily čtyři repetice bohaté na Gly-, Cys-. V každé repetici je obsažen motiv Cys-X-X-Cys-X-Gly-X-Gly, který charakterizuje proteiny DnaJ (P.A.Silver and J.C.Way, Cell, 74, pp. 5-6 (1993)).

Blízko N-konce se našly čtyři opakované sekvence GGFGG (zbytky 75 až 79, 81 až 85 a 90 až 94).

F. Reaktivita monoklonálnich protilátek proti rekombinantním antigenům

Testovala se reaktivita čtyř monoklonálnich protilátek (Fl-Pn3.1, F2-Pn3.2, F2-Pn3.3 a F2-Pn3.4, uvedeno shora) specifických pro HSP72 proti proteinům exprimovaných bakteriemi E.coli, které jsou infikovány nebo transformovány rekombinantními fágy a plazmidy, jež obsahují sekvence HSP72. Čtyři jednotlivé monoklonální protilátky reagovaly s fúzním proteinem lacZ-HSP72, který exprimoval klon XJBD7. Epitopy rozeznávané uvedenými monoklonálními protilátkami se nacházejí ve zbytcích 169 C-konce. Překvapivě pouze tři ze ·· ···♦ ·· · ·· • ·· ·· *· čtyř monoklonálních protilátek rozeznaly proteiny kódované pneumokokovými inzerty v plazmidech λύΒΏ17 a pJBDál. Tyto výsledky naznačují, že ačkoli fragmenty C-169, které se syntetizují v bakteriích E.coli infikovaných XJBD7 a XJBD17 mají stejnou primární strukturu, liší se v konformaci. Chybějící reaktivita monoklonálních protilátek F2-Pn3.2 s některými rekombinantními proteiny naznačuje možnost, že tyto určité monoklonální protilátky rozeznávají více komplexních epitopů. Komplexní epitopy F2-Pn3.2 jsou stále rozeznatelné westernovými imunobloty. Celý protein HSP72_rec exprimující se v bakteriích E.coli, které obsahují rekombinantní plazmid pJBDA4, je reaktivní se všemi čtyřmi monoklonálními protilátkami.

Příklad 4: Antigenní specifita a reaktivita HSP72 a monoklonálních protilátek

Reaktivita monoklonálních protilátek Fl-Pn3.1, F2-Pn3.2, F2-Pn3.3 a F2-Pn3.4 s bakteriálními kmeny, které zahrnují 20 kmenů bakterií S.pneumoniae, jež reprezentují 16 kapsulárních sérotypů (tytpy 1,2,3,4,5,6,8,9,10,11,12,14,15,19,20 a 22) a 17 bakteriálních kmenů, které nejsou pneumokoky a jsou uvedeny v tabulce č. 2, se testovala za použití bodov^Ů^ enzymového imunotestu popsaného D.Martinem et al. (citace uvedena shora) a imunoblotováním. Bakterie, které se použily v dot enzymovém imunotestu, se kultivovaly přes noc na plotnách s čokoládovým agarem a pak se suspendovaly v PBS, pH7,4. Na nitrocelulózový papír se aplikovalo 5 μΐ suspenze, která obsahuje přibližně 10⁹ jednotek tvořících kolonie/ml (CFU/ml). Membrána se blokovala PBS, který obsahuje 3 % bovinní sérový albumin a pak se inkubovala s monoklonálními protilátkami a sekundárními protilátkami značenými peroxydázou. Aby se mohla provést analýza westernovým přenosem, připravil se celobuněčný extrakt povařením ·· bakteriální suspenze obsažené ve vzorkovém pufru po dobu 5 minut.

Tabulka č. 2: SEZNAM IZOLÁTU, KTERÉ NEPATŘÍ MEZI PNEUMOKOKY,

A TESTOVALY SE BODOVÝM ENZYMOVÝM IMUNOTESTEM

Označeni kmene	Rod a druh	Skupina nebo
		typ
C-2	Streptococcus pyogenes	skupina A
C-3	Streptococcus agalactiae	skupina B
C-7	Enterococcus faecalis	skupina D
C-9	Streptococcus bovis	skupina D
C-14	Streptococcus mutans
C-15	Streptococcus salivaris
C-19	Streptococcus sanguis	I
C-20	Streptococcus sanguis	I
C-21	Streptococcus sanguis	I
C-22	Streptococcus sanguis	II
C-23	Streptococcus sanguis	II
C-24	Streptococcus sanguis	II
C-25	Streptococcus sanguis	II
C-27	Gemella morbillorum
C-30	Staphylococcus aureus
C-33	Bacillus
C-36	Escherichia coli

Při bodovém enzymovém imunotestu každá monoklonální protilátka reagovala s každým kmenem bakterií S.pneumoniae, ale se žádným izolátem, který není pneumokok. Tyto výsledky se neočekávaly, protože srovnávací studie ukázaly, že protein HSP72 je velmi podobný jako jiné známé bakteriální proteiny HSP70 (DnaK), například ty získané z bakterií E.coli a S.aureus.

Na imunoblotech se pak dále zkoumala imunoreaktivita monoklonálních protilátek. Tabulka č.3 ukazuje, že každá monoklonální protilátka vykazuje nějakou reaktivitu. Ačkoli procento shody aminokyselinové sekvence bakterii E.coli a aminokyselinové sekvence proteinu HSP72 (SEQ ID č.: 5) je

54%, čtyři monoklonální protilátky specifické pro HSP72 nerozeznaly protein HSP70 (DnaK) bakterii E.coli. Podobně • · • · · · monoklonální protilátky specifické pro protein HSP72 nereagují s proteinem HSP70 (DnaK) C. trachomatis, který vykazuje 56 % shodu aminokyselin s aminokyselinovou sekvencí proteinu HSP72. Vysoká homologie aminokyselinové sekvence se pozorovala mezi proteiny HSP72 a HSP70 (DnaK), které pochází z gram-pozitivních bakteriálních druhů. Opět žádná monoklonální protilátka specifická pro protein HSP72 nereagovala s gram-pozitivními druhy bakterií S.aureaus nebo Bacillus, které vykazují 74 % a 76 % homologii aminokyselinové sekvence, respektive s HSP72. Na základě těchto dat je jasné, že ačkoli proteiny HSP70 (DnaK) mohou být strukturálně příbuzné s HSP72

K izolátům, protilátkou imunologicky odlišné, j ednou patří , j sou které reagují nejméně s a nejsou pneumokoky, faecalis, S.mutans a S.sanguis. bakterie patří k rodu Streptococcus nebo rodu monoklonální

S.pyogenes,

Enterococcus

Všechny tyto

Enterococcus, který je příbuzný rodu Streptococcus. V bakteriích rodu

Streptococcus a Enterococcus se nenašel ani protein HSP70 ani strukturní gen. Tato pozorování indikují, že hypervariabilní sekvence aminokyselin nebo zbytků v proteinech HSP70 (DnaK) se podílejí na imunogenitě. Je zajímavé, že imunoblotovací analýza ukázala, že neexistuje podstatný rozdíl v molekulové hmotnosti proteinů HSP70 (DnaK) u izolátů S.pneumoniae a u imunoreaktivních izolátů, které nejsou pneumokoky.

Tabulka č. 3: REAKTIVITA MONOKLONÁLNÍCH PROTILÁTEK S IZOLÁTY, KTERÉ NEJSOU PNEUMOKOKY, TESTOVANÁ WESTERNOVÝM IMUNOBLOTOVÁNÍM

	Bakteriální kmen		MAb
Označení	Rod/druh	Typ	Fl- Pn3.1	F2Pn3.2	F2Pn3.3	F2- Pn3.4

C-2	Streptococcus pyogenes	s.	A	-	+	-	+/-a
C-3	Streptococcus agalactiae	s.	B
C-7	Enterococcus faecalis	s.	D		+		—
C-9	Streptococcus bovis	s.	D	-	-		-
C-14	Streptococcus mutans			-	+	-	+/-
C-15	Streptococcus salivaris			-	-	-	-
C-19	Streptococcus sanguis	I		+	+	-	-
C-20	Streptococcus sanguis	I		+	+		+
C-21	Streptococcus sanguis	I		+	+	+	+
C-22	Streptococcus sanguis	II		+	+	+	+
C-23	Streptococcus sanguis	II		+	+	—	—
C-24	Streptococcus sanguis	II		+	+	+	+
C-25	Streptococcus sanguis	II		+	+	+	+
C-27	Gemella morbillorum			-	—	-	-
C-30	Staphylococcus			-	-	-	-
	aureus
C-33	Bacillus			-		-	-
C-36	Escherichia coli			-	-	-	-
C-37	Chlamydia trachomatis15	L2				-

+/- označuje slabý signál ve srovnání s reaktivitou pozorovanou u antigenů bakterií S.pneumoniae ^b v případě C.trachomatis se testovaly čištěné elementární látky

Příklad 5: Izolace HSP72 a jeho použití jako imunogenu za účelem ochrany proti letální infekci bakteriemi

S.pneumoniae

ΙΛ

A. Postupy

1.Příprava a izolace rekombinantního proteinu HSP72 a C-169

Vysoké hladiny exprese genu HSP72 se dosáhlo použitím systému bakteriofágové T7 RNA polymerázy/T7 promotor v bakteriích E.coli. Obě orientace HindlII fragmentu o velikosti 3,2kb se klonovaly před T7 promotor Φ10 do plazmidů pT7-5. Výsledný plazmid pJBDk51 se pak vnesl do kmene BL21(DE3) bakterií E.coli. Nadměrná exprese rekombinantního proteinu HSP72 (HSP72_rec) se indukovala kultivací v půdě, která je doplněná antibiotiky, po dobu tří hodin po přidání IPTG v množství, aby konečná koncentrace byla lmM. E.coli exprimující vysoké koncentrace HSP72_rec se centrifugací ko^rcentrovaly a lyžovaly se mírnou sonikací v lyzačním pufru 50mM Tris-HCl (pH8,0), lmM EDTA a lOOmM NaCl, který obsahuje 0,2mg/ml lysozymu. Buněčný lyzát se centrifugoval při 12 OOOg po dobu 15 minut a shromáždily se supernatanty. Protein HSP72_rec se izoloval na základě imunoafinity za použití monoklonálních protilátek Fl-Pn3.1, které jsou imobilizovány na zrnech sefarózy 4B (Pharmacia). Čistota eluátu se určila na SDS-PAGE.

Rekombinantní protein C-169 (C-169_rec) se exprimoval v bakteriích E.coli kmen JM109, které jsou transformované plazmidem pJBDÁl, ve formě nerozpustných inkluzních tělísek. Protein inkluzních tělísek se získal z peletu bakteriálních buněk rozrušených sonikací způsobem, jež se popisuje v předchozím textu. Pelety se promyly lyzačním pufrem, který obsahuje lmg/ml deoxycholátu, za účelem odstranit kontaminující materiál a uvedený protein se pak rozpustil v 6M močovině. Roztok proteinu se centrifugoval při 100 OOOg a vyčeřený supernatant se dialyzoval proti fyziologickému roztoku, který je pufrovaný fosforečnanem. Po izolaci se Bio63 «» 99 »» *-* • · · · · · · ··· • · · 9 9 · · ·-····

9.99 ··· ·· ·· ·♦·· ·· ···· ·· ··

Rad proteinovým testem (Bio-Rad Laboratories, Mississauga, Ontario, Kanada) stanovil obsah proteinu.

2. Aktivní imunoprotektivní studie

Dvě skupiny po 10 samičkách myší Balb/c (Charles River Laboratories) se třikrát imunizovaly podkožně ve dvoutýdenních intervalech s objemem 0,1 ml čištěných antigenů HSP72_rec nebo C169_rec absorbovaných na alhydrogelovém adjuvans. Testovaly se dvě dávky antigenu, přibližně 1 a 5 gg. Třetí skupina deseti kontrolních myší se imunizovala stejným způsobem se samotným alhydrogelovým adjuVans. Před každou imunizací a pět až sedm dní po třetí injekci se z očnicové dutiny odebíraly vzorky krve. U myší se pak vyvolala reakce přibližně s 10⁶ jednotek tvořících kolonie bakterií S. pneumoniae typ 3 kmen WU2. Vzorky inokula takto upravených bakterií S. pneumoniae se nanesly na plotny s čokoládovým agarem za účelem určit jednotky tvořící kolonie a ověřit dávku vhodnou pro vyvolání reakce. Úmrtí se zaznamenávalo v prvních 3 až 4 dnech po infekci v šestihodinových intervalech a pak ve 24hodinových intervalech v období 14 dnú. Čtrnáctý nebo patnáctý den se myši, které přežily, usmrtily a v krevních vzorcích se testovala přítomnost organismů S. pneumoniae. Protilátkové odezvy na antigeny rekombinantního proteinu HSP72 se popisují v příkladu 7.

3. Pasivní imunoprotektivní studie

Jeden králík NZW (Charles River Laboratories) se podkožně imunizoval na několika místech přibližně 50 gg čištěného proteinu C-169_rec, který je absorbovaný na alhydrogelovém adjuvans. Aplikace injekcí se opakovala třikrát ve dvou týdenních intervalech se stejným antigenem. Po 7 a 14 dnech po poslední imunizaci se odebraly vzorky

krve. Vzorky séra se spojily a izolovaly se protilátky precipitací za použití 40 % saturovaného síranu amonného.

Přísně kombinovaným imunodeficientním myším SCID se intraperitonálně aplikovala injekce s 0,25ml izolovaných králičích protilátek. Jednu hodinu po této injekci se myši inokulovaly s 5 000 nebo 880 jednotkami tvořícími kolonie bakterií S.pneumoniae typ 3 kmen WU2. Kontrolní myši SCID se inokulovaly sterilním pufrem nebo protilátkami, které se izolovaly z neimunních králičích sér. Vzorky inokula bakterií S.pneumoniae, které se použily pro vyvolání odezvy, se nanesly na plotny s čokoládovým agarem za účelem určit jednotky tvořící kolonie a potvrdit dávku pro vyvolání odezvy. Důvodem proč byly vybrány myši SCID je jejich vysoká náchylnost k infekci bakteriemi S.pneumoniae. Vzorky krve (20μ1) získané 24 hodin po inokulaci myší se nanesly na čokoládový agar a testovala se přítomnost organizmů S.pneumoniae. Hladina detekce byla 50 jednotek tvořících kolonie/ml. Úmrtí se zaznamenávalo ve 24 hodinových intervalech po dobu 5 dnů.

B. Výsledky

Schopnost klonovaných inzertů DNA bakterií S.pneumoniae, které kódují celý nebo část proteinu HSP72 (C-169), exprimovat rekombinantní proteiny v bakteriích E.coli umožňují získat proteiny, které jsou použitelné pro zkoumání potenciálu vakcinace proteinem HSP72. Proteiny HSP72_rec a C169_rec se získaly v relativně čisté formě. Na SDS polyakrylových gelech (obrázek č. 14 a 15) barvených Coomassieovou modří se nezjistily žádné kontaminanty.

Za účelem zhodnotit potenciál vakcinace HSP72 se nejdříve testovala schopnost proteinu HSP72_rec vyvolat ochrannou imunní odezvu. Skupiny deseti myší se imunizovaly proteinem HSP72_rec v plné délce (dávka je 1 μg nebo 5 μg) a • · inokulovaly se s 4,2 miliony jednotek tvořících kolonie bakterií S.pneumoniae typ 3 kmen WU2. 80% myší, které se imunizovaly lgg proteinu HSP72_rec, přežily inokulaci stejně tak bylo u 50% myší imunizovaných 5μg proteinu HSP72_rec. Žádná z myší poprvé použitá v experimentu, které se imunizovaly pouze se samotným alhydrogelovým adjuvans bez antigenu, nepřežila inokulaci (obrázek č. 16) . V žádném z krevních vzorků odebraném 14. nebo 15. den z myší, které přežily inokulaci, se nezjistila přítomnost organizmů S.pneumoniae. Pozorování, že protein HSP72_rec vyvolává ochranu proti pneumokokům typu 3 kmen WU2 ukazuje, že protein HSP72 odvozený z DNA izolované z kmene typu 6 obsahuje epitopy schopné vyvolat ochranu proti heterolognímu kmenu s odlišným kapsulárním typem.

Dále se testovala imunní odezva na protein HSP72 za použití fragmentů rekombinantního proteinu exprimovaného v bakteriích E.coli, které se transformovaly chimérickým genem fucI-HSP72. Myši imunizované čištěným C-169_rec vykazovaly ochranu proti fatální inokulaci pneumokoky. To ukazuje, že některé, ne-li všechny, epitopy vyvolávající ochranu se nacházejí v oblasti C-konce molekuly proteinu HSP72, který obsahuje posledních 169 zbytků. Skupiny deseti myší se imunizovaly s C-169 (dávka je 1 μg nebo 5 μg) a inokulovaly se 6 miliony jednotek tvořících kolonie bakterií S.pneumoniae typ 3 kmen WU2. 60% myší imunizovaných 1 μg C-169_rec přežilo inokulaci stejně jako 70% myší imunizovaných 5 μg C-169_rec (obrázek č. 17). O proti tomu, všechny myši poprvé použité v experimentu zemřely dva dny po inokulaci. Oblast C-konce HSP72 bakterií S.pneumoniae, která zahrnuje oblast maxima divergence mezi proteiny DnaK, je cíl ochranné imunní odezvy.

Jak se uvádí v tabulce č. 4 uvedené dále v textu, dva nezávislé experimenty naznačují, že myši SCID, do kterých se • · · · pasivně přenesly králičí anti-C-169 protilátky, vykazují ochranu proti fatální infekci bakteriemi S.pneumoniae kmene WU2. Naproti tomu žádná z 15 kontrolních myší nepřežila. Kontrolním myším se aplikovaly protilátky z neimunního králičího séra nebo samotný sterilní pufr. Všechny myši z kontrolních skupin měly 24 hodin po inokulaci pozitivní hernokulturu, zatímco u imunizovaných myší se organizmy S.pneumoniae stanovily pouze u dvou z celkového počtu deseti myší.

Tabulka Č. 4: PASIVNÍ IMUNIZAČNÍ STUDIE VYKAZUJÍCÍ OCHRANU

SCID MYŠÍ PROTI EXPERIMENTÁLNÍ INFEKCI

S.PNEUMONIAE POMOCÍ ANTI-C-169 KRÁLIČÍCH

PROTILÁTEK

Experiment	Obsah injekce	Počet myší, které přežily inokulaci po 5 dnech	Počet myší s prokázanou přítomností S.pneumoniae
1	sterilní pufr	0/5	5/5
	anti-C-169rec	4/5	2/5
	kontrolní protilátky	0/5	5/5
2	sterilní pufr	0/5	5/5
	anti-C-169rec	5/5	0/5

V experimentu 1 a 2 (tabulka č. 4) se myši inokulovaly 5 000 a 880 jednotkami tvořícíirí kolonie bakterií S. pneumoniae typ 3 kmen WU2. Výsledky v tabulce č. 4 se uvádějí jako počet myší, které přežily inokulaci nebo které vykazují přítomnost bakterií S.pneumoniae, ku celkovému počtu myší ve skupině.

Demonstrace anti-HSP72 specifity protilátky vyvolané imunizací s rekombinantním proteinem HSP72 nebo C-169 vychází ___________— ---- * · · · ··- · ·

........ II 4 f y^gg^ , .·-- _y » _w· g• · · ·· · ···· «••4········· ··· · · · ··· a· ···· ·· ···· ·· ·· z analýzy westernovým přenosem, kde se jako antigenů používají buněčné lyzáty bakterii S.pneumoniae. Všechna testovaná králičí a myší antiséra detekovala jeden pruh odpovídající proteinu HSP72. Tyto serologické výsledky naznačují ochranu, která vzniká po imunizaci rekombinantními proteiny a je způsobená produkcí protilátek reaktivních s proteinem HSP72 bakterií S.pneumoniae.

Příklad 6: Teplem indukovaný expresivní systém vhodný pro vysokou produkci C-151 terminální oblasti proteinu HSP72

A. Konstrukce plazmidu pURV3, který obsahuje C-151 terminální oblast kódující HSP72 bakterií S.pneumoniae.

Oblast DNA kódující 151 aminokyselin karboxylového konce proteinu HSP72 bakterií S.pneumoniae se začlenila do translačního vektoru p629 po směru transkripce promotoru λ PL (H.J.George et al., Bio/Technology 5, pp. 600-6003 (1987)).

Tento vektor obsahuje kazetu bakteriofágového λ cI857 represorového genu citlivého na teplotu, z kterého se odstranil funkční promotor P_R. Inaktivace represoru cI857 zvýšením teploty z rozmezí 30 až 37°C na 37 až 42°C vede k indukci genu řízeného λ PL. Indukce exprese genu v buňkách E.coii teplotním skokem je výhodné použít při fermentaci ve velkém měřítku, protože v moderních fermentorech lze teplotního skoku jednoduše dosáhnout. Rozumí se, že zatímco pro tento experiment se zvolily bakterie E.coii, jiné hostitelské organizmy, jako jsou kvasinky, spadají do rozsahu tohoto vynálezu.

Fragment s 477 nukleotidy, který zahrnuje v genu HSP72 bakterií S.pneumoniae oblast 457 baží mezi 2050 až 2506 (SEQ

ID č.: 4), se amplifikoval polymerázovou řetězovou reakcí * 9 *-• · · · ---*-*—— (PCR). Jako templát sloužila genomová DNA bakterií S. pneumoniae typ 6 kmen 64 a použily se oligonukleotidové primery OCRR26 (5'-GGCAGATCTATGAAGGCCAAAGACCTTGGAAC) - a OCRR27 (5'CGCGGATCCTTACTTTTCCGTAAACTCTCCGT). Chromozomální DNA se připravila z 90ml kultury exponenciálně rostoucích buněk bakterií S. pneumoniae v půdě obsahující vývar srdce podle metody Jayarao et al. (J.Clin.Microbiol., 29, pp. 2774-2778 (1991)). Za použití DNA termálního cykleru (Perkin Elmer, San Jose, CA) se provedly amplifikační reakce DNA. Startovací kodón ATG v primeru OCR26 se nachází v rámci proti směru transkripce právě před kódující oblastí pro oblast N-konce C-151. Primery OCRR26 a OCRR27 obsahují místa, která rozeznávají restrikční endonukleázy BglII (AGATCT), resp. BamHI (GGATCC), což se využívá pro klonování produktu PCR do zmíněných defosforylovaných míst vektoru p629. Produkt PCR se izoloval z agarozových gelů způsobem, který se zakládá na zmrazení ve fenolu (S.A.Benson, Biotechniques 2, pp. 67-68 (1984)), a dále se štěpil restrikčnímy enzymy BglII a BamHI. BglII-BamHI fragment, který obsahuje 471 párů baží, se pak ligoval do defosforylovaných restrikčních míst vektoru p629, které rozeznávají restriktázy BglII a BamHI. Částečná mapa výsledného plazmidu pURV3 je na obrázku č. 18. Tento plazmid se vnesl způsobem podle Simanis (Hanahan,D. In D.M.Glover (ed.), DNA Cloning, pp. 109-135, (1985)) do bakterií E. coli kmene XLI Blue MRF(Δ(mcrA)183 Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endAl supE44 thi-1 recAl gyrA96 relAl lac [F' proAB lacFzAMlS TnlO (Tet^r)] ^c) , který se získal od firmy Stratagene, La Jolla, CA. Transformanti rostoucí při teplotě 37°C se testovali imunoblotem jednotlivých kolonií (J.Sambrook et al. (citace uvedena shora)) za použití monoklonálních protilátek Fl-Pn3.1 reaktivních s proteinem C-169_rec. Z vybraných transformantů se izoloval plazmid DNA a inzert DNA se sekvenoval PCR za použití soupravy Taq Dye Deoxy Terminátor Cycle Sequencing kit od Applied Biosystems τ

• · · ·

lne. (ΑΒΙ) a elektroforéza DNA se uskutečnila na automatizovaném sekvenátoru DNA 373A (ABI). Nukleotidové sekvence inzertu zcela odpovídá nukleotidové sekvenci C-151 kódující oblasti genu HSP72. (SEQ ID č. 25 a korespondující aminokyselinová sekvence v SEQ ID č. 26) . Plazmid se vnesl elektroforeticky do bakterií E.coli kmene W3110 (ATCC 27325) za účelem produkce C-151_rec·

B. Exprese C-151_rec a příprava antigenu

Rekombinantní C-151_rec s methioninovým zbytkem na jeho Nkonci se syntetizoval v bakteriích E.coli kmene W3110, které nesou plazmid pURV3. Buňky bakterii E.coli se kultivují v LB půdě obsahující ampicilin o koncentraci ΙΟΟμς při teplotě 37°C až do okamžiku, kdy A₆₀₀ dosáhne hodnoty 0,6. Buňky se pak kultivují při teplotě 40°C po dobu 18 hodin za účelem indukovat produkci proteinu C-151_rec. Příprava semi-čištěného proteinu C-151_rec proběhla následujícími způsoby. Bakteriální buňky se shromáždily centrifugací a výsledný pelet se promyl a resuspendoval se ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosforečnanem. Přidal se lysozym a buňky se inkubovaly po dobu 15 minut na ledu. Pak se buňky otevřely pulzní sonikací. Buněčný lyzát se vyčeřil centrifugací a supernatanty se shromáždily a provedla se separace za použití ultrafiltračního zařízení Amicon (míchané buňky serie 8 000, Amicon Canada Ltd. Oakville, Ontario). Shromáždil se ultrafiltrát, který nezadržela membrána YM30, analyzoval se na SDS-PAGE a obarvil se Coomassieovou modří R-250. Koncentrace proteinů se odhadly srovnáním intenzity barvy proteinu C-151_rec a intenzity barvy inhibitoru sojového trypsinu o známé koncentraci.

—99——e·----·γ · · · · · · * i 4 ^τ¥ 4 ΙΙ ^Τ· · 4 4· • « · · · ····· • · 9 9 9 · 9 9 99 9 99

9 9 9 9 9 9 99

9999 99 9999 ····

ΊΟ

C. Reaktivita monoklonálních protilátek proti C-151_rec

Reaktivita 10 monoklonálních protilátek s C-151_rec vybraných z hlediska jejich reaktivity s proteinem HSP72 bakterií S.pneumoniae se testovala westernovým přenosem za použití ultrafiltrátů YM30 připraveným shora popsaným způsobem. Monoklonální protilátky zahrnují sérii šesti monoklonálních protilátek vytvořených proti proteinu HSP72_rec (F3-Pn3.5 až F3-Pn3.10) a monoklonálních protilátek Fl-Pn3.1, F2-Pn3.2, F2-Pn3.3, F2-Pn3.4. Tři monoklonální protilátky FlPn3.1, F2-Pn3.3 a F2-Pn3.4, které jsou reaktivní s C-169_rec, také rozeznávají fragment C-151_rec. Všechny další monoklonální protilátky jsou reaktivní pouze s HSP72_rec, což ukazuje, že mohou být určeny proti epitopům přítomný v oblasti N-konce proteinu HSP72.

Příklad 7: Protilátková odezva Balb/c myší a opic Maca_caFascicularis (cynomolgus) na rekombinantní antigeny HSP72.

A. Postupy

1. Imunizace zvířat

Skupiny deseti samiček myší Balb/c se imunizovaly podkožně buď HSP72_rec nebo C-169_rec, jak se popisuje v Příkladu 5. Za účelem získat protilátkovou odezvu na C-151_rec se skupina šesti myší třikrát imunizovala v intervalu dvou týdnů s 0,5μg C-151_rec absorbovaném na alhydrogelovém adjuvans aplikací intraperitonální injekce. Čtyři až sedm dní po třetí imunizaci se testovala přítomnost protilátek reaktivních s bakteriemi S.pneumoniae v sérech získaných z krevních vzorků odebraných před každou imunizací, testem ELISA za použití destiček potažených buně čnými extrakty buněk bakterií S.pneumoniae.

• · ^ττ4 ·· · · · · ♦ · ♦ ··· · ·····« · ♦ · ·· ···· ·· ···· ·· ··

Samice opic cynomolgus se intramuskulárně imunizovaly v den 1, 22 a 77 s 0,5ml, které obsahují 15(^g čištěných antigenů HSP72_rec nebo C-169_rec absorbovaných na alhydrogelovém adjuvans. Vzorky krve se odebíraly pravidelně před a po každé imunizaci a testovala se přítomnost protilátek reaktivních s antigenem proteinu HSP72 bakterií S.pneumoniae pomocí analýzy westernovým přenosem.

Specifita vzniklých protilátek proti proteinu HSP72 bakterií S.pneumoniae se potvrdila analýzou westernovým přenosem za použití buněčných extraktů bakterií S.pneumoniae a izolovaných rekombinantních antigenů.

B. Výsledky

Výsledky popsané v Příkladu 5 jasně ukazují ochranou povahu protilátky, která vznikla následující imunizací s rekombinantními antigeny HSP72. Během imunizace se monitoroval výskyt sérové protilátkové odezvy u myší (obrázek č. 19, 20 a 21) au opic (obrázek č. 22). Oba živočišné druhy vykazují silnou odezvu na celý a zkrácený rekombinantní protein HSP72, které se použily jako imunogeny. Po třetí injekci průměrný titr protilátek byl 1:64 000. Detailní analýza jednotlivých sér ukazuje, že každé zvíře odpovědělo na imunizaci vývojem protilátek reaktivních s proteinem HSP72 bakterií S.pneumoniae.

U myší imunizovaných s C-169_rec, dvě testované dávky 1 a 5gg byly podobně účinné, indukovaly podobné titry protilátek (obrázek č. 20) . Silná odezva se pozorovala po aplikaci druhé injekce s C-169_rec. Ke zvýšení titru protilátek však nedošlo po aplikaci třetí injekce. Na rozdíl od tohoto pozorování imunní odezva na protein HSP72_rec nebyla závislá na dávce. Zvýšení titru specifických protilátek se pozorovalo po aplikaci druhé a třetí injekce, která obsahovala buď protein HSP72_rec nebo C-151_rec (obrázek č. 19 a 21) .

---- · »* *»- **** .**.1**1 —_β φ Φ Φ φ φ φ Φ Φ φ φW • · · « · · 9 ' · · · 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 / Ζ <····· ··.···· 9 9 9 9

Studie imunní odezvy u opic jasně ukazuje, že imunogenita rekombinantních antigenů HSP72 není omezena pouze na hlodavce, jako jsou králík nebo myš. Humorální odezva následující po aplikaci druhé injekce s libovolným antigenem se charakterizuje silným vzrůstem titrů protilátky specifické pro protein HSP72, který může přetrvávat několik týdnů, aniž dojde k jejich detekovatelnému snížení (obrázek č. 22). Navíc se v sérech každé opice, po aplikaci jedné injekce s rekombinantními antigeny, detekovaly specifické sérové protilátky.

Příklad 8: Mapování epitopu B-buňky stresového proteinu HSP72.

Příklad 3 ukazuje, že podstatná variabilita primární sekvence proteinů HSP70 se hlavně nachází ve dvou oblastech odpovídajících aminokyselinovým zbytkům 244 až 330 a 510 až 607 proteinu HSP72 bakterií S.pneumoniae. Tyto variabilní oblasti mohou obsahovat epitopy B-buňky, které odpovídají za antigenní heterogenitu, o níž se píše v Příkladu 4. Za účelem zjistit tuto možnost se testovala reaktivita polyklonálních a monoklonálních protilátek proteinu HSP72 bakterií S. pneumoniae proti 14 peptidům vybraným tak, aby pokryly většinu těchto oblastí.

A. Postupy

Syntetizovalo se 14 peptidů obsahujících 14 až 30 aminokyselinových zbytků. Sekvence peptidů a jejich umístění v proteinu se uvádí v tabulce č. 5. Za použití automatizovaného peptidového syntetizátoru v instituci Biochem Immunosystem lne. (Montreal, Kanada) se syntetizovaly peptidy CS870, CS873,

CS874, CS875, CS876, CS877, CS878, CS879, CS880 a CS882.

Peptidy MAP1, MAP2, MAP3 a MAP4 se syntetizovaly na rozvětveném lysinovém řetězci jako peptidy s mnohočetnou antigenitou (MAP; Multiple Antigenic Peptides) v instituci ·· · · • · ···· ·· ···· • ·

Service de Séquence de Peptides de 1'Est du Québec, Centre de recherche du CHUL (Sainte-Foy, Kanada). Peptidy se čistily vysokotlakou kapalnou chromatografií s obrácenými fázemi. Peptidy se rozpustily v destilované vodě, výjimkou jsou peptidy CS874 a CS876, které se rozpustily v malém objemu buď 6M guanidin-HCl nebo dimethylsulfoxidu a pak se upravila jejich koncentrace přidáním destilované vody na výslednou hodnotu 1 mg/ml.

Test ELISA peptidu proběhla tak, že mikrotitrační destičky Immunolon 4 (Dynatech Laboratories, Inc., Chantilly, VA) se potáhly syntetickými peptidy v koncentraci 50gg/ml podle postupu, který popisuje J.Hamel et al. (citace uvedená shora). Za účelem potvrdit reaktivitu monoklonálních protilátek s peptidy se stanovila schopnost peptidů ve fluidní fázi inhibovat navázání monoklonálních protilátek na pevný protein HSP72. Za účelem provedení inhibičního testu se povlékly mikrotitrační destičky extrakty buněčných stěn bakterií S. pneumoniae. Supernatanty kultury hybridomu obsahující monoklonální protilátky specifické pro protein HSP72 se kultivovaly přes noc při teplotě 4°C s několika koncentracemi peptidu. Kontrolní supernatant a supernatant s peptidem se testoval testem ELISA, jak se popisuje ve shora uvedeném textu.

Imunní séra pocházela ze zvířat třikrát imunizovaných s rekombinantními antigeny proteinu HSP72. Jeden králík se imunizoval 37,5 μ9 čištěného proteinu HSP72_rec podle imunizačního protokolu, který se popisuje v příkladu 5. Spojila se myší séra ze tří myší Balb/c imunizovaných proteinem HSP72_rec z příkladu 5 a dále se spojila séra skupin po dvou opicích imunizovaných buď proteinem HSP72_rec nebo C-169_rec.

·· · · φφ φφφφ • φ

Tabulka č. 5: SEKVENCE A POLOHA SYNTETICKÝCH PEPTIDŮ

ODPOVÍDAJÍCÍM AMINOKYSELINVÝM ZBYTKŮM PROTEINU

HSP72 S.PNEUMONIAE

Peptid	Poloha	Sekvence	SEQ ID č.
CS876	247-261	TSTQISLPFITAGEA	7
CS877	257-271	TAGEAGPLHLEMTLT	8
CS878	268-281	MTLTRAKFDDLTRD	9
CS879	276-290	DDLTRDLVERTKVPV	10
CS880	286-299	TKVPVRQALSDAGL	11
CS882	315-333	RIPAWEAVKAETGKEPNK	23
CS873	457-471	KAKDLGTQKEQTIVI	12
CS874	467-481	QTIVIQSNSGLTDEE	24
CS875	477-491	LTDEIDRMMKDAEA	13
MAP1	487-510	KDAEANAE S DKKRKEEVDLRNEVD	14
CS870	507-521	NEVDQAIFATEKTIK	15
MAP 2	517-544	EKTIKETEGKGFDAERDAAQAALDDLKK	16
MAP3	544-573	KAQEDNNLDDMKAKLEALNEKAQGLAVK LY	Γ7
MAP 4	583-607	QE GAE GAQATGNAGDDWDGE FTE	18

B. Identifikace a lokalizace lineárních epitopů B-buňky Výsledky na obrázku č. 23 ukazuji, že většina imunologické reaktivity se pozorovala u peptidů lokalizovaných v oblasti aminokyselinových zbytků 457 a? 607, které odpovídají fragmentu C-151 proteinu HSP72. Králičí, myší a opičí sérové protilátky pocházející ze zvířat, které se imunizovaly buď rekombinantním HSP72_rec nebo C-169_rec, jsou • · · ··· · · · · ♦ · ·· *··· ·· ···· ·· ·· reaktivní jak s peptidem MAP2 tak i s peptidem MAP4. Je zajímavé, že v sekvenci peptidů ΜΆΡ2 a ΜΆΡ4 chybí hypervariabilní oblast C-konce obsahující sekvence GFDAERDAAQAALDD (zbytky 527 až 541) a AEGAQATGNAGDDW (zbytky 586 až 600), které se nacházejí pouze v proteinu HSP72 bakterií S.pneumoniae, což je založeno na porovnání sekvencí proteinu HSP70, jenž jsou dostupné v datové bance. Naše data ukazují, že obě peptidové sekvence obsahují lineární epitopy B-buňky. Navíc samotný peptid MAP4 byl také rozeznán monoklonálními protilátkami Fl-Pn3.1. Tato reaktivita se potvrdila inhibičním testem ve fluidní fázi, kde 10μς/ιη1 proteinu MAP4 způsobilo úplnou inhibici vazby monoklonálních protilátek Fl-Pn3.1 s proteinem HSP72. Také polyklonální antiséra, pocházející ze zvířat imunizovaných celým rekombinantním proteinem HSP72, rozeznaly epitopy B-buňky, které se nacházejí na peptidech CS875, MAP1 a MAP3. Všechna tato data dohromady ukazují, že hypervariabilní terminální fragment C-151 proteinu HSP72 stimuluje odezvy B-buňky a možná tvoří imunodominantní oblast proteinu HSP72. Chybějící reaktivita monoklonálních protilátek F2-Pn3.3 a F2-Pn3.4 se syntetickými peptidy naznačuje, že reagují s konformačními determinanty, které se nacházejí v oblasti C-konce proteinu HSP72. Příklad 5 naznačuje, že ochranné epitopy se nachází v oblasti C-151. Skutečnost, že myši imunizované čištěným C169_rec jsou chráněny před fatální infekci virulentním kmenem bakterií S.pneumoniae, naznačuje, že fragmenty C-konce C-169 a C-151 bakterií proteinu HSP72 S.pneumoniae nebo dokonce i jeho menší fragmenty jsou velmi dobře použitelné pro vývoj budoucí vakcíny.

Variabilní oblast obsažená v oblasti aminokyselinových zbytků 244 až 330 také tvoří antigenní doménu. Lineární epitopy, které se nacházejí na překrývajících se peptidech

CS877 (aminokyseliny 257 až 271) a CS878 (aminokyseliny 268 • · · φ · · · · ···· ·.

φφφ · φ · · φ φ φφ φφφφ φφ φφφφ φφ φφ až 281), peptidech CS880 (aminokyseliny 286 až 299) a peptidech CS882 (aminokyseliny 315 až 333), se identifikovaly hyperimunnimi séry.

Příklad 9: HSP70 (DnaK) pocházející z bakterií Streptococcus pyogenes a Streptococcus agalactiae: Molekulární klonování a sekvenování genů hsp70; analýza nukleotidové a proteinové sekvence; antigenní vztah k S.pneumoniae; zvýšená syntéza proteinu HSP70 bakterií Streptococcus agalactiae jako odezva na teplotu.

A. Postupy

1. Bakteriální kmeny a plazmidové vektory

Kmeny bakterií Streptococcus pyogenes (Streptococcus skupiny A) a Streptococcus agalactiae (Streptococcus skupiny Β), které se používájí v této studii, se získaly z Laboratoire de la Santé Publique du Québec (LSPQ), SainteAnne de Bellevue, Québec, i4anada. S. agalactiae typ II kmen V8 odpovídá ATCC kmen 12973. S. pyogenes kmen Bruno odpovídá ATCC kmen 19615. E.coli kmen XLI Blue MRF'se získal od firmy Stratagene.

Streptokokové kmeny se kultivovaly při teplotě 37°C v inkubátoru s atmosférou 5 % CO2. Bakterie streptokoků se nanesly na plotny s tryptovaným sojovým agarem, který obsahuje 5 % ovčí krev (Les Laboratoires Quélab, Montréal, kanada) . Kapalné kultury se připravily v půdě se srdcovým vývarem (Difco Laboratories, Detroit, MI) bez agitace. Kmen bakterií E.coli se kultivoval při teplotě 37°C v L půdě za agitace při 250 ot./min. nebo na L agaru.

Od firmy StratagenK se získal obecný klónovací fágemid pBluescript KS(-).

• · · · • ·

2. Způsoby rekombinace DNA

Restrikční enzymy, T4 DNA ligáza a telecí intestinálni fosfatáza se používaly podle doporučení výrobce (Pharmacia (canada) lne., Baie ď Urfe, Kanada; and New England Biolabs Ltd., Mississauga, kanada). Příprava plazmidů centrifugací v gradientech CsCl-etidium bromid, elektroforéza fragmentů DNA na agarózovém gelu, Sothernova hybridizace, hybridizace DNA kolonii se provedly podle publikace autora J.Sambrook et al. (citace uvedena shora). Chromozomálni DNA streptokoků se připravila za použití postupu podle B.M. Jayarao et al. (J.Clin. Microbiol., 29, pp. 2774-2778 (1991)), která se upravila pro bakteriální kultury o objemu 90 ml. Rychlá izolace plazmidů se provedla podle způsobu publikovaného v

D.Ish-Horowicz et al. (Nucl.Acids Res. 9, pp. 2989-2998 (1981)). Plazmidy používané při sekvenování DNA se čistily za použití soupravy od firmy Qiagen lne. (Chatsworth, CA). Fragmenty DNA se čistily z agarózového gelu způsobem založeným na zmrazení ve fenolu (S.A.Benson, Biotechniques 2, pp. 67-68 (1984)). Sondy DNA se značily ³²P-dCTP nebo digoxigeninem (DIG)-11-dUTP za použití soupravy pro značení pomocí náhodných primerů (random primer labeling) od firmy Boehringer Manheim (Laval, anada). Transformace plazmidů se provedla způsobem podle Simanis (Hanahan,D. In D.M.Glover (ed.), DNA Cloning, pp. 109-135, (1985)). Sekvenování genomové DNA začleněných do plazmidů se provedlo za použití syntetických oligonukleotidů. Sekvenační reakce proběhla jako polymerázová řetězová reakce (PCR) za použití soupravy Taq Dye Deoxy Terminátor Cycle sequencing kit (ABI) a elektroforéza se uskutečnila na automatizovaném sekvenátoru DNA 373A (ABI). Sestavení sekvence DNA se uskutečnilo za použití programu Sequencher 3.0 od firmy Gene Codes Corporation (Ann Arbor, MI) . Analýza sekvencí DNA a z nich předpovězených polypeptidů proběhla na základě programu Gene • · • · · · ' • · · ·

Work verze 2.45 od firmy Intelligenetics, lne. (Mountain

View, CA). Amplifikačni reakce DNA se uskutečnily na zařízení

DNA Thermal Cycler 480, Perkin Elmer. Oligonukleotidy se

syntetizovaly na (ABI).	oligonukleotidovém	syntetizéru	model 394
3. Molekulární	klonování genů	hsp70/dnak	bakterií
S. agalactiae a	S.pyogenes.
Chromozomální DNA z bakterií S.	agalactiae a	S.pyogenes

se zcela štěpily různými restrikčními enzymy, které rozeznávají palindromické hexanukleotidové sekvence. Vzniklé fragmenty se analyzovaly Southernovou hybridizací za použití sond, které představují značené DNA amplifikáty pomocí PCR a které odpovídají oblasti 782 párů baží, jež začíná bází 332 po směru transkripce od ATG iniciačního kodonu genu HSP72 bakterií S.pneumoniae (SEQ ID č.4). Tato oblast DNA se vybrala z důvodu, že je mezi geny hsp70 gram-pozitivních charakterizovaných bakterií dobře konzervativní. Genomová DNA bakterií S.pneumoniae se amplifikovala PCR za použití oligonukleotidů OCRR2 (5'-AAGCTGTTATCACAGTTCCGG) a OCRR3 (5'GATACCAAGTGACAATGGCG). Hybridizující genomové restrikční fragmenty, jejichž velikost je dostatečná, aby mohly kódovat 70kDa velký polypeptid (>l,8kb), se částečně čistily z agarózového gelu extrakcí genomových fragmentů, které odpovídají velikostí. Southernovou hybridizací za použití značené 782bp velké DNA sondy z bakterií S.pneumoniae se potvrdilo, že mezi izolovanými genomovými restrikčními fragmenty je přítomen gen hsp70.

Izolované restrikční fragmenty genomové DNA se klonovaly do defosforylovaných kompatibilních restrikčních míst vektoru pBluescript KS(-) a vnesly se do bakterií E.coli kmene XLI

Blue MRF'. Kolonie se testovaly DNA hybridizací za použití značené DNA sondy bakterií S.pneumoniae o velikosti 782bp. Z • · · • · ····.·· ··· · · • · · ··· ··· »· ···· ·· ···· ·· ·· důvodu odhadnutí velikosti inzertů a potvrzení přítomnosti genu hsp70 Southernovou hybridizací za použití sondy značené DNA bakterií S.pneumoniae o velikosti 782pb se extrahované plazmidy štěpily různými rčstri kčními enzymy. Plazmid pURV5 obsahuje 4,2kb velký HindlII inzert genomové DNA bakterií S.agalactiae. Plazmid pURV4 obsahuje 3,5kb velký HindlII fragment genomové DNA bakterií S.pyogenes.

4. Teplotní šok a značení proteinu

Stresová odezva bakterií S.agalactiae na teplotní šok se testovala pulzním značením s [³⁵S]methioninem, jak se popisuje v Příkladu 1. Bakterie S.agalactiae se kultivují přes noc v médiu SMAM (médium pro methioninový test doplněné methioninem o koncentraci lmg/ml, 1% (o/o) Isovitalex a lmg/ml chloridu o i ing) . Bakterie po centrifugaci vytvořily pelet a pak se resuspendovaly v SMAM médiu bez methioninu. Bakterie se inkubovaly při teplotě 37°C po dobu 1 hodiny a pak se rozdělily do frakcí o stejném objemu. Vzorky se inkubovaly buď při teplotě 37°C nebo 43°C po dobu 10 minut a pak se značily 100gCi/ml [³⁵S]methioninu po dobu 30 minut při teplotě 37°C. Bakterie se promyly PBS a buněčné extrakty se připravily aplikací mutanolysinu a lysozymu, jak se popisuje v publikaci M.Jayarao et al. (citace uvedena shora), pak následuje sonikace.

5. Imunologická charakterizace

V sérii šesti monoklonálních protilátek vzniklých proti proteinu HSP72_rec (F3-Pn3.5 až F3-Pn3.10) a u monoklonálních protilátek Fl-Pn3.1, F2-Pn3.2, F2-Pn3.3, F2-Pn3.4 se testovala jejich reaktivita s antigeny HSP70 z bakterií S.pyogenes a S.agalactiae analýzou westernovým přenosem. Buněčné lyzáty z bakterií S .pyogenes a S.agalactiae se získaly aplikaci mutanolysinu a lysozymu (M. Jayarao et al., • * · φ · • Φ φ ·· φ φ φ φ φ φ φ φ ,φ φ φ · · φφφ · · φφφ φφφ φφφ •Φ φφφφ φφ φφφφ φ* φφ citace uvedena shora), sonikaci a povařenim ve vzorkovém pufru pro SDS-PAGE. Buněčné lyzáty z bakterii E.coli transformované buď plazmidy pURV4 nebo pURV6 produkující antigeny zkráceného proteinu HSP70 bakterií S.pyogenes se testovaly po povaření ve vzorkovém pufru pro SDS-PAGE.

B. DNA analýza sekvence genů hsp70/dnak bakterií

Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae a Streptococcus pneumoniae.

Sekvenovala se oblast 2 438 baží ve 4,2kb velkém HindlII inzertu plazmidu pURV5. Tato sekvence obsahuje otevřený čtecí rámec (ORF) o 1830 nukleotidech, který kóduje polypeptid obsahující 609 aminokyselin s molekulovou hmotností 64907 (SEQ ID č. 7). Startovací kodon ORF ATG začíná v poloze 248 a terminační kodon TAA končí v poloze 2077. Startovacímu kodonu ATG předchází sekvence GAGG, která začíná v poloze 237 a která je komplementární s 16SrRNA a u bakterií E.coli slouží jako vazebné místo pro ribozom (G.D.Stormo et al., Nucleic Acids Res. 10, pp. 2971-2996 (1982)). ORF a polypeptid HSP70 bakterií S. agalactiae jsou identické z 85% a 95% s ORF a polypeptidem bakterií S. pneumoniae.

Dřívější porovnání sekvence s proteinem HSP72 bakterií S. pneumoniae ukazuje, že 3,5kb velký HindlII inzert v plazmidu pURV4 nemá kódující oblast 3'-konce hsp70 bakterií S.pyogenes. Pokus o klonování 3kb velkého Sáli genomového fragmentu, který obsahuje celou kódovací oblast hsp70 bakterií S.pyogenes, vede ke vzniku plazmidu pURV6, který obsahuje 3,lkb velký inzert bez 5'-konce kódující oblasti genu. Seřazení sekvence oblastí genu hsp70 přítomných v plazmidech pURV4 a pURV6 dalo oblast 2183 nukleotidů obsahující ORF 1824 baží kódující polypeptid o 608 aminokyselinách s molekulovou vahou 64847 (SEQ ID č. 20). Startovací kodon ATG začíná v poloze 204 a terminační kodon • '» • · · · · • · · · • · · ·· ····

TAA dosahuje do pozice 2030. Podobně jako u hsp70 bakterii S.agalactiae startovacímu kodonu ATG předchází putativni sekvence GAGG vazebného místa pro ribozom, která začíná v poloze 193 (G.D.Stormo, citace uvedena shora). ORF a dedukovaný polypeptid hsp70 bakterií S.pyogenes jsou z 85 a 94% identické s ORF a polypeptidem HSP72 bakterií S. pneumoniae. ORF plazmidu pURV4 nemá 125 párů baží kódující 41 aminokyselin karboxylového konce proteinu HSP70 bakterií S .pyogenes; ORF kóduje 567 aminokyselin N-konce zmíněného HSP70 (N-567_rec) . ORF plazmidu pURV6 chybí 114 párů baží kódující 38 aminokyselin na N-konci HSP70 bakterií S. pyogenes; ORF kóduje 570 aminokyselin C-konce HSP70 (C57 0_rec) .

Celkové srovnání DNA otevřených čtecích rámců (obrázek č. 24) a aminokyselinových sekvencí (obrázek č. 25) HSP70/DnaK bakterií S.pyogenes, S. pneumoniae a S.agalactiae dá procento identity, což je 82% respektive 93%.

C. Zvýšená syntéza HSP70 bakteriemi S.agalactiae jako odezva na zvýšenou teplotu

Elektroforetická analýza buněčných extraktů kontrolních bakterií S.agalactiae a bakterií S.agalactiae vystavených teplotnímu šoku provedená na dvoudimenzionálním SDSpolyakrylamidovém gelu, přičemž bakterie byly pulzně značené [³⁵S]methioninem, ukázala, že syntéza 70kDA velkého proteinu se podstatně zvýšila po teplotním stresu (obrázek č. 26, dráha 1 a 2). Radioimunoprecipitační analýza ukázala, že teplem indukovatelný 70kDa velký protein se jednoduše detekuje při teplotě 43°C za použití monoklonálních protilátek F2-Pn3.4. Tato skutečnost ukazuje, že protein patří do rodiny proteinů 70 teplotního šoku (hsp70/DnaK) (obrázek č. 26, dráha 3 a 4).

-·· · · · · · · · · • · · ·· · · · ···· · oo ··· ··· ···* οχ. ·· ···· ·· ···· ·· ··

D. Antigenní příbuznost proteinů HSP70 u bakterií S.

pneumoniae, S. pyogenes a S. agalactiae

V této studii se použila řada monoklonálních protilátek za účelem zjistit antigenní příbuznost HSP70 proteinů bakterií S. pyogenes, S. agalactiae a S. pneumoniae. Osm z deseti monoklonálních protilátek reagovalo se všemi třemi druhy Streptococcus, což ukazuje, že epitopy pro některé B-buňky jsou mezi S. pneumoniae, S. pyogenes a S. agalactiae rozsáhle rozděleny. Monoklonální protilátka Fl-Pn3.1, která je zaměřena proti epitopu, jenž se nachází mezi aminokyselinovými zbytky 584 a 607 HSP72 získaného z bakterií S. pneumoniae, nereagovala s antigeny HSP70 ani z S. pyogenes ani z S.agalactiaea. Srovnání této oblasti mezi třemi druhy bakterií Streptococcus ukázalo rozdíly u 5 až 8 aminokyselin, které se nachází mezi aminokyselinami 589 a 596. Monoklonální protilátka F2-Pn3.3, která je také zaměřena proti epitopům přítomným v oblasti C151, byla reaktivní s bakteriemi S. agalactiae, ale ne s bakteriemi S. pyogenes. Tato data jasně ukazují, že proteiny HSP70 pocházející z bakterií druhů Streptococcus jsou strukturálně a imunologicky příbuzné. Existuje zde však imunologická rozdílnost.

Analýza reaktivity monoklonálních protilátek F3-Pn3.5, F3Pn3.6, F3-Pn3.7 a F3-Pn3.10 s antigeny zkráceného rekombinantního proteinu HSP70 bakterií S. pyogenes umožnila identifikaci antigenní oblasti blízko N-konce proteinu HSP72 bakterií S. pneumoniae. Tyto monoklonální protilátky reagovaly s konstrukty, které exprimují 567 aminokyselinových zbytků Nkonce, ale nereagují s konstrukty exprimujícími fragment C-570. Tato data lokalizují epitopy rozeznatelné monoklonálními protilátkami F3-Pn3.5, F3-Pn3.6, F3-Pn3.7 a F3-Pn3.10 mezi zbytky 1 a38 proteinu HSP72.

Příklad 10: Použití HSP70/HSP72 jako lidské vakcíny • ·

Za účelem vytvořit vakcínu pro použití na lidech je možno příslušné antigeny HSP72 vybrat ze zde popsaných polypeptidů. Odborník by například mohl navrhnout vakcínu s polypeptidem HSP70/HSP72 nebo jeho fragmentem, který obsahuje imunogenní epitop. Pro přípravu v podstatě čistých rekombinantích antigenů je zvláště vhodné použití způsobů molekulární biologie.

Vakcínová kompozice se může vyskytovat v různých formách. Jsou to například pevné, semi-pevné a kapalné dávkové formy, jako jsou prášek, kapalné roztoky nebo suspenze a liposomy. Na základě našeho přesvědčení, že antigeny HSP70/HSP72 podle vynálezu mohou po aplikaci vyvolat u lidí ochrannou imunitní odezvu, kompozice podle vynálezu budou podobné těm, které se používají při imunizaci lidí jinými proteiny a polypeptidy, například toxiny tetanu a difterie. Kompozice podle vynálezu proto s výhodou obsahují farmaceuticky přijatelné adjuvans, jako je neúplné Freundovo adjuvans, hydroxid hlinitý, muramylpeptid, emulze vody v oleji, liposomy, ISCOM nebo CTB nebo netoxickou B subjednotku cholerového toxinu. Nejvýhodnější je kompozice, která obsahuje jako adjuvans emulzi voda v oleji nebo hydroxid hlinitý.

Kompozice se aplikuje pacientovi libovolnou farmaceuticky přijatelnou formou, což znamená intramuskulárně, intradermálně, podkožně nebo povrchově. Upřednostňuje se intramuskulární aplikace vakcíny.

Obecně lze říci, že dávka na jednoho pacienta zahrnuje počáteční injekci, kde je 0,01 až 10 mg adjuvans a 0,1 až 1 mg antigenu HSP72. Po této injekci může následovat jedna nebo více posilovačích injekcí. Tyto injekce se výhodně aplikují okolo jednoho až šesti měsíců po počáteční injekci.

Důležitá úvaha vztahující se k vývoji pneumokokové vakcíny je otázka mukózní imunity. Ideální mukózní vakcína se může bez nebezpečí aplikovat orálně nebo intranasálně v jedné nebo více • · · dávkách. Tyto vakcíny vyvolávají příslušném povrchu současně se systémovou imunitou. Kompozice mukózní vakcíny mohou zahrnovat adjuvans, inertní částicové • · · · · · • · · · · · · • · · · • · · · ·· ·· ochranné protilátky na nosiče nebo rekombinantní živé vektory.

Anti-HSP72 protilátky podle vynálezu pasivní imunoterapii a imunoprofylaxi bakteriemi S.pyogenes,

S.agalactiae a jsou použitelné při lidí infikovaných S .pneumoniae nebo příbuznými bakteriemi.

Forma dávek a režim takové pasivní imunizace je podobný případům jiné pasivní imunoterapie.

Příkladem protilátky podle vynálezu je hybridom produkuj ící monoklonální protilátka Fl-Pn3.1, která byla uložena v instituci Američan Type Culture Collection v Rockville,

Maryland, USA

21. července 1995 a je identifikována jako linie buněk myšího hybridomu, Fl-Pn3.1 a je uložena pod přírůstkovým číslem

HB 11960.

• · • ·

Seznam sekvencí

Informace o sekvenci SEQ ID č. 1:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 3167 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: dvouřetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: DNA (genomová) (iii) hypotetická: není (iv) anti-sense: není (vi) původní zdroj: Streptococcus pneumoniae (ix) rys:

(A) jméno/klíč: CDS (B) poloha: 30..755 (ix) rys:

(A) jméno/klíč: CDS (B) poloha: 771..2912 (C) další informace: /produkt=Fuc/HSP72 (C-169) (xi) znázornění sekvence: SEQ ID č.:l

GAACTTCATT ITTAGMASG AGTCXGTTT ATG TCT CAA

GAT GAA AAA TTA ATT

53

Met 1

Ser

Gin

Asp Glu 5

Lys Leu Ile

CGT

GAA

CAG

ATT

TCT

GAT

GTT

TCT

CAT

AAG

ATC

TCG

CAA

CTT

GGT

TCG

101

Arg

Glu 10

Gin

Ile

cys

Asp

Val 15

cys

His

Lys

Met

Trp 20

Gin

Leu

Gly

Trp

GTT

GCT

GCT

AAC

GAT

GGG

AAT

GTA

TCT

GTT

CGA

TTA

GAT

GAG

GAT

ACC

149

Val 25

Ala

Ala

Asn

Asp

Gly 30

Asn

Val

Ser

Val

Arg 35

Leu

Asp

Glu

Asp

Thr 40

ATT

CTT

GCA

ACA

CCT

ACT

GGT

ATC

AGC

AAA

AGT

TTT

ATT

AČA

CCA

GAA

197

Ile

Leu

Ala

Thr

Pro 45

Thr

Gly

Ile

Ser

Lys 50

Ser

Phe

Ile

Thr

Pro 55

Glu

AAG

CTG

GTG

AAG

TTA

AAT

CTT

AAA

GGA

GAG

ATT

TTA

GAA

GCA

GAA

GGT

245

Lys

Leu

Val

Lys 60

Leu

Asn

Leu

Lys

Gly £5

Glu

Ile

Leu

Glu

Ala 70

Glu

Gly

GAT

TAC

TCT

CCT

TCT

AGT

GAA

ATT

ΛΛΛ

ATC

CAC

ATT

CGG

TCC

TAC

GAA

293

Asp

Tyr

cys 75

Pro

Ser

Ser

Glu

Ile 80

Lys

Met

His

Ile

Arg 85

Cys

Tyr

Glu

GAA

CGT

GAG

GAT

GTT

CGT

TCA

GTT

GTT

CAC

GCG

CAT

CCA

CCG

ATT

GCA

341

Glu

Arg 90

Glu

Asp

Val

Arg

Ser 95

Val

Val

His

Ala

His 100

Pro

Pro

Ile

Ala

ACA

GGA

TTT

GCT

CTT

GCA

CAC

ATT

CCT

TTA

GAT

ACT

TAT

TCA

CTA

ATT

38?

Thr 105

Gly

Phe

Ala

Leu

Ala 110

His

Ile

Pro

Leu

Asp 115

Thr

Tyr

ser

Leu

Ile 120

	' U4.......		—iTF
♦	•	9 9	9		9	•	•	•	•	•
•	•	9	9		9		•	9	•		• ·
•	•	9	9 9		9	•		9 9 9	•	•	•
•	•	9	•		•	•			•	•	•
• ·		9 99 9		• 9		9 99	•	9 9			• ·

GAG AGC GCG ATT

GTG GTT GGG GCA

ATT CCT ATT ACC CCA TTT GGA GTA Ile Pro Ile Thr Pro Phe Gly Val

437

Glu Ser

Ala Ile

Val 125

Val

Gly

Ala

130

13 S

CCG

TCT

ACA

ATG

GAA

GTG

CCA

GAA

GCA

ATT

ACA

CCT

TAT

CTG

ccc

GAT

485

Pro

Ser

Thr

Met 140

Glu

Val

Pro

Glu

Ala US

Ile

Thr

Pro

Tyr

Leu 150

Pro

Asp

CAT

GAT

GTC

ATG

CTA

TTA

GAA

AAT

CAT

GGA

GCT

CTG

ACT

GTC

GGA

AGC

533

His

Asp

Val 155

Met

Leu

Leu

Glu

Asn 160

His

Gly

Ala

Leu

Thr 165

Val

Gly

Ser

GAT

GTC

ATT

ACA

GCA

TAC

TAC

CGT

ATG

GAA

ACT

TTA

GAA

TTA

GTC

GCA

581

Asp

Val 170

Ile

Thr

Ala

Tyr

Tyr 175

Arg

Met

Glu

Thr

Leu 180

Glu

Leu

Val

Ala

AAG

ACA

ACC

TTC

CAC

GGA

AGA

ATG

TTA

CTT

TCT

ACA

AAG

GGC

ATT

GAG

629

Lys 185

•ru-

mr

Phe

His

Gly Arg 190

Met

Leu

Leu

Ser 195

Thr

Lys

Gly

Ile

Glu 200

GAG

čka

GAA

ATT

GCT

CGT

CCG

ACT

TTA

GAA

CGT

CTA

TTC

TCA

ATG

CGA

677

Glu

Gin

Glu

Ile

Ala 205

Arg

Pro

Thr

Leu

Glu 210

Arg

Leu

Phe

Ser

Met 215

Arg

GAA

AAT

TAT

AAG

GTT

ACA

GGT

CGT

CAC

CCA

GGC

TAC

CGT

AAA

TAT

AAT

725

Glu

Asn

Tyr

Lys 220

Val

Thr

Gly

Arg

His 225

Pro

Gly

lyr

Arg

Lys 230

Tyr

Asn

GGC Gly	GAT GGT	AGT ATA AAA GAA	ACA AAA AAA TAAGAGGAAA GTATT ATS ATC	776
Asp	Gly 235	Ser	Ile	Lys Glu	Thr 240	Lys Lys	Met Ile 1
CAA	CAT	CCA	CGT	ATT	GGG ATT	CGT	CCG ACT ATT GAT GGT	CGT CGT CAA	824
Gin	His	Pro	Arg	Ile	Gly Ile	Arg	Pro Thr Ile Asp Gly	Arg Arg Gin
		5				10	15
GGT	GTA	CGC	GAA	TCA	CTT GAA	GTA	CAA ACA ATG AAC ATG	GCT AAA AGT	872
Gly	Val	Arg	Glu	Ser	Leu Glu	Val	Gin Thr Met Asn Het	Ala Lys Ser
	20				25		30
GTG	GCA	GAT	TTG	ATT	TCA AGC	ACA	TTG AAA TAT CCA GAT	GGG GAA CCT	920
Val	Ala	Asp	Leu	Ile	Ser Ser	Thr	Leu Lys Tyr Pro Asp	Gly Glu Pro
35					40		45	50
GTG	GAA	TGT	GTG	ATT	TCT CCA	TCT	ACC ATT GGT CGT GTT	CCA GAG GCT	968
Val	Glu	cys	Val	Ile	Ser Pro	Ser	Thr Ile Gly Arg Val	Pro Glu Ala
				55			60	65
GCA	GCT	TCC	CAT	GAG	TTG TTT	AAA	AAA TCA AAT GTT TGC	GCA ACA ATT	1016
Ala	Ala	Ser	His	G1U	Leu Phe	Lys	Lys Ser Asn Val Cys	Ala Thr Ile
			70				75	80
ACA	GTT	ACA	CCA	TGC	TGG TGT	TAT	GGT AGT GAA ACT ATG	GAT ATG TCT	1064
Thr	Val	Thr	Pro	cys	Trp Cys	Tyr	Gly Ser Glu Thr Met	Asp Met Ser
		85				90	95
CCA	GAT	ATT	CCT	CAT	GCT ATT	TGG	GGA TTT AAT GGG ACA	GAA CGC CCA	1112
Pro	Asp	Ile	Pro	His	Ala Ile	Trp	Gly Phe Asn Gly Thr	Glu Arg Pro
	100				105		110
GGA	GCT	GTC	TAT	CTT	GCA GCT	GTA	CTA GCT TCA CAT ACT	CAA AAA GGG	1160
Gly	Ala	Val	Tyr	Leu	Ala Ala	Val	Leu Ala Ser His Thr	Gin Lys Gly
115					120		125	130
ATT	CCA	GCC	TTT	GGG	ATT TAT	GGT	AGA GAT GTT CAG GAA	GCT AAT GAT	1208
Ile	Pro	Ala	Phe	Gly	Ile Tyr	Gly	Arg Asp Val Gin Glu	Ala Asn Asp
				135			140	145

ACA Thr

GCT Ala

ATT Ile

CCA Pro 150

GAA Glu

GAT Asp

GTC Val

XAA Lys

GAA Glu 155

AAA Lys

CTT Leu

TTA Leu

CGT Arg

TAT Tyr 160

GCG Ala

CGG Arg

1256

GCA Ala

GTT Val

CTT Leu 165

GCA Ala

ACT Thr

GGC Gly

TTG Leu

ATG Met 170

AGA Arg

GAC Asp

ACT Thr

GCT Ala

TAC Tyr .175

CTA Leu

TCA Ser

ATG Met

1304

GGT Gly

AGT Ser 180

GTT Val

TCG Ser

ATG Hec

GGG Gly

ATT Ile 185

GGT Gly

GGT Gly

tct Ser

ATT Ile

GTA Val 190

AAT Asn

CCA Pro

GAT Asp

TTC Phe

1352

TTC Phe 195

CAA Gin

GAA Glu

TAC Tyr

TTA Leu

GGA Gly 200

ATG Met

CGA Arg

AAT Asn

GAA Glu

TCG Ser 205

GTA Val

GAT Asp

ATG Het

ACG Thr

GAG G1U 210

1400

TTC Phe

ACG Thr

CGC Arg

CGT Arg

ATG Met 215

GAC Asp

CGT Arg

GGT Gly

ATT Ile

TAC Tyr 220

GAC Asp

CCT Pro

GAA Glu

GAG Olu

TTC Phe 225

GAA G1U

1448

CGT Arg

GCG Ala

CTC Leu

AAA Lys 23 0

TCG Trp

GTG Val

AAA Lys

GAA Glu

AAC Asn 235

GTA Val

AAA Lys

GAA Glu

GGA Gly

TTC Phe 240

GAC Asp

CAT Bis

1496

AAC Asn

CGT Arg

GAA Glu 245

GAC Asp

CTT Leu

GTT Val

TTA Leu

AGC Ser 2S0

CGT Arg

GAA Glu

GAA Glu

AAA Lys

GAT AGA Asp Arg 2S5

CAA Gin

TCG Trp

1544

GAA TTT

GTT ATT AAG ATG

TTC ATG ATT GGA CGT GAC TTA ATG GTT GGT

1592

Glu

Phe 260

Val Ile

Lys

Met

Phe 265

Met

Ile Gly

Arg Asp 27 0

Leu

Met

Val Gly

AAC

CCA

AGA

CTT

GCT

GAA

CTT

GGT

TTT

GAG

GAA

GAA

GCA

GTT

GGT

CAC

1640

Asn

Pro

Arg

Leu

Ala

Glu

Leu

Gly

Phe

G1U

Glu

Glu

Ala

Val

Gly

His

27S

280

285

290

CAT

GCT

TTA

GTA

GCT

GGT

TTC

CAA

GGT

CAA

CGT

CAG

TGG

ACA

GAC

CAT

1688

His

Ala

Leu

Val

Ala

Gly

Phe

Gin

Gly

Gin

Arg

Gin

Trp

Thr

Asp

His

295

300

305

TTT

CCA

AAT

GGG

GAC

TTT

ATG

GAA

ACT

TTC

CTC

AAT

ACT

CAG

TTT

GAC

1736

Phe

Pro

Asn

Gly

Asp

Phe

Met

Glu

Thr

Phe

Leu

Asn

Thr

Gin

íhe

Asp

310

315

320

TGG

AAT

GGT

ATT

CGA

AAA

CCA

TTT

GTA

TTT

GCG

ACA

GAG

AAT

GAT

TCA

- 1784

Trp

Asn

Gly

Ile

Arg

Lys

Pro

Phe

Val

Phe

Ala

Thr

Glu

Asn

Asp

Ser

325

330

335

CTA

AAT

GGT

GTG

TCT

ATG

CTC

TTT

AAT

TAT

CTA

TTA

ACA

AAT

ACT

CCA

1832

Leu

Asn

Gly

Val

Ser

Met

Leu

Phe

Asn

Tyr

Leu

Leu

Thr

Asn

Thr

Pro

340

345

350

CAA

ATC

ttt

GCT

GAT

GTG

CGT

ACT

TAT

TGG

AGT

CCA

GAG

GCT

GTT

GAA

1880

Gin

Ile

Phe

Ala

Asp

Val

Arg

Thr

Tyr

Trp

Ser

Pro

G1U

Ala

Val

Glu

355

360

365

370

CGT GTA ACA GGA TAT

ACT TTA GAG GGT CGT GCT GCA GCT GGA TTC TTA

1928

Arg

Val Thr

Gly Tyr 375

Thr

Leu

Glu

Gly Arg Ala Ala Ala Gly Phe Leu

380

385

CAT

CTA

ATC

AAC

TCT

GGA

TCT

TGT

ACA

TTG

GAT

GGT

ACA

GGT

CAA

GCT

1976

Bis

Leu

Ile

Asn

Ser

Gly

Ser

cys

Thr

Leu

Asp

Gly

Thr

Gly

Gin Ala

390

395

400

ACT

CGA

GAT

GGC

AAA

CCT

GTT

ATG

AAA

CCA

TTC

TCG

GAG

TTG

GAT

GAA

2024

Thr

Arg

Asp

Gly

Lys

Pro

Val

Met

Lys

Pro

Phe

Trp

Glu

Leu

Asp

Glu

405

410

415

AGT GAA GTA

CAG GCT ATG

CTT GAA AAT ACA GAC TTC CCA CCA GCA AAC

2072

Ser Glu 420

Val

Gin Ala

Met

Leu 425

Glu Asn

Thr

Asp

Phe Pro 430

Pro

Ala Asn

CGC

GAA

TAC

TTC

CGT

GGA

GGA

GGA

TTC

TCA

ACT

CGT

TTC

TTG

ACG

AAG

2120

Arg

Glu

Tyr

Phe

Arg

Gly

Gly

Gly

Phe

Ser

Thr

Arg

Phe

Leu

Thr

Lys

435

440

445

450

GGG

GAT

ATG

CCA

GTA

ACA

ATG

GTA

CGT

CTC

AAT

CTT

TTA

AAA

GGG

GTT

2168

Gly

Asp

Met

Pro

Val

Thr

Met

Val

Arg

Leu

Asn

Leu

Leu

Lys

Gly

Val

455

460

465

GGT

CCA

GTG

CTA

CAA

ATT

GCA

GAA

GGT

TAC

ACA

CTT

GAA

CTT

CCT

GAA

2216

Gly

Pro

Val

Leu

Gin

Ile

Ala

Glu

Gly

Tyr

Thr

Leu

Glu

Leu

Pro

Glu

470

47S

480

GAT

GTT

CAC

CAT

ACT

TTA

GAT

AAT

CGT

ACA

GAT

CCA

GGA

TGG

CCA

ACT

2264

Asp

Val

His

His

Thr

Leu

Asp

Asn

Arg

Thr

Asp

Pro

Cly

ΤΓΡ

Pro

Thr

485

490

495

ACT

TGG

TTT

GCT

CCA

CGT

TTG

ACA

GGA

AAA

GGT

GCT

TTC

AAG

TCT

GTC

2312

Hu-

Trp

Phe

Ala

Pro

Arg

Leu

Thr

Gly

Lys

Gly

Ala

Phe

Lys

Ser

Val

soo

505

510

tat

GAC

GTC

ATG

AAT

AAT

TGG

GGA

GCT

AAT

CAC

GGA

GCC

ATA

ACA

TAT

2360

iyr

Asp

Val

Met

Asn

Asn

Trp

Gly

Ala

Asn

His

Gly

Ala

Ile

Thr

Tyr

515 520 525 530

GGA CAC ATT GGA

GCA GAC TTG ATT ACC TTG GCT TCT

ATG TTG

AGA Arg 545

ATT Ile

2408

Gly

His

Ile Gly

Ala 535

Asp

Leu

Ile

Thr Leu Ala 540

Ser

Met

Leu

CCT

CAA

ATC

GAA

GTA

ACA

TTT

GAC

ATC

GAC

AAG

AAC

GGT

ATC

GTG

TCT

2456

Pro

Gin

Ile

Glu 550

Val

Thr

Phe

Asp

Ile 555

Asp

Lys

Asn

Gly

Ile 560

Val

Ser

GTT

AAG

GCC

AAA

GAC

CTT

GGA

ACT

CAA

AAA

GAA

CAA

ACT

ATT

GTC

ATC

2504

Val

Lys

Ala 565

Lys

Asp

Leu

Gly

Thr 570

Gin

Lys

Glu

Gin

Thr 575

Ile

Val

Ile

CAA

TCG

AAC

TCA

GGT

TTG

ACT

GAC

GAA

GAA

ATC

GAC

CGC

ATG

ATG

AAA

2552

Gin

Ser 580

Asn

Ser

Gly

Leu

Thr 585

Asp

Glu

Glu

Ile

Asp 59 0

Arg

Met

Met

Lys

GAT

GCA

GAA

GCA

AAC

GCT

GAA

TCC

GAT

AAG

AAA

CGT

AAA

GAA

GAA

GTA

2600

Asp 595

Ala

G1U

Ala

Asn

Ala 600

Glu

Ser

Asp

Lys

Lys 605

Arg

Lys

Glu

Glu

Val 610

GAC

CTT

CGT

AAT

GAA

GTG

GAC

CAA

GCA

ATC

TTT

GCG

ACT

GAA

AAG

ACA

2648

Asp

Leu

Arg

Asn

Glu 615

Val

Asp

Gin

Ala

Ile 620

Phe

Ala

Thr

Glu

Lys 625

Thr

ATC

AAG

GAA

ACT

GAA

GGT

AAA

GGC

TTC

GAC

GCA

GAA

CGT

GAC

GCT

GCC

2696

Ile

Lys

Glu

Thr 630

Glu

Gly

Lys

Gly

Phe 635

Asp

Ala

Glu

Arg

Asp 640

Ala

Ala

CAA

GCT

GCC

CTT

GAT

GAC

CTT

AAG

AAA

GCT

CAA

GAA

GAC

AAC

AAC

TTG

2744

Gin

Ala

Ala 645

Leu

Asp

Asp

Leu

Lys 650

Lys

Ala

Gin

Glu

Asp 655

Asn

Asn

Leu

GAC

GAC

ATG

AAA

GCA

AAA

CTT

GAA

GCA

TTG

AAC

GAA

AAA

GCT

CAA

GGA

2792

Asp

Asp 660

Met

Lys

Ala

Lys

Leu 665

Glu

Ala

Leu

Asn

Glu 670

Lys

Ala

Gin

Gly

CTT

GCT

GTT

AAA

CTC

TAC

GAA

CAA

GCC

GCA

GCA

GCG

CAA

CAA

GCT

CAA

2840

Leu 67 5

Ala

Val

Lys

Leu

Tyr 680

Glu

Gin

Ala

Ala

Ala 685

Ala

Gin

Gin

Ala

Gin 690

GAA GGA GCA GAA GGC GCA CAA CCA

Glu Gly Al· Glu Gly Ala Gin Ala «95

ACA GGA AAC GCA GGC GAT GAC GTC

Thr Gly Asn Ala Gly Asp Asp Val 700 705

GTA GAC GGA GAG ΤΓΤ ACG GAA AAG TAAGATGAGT GTMT3GATG AAGAGTATCT Val Asp Gly Glu Phe Thr Glu Lys

710 aaaaaataca cgaaaagttt ataatgattt aaaagatttt attgataata ttccaataga agctgagcat gatagttctg tcaaaaatga ATTGTTGTCT GCATTTGTAT CGGCGATGGT

TTGTAATCAA GCTGATAACT ATAGAACATC ATATTTAGCT AGATATAGAG AAATTATATT TGAAGCGGTA AGGAATTTTO TTACCTCAGT ATCAGCTATG ATATC

2888

2942

3002

3062

3122

3167

Informace o sekvenci SEQ Π) č. 2 /i/ charakteristika sekvence:

/A/ délka:24-2 aminokyselin /B/ typ: aminokyselina /0/ topologie: lineární /ii/ typ molekuly: protein /xi/ znázornění sekvence SEQ Π) č. 2

Met 1

Ser

Gin

Asp

Glu 5

Lys

Leu

Ile Arg

Glu 10

Gin

Ile

cys

Asp

Val 15

cys

His

Lys

Met

Trp 20

Gin

Leu

Gly

Trp

Val 25

Ala

Ala

Asn

Asp

Gly 30

Asn

Val

Ser

Val

Arg 35

Leu

Asp

Glu

Asp

Thr 40

Ile

Leu

Ala

Thr

Pro 45

Thr

Gly

Ile

Ser

Lys 50

Ser

Phe

Ile

Thr

Pro 55

Glu

Lys

Leu

Val

Lys 60

Leu

Asn

Leu

Lys

Gly 65

Glu

Ile

Leu

Glu

Ala 70

Glu

Gly Asp

Tyr

Cys 75

Pro

Ser

Ser

Glu

Ile 80

Lys

Met

His

Ile

Arg 85

cys

Tyr

Glu

Glu

Arg 90

Glu

Asp

Val

Arg

Ser 95

Val

Val

His

Ala

His 100

Pro

Pro

Ile

Ua

Thr 105

Gly

Phe

Ala

Leu

Ala 110

His

Ile

Pro

Leu

Asp 115

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ile 120

Glu

Ser

Ala

Ile

Val 125

Val

Gly

Ala

Ile

Pro 130

Ile

Thr

Pro

Phe

Gly 13 5

Val

Pro

Ser

Thr

Met 140

Glu

Val

Pro

Glu

Ala 14S

Ile

Thr

Pro

Tyr

Leu 150

Pro

Asp

His

Asp

Val 155

Met

Leu

Leu

Glu

Asn 160

His

Gly

Ala

Leu

Thr 165

Val

Gly

Ser

Asp

Val 170

Ile

Thr

Ala

Tyr

Tyr 175

Arg

Met

Glu

Ihr

Leu 180

Glu

Leu

Val

Ala

Lys 185

Thr

Thr

Phe

His

Gly 190

Arg

Met

Leu

Leu

Ser 195

Thr

Lys

Gly

Ile

Glu 200

Glu

Gin

Glu

Ile

Ala 205

Arg

Pro

Thr

Leu

Glu 210

Arg

Leu

Phe

Ser

Met 215

Arg

Glu

Asn

Tyr

Lys 220

Val

Thr

Gly

Arg

His

Pro

Gly

Tyr

Arg

Lys

Tyr

Asn

Gly

Asp

Gly

Ser

Ile

Lys

Glu

Thr

225 230 235

Lys Lys • ·

Informace o sekvenci SEQ ID č. 5 /i/ charakteristika sekvence:

/A/ délka: 714 aminokyselin /B/ typ: aminokyselina /0/ topologie: lineární /ii/ typ molekuly: protein /xi/ znázornění sekvence SEQ ID č. 3

Met 1

Ile

Gin

His

Pro 5

Arg

Ile

Gly

Ile

Arg 10

Pro

Thr

Ile

Asp

Gly Arg 15

Arg

Gin

Gly

Val 20

Arg

Glu

Ser

Leu

Glu 25

Val

Gin

Thr

Met

Asn 30

Met

Ala

Lys

Ser

Val 35

Ala

Asp

Leu

Ile

Ser 40

Ser

Thr

Leu

Lys

Tyr 45

Pro

Asp

Gly

Glu

Pro 50

Val

Glu

cys

Val

Ile 55

Ser

Pro

Ser

Thr

Ile 60

Gly Ar?

Val

Pro

Glu 65

Ala

Ala

Ala

Ser

His 70

Glu

Leu

Phe

Lys

Lys 75

Ser

Asn

Val

Cys

Ala 60

Thr

Ile

Thr

Val

Thr 85

Pro

cys

Trp

Cys

Tyr 90

Gly

Ser

Glu

Thr

Met 95

Asp

Met

Ser

Pro

Asp 100

Ile

Pro

His

Ala

Ile 105

Trp

Gly

Phe

Asn

Cly 110

Thr

Glu

Arg

Pro

Gly 115

Ala

Val

Tyr

Leu

Ala 120

Ala

Val

Leu

Ala

Ser 12S

His

Thr

Gin

Lys

Gly 130

Ile

Pro

Ala

Phe

Gly 135

Ile

Tyr

Gly Arg

Asp 140

Val

Gin

Glu

Ala

Asn 145

Asp

Thr

Ala

Ile

Pro 150

Glu

Asp

Val

Lys

Glu 155

Lys

Leu

Leu

Arg

Tyr 160

Ala

Arg

Ala

Val

Leu 165

Ala

Thr

Gly

Leu

Met 170

Arg

Asp

Thr

Ala

Tyr 175

Leu

Ser

Met

Gly

Ser 180

Val

Ser

Met

Gly

Ile 185

Gly

Gly

Ser

Ile

Val 190

Asn

Pro

Asp

Phe

Phe 195

Gin

Glu

Tyr

Leu

Gly 200

Met

Arg

Asn

Glu

Ser 205

Val

Asp

Met

Thr

Glu 210

Phe

Thr

Arg

Arg

Met 215

Asp

Arg

Gly

Ile

Tyr 220

Asp

Pro

Glu

Glu

Phe 225

Glu

Arg

Ala

Leu

Lys 230

Trp

Val

Lys

Glu

Asn 235

Val

Lys

Glu

Gly

Phe 240

Asp

His

Asn

Arg

Glu 245

Asp

Leu

Val

Leu

Ser 250

Arg

Glu

Glu

Lys

Asp Arg 255

Gin

Trp

Glu

Phe 260

Val

Ile

Lys

Met

Phe 265

Met

Ile

Gly

Arg

Asp 270

Leu

Met

Val

Gly

Asn 275

Pro

Arg

Leu

Ala

Glu 280

Leu

Gly

Phe

Glu

Glu 285

Glu

Ala

Val

Gly

Hifi 290

His

Ala

Leu

Val

Ala 295

Gly

Phe

Gin

Gly

Gin 300

Arg

Gin

Trp

Thr

Asp 305

His

Phe

Pro

Asn

Gly Asp 310

Phe

Met

Glu

Thr 315

Phe

Leu

Asn

Thr

Gin 320

Phe Asp Trp Asn Gly Ile Arg Lys Pro Phe Val Phe Ala Thr Glu Asn

325 330 33S • · • ·

Asp Ser

Leu Asn Gly Val 340

Ser Met Leu Phe Asn Tyr Leu Leu Thr Asn

345

3S0

Thr

Pro

Gin 3S5

Ile

Phe

Ala

Asp

Val 360

Arg

Thr

Tyr

Trp

Ser 355

Pro

Glu

Ala

Val

Glu 370

Arg

Val

Thr

Gly

Tyr 375

Thr

Leu

Glu

Gly

Arg 380

Ala

Ala

Ala

Gly

Phe 385

Leu

His

Leu

Ile

Asn 390

Ser

Gly

Ser

cys

Thr 395

Leu

Asp

Gly

Thr

Gly 400

Gin

Ala

Thr

Arg

Asp 405

Gly

Lys

Pro

Val

Met 410

Lys

Pro

Phe

Trp

Glu 415

Leu

Asp

Glu

Ser

Glu

Val

Gin

Ala

Met

Leu

Glu

Asn

Thr

Asp

Phe

Pro

Pro

420

425

430

Ala

Asn

Arg

Glu

Tyr

Phe

Arg

Gly Gly Gly

Phe

Ser

Thr

Arg

Phe

Leu

43 5

440

445

Thr

Lys

Gly

Asp

Met

Pro

Val

Thr

Met

Val

Arg

Leu

Asn

Leu

Leu

Lys

4S0

45S

460

Gly

Val

Gly

Pro

Val

Leu

Gin

Ile

Ala

Glu

Gly

Tyr

Thr

Leu

Glu

Leu

465

470

475

480

Pro

Glu

Asp

Val

His

His

Thr

Leu

Asp

Asn

Arg

Thr

Asp

Pro

Gly

Trp

485

490

49S

Pro

Thr

Thr

Trp

Phe

Ala

Pro

Arg

Leu

Thr

Gly

Lys

Gly

Ala

Phe

Lys

500

SOS

510.

Ser

Val

Tyr

Asp

Val

Met

Asn

Asn

Trp

Gly

Ala

Asn

His

Gly

Ala

Ile

515

520

525

Thr

Tyr

Gly

His

Ile

Gly

Ala

Asp

Leu

Ile

Thr

Leu

Ala

Ser

Met

Leu

530

S3S

540

Arg

Ile

Pro

Gin

Ile

Glu

Val

Thr

Phe

Asp

Ile

Asp

Lys

Asn

Gly

Ile

545

550

555

S60

Val

Ser

Val

Lys

Ala

Lys

Asp

Leu

Gly

Thr

Gin

Lys

Glu

Gin

Thr

Ile

565

570

575

Val

Ile

Gin

Ser

Asn

Ser

Gly

Leu

Thr

Asp

Glu

Glu

Ile

Asp

Arg

Met

S80

ses

590

Met

Lys

Asp

Ala

Glu

Ala

Asn

Ala

Glu

Ser

Asp

Lys

Lys

Arg

Lys

Glu

595

600

605

Glu

Val

Asp

Leu

Arg

Asn

Glu

Val

Asp

Gin

Ala

Ile

Phe

Ala

Thr

Glu

610

615

620

Lys

Thr

Ile

Lys

Glu

Thr

Glu

Gly

Lys

Gly

Phe

Asp

Ala

Glu

Arg

Asp

625

630

635

640

Ala

Ala

Gin

Ala

Ala

Leu

Asp

Asp

Leu

Lys

Lys

Ala

Gin

Glu

Asp

Asn

645

650

6S5

Asn

Leu

Asp

Asp

Met

Lys

Ala

Lys

Leu

Glu

Ala

Leu

Asn

Glu

Lys

Ala

660

66S

670

Gin

Gly

Leu

Ala

Val

Lys

Leu

Tyr

Glu

Gin

Ala

Ala

Ala

Ala

Gin

Gin

675

680

685

Ala

Gin

Glu

Gly

Ala

Glu

Gly

Ala

Gin

Ala

Thr

Gly

Asn

Ala

Gly

Asp

690

695

700

Asp

Val

Val

Asp

Gly

Glu

Phe

Thr

Glu

Lys

705 710

Informace o sekvenci SEQ ID č. 4 /i/ charakteristika sekvence:

/A/ délka: 4520 párů baží /B/ typ: nukleová kyselina /0/ počet řetězců: dvouřetezcová /D/ topologie: lineární /ii/ typ molekuly: DNA /genomová/ /iii/ hypotetická: není /iv/ anti-sense: není /vi/ původní zdroj:

/A/ organizmus: Streptococcus pneumoniae /ix/ I*VS · /Á/jméno/klíč: ODS /B/ poloha: 682..2502 /0/ další informace: produkt= protein 72 teplotního šoku /ix/ rys:

/A/ jméno/klič: ODS /B/ poloha: 5265-.^520 /0/ další informace: produkt= NH2-terminační část

DNA J /ix/ rys:

/A/ jméno/klíč: mat pentid /B/ poloha: 682..2502 /xi/ znázornění sekvence SEO ID č. 4

AAGCTTGATT CACGCTTTGA AAGAAGAAGG	AATTGAAGAA ATCGCAGCAG ATGGCGAATT	60
TGACCATAAC	TACCATATGG	CCATCCAAAC	TCTCCCAGCA	GACGATGAAC	ACCCAGTAGA	120
TACCATCGCC	CAAGTCTTTC	AAAAAGGCTA	CAAACTCCAT	GACCGCATCC	TACGCCCAGC	180
AATGGTAGTG	GTGTATAACT	AAGATACAAA	GCCCGTAAAA	AGCTCGCAGT	AAAAATAGGA	240
GATTGACGAA	GTGTTCGATG	AACACAAGAA	AATCTATCTT	TTTTACTCAG	AGCTTAGGGC	300
GTGTTCGAIT	CGGCAATTCT	GACGGTAGCT	AAAGCAACTC	GTCAGAAAAC	ggcagtcgct	360
ATGGCGTTTG	TCTAGCTTCC	TTACTAACTC	GTCGTCGAAA	TAAAATCGAT	TTCGACTCTT	420
CGTCTCGCAA	TTTXCATAAT	AGAAAACTTG	TCCGAAACGA	CAAIAAACTA	tgaagaaaga	480
TAAAATATGT	TTGGCTTTGT	AATAGTGAGC	GAAGCGAACC	AAAGACGATA	CTCTTCGCTG	540
TGGCGCTATT	TGCGCAAATT	TTGAGACCTT	AGGCTCAAAG	THAGTCAAA	GAGATTGACA	600
AAGTCAAGCT	CTGACGGCGT	CGCCACITAA	GAAGAGTATC	AAAAAGAAAA	ATAGAAAATT	660

711

AACTAACAAG GAGAAAAACA C ATC TCT ΑΑλ ATT ATC GCT ATT GAC TTA GGT Met Ser Lys Ile Ile Gly II. Asp Leu Gly 15 10

ACA ACA Thr Thr

AAC TCA GCA

GTT GCA Val Ala

GTT CTT GAA GGA ACT GAA AfiC AAA ATC

759

Asn

Ser

Ala 15

Val Leu

Glu 20

Gly Thr Glu

Ser

Lys 25

Ile

ATC

GCA

AAC

CCA

GAA

GGA

AAC

CGC

ACA

ACT

CCA

TCT

GTA

GTC

TCA

TTC

807

Ile

Ala

Asn

Pro

G1U

Gly

Asn

Arg

Thr

Thr

Pro

Ser

Val

Val

Ser

Phe

30

35

40

AAA

AAC

GGA

GAA

ATC

ATC

GTT

GGT

GAT

GCT

GCA

AAA

CGT

CAA

GCA

GTT

855

Lys

Asn

Gly

Glu

Ile

Ile

Val

Gly Asp

Ala

Ala

Lys

Arg

Gin

Ala

Val

45

50

55

ACA

AAC

CCA

GAT

ACA

GTT

ATC

TCT

ATC

AAA

TCT

AAG

ATG

GGA

ACT

TCT

903

Thr

Asn

Pro

Asp

Thr

Val

Ile

Ser

Ile

Ly«

Ser

Lys

Met

Gly

Thr

Ser

60

65

70

GAA

AAA

GTT

TCT

GCA

AAT

GGA

AAA

GAA

TAC

ACT

CCA

CAA

GAA

ATC

TCA

951

Glu

Lys

Val

Ser

Ala

Asn

cly

Lys

Glu

Tyr

Thr

Pro

Gin

Glu

Ile

Ser

75

80

85

90

GCT

ATG

ATC

CTT

CAA

TAC

TTG

AAA

GGC

TAC

GCT

GAA

GAC

TAC

CTT

GGT

999

Ala

Met

Ile

Leu

Gin

Tyr

Leu

Lys

Gly

Tyr

Ala

Glu

Asp

Tyr

Leu

Gly

95

100

105

GAG AAA GTA ACC

AAA GCT GTT ATC ACA GTT CCG GCT TAC TTC AAC GAC

1047

Glu

Lys

Val

Thr 110

Lys Ala

Val

Ile Thr Val 115

Pro Ala T/r

Phe 120

Asn Asp

GCT

CAA

CGT

CAA

GCA

ACA

AAA

GAC

GCT

GGT

AAA

ATT

GCT

GGT

CTT

GAA

1095

Ala

Gin

Arg 125

Gin

Ala

Thr

Lys

Asp 130

Ala

Gly

Lys

Ile

Ala 135

Gly

Leu

Glu

GTA

GAA

CGT

ATT

GTT

AAC

GAA

CCA

ACT

GCA

GCA

GCT

CTT

GCT

TAT

GGT

1143

val

Glu 140

Arg

Ile

val

Asn

Glu 145

Pro

Thr

Ala

Ala

Ala 150

Leu

Ala

Tyr

Gly

TTG

GAC

AAG

ACT

GAC

AAA

GAA

GAA

AAA

ATC

TTG

GTA

ΠΤ

GAC

CTT

GGT

1191

Leu 1SS

Asp

Lys

Thr

Asp

Lys 160

Glu

G1U

Lys

Ile

Leu 165

Val

Phe

Asp

Leu

Gly 170

GGT

GGT

ACA

TTC

GAC

GTC

TCT

ATC

CTT

GAA

TTG

GGT

GAC

GGT

GTC

TTC

1239

Gly

Gly

Thr

Phe

Asp 175

Val

Ser

Ile

Leu

Glu 180

Leu

Gly Asp

Gly

Val 185

Phe

GAC

GTA

TTG

TCA

ACT

GCA

GGG

GAC

AAC

AAA

CTT

GGT

GGT

GAC

GAC

TTT

1287

Asp

Val

Leu

Ser 190

Thr

Ala

Gly

Asp

Asn 195

Lys

Leu

Gly

Gly

Asp 200

Asp

Phe

GAC

CAA

AAA

ATC

ATT

GAC

CAC

TTG

GTA

GCA

GAA

TTC

AAG

AAA

GAA

AAC

1335

Asp

Gin

Lys 205

Ile

Ile

Asp

His

Leu 210

Val

Ala

Glu

Phe

Lys 215

Lys

Glu

Asn

GGT

ATC

GAC

TTG

TCT

ACT

GAC

AAG

ATG

GCA

ATG

CAA

CGT

TTG

AAA

GAT

1383

Gly

Ile 220

Asp

Leu

Ser

Thr

Asp 225

Lys

Met

Ala

Met

Gin 230

Arg

Leu

Lys

Asp

GCG

GCT

GAA

AAA

GCG

AAG

AAA

GAC

CTT

TCT

GGT

GTA

ACT

TCA

ACA

CAA

1431

Ala 235

Ala

G1U

Lys

Ala

l&s 240

Lys

Asp

Leu

Ser

Gly 245

Val

Thr

Ser

Thr

Gin 250

ATC

AGC

TTG

CCA

TTT

ATC

ACT

GCA

GGT

GAG

GCT

GGA

CCT

CTT

CAC

TTG

1479

Ile

Ser

Leu

Pro

Phe 255

Ile

Thr

Ala

Gly

Glu 260

Ala

Gly

Pro

Leu

Bis 265

Leu

GAA

ATG

ACT

TTA

ACT

CGT

GCG

AAA

TTT

GAT

GAT

TTG

ACT

CGT

GAC

CTT

1527

Glu

Met

Thr

Leu

Thr

Arg

Ala

Lys

Phe

Asp

Asp

Leu

Thr

Arg

Asp

Leu

270 275 280

GTT GAA CGT ACA AAA GTT

CCA GTT CGT CAA GCC CTT TCA GAT GCA GGT

1575

Val Glu Arg Thr

Lys Val

Pro

Val 290

Arg Gin Ala Leu

Ser Asp Ala Gly 295

285

TTG

AGC

TTG

TCA

GAA

ATC

GAC

GAA

GTT

ATC

CTT

GTT

GGT

GGT

TCA

ACT

1623

Leu

Ser 300

Leu

Ser

Glu

Ile

Asp 30S

Glu

Val

Ile

Leu

Val 310

Gly

Gly

Ser

Thr

CGT

ATC

CCT

GCC

GTT

GTT

GAA

GCT

GTT

AAA

GCT

GAA

ACT

GGT

AAA

GAA

1671

Arg 315

Ile

Pro

Ala

Val

Val 320

Glu

Ala

Val

Lys

Ala 325

Glu

Thr

Gly

Lys

Glu 330

CCA

AAC

AAA

TCA

GTA

AAC

CCT

GAT

GAA

GTA

GTT

GCT

ATG

GGT

GCG

GCT

1719

Pro

Asn

Lys

Ser

Val 335

Asn

Pro

Asp

Glu

Val 340

Val

Ala

Met

Gly

Ala 345

Ala

ATC

CAA

GGT

GGT

GTG

ATT

ACT

GGT

GAT

GTC

AAG

GAT

GTT

GTC

CTT

CTT

1767

11«

Gin

Gly

Gly 350

Val

Ile

Thr

Gly

Asp 355

Val

Lys

Asp

Val

Val 360

Leu

Leu

GAT

GTA

ACG

CCA

TTG

TCA

CTT

GGT

ATC

GAA

ACA

ATG

GGT

GGA

GTA

TTT

1815

Asp

Val

Thr 365

Pro

Leu

Ser

Leu

Gly 370

Ile

Glu

Thr

Met

Gly 375

Gly

Val

Phe

ACA AAA CTT ATC

GAT CGC Asp Arg

AAC ACT ACA ATC CCA ACA

TCT AAA TCA CAA

1863

Thr Lys

Leu

Ile

Asn Thr Thr 385

Ile

Pro Thr 390

Ser Lys

Ser

Gin

380

GTC

TTC

TCA

ACA

GCA

GCA

GAC

•AAC

CAA

CCA

GCC

GTT

GAT

ATC

CAC

GTT

1911

Val 395

Phe

Ser

Thr

Ala

Ala 400

Asp

Asn

Gin

Pro

Ala 405

Val

Asp

Ile

His

Val 410

CTT

CAA

GGT

GAA

CGC

CCA

ATG

GCA

GCA

GAT

AAC

AAG

ACT

CTT

GGA

CGC

1959

Leu

Gin

Gly

Glu

Arg 415

Pro

Met

Ala

Ala

Asp 420

Asn

Lys

Thr

Leu

Gly 425

Arg

TTC

CAA

TTG

ACT

GAT

ATC

CCA

GCT

GCA

CCT

CGT

GGA

ATT

CCT

CAA

ATC

2007

Phe

Gin

Leu

Thr 430

Asp

Ile

Pro

Ala

Ala 435

Pro

Arg

Gly

Ile

Pro 440

Gin

Ile

GAA

GTA

ACA

TTT

GAC

ATC

GAC

AAG

AAC

GGT

ATC

GTG

TCT

GTT

AAG

GCC

2055

G1U

Val

Thr 445

Phe

Asp

Ile

Asp

Lys 450

Asn

Gly

Ile

Val

Ser 455

Val

Lys

Ala

AAA

GAC

CTT

GGA

ACT

CAA

AAA

GAA

CAA

ACT

ATT

GTC

ATC

CAA

TCG

AAC

2103

Lys

Asp 460

Leu

Gly

Thr

Gin

Lys 465

Glu

Gin

Thr

Ile

Val 470

Ile

Gin

Ser

Asn

TCA

GGT

TTG

ACT

GAC

GAA

GAA

ATC

GAC

CGC

ATG

ATG

AAA

GAT

GCA

GAA

2151

Ser 475

Gly

Leu

Thr

Asp

Glu 4S0

Glu

Ile

Asp

Arg

Met 485

Met

Lys

Asp

Ala

Glu 490

GCA

AAC

GCT

GAA

TCC

GAT

AAG

AAA

CGT

AAA

GAA

GAA

GTA

GAC

CTT

CGT

2199

Ala

Asn

Ala

G1U

Ser 495

Asp

Lys

Lys

Arg

Lys 500

Glu

Glu

Val

Asp

Leu 50.5

Arg

AAT

GAA

GTG

GAC

CAA

GCA

ATC

TTT

GCG

ACT

GAA

AAG

ACA

ATC

AAG

GAA

2247

Asn

Glu

Val

Asp 510

Gin

Ala

Ile

Phe

Ala 515

Thr

Glu

Lys

Thr

Ile 520

Lys

Glu

ACT

GAA

GGT

AAA

GGC

TTC

GAC

GCA

GAA

CGT

GAC

GCT

GCC

CAA

GCT

GCC

2295

Thr

Glu

Gly 525

Lys

Gly

Phe

Asp

Ala 530

Glu

Arg

Asp

Ala

Ala S3 5

Gin

Ala

Ala

CTT

GAT

GAC

CTT

AAG

AAA

GCT

CAA

GAA

GAC

AAC

AAC

TTG

GAC

GAC

ATG

2343

Leu

Asp 540

Asp

Leu

Lys

Lys

Ala 545

Gin

Glu

Asp

Asn

Asn 550

Leu

Asp

Asp

Met

AAA Lys 555

GCA AAA Ala Lys

CTT GAA Leu Glu

GCA TTG AAC GAA AAA

GCT CAA GGA CTT GCT GTT Ala Gin Gly Leu Ala Val

2391

Ala Leu 560

Asn

Glu Lys

565

570

AAA

CTC

TAC

GAA

CAA

GCC

GCA

GCA

GCG

CAA

CAA

GCT

CAA

GAA

GGA

GCA

2439

Lys

Leu

Tyr

Glu

Gin 575

Ala

Ala

Ala

Ala

Gin 580

Gin

Ala

Gin

Glu

Gly 585

Ala

GAA

GGC

GCA

CAA

GCA

ACA

GGA

AAC

GCA

GGC

GAT

GAC

GTC

GTA

GAC

GGA

2487

Glu

Cly

Ala

Gin

Ala

Thr

Gly

Asn

Ala

Gly

Asp

Asp

Val

Val

Asp

Gly

S90 595 600

GAG TTT ACG GAA AAG TAAGATGAGT GTATTGGATG AAGAGTATCT AAAAAATACA	2542
Glu Phe Thr Glu Lys
605
CGAAAAGTTT ATAATGATTT TTGTAATCAA GCTGATAACT ATAGAACATC AAAAGATTTT	2602
ATTGATAATA TTCCAATAGA ATATTTAGCT AGATATAGAG AAATTATATT AGCTGAGCAT	2662
GATAGTTCTC TCAAAAATGA TGAAGCGGTA AGGAATTTTG TTACCTCAGT ATTGTTOTCT	2722
GCATTTGTAT cggcgatcgt atcagctatc atatcattag aaatacaaac atataaattt	2782
GTAATACCGT TCATAATTGG TATCATTTOG ACAGTAGTTG TATTTCTTAT GATCAATTGG	2842
AATTATATAG GCAAATACTA AGAAGAGACA AAAATATATA AATATTTCTC TACTTATAGG	2902
ATATTTAAAA TCCAAATAAA GTTAATTTAC TTATTTCCAG AGGTTGCAAC CCAGCCTCTC	2962
TTTTTCGATA AAAAGGGACG GAATCTCATT TCTTTCGGTT TTGTCTCATC AATAGAAAGG	3022
AACAAAGAGT GTTCGTAACT GAACACGGGT TTCAGAATTT CTTACTAAAT ATAAAAGAAA	3082
GGAATTGAAC CCGACCTAAA TCGTCGTTCG ATTCAGAACA TCAATAGAAA GGAATAAGGG	3142
TCTTCGTAAC TGAACACGGG CTACGGACTC TGCCAAAAAG ATAGTTITTT CTAGGACGTA	3202
AGCGTCCGTC GTCAAAACTC CTAGATGGCT GTCTCCGTTT GACGCCCTTT GTATCTTGAA	3262
TT ATC AAC AAT ACT GAA TTT TAT GAT CGT CTC GGG GTA TCC AAA AAC	3309
Met Asn Asn Thr Glu Phe Tyr Asp Arg Leu Gly Val Ser Lys Asn
15 10 15

GCT TCG GCA GAC

GAA ATC AAA AAG

GCT TAT CGT AAG CTT TCC AAA AAA Ala Tyr Arg Lys Leu Ser Lys Lys

3357

Ala Ser

Ala Asp

G1U 20

Ile

Lys

Lys

25

30

TAT

CAC

CCA

GAT

ATC

AAC

AAG

GAG

CCT

GGT

GCT

GAG

GAC

AAG

TAC

AAG

3405

Tyr

His

Pro

Asp 35

Ile

Asn

Lys

Glu

Pro 40

Gly

Ala

Glu

Asp

Lys 45

Tyr

Lys

GAA

GTT

CAA

GAA

GCC

TAT

GAG

ACT

TTG

AGT

GAC

GAC

CAA

AAA

CGT

GCT

3453

Glu

Val

Gin 50

Glu

Ala

Tyr

Glu

Thr 55

Leu

Ser

Asp

Asp

Gin 60

Lys

Arg

Ala

GCC

TAT

GAC

CAG

TAT

GGT

GCT

GCA

GGC

GCC

AAT

GGT

GGT

TTT

GGT

GGA

3501

Ala

Tyr 65

Asp

Gin

Tyr

Gly

Ala 70

Ala

Gly

Ala

Asn

Gly 75

Gly

Phe

Gly Gly

GCT

GGT

GGT

TTC

GGC

GGT

TTC

AAT

GGG

GCA

GGT

GGC

TTC

GGT

GGT

TTT

3549

Ala 80

Gly Gly

Phe

Gly

Gly 85

Phe

Asn

Gly

Ala

Gly 90

Gly

Phe

Gly Gly

Phe 95

GAG

GAT

ATT

TTC

TCA

AGT

TTC

TTC

GGC

GGA

GGC

GGT

TCT

TCG

CGC

AAT

3597

Glu

Asp

Ile

Phe

Ser 100

Ser

Phe

Phe

Gly

Gly Gly 105

Gly

Ser

Ser

Arg 110

Asn

CCA

AAC

GCT

CCT

CGC

CAA

GGA

GAT

GAT

CTC

CAG

TAT

CGT

GTC

AAT

TTG

3645

Pro

Asn

Ala

Pro 115

Arg

Gin

Gly

Asp

Asp 120

Leu

Gin

Tyr

Arg

Val 125

Asn

Leu

ACC TTT GAA GAA GCT ATC	TTC GGA ACT GAG AAG GAA GTT AAG TAT CAT	3693
Thr Phe Glu Glu	Ala Ile	Phe	Gly 135	Thr Glu Lys Glu	Val Lys 140	Tyr	His
	130
CGT	GAA GCT GGC	TGT CGT	ACA	TGT	AAT GGA TCT CGT	GCT AAG	CCA	GGG	3741
Arg	Glu Ala Gly	Cys Arg	Ihr	Cys	Asn Gly Ser Gly	Ala Lys	Pro	Gly
	145		150		155
ACA	AGT CCA GTC	ACT TGT	GGA	CGC	TOT CAT GGC GCT	GGT GTC	ATT	AAC	3789
Thr	Ser Pro Val	Thr Cys	Gly	Arg	Cys His Gly Ala	Gly Val	Ile	Asn
160		165			170			175
GTC	GAT ACG CAG	ACT CCT	CTT	GGT	ATG ATG CGT CGC	CAA GTA	ACC	TGT	3837
Val	Asp Thr Gin	Thr Pro	Leu	Gly	Met Met Arg Arg	Gin Val	Thr	Cys
		180			185		190
GAT	GTC TGT CAC	GGT CGA	GGA	AAA	GAA ATC AAA TAT	CCA TGT	ACA	ACC	3885
Asp	Val Cys His	Gly Arg	Gly	Lys	Glu Ile Lys Tyr	Pro Cys	Ihr	Thr
	195				200	205
TGT	CAT GGA ACA	CGT CAT	GAG	AAA	CAA GCT CAT AGC	GTA CAT	GTG	AAA	3933
Cys	His Gly Thr	Gly His	Glu	Lys	Gin Ala His Ser	Val His	Val	Lys
	210			215		220

ATC CCT GCT Ile Pro Ala	GGT GTG GAA	ACA GGT CAA	CAA ATT CGC CTC GCT GGT CAA	3981
Gly	Val Glu	Thr 230	Gly	Gin	Gin	Ile Arg 235	Leu	Ala Gly Gin
	225
GGT	GAA GCA	GGC	TTT AAC	GGT	GGA	CCT	TAT	GGT GAC	TTG	TAT GTA GTA	4029
Gly	Glu Ala	Gly	Phe Asn	Gly	Gly	Pro	Tyr	Gly Asp	Leu	Tyr Val Val
24Q			245					250		2SS
GTT	TCT GTG	GAA	GCT AGT	GAC	AAG	TTT	GAA	CGT GAA	GGA	ACG ACT ATC	4077
Val	Ser Val	Glu	Ala Ser	Asp	Lys	Phe	Glu	Arg Glu	Gly	Thr Thr Ile
			260				265			270
TTC	TAC AAT	CTC	AAC CTC	AAC	TTT	GTC	CAA	GCG GCT	CTT	GGT GAT ACA	4125
Phe	Tyr Asn	Leu	Asn Leu	Asn	Phe	Val	Gin	Ala Ala	Leu	Gly Asp Thr
		275				280				285
GTA	GAT ATT	CCA	ACT GTT	CAC	GGT	GAT	GTT	GAA TTG	GTT	ATT CCA GAG	4173
Val	Asp Ile	Pro	Thr Val	His	Gly Asp	Val	Glu Leu	Val	Ile Pro Glu
	290				29S				300
GGA	ACT CAG	ACT	GGT AAG	AAA	TTC	CGC	CTA	CGT AGT	AAG	GGG GCA CCG	4221
Gly	Thr Gin	Thr	Gly Lys	Lys	Phe	Arg	Leu	Arg Ser	Lys	Gly Ala Pro
	305			310				315
AGC	CTT CGT	GGC	GGT GCA	GTT	GGT	GAC	CAA	TAC GTT	ACT	GTT AAT GTC	4269
Ser	Leu Arg	Gly	Gly Ala	Val	Gly Asp	Gin	Tyr Val	Thr	Val Asn Val
320			325					330		335
GTA	ACA CCG	ACA	GGC TTG	AAC	GAC	CGC	CAA	AAA GTA	GCC	TTG AAA GAA	4317
Val	Thr Pro	Thr	Gly Leu	Asn	Asp Arg	Gin	Lys Val	Ala	Leu Lys Glu
			340				345			350

TTC Phe

4320

.........ΓΤΤ

Informace ο sekvenci SEQ ID č. 5 /i/ charakteristika sekvence:

/A/ délka: 60? aminokyselin /B/ typ: aminokyselina /0/ topologie: lineární /ii/ typ molekuly: protein /xi/ znázornění sekvence SEQ ID č.5

Met 1

Ser Lys Ile

lle Gly lle Asp Leu Gly Thr Thr Asn Ser Ala Val

5

10

15

Ala

Val

Leu

Glu 20

Gly

Thr

Glu

Ser

Lys 25

Ile

Ile

Ala

Asn

Pro 30

Glu

Gly

Asn

Are

Thr 35

Thr

Pro

Ser

Val

Val 40

Ser

Phe

Lys

Asn

Gly 45

Glu

Ile

Ile

Val

Gly 50

Asp

Ala

Ala

Lys

Arg 55

Gin

Ala

Val

Thr

Axn 60

Pro

Asp

Thr

Val

Ile 65

Ser

Ile

Lys

Ser

Lys 73

Met

Gly

Thr

Ser

Glu 75

Lys

Val

Ser

Ala

Asn 80

Gly

Lys

Glu

Tyr

Thr 85

Pro

Gin

Glu

Ile

Ser 90

Ala

Met

Ile

Leu

Gin 95

Tyr

Leu

Lys

Gly

Tyr 100

Ala

Glu

Asp

Tyr

Leu 105

Gly

Glu

Lys

Val

Thr 110

Lys

Ala

Val

Ile

Thr 115

Val

Pro

Ala

Tyr

Phe 120

Asn

Asp

Ala

Gin

Arg 125

Gin

Ala

Thr

Lys

Asp 13 0

Ala

Gly

Lys

Ile

Ala 135

Gly

Leu

Glu

Val

Glu 140

Arg

Ile

Val

Asn

Glu 145

Pro

Thr

Ala

Ala

Ala 150

Leu

Ala

Tyr

Gly

Leu 155

Asp

Lys

Thr

Asp

Lys 160

Glu

Glu

Lys

Ile

Leu 165

Val

Phe

Asp

Leu

Gly 170

Gly

Gly

Thr

Phe

Asp 17S

Val

Ser

Ile

Leu

Glu 180

Leu

Gly

Asp

Gly

Val 185

Phe

Asp

Val

Leu

Ser 190

Thr

Ala

Gly

Asp

Asn 195

Lys

Leu

Gly Gly

Asp 200

Asp

Phe

Asp

Gin

Lys 205

Ile

Ile

Asp

His

Leu 210

Val

Ala

Glu

Phe

Lys 215

Lys

Glu

Asn

Gly

11« 220

Asp

Leu

Ser

Thr

Asp 225

Lys

Met

Ala

Met

Gin 230

Arg

Leu

Lys

Asp

Ala 235

Ala

GlU

Lys

Ala

Lys 240

Lys

Asp

Leu

Ser

Gly 245

Val

Thr

Ser

Thr

Gin 250

Ile

Ser

Leu

Pro

Phe 255

Ile

Thr

Ala

Gly

Glu 260

Ala

Gly

Pro

Leu

His 265

Leu

Glu

Met

Thr

Leu 270

Thr

Arg

Ala

Lys

Phe 275

Asp

Asp

Leu

Thr

Arg 280

Asp

Leu

Val

Glu

Arg 285

Thr

Val

Pro

Val 290

Arg

Gin

Ala

Leu

Ser 295

Asp

Ala

Gly

Leu

Ser 300

Leu

Ser

Glu

Ile

Asp 305

Glu

Val

Ile

Leu

Val 310

Gly

Gly

Ser

Thr

Arg 315

Ile

Pro

Ala

Val

Val 320

Glu

Ala

Val

Lys

Ala 325

Glu

Thr

Gly

Lys

Glu 330

Pro

Asn

Lys

Ser

Val 335

Asn

Pro

Asp

Glu

Val 340

Val

Ala

Met

Gly

Ala 345

Ala

Ile

Gin

Gly

Gly 350

Val

Ile

Thr

Gly

Asp 355

Val

Lys

Asp

Val

Val 360

Leu

Leu

Asp

Val

Thr 365

Pro

Leu

Ser

Leu

Gly 370

Ile

Glu

Thr

Met

Gly 37S

Gly

Val

Phe

Thr

Lys 380

Leu

Ile

Asp Arg

Asn 385

Thr

Thr

Ile

Pro

Thr 390

Ser

Lys

Ser

Gin

Val 395

Phe

Ser

Thr

Ala

Ala 400

Asp

Asn

Gin

Pro

Ala 405

Val

Asp

Ile

His

Val 410

Leu

Gin

Gly

Glu

Arg 415

Pro

Met

Ala

Ala

Asp 420

Asn

Lys

Thr

Leu

Gly 425

Arg

Phe

Gin

Leu

Thr 430

Asp

Ile

Pro

Ala

Ala 435

Pro

Arg

Cly

Ile

Pro 440

Gin

Ile

Glu

Val

Thr 44S

Phe

Asp

Ile

Asp

Lys 450

Asn

Gly

Ile

Val

Ser 455

Val

Lys

Ala

Lys

Asp 460

Leu

Gly

Thr

Gin

Lys 465

Glu

Gin

Thr

11«

. Val 470

Ile

Gin

Ser

Asn

Ser 475

Gly

Leu

Thr

Asp

Glu 480

Glu

Ile

Asp

Arg

Met 485

Met

Lys

Asp

Ala

Glu 490

Ala

Asn

Ala

Glu

Ser 495

Asp

Lys

Lys

Arg

Lys 500

Glu

Glu

Val

Asp

Leu 505

Arg

Asn

Glu

Val

Asp 510

Gin

Ala

Ile

Phe

Ala 515

Thr

Glu

bys

Thr

Ile 520

Lys

Glu

Thr

Glu

Gly S2 5

Lys

Gly

Phe

Asp

Ala 530

Glu

Arg

Asp

Ala

Ala 535

Gin

Ala

Ala

Leu

Asp 540

Asp

Leu

Lys

Lys

Ala 545

Gin

Glu

Asp

Asn

Asn 550

Leu

Asp

Asp

Met

Lys 555

Ala

Lys

Leu

Glu

Ala 560

Leu

Asn

Glu

Lys

Ala S6S

Gin

Gly

Leu

Ala

Val 570

Lys

Leu

Tyr

Glu

Gin 575

Ala

Ala

Ala

Ala

Gin. S80

Gin

Ala

Gin

Glu

Gly 585

Ala

Glu

Gly

Ala

Gin 590

Ala

Thr

Gly

Asn

Ala

Gly

Asp

Asp

Val

Val

Asp

Gly

Glu

Phe

Thr

Glu

Lys

595 600 605

Informace o sekvenci SEQ	ID c. 6
/i/	charakteristika	. sekvence:
	/A/ délka:	aminokyselin
	/á/ typ: aminok	:y se lina
	/0/ topologie:	line ární
/ii/	tuρ molekuly:	protein
/xi/	znázornění sek	:vence SEQ li č.5

φφ dl * φ φ

ΦΦ___Ορ · · ' φ φ φ φφ φφ φφφ· φφ φ φφφφ φ φφ φφφ φ · φ φ · • r φφ

Met 1

Asn

Asn

Thr

Glu 5

Phe

Tyr

Asp

Arg

Leu 10

Gly

Val

Ser

Lys

Asn 15

Ala

Ser

Ala

Asp

Glu 20

Ile

Lys

Lys

Ala

Tyr 25

Arg

Lys

Leu

Ser

Lys 30

Lys

Tyr

His

Pro

Asp 35

Ile

Asn

Lys

Glu

Pro 40

Gly

Ala

Glu

Asp

Lys 45

Tyr

Lys

Glu

Val

Gin 50

Glu

Ala

Tyr

Glu

Thr SS

Leu

Ser

Asp

Asp

Gin 60

Lys

Arg

Ala

Ala

Tyr 65

Asp

Gin

Tyr

Gly

Ala 70

Ala

Gly

Ala

Asn

Gly 75

Gly

Phe

Gly

Gly

Ala 80

Gly

Gly

Phe

Gly

Gly 85

Phe

Asn

Gly

Ala

Gly 90

Gly

Phe

Gly

Gly

Phe 9S

Glu

Asp

Ile

Phe

Ser 100

Ser

Phe

Phe

Gly

Gly 105

cly

Gly

Ser

Ser

Arg 110

Asn

Pro

Asn

Ala

Pro 115

Arg

Gin

Gly Asp Asp 120

Leu

Gin

Tyr

Arg

Val 125

Asn

Leu

Thr

Phe

Glu 130

Glu

Ala

Ile

Phe

Gly 135

Thr

Glu

Lys

Glu

Val 140

Lys

Tyr

His

Arg

Glu 145

Ala

Gly

Cys

Arg

Thr 150

cys

Asn

Gly

Ser

Gly 155

Ala

Lys

Pro

Gly

Thr 160

Ser

Pro

Val

Ihr

cys 165

Gly

Arg

Cys

His

Gly 170

Ala

Gly

Val

Ile

Asn 175

Val

Asp

Thr

Gin

Thr 180

Pro

Leu

Gly

Met

Met 185

Arg

Arg

Gin

Val

Thr 190

Cys

Asp

Val

cys

His 195

Gly

Arg

Gly

Lys

Glu 200

Ile

Lys

Tyr

Pro

Cys 20S

Thr

Thr

cys

His

Gly 210

Thr

Gly

His

Glu

Lys 215

Gin

Ala

His

Ser

Val 220

His

Val

Lys

Ile

Pro 225

Ala

Gly

Val

Glu

Thr 230

Gly

Gin

Gin

Ile

Arg 235

Leu

Ala

Gly

Gin

Gly 240

G1U

Ala

Gly

Phe

Asn 245

Gly

Gly

Pro

Tyr

Gly 250

Asp

Leu

Tyr

Val

Val 255

Val

Ser

Val

Glu

Ala 260

Ser

Asp

Lys

Phe

Glu 26S

Arg

Glu

Gly

Thr

Thr 270

Ile

Phe

Tyr

Asn

Leu 275

Asn

Leu

Asn

Phe

Val 280

Gin

Ala

Ala

Leu

Gly 285

Asp

Thr

Val

Asp

Ile 290

Pro

Thr

Val

His

Gly 295

Asp

Val

Glu

Leu

Val 300

Ile

Pro

Glu

Gly

Thr 305

Gin

Thr

Gly

Lys

Lys 310

Phe

Arg

Leu

Arg

Ser 315

Lys

Gly

Ala

Pro

Ser 320

Leu

Arg

Gly

Gly

Ala 325

Val

Gly

Asp

Gin

Tyr 330

Val

Thr

Val

Asn

Val 335

Val

Thr

Pro

Thr

Gly 340

Leu

Asn

Asp

Arg

Gin 34 5

Lys

Val

Ala

Leu

Lys 350

Glu

Phe

• 4 • · · 4 4 · · · ····

4 · ··· · · • 4 4··Φ ·· ·>· · ·

100

Informace ο sekvenci SEQ ID č. 7 (i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 15 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (C) topologie: lineární (ii) typ molekuly: peptíd (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 7

Thr Ser Thr Gin Ile Ser Leu Pro Phe Ile Thr Ala Gly Glu Ala 15 10 1S

Informace o sekvenci SEQ ID č. 8 (i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 15 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (C) topologie: lineární (ii) typ molekuly: peptíd (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 8

Thr Ala Gly Glu Ala Gly Pro Leu His Leu Glu Met Thr Leu Thr 15 10 15

Informace o sekvenci SEQ ID č. 9 (i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 14 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (C) topologie: lineární (ii) typ molekuly: peptid (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 9

Met Thr Leu Thr Arg Ala Lys Phe Asp Asp Leu Thr Arg Asp ¹ 5 io

Informace o sekvenci SEQ ID č. 10 (i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 15 aminokyselin

I u

101 (B) typ: aminokyselina (C) topologie: lineární (ii) typ molekuly: peptid (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 10

Asp Asp Leu Thr Arg Asp Leu Val Glu Arg Thr Lys Val Pro Val 15 10 15

Informace o sekvenci SEQ ID č. 11 (i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 14 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (C) topologie: lineární (ii) typ molekuly: peptid (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 11

Thr Lys Val Pro Val Arg Gin Ala Leu Ser Asp Ala Gly Leu

Informace o sekvenci SEQ ID č. 12 (i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 15 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (C) topologie: lineární (ii) typ molekuly: peptid (xi) znázorněni sekvence SEQ ID č. 12

Lys Ala Lys Asp Leu Gly Thr Gin Lys Glu Gin Thr Ile Val Ile 1 ^{5 10}

Informace o sekvenci SEQ ID č. 13 (i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 14 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (C) topologie: lineární (ii) typ molekuly: peptid ·· ····

102 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 13

Leu Thr Asp Glu Ile Asp Are Met Met Lys Asp Ala Glu Ala 15

Informace o sekvenci SEQ ID č. 14 (i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 24 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (C) topologie: lineární (ii) typ molekuly: peptid (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 14

Lys Asp Ala Glu Ala Asn Ala Glu Ser Asp Lys Lys Arg Lys Glu Glu 15 1° ¹⁵

Val Asp Leu Arg Asn Glu Val Asp

Informace o sekvenci SEQ ID č. 15 (i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 15 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (C) topologie: lineární (ii) typ molekuly: peptid (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 15

Asn Glu Val Asp Gin Ala Ile Phe Ala Thr Glu Lys Thr Ile Lys 15 10 15

Informace o sekvenci SEQ ID č. 16 (i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 28 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (C) topologie: lineární (ii) typ molekuly: peptid (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 16

Phe Asp Ala Glu Arg

Glu Lys Thr II. W* Glu Thr Glu Gly Lys Gly i 5

103

Asp

Ala Ala Gin Ala Ala Leu

Asp Asp Leu Lys Lys

Informace o sekvenci SEQ ID č. 17 (i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 30 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (C) topologie: lineární (ii) typ molekuly: peptid (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 17

Lys Ala Gin Glu 1

Asp Asn Asn Leu Asp

Asp Het Lys Ala Lys

Leu Glu

Ala Leu Asn Glu

Lys Ala Gin Gly Leu

Ala Val Lys Leu Tyr

Informace o sekvenci SEQ ID č. 18 (i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 25 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (C) topologie: lineární (ii) typ molekuly: peptid (xi) znázorněni sekvence SEQ ID č. 18

Gin Glu Gly Ala Glu Gly Ala Gin Ala Thr Gly Asn Ala Gly Asp Asp ¹⁰ 15

Val Val Asp Gly Glu Phe Thr Glu Lys ²⁰ 25

Informace o sekvenci SEQ ID č. 19 (i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 2183 párů baží (B) typ: nukleová kyselina

104 (C) počet řetězců: dvouřetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: DNA (genomová) (iii) hypotetická: není (iv) anti-sense: není (vi) původní zdroj: Streptococcus pyogenes (ix) rys:

(A) jméno/klíč: CDS (B) poloha: 204..2030 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 19

CAGCGATGGT AGTTGTTIAT AACTAAGGTA AATGAGTTTT CGTTTTTGTC CGTAATGACA60

GTAAACTAGA TAGCAAGTTA GAAGCTATTT CGCTTGCTGA TTAAACTATA GTGATTGCTT120

AGAATTGGAA GTAAAATAAT TCGAGTGCTT ACTAAGATAA ATTGAAATAA AAAGTAATAA180

AGTATAAAAT AAGAGGTATT AAC ATG TCT AAA ATT ATT GGT ATT GAC TTA230

Met Ser Lys Ile Ile Gly Ile Asp Leu

GGT Gly 10

ACA ACA AAC

TCA GCA GTA GCA GTT CTT GAA GGG ACT GAA TCA AAA

278

Thr

Thr Asn

Ser Ala 15

Val

Ala

Val

Leu

Glu Gly TŤir Glu Ser Lys

20

25

ATC

ATT

GCT

AAC

CCA

GAA GGC

AAT

CGT

ACA

ACT

CCT

TCA

GTA

GTA

TCA

326

Ile

Ile

Ala

Asn

Pro 30

Glu

Gly

Asn

Arg

Thr 35

Thr

Pro

Ser

Val

Val 40

Ser

TTC

AAA

AAT

GGT

GAA

ATT

ATC

GTG

GGT

GAT

GCT

GCA

AAA

CGC

CAA

GCA

374

Phe

Lys

Asn

Gly 45

Glu

Ile

Ile

Val

Gly 50

Asp

Ala

Ala

Lys

Arg 55

Gin

Ala

GTO

ACA

AAC

CCA

GAA

ACA

GTA

ATC

TCT

ATT

AAA

TCT

AAA

ATG

GGA

ACT

422

Val

Thr

Asn 60

Pro

Glu

Thr

Val

Ile 65

Ser

Ile

Lys

Ser

Lys 70

Met

Gly

Thr

TCT

GAA

AAA

GTT

TCT

GCA

AAT

GGT

AAA

GAA

TAT

ACT

CCT

CAA

GAA

ATT

470

Ser

G1U 75

Lys

Val

Ser

Ala

Asn 80

Gly

Lys

Glu

Tyr

Thr 85

Pro

Gin

Glu

Ile

TCA

GCA

ATG

ATT

CTT

CAA

TAC

CTT

AAA

GGT

TAT

GCT

GAA

GAC

TAT

CTT

518

Ser 90

Ala

Met

Ile

Leu

Gin 95

Tyr

Leu

Lys

Gly

Tyr 100

Ala

Glu

Asp

Tyr

Leu 105

GGA

GAA

AAA

GTA

GAA

AAA

GCA

GTT

ATT

ACT

GTT

CCA

GCT

TAT

TTC

AAC

566

Gly

Glu

Lys

Val

G1U 110

Lys

Ala

Val

Ile

Thr 115

Val

Pro

Ala

Tyr

Phe 120

Asn

GAT

GCA

CAA

CGT

CAA

GCA

ACT

AAA

GAC

GCT

GGT

AAA

ATT

GCA

GGT

CTT

614

Asp

Ala

Gin

Arg 125

Gin

Ala

Thr

Lys

Asp 130

Ala

Gly

Lys

Ile

Ala 135

Gly

Leu

GAA

GTA

GAA

CGT

ATC

GTT

AAT

GAA

CCA

ACA

GCA

GCT

GCA

CTT

GCT

TAT

662

Glu

Val

Glu 140

Arg

Ile

Val

Asn

Glu 145

Pro

Thr

Ala

Ala

Ala 150

Leu

Ala

Tyr

GGT

ATG

GAC

AAG

ACT

GAC

AAG

GAT

GAA

AAA

ATC

TTA

GTT

TTT

GAC

CTT

710

Gly

Met 155

Asp

Lys

Thr

Asp

Lys 160

Asp

Glu

Lys

Ile

Leu 165

Val

Phe

Asp

Leu

GGT

GGT

GGT

ACA

TTT

GAC

GTA

TCA

ATC

CTT

GAA

TTA

GGT

GAT

GGT

GTC

758

Gly Gly 170

Gly

Thr

Phe

Asp 175

Val

Ser

11«

Leu

Glu 180

Leu

Gly

Asp Gly

Val 185

TTC Phe

GAC GTT

CTT Leu

GCA ACA

GCA GGT GAT AAC AAA CTT GGT GGT GAC GAC

80«

Asp

Val

Ala 190

Thr

Ala Gly Asp

Asn 195

Lys

Leu Gly

Gly

Asp Asp 200

TTT

GAC

CAA

AAA

ATT

ATT

GAT

TTC

TTA

GTG

GCT

GAA

TTT

AAG

AAA

GAA

854

Phe

Asp

Gin

Lys 205

Ile

Ile

Asp

Phe

Leu 210

Val

Ala

Glu

Phe

Lys 215

Lys

Glu

AAT

GGT

ATT

GAC

TTA

TCA

CAA

GAT

AAG

ATG

GCA

CTT

CAA

CGC

TTG

AAA

902

Asn

Gly

Ile 220

Asp

Leu

Ser

Gin

Asp 225

Lys

Met

Ala

Leů

Gin 230

Arg

Leu

Lys

GAT

GCT

GCT

GAA

AAA

GCT

AAA

AAA

GAT

CTT

TCA

GGT

GTG

ACA

CAA

ACA

950

Asp

Ala 23 5

Ala

Glu

Lys

Ala

Lys 240

Lys

Asp

Leu

Ser

Gly 245

Val

Thr

Gin

Thr

CAA

ATT

TCA

TTA

CCG

TTC

ATC

ACT

GCT

GGT

TCT

GCT

GGT

CCT

CTT

CAC

998

Gin 250

Ile

Ser

Leu

Pro

Phe 255

Ile

Thr

Ala

Gly

Ser 260

Ala

Gly

Pro

Leu

His 265

TTA

GAG

ATG

AGC

TTA

TCT

CGT

GCT

AAA

TTT

GAC

GAT

CTC

ACT

CGT

GAC

104«

Leu

Glu

Met

Ser

Leu 270

Ser

Arg

Ala

Lys

Phe 275

Asp

Asp

Leu

Thr

Arg 2B0

Asp

CTT

GTT

GAA

CGT

ACG

AAA

ACT

CCA

GTT

CGT

CAA

GCT

CTT

TCA

GAT

GCA

1094

Leu

Val

Glu

Arg 285

Thr

Lys

Thr

Pro

Val 290

Arg

Gin

Ala

Leu

Ser 295

Asp

Ala

GGA

TTG

TCA

TTG

TCA

GAA

ATT

GAT

GAA

GTT

ATC

CTT

GTT

GGT

GGA

TCA

1142

Gly

Leu

Ser 300

Leu

Ser

Glu

Ile

Asp 305

Glu

Val

Ile

Leu

Val 310

Gly

Gly

Ser

ACT

CGT

ATC

CCA

GCA

GTT

GTC

GAA

GCT

GTA

AAA

GCT

GAA

ACT

GGT

AAA

1190

Thr

Arg 315

Ile

Pro

Ala

Val

Val 320

Glu

Ala

Val

Lys

Ala 325

Glu

Thr

Gly

Lys

GAA G1U 330

CCA AAT AAA TCT

GTA AAC

CCT GAT GAA GTG GTT GCT ATG GGT GCT

1238

Pro Asn

Lys

Ser

Val 335

Asn

Pro

Asp Glu

Val 340

Val Ala

Met Gly Ala 345

GCT

ATC

CAA

GGT

GGG

GTT

ATC

ACT

GGG

GAT

GTG

AAA

GAC

GTT

GTC

CTT

1286

Ala

Ile

Gin

Gly

Gly 350

Val

Ile

Thr

Gly

Asp 355

Val

Lys

Asp

Val

Val 360

Leu

CTT

GAC

GTA

ACA

CCA

TTG

TCA

CTT

GGT

ATT

GAA

ACA

ATG

GGT

GGT

GTC

1334

Leu

Asp

Val

Thr 365

Pro

Leu

Ser

Leu

Gly 370

Ile

Glu

Thr

Met

Gly Gly 375

Val

TTC

ACT

AAA

TTG

ATC

GAC

CGC

AAT

ACA

ACT

ATC

CCA

ACA

TCT

AAA

TCA

1382

Phe

Thr

Lys 380

Leu

Ile

Asp

Arg

Asn 385

Thr

Thr

Ile

Pro

Thr 390

Ser

Lys

Sex

CAA

GTC

TTC

TCA

ACA

GCA

GCA

GAO

AAC

CAA

CCA

GCC

GTT

GAT

ATC

CAT

1430

Gin

Val 395

Phe

Ser

Thr

Ala

Ala 400

Asp

Asn

Gin

Pro

Ala 405

Val

Asp

Ile

His

GTT

CTT

CAA

GGT

GAA

CGC

CCA

ATG

GCA

GCA

GAT

AAC

AAG

ACT

CTT

GGT

1478

Val 410

Leu

Gin

Gly

Glu

Arg 415

Pro

Met

Ala

Ala

Asp 420

Asn

Lys

Thr

Leu

Gly 425

CGC

TTC

CAA

TTG

ACT

GAT

ATC

CCA

GCT

GCA

CCT

CGT

GGA

ATC

CCA

CAA

1526

Arg

Phe

Gin

Leu

Thr 430

Asp

Ile

Pro

Ala

Ala 435

Pro

Arg

Gly

Ile

Pro 440

Gin

ATT

GAA

GTA

ACA

TTT

GAT

ATC

GAT

AAA

AAC

GGT

ATT

GTT

TCT

GTA

AAA

1S74

Ile

Glu

Val

Thr

Phe

Asp

Ile

Asp

Lys

Asn

Gly

Ile

Val

Ser

Val

Lys

445 4S0 4SS i

106

GCT Ala

AAA GAC CTT GGT

ACG Thr

CAA AAC GAA CAA CAC ATC GTT ATC AAA TCA

1622

Lys

Asp 460

Leu Gly

Gin

tys 465

Glu

Gin

His

Ile Val 470

Ile Lys

Ser

AAC

GAC

GGA

CTT

TCT

GAA

GAA

GAA

ATT

GAT

CGC

ATG

ATG

AAA

GAC

GCT

1670

Asn

Asp 475

Gly

Leu

Ser

Glu

Glu 480

Glu

Ile

Asp

Arg

Met 485

Met

Lys

Asp

Ala

GAA

GCT

AAT

GCC

GAA

GCC

GAT

GCG

AAA

CGT

AAA

GAA

GAA

GTT

GAC

CTT

1718

G1U 490

Ala

Asn

Ala

Glu

Ala 495

Asp

Ala

Lys

Arg

Lys 500

Glu

Glu

Val

Asp

Leu 505

AAA

AAC

GAA

GTT

GAC

CAA

GCT

ATC

TTT

GCT

ACT

GAA

AAA

ACA

ATC

AAA

1766

Lys

Asn

Glu

Val

Asp 510

Gin

Ala

Ile

Phe

Ala 515

Thr

G1U

Lys

Thr

Ile 520

Lys

GAA

ACT

GAA

GGT

AAA

GGC

TTT

GAC

ACA

GAA

CGC

GAT

GCA

GCG

CAA

TCA

1814

Glu

Thr

Glu

Gly 525

Lys

Gly

Phe

Asp

Thr 530

Glu

Arg

Asp

Ala

Ala 535

Gin

Ser

GCT

CTT

GAC

GAG

TTA

AAA

GCT

GCG

CAA

GAA

TCT

GGC

AAC

CTT

GAC

GAC

1862

Ala

Leu

Asp 540

Glu

Leu

Lys

Ala

Ala 545

Gin

G1U

Ser

Gly

Asn 550

Leu

Asp

Asp

ATG

AAA

GCT

AAA

CTT

GAA

GCA

TTA

AAT

GAA

AAA

GCG

CAA

GCT

TTG

GCT

1910

Met

Lys S55

Ala

Lys

Leu

Glu

Ala S60

Leu

Asn

Glu

Lys

Ala 565

Gin

Ala

Leu

Ala

GTT

AAA

ATG

TAC

GAG

CAA

GCT

GCA

GCA

GCT

CAA

CAA

GCA

GCA

CAA

GGT

1958

Val 570

Lys

Met

Tyr

Glu

Gin 575

Ala

Ala

Ala

Ala

Gin 580

Gin

Ala

Ala

Gin

Gly 585

GCA

GAA

GGT

GCA

CAA

GCT

AAT

GAT

TCA

GCA

AAT

AAT

GAT

GAT

GTT

GTA

2006

Ala

Glu

Gly

Ala

Gin S90

Ala

Asn

Asp

Ser

Ala 595

Asn

Asn

Asp

Asp

Val 600

Val

GAT GGC GAA TTT ACA GAA AAG TAATGATTTA GTTATCTAGT AACATTAATA 2057

Asp Gly Glu Phe Thr Glu Lys

605

TCCGAATTCA GAGGTTCTAC CAAACCTCTG TTTTTGGCTA AATAAAATGT AAAAATGCTG 2117

ACGTCAAAAT ATTTTAAGAA AGGAATACAA GTICGATTAT TCGAACACAG GCTAAAGCGT

GTAAAG

2177

2183

Informace o sekvenci SEQ ID č. 20 /i/ charakteristika sekvence:

/A/ délka: 608 aminokyselin /B/ typ: aminokyselina /0/ topologie: lineární /ii/ typ molekuly: protein /xi/ znázornění sekvence SEQ ID č. 20 i

Ίογ

Met Ser Lys 1

Ile

Ile Gly Ile Asp Leu Gly Thr Thr Asn Ser Ala Val

5

10

15

Ala

Val

Leu

Glu 20

Gly

Thr

Glu

Ser

Lys 25

Ile

Ile

Ala

Asn

Pro 30

Glu

Gly

Asn

Arg

Thr 35

Thr

Pro

Ser

Val

Val 40

Ser

Phe

Lys

Asn

Gly 45

Glu

Ile

Ile

Val

Gly Asp SO

Ala

Ala

Lys

Arg 55

Gin

Ala

Val

Thr

Asn 60

Pro

Glu

Thr

Val

Ile 65

Ser

Ile

Lys

Ser

Lys 70

Met

Gly

Thr

Ser

Glu 75

Lys

Val

Ser

Ala

Asn SO

Gly

Lys

Glu

Tyr

Thr 85

Pro

Gin

Glu

Ile

Ser 90

Ala

Met

Ile

Leu

Gin 95

Tyr

Leu

Lys

Gly

Tyr 100

Ala

Glu

Asp

Tyr

Leu 105

Gly

Glu

Lys

Val

Glu 110

Lys

Ala

Val

Ile

Thr 115

Val

Pro

Ala

Tyr

Phe 120

Asn

Asp

Ala

Gin

Arg 125

Gin

Ala

Thr

Lys

Asp 130

Ala

Gly

Lys

Ile

Ala 135

Gly

Leu

Glu

Val

Glu 140

Arg

Ile

Val

Asn

Glu 145

Pro

Thr

Ala

Ala

Ala 150

Leu

Ala

T?r

Gly

Met 155

Asp

Lys

Thr

Asp

Lys 160

Asp

Glu

Lys

Ile

Leu 165

Val

Phe

Asp

Leu

Cly Gly 170

Gly

Thr

Phe

Asp 175

val

Ser

Ile

Leu

Glu 180

Leu

Gly

ASp

Gly

Val 185

Phe

Asp

Val

Leu

Ala 190

Thr

Ala

Gly

Asp

Asn 195

Lys

Leu

Gly

Gly

Asp 200

Asp

Phe

Asp

Gin

Lys 205

Ile

Ile

Asp

Phe

Leu 210

Val

Ala

Glu

Phe

Lys 215

Lys

Glu

Asn

Gly

Ile 220

Asp

Leu

Ser

Gin

Asp 225

Lys

Met

Ala

Leu

Gin 230

Arg

Leu

Lys

Asp

Ala 235

Ala

Glu

Lys

Ala

Lys 240

Lys

Asp

Leu

Ser

Gly 245

Val

Thr

Gin

Thr

Gin 250

Ile

Ser

Leu

Pro

Phe 255

Ile

Thr

Ala

Gly

Ser 260

Ala

Gly

Pro

Leu

His 265

Leu

Glu

Met

Ser

Leu 270

Ser

Arg

Ala

Lys

Phe 27 5

Asp

Asp

Leu

Thr

Arg 280

Asp

Leu

Val

Glu

Arg 285

Thr

Lys

Thr

Pro

Val 290

Arg

Gin

Ala

Leu

Ser 295

Asp

Ala

Gly

Leu

Ser 300

Leu

Ser

Glu

Ile

Asp 305

Glu

Val

Ile

Leu

Val 310

Gly

Gly

Ser

Thr

Arg 31S

Ile

Pro

Ala

Val

Val 320

Glu

Ala

Val

Lys

Ala 325

Glu

Thr

Gly

Lys

Glu 330

Pro

Asn

Lys

Ser

Val 335

Asn

Pro

Asp

Glu

Val 340

Val

Ala

Met

Gly

Ala 345

Ala

Ile

Gin

Gly

Gly 350

Val

Ile

Thr

Gly

Asp

Val

Lys

Asp

Val

VÁ1

Leu

Leu

Asp

Val

Thr

Pro

Leu

Ser

355 360 365

I

108

Leu

Gly 370

Ile

Glu

Thr

Met

Gly Gly 375

Val

Phe

Thr

Lys 380

Leu

Ile

Asp

Arg

Asn 385

Thr

Thr

Ile

Pro

Thr 390

Ser

Lys

Ser

Gin

Val 395

Phe

Ser

Thr

Ala

Ala 400

Asp

Asn

Gin

Pro

Ala 405

Val

Asp

Ile

His

Val 410

Leu

Gin

Gly

Glu

Arg 415

Pro

Met

Ala

Ala

Asp 420

Asn

Lys

Thr

Leu

Gly 425

Arg

Phe

Gin

Leu

Thr 430

Asp

Ile

Pro

Ala

Ala 435

Pro

Arg

Gly

Ile

Pro 440

Gin

Ile

Glu

Val

Thr 445

Fhe

Asp

Ile

Asp

Lys Asn Gly 450

Ile

Val

Ser 4SS

Val

Lys

Ala

Lys

Asp 460

Leu

Gly

Thr

Gin

Lys 465

Glu

Gin

His

Ile

Val 470

Ile

Lys

Ser

Asn

Asp 475

Gly

Leu

Ser

Glu

Glu 480

Glu

Ile

Asp

Arg

Met 485

Met

Lys

Asp

Ala

Glu 490

Ala

Asn

Ala

Glu

Ala 495

Asp

Ala

Lys

Arg

Lys 500

Glu

Glu

Val

Asp

Leu 505

Lys

Asn

Glu

Val

Asp 510

Gin

Ala

Ile

Phe

Ala 515

Thr

Glu

Lys

Thr

Ile 520

Lys

Glu

Thr

Glu

Gly 525

Lys

Gly

Phe

Asp

Thr S30

Glu

Arg

Asp

Ala

Ala S35

Gin

Ser

Ala

Leu

Asp 540

Glu

Leu

Lys

Ala

Ala 545

Gin

Glu

Ser

Gly

Asn 5S0

Leu

Asp

Asp

Met

Lys 555

Ala

Lys

Leu

Glu

Ala 560

Leu

Asn

Glu

Lys

Ala 565

Gin

Ala

Leu

Ala

Val S70

Lys

Met

Tyr

Glu

Gin 575

Ala

Ala

Ala

Ala

Gin 580

Gin

Ala

Ala

Gin

Gly 585

Ala

Glu

Gly

Ala

Gin 590

Ala

Asn

Asp

Ser

Ala 595

Asn

Asn

Asp

Asp

Val 600

Val

Asp

Gly

Glu

Phe 605

Thr

Glu

Lys

Informace o sekvenci SEQ ID c. 21 /i/ charakteristika sekvence:

/A/ délka: 24-38 párů baží /3/ typ: nukleová kyselina /0/ počet řetězců: dvouřetězcová /0/ typologie: lineární /ii/ typ molekuly: DNA /genomová/ /íii/ hypotetická: není /iv/ anti-sense: není /vi/ původní zdroj /A/ organizmus: Streptococcus agalactiae /ix/ rys:

/A/ jméno/klíč: ODS /3/ poloha: 24-8..2077

109 /xi/ znázornění sekvence SEQ ID č. 21

CTTTCAAAAG

GGATATAAAT

TGCACGAGCG

TCTGCTAAGA

CCAGCGATGG

TAGTTGTCTA

TAACTAAGGT

AAATGAGTTT

TCGTTTTTGT

CCGTAATGAC

AGTAAACTAG

ATAGCAAGTT

120

AGAAGCTATT

CAGCTTGCTG ATTXAACTAT

AGTGATTGCT

TAGAATTGGA

AGTAAAATAA

180

AAGTATTATA

TACTAAGATA AATTGAAATA

AAAAGTAATA

AAATAAGAGG

240

TTCGAGTGCT

TATTAAC ATG

TCT AAA ATT ATT GGT

ATT GAC TTA GGT ACA ACA AAC TCA

289

Met 1

Ser

Lys Ile Ile 5

Gly

Ile Asp

Leu Gly Thr 10

Thr

Asn

Ser

GCA

GTA

GCA

GTT

CTT

GAA

GGG

ACT

GAA

TCA

AAA

ATC

ATT

GCT

AAC

CCA

337

Ala 1S

Val

Ala

Val

Leu

Glu 20

Gly

Thr

Glu

Ser

Lys 25

Ile

Ile

Ala

Asn

Pro 30

GAA

GGC

AAT

CGT

ACA

ACT

CCT

TCA

GTA

GTA

TCA

TTC

AAA

AAT

GGT

GAA

38S

Glu

Gly

Asn

Arg

Thr 35

Thr

Pro

Ser

Val

Val 40

Ser

Phe

Lys

Asn

Gly 45

Glu

ATT

ATC

GTG

GGT

GAT

GCT

GCA

AAA

CGT

CAA

GCG

GTA

ACA

AAT

CCA

GAT

433

Ile

Ile

Val

Gly 50

Asp

Ala

Ala

Lys

Arg 55

Gin

Ala

Val

Thr

Asn 60

Pro

Asp

ACT

GTT

ATC

TCT

ATC

AAA

TCA

AAG

ATG

GGA

ACT

TCT

GAA

AAA

GTT

TCT

481

Thr

Val

Ile 6S

Ser

Ile

Lys

Ser

Lys 70

Met

Gly

Thr

Ser

G1U 75

Lys

Val

Ser

GCA

AAT

GGT

AAA

GAA

TAT

ACT

CCT

CAA

GAA

ATT

TCA

GCA

ATG

ATT

CTT

529

Ala

Asn 80

Gly

Lys

Glu

Tyr

Thr 85

Pro

Gin

Glu

Ile

Ser 90

Ala

Met

Ile

Leu

CAA

TAC

CTT AAA

GGT

TAT

GCT

GAA

GAC

TAT

CTT

GGA

GAA

AAA

GTA

GAA

577

Gin 95

Tyr

Leu

Lys

Gly

Tyr 100

Ala

Glu

Asp

Tyr

Leu 105

Gly

G1U

Lys

Val

Glu 110

AAA

GCA

GTT

ATT

ACT

GTT

CCA

GCT

TAC

TTC

AAC

GAT

GCA

CAA

CGT

CAG

625

Lys

Ala

Val

Ile

Thr 115

Val

Pro

Ala

Tyr

Phe 120

Asn

Asp

Ala

Gin

Arg 125

Gin

GCA

ACT

AAA

GAC

GCT

GGT

AAA

ATT

GCA

GGT

CTT

GAA

GTA

GAA

CGT

ATC

673

Ala

Thr

Lys

Asp 130

Ala

Gly

Lys

Ile

Ala 13 5

Gly

Leu

Glu

Val

G1U 140

Arg

Ile

GTT AAC GAA CCA ACA	GCA Ala	GCC GCA CTT GCT TAT GGT ATG GAC AAG ACT	721
Val Asn Glu	Pro	Thr	Ala	Ala Leu Ala Tyr Gly Met Asp	Lys	Ihr
	145	150	155
GAC	AAG GAT	GAA	AAA	ATC	TTA	GTT TTT	GAC CTT GGT GGT GGT	ACA	TTT	769
Asp	Lys Asp	Glu	Lys	Ile	Leu	Val Phe	Asp Leu Gly Gly Gly	Thr	Phe
	160				165		170
GAC	GTA TCA	ATC	CTT	GAA	TTA	GGT GAT	GGT GTC TTC GAC GTT	CTT	GCA	617
Asp	Val Ser	Ile	Leu	Glu	Leu	Gly Asp	Gly Val Phe Asp Val	Leu	Ala
175				180			185		190
ACA	GCA GGT	GAT	AAC	AAA	CTT	GGT GGT	GAC GAC TTT GAC CAG	AAA	ATT	865
Thr	Ala Gly	Asp	Asn	Lys	Leu	Gly Gly	Asp Asp Phe Asp Gin	Lys	Ile
			195				200	205
ATT	GAT TTC	TTG	GTA	GAA	GAA	TTC AAG	AAA GAA AAT GGT ATT	GAT	CTT	913
Ile	Asp Phe	Leu	Val	G1U	G1U	Phe Lys	Lys Glu Asn Gly Ile	Asp	Leu
		210				215	220
TCT	CAA GAC	AAA	ATG	GCT	CTT	CAA CGC	TTG AAA GAT GCT GCT	GAA	AAA	961
Ser	Gin Asp	Lys	Met	Ala	Leu	Gin Arg	Leu Lys Asp Ala Ala	Glu	Lys
	225					230	235

110

GCT AAA AAA GAC CTT TCA

GGT GTA ACT CAA ACT CAA ATT TCA TTA CCG

1009

Ala Lys 240

Lys Asp

Leu Ser

Gly 245

Val

Ώιτ Gin

Thr Gin 250

Ile

Ser

Leu Pro

TTC

ATC

ACT

GCT

GGT

TCT

GCT

GGT

CCT

CTT

CAC

TTG

GAG

ATG

AGC

TTA

1057

Phe 2S5

Ile

Thr

Ala

Gly

Ser 260

Ala

Gly

Pro

Leu

His 265

Leu

Glu

Met

Ser

Leu 270

TCA

CGT

GCT

AAA

TTT

GAC

GAT

CTC

ACT

CGT

GAC

CTT

GTT

GAA

CGT

ACG

1105

Ser

Arg

Ala

Lys

Phe 275

Asp

Asp

Leu

Thr

Arg 280

Asp

Leu

Val

Glu

Arg 285

Thr

AAA

ACT

CCA

GTT

CGT

CAA

GCT

CTT

TCA

GAT

GCA

GGC

TTG

TCA

TTG

TCA

1153

Lys

Thr

Pro

Val 290

Arg

Gin

Ala

Leu

Ser 295

Asp

Ala

Gly

Leu

Ser 300

Leu

Ser

GAA

ATT

GAT

GAA

GTT

ATC

CTC

GTT

GGT

GGA

TCA

ACA

CGT

ATC

CCA

GCA

1201

Glu

Ile

Asp 30S

Glu

Val

Ile

Leu

Val 310

Gly

Gly

Ser

Thr

Arg 315

Ile

Pro

Ala

GTT

GTT

GAA

GCT

GTA

AAA

GCT

GAA

ACT

GGT

AAA

GAA

CCA

AAT

AAA

TCT

124 9

Val

Val 320

Glu

Ala

Val

Lys

Ala 325

G1U

Thr

Gly

Lys

Glu 330

Pro

Asn

Lys

Ser

GTT

AAC

CCT

GAT

GAA

GTG

GTT

GCC

ATG

GGT

GCT

GCT

ATC

CAA

GGT

GGT

1297

Val 335

Asn

Pro

Asp

G1U

Val 340

Val

Ala

Met

Gly

Ala 345

Ala

Ile

Gin

Gly

Gly 350

GTT

ATC

ACT

GGG

GAT

GTG

AAA

GAC

GTT

GTA

CTT

CTT

GAC

GTA

ACA

CCA

1345

Val

Ile

Thr

Gly

Asp 355

Val

Lys

Asp

Val

Val 360

Leu

Leu

Asp

Val

Thr 365

Pro

TTG

TCA

CTT

GGT

ATT

GAA

ACA

ATG

GGT

GGT

GTC

TTC

ACT

AAA

TTG

ATC

1393

Leu

Ser

Leu

Gly 370

Ile

Glu

Thr

Met

Gly 375

Gly

Val

Phe

Thr

Lys 380

Leu

Ile

GAC

CGC

AAC

ACA

ACT

ATC

CCA

ACA

TCT

AAA

TCA

CAA

GTC

TTC

TCA

ACA

1441

Asp

Arg

Asn 385

Thr

Thr

Ile

Pro

Thr 390

Ser

Lys

Ser

Gin

Val 395

Phe

Ser

Thr

GCA

GCA

GAC

AAC

CAA

CCA

GCC

GTT

GAT

ATC

CAT

GTT

CTT

CAA

GGT

GAA

1489

Ala

Ala 400

Asp

Asn

Gin

Pro

Ala 405

Val

Asp

Ile

His

Val 410

Leu

Gin

Gly

Glu

CGC Arg 415	CCA ATG GCA GCA Pro Met Ala Ala	GAT AAC AAA ACA CTC GGT CGC TTC CAA TTG ACT	1537
Asp Asn 420	Lys	Thr Leu	Gly 425	Arg	Phe	Gin	Leu	Thr 430
GAT	ATC CCA GCT GCA	CCT CGT	GGA	ATC CCA	CAA	ATT	GAA	GTA	ACA	TTT	1585
Asp	11· Pro Ala Ala	Pro Arg	Gly	Ile Pro	Gin	Ile	Glu	Val	Thr	Phe
	435			440					445
GAT	ATC GAT AAA AAT	GGT ATT	GTA	TCT GTT	AAA	GCT	AAA	GAT	CTC	GGT	1633
Asp	11· Asp Lys Asn	Gly Ile	Val	Ser Val	Lys	Ala	Lys	Asp	Leu	Gly
	450			455				460
ACT	CAA AAA GAA CAA	CAC ATT	GTT	ATC CAA	TCT	AAT	TCA	GGA	TTA	ACT	1681
Thr	Gin Lys Glu Gin	His Ile	Val	Ile Gin	Ser	Asn	Ser	Gly	Leu	Thr
	465		470				475
GAT	GAA GAA ATT GAT	AAA ATG	ATG	AAA GAT	GCT	GAA	GCA	AAT	GCT	GAA	1729
Asp	Glu Glu Ile Asp	Lys Met	Met	Lys Asp	Ala	Glu	Ala	Asn	Ala	Glu
	480	485				490

111

GCA Ala 495

GAT GCA

AAA Lys

CGT ΑΛΑ GAA GAA GTT GAT CTT AAA AAT GAA GTT GAC

1777

Asp

Ala

Arg Lys Glu 500

Glu

Val

Asp Leu Lys Asn Glu Val Asp

505

510

CAA

GCC

ATC

TTT

GCA

ACA

GAA

AAA

ACT

ATT

AAA

GAA

ACT

GAA

GGC

AAA

1825

Gin

Ala

Ile

Phe

Ala 515

Thr

Glu

Lys

Thr

Ile 520

Lys

Glu

Thr

Glu

Gly 525

Lys

GGT

TTT

GAT

ACA

GAA

CGC

GAT

GCA

GCG

CAA

TCA

GCA

CTT

GAT

GAG

TTG

1873

Gly

Phe

Asp

Thr 530

Glu

Arg

Asp

Ala

Ala 535

Gin

Ser

Ala

Leu

Asp 540

Glu

Leu

AAA

AAA

GCT

CAA

GAA

TCA

GGT

AAC

CTT

GAC

GAC

ATG

AAA

GCT

AAA

CTT

1921

Lys

Lys

Ala S45

Gin

Glu

Ser

Gly

Asn 550

Leu

Asp

Asp

Met

Lys 555

Ala

Lys

Leu

GAA

GCT

CTT

AAC

GAA

AAA

GCA

CAA

GCT

CTT

GCA

GTT

AAA

CTT

TAC

GAA

1969

Glu

Ala 560

Leu

Asn

Glu

Lys

Ala 565

Gin

Ala

Leu

Ala

Val 570

Lys

Leu

Tyr

Glu

CAA

GCG

GCT

GCA

GCA

CAA

CAA

GCA

GCT

CAA

GGG

GCT

GAA

GGT

GCA

CAA

2017

Gin 575

Ala

Ala

Ala

Ala

Gin 5B0

Gin

Ala

Ala

Gin

Gly 585

Ala

Glu

Gly

Ala

Gin S90

TCA

GCT

GAT

TCA

TCA

AGC

AAG

GGT

GAT

GAT

GTT

GTA

GAT

GGC

GAA

TTC

2065

Ser

Ala

Asp

Ser

Ser 595

Ser

Lys

Gly

Asp

Asp 600

Val

Val

Asp

Gly

Glu 605

Phe

ACT GAG AAA TAATTATTAA TATTGTTCAG ATTCATTTGA ATATAAGCAT 2114

Thr Glu Lys

610

GAAAACTATA	CTAGCATAGT AAAGTTCTTC GTGATAGGGA TTGCTCAATA ATCTAGATAA	2174
GTTTCAGATT	ACATAAGCTA ATTTCGCTAT CACTAAATAA AAACATATTA ATAATAAATA	2234
GGCGGGGCGC	CTCGCTCCGT CTGTTTTATT AAGTGTCATA TATATGTTAA CTATTTAGAG	2294
CTGTAACTGG	GCAAGAATAA TTGTTAATCT CTTCAAGTGT AGTATATGAA CAAAATATAA	2354
AGGATTAGAT	AATGAACAAT ACAGAATTTT ATGATCGTCT TGGCGTTTCA AAAGATGCTT	2414
CTCAGGACGA	AATAAAAAAA GCTT	2438

Informace o sekvenci SEQ IB č. 22 /i/ charakteristika sekvence:

,/A/ délka: 60Q aminokyselin /3/ typ: aminokyselina /0/ topologie: lineární /ii/ typ molekuly: protein /xi/ znázornění sekvence SEQ ID č. 22

112

Met 1

Ser

Lys

Ile

Ile S

Gly

Ile

Asp

Leu

Gly 10

Thr

Thr

Asn

Ser

Ala 15

Val

Ala

Val

Leu

Glu 20

Gly

Thr

Glu

Ser

Lys 25

Ile

Ile

Ala

Asn

Pro 30

Glu

Gly

Asn

Arg

Thr 35

Thr

Pro

Ser

Val

Val 40

Ser

Phe

Lys

Asn

Gly 45

Glu

Ile

Ile

Val

Gly Asp 50

Ala

Ala

Lys

Arg 55

Gin

Ala

Val

Thr

Asn 60

Pro

Asp*

Thr

Val

Ile 65

Ser

Ile

Lys

Ser

Lys 70

Met

Gly

Thr

Ser

Glu 75

Lys

Val

Ser

Ala

Asn 80

Gly

Lys

Glu

Tyr

Thr 85

Pro

Gin

Glu

Ile

Ser 90

Ala

Met

Ile

Leu

Gin 95

Tyr

Leu

Lys

Gly

Tyr 100

Ala

Glu

Asp

iyr

Leu 105

Gly

Glu

Lys

Val

Glu 110

Lys

Ala

Val

Ile

Thr 115

Val

Pro

Ala

Tyr

Phe 120

Asn

Asp

Ala

Gin

Arg 125

Gin

Ala

Thr

Lys

Asp 130

Ala

Gly

Lys

Ile

Ala 135

Gly

Leu

Glu

Val

Glu 140

Arg

Ile

Val

Asn

Glu 145

Pro

Thr

Ala

Ala

Ala 150

Leu

Ala

iyr

Gly

Met 1S5

Asp

Lys

Thr

Asp

Lys 160

Asp

Glu.

Lys

Ile

Leu 165

Val

Phe

Asp

Leu

Gly 170

Gly

Gly

Thr

Phe

Asp 175

Val

Ser

Ile

Leu

Glu X80

Leu

Gly

Asp

Gly

Val 185

Phe

Asp

Val

Leu

Ala 190

Thr

Ala

Gly

Asp

Asn 195

Lys

Leu

Gly

Gly

Asp 200

Asp

Phe

Asp

Gin

Lys 205

Ile

Ile

Asp

Phe

Leu 210

Val

Glu

Glu

Phe

Lys 215

Lys

Glu

Asn

Gly

Ile 220

Asp

Leu

Ser

Gin

Asp 225

Lys

Met

Ala

Leu

Gin 230

Arg

Leu

Lys

Asp

Ala 23 S

Ala

Glu

Lys

Ala

Lys 240

Lys

Asp

Leu

Ser

Gly 245

Val

Thr

Gin

Thr

Gin 250

Ile

Ser

Leu

Pro

Phe 255

Ile

Thr

Ala

Gly

Ser 260

Ala

Gly

Pro

Leu

His 265

Leu

Glu

Met

Ser

Leu 270

Ser

Arg

Ala

Lys

Phe 275

Asp

Asp

Leu

Thr

Arg 280

Asp

Leu

Val

Glu

Arg 285

Thr

Lys

Thr

Pro

Val 290

Arg

Gin

Ala

Leu

Ser 295

Asp

Ala

Gly

Leu

Ser 300

Leu

Ser

Glu

Ile

Asp 305

Glu

Val

Ile

Leu

Val 310

Gly

Gly

Ser

Thr

Arg 315

Ile

Pro

Ala

Val

Val 320

Glu

Ala

Val

Lya

Ala 325

Glu

Thr

Gly

Lys

Glu 330

Pro

Asn

Lys

Ser

Val 335

Asn

Pro Asp Glu Val Val Ala Met Gly Ala Ala Ile Gin Gly Gly Val Ile

340 345 350

113

Thr

Gly

Asp 3S5

Val

Lys

Asp

Val

Val 360

Leu

Leu

Asp

Val

Thr 365

Pro

Leu

Ser

Leu

Gly 370

Ile

Glu

Thr

Met

Gly Gly 37S

Val

Phe

Thr

Lys 380

Leu

Ile

Asp

Arg

Asn 385

Thr

Thr

Ile

Pro

Thr 390

Ser

Lys

Ser

Gin

Val 395

Phe

Ser

Thr

Ala

Ala 400

Asp

Asn

Gin

Pro

Ala 405

Val

Asp

Ile

His

Val 410

Leu

Gin

Gly

Glu

Arg 415

Pro

Met

Ala

Ala

Asp 420

Asn

Lys

Thr

Leu

Gly 425

Arg

Phe

Gin

Leu

Thr 430

Asp

Ile

Pro

Ala

Ala 435

Pro

Arg

Gly

Ile

Pro 440

Gin

Ile

Glu

Val

Thr 445

Phe

Asp

Ile

Asp

Lys 450

Asn

Gly

Ile

Val

Ser 455

Val

Lys

Ala

Lys

Asp 460

Leu

Gly

Thr

Gin

Lys ‘465

Glu

Gin

His

Ile

Val 470

Ile

Gin

Ser

Asn

Ser 475

Gly

Leu

Thr

Asp

Glu 480

Glu

Ile

Asp

Lys

Met 485

Met

Lys

Asp

Ala

Glu 490

Ala

Asn

Ala

Glu

Ala 495

Asp

Ala

Lys

Arg

Lys SOO

Glu

Glu

Val

Asp

Leu 505

Lys

Asn

Glu

Val

Asp 510

Gin

Ala

Ile

Phe

Ala 515

Thr

Glu

Lys

Thr

Ile 520

Lys

Glu

Thr

Glu

Gly 525

Lys

Gly

Phe

Asp

Thr 530

Glu

Arg

Asp

Ala

Ala 535

Gin

Ser

Ala

Leu

Asp 540

Glu

Leu

Lys

Lys

Ala S4S

Gin

Glu

Ser

Gly

Asn 550

Leu

Asp

Asp

Met

Lys 555

Ala

Lys

Leu

Glu

Ala 560

Leu

Asn

Glu

Lys

Ala 565

Gin

Ala

Leu

Ala

Val 570

Lys

Leu

Tyr

Glu

Gin S75

Ala

Ala

Ala

Ala

Gin 580

Gin

Ala

Ala

Gin

Glý 585

Ala

Glu

Gly

Ala

Gin 590

Ser

Ala

Asp

Ser

Ser 595

Ser

Lys

Gly

Asp

Asp 600

Val

Val

Asp

Gly

Glu 605

Phe

Thr

Glu

Lys

Informace o sekvenci SEQ ID č. 23 /i/ charakteristika sekvence:

/A/ délka: 19 aminokyselin /B/ typ: aminokyselina /0/ topologie: lineární /ii/ typ molekuly: peptid. /xi/ znázornění sekvence SEQ ID č. 23

Arg Ile Pro Ala Val Val Glu Ala Val Lys Ala Glu Thr Gly Lys Glu

10 15

Pro Asn Lys ’μ' ···· *··* ···· ·· ··

114

Informace o sekvenci SEQ ID č. 24 (i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 15 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (C) topologie: lineární (ii) typ molekuly: peptid (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 24

Gin Thr Ile Val Ile Gin Ser Asn Ser Gly Leu Ihr Asp Glu Glu

10 15

Informace o sekvenci SEQ ID č. 25 (i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 460 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: dvouřetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: DNA (genomová) (iii) hypotetická: není (iv) anti-sense: není (vi) původní zdroj: Streptococcus pneumoniae (ix) rys:

(A) jméno/klíč: CDS (B) poloha: 1..456 (D) další informace: produkt= fragment od 151 zbytku C-konce (C-151) HSP72 (xi) znázorněni sekvence SEQ ID č. 25

115

ATG AAG GCC AAA

GAC CTT GGA ACT CAA AAA GAA CAA ACT ATT GTC ATC ’

48

Met 1

Lys

Ala Lys

Asp S

Leu

Gly

Thr

Gin Lys Glu Gin Thr Ile Val

Ile

10

1S

CAA

TCG

AAC

TCA

GGT

TTG

ACT

GAC

GAA

GAA

ATC

GAC

CGC

ATG

ATC

AAA

96

Gin

Ser

Asn

Ser

Gly

Leu

Thr

Asp

Glu

Glu

Zle

Asp

Arg

Met

Mat

Lys

20

25

30

GAT

GCA

GAA

GCA

AAC

GCT

GAA

TCC

GAT

AAG

AAA

CGT

AAA

GAA

GAA

GTA

144

Asp

Ala

Glu

Ala

Asn

Ala

Glu

Ser

Asp

Lys

Lys

Arg

Lys

Glu

Glu

Val

35

40

45

GAC

CTT

CGT

AAT

GAA

GTG

GAC

CAA

GCA

ATC

TTT

GCG

ACT

GAA

AAG

ACA

192

Asp

Leu

Arg

Asn

Glu

Val

Asp

Gin

Ala

Ile

Phe

Ala

Thr

Glu

Lys

Thr

50

55

60

ATC

AAG

GAA

ACT

GAA

GGT

AAA

GGC

TTC

GAC

GCA

GAA

CGT

GAC

GCT

GCC

240

Ile

Lys

Glu

Thr

Glu

Gly

Lys

Gly

Phe

Asp

Ala

Glu

Arg

Asp

Ala

Ala

65

70

75

80

CAA

GCT

GCC

CTT

GAT

GAC

CTT

AAG

AAA

GCT

CAA

GAA

GAC

AAC

AAC

TTG

288

Gin

Ala

Ala

Leu

Asp

Asp

Leu

Lys

Lys

Ala

Gin

Glu

Asp

Asn

Asn

Leu

85

90

95

GAC

GAC

ATG

AAA

GCA

AAA

CTT

GAA

GCA

TTG

AAC

GAA

AAA

GCT

CAA

GGA

336

Asp

Asp

Met

Lys

Ala

Lys

Leu

Glu

Ala

Leu

Asn

Glu

Lys

Ala

Gin

Gly

100

105

no

CTT

GCT

GTT

AAA

CTC

TAC

GAA

CAA

GCC

GCA

GCA

GCG

CAA

CAA

GCT

CAA

384

Leu

Ala

Val

Lys

Leu

Tyr

Glu

Gin

Ala

Ala

Ala

Ala

Gin

Gin

Ala

Gin

115

120

125

GAA

GGA

GCA

GAA

GGC

GCA

CAA

GCA

ACA

GGA

AAC

GCA

GGC

GAT

GAC

GTC

432

Glu

Gly

Ala

Glu

Gly

Ala

Gin

Ala

Thr

Gly

Asn

Ala

Gly

Asp

Asp

Val

130

135

140

GTA

GAC

GGA

GAG

TTT

ACG

GAA

AAG

TAAG

460

Val

Asp

Gly

Glu

Phe

Thr

Glu

Lys

14S

1S0

Informace o sekvenci SEQ ID č. 26 (i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 152 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (C) topologie: lineární (ii) typ molekuly: peptid (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 26

116

Met Lys Ala Lys Asp Leu Gly Thr Gin Lys Glu Gin Thr Ile Val Ile

1

5

10

15

Gin

Ser

Asn

Ser

Gly

Leu

Thr

Asp

Glu

Glu

Ile

Asp

Arg

Met

Met

Lys

20

25

30

Asp

Ala

Glu

Ala

Asn

Ala

Glu

Ser

Asp

Lys

Lys

Arg

Lys

Glu

Glu

Val

35

40

45

Asp

Leu

Arg

Asn

Glu

Val

Asp

Gin

Ala

Ile

Phe

Ala

Thr

Glu

Lys

Thr

50

55

60

Ile

Lys

Glu

Thr

Glu

Gly

Lys

Gly

Phe

Asp

Ala

Glu

Arg

Asp

Ala

Ala

65

70

75

80

Gin

Ala

Ala

Leu

Asp

Asp

Leu

Lys

Lys

Ala

Gin

Glu

Asp

Asn

Asn

Leu

85

90

95

Asp

Asp

Met

Lys

Ala

Lys

Leu

Glu

Ala

Leu

Asn

Glu

Lys

Ala

Gin

Gly

100

105

110

Leu

Ala

Val

Lys

Leu

Tyr

Glu

Gin

Ala

Ala

Ala

Ala

Gin

Gin

Ala

Gin

115

120

125

Glu

Gly

Ala

Glu

Gly

Ala

Gin

Ala

Thr

Gly

Asn

Ala

Gly Asp

Asp

Val

130

13 5

140

Val

Asp

Gly

Glu

Phe

Thr

Glu

Lys

145 150

7V

PATE

Claims (84)

1. NTOVÉ NÁROKY

   1. Polypeptid vybraný ze skupiny, zahrnující:

   (a) polypeptid HSP72, mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č.: 5;

   (b) polypeptid HSP70(DnaK), mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č.: 20;

   (c) polypeptid HSP70(DnaK), mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č.: 22;

   (d) fragmenty C-terminální části polypeptidů HSP70/72.
2. 2. Polypeptid podle nároku 1, kde fragmenty podle odstavce (d) jsou vybrány ze skupiny, zahrnující aminokyseliny 439 až 607 SEQ ID č. 5 (C-169), aminokyseliny 457 až 607 SEQ ID č. 5 (C-151) , aminokyseliny 527 až 541 SEQ ID č. 5 a aminokyseliny 586 až 600 SEQ ID č. 5.
3. 3. Polypeptid podle nároku 1, mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č. 5, nebo jeho analogy nebo deriváty.
4. 4. Polypeptid podle nároku 1, mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č. 20, nebo jeho analogy nebo deriváty.
5. 5. Polypeptid podle nároku 1, mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č. 22, nebo jeho analogy nebo deriváty.
6. 6. Polypeptid podle nároku 1, mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č. 26, nebo jeho analogy nebo deriváty.
7. 7. Polypeptid podle nároku 1, mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č. 7, nebo jeho analogy nebo deriváty.

   118 • ·
8. 8.

   sekvenci
9. 9.

   sekvenci
10. 10. sekvenci
11. 11.

    sekvenci
12. 12. sekvenci
13. 13 . sekvenci
14. 14. sekvenci
15. 15. sekvenci
16. 16. sekvenci
17. 17.

    sekvenci

    Polypeptid podle nároku 1, mající aminokyselinovou SEQ ID č. 8, nebo jeho analogy nebo deriváty.

    Polypeptid podle nároku 1, mající aminokyselinovou SEQ ID č. 9, nebo jeho analogy nebo deriváty.

    Polypeptid podle nároku 1, mající aminokyselinovou SEQ ID č. 10, nebo jeho analogy nebo deriváty.

    Polypeptid podle nároku 1, mající aminokyselinovou SEQ ID č. 11, nebo jeho analogy nebo deriváty.

    Polypeptid podle nároku 1, mající aminokyselinovou SEQ ID č. 12, nebo jeho analogy nebo deriváty.

    Polypeptid podle nároku 1, mající aminokyselinovou SEQ ID č. 13, nebo jeho analogy nebo deriváty.

    Polypeptid podle nároku 1, mající aminokyselinovou SEQ ID č. 14, nebo jeho analogy nebo deriváty.

    Polypeptid podle nároku 1, mající aminokyselinovou SEQ ID č. 15, nebo jeho analogy nebo deriváty.

    Polypeptid podle nároku 1, mající aminokyselinovou SEQ ID č. 16, nebo jeho analogy nebo deriváty.

    Polypeptid podle nároku 1, mající aminokyselinovou SEQ ID č. 17, nebo jeho analogy nebo deriváty.

    119 • ---• · · • ·· ··
18. 18. Polypeptid podle nároku 1, mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č. 18, nebo jeho analogy nebo deriváty.
19. 19. Polypeptid podle nároku 1, mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č. 23, nebo jeho analogy nebo deriváty.
20. 20. Polypeptid podle nároku 1, mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č. 24, nebo jeho analogy nebo deriváty.
21. 21. Polypeptid podle kteréhokoli z nároků 1 až 20, kde zmíněný polypeptid vyvolává imunitní reakci, která je specifická pro kmeny streptokoků.
22. 22. Polypeptid podle nároku 1, vybraný ze skupiny, zahrnuj ící :

    (a) polypeptid HSP72, mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č. 5, a (b) fragmenty výše uvedeného polypeptidu, bud' samotné nebo v kombinaci s jinými polypeptidy za tvorby fúzního proteinu.
23. 23. Polypeptid podle nároku 22, kde fragmenty podle odstavce (b) jsou vybrány ze skupiny, zahrnující aminokyseliny 439 až 607 SEQ ID č. 5 (C-169), aminokyseliny 527 až 541 SEQ ID č. 5a aminokyseliny 586 až 600 SEQ ID č. 5.
24. 24. Polypeptid podle nároku 22, kde fúzní protein podle odstavce (b) je protein isomeráza fukosy-HSP72 (C-169), mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č. 3.
25. 25. Sekvence DNA, vybraná ze skupiny zahrnující:

    (a) sekvenci DNA HSP72 SEQ ID č. 4;

    (b) sekvenci DNA HSP70 (DnaK) SEQ ID č. 19;

    120 ·· ···· · · ···· • · (c) sekvenci DNA HSP70 (DnaK) SEQ ID č. 21;

    (d) sekvence DNA, které jsou degeneráty k libovolné z výše uvedených sekvencí DNA; a (e) fragmenty libovolné z výše uvedených sekvencí DNA, buď samotné nebo v kombinaci s jinými sekvencemi DNA za tvorby fúzní sekvence DNA.
26. 26. Sekvence

    DNA podle nároku 25, zahrnující sekvenci vzorce SEQ ID č. 4 od nukleotidu 682 do nukleotidu 2502.
27. 27. Sekvence

    DNA podle nároku

    25, zahrnující sekvenci vzorce SEQ ID č. 4 od nukleotidu 1996 do nukleotidu 2502.
28. 28. Sekvence

    DNA podle nároku

    25, zahrnující sekvenci vzorce SEQ ID č. 4 od nukleotidu 2050 do nukleotidu 2502.
29. 29. Sekvence

    DNA podle nároku

    25, zahrnující sekvenci vzorce SEQ ID č. 4 od nukleotidu 2260 do nukleotidu 2304.
30. 30. Sekvence

    DNA podle nároku

    25, zahrnující sekvenci vzorce SEQ ID č. 4 od nukleotidu 2437 do nukleotidu 2481.
31. 31. Sekvence DNA podle nároku 25, zahrnující sekvenci vzorce SEQ ID č. 19 od nukleotidu 204 do nukleotidu 2027.
32. 32. Sekvence DNA podle nároku 25, zahrnující sekvenci vzorce SEQ ID č. 21 od nukleotidu 248 do nukleotidu 2074.
33. 33. Sekvence DNA podle nároku 25, zahrnující sekvenci vzorce SEQ ID č. 25 od nukleotidu 4 do nukleotidu 456.

    121 • · · ·· ···· • · ··· ·
34. 34. Sekvence DNA, kódující polypeptid podle kteréhokoli z nároků 1 až 20.
35. 35. Sekvence DNA podle nároku 25, vybraná ze skupiny zahrnuj ící:

    (a) sekvenci DNA HSP72 SEQ ID č. 4;

    (b) sekvence DNA, které jsou degeneráty k výše uvedené sekvenci DNA; a (c) fragmenty libovolné z výše uvedených sekvencí DNA, buď samotné nebo v kombinaci s jinými sekvencemi DNA za tvorby fúzní sekvence DNA.
36. 36. Sekvenci DNA podle nároku 35, kde fragmenty podle odstavce (c) jsou vybrány ze skupiny, zahrnující nukleotidy 1996 až 2502 (aminokyseliny 439 až 607) SEQ ID č. 4 (C-169) ; nukleotidy 2260 až 2304 (aminokyseliny 527 až 541) SEQ ID č. 4 a nukleotidy 2437 až 2481 (aminokyseliny 586 až 600) SEQ ID č. 4.
37. 37. Sekvence DNA podle nároku 35, kde fúzní sekvence DNA podle odstavce (c) je sekvence DNA isomeráza fukosy-HSP72 (C169) SEQ ID č. 1 (nukleotidy 771 až 2912).
38. 38. Expresní vektor, zahrnující nejméně jednu sekvenci DNA podle nároku 35, operabilně spojenou s promotorem.
39. 39. Rekombinantní molekula DNA, zahrnující sekvenci DNA podle kteréhokoli z nároků 25 až 34 a jednu nebo více sekvencí, které řídí expresi, operabilně spojených se sekvencí DNA.

    122

    40. Rekombinantní molekula DNA podle nároku 39, kde zmíněná sekvence řídící expresi je indukovatelný expresní vektor. 41. Rekombinantní molekula podle nároku 4 0, kde zmíněný expresní vektor obsahuje promotor λ PL.
40. 42. Rekombinantní molekula podle nároku 39 obsahující plazmid, který je vybrán za skupiny zahrnující: pURV3, pURV4, pURV5, pURV6, pJBD291, pJBDÁ4, pJBDk51, pJBD177, pJBD171, pJBD177, pJBD179, pJBDÁl, pJBDf51 a pJBDf62.
41. 43. Jednobuněčný hostitel, transformovaný expresním vektorem podle nároku 38.
42. 44. Jednobuněčný hostitel, transformovaný rekombinantní molekulou DNA podle nároku 39.
43. 45. Jednobuněčný hostitel podle nároku 44, vyznačující se tím, že je vybrán ze skupiny zahrnující E.coli kmeny XLI Blue MRF^X, W3110, JM109, Y1090 a BL21(DE3).
44. 46. Způsob výroby polypeptidu nebo jeho fragmentu, vyznačující se tím, že zahrnuje kultivaci jednobuněčného hostitele podle kteréhokoli z nároků 43 až 45 a izolaci zmíněného polypeptidu nebo fragmentu.
45. 47. Polypeptid v podstatě v čisté formě, získaný způsobem podle nároku 46.

    123,
46. 48. Protilátka nebo její fragment, která se specificky váže na polypeptid podle kteréhokoli z nároků 1 až 20.
47. 49. Protilátka nebo její fragment, která se specificky váže na epitop, jejž rozeznává monoklonální protilátka FlPn3.1.
48. 50. Protilátka nebo fragment podle nároku 48, kterou je monoklonální protilátkou.
49. 51. Monoklonální protilátka nebo fragment podle nároku 57, která je myšího původu.
50. 52. Monoklonální protilátka nebo fragment podle nároku 51, která je typu IgG.
51. 53. Monoklonální protilátka Fl-Pn3.1.
52. 54. Způsob izolace protilátky podle nároku 48, vyznačující se tím, že zahrnuje:

    (a) zavedení preparátu polypeptidu podle kteréhokoli

    z nároků 1 až 20 do savce; a (b) izolaci séra ze savce, obsahuj ícího zmíněnou protilátku. 55. Způsob izolace monoklonální protilátky podle nároku 50, vyznač ující s e tím, ž e zahrnuj e:

    (a) zavedení preparátu polypeptidu podle kteréhokoli z nároků 1 až 20 do savčích buněk produkujících protilátku;

    (b) fúzování buněk produkujících protilátku s buňkami myelomu za tvorby buněk hybridomu; a

    124 (c) izolaci zmíněné monoklonální protilátky z buněk hybridomu.

    56.

    Farmaceut ická kompozice, vyznačuj ící se tím, že zahrnuje polypeptid podle kteréhokoli z nároků 1 až 20.

    57.

    Farmaceutická kompozice podle nároku 56, vyznačující se tím, že se jedná o vakcínu.

    58.

    Farmaceutická kompozice podle nároku
53. 56, vyznačuj ící se tím, že dále zahrnuje jeden nebo více farmaceuticky přijatelných excipientú.

    59.

    Farmaceutická kompozice, vyznačuj ící se tím, ž e zahrnuje jednu nebo více protilátek nebo jejich fragmentů podle nároku 48.

    60.

    Farmaceutická kompozice podle nároku
54. 59, vyznačující se tím, že se jedná o vakcínu.

    61.

    Farmaceutická kompozice podle nároku 6 0, vyznačující se tím, dále zahrnuj e farmaceuticky přijatelný excipient.

    62. Farmaceutická kompozice podle nároku 60 nebo 61, v y z n a č u j ící se t í m, ž e protilátka je Fl-Pn3.1. 63. Způsob prevence infekce pacienta, způsobené Streptococcus pneumoniae nebo příbuznými bakteriemi, v y z n a č u j ící se t í m, ž e zahrnuj e podání

    125 farmaceuticky přijatelného množství vakcíny podle nároku 57, 60 nebo 61.
55. 64. Způsob prevence infekce pacienta, způsobené Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes nebo Streptococcus agalactiae, vyznačuj ící se tím, že zahrnuje podání farmaceuticky přijatelného množství vakcíny podle nároku 57, 60 nebo 61.
56. 65. Způsob léčby pacienta, infikovaného nebo s podezřením na infekci Streptococcus pneumoniae nebo příbuznými bakteriemi, vyznačující se tím, že zahrnuje podání farmaceuticky účinného množství vakcíny podle nároku 60 nebo 61.
57. 66.

    Způsob detekce

    Streptococcus pneumoniae nebo příbuzných bakterií biologickém vzorku, vyznačující se tím, ž e zahrnuj e:

    (a) inkubaci protilátky nebo fragmentu podle nároku 48 s biologickým vzorkem za tvorby směsi; a (b) detekci ve směsi specificky vázané protilátky nebo fragmentu, což ukazuje přítomnost Streptococcus pneumoniae nebo příbuzných bakterií.

    67. Způsob podle nároku 74, v y z n a č u j ící se tím, že protilátka je Fl-Pn3.1. 68. Způsob detekce protilátek specifických pro

    Streptococcus pneumoniae nebo příbuzné bakterie v biologickém vzorku, vyznačující se tím, že zahrnuje:

    (a) inkubaci polypeptidů podle nároku 2 nebo 22 s biologickým vzorkem za tvorby směsi; a • · • · · ·

    126 •· · •· •· •· · (b) detekci ve směsi specificky vázaného polypeptidu, což ukazuje přítomnost protilátek specifických pro Streptococcus pneumoniae nebo příbuzné bakterie.
58. 69. Způsob detekce Streptococcus pneumoniae nebo příbuzných bakterií v biologickém vzorku, vyznačující se tím, že zahrnuje:

    (a) inkubaci sondy DNA, mající sekvenci DNA podle nároku 35, s biologickým vzorkem za tvorby směsi; a (b) detekci ve směsi specificky vázané sondy DNA, což ukazuje přítomnost Streptococcus pneumoniae a příbuzných bakterií.
59. 70. Způsob podle nároku 69, vyznačuj ící se tím, že sonda DNA je oligomer, mající sekvenci komplementární k alespoň asi šesti sousedícím nukleotidům sekvence DNA podle nároku 35.
60. 71. Způsob podle nároku 70, vyznačuj ící se tím, že dále zahrnuje:

    (a) poskytnutí sady oligomerú, které jsou primery při polymerázové reakci a které lemují cílovou oblast; a (b) amplifikaci cílové oblasti pomocí polymerázové reakce.
61. 72. Způsob detekce Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes nebo Streptococcus agalactiae v biologickém vzorku, vyznačující se tím, že zahrnuje:

    (a) inkubaci protilátky nebo fragmentu podle nároku 48 s biologickým vzorkem za tvorby směsi; a (b) detekci ve směsi specificky vázané protilátky nebo fragmentu, což indikuje přítomnost Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes nebo Streptococcus agalactiae.

    φφφ φ

    127 • Φ φ* φ φ
62. 73. Způsob detekce protilátek specifických pro

    Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes nebo

    Streptococcus agalactiae v biologickém vzorku, vyznačuj í c í se t í m, že zahrnuje: (a) inkubaci polypeptidu podle nároku 1 nebo 21 s biologickým vzorkem za tvorby směsi; a

    (b) detekci ve směsi specificky vázaného polypeptidu, což indikuje přítomnost protilátek specifických pro Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes nebo Streptococcus agalactiae.
63. 74. Způsob detekce Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes nebo Streptococcus agalactiae v biologickém vzorku, vyznačující se tím, že zahrnuje:

    (a) inkubaci sondy DNA, mající sekvenci DNA podle nároku 25 nebo 34, s biologickým vzorkem za tvorby směsi; a (b) detekci ve směsi specificky vázané sondy DNA, což ukazuje přítomnost Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes nebo Streptococcus agalactiae.
64. 75.

    Způsob podle nároku

    74, vyznačuj ící se tím, že sonda DNA je komplementární s alespoň asi oligomer, mající šesti sousedícími sekvenci nukleotidy sekvence DNA podle nároku

    25 nebo 34.
65. 76. Způsob podle nároku 75, vyznačující se tím, že dále zahrnuje (a) poskytnutí sady oligomerů, které jsou primery při polymerázové reakci a které lemují cílovou sekvenci; a (b) amplifikaci cílové oblasti pomocí polymerázové reakce.

    128 • · ·· · · · · · · · · ·· · · · ··· ·· ····< ·· ···· ♦· ··
66. 77. Použití polypeptidu podle nároku 1 nebo 21 pro profylaktické, diagnostické, imunoterapeutické nebo terapeutické účely.
67. 78. Použití farmaceuticky účinného množství polypeptidu podle nároku 1 nebo 21 pro prevenci streptokokové infekce u lidí.
68. 79. Použití polypeptidu podle nároku 1 nebo 21 pro výrobu léčiva pro prevenci streptokokové infekce u lidí.
69. 80. Použití polypeptidu podle nároku 1 nebo 21 pro výrobu vakcíny pro prevenci streptokokové infekce u lidí.
70. 81. Použití polypeptidu podle nároku 1 nebo 21 pro výrobu soupravy pro detekci a diagnózu streptokokové infekce u lidí.
71. 82. Použití způsobu podle nároku 46 pro výrobu vakcíny pro prevenci streptokokové infekce u lidí.
72. 83. Použití způsobu podle nároku 46 pro výrobu soupravy pro detekci a diagnózu streptokokové infekce u lidí.
73. 84. Použití protilátky podle nároku 48 nebo 53 pro výrobu léčiva pro profylaktické, diagnostické, imunoterapeutické nebo terapeutické účely.
74. 85. Použití farmaceuticky účinného množství protilátky podle nároku 48 nebo 53 pro prevenci streptokokové infekce u lidí.

    129 φ Φ • Φ •φ φφφφ φφ · · · φ
75. 86. Použití protilátky podle nároku nebo 53 pro výrobu léčiva pro prevenci streptokokové infekce lidí.
76. 87.

    Použití protilátky podle nároku nebo 53 pro výrobu vakcíny pro prevenci streptokokové infekce u lidí.
77. 88.

    Použití protilátky podle nároku 48 nebo 53 pro výrobu soupravy pro detekci a diagnózu streptokokové infekce u lidí.
78. 89. Použití způsobu podle nároku 54 nebo 55 pro výrobu vakcíny pro prevenci streptokokové infekce u lidí.
79. 90. Použití způsobu podle nároku 54 nebo 55 pro výrobu soupravy pro detekci a diagnózu streptokokové infekce u lidí.
80. 91. Použití farmaceuticky účinného množství protilátky podle nároku 48 nebo 53 pro léčbu streptokokové infekce u lidí.
81. 92. Použití protilátky podle nároku 48 nebo 53 pro výrobu léčiva pro léčbu streptokokové infekce u lidí.
82. 93. Použití sekvence DNA podle kteréhokoli z nároků 25 až 34 pro profylaktické, diagnostické, imunoterapeutické nebo terapeutické účely.
83. 94. Použití sekvence DNA podle kteréhokoli z nároků 25 až 34 pro výrobu soupravy pro detekci a diagnózu streptokokové infekce u lidí.
84. 95. Použití podle kteréhokoli z nároků 77 až 94, kde uvedená streptokoková infekce je způsobena organismy ···· · ··· ···· • · · · · · · · · · • · · ·· · · · ···· · • · · · · · ··· ···· ·· ···· ·· ' ··

    130

    Streptococcus

    Streptococcus pneumoniae,

    Streptococcus pyogenes nebo agalactiae.