CZ400497A3

CZ400497A3 - Nová pesticidní substance Bacillus thuringiensis

Info

Publication number: CZ400497A3
Application number: CZ974004A
Authority: CZ
Inventors: Denise C. Manker; Chi-Li Liu; Anita M. Macmullan
Original assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1995-06-27
Filing date: 1996-06-27
Publication date: 1998-06-17
Also published as: JPH11508446A; JP3755895B2; PL324167A1; ATE232046T1; ES2191761T3; RU2185064C2; EP0837634B1; KR19990028455A; AU707228B2; WO1997001282A1; HUP9802530A3; HUP9802530A2; CA2225565A1; AU6397896A; EP0837634A1; DE69626113D1; DE69626113T2; MX9710402A; CA2225565C

Description

Nová pesticidní substance Bacillufthuringiensis

Oblast techniky

Vynález se týká nové substance, která má pesticidní účinnost zejména vůči škůdcům řádu Coleoptera. Vynález se dále týká pesticidních komposicí obsahujících substanci, právě tak jako způsobů použiti komposicí pro potírání škůdce.

Dosavadní stav techniky

Bacillus thuringiensis je pohyblivá, tyčinkovitá, gram-positivní bakterie, která je v přírodě široce rozšířená.

Bacillus thuringiensis vytváří během sporulace paraspory ve formě krystalických inklusí, které jsou po požití insekticidní pro citlivé hmyzí larvy řádu

Lepidoptera,

Diptera a Coleoptera. Inkluse se mohou lišit v tvaru, počtu a složení. Jsou tvořeny jedním nebo více proteiny nazývanými delta-endotoxiny, jejichž velikost se může pohybovat mezi 27 až 140 kDa. Insekticidní delta-endotoxiny jsou obvykle ve vnitřnostech larev proteázami přeměněny na menší (zkrácené) toxické polypeptidy způsobující destrukci vyživovacího kanálu a konečně uhynutí hmyzu.

Krystalické delta-endotoxiny Bacillu thuringiensis jsou nej častěji užívanými biopesticidy. Existují některé kmeny Bacillu thuringiensis, které se užívají jako producenti krystalických delta-endotoxinů v lesnictví, zemědělství a oblastech obecného zdraví. Bacillus thuringiensis subsp.

kurstaki a Bacillus thuringiensis subsp. aizawai produkují delta-endotoxiny specifické pro Lepidoptera, Delta-endotoxin specifický pro Coleoptera produkuje Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis. Dále Bacillus thuringiensis subsp.

pro bylo

israelensis

Diptera. O produkuje delta-endotoxiny specifické jiných kmenech Bacillu thuringiensis publikováno, že produkují delta-endotoxiny pesticidní vůči hlíštičím, Acari, Hymenoptera, Phthiraptera, Platyhelmínthes ;

Homoptera, Blattodea a Protozoa.

Je rovněž známo, že Bacillus thuringiensis produkuje i jiné, ve vodě rozpustné molekuly, které jsou pesticidní. Několik kmenů Bacillu thuringiensis například produkuje tepelně stálý pesticidní analog adenin nukleotidu, známý jako beta-exotoxin neboli thuringiensin (Šebesta a spol., v H.D. Burges [editor], Microbial Control of Pests and Plant diseases, Academie Press, New York, str. 249-281, 1981). Beta-exotoxin má molekulovou hmotnost 789- a skládá se z adenosinu, glukosy a allarové kyseliny (Lůthy a spol., v Kurstak [editor], Microbial and Viral Pesticides, Marcel

Dekker, New York, 1982, str. 35-72). Okruh jeho hostitelů zahrnuje, ale není omezen na: Musea domestica, Marné stra configurata Valker, Tetranychus urticae, Drosophila melanogaster a Tetranychus cinnabarinus. Beta-exotoxin může být klasifikován jako typ I nebo beta-exotoxin typu II (Levinson a spol.,

1990, J. Bacteriol. 172:3172-3179).

Zjistilo se, že beta-exotoxin typu I produkuje Bacillus thuringiensis thuringiensis subsp. thuringiensis serotyp 1, Bacillus subsp. tolworthi serotyp 9 a Bacillus thuringiensis subsp. darmstadiensis serotyp 10. Zjistilo se, že beta-exotoxin typu II subsp. morrisoni serotyp Leptinotarsa decemlineata. látky, které byly isolovány produkuje Bacillus thuringiensis 8ab, a že je účinný proti Mezi další ve vodě rozpustné z Bacillus thuringiensis, patří alfa-exotoxin, který je toxický pro larvy Musea domestica (Luthy, 1980, FEMS Microbiol. Lett. 8:1-7); gamma-exotoxiny, což jsou různé enzymy zahrnující lecithinázy, chitinázy a proteázy, jejichž toxické účinky se projevují pouze ve

spojení s beta-endotoxinem nebo delta-endotoxinem (Forsberg a spol., 1976, Bacillus thuringiensis: Its Effects on Environmental Quality, Natíonal Research Council of Canada, NRC Associate Committee on Scientific Criteria for Environmental Quality, Subcommittees on Pesticides and Related Compounds and Biological Phenomena); sigma-exotoxin, který má podobnou strukturu jako beta-exotoxin a je také účinný proti Leptinotarsa decemlineata (Argauer a spol., 1991, J. Entomol. Sci. 26:206-213); a anhydrothuríngiensin (Coli. Czechoslovak Chem. Comm. 40,1775,1975).

Stonard a spol. (1994, v Natural and Engineered Pěst Management Agents, Paul A. mann, Robert M. Hollingworth, editors, Američan Chemical Society, Washington, D.C., str. 25 - 36) popsali diabrocitiny se strukturou

1. R, R·^, ^2⁼^· θΗ Diabroticin A

2. R, R^, R2< R^= H Diabroticin B

Diabroticiny byly isolovány z Bacillus subtilis a jsou účinné proti Diabrotica undecimpunctata, Leptinotarsa decemlineata, Anthomus grandis Boheman, larvám moskytů, Staphylococcus aureus a Micrococcus lutea, nejsou však účinné vůči • · · * . —

pilousům, Escherichia coli, Bacillus subtilis a Pseudomonas aeruginosa. Účinnost vůči jiným škůdcům ' Stonard a spol. nepopsali. Diabrocitin A byl rovněž isolován z fermentační kultury Bacillu cereus.

Bylo vyvíjeno úsilí identifikovat nové biopesticidy k náhradě pesticidů chemických, které jsou škodlivé pro prostředí anebo pesticidně neefektivní vzhledem k tomu, že se u určitého škůdce vyvine resitence vůči pesticidu.

Předmětem předkládaného vynálezu je získání nové substance s pesticidní účinností vůči hmyzím škůdcům řádu Coleoptera.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká nové substance získané ze supernatantu živné kultury kmene Bacillus, kde substance je účinná proti hmyzím škůdcům řádu Coleoptera; v NMR spektru má chemické posuny δ kolem 5,17 (d, 1H), 4,48 (d, 1H), 4,1 (m, 1H), 4,0 (dd, 1H), 3,92 (d, 1H), 3,85 (m, 2H), 3,80 (m, 1H), 3,65 (m, 1H), 3,50 (m, 1H), 3,36 (m, 1H), 3,1 (dd, 1H) , 2,8 (m, 1H) , 1,27 (d, 3H) , 1,19 (m, 3-4H); má 12 uhlíků a koncovou UV absorpci. Substance podle tohoto vynálezu může například spolu s různými pesticidy souvisejícími s kmenem Bacillus, působit proti škůdci také jako potenciátor nebo synergisující složka. Vynález se také substance množství množství substance kmenem.

Vynález se zahrnuj ící mutantu, (b) pěstování mutovaného vztahuje na mutánt produkované produkované dále týká (a) ošetření kmene kmene Bacillus, kde mutantem je větší, než odpovídajícím mateřským způsobů získání takového kmene Bacillus mutagenem; Bacillus podle stupně (a) v prostředí vhodném pro selekci kmene mutantu; (c) selekci kmene mutantu získaného ve stupni (b) na základě zvýšené produkce substance.

Předkládaný vynález se také týká způsobu získání podstatně čisté substance podle tohoto vynálezu spočívajícím na (a) kultivaci kmene Bacillus za vhodných podmínek; (b) odebrání supernatantu kultury, kmene Bacillus ze stupně (a) a (c) isolaci substance ze supernatantu podle stupně (b) , aby se získala podstatně čistá substance.

Předkládaný vynález se dále týká pesticidních kompozicí zahrnujících substanci a pesticidní nosič, právě tak jako substanci a pesticid související s kmenem Bacillus, chemický pesticid a/nebo entomopathogenní virus a stejně tak způsobů používání pesticidních kompozicí k potírání škůdce.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 představuje NMR spektrum substance podle tohoto vynálezu.

A

Obrázek 2 představuje NMR spektrum substance podle tohoto vynálezu.

Předkládaný vynález je zaměřen na substanci, která má pesticidní účinnost zejména proti hmyzím škůdcům řádu Coleoptera. Pesticidní účinnost je zde definována jako míra velikosti účinku substance podle vynálezu proti škůdci při jeho zahubení, nebo při zabránění jeho růstu, anebo při ochraně rostliny před zamořením škůdcem. V typickém případě má substance podle předkládaného vynálezu molekulovou hmotnost v rozmezí kolem 250 až kolem 500; v H NMR spektru má chemické posuny 5 kolem 5,17 (d, 1H) , 4,48 (d, 1H) , 4,1 (m, 1H), 4,0 (dd, 1H), 3,92 (d, 1H), 3,85 (m, 2H), 3,80 (m,. 1H), 3,65 (m, 1H), 3,50 (m, 1H), 3,36 (m, 1H), 3,1 (dd, 1H) ,

2,8 (m, 1H), 1,27 (d, 3H), 1,19 (m, 3-4H); má 12 uhlíků s chemickými posuny v NMR spektru kolem δ 97,8, 92,5,

71,1, 68,1, 67,8, 63,6, 57,8, 54,7, 52,9, 52,3 a 19,7; a má

-í—'i-.— • · · ·' ··· ·*· ,

8' • · «·· koncovou UV absorpci. V dalším specifickém provedení je substance podle předkládaného vynálezu rozpustná ve vodě.

Pesticidní účinnost substance proti hmyzím škůdcům může být stanovena v oboru známými postupy jako je podáváni umělé hmyzí výživy, překrývání umělé výživy, natírání listu, namáčeni listu a postřik listu.

Ve specifickém provedení má substance podle předkládaného vynálezu pesticidní účinnost proti hmyzím škůdcům řádu Coleoptera. Konkrétně má substance podle předkládaného vynálezu pesticidní účinek proti hmyzímu škůdci rodu Diabrotica řádu Coleoptera. Zejména má substance podle vynálezu pesticidní účinek proti Diabrotica undecimpunciata řádu Coleoptera.

Substance podle předkládaného vynálezu může být získána z kapaliny nad živnou půdou při fermentaci kmene Bacillus. Ve specifickém provedení se substance podle předkládaného vynálezu získává ze supernatantu fermentace kmene Bacillus thuringiensis. Zejména se substance podle vynálezu se získává ze sueprnatantu fermentace kmene Bacillus thuringiensis EMCC-0080, který má identifikační charakteristiku NRRL B-21093, nebo jeho mutantů, které mají tytéž vlastnosti jako EMCC-0080 a které jsou popsány v přihláškách č. 08/212,462 a č. 08/404,016, které jsou zde citovány.

Předkládaný vynález se také týká mutantu kmene Bacillus, kde množství substance, kterou mutant produkuje, je větší než množství substance, kterou produkuje odpovídající mateřský kmen. Předkládaný vynález se týká dále způsobů získávání takového mutantu. Jak je zde definováno, mateřský kmen je původní kmen Bacillus před mutagenesí, která ke zmutovanému kmenu vede.

V jednom provedení se substance podle vynálezu získává z mutantu kmene Bacillus, zejména kmene Bacillus thuringiensis, kde substance je produkována ve větším

7.

množství než je množství produkované odpovídajícím mateřským kmenem. Pro získání takových mutantů může být například mateřský kmen ošetřen mutagenem na základě chemických prostředků jako jsou N-methyl-N -nitro-N-nitrosoguanidin, nebo methansulfonan ethylnatý,. nebo ozářením gamma-paprsky, X-paprsky čí UV-zářením. Jeden z typických způsobů mutace kmene Bacillus a selekce takového mutantu, představuje následuj ící postup:

i) mateřský kmen je ošetřen mutagenem;

ii) předpokládané mutanty se kultivují v mediu vhodném pro selekci kmene mutantu; a iii) kmen mutantu se vybere na základě zvýšené produkce substance podle předkládaného vynálezu.

Podle preferovaného provedení této metody še vybrané kolonie pěstují v normálním produkčním mediu a provede se finální výběr takových mutantů.

Bacillus thuringiensis může být kultivován za použití medií a fermentačních technik, které jsou v oboru běžné (viz například Rogoff a spol., 1969, Jounal of Invertebrate Pathology 14:122-129; Dulmage a spol., 1971, Journal of Invertebrate Pathology 18:353-358; Dulmage a spol., v Microbial Control of Pests and Plant Diseases, H.D. Burges, editor, Academie Press, N.Y., 1980). Po dokončení fermentačního cyklu může být kapalina nad kulturou získána po oddělení spor Bacillu thuringiensis a krystalů z fermentační živné směsi v oboru dobře známými prostředky, jako je centrifugování a/nebo ultrafiltrace. Substance podle předkládaného vynálezu je obsažena v kapalině nad kulturou a může být získána v oboru dobře známými způsoby, například ultrafiItraci, odpařením nebo sušením rozprašováním.

Předkládaný vynález se také týká způsobu pro získání podstatně čisté substance podle předkládaného vynálezu. Podstatně čistá substance jezde definována jako substance, • · která obsahuje méně než 5 %

kontaminantů, například protein delta-endotoxinu. Čistění substance různými v oboru známými procedurami, může být provedeno včetně, nikoliv však pouze, chromatografických (například iontoměniče, afinitní a rozdělovači sloupcová chromatografie), elektroforetických procedur, diferenční rozpustnosti, extrakce, anebo jakýmíkoliv standardními technikami známými v oboru (viz například Protein Purification, editoři J-C. Janson a Lars

Ryden, VCH Publishers, New York, 1989). Jednu z metod pro získání podstatně čisté substance podle předkládaného vynálezu představuje následující postup:

(i) kultivace kmene Bacillus za vhodných podmínek;

(ii) odebrání kapaliny nad kulturou kmene Bacillus a (iii) isolace substance z kapaliny nad kulturou kmene Bacillus a získání podstatně čisté substance.

Předkládaný vynález se dále týká pesticidních kompozicí, které obsahují substanci v množství účinném pro hubení škůdce a nosič pesticidu. Účinné množství se zde definuje jako množství substance, které je dostatečné pro zahubení škůdce usmrcením, pro zakrnění růstu škůdce nebo pro ochranu rostliny před zamořením škůdcem. Pesticidní kompozice mohou obsahovat substanci podle tohoto vynálezu v podstatně čisté formě nebo jako kapalný podíl z celkové kultivační směsi kmene Bacillus ve vysušené, koncentrované, nebo kapalné formě a vhodný nosič pesticidu, jehož příklady se uvádějí níže. Substance je v kompozici v koncentraci od asi 0,001 % do asi 60 % hmotnostních.

Pesticidní kompozice podle předkládaného vynálezu mohou dále obsahovat depoziční činidlo, které napomáhá, aby kompozice nebyla unášena z cílového prostoru během aplikace (například, je-li rozprašována z letadla), anebo aby nebyla odváta z rostliny, pokud již na ni byla deponována. Jako depoziční činidlo v kompozicích podle předkládaného vynálezu i

......““ —-	* ·	• «	•
9 : : · ·»* ···	» · • « • · · ····	· — ··« • •	«

bývá preferován bílkovinný materiál, který má navíc tu přednost, že je stravitelný pro hmyz. Pro tento účel se hodí jakýkoliv živočišný nebo rostlinný protein v suché nebo kapalné formě. Příklady užitečných zdrojů proteinu, který může být příhodně a ekonomicky přidáván do kompozice představují, avšak neomezují se na: bílkovinu sóji, bílkovinu brambor, sojovou moučku, bramborovou moučku, rybí moučku, kostní moučku, extrakt z kvasnic a krevní moučku. Alternativní depoziční činidla představuje modifikovaná celulosa (karboxymethylcelulosa), rostlinný materiál (rozemleté zrní, semena, stébla), křemičitany (mastek, vermikulit, rozsivková zemina), přírodní hlíny (attapulgit, bentonit, kaolinit, montmorillonit) i syntetické hlíny (Laponite). Pokud je užito, je v pesticidní směsi podle tohoto vynálezu depoziční činidlo přítomno v množství mezi cca 0,4 % a cca 50 % hmotnostních, výhodně pak mezi cca 1 % a cca 20 % hmotnostních.

Pesticidní kompozice podle předkládaného vynálezu může dále obsahovat nemrznoucí a zvlhčovači činidlo, které snižuje teplotu zmrznutí produktu a pomáhá minimalisovat odpařování při rozprašování, a které udržuje texturu depositu a činí produkt účinnější a stravitelnější. Příklady nemrznoucího a zvlhčovacího činidla představuji, avšak neomezují se na: ethylenglykol, propylenglykol, dipropylenglykol, glycerol, butylenglykoly, pentylenglykoly a hexylenglykoly. Pokud je užito, je nemrznoucí a zvlhčovači činidlo přítomno ve směsi podle předkládaného vynálezu v množství mezi cca 0,5 % a cca 25 % hmotnostních, výhodně pak mezi asi 2 % a asi 15 % hmotnostních.

Pesticidní kompozice podle předkládaného vynálezu mohou dále obsahovat povrchově aktivní činidlo v množství, ve kterém působí jako emulgační, zvlhčovači a dispergačni činidlo. Příklady takových povrchově aktivních činidel jsou

anionaktivní sloučeniny jako karboxyláty, například kovové soli mastných kyselin o dlouhém řetězci; N-acylsarkosináty; mono- nebo diestery fosforečné kyseliny s ethoxyláty mastných alkoholů či soli takových esterů; sulfáty mastných alkoholů jako dodecylsíran sodný, oktadecylsíran sodný nebo cetylsíran sodný; sulfáty ethoxylovaných mastných alkoholů; sulfáty ethoxylovaných alkylfenolů; ligninsulfonáty; ropné sulfonáty; alkylarylsulfonáty jako alkylbenzensulfonáty, nebo nižší alkylnaftalensulfonáty, například butylnaftalensulfonát; soli sulfonovaných kondensačních produktů naftalenu a formaldehydu; soli sulfonovaných kondensačních produktů fenolu a formaldehydu; nebo složitější sulfonáty jako amidsulfonáty, například sulfonovaný kondensační produkt olejové kyseliny a N-methyltaurínu nebo dialkyl sulfosukcináty, například dioktyl sulfosukcínát sodný. Dalšími příklady takových povrchově aktivních činidel jsou neionogenní činidla jako kondensační produkty ethylenoxidu a esterů mastných alkoholů, mastných alkoholů, amidů mastných kyselin, nebo alkyl- čí alkenylfenolů s mastnými alkyly či alkenyly, blokové kopolymery ethylenoxidu a propylenoxidu, acetylenické glykoly jako 2,4,7,9-tetraethyl-5decin-4,7-diol, nebo ethoxylované acetylenické glykoly. Dalšími příklady takových povrchově aktivních činidel jsou kationaktívní povrchově aktivní činidla, například alifatické mono-, di- nebo polyaminy ve formě acetátů, naftenátů nebo oleátů, dále kyslík obsahující aminy jako aminoxid polyoxyethylenalkylaminu, potom amidovými skupinami seřetězený amin, získaný kondensaci karboxylové kyseliny s di- či polyaminem anebo kvarterní amoniové soli. Pokud se používá, je povrchově aktivní činidlo ve směsi přítomno v množství mezi cca 0,5 % a cca 25 % hmotnostních, výhodně pak mezi cca 1 % a cca 8 % hmotnostních.

Pesticidní kompozice podle předkládaného vynálezu mohou »· · · • · • Φ · · • · dále obsahovat inertní materiál, zahrnuj i kaolin, uhličitany, materiály botanické kukuřičné a skořápky materiály umělé fosforečnany, škroby nebo cykloďextriny,

Příklady inertních i jako rozsivkovou hnoj ivo, dále materiálů l zeminu, ,fylosilikáty, i organické anebo anorganické slídu, sádru, sírany nebo j ako cukry, materiály jako lesní produkty, korek, rozemleté palice, rýžové slupky, slupky burských oříšků vlašských ořechů.

Pesticidní kompozice podle předkládaného vynálezu mohou dále obsahovat ochranný prostředek, chuťový stimulant, kapsulační činidlo, plnidlo, barvivo, ochranu záření, pufr, zkapalňující činidlo nebo jiné atraktant, proti UV komponenty, které usnadňují manipulaci a aplikaci zaměřenou na určité škůdce.

Pesticidní kompozice podle předkládaného vynálezu mohou obsahovat pesticid související s kmenem Bacillus, : thuringiensis. Biopesticid být například odvozen, ale thuringiensis subsp. aizawai, alesti, Bacillus thuringiensis thuringiensis subsp. colmeri, subsp. coreanensis, Bacillus Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis subsp. dendrolimus > subsp. entomocidus, dále obsahovat pesticid zejména biopesticid Bacillu Bacillu thuringiensis může neomezuje se na Bacillus Bacillus thuringiensis subsp. subsp. canadiensis, Bacillus Bacillus thuringiensis thuringiensis subsp. dakota, darmstadiensis, Bacillus Bacillus thuringiensis subsp. entomocidus, Bacillus thuringiensis subsp, finitimus, Bacillus thuringiensis subsp. galleriae, Bacillus thuringiensis subsp. indiana, Bacillus thuringiensis subsp. israelensis, Bacillus thuringiensis subsp. kenyae, Bacillus thuringiensis subsp. kumamotoensis, Bacillus subsp. thuringiensis subsp. kurstaki, Bacillus thuringiensis subsp. kyushuensis, Bacillus thuringiensis subsp. japonensis, Bacillus thuringiensis subsp.

mexicanensis, Bacillus thuringiensis subsp. morrisoni, • *t «

Λ ·

Bacillus thuringiénsis subsp. neoleonensis, Bacillus thuringiensis subsp. nigeriae, Bacillus thuringiénsis subsp. ostriniae, Bacillus thuringiénsis subsp. pakistani, Bacillus thuringiénsis subsp. pondicheriensis, Bacillus thuringiénsis subsp. shandongiensis, Bacillus thuringiénsis subsp. silo, Bacillus thuringiénsis subsp. sotto, Bacillus thuringiénsis subsp. subtoxicus, Bacillus thuringiénsis subsp. tenebrionis, Bacillus thuringiensis subsp. thompsoni, Bacillus thuringiénsis subsp. tochigiensis, Bacillus thuringiensis subsp. tohokuensis, Bacillus thuringiensis subsp. tolworthi, Bacillus thuringiensis subsp. toumanoffi, Bacillus thuringiensis subsp. wuhanensis, nebo Bacillus thuringiensis subsp. yunnanensis. V závislosti na doporučené dávce pro formulaci biopesticidniho produktu Bacillu' thuringiensis může být substance podle předkládaného vynálezu kombinována s produktem Bacillu thuringiensis buď v mísícím tanku nebo ve zformulovaném produktu.

Biopesticid Bacillu thuringiensis, to jest protein delta-endotoxinu nebo jeho pesticidně účinného fragmentu může být volen ze skupiny, avšak neomezuje se na Cryl, CrylI, CrylII, CrylV, CryV a Cry VI. Přesněji vyjádřeno protein delta-endotoxinu Bacillu thuringiensis, nebo jeho pesticidně účinný fragment může představovat, avšak neomezuje se na CrylA(a), CrylA(b), Cryla(c), CrylB, CrylC, CrylD, CrylE, CrylF, CrylIA, CrylIIA, CrylIIB, CrylIIC, CrylVA, CrylVB, CrylVC, CryIVD, CryV, CryVI a CytA. Do rozsahu předkládaného vynálezu patří také, že biopesticid Bacillu thuringiensis může obsahovat sporu související s kmenem Bacillu thuringiensis.

Biopesticid Bacillu thuringiensis v pesticidní kompozici podle předkládaného vynálezu může být alternativně derivován z buňky, do které byl vložen gen, který kóduje protein delta-endotoxinu Bacillu thuringiensis nebo jeho pesticidně účinný fragment. Dále v rámci rozsahu předkládaného vynálezu může biopesticid Bacillu thuringiensis nebo jeho pesticidně účinný fragment může být derivován z transkonjugovaného kmene, do něhož byl konjugací buněk přenesen plasmid. obsahující gen, který kóduje protein delta-endotoxinu Bacillu thuringiensis nebo jeho pesticidně účinný fragment.

Pesticidní kompozice podle předkládaného vynálezu mohou obsahovat substanci podle předkládaného vynálezu v množství mezi kolem 0,001 a kolem 100 gramů na gram biopesticidu Bacillu thuringiensis.

Pesticidní kompozice podle předkládaného vynálezu mohou dále obsahovat jednu nebo více synergisujích složek, potenciátorů, nebo fagostimulantů, jak je to v oboru běžné. V kompozicích podle předkládaného vynálezu může být například použit potenciátor popsaný v VO 94/09630 nebo jeho pesticidně účinná sůl.

Kompozice podle předkládaného vynálezu mohou dále obsahovat entomopathogenní virus. Příklady takových entomopathogenních virů představují, ale nejsou omezeny na virus nukleární polyhedrosis (NPV) Autographa californica, NPV Syngrapha falcifera, virus granulosis (GV) Cydia pomonella, NPV Heliothis zea, NPV Lymanthia dispar, NPV Orgyia pseudotsugata, NPV Spodoptera exigua, NPV Neodiprion lecontei, NPV Neodiprion sertifer, NPV Harrisina brilians a NPV Endopiza viteana Clemens.

Kompozice podle předkládaného vynálezu mohou dále obsahovat chemický pesticid. Příklady takových chemických pesticidů představují, ale neomezují se na: regulátory hmyzího růstu, karbamáty, organofosfáty, pyrethroidy, anorganické fluoridy, pyrazoly, pyrroly a avermektiny.

Vynález se dále týká způsobu kontroly hmyzího zamoření rostlin zahrnující aplikací pesticidních kompozicí na rostliny.

• ·	• 9	• 9 9 9	9 ·'· 9----
•	•	• 9	9 9	9
•	• ·	9 9	* ,· * ♦	9
•	•	• 9	9	9
	• 99	999 ····	99	9

Pesticidní kompozice podle předkládaného vynálezu mohou být aplikovány v suché nebo kapalné formě, například jako suspense, roztok, emulse, prachová moučka, dispersibilní granule, zvlhčitelný prášek, koncentrát pro emulsi, aerosol, nebo, impregnované granule anebo jako koricentrát či primární kompozice, která před aplikací vyžaduje zředění potřebným množstvím vody nebo jiného rozpouštědla. Koncentrace každé ze složek kompozice bude kolísat v závislosti na povaze dané kompozice, zejména pak, jedná-li se o koncentrát nebo má-li být použita přímo. Kompozice mohou obsahovat kolem 1 % až asi 98% inertního nosiče v pevné nebo kapalné formě. Kompozice se přednostně nasazují v dávce navrhované pro komerční produkty, nejlépe kolem 0,01 kg/ha (0,01 lb/akr) až 5,6 kg/ha (5,0 lb/akr), pokud jsou v suché formě a kolem 0,01 1/ha (0,01 pint/akr) až 29,2 1/ha (25 pint/akr), pokud jsou ve formě kapalné.

Pesticidní kompozice podle předkládaného vynálezu mohou být aplikovány přímo na rostlinu, například pomocí postřikováni nebo poprašování v době, kdy se škůdce začal objevovat na rostlině, anebo před objevením se škůdce, jako ochranný prostředek. Pesticidní kompozice mohou aplikovány na list, zaoráním, rozhazováním granulí, na poslední chvíli před sklizní nebo nasáknutím do země. Kompozice podle předkládaného vynálezu mohou být také aplikovány přímo do rybníků, jezer, potoků, řek, stojatých vod a dalších oblastí, kde nastalo zamoření škůdcem, který ohrožuje obecné zdraví.

Kompozice mohou být aplikovány postřikem, práškováním, stříkáním a podobně. Postřik nebo prášek může obvykle obsahovat jiný pesticid. Pesticidní kompozice podle předkládaného vynálezu se výhodně aplikují přímo na rostlinu.

Pesticidní kompozice podle předkládaného vynálezu mohou být použity k ochraně řady různých druhů rostlinstva, mezi něž patří, ale neomezují se jen na ně, obiloviny (pšenice,

ječmen, žito, oves, rýže, čirok a příbuzné plodiny), řepy (cukrová řepa, krmná řepa), peckoviny, jádroviny a měkké ovoce (jablka, hrušky, švestky, broskve, mandle, třešně, jahody, maliny, borůvky), luskoviny (vojtěška, fazole, čočka, hrách, sója), olejniny (řepka, hořčice, mák, olivy, slunečnice, kokos, skočce poskytující ricinový olej, kakaové boby, podzemnice olejna), okurkovité rostliny (okurky, dýně, melouny), vláknité rostliny (bavlna, len, konopí, juta), citrusové ovoce (pomeranče, citrony, grapefruity, mandarinky), zelenina (špenát, salát, chřest, zelí a jiné košfáloviny, mrkve, cibule, rajčata, brambory), vavřínovité rostliny (avokado, skořice, kafr), opadavé listnaté stromy i jehličnany (lípy, tisy, duby, olše, topoly, břízy, jedle, modříny, borovice), nebo rostliny jako jsou kukuřice, trávníkové rostliny, tabák, ořechy, kávovník, třtina cukrová, čajovník, vinná réva, chmel, banánovníky, kaučukovníky stejně tak jako rostliny okrasné.

Předkládaný vynález se dále vztahuje na způsob aplikace sustance podle předkládaného vynálezu na transgenní rostliny, které obsahují gen, který kóduje biopesticid Bacillu thuringiensis.

Pesticidní kompozice podle předkládaného vynálezu mohou být použity k ošetření nebo prevenci zamoření způsobených řadou různých typů hmyzu. Kompozice podle předkládaného vynálezu se zejména s výhodou používají při potírání škůdců řádu Coleoptera, například Leptinotarsa sp., Acanthoscelides obtectus, Callosobruchus chinensis > Epilachna varivestis, Pyrrhalta luteola, Cylas formicarius elegantulus, Listronotus oregonensis, Sitophylus sp. , Cyclocephala borealis, Cyclocephala immaculata, Macrodactylus subspinosus, Popillia japonica, Rhizotrogus majalis, Alphitobius diaperinus> Palorus ratzeburgi, Tenebrio molitor, Tenebrio obscurus, Tribolium castaneum, Tribolium confusum a Tribolius destructor. Avšak kompozice podle předkládaného vynálezu mohou být také účinné proti hmyzím škůdcům řádu Lepidoptera, například Achroia grisella, Acleris gloverana, Acleris variana, Adoxophyes orana, Agrotis ipsilon, Alabama argillacea, Alsophila pometaria, Amyelois transitella, Anagasta kuehniella, Anarsia lineatella, Anisota senatoria, Antheraea pernyi, Anticarsia gemmatalis, Archips sp. , Argyrotaenia sp., Athetis mindara, Bombyx moři, Bucculatrix thurberiella, Cadra cautella, Choristoneura sp. , Cochylis hospes, Colias eurytheme, Corcyra cephalonica, Cydia latiferreanus, Cydia pomonella, Datana integerrima, Dendrolimus sibericus, Desmia funeralis, Diaphania hyalinata, Diaphania nitidalis, Diatraea grandiosella, Diatraea saccharalis, Ennomos subsignaria, Eoreuma loftini, Ephestia elutella, Erannis tiliaria, Estigmene acrea, Eulia salubricola, Eupoecilia ambiguella, Euproctis chrysorrhoea, Euxoa messoria, Galleria mellonella, Grapholita molesta, Harrisina americana, Helicoverpa subflexa, Helicoverpa zea, Heliothis virescens, Hemileuca oliviae, Homoeosoma electellum, Hyphantria cunea, Keiferia lycopersicella, Lambdina fiscellaria fiscellaria, Lambdina fiscellaria lugubrosa, Leucoma salicis, Lobesia botrana, Loxostege sticticalis, Lymantria dispar, Macalla thyrsisalis, Malacosoma sp. , Mamestra brassicae, Mamestra brassicae, Mamestra configurata, Manduca quinquemaculata, Manduca sexta, Maruca testulalis, Melanchra pieta, Operoptera brumata, Orgyia sp., Ostrinia nubilalis, Paleacrita vernata, Pápilio cresphontes, Pectinophora gossypiella, Phryganidia californica, Phylonorycter blancardella, Pieris napi, Pieris rapae, Plathypena scabra, Platynota flouendana, Platynota sultana, Platyptilia carduidactyla, Plodia interpunctella, Plutella xylostella, Pontia protodice, Pseudaletia unipuncta, Pseudoplusia includens, Sabulodes aegrotata, Schizura

Spilonota pityocampa, rubigalis, řádu Diptera, • ··· concinna, Spodoptera bisselliella, curialis a

Sitotroga cerealella, sp., Thaurnstopoea

Trichoplusia ni, Udea

Yponomeuta padella; dále ocel lana,

Tineola

Xylomyges například

Aedes sp. , Andes vittatus, Anastrepha ludens, Anastrepha suspensa, Anopheles barberi, Anopheles quadrimaculatus, Armigeres subalbatus, Calliphora stygian, Calliphora vicina, Ceratitis capitata, Chironomus tentans, Chrysomya rufifacies, Cochliomyia macellaria, Culex sp., Culiseta inornata, Dacus oleae, Delia antiqua, Delia platura, Delia řadičům, Drosophila melanogaster, Eupeodes corollae, Glossina austeni, Glossina brevipalpis, Glossina fuscipes, Glossina morsitans centralis, Glossina morsitans morsitans, Glossina morsitans submorsitans, Glossina pallidipes, Glossina palpalis gambiensis, Glossina palpalis palpalis, Glossina tachinoides, Haemagogus equinus, Haematobia irritans, Hypoderma bovis, Hypoderma lineatum, Leucopis ninae, Lucilia čupřina, Lucilia sericata, Lutzomyia longlpaipis, Lutzomyia shannoni, Lycoriella malí, Mayetiola destructor, Musea autumnalis, Musea domestica, Neobillieria sp., Nephrotoma suturalis, Ophyra aenescens, Phaenicia sericata, Phlebotomus sp., Phormia regina, Sabethes cyaneus, Sarcophaga bullata, Scatophaga stercoraria, Stomoxys calcitrans, Toxorhynchites amboinensis a Tripteroides bambusa; dále řádu Acari, například Oligonyhus pratensis, Panonychus ulmi, Tetranychus urticae; nebo řádu Hymenoptera, například Iridomyrmex humilis a Solenopsis invicta; či řádu Isoptera, například Reticulitermes hesperus, Reticulitermes flavipes, Coptotermes formosanus, Zootermopsis angusticollis, Neotermes connexus, Incisitermes minor a Incisitermes immigrans; nebo řádu Siphonaptera, například Ceratophyllus gallinae, Ceratophyllus niger, Nosopsyllus fasciatus, Leptopsylla segnis, Ctenocephalides canis, Ctenocephalides felis, Echicnophaga č

gallinacea, Pulex irritans, Xenopsylla cheopis, Xenopsylla vexabilis a Tunga penetrans; anebo řádu Tylenchida, například Melodidogyne incognita a Pratylenchus penetrans.

Příklady provedení vynálezu

Předkládaný vynález je dále popsán následujícími příklady, které nelze chápat jako omezující rozsah vynálezu.

Příklad 1

Kultivace Bacillu thuringiensis EMCC-0080

Kmen Bacillu thuringiensis EMCC-0080 byl pěstován 24 hodin při 30 C v mediu adjustovaném na pH 7,0, které mělo následující složení:

	Škobový hydrolyzát	40 g/1
	Rostlinný protein	40 g/1
	kh₂po₄	1.8 g/1
	k₂hpo₄	4.5 g/1
	MgSO₄.7 H₂0	0,3 g/1
	Stopové kovy	0,2 ml
Buňky	a ostatní nerozpustné	částice byly	z celkové
kultivační	směsi kmene Bacillu	thuringiensis	EMCC-0080

odstraněny - centrifugováním a následnou filtrací takto získané kapaliny z kutivační směsi přes Celíte a membránu 0,2 gm Získaný filtrát byl pak odpařením zkoncentrován na desetinu.

Příklad 2

Bioassay s Diabrotica undecimpunctata

Vzorky o objemu 20 μΐ byly umístěny do jednotlivých jamek mikrotitrační desky o 96 jamkách, z nichž každá obsahovala 200 μΐ ztužené umělé hmyzí potravy a pak byly

usušeny na vzduchu. Do každé jamky byl jemně pomocí štětce umístěn jeden novorozenec Diabrotica undecimpunctata. Mikrotitrační deska byla potom zatavena do plastické folie Mylar opatřené dírkami pro výměnu vzduchu a podrobena inkubaci při 30 C a 80 % vlhkosti. V 5. až 6. dni se stanovila procenta mortality.

Příklad 3

Čistění pesticidní substance

Vyčistění pesticidní substance z lOx zkoncentrovaného filtrátu z příkladu 1 se dosáhlo třístupňovým čistícím postupem. V průběhu čistící operace byla pomocí bioassaye s Diabrotica undecimpunctata, jak je popsáno v příkladu 2, monitorována účinnost. Pokud není uvedeno jinak, ve všech chromatografických stupních byla používaná detekce při 278 nm.

V prvém stupni byl desetkrát zkoncentrovaný filtrát čištěn nejprve sloupcovou chromatografií (5 x 23 cm) na Pharmacia SP Sepharose Fast Flow (kationtoměnič). Sloupec byl promyt 1350 ml deionisované vody, poté pak 1350 ml pufru, kterým byl 20 mM roztok octanu amonného o pH 5,0, a před nasazením vzorku byl znovu upraven pufrem 20 mM octanu amonného o pH 5,0. 425 ml vzorku desekrát zkoncentrovaného filtrátu bylo zředěno 18 1 deionisované vody, aby bylo dosaženo konduktivity 2,01 í)^-^ a pH 4,8. Zředěný vzorek byl rychlostí 17 ml za minutu nasazován na sloupec preparovaný předtím pufrem 20 mM octanu amonného o pH 5,0. Sloupec byl vymýván rychlostí 8 ml za minutu 5 1 pufru z octanu amonného s kontinuálně stoupající koncentrací od 20 mM do 1,0 M při pH 5,0. Frakce byly odebírány každou minutu a každá pátá frakce byla podrobena bioassayi proti Diabrotica undemcipuncta jak je svrchu popsáno. Bioassayem bylo zjištěno, že účinné byly ,20 frakce 25 až 95. Účinné frakce byly spojeny, lyofilisovány a znovu zředěny 50 ml deinisované vody.

Ve druhém stupni bylo 50 ml spojených frakcí nasazeno na rozdělovači kolonu (5 x 100 cm) s BioRad P2 (extra fine), která byla předpreparována deionisovanou vodou. Kolona byla rychlostí 1 ml za minutu vymývána deionisovanou vodou. Každých 10 minut byly sbírány frakce, které byly, jako nahoře podrobeny bioassayi (každá pátá frakce). Účinnost byla prokázána ve frakcích 94 až 120 a ty byly spojeny.

Ve třetin stupni bylo 6 ml vzorku sebraných účinných frakcí ze stupně 2 zředěno na 10 ml deionisovanou vodou, aby bylo dosaženo konduktivity 223 ÍJ“1. Zředěný vzorek byl nasazen na HPLC kolonu (vnitřní průměr 15 cm x 21,5 mm) TSK SP-5PV a eluován rychlostí 4 ml za minutu 120 ml pufru z octanu amonného s kontinuálně stoupající koncentrací od 225 mM do 400 mM při pH 5,0. Frakce byly monitorovány při 310 nm a sbírány po každé 1,5 minutě a každá pátá frakce byla podrobena bioassayi jako předtím. Přibližně po 15 minutách byl vymyt velký peak následovaný shouldrem, které obsahovaly účinnou substanci, jak se prokázalo bioassayem.

Příklad 4

Charakterisace pesticidní substance

Charakterisována byla účinná látka z příkladu 3. Spektroskopická data H a ^JC NMR u vyčištěné substance byla získána pomocí spektrometru Varian Gemini 400 MHz. ^H NMR spektrum (D2O, 400 MHz) vyčištěné sloučeniny je uvedeno na obrázku 1, má chemické posuny 5 kolem 5,17 (d, 1H), 4,48 (d, 1H), 4,1 (m, 1H), 4,0 (dd, 1H), 3,92 (d, 1H), 3,85 (m, 2H), 3,80 (m, 1H), 3,65 (m, 1H), 3,50 (m, 1H), 3,36 (m, 1H), 3,1 (dd, 1H) , 2,8 (tu, 1H), 1,27 (d, 3H) , 1,19 (m, 3-4H) . ¹³C NMR spektrum (D2O, 100 MHz) vyčištěné sloučeniny je uvedeno na obrázku 2 a má chemické posuny kolem fi 97,8, 92,5,

71,1, 68,1, 67,8, 63,6, 57,8, 54,7, 52,9, 52,3 a 19,7.

Vyčištěná substance je dále charakterisována UV spektrem získaným na přístroji Hewlett-Packard s diodovým detektorem, kdy bylo zjištěno, že má pouze koncovou UV absorpci. Substance je rozpustná v methanolu stejně jako ve vodě. Dále dává substance positivní reakci jak s ninhydrinem tak s Dragendorffovým činidlem.

Na základě NMR dat bylo stanoveno, že čistá substance má molekulovou hmotnost v rozmezí od kolem 200 do kolem 500.

Příklad 5

Stanovení LCcq a LC^q pesticidní substance

Čistá substance z TSK SP-5PV HPLC čistícího stupně jak je popsáno v příkladu 3, byla jednou lyofilisována a opět rozpuštěna v deionisované vodě ma koncentraci přibližně 3 mg/ml. Potom byla substance podrobena bioassayi proti Diabrotica undecimpunctata pro stanovení LC^q a LC^q.

Umělá hmyzí potrava byla připravena ve složení voda, agar, cukr, kasein, pšeničné klíčky, methyl paraben, sorbová kyselina, olej z lněných semen, celulosa, soli, propionová kyselina, fosforečná kyselina, streptomycin, chlortetracyklin a vitaminy. Z umělé potravy byly připravovány vzorky, ve kterých byly rehydratované prášky a kapaliny v poměru 20 % objemových. Testovací vzorky byly připravovány ve zkumavkách do mikrocentrifugy a bylo získáno 8 až 16 sériových zředění. Kapalné vzorky byly testovány při 200 μΐ/ml a potom sériově rozpuštěny v 0,1 % TVEEN^ 20 na koncentrace 100 μΐ/ml, 50 μΐ/ml, 25 μΐ/ml, 12,5 μΐ/ml, 6,25 μΐ/ml, 3,125 μΐ/ml, 1,563 μΐ/ml atd. Každý vzorek byl smísen s roztavenou potravou na 1 ml. Tekutá potrava byla rozmixována a po 0,1 ml alikvotech pipetována do 10 jamek mikrotitrační desky s 96 jamkami.

Kontrolní vzorky obsahující 0,1 % TVEEN™ 20 byly umístěny do 16 jamek. Jakmile potrava ztuhla, byly do každé jamky dány dva novorozenci larev Diabrotica undecempunctata a desky byly pokryty perforovanou folií průhledného plastu Mylar. Desky byly 5 dni podrobeny inkubaci při 28 ± 2 C a relativní vlhkosti 65 %. Bioassaye byly třikrát opakovány.

Po 5 dnech byla spočítána mortalita. Plastická folie Mylar byla odstraněna, a každá jamka byla prohlížena mikroskopem. Larvy, které se nehýbaly, když byly dloubnuty pitvací jehlou, byly počítány jako mrtvé. Byla spočítána procenta mortality a data byla analyzována. Byly stanoveny LC₅₀, LCgg, směrnice regresní přímky a variační koeficient.

Bylo zjištěno, že substance má LC^q 20 μΙ/ml, LC^q 172,2 μΙ/ml, směrnici regresní přímky 1,5 a variační koeficient 18,8.

Uložení mikroorganismů

Následující kmen Bacillu thuringiensis byl podle Budapešťské dohody uložen v Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Nothern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, Illinois, 61604, USA.

Kmen_________________Přírůstkové číslo _______Datum uložení

EMCC-0080 NRRL B-21093 10. května 1993

Kmen byl deponován za podmínek, které zaručuj ί, že přístup ke kultuře bude dosažitelný během řízení o této patentové přihlášky tomu, koho určí Comniissioner of Patents and Trademarks (Komisař pro patenty a ochranné známky), který je pro to zmocněn podle 37 C.F.R. 1.14 a U.S.C. 122. Uložený vzorek představuje podstatně čistou kulturu deponovaného kmene. Uložený vzorek je dostupný, jak vyžadují

_ ______				1 1 ie	¹
	23	—	• · ♦	• · · » • · * ···	T
			• ·	• · ·	•
			·«· ···	···· 4Φ	•

cizí patentová práva v zemích, v nichž jsou zaregistrovány protějšky nebo příbuzné přihlášky subjektu. Avšak je třeba rozumět, že dostupnost uloženého vzorku nezakládá volnost provozovat předložený vynález za narušení patentových práv udělovaných státním aktem.

Vynález zde popsaný a nárokovaný není ve svém rozsahu omezen na zde popsaná provedení, protože tato provedení jsou zamýšlena jako ilustrace některých aspektů tohoto vynálezu. Všechna ekvivalentní provedeni jsou považována za spadající do rozsahu tohoto vynálezu. Ve skutečnosti různé modifikace vynálezu spolu s těmi, které jsou zde ukázány a popsány, se stanou zřejmé z předcházejícího popisu těm, kteří mají v oboru zkušenosti.

Zde se odkazuje na různé reference a objevy v mích popsané jsou zde v jejich celistvosti citovány.

Claims

1. Substance s pesticidní účinností proti škůdci, kde ¹substance (a) je účinná proti hmyzímu škůdci řádu Coleoptera;

(b) má v NMR spektru chemické posuny δ kolem 5,17 (d,

1H), 4,48 (d, 1H), 4,1 (m, 1H), 4,0 (dd, 1H), 3,92 (d, 1H),

3,85 (m, 2H), 3,80 (m, 1H), 3,65 (m, 1H), 3,50 (m, 1H) , 3,36 (m, 1H), 3,1 (dd, 1H), 2,8 (m, 1H), 1,27 (d, 3H), 1,19 (m,

3-4H) ;

(c) má 12 uhlíků a (d) má koncovou UV absorpci.

2. Substance podle nároku 1, kde substance má molekulovou hmotnost v rozmezí od kolem 250 do kolem 500.

3. Substance podle nároku 1, kde substance je ve vodě rozpustná.

4. Substance podle nároku 1, kde substance má 12 uhlíků a ¹³C NMR spektrum s chemickými posuny kolem δ 97,8, 92,5,

71,1, 68,1, 67,8, 63,6, 57,8, 54,7, 52,9, 52,3 a 19,7.

5. Substance podle nároku 1, kde se substance získává (a) kultivací kmene Bacillus za vhodných podmínek;

(b) odebráním supernatantu kultury kmene Bacillus ze stupně (a) a (c) isolací substance ze supernatantu kultury ze stupně (b).

6. Substance* podle nároku 5, kde kmen Bacillus je kmen Bacillus thuringiensis.

—·—— ·· -- r·'·“· ♦· · · ·' * · • 9 9 9 · • * 9,9999 • · · 9

99Φ9999 «9 *

7. Substance podle nároku 6, kde kmen Bacillus thuringiensis je kmen, který má identifikační charakteristiku EMCC-0080, je uložen v NRRL a má přírůstkové číslo NRRL B-21093, anebo jeho mutanty, které mají v podstatě stejné identifikační charakteristiky-^:EMCC-0080.

8. Substance podle nároku 1, kde hmyzím škůdcem je rod Diabrotica.

9. Substance podle nároku 8, kde hmyzím škůdcem je

Diabrotica undecimpunctata.

10. Způsob získání podstatně- čisté substance podle nároku 1,vyznačující se tím, že zahrnuje (a) kultivaci kmene Bacillus za vhodných podmínek;

(b) odebrání superňatanru. kultury kmene Bacillus ze stupně (a) a (c) isolaci substance ze supernatantu kultury ze stupně (b), aby byla získána podstatně čistá substance.

11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se ti m, ž e substance se isoluje ze supernatantu kultury sloupcovou chromatografií.

12. Pesticidní kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje (a) substanci podle nároku 1 a (b) pesticidní nosič, přičemž substance je přítomna v množství účinném pro potíráni škůdce.

13. Pesticidní vyznačuj ící kompozici přítomna v kompozice podle nároku 12, se tím, že substance je v množství v rozmezí kolem 0,001 % hmotnostních až do asi 60 % hmotnostních.

14. Způsob potírání škůdce vyznačující s e \ tím, že se škůdce vystaví působení pesticidně účinného množství pesticidní kompozice podle nároku 12.

15. Způsob získání mutantu kmene Bacillus, kde množství substance podle nároku 1 mutantem produkované je větší než množství substance produkované odpovídajícím mateřským kmenem, vyznačující se tím, že zahrnuje (a) ošetření kmene Bacillus mutagenem;

(b) pěstování mutovaného kmene Bacillus ze stupně (a) v prostředí vhodném pro selekci mutantu a (c) selekce kmene mutantu ze stupně (b) na základě zvýšené produkce substance.

16. Mutant kmene Bacillus, získaný způsobem podle nároku 15.