CZ407097A3 - Anti-obezitní proteiny, způsob jejich výroby a farmaceutický prostředek s jejich obsahem - Google Patents

Anti-obezitní proteiny, způsob jejich výroby a farmaceutický prostředek s jejich obsahem Download PDF

Info

Publication number
CZ407097A3
CZ407097A3 CZ974070A CZ407097A CZ407097A3 CZ 407097 A3 CZ407097 A3 CZ 407097A3 CZ 974070 A CZ974070 A CZ 974070A CZ 407097 A CZ407097 A CZ 407097A CZ 407097 A3 CZ407097 A3 CZ 407097A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
leu
ser
protein
asp
gin
Prior art date
Application number
CZ974070A
Other languages
English (en)
Inventor
John Michael Beals
Ronald Eugene Chance
James Arthur Hoffmann
Rohn Lee Millican Jr.
Original Assignee
Eli Lilly And Company
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eli Lilly And Company filed Critical Eli Lilly And Company
Publication of CZ407097A3 publication Critical patent/CZ407097A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/5759—Products of obesity genes, e.g. leptin, obese (OB), tub, fat
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Vynález se týká humánní medicíny, především použití léčiv pro léčení obezity a poruch, spojených s obezitou. Vynález se obzvláště týká anti-obežitních peptidů které, pokud jsou podávány pacientovi, regulují tukové tkáně.
Dosavadní stav techniky
Obezita, speciálně obezita horní části těla, je běžný a velmi vážný veřejný zdravotní problém jak ve Spojených státech, tak i po celém světě. Podle současných statistik je více než 25 % populace ve Spojených státech a 27 % populace v Kanadě zasaženo nadváhou (Kuczmarski, R.J., Amer. J. of Clín. Nutr. 55: 495S-502S (1992); Reeder, B.A. a kol., Car. Med. Assoc. <J., 146:2009-2019 (1992) }. Obezita norni části těla je nejsilnější známý rizikový faktor pro osoby s diabetem typu 2 a je také silný rizikový faktor pro kardiovaskulární onemocnění a rakovinu. Současné odhady pro lékařské náklady spojené s obezitou čmí po celém světě 150.000.000.000 dolarů. Problém se stal natolik závažným, že hlavní lékař (Spojených států) zahájil iniciativu boje proti stálo sílící tělesné tloušťce, zasahující americkou společnost.
* » 6 Φ 4 » se s ’ « e »
• ·
• · · · · · · ·
Mnoho z této obezitou indukované patologie může být připsáno silné asociaci na dyslipidenui, hypertensi a odolností proti insulinu. Mnoho studií prokázalo, že snížení obezity pomocí diety a tělesného cvičení redukuje dramatickým způsobem tato rizika. Naneštěstí je tento postup značně neúspěšný s pravděpodobností neúspěchu dosahující 95 %. Tento neúspěch může být způsobován skutečností, že stav je silně asociován s geneticky vrozenými faktory, které přispívají zvýšené chuti k jídlu, preferování vysoce kalorické potravy, snížené fyzické aktivitě a zvýšenému lipogenickému metabolismu. To indikuje, že osoby, které zdědily tyto genetické znaky, jsou náchylné k tomu stát se obézní bez ohledu na jejich úsilí tento stav překonat. Z tohoto důvodu je potřebné farmakologické činidlo, které by mohlo korigovat tento handicap tělesné tloušťky a dovolilo by lékaři úspěšně léčit obézní pacienty i přes jejich genetické vlohy.
Fyziologové po léta předpokládali, že pokud se savec přejídá, výsledný přebytek tuku signalizuje mozku, že tělo je obézní, což dále způsobuje, že tělo požívá méně potravy a spaluje více zdrojů (Hervey, G.R., Nátuře 222: 629-631 (1969) ). Tento „zpětnovazební model je podporován parabiotíckými experimenty, které implikuji obíhající hormon, ovládající tělesnou tloušťku.
Myš ob/ob je model obezity a diabetů, o němž je známo, že nese aut.ORomální recesivní znak, vázaný k mutaci v šestém chromosomu. Nedávno Zhang, Y. a spolupracovníci publikovali poziční klonování myšího genu, vázaného k tomuto stavu (Zhang, Y. a kol., Nátuře 372:425-432 (.1 994)). Tato zpráva
* · · • « · · ·« ·· «« ·* odhaluje gen, kódující protein o 167 aminokyselinách se signálním peptidem o 21 aminokyselinách, který je exprimován výhradně v tukové tkáni. Následně byl klonován a exprimován gen obezity krysy (Murakami, T, a kol., Biochem. B.iophyo. Ros. Comm. 209:944-952 (1995)). Nyní se spekuluje o tom, že protedn, který z.řejmě kóduje ob gen, je regulační hormon tukové tkáně.
Protein, kódovaný ob genem je farmakologicky účinný, ale fyzikální vlastnosti tohoto proteinu jsou méně vhodné. Například lidský protein je náchylný k precipitaci a agregaci jak ve farmaceutických přípravcích, tak i za fyziologických podmínek. Proteinové přípravky, obsahující precipitát nebo přípravky, které dovolují precipitaci po injekci, zvyšují riziko vytváření imunologické odezvy u pacienta, což může vést k podráždění v místě injekce. V souladu s tím přetrvává potřeba vyvinout iarmakologická činidla, která vykazuji íarmakologickou účinnost a mají. lepší fyzikální a chemickou stabilitu.
Podstata vynálezu
Přihlašovatelé objevili, že agregace, pozorovaná u přírodního lidského proteinu je částečně způsobovaná hydrofobní interakci povrchu proteinu, obzvláště zbytků v polohách 100 a 138. Přihlašovatelé dále objevili, že substitucí těchto poloh nabitými. aminokyselinami je dramaticky redukována náchylnost ob proteinu k agregaci, čímž se získá značně zlepšený farma kologický přípravek. V souladu s tím předkládaný vynález podává biologicky účinný obezitni protein. Takový přípravek dovoluje pacientovi * A ·♦« *
A A překonat jeho obezitní handicap a žít normalizovaným rizikem u diabetů typu 2, chorob a rakoviny.
normální život kardiovas kulární c
Přehled vynálezu
Vynález se týká proteinu obecného vzorce (I):
ou 2 ID NO: L )
g 10 1 b
V a 1 Pro ile Chi Lys Val Gin Asp Asp 'Ihr bys Thr Leu Tle Lys Thr
20 a b 30
J lo Vói 1 Thr Arg Ue Xaa Asp T l.e Der Lis Thr Xa a D e r Val Ser Ser
,1 A
j b '! U 4 b
Lys Cπ L,ya V a 1 Th.r 0 1 y Leu Asp hhc TLe Pro G.. y Leu H i s Pro l· le
,· 0 bt
Leu Tor Leu Ser U Met Asp G.l.r: 0'hr leu Ala V a j. Ϊ y r Gin Gin 11c
65 10 7 r, 80
Thr Ser MeL Pro Ser Arg X d d Λ či či lis Gin 1 . a S p r A.on Asp.· ! i e i. i
8 5 90 g a
G1 .1 Asn Γ, e o Arg Asp Leu Leu Lis Vol· 'su /es lbe So r Lyn Se, -ys
J 00 Ί 0 110'
Ή i. S Lc.] hro Ad rt 5 e r Gly 7., pij pl· 0 Thr Dru As ρ Ser Len Gly : y
ttit
Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr GIu Val Val Ala Leu Ser Arg :u . , 'i ij .e;i Gin Glv Ser Lea GTn Asp Mot Leu Trp Gin Leu Asp Leu Ser Pro ve kterém
Xaa v poloze 22 je Asn nebo Ser;
Xa a v poloze 28 je Gin nebo chybí;
Xaa v poloze 72 je Asn, Gin, Glu, nebo Asp;
Xaa v poloze 73 je Val· nebo Met;
a protein zahrnuje alespoň jednu z následujících substitucí:
Trp v poloze 100 je nahrazen Glu, Asp, His, Lys nebo Arg;
Trp v poloze T 38 ie nahrazen Glu, Ano, His, Tys nebo Arg;
nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl.
Vynález se dále týká prostřdků, použitelných pro léčení obezity nebo stavů, asociovaných s obezitou, přičemž jejich použití zahrnuje podávání proteinu obecného vzorce (I) savci, který má jeho potřebu.
Vynález se dále týká farmaceutického přípravku, který !íi
S« «9 • · * • · * • « · « · • 9 · • · * · zahrnuje protein obecného vzorce (I) spolu s jedním nebo více farmaceuticky přijatelnými ředidly, nosiči nebo exci plenty.
Vynález se dále týká proteinu obecného vzorce (I), které máji navíc leader sekvenci, vázanou k N-konci proteinu obecného vzorce (I). Takové proteiny jsou užitečné pro jejich anti-obezitní účinek a slouží také jako mezistupeň při přípravě proteinů obecného vzorce (I).
Vynález se dále týká DNA, kódující protein obecného vzorce (I) nebo prolein obecného vzorce (I), ktierý obsahuje leader sekvenci.
Dodatkové provedení vynálezu je způsob přípravy proteinu obecného vzorce (I), který zahrnuje:
a) transformaci hostitelské buňky pomocí DNA, která kóduje protein obecného vzorce (1) nebo proLein obecného vzorce (i) s leader sekvencí;
b) kultivaci hostitelské buňky v podmínkách, dovolujících expresi proteinu;
c) získání exprimovaného proteinu; a popřípadě dl získání proteinu obecného vzorce (I) enzymatickým odštěpením leader sekvence.
Vynález se dále týká proteinu pro léčení obezity nebo stavů, spojených s obezitou a také proteinu pro výrobu léčiv pro léčení obezity nebo stavů spojených s obezitou.
* *4 M íiíí !* * * «··· ·· ·«·* ... · ♦ · ♦·· < · ♦ · ··«**· «*«·«·· ··· *·«· * · · a * « 1 * «« * · · · «·
Podrobný popis vynálezu
Pro potřeby popisu předkládaného vynálezu, jak vyplývá z popisu a patentových nároků, jsou používány následující pojmy a zkratky:
Pár bázi (pb) - se vztahuje k DNA nebo RNA. Označení A, C, G a T odpovídají 5’-monofosfátové formě nukleotidů (deoxy)adenin, (deoxy)cytidin, (deoxy)guanin respektive (deoxy)thymin, pokud se vyskytují v DNA molekule. Označení U, C, G a T odpovídají 5'-monofosfátové formě nukleosidů uráčil, cytidin, guanin respektive thvmin, pokud se vyskytují v RNA molekule. V DNA se dvěma vlákny odpovídá pár bází spojení A s T nebo C s G. V DNA/RNA heteroduplexu pár bází odpovídá spojení T nebo U a A nebo C s G.
FMOC - zkratka pro 9-fiuorenylmethoxykarbonyl.
Tmunoreaktivní protein(y) - termín, užívaný pro kolektivní popis protilátek, fragmentů proti látek, schopných vázat antigeny a majících podobnou povahu jakou má molekula protilátky, z níž jsou odvozeny a polypeptidove vazebné molekuly s jednoduchým řetězcem (Bírd., E.R., a kol., PCT přihláška č. PCT/US 87/02108, Mezinárodní publikace č. WO 88/01649, publikovaná 10. března 1988).
Plasmid - extrachromosomáiní samoieplíkující genetický prve k.
PAM - zkratka pro 4-hydroxymethylfer.ylacetami domethyl.
« « ťt ► « · 4
PMSF - zkratka pro fenylmethyIsulfonylfiuorid.
Čtecí rámec - nukleotidová sekvence, ze které dochází k translaci „čtením tripletu translačním mechanismem tRNA, ribosomů a souvisejících faktorů, přičemž každý triplet odpovídá konkrétní aminokyselině. Jelikož triplety jsou navzájem různé a mají tutéž délku, délka kódující sekvence musí být dělitelná třemi. Vložení nebo vynecháni páru bází (nazývané mutace posunu rámce) může vést ke vzniku dvou různých proteinů, kódovaných týmž segmentem DNA. Na ochranu proti tomu musí být tripletové kodony, odpovídající požadované vlastnosti, seskupeny v násobcích tří počínaje iniciálním kodonem, to jest musí být udržován správný „čtecí rámec.
Rekombinantni DNA klonovací vektor - libovolný rekombinantní DNA klonovací vektor, ve kterém je zahrnut promotor.
Replikon - DNA sekvence, která ovládá a dovoluje autonomní replikaci plasmidu nebo dalšího vektoru.
TRA - zkratka pro triřluoroctovou kyselinu.
Transkripce - proces, při kterém je informace, obsažená v nukl.eotidové sekvenci DNA přenášena na komplementární RNA sekvenci.
Translace - proces, při kterém je genetická informace informační RNA používána ke specifikaci a přímé syntéze polypeptlbového řetězce.
e«ee
- lb í: e 9 «*·* ·· * · * ♦ * • « · »· · ·*·· · · * * · · · ·«·> * • · · ·<«« · · · • · v « * · · ·« · · ··
Tris - zkratka pro tris(hydroxymethyl)aminomethan.
Léčení - popisuje péči o pacienta s cílem potlačit nemoc, stav nebo poruchy a zahrnuje podávání sloučeniny podle předkládaného vynálezu s cílem zabránit vzniku symptomů nebo komplikací, přinést úlevu symptomu nebo komplikací nebo odstranit nemoc, stav nebo poruchu. Léčení obezity proto zahrnuje inhibici přijmu potravy, inhibici přírůstku váhy a indukci úbytku váhy u pacienta, který toho má potřebu.
Vektor - replikon, používaný pro transformaci buňky při genové manipulaci, nesoucí poiynukleotidovou sekvenci, odpovídající příslušné proteinové molekule který, pokud je kombinován s vhodnou kontrolní sekvencí propůjčuje hostitelské buňce, která má být transformována, specifické vlastnosti. Plasmidy, viry a bakteriofágy jsou vhodné vektory, neboť jsou svou vlastni povahou replikony. Umělé vektory jsou konstruovány štěpením a spojováním DNA molekul z různých zdrojů použitím restrikčních enzymů a lrgáz. Vektory zahrnují rekombinantní DNA klonovaní vektory a rekombinantní DNA vektory exprese.
X-gal - zkratka pro 5-brom-4-chLor-3-indolyl beta-Dgalaktosid.
Zkratky aminokyselin přij ímá jako přípustné United S t a t. e s
Patent and Trademark 0 i £ i c p ř jak je stanovéno v 37 C. F. K. §
1.822 (b')( 2 1 (1 993 ) Pokud neru výslovně uvedeno, , jsou
aminokyseliny v L konfiguraci.
¢44
- iU ϊ 3
Jak bylo uvedeno výše obecného vzorce (I):
předkládaný vynález.
se týká proteinu i 5
Val r TO Zle G ] n tys Val G' fi ňs o λ t- >' TLr o r nn Ϊ ., . . τ i_e l7y S TLr
2 0 25 30
1 >· Val Tur Arg 11 e Xaa Asp lle ď U r Hrs Lht λ a a S e r Val |f v· ' Λ í
3 3 4 0 z - •i ->
tys Gin Lys Val Tnr Gly Leu Asp Phe Tle Pro Gly Leu His P r o I le
50 55 60
LSJ TLr Leu S i. ·.- Lys Met Asp Gin Tnr Leu A1 a V a i Tyr Gin G .1 n _i_ i, e
65 V 0 ~7 L ; J 8 9
Leu Thr Ser Met V y q Ser Arg X d d Xaa lle G i n i. .1 e Ser A.sn Asp Leu
8 5 90 95
Glu Asn Leu Arg Asp Lea Leu His v a 1 Let] Ala PS e $ e r T. v a Ser ,1”’ U Z f
1 00 10 5 110
hT i 5 Leu Pro Trp Ala 3 e r Gly L e u Gin TLr Leu Asp G e r Leu G ! v Gly
111? 120 . ... r
Vd , . ě U Glu Ala Ser L i y ryr S e r Trn: - : . Úd ) v.,: A.u Gď r Δ r .v
1 50 135 : to
... eí Gin ciy Ser lnou Gin M L Pie X Leu i .. Gn Leu Asp Osu S e r P r ')
«4
φ A 14 • · * ·
Gly Gyí ; (SEQ LD NO: 1!
ve kterém
X a a v po]oze 22 je Asn nebo Ser;
Xaa v poloze 28 je Gin nebo chybí;
X a a v poloze 72 3θ Asn, Gin, Glu, nebo Asp
Xaa v poloze 7 3 jie Val nebo Met;
a protein zahrnuje alespoň jednu z následujících substitucí: Trp v poloze 100 je nahrazen Glu, Asp, His, Lys nebo Arg;
Trp v poloze 138 je nahrazen Glu, Asp, His, Lys nebo Arg; nebo jeho farmaceuticky přijatelnou súl.
Výhodné proteiny podle předkládaného vynálezu jsou ty proteiny obecného vzorce (I), ve kterém
Xa cl v poloze 22 je Asn;
Xaa v poloze 28 ίθ Gin;
Xaa v poloze 72 je Asn nebo Asp; a
Xaa v poloze 73 3θ Val.
Další výhodné proteiny jsou ty, ve kterých Trp v poloze 100 je nahrazen Glu nebo Asp; Trp v poloze 138 je nahrazen Glu nebo Asp. Obzvláště výhodné jsou proteiny obecného vzorce T, ve kterých Xaa v poloze 72 je Asp. Další výhodné proteiny jsou ty, ve kterých Trp v poloze 100 je nahrazeno His, Lys nebo Arg. Další výhodné proteiny jsou ty, ve kterých Trp v nnloze 100 -je nahrazeno nebo Arg nebo Trp v poloze i 38 je nahrazeno Lys nebo Arg.
• « ·
Nej výhodně j š í protejny podle vynálezu jsou proteiny s jednou
ze sekvencí SKQ ID NO:2 -12 •
7 1 0 1')
V 31 Pro Ile Gin Lys Val G1 n Asp Asp Thr L y 3 Thr Leu I i e Lva Thr
20 Ά Γ t.. ..· 20
Ile V a í Thr Arg Tle Asn Asp i 1 C; S e r His Thr e _ id Ser V a 1 Ser Ser
3 5 4 0 4 5
1 'V 5 Gin 7. y s Val Thr G i y Leu Asp Phe ile Pro a u_ y Leu. li i s P i · i 7 ! e
00 55 00
Thr Leu Ser Ly 5 Mor Asp G i 7 Thr Leu Ala • r - ’’ V C Tyr Gin G '1 π Ile
ύ'? 7 7 7 5 «0
Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Vůl ile Gin 11 e Ser A .a n Asp Leu
G5 to 9 ii
G i /i £ r; Leu Arg Ano Leu Leu His Vd x Leu AI a , P, k·, S e r Lys S o r Cys
100 100 1 1 0
:lí S Leu Pro As μ AI o Ser Gly Lea G 3 u Thr Leu Asp Se r Leu Gly G-/
1 1 0 Ϊ / 3 Ί 2. 5
Va i ku Glo A1 ·3 Se r γ T v r TO- 0- ’ i, 7 / ,·Η ' Al-j y,;,j
* • · 44 » 4 4 4 · *
*
Leu Glr. Gly Sex Leu Gin Asp Met Leu Trp Glr. Leu Asp Leu Ser Pro
G . v Cvs (SEC1 1L LC : 2 )
Val Pro Ile Glu Lys Val Gin Asp Asp Thr eu 'i i e Lvs 7hx
Ile Val 7Κχ· Aru lle Asn Asd Ile Ser II: s Thr Gin Ser Val Ser Ser ;i.n Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu S i 3 Pro lit
55 60 eu Thr Len Ser Lys Mel Asp GI Thr Leu Ala Ve.] Tyr Gin Gin Ile
Ten Thr Ser Mel pro Ser Aru Asn V,-;] í e e’n T|
P‘- I -i Τ’ M k ΓΊ A '5 TJ ř-i !
ílu Asn Leu Arcj Asp Leu Leu His Val Leu AI
0
U i. u >A _u ci
Gly Leu CL ] ri Thr Leu Asp Ger Leu G.y GJ
120
Val T.eij Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Tru. G.lu
A i a ser Aru
9 * · 9 · » 9
9
9 9 9 * « 9 · · · · · • · · ♦ ·
9« 9 9 9 9
130 135
T.c-u Gin Giy Ser Lou Gin Asp Mc·’
Lea Ger Pn
Ty Cys (SÍLO i5 NO:Gj
Pro lle Gin Lys Val Gin Asp Asp ;'hr bys Thr Leu lle bys Th:
lle Val Thr Aru lle Asn Asp lle Ser His Thr Glrt Ser Val Ser Ser
Lvs Gin bvs Val Thr Glv Leu Asn Phe lle Pro Glv Leu His Pro TI.
;u Thr T.ei: Ger hyn Mot Asp Gin Thr ...eu Ala Val Tyr Gin Gin ilí řl 0
Thr Mjif Oro Qpr f. r ri A«n Val Tip O 1 r, ’1.
Gi.u Asn Leu Arq Asp Leu Leu His Val Leu Ala vhe Ser L
1T; cPro Trn Aia Ger Glv Leu Giu Thr Leu Are Ger i,ee Glv OJ v
Glu Ala Ser Giy Tyr Ser Thr Giu Val Val «« »444 · «4 »44 » * 4 ♦ i · »T ** · 4 · • 4 4 4
4*44 ·
4 «
4 4 *4 »* ·· · ·
130
10
Leu 5.1η Cly Ser Leu Gin Asp Mel bu Glu Gin Leu Asp Leu Ser Prc y . ye b’tm 10 OtJ 4 }
V a 1 t rej i .i e u 1 r i _j y e v a 1 um As o A 5 ρ lei u y s i r,r Lee Ile u y s i b c
Ilo Val Thr Arq Tle Asii .Asp Ae Ser His Thr Gin Ser Val Ser Ser' o
3·
Lys Gin Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile
Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr Gin Gb, jle
Leu Thr Ser Met Pro Ser Aru Asn Val Tle Gin ile Ser Asn Asn Leu
Asr. Leu nrq uup ueu
Leu Giu Ala Ser el y 'lyr Ser Thr mu Val Val Am Leu Ser Arq e «« »*»«» »· ”· ·· * · * » · · · · • ·« » ♦ » « · ·· *. « T * * · · »·· · * * · ·**· · · «···> ·· ·· · · · ·
Leu GLn Gly Ser T.eu Gin Asp Met. Leu Asp Glr. Leu Asp Leu Ser Pro ;SLQ lij NO:
Val Pro Ile Glr. Lys Val Glr. Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr
Tle Val Thr Arg T.le Asn Asp Tle Ser His Thr Gin Ser Val. Ser Ser
I.ys Gin T,ys Vat Thr Gly Leu Asp Phe ile Pro Gly Leu Hl.s Pro 11·:
jC
Le'u 'Thr Len Ser Lys Met ň.sp Gin Thr Leu Ala Val Tyr Gin Gin T.i.e
Leu Tlir Ser Met Pro Ser Arg Asp Vat Ile Gin Tle Ser Asn Asp Lei
Asn Leu Arg Asp Leu .Leu His Val Lea Ala Phe Ser Lve Ser p ber ne,:
His Leu Pro Asr. Ala Ser Glv T.eu Gin Thr Leu Asp
Vox T.eu Giu Ala Ser G!y Tyr Ser. Thr Giu Val. Val Aia Leu Ser Are
135 ne
I,!-;: Gin Čily Ser Leu Gin Asp Met Leu Trp Gin Leu Asp Leu Ser Pro .4 3
1.y Mys ÍSEQ ID NO:
Val Pro Ile Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr I.ys Thr Leu Tle Ly.s Thr
Tle Val Thr Arq lle Asn Asp Ile Ser His Thr Gin Ser- Val Ser Ser
0Lys Gin Lys Val Thr Giy Leu Asp Pii o . le Pro Gly Leu líi.s Prn ile ,eu Thr Leu Ser Lys Mot. Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr Gin Gin Tle
Ser Mot Pro Ser Arg Asn Val Tle Gin i.e Ser Asn Asp Leu
Gin Asn Leu Aru .Asp Leu Leu Kis Val Len Aia Phe Ser ier Leu Pro Lys Thr Ser Giy Leu. 01 u Thr; hrnu Λ.ηρ Ser I,· » e » * • » · ♦ • · ♦ ♦ • · · · * • · · n ··
:.20 * *· Mí * Μ * »··· ·* · « · φ * · · * « * · « » I »·· ti ♦ » · « Μ «φ
0· žu Glu Ala Ser Cly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg
110 i u.
Lln Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Trp Gin Leu Asp Leu Ser ?r<
Val Pro Tle Gin Lys Val Gin Zisp Asp Thr Lys Thr ^eu Tle Lys Th lle Val Thr Arg Tle Asn Asp lle Ser His Thr Gin Ser Val Ser Ser
Gin I.ys Val Thr Gly Len Asp Lne Tle Pro y^y Leu His Pru u Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Tor Leu Ala Val Tyr Gin Gin
Thr Ser Met Pro Ser Arg Ase Val Tle Gl.n Tle Ser Asn Asp Leu
Asn Leu Arg Asp I.eu Leu iris Val Leu Ala
Pru Trp Ala Ser Gly Leu Glu: Thr Leu Ase Ser Leu GLy Gle
Glu Ala Ser Gly Tyr
1S • · · * í *f s • * A « ·
A A · A A • A A A A · • * * A A V • * A A A A « A ·
A A A · • AAA
AAAA A
A A
AA A A
120 125
Ser Thr Gin Val Val Ala Lei:
ar urg
13b
G-η Gly Ser Leu Gin Asp Mer Len Lys Gin Leu Asp Leu Ser L
145
Gy Cys fSEG TL NO: 5) ln
Met Arg Val Lre Ile Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu Tli
Lys ’l'hr Tle Va! Thr Arg Le Asn Asd Ile Ser His Thr Gin Ser Val ?er Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly Lnu Asp Phe TG e ?ro Gly Leu FTls
Pro ile Leu Thr Leu Sec Lys Met Aso Gl.n Thr Leu Ala Val Ty u5
Gin ile Leu Thr Ser Met Hro Ser Arg Asp Val i Le Gin 1e o e τ·
Tu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu /Oa pb.p ;-r . ve u Ala Ser Gu.' Ge Glu ''Tu L>nu
12C * 4 «
4 4 4 · • · · 4
4 4 · «
4 4 4
4* * * i * 4 4 4 4
444 « 4 » 4 4 4 4 • 4 4 4 4«
G1 y O L y Vu i Leu e 1 u A .i. d n θ r G1 y i y r S r i r1r G1 j v a 1 7n 1 A1 a Lsu no m no
Jer Arg Leu Gin Giy Ser Leu Gin Asp Met Leu Trp Gin Leu Asp Lnu
Ser Fro Cly Gys '3GQ yoyo;,
Met Arg Val Pro Tle Gin Cys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu
Thr Tle Val Thr Ar a Tle Asn Asp Tle Ser I!
Thr Gin Ser
Ser Ser Mys G.lrj Lys Val Thr Cly Leu Asp Pho ile Pro G1 y Leu Hi:
Pru II .eu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Va, Tyr Gin lln . íe Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asp Val 11c Gin Tle tup· Lea Gnu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Va.l Leu .Ala vir rG £7 .· r
Lis Gen Pro Asp Ala Ser G!v Gen '1 1 0
Thr Gen A,sp· Ser
- Z .1.
* ·· í i 4 » » 4 4 4 ··«« «· 4 ♦·» · · 444 44 • 4 4 4 4 »
4 4
4 4 4
Glv Val· Leu Glu Ala Ser Gi' ’j Γ 1.? 1 á '7 d, _l_ V d. _ A.. d -L β U
130 l ji ;r Arg l,eu Gin Gly Ser Leu Glu Asp Met Leu Trp Gin Leu
H5
Ser Pro Gly Gys (5Q IL NO:10;
1U
Met .Arg Var Pro T!e Gin Lys Val G,n Asp Asp Thr
Thr 11 e Val Thr Arq Ile Asn Asd I ie Ser His r.'hr Gin Ser Val
5 1 3 -Ί 5
Ser Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly Len Asp Phe Ile Pro Gly Leu Hi«
L0 tu J
Lrc; ile Leu rrhr ·>
Mel A.si.) ni n i lil1 Leu Aha via vaj eyr ;
Gin rie Lnu Thr Ser Mel Pro Ser. Arg Asn Val iie Gin iíe Ser
Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Lnu Ala Phc Ser lv » « v ♦ ·
Cys His Leu Pro Glu Ala Ser Gly Leu Gin Thr Leu Asp Ser Leu zz • · 5» » * · · · *«· * · * · · · · « · • »·« * «· ···« i • * · · « « · · · ·* II ·» «·
10:
110
Glv Val Leu Glu Ala Ser Gl
105 li:
Ser Arg Leu Glr. Gly Ser Leu Gin Asp Mot Leu Trp Cln Leu Asp Leu
145
Ser Pro Gly Cys (SEQ TD NO:11J
10 15
Met Arg Val Pro lle Gin Lys Val Gi.n Asp Asp Tnr Lys Tur eu
25 50
Lys Thr lle Val Thr Arg lle Asn Asp lle Ser ILLa Thr Gin Ser val
Ser Ser Lys Gin Lys Val Thr Gly Lou Asp Phe lle Pro Gly Leu His
Tle Leu Thr len Ser Lvs Met: Asp Clo Thr Leu i cl v 1 v ile Lee Thr Ser Met Pro Sex' I\rfi Asn Vn
Leu
Arg Asp- Leu Leu his Vel len Ala Phe Ser
Ser Cys His Leu Pro Asp Ala Ser Civ Leu Glu ?hr Leu Asp Ser Lei.
100
101
11G
- - · » ► · · , ► · · « * · · · I • · • ft ♦
115
120
Oly iL: y vsi 5reu Gin A^o Ser n,.y :yr Ser lir: iLu m, va_ Ala reu
0 0 1 3.3 14 0
3er Arg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Ke; Leu Trp Gin Leu Asp Leu
5
Ser Pro Gly Cys (SEQ ID NO:12)
Předkládaný vynález se týká biologicky aktivních proteinu, které přinášejí účinné léčení obezity. Přihlašovatelé objevili, že specifická substituce do hydrofobních residuí na povrchu proteinu má za následek zlepšení vlastnosti. Tato residua nemohou být předem určena z primárních sekvencí. Proteiny s těmito substitucemi jsou farmakologicky aktivní a mají redukovanou náchylnost k agregaci, pokud jsou porovnány s myšími nebo lidskými formami proteinu. Předkládaný vynález dovoluje, aby byly obezitni proteiny lépe formulovatelné ve vyšších koncentracích a zvyšuje farmaceutickou eleganci jejich použití, neboť jsou použitelné spolu s běžně užívanými farmaceutickými látkami..
Proteiny podle vynálezu jsou získány rekombinantními technikami . Způsoby pro vytváření substitučních mutací v předem, daných místech DNA, které mají známou sekvenci jsou dobře známy, jako je například Mlž prímérová mutageneze. Mutace, které mohou být provedeny v L)N7\ kódování
- 24 • « » * I * · 0 0 0
0 0 · 0 0 · « « 1 0 · «0 (DeBoer, 75,444 A2, existujících antí-obezitních proteinů nesmí umístit sekvenci mimo čtecí rámec a výhodně nevytvoří komplementární oblastí, které by mohly vytvářet sekundární mRNA strukturu
H.A. a kol., publikace Evropského patentu č publikováno 30. března 1983) .
Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být produkovány buď rekombinantní DNA technologií nebo známými chemickými procedurami, jako je syntéza proteinů v roztoku nebo v pevné fázi nebo semisyntéza v roztoku započatá proteinovým fragmentem, vázaná konvenčními roztokovými metodami.
A. Pevná fáze
Syntéza nárokovaných proteinů může být prováděna syntézou peptidu v pevné fázi nebo rekombinantními metodami. Principy chemické syntézy polypeptidů v pevné fázi jsou dobře známy odborníkům a mohou být nalezeny v obecných textech, pojednávajících o této oblasti jako je Dugas, H. a Penney, C., Bioorganíc Chemistry, Sprinqer Verlag, New York, (1981), 54-59. Peptidy mohou být například syntetizovány způsobem v pevné fázi, používající peptidový syntetizátor PE-Applied Biosystemt 433A (Perkin Elmer - Applied Biosystems Division, Poster City, Calífornia) a společností Applied Biosystems cykly syntézy, dodávané Boc-aminokysellny a další reagenty jsou komerčně dostupné od společnosti PE-Applied Bíosystems a dalších společností, dodávajících chemické produkty. Sekvenční boc chemie, používající dvoj vazné protokoly je aplikována na výchozí ρ-methyl benzhydryl aminovou pryskyřici pro výrobu C-terminálnich karboxamrdu.
to Pro výrobu C-termmálních kyselin je používána odpovídající PAM pryskyřice. Arginin, asparagin, glutamin, histidin a methionin jsou vázány s použitím předběžně vytvořených hydroxy benzotriazolových esterů. Mohou být používány následující způsoby ochrany postranních řetězců:
Arg, tosyl
Asp, cyklohexyl nebo benzyl
Cys, 4-methylbenzyl
Glu, cyklohexyl
His, benzyloxymethyl
Lys, 2-chlorbenzyloxykarbonyl
Met, sulfoxid
Ser, benzyl
Thr, benzyl
Trp, formy1
Tyr, 4-bromkarbobenzoxy
Odstranění chránící skupiny Boc může být provedeno pomocí trif luoroctové kyseliny (tr if luoroacetic acid TFA) v methylenchlorídu. Odstranění formylu z Trp je provedeno působením 20¾ píperidinu na peptidylovou pryskyřici v dimelhylformamidu po 60 minut při 40 °C. Met (O) může být redukován působením na peptidylovou pryskyřici pomocí TF'A/ dimethylsu.l. fid/ koncentrovaná HCl (95/5/1) při 250 °C po dobu 60 minut. Pomocí, výše uvedených předběžných zpracováni mohou být peptidy dále zbaveny ochrany a odštěpeny od pryskyřice bezvodým fluorovodíkem, obsahujícím směs 10 i mkrcsolu nebo m-kresolu a 1J v ρ-thiokresolu nebo směs mkresol/p-Lhiokresol/dimethylsulfid. Štěpení skupiny nebo skupin, chránících postranní řetězce a štěpeni řetězců od * v · pryskyřice může být prováděno při teplotě 0 °C nebo nižší, výhodně při teplotě -20 °C po třicet minut a potom po třicet minut při 0 °C, Po odstranění fluorovodíku jsou peptid/pryskyříce promývány ve vodě. Peptid je extrahován ledovou kyselinou octovou a lyofi lizován. Purifikace se provádí reverzní fázovou Clfi chromatograf íí v 0,1 '1 TFA s gradientem vzrůstající koncentrace acetonitrilu, například v 2,2 cm x 25 cm koloně Vydac™ (The Separation Group, lne. Hesperia, California).
Odborníkovi v oboru je zřejmé, že syntéza v pevné fázi také může být prováděna FMOC strategií, a TFA/štěpicí směsí.
B, Rekombinantní syntéza
Proteiny podle předkládaného vynálezu také mohou být vyráběny rekombinantními metodami. Rekombinantní metody jsou preferovány, pokud má být dosaženo vysokého výtěžku. Základní kroky při rekombinantním způsobu přípravy proteinů zahrnuj í:
a) konstrukci DNA, kódující protein podle vynálezu, syntetickým nebo senusyntetickým. způsobem (nebo izolací z přírodních zdrojů),
b) integraci kódující sekvence do vektoru exprese způsobem vhodným pro expresi proteinu buď samotného nebo jako fúzovaného proteinu
o) transformací vhodné eukaryotické nebo prokaryotické hostitelské buňky vektorem exprese a cl) získáni a purifikaci rekombinantně získaného proteinu.
t *4 ·· · · 44 •*· ·«· * « «4 ·* *44 > · · 4444 g ·· *444 444 ··· ·· ·4 44 44 4·
a) Konstrukce genu
Syntetické geny, jejichž ni vítro nebo in vivo transkripce a translace přináší produkci požadovaného proteinu, mohou být konstruovány způsoby, dobře známými odborníkům. Vzhledem k přirozené degeneraci genetického kódu je odborníkovi zřejmé, že může být sestrojeno značné, byť omezené, množství DNA sekvencí, které kódují proteiny podle vynálezu. Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu je syntézy dosaženo rekombinantní DNA technologií.
Metodologie konstrukce syntetických genů je dobře známa odborníkům (Brown, E.L. a kol., Methods m Enzymology, Academie Press, New York, NY, 68:109-151 (1979)). DNA sekvence, odpovídající syntetickým genům, proteinů podle vynálezu může být vytvořena pomocí konvenčního přístroje pro syntézu DNA, jako je Applied Biosystems Model 380A nebo 380B DNA Synthetiser (Perkin Elmer, Applied Biosystems Division, Foster City, California).
V některých aplikacích je žádoucí modifikovat kódující sekvenci proteinu podle vynálezu tak, aby zahrnovala vhodné místo štěpení, citlivé na proteázu, například mezi signální peptid a strukturální protein, které usnadňuje řízenou excizi signálního peptidu od fúzovaného proteinového konstruktu.
Gen kódující protein podle vynálezu také může být vytvořen použitím polymcrázové řetězové reakce ÍI-CR), Tempiát.em může být cDNA knihovna (komerčně dostupná od společností CLONETECH nebo STRATAGENE) nebo mRNA izolovaná z lidské
• « * · · tukové tkáně. Tyto metodologie jsou dobře známy odborníkům, viz například Maniatis, T. a kol., Molecular Cioning: A Laboratory Manual, 2.vydání, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York ( 1989) .
b. Přímá exprese nebo fúze protě inu
Proteiny podle vynálezu mohou být vytvořeny buď přímou expresí nebo jako fúzované proteiny obsahující protein podle vynálezu s následujícím enzymatickým nebo chemickým štěpením. Je známo množství peptidáz (například trypsin), které štěpí polypeptíd ve specifických místech nebo natrávi peptid od amino nebo karboxy konce peptidového řetězce (například diaminopeptidáza). Dále existují jisté chemické látky (například kyanogenbromid), které štěpí polypept i.dový řetězec ve specifických místech. Odborníkovi jsou zřejmé nutné modifikace sekvence aminokyselin (a syntetických nebo semi-syntetických kódujících sekvencí, pokud jsou použity rekombinantní postupy) pro vložení specifických vnitřních míst štěpení. Viz například Oarter, P., Kapitola 13 v Protein Puri fication: From Molecular Mechanism to I.arge Scale Processes, Lanchsch, M., a kol., (Editoři) American Chemical· Society, Washington, D.C, (1990).
c . Konst.ru kce vek Lor u
Konstrukce vhodných vektorů, obsahujících požadované kódující a řídící sekvence používá standardní ligační techniky. Izolované plasmldy nebo fragmenty DNA ·5Ο(1 • · · · · • · · « · « • · · · * »·· ·· ·· ·♦ · · i * · 1 • · · · štěpeny, upraveny a znovu ligovány způsobem, nutným k vytvoření požadovaných plasmidů.
K dosažení translace požadovaného proteinu se vloží zkonstruovaná syntetické DNA sekvence do kteréhokoli z nepřeberného množství vhodných vektorů exprese rekombmantní ch DNA sekvencí použitím odpovídajících restrikčních endonukleáz. Syntetická kódující sekvence ge navržena tak, aby obsahovala místa štěpitelná restrikčními endonukleázami na obou koncích transkriptu, aby se usnadnila izolace nebo naopak vložení do vektoru exprese a ampliřikace a exprese plasmidů. Izolované cDNA kódující sekvence mohou být snadno modifikovány použitím syntetických spojovníků pro usnadnění vložení této sekvence do požadovaného klunovacího vektoru způsoby dobře známými odborníkům. Konkrétní volba endonukleáz je diktována vzory pro štěpeni restrikčními endonukleázami v použitém vektoru exprese. Restrikční místa jsou volena tak, aby správné orientovaly kódující, sekvenci s řídící sekvencí tak, aby bylo dosaženo správného rámcového člení a exprese proteinu podle vynálezu.
Obecně jsou v uvedených hostitelích používány plasmídové vektory obsahují promotory a řídící sekvence, které jsou odvozeny z druhů, slučitelných s hostitelskou buňkou. Vektor obvykle nese replikační místo, stejně tak jako sekvenci markéru, která umožňuje provedení fenotypové selekce v transformovaných buňkách. Tak například E. coh ie typicky transformována použitím pBR322, což jc plasmid, odvozený z druhu E. coli (Bolívar, F., a kol., Gene 2:95-113 (1977)1. Plasmě pDR322 obsahuje geny pro resistenci na ampicilin a tetracykíín a proto poskytuje jednoduché prostředky pro β 9 • 9 · · • · »
9 9
9 9 • « 9 9 9 »♦ »·«·
9«
9 9 9
9 · 9
9 9 9 ·
9 9
9 99 identifikaci transformovaných buněk. Plasmíd pBR322 nebo další mikrobiální plasmíd musí také obsahovat nebo být modifikován tak, aby obsahoval určité promotory a další řídící prvky, které jsou běžně používané v rekombinantní DNA technologii..
Požadovaná kódující sekvence je vložena do vektoru exprese ve vhodné orientaci, aby byla transkribována od promotoru a ribosomového vazebného místa, přičemž oba tyto prvky musí být funkční v hostitelské buňce, ve které má být protein exprimován. Příkladem takového vektoru exprese je plasmíd, popsaný v Belagaje, R.M. a kol., U.S. Patent č. 5,304,473 vydaný 19. dubna 1994, který je do popisu předkládaného vynálezu zahrnut jako reference. Gen kódující A-C-B proinsuíin, popsaný v U.S. patentu č. 5,304,473 může být odstraněn z piasmidu pRB132 restrikčními enzymy Ndel a BamHí Geny kódující protein podře předkládaného vynálezu mohou být vloženy do hlavního plasmidového řetězce v Ndel/BamHI kazetě restrikčních fragmentů.
d_. Prokaryotická exprese
Obecně jsou prokaryota používána pro klonování DNA sekvenci při konstrukci vektorů, použitelných podle předkládaného vynálezu. Například E. ccd i K12 kmen 294 (ATCC č, 31446) je obzvláště vhodný. Další mikrobiální kmeny, které mohou být použity zahrnují E. coli 5 a k. coli X1776 (ATCC č. 31537). Tyto příklady jsou ilustrativní a neomezují rozsahu vynálezu.
Prokaryota jsou také používána pro expresi. Mohou být « · v * ·»·«
·* ·· použity výše uvedené kmeny, stejně tak jako E. coli W3110 (prototropní, ATCC č. 27325), bacily jako je Bacillus subtilis a další enterobakterie jako je Salmonella typhimurium nebo Serratia marcescans a různé druhy Pseudomonas. Promotory, vhodné pro použití v prokaryotickém hostiteli zahrnují β-laktamázu (vektor pGX2907 [ATCC 39344] zahrnuje replikon a β-laktamázový gen) a laktózový promotorový systém (Chang, A.C.Y. a kol., Náturo, 275:617624 (1978); a Goedel, D,V. a kol., Náturo 281:544-548 (1979)), alkalickou fosfatázu, tryptofanový (trp) promotorový systém (vektor pATHl [ATCC č. 37695] je navržen s cílem usnadnit expresi otevřeného čtecího rámce jako trpE fúzovaný protein pod kontrolou trp promotoru) a hybridní promotory jako je tac promotor (izolovatelný z plasmidu pDR540 ATCC-37282). Na druhé straně však jiné funkcionální bakteriální promotory, jejichž nukleotídové sekvence jsou obecně známy, dovolují odborníkovi v oboru ligovat. je k DNA kódu proteinu použitím linkeru nebo adaptorů pro podporu jakýchkoli požadovaných restríkčních míst. Promotory, určené k použití v bakteriálních systémech budou také obsahovat Shine-Dalgarno sekvencí operativním způsobem připojenou k DNA kódujícímu proteinu.
e. Bukaryotická exprese
Proteiny mohou být produkovány eukaryotickým způsobem expresi v eukaryot ickýc.h systémech. Výhodné promotory, ovládající transkripci v savčích hostitelských buňkách mohou být získány z různých zdrojů, jako jsou například genomy virů jako: polyom, Simian virus 40 (SV40), adenovirus, retroviry, virus hepatitídy-B a obzvláště výhodně *
4·«4
4*44 4 • 4 cytomegalovíry nebo heterologní savčí promotory, například β-aktin promotor. Rané a pozdní promotory viru SV40 jsou výhodně získány jako SV40 restrikční fragment, který také obsahuje SV40 virální počátek replikace [Fiers, W. a kol., Nátuře, 273:113-120 (1978)]. Celý genom viru SV40 muže být získán z plasmidu pBRSV, ATCC 45019. Okamžitý raný promotor lidského cytomegaloviru může být získán z plasmidu ρΟΜΒβ (ATCC 77177). Promotory z hostitelské buňky nebo z příbuzných druhů mohou pochopitelně být použity také.
Transkripce DNA kódu nárokovaných proteinů vyššími eukaryoty je zvýšena vložením enhancerové (zesílujcí) sekvence do vektoru. Enhancery jsou cis-působící prvky DNA, obvykle okolo 10-300 párů bází, které působí na promotor a zvyšují jeho transkripci. Enhancery jsou relativně nezávislé na orientaci a poloze a byly nalezeny u 5' [Laimins, L.A. a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 78:464-468 (1981)] a 3' [Luskz, M., a kol., Mol. Cell. Bio. 3:1108-1122 (1983)] konce transkripční jednotky, uvnitř intronu [Banerji, J. a kol., Cell. 33:729-740(1983)] stejně tak jako uvnitř samotné kódující sekvence [Osborne, T. a kol., Moř. Cell. Bio. 4:1293-1305 (1984)]. Nyní je známo mnoho enhancerů ze savčích genů (globin, RSV, SV40, EMC, aíastasový albumin, afetoprotein a insulin). Typicky však budou používány enhancery z virů eukaryotických buněk. Příklady zahrnují SV40 pozdní enhancer, enhancer raného promotoru cytomegaloviru, enhancer polyomu na pozdní straně replikačního počátku a enhancery adenoviru.
Vektory exprese, používané v eukaryotických hostitelských buňkách (kvasinky, houby, hmyz, rostliny, zvířata nebo
«4 4 4 4 4
* 4 4
4 4 4 • · 44
4 4 4 4
4> 4
44 jaderné baňky z dalšícn vícebuněčných organismů) budou také obsahovat sekvence, které jsou nutné pro ukončení transkripce, které mohou ovlivnit expresi mRNA. Tyto oblasti jsou transkribovány jako polyadenyíováné segmenty v netransiatovaných částech mRNA, kódující protein. 3' netranslatované oblasti také zahrnují termínační místa transkripce.
Vektor exprese může obsahovat selekční, gen, označovaný také jako selekční markér. Příklady selekčních markérů pro savčí buňky jsou dihydrofolát reduktáza (DHFR, která může být odvozena z BglII/Hindl11 restrikčního fragmentu pJOD-10 [ATCC 68815]), thymidin kináza (thymidm kináza viru herpes simplex je obsažena v BaniHI fragmentu vP-5 klonu (ATCC 2028) nebo kmeny, rezistentní na neomycin (G418), které lze získat z pNN414 kvasinkového artificiálního chromosomového vektoru (ATCC 31/682). Pokud jsou Lakové selekční markéry úspěšně přeneseny do savci hostitelské buňky, transfektovaná savčí buňka může přežít, pokud je umístěna pod selektivní tlak. Existují dvě široce používané odlišné kategorie selekčních režimů. První kategorie je založena na metabolismu buňky a používá mutované buněčné linie, které postrádají schopnost růst bez vhodného doplněného média. Dva příklady jsou: CHO DHFR buňky (ATCC CRL-9096) a myší LTKC buňky (L-M(TK-) ATCC CCL-2.3). Tyto buňky postrádají schopnost růst bez přidání takových živin, jako je thymidín nebo hypoxantm. Jelikož tyto buňky postrádají jisté geny, nutné pro úplnou dráhu nukleotidové syntézy, nemohou přežít, pokud chybějící nukleotidy nejsou poskytnuty v podávaném médiu. Alternativou k podáváni příslušného doplněného média je vložit neporušený DHFR nebo TK gen do buněk, které tyto geny postrádají a tím *
• « · · • · 4 • a ♦· pozměnit jejich růstové požadavky. Jednotlivé buňky, které nebyly transformovány pomoci DHFR, respektive TK genu nebudou schopny přežít v nedoplněném médiu.
Druhou kategorií je dominantní selekce, která se odvolává na selekční schéma, použité u libovolného buněčného typu a nevyžaduje použití mutované buněčné linie. Toto schéma typicky používá chemickou látku pro zastavení růstu hostitelské buňky. Ty buňky, které mají nový gen jsou schopny exprimovat protein, poskytující jim odolnost proti uvedené látce a tudíž přežít selekci. V příkladech takové dominantní selekce se jako chemická látka používá neomycin (Southern, P.J. a kol., J. Molec. Appl. Genet.. 1:327-341 (1982)], mykofenolová kyselina [Mulligan, R.C. a kol., Science 209:1422-1427 (1980)] nebo hygromycin (Sudgen, R. a kol., Mol. Cell. Biol. 5:410-413 (1985)]. Tyto tři příklady podané výše používají bakteriálních genů pod eukaryotickou kontrolou k předání resistence na odpovídající látku, například G418, neomycin (geneticin), xgpt. (mykofenolová kyselina) nebo hygromycin.
Výhodný vektor pro eukaryotickou expresi je pRc/CMV. pRc/CMV je komerčně dostupný od společnosti Tnvitrogen Corporation, San Diego, CA. Pro potvrzeni správné sekvence v konstruovaném plasmidu je použita ligační směs pro transformaci E. coli K12 kmen DH5a (ATCC 314 46) a úspěšné transformanty jsou selektovány, pokud je to potřebné, antibi.otickou rezistencí. 7, transformuntů jsou připraveny plasmidy, analyzovány restrikcí a/nebo sekvencovány způsobem podle článku Messíng, J. a kol., Nucleic Acid Res. 9:309-321 (1981) .
β φ» φ« » φ φ • φ * φ « • · φ · φ φ « φ φ φ · φφφ φ« φφ « ΦΦΦΦ « · φ ΦΦΦΦ φ φ φ φφ φ * ΦΦΦΦ φ φ φ φ * • Φ Φ Φ Ο Φ
Hostitelské buňky mohou být transformovány vektory exprese podle vynálezu a kultivovány v konvenčních živných médiích, jak je vhodné pro indukci promotorů, selekci trans formantů nebo amplífikaci genů. Kultivační podmínky, jako je teplota, pH a podobně jsou ty, které byly dříve použity u hostitelských buněk, zvolených pro expresi a jsou zřejmé každému odborníkovi v oboru. Techniky transformace buněk výše uvedenými vektory jsou dobře známy odborníkům a mohou být nalezeny v takových obecných referencích, jako je Maniatis, T. a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vyd. Cold Spring Barbor Press, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989) nebo Current Protocols in Molecular Biology (1 989) a dodatky.
Výhodné hostitelské buňky použitelné pro expresi vektorů, kódujících proteiny podle vynalezu ve vyšších eukaryotech zahrnují: ledvinové buňky africké ze.le.né opice transformované pomocí SV40 (COS-7, ATCC CRI-1651), transformované lidské primární embryonální buněčné linie 293 [Graham, F.L. a kol., J. Gen. Virol. 36:59-72 (1 977); Harrison T. a kol., Virology 77:319-329 (1977); Graham, F.L. a kol., Virology 86:10-21 (1978)]; ledvinové buňky mláděte křečka [BHK-21 (C-13), ATCC CCL-10; MacPherson, I. a kol., Virology 16:147-151 (1962)]; ovariální buňky čínského křečka [CHO/DHFR (ATCC CRL-9096) i; mz39 Sertoiiho buňky [TM4, ATCC CRL-1715; MaLher, J.P., Bicd. Reprod. 2.3:243-252 (1980)]; ledvinové buňky africké zelené opice (VĚRO 76, /ATCC CRL1587); lidské červikálrí epiteloidní karcinomové buňky (HeLA, ATCC CCL-2); psí ledvinové buňky (MDCK, ATCC CCL-34); krysí jaterní buňky (BRL 3A, ATCC CRL-1442). lidské tf » <
• * ♦ »· 0 0 0 • · díploidní piicní buňky (Wl-38, ATCC CCL-75); lidské hepatocelulární karcinomové buňky (Hep G2, ATCC HB-8065) a myši buňky nádoru prsní žlázy (MMT 060562, ATCC CCL51).
f. Exprese v kvasinkách
Kromě prokaryotických a savčích hostitelských buněk mohou být jako hostitelské buňky použity také kvasinky. Saccharomyces cerevisiae, běžné pekařské kvasnice, představují nejčastěji užívaný eukaryotický organismus pro expresi heterologních proteinů, i když je k disposici řada dalších kmenů. Pro expresi v Saccharomyces je příkladem běžně užívaného vektoru plasmid YRp7 [ATCC-40053, Stínchcomb, D. T. a kol., Nátuře 282:39-43 (1979); Kingsman, A. J. et al., Gene 7:141-152 (1979); Tschumper, G. et al., Gene 10:157-166 (1980) ] . Tento plasmid již obsahuje trp gen, který poskytuje selekční markér pro mutovaný kmen kvasinek, postrádající schopnost růstu v tryptofanu [například ATCC 44076 nebo PEP4-1; Jones, E. W. , Genetice 85:23-33 (1977)] .
Vhodné sekvence promotorů pro použití v kvasinkovém hostiteli zahrnují promotory pro 3-fosfoglycerát kinázu, který se nachází v plasmidu pAPlŽBD ATCC 53231 [Patel, A. et al., U.S. Patent No. 4,935,350, vydaný 19. června 1990] nebo další glykolytické enzymy, jako je enoláza která se nachází v plasmidu pACl (ATCC 39532), glyceraldchyd-3-fosiát óehydrogenáza, derivovaná z plasmidu pHcGAPCl (ATCC 57090, 57091), zymomonas mobilis [[ngram, L.O. a kol., Patent, č. 5,000,000 vydaný 19. března 1991], hexokináza, pyruvát dekarboxyláza, fosfofruktokináza, glukóza-6-fostát ·· • ·· • · * • · « • · · · • · · » »· ♦· ·· ·» • * « · • · ·« • ·»« · · * * * ·· «« isomeráza, 3-fosřogiycerát mutáza, pyruvát kináza, triosefosfát isomeráza, fosfoglukózová isomeráza, a glukokináza.
Další kvasinkové promotory, což jsou indukovatelné promotory, které mají další výhodu v tom, že transkripce je řízena růstovými podmínkami, jsou promotorové oblasti pro alkohol· dehydrogenázu 2, isocytochrom C, kyselou fosfatázu, degradativní enzymy asociované s dusíkovým metabolismem, metalothíonem, který je obsažen v plasmidovém vektoru pCL28XhoLHBPV [ATCC 39475; Reddy, V. B. a kol., U.S. Patent No. 4,840,896, vydaný 20. června 1989], glyceraldehyd 3fosfát dehydrogenáza a enzymy odpovídající za použití maltózy a galaktózy, jako je GALl promotor, který se nachází v plasmidu pRY121 (ATCC 37658). Vhodné vektory a promotory pro použití při expresi v kvasinkách jsou dále popsány v Hitzeman, R. A., a kol., Evropský patent č. 73,657A1, vydaný 9. března 1983. Kvasinkové enhancery jako je RAS Gal z Saccharomycos cerevisiae, který se nachází spolu s CYC1 promotérem na plasmidu YEpsec-hllbeta (ATCC 67024)jsou také výhodně používány s kvasinkovými promotory.
Příklady provedení vynálezu
Následující příklady poskytují ilustraci způsobů výroby nárokovaných proteinů podle předkládaného vynálezu. Rozsah předmětu však není omezen následujícími příklady, ale vyplývá výhradně z přiložených patentových nároků.
» β a · * A « · ► AAA • A · A 4
A · 4
A A ·
Příklad 1
Konstrukce vektoru
Gen o SEQ ID NO: 13 je složen ze dvou segmentů o asi 220 párech bází a asi 240 párech bází, které jsou odvozeny z chemicky syntetizovaných oligonukleotidů.
(SEQ ID NO:13)
1 CATATGAGGG TACCTATCCA AAAAGTACAA GATGACACCA AAACACTGAT
51 AAAGACAATA GTCACAAGGA TAAATGATAT CTCACACACA CAGTCAGTCT
101 CATCTAAACA GAAAGTCACA GGCTTGGACT TCATACCTGG GCTGCACCCC
151 ATACTGACAT TGTCTAAAAT uGACCAGmCh CTGGCAGTCT ATCAACAGAT
201 CTTAACAAGT ATGCCTTCTA GAAACGTGAT ACAAATATCT AACGACCTGG
251 AGAACCTGCG GGATCTGCTG CACGTGCTGG CCTTCTCTAA AAGTTGCCAC
301 TTGCCATGGG CCAGTGGCCT GGAGACATTG GACAGTCTGG GGGGAGTGCT
351 GGAAGCCTCA GGCTATTCTA CAGAGGTGGT GGCCLT&AgC AGGCTGCAGG
401 GGTCTCTGCA AGACATGCTG TGGCAGCTGG ACCTGAGCCC CGGGTGCTAA
451 TAGGATCC
Segment o 220 párech bází se nachází od místa Ndel k místu Xbal v poloze 220 v kódující oblasti a je vytvořen ze sedmi překrývajících se oligonukleotidů, jejichž délky jsou od 34 do 83 bází. Segment o 240 párech bází, který se nachází od místa Xbal do místa BamHI je také vytvořen ze sedmi překrývajících se oligonukleotidů jejichž délky jsou v rozmezí od 57 do 92 bází.
Pro vytvoření těchto fragmentů bylo sedm odpovídajících oligonukleotidů smícháno v ekvimolárním množství, obvykle v koncentracích asi 1-2 pikomolú na mikrolitr. Před spojením
9 ·ι·»
4*4 4 4 byly všechny oligonukleotidy s výjimkou těch, které se nacházejí na 5''konci segmentu, i osf orylovány v standardním kinázovém pufru s T4 DNA kinázou za podmínek specifikovaných dodavatelem látky. Směs byla zahřívána na 95 °C a potom ponechána pomalu ochladit na pokojovou teplotu po dobu 1-2 hodin, aby bylo zajištěno správné zpracování cdigonukleotidů. Oligonukleotidy byly potom ligovány navzájem a do odpovídajícího klonovacího vektoru, jako je pUC18 nebo pLJCIO použitím T4 DNA lígázy. Pufry a podmínky, které byly použity, se shodovaly s doporučenými podmínkami dodavatele enzymu. Vektor pro fragment o 220 párech bází byl natráven pomocí Ndel a Xbal, zatímco vektor pro fragment o 240 párech bází byl před použitím natráven pomocí Xbal a Bamlíl. Pro transformací buněk E. coli DH10B (komerčně dostupných od Life Technologies, výrobce produktů GIBCO/BRL, Grand Island, NY) byly použity ligační směsi a transformované buňky byly umístěny na Lrypton-kvasinkové (TY - tryptone-yeast) misky (TY, Difco, Detroit, MI), obsahující 100 pg/ml ampicilinu, X-gal a IPTG. Kolonie, které přes noc vyrostly, byly pěstovány v tekutém médiu TY s 100 pg/ml ampicilinu a byly použity pro izolaci plasmidu a DNA sekvenační analýzu. Plasmidy se správnou sekvencí byly ponechány pro sestaveni úplného genu. Toho bylo dosaženo gelovou purifikaci fragmentů s 220 páry bází a fragmentů s 240 páry bází a llgací těchto dvou fragmentů do vektoru exprese jako je pRB182 ze kterého byla vynechána sekvence kódující Λ-C-B proinsulin a který byl před použitím natráven pomocí Ndel a BamHI.
Alternativně může být natráven plasmíd pET30 (Novagen, Madison, WI) pomoci Ndel a Bam.HI a požadovaná DNA sekvence,
- 4ϋ * e • · * * < • · · · · • · · · · · * kódující proteiny podle předkládaného vynálezu, může být vložena procedurami podle stavu techniky, které jsou zde popsány. Zdrojem DNA jsou syntetické oiigonukleotidy, které jsou spojeny způsobem podle stavu techniky, který je zde popsán.
Příklad 2
Plasmid pOJ722 (NRL, č. B-21,654), obsahující DNA sekvenci kódující požadovaný protein, byl připraven způsobem analogickým přikladu 1. Plasmid byl natráven pomocí. Pinii a Bsv36I. Sekvence rozpoznávaná těmito enzymy leží uvnitř oblasti kódující protein mezi nukleot i.dovými polohami 275 a 360. Kionovací vektor neobsahuje tuto rozpoznávací sekvenci. Z tohoto důvodu po natrávení restrikčními enzymy Prali a Bsu361 byly pozorovány pouze dva fragmenty, jeden odpovídající fragmentu vektoru a druhý fragmentu o asi 85 párech bází, který byl uvolněn z protein kódující sekvence. Tato sekvence byla nahrazena libovolnou DNA sekvencí, kódující aminokyselinovou substituci podle předkládaného vynálezu. Tyto DNA sekvence byly syntetizovány chemicky jako dva oiigonukleotidy s komplementárními bázemi a konci, které jsou kompatibilní s konci, vzniklými netrávením pomocí enzymy PmlI a Bsu36I. Chemicky syntetizované oiigonukleotidy byly smíchány v ekvimoiárním množství (1-10 pikomolů na mikroli.tr), zahřívány na 95 °C a ponechány chlazeny pomalým poklesem teploty na hodnntu 2Q-25 °C. Takto získané oiigonukleotidy byly použity ve standardní ligační. reakci, Ligační produkty potom byly transformovány do E. coli. DH10B buněk ÍGíBCO BRL) a transformované buňky byly umístěny na TY misky obsahující 10 mikrogramú na mililitr tetracyklinu (Sigma, St. Louis, MO) . Kolonie, které vyrostly přes noc, byly pěstovány v tekutém TY médiu s 10 mikrogramy na mililitr tetracyklinu a byly použity pro plasmidovou isolací a DNA sekvenční analýzu. Plasmidy se správnou sekvencí byly uchovány.
Příklad 3
Plasmid exprese pHS787 (Protein SEQ ID NO: 6)
Vektor pHS692, získaný způsobem analogickým postupu z. příkladu 1 (40 pg) byl natráven 20 jednotkami PmlI (New
Eng.land Biolab, Beverly, MA) v pufru „New England Biolab bufřer 1 při teplotě 37 °C po dobu dvě hodiny. Pufrovací sůl byla změněna na „New England Biolab buffer 3 a bylo přidáno 20 jednotek BstXl (New England Biolab), čímž započalo natrávení, které pokračovalo po dobu dvou hodin při teplotě 55 °C. Na natrávenou látku bylo působeno 20 jednotkami alkalické fosfatázy (Boehrmger Mannheim, Indianopolis, IN) při teplotě 37 °C po dobu 30 minut. Vzniklá natrávená látka byla purifikována na 1 % aqarózovém gelu a fragment o 4170 párech bází byl isolován metodou „freeze-squeeze.
Oligonukleotídy 13824 (5'-TGA GGC TTC CAG GAC TCC CCC CAG ACT GTC CAA TGT CTC CAG
GCC ACT GGC CTC TGG CAA uTG GCA ACT TTT AGA GAA GGC CAG CAG -3 ' (SEQ ID NO:14) a 13825 (S’-GTG CTG GCC TTC TCT AAA AGT TGC CAG TTG CCA GAC GCC AGT GGC CTG GAG ACA TTG GAC AGT CTG GGG GGA GTC CTG GAA GCC-3’ ► · · 4 «ι · · (SEQ ID NO:15) byly kinázovány v přítomností lx kínázového pufru, 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM MgCl2, 0.5 mM ATP, 1 mM DTT, and 5 jednotek T4 polynukleotidové kinázy (GíBCO BRL) při. 37 °C po 30 minut.
The PmlI/BstXI linearizovaný pHS692 vektor a lmkery 13824 a 13825 byly ligovány v lx kínázového putru, 0.5 mM ATP and 1 jednotky T4 DNA ligázy (GIBCO BRL) při teplotě 16 °C po jednu noc. Ligační produkty byly transformovány do E. coli BL21(DE3) (NOVAGEN) a kolonie vypěstované na TY miskách s přidáním 10 μς/ιηΐ tetracyklinu byly analyzovány. Byla isolována piasmidová DNA, která byla podrobena DNA sekvenaci na sekvenceru PE-Applíed Biosystems 370 DNA sequencer. Plasmidy obsahující očekávané fragmenty od NdeT do BamllI o okolo 400 párech bází byly uchovány a nazvány pHS787.
Příklad 4
Plasmid exprese (Protein SEQ ID NO:3)
Plasmid pOL722 byl natráven pomocí PmlT a Bsudhf.
Syntetický DNA fragment, který má sequenci 5'-SEQ ID NQ:16: (SEQ ID N0:16)
TGAGGCTTCCAGGACTCCCCCCAGACTGTCCAATGTCTCCAGGCCACTGGCGTCTGGCAA
GTGGCAACTTTTAGAGAAGGCCAGCAC zpracovaný se sekvencí a * a « « » » » a * *»«*» « • · » · · ♦ * • · · · i • · «a * *
5’-3EQ ID NG:17; (SEQ ID N0:17)
GTGCTGGCCTTCTCT/tAAAGTTGCCACTTGCCAGACGCCAGTGGCCTGGAGACATTGGAC
AGTCTGGGGGGAGTCCTGGAAGCC byl vložen mezi místa PmlI a Bsu.36I. Po ligaci, transformaci a isolaci plasmídu byla sekvence, syntetického fragmentu ověřena DNA sekvenační analýzou.
Techniky pro transformaci buněk výše uvedenými vektory jsou odborníkům dobře známy (Maniatis, T. a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vyd., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1988); Current Protocols in Molecular Biology (1989) a dodatky). Techniky použité při transformaci buněk E. coli, použité při výhodném provedeni předkládaného vynálezu, jak jsou zde popsány, jsou dobře známy odborníkům v oboru. Přesné podmínky, za nichž byly transformované buňky E. coli kultivovány jsou závislé na povaze linie hostitelských buněk E. coli a na použitém vektoru exprese nebo klonováním vektoru. Například vektory, které zahrnují termomducibilní oblasti proinotor-operátor, jako je cl857 termoinducibilni lambda fugová oblast promotor-operátor, vyžadují teplotní posun 2 asi 30 °C na asi 40 °C kultivačních podmínkách, aby byla indukována syntéza proteinu.
neomezujícím výčtu E. 1,640, L641, L695,
Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu byly jako hostitelské buňky použity buňky E. coli K12 RV.308, ale je možné použití, i řady dalších buněčných linií, jako jsou v coli K 12 L201, L687, L 693, L507,
L814 (E. co li B) ,
T r a nsf ormováné hostitelské buňky jsou potom umístěny na vhodnou kultivační půdu pod selektivním tlakem antibiotika, odpovídajícího genu resistence, který je přítomen v piasmidu exprese. Kultury jsou potom inkubovány po dobu a při teplotě, které odpovídají zvolené linii hostitelských buněk.
Proteiny, které jsou exprimovány v bakteriálním systému exprese o vysoké úrovní, typicky agregují v granulích nebo inkluznich tělesech, která obsahují vysokou úroveň hyperexprimovaného proteinu [Kreuger, J.K.
Protein Folding, Gierasoh, L.M. a King, J. editoři, publikace American Associatíon for the Advancement oí Science č. 89-18S, Washington, D.C., 136-142 (1990)]. Takové proteinové agregáty musí být rozpuštěny, aby byla možná jejich další purifikace a iso.lace požadovaného proteinového produktu. (Kreuger, J.K. a kol., viz výše}. Pro solubilízaci takových proteinů je používaná řada technik, používajících silně denaturující roztoky, jako je guanidin-HCl a/nebo slabě denaturující roztoky jako je močovina. Postupné odstraňování denaturujících činidel (často dialýzou) z roztoku dovoluje denaturovanému proteinu, aby přijal svojí í přirozenou konformaci. Konkrétní podmínky denaturace a skládání jsou určeny konkrétním protein exprimujícím systémem a/nebo uvažovaným proteinem.
Výhodně jsou proteiny podle předkládaného vynález exprimovány s leader sekvencí. Odborník v oboru ví, že je možno použít řadu leader sekvencí, avšak leader sekvence je výhodně Met-R;-, kde je jakákoli aminokyselina s výjimkou Pro a nebo chybí, takže exprimované proteiny mohou být snadno konvertovány na proteiny podle předkládaného vynálezu « ♦ pomocí Catnepsínu C nebo jiné vhodné aminopeptidázy. Rt je výhodně Arg, Asp nebo Tyr a obzvláště výhodně jsou proteiny exprimovány se leader sekvencí Met-Arg. Je zajímavé, že leader sekvence neovlivňuje významným způsobem stabilitu nebo aktivitu proteinu. Leader sekvence je však výhodně od proteinu odštěpena. Proteiny obecného vzorce Met-Rj-3EQ LD NO:1 jsou tedy použitelné jako biologická činidla a výhodně jako meziprodukty.
Příklad 5
Protein se sekvencí SEQ ID NO:3, který má Met-Arg leader sekvenci je exprimován v E. coli, isolován a složen technikami, analogickými technikám z předchozích příkladů. pH proteinového roztoku je redukováno na pH 2,8. Met-Arg leader sekvence jo odštěpena přidáním 5-10 mílijednotek dDAP na miligram proteinu (dDAP je zkratka pro dipeptidyiaminopeptidázu isolovanou z slízovky Dicteosteíi um descoidíum, popsaná Atkinsonem P.R. a kol., U.S. patent 5,565,330, vydaný 15. října 1996). Reakce konverze byla prováděna po dobu 2-8 hodin při pokojové teplotě. Postup reakce byl monitorován vysokovýkonnou chromatografií s reverzní fází (HP-RPC) . Reakce byla ukončena upravením pil na 8 přidáním NaOH, desfMet-Arg) protein byl dále purifikován kationtovou ionexovou chromatografií v přítomnosti 7-8 M vylučovací chromatografi i v PBS. Po finální močoviny a purífikaci vylučovací diromatograf ií byl protein koncentrován na 3-3,5 mg/ml v PBS.
Purífikace proteinů podle vynálezu byla prováděna způsoby známými ze stavu techniky, které zahrnují reverzní fázovou
- 4 6 * · · » » · · I
I · · · • · « · 4 • · « • « * · chromatografii, aiinitní chromatografii, chromatografíi iontovou výměnou a vylučováním podle velikosti.
Proteiny podle vynálezu obsahují dva cysteinové zbytky. Z tohoto důvodu může být použita disulfidová vazba pro stabilizaci proteinu. Předkládaný vynález zahrnuje proteiny obecného vzorce (I), ve kterém Cys v poloze 96 je křížově spojen s Cys v poloze 146 stejně tak jako proteiny bez takovéto disulfídové vazby. Výhodně je Cys v poloze 96 disulfidovým způsobem vázána k Cys v poloze 146. Navíc proteiny podle vynálezu mohou existovat, obzvláště ve farmaceutických přípravcích, jako dimery, trimery, tetramery a další multimery. Takovéto multimery spadají do rozsahu předmětu předkládaného vynálezu.
Předkládaný vynález podává použití proteinů podle vynálezu při léčení obezity. Toto použiti zahrnuje podávání účinného množství anti-obezitního proteinu do organismu v dávkách od asi i pg/kg do asi 1000 pg/kg. Výhodná dávka je od asi 10 pg/kg do asi 100 pg/kg aktivní složky. Typická denní dávka pro dospělou osobu je od asi 0,5 mg do asi TCO mg. Při použití podle předkládaného vynálezu mohou být sloučeniny obecného vzorce (I) podávány v jednoduché denní dávce nebo ve více dávkách denně. Režim může vyžadovat podávání po dlouhou dobu. Množství podávané látky v jedné dávce nebo celkové podané množství budou určeny lékařem a závisí na takových faktorech, jako je povaha a úpornost nemoci, věk a celkový zdravotní stav pacienta a snášenlivost pacienta k sloučen ině.
Předkládaný vynález dále podává farmaceutické prostředky • · * · « v t *
- 4 7 * * «» ---• ·· * · · 4 • · »· · · · »♦ • * * » · · ···* 4 · ·«· ««1 ·· · * * · * · * * terapeutické nebo obezity. Sloučeniny obsahující sloučeniny podle vynálezu. Proteiny, výhodně ve formě farmaceuticky přijatelné soli, mohou být připraveny pro parenterální podávání pro profylaktické účely, týkající se obecného vzorce mohou například být smíchány s konvenčními farmaceutickými nosiči a excipienty. Kompozice obsahující proteiny podle vynálezu obsahují od asi 0,1 do asi 85 % hmotnostních aktivního proteinu, výhodně ve rozpustné formě a obecněji od asi. 10 do asi 30 %. Dále, proteiny podle vynálezu mohou být podávány samotné nebo v kombinaci s dalšími anti-obezitními činidly nebo činidly, užitečnými pro léčení diabetů. Pro intravenózní (i.v.) podávání může být protein podáván v běžně používaných intravenózních tekutinách a podáván infúzí. Takové tekutiny jsou například fyziologický roztok, Ringerův roztok nebo 5 á roztok dextrózy. Pro intrámuskulární podáváni může být sterilní přípravek proteinu obecného vzorce (I), výhodně ve formě vhodné rozpustné soli, například soli chlorovodíkové, rozpuštěn a podáván ve farmaceutíckém ředidle jako je nepyrogenní (destilovaná) voda, fyziologický roztok nebo 5 % roztok glukózy. Vhodná rozpustná forma sloučeniny může být připravena a podávána i jako suspenze na vodné bázi nebo na bázi fyziologicky přijatelného oleje, například jako ester mastné kyseliny s dlouhým řetězcem, jako je ethyloleát. Do kompozice jsou výhodně přidány farmaceuticky přijatelná konzervační nebo chránící činidla jako je alkylparaben, obzvláště rrtethylparaben, elhylpa raben, propylparabn nebo butylparaben a nebo chlorbuoanol·, aby se umožnilo vícedávkové použití. Je významné, že proteiny podle vynálezu jsou také stabilní v přítomnosti fenolových činidel, jako je m-kreso] nebo fenol. Stabilita proteinů kyseliny * · * · · · · · * «4 » · « · « 4 4 * V * * · 4 f 4 · 4 4 · * » * » · W 4 « · • 44 * * »» 1« 4 4 · · podle vynálezu v přítomnosti fenolových činidel je výhodná ve farmaceutickém použití, které využívá zvýšenou účinnost
uvedených činidel. Přípravky j sou výhodně připravovány v
nepřítomnosti soli, aby se minimalizoval i on i. cký účinek
přípravku.
Schopnost sloučenin podle vynálezu působit na obezitu je
demonstrována in vivo v následujících příkladech.
Biologické testy
Parabiotícké experimenty naznačují, že protein je uvolňován periferální adipózní (tukovou) tkání a že protein je schopen řídit přírůstky tělesné hmotnosti u normální í u obézní myši [Coleman, D.L., Diabetologia 14:141-148 (1978)]. Biologickým testem, který nejvíce odpovídá použití proteinů, je proto injekce testovaného činidla kterýmkoli z více možných způsobů podáváni, například intravenózně (i.v.), subkutánně (S.C), intraperitoneálně (i.p.) nebo minipumpou nebo kanylou a následující sledování spotřeby potravy a vody, přírůstku tělesné hmotností, chemických vlastností plazmy nebo hormonů (glukóza, insulin, AC.TH, kortí kosteron, GH, T4) po různé časové intervaly.
Mezi vhodná testovací zvířata patří normální myši (ICR a podobně) a obézní myši (ob/ob, Avy/a, KK-Ay, „tubby, „fat). Myší model ob/ob obezity a diabetů je obecně přijímán jako indikativní pro obezitni stavy. Byly používány kontrolní vzorky pro určování nespecifických účinků pomocí vehíkula s nebo bez aktivního činidla nebo podobných kompozic u stejných zvířat monitorováním týchž parametrů a
- 4 9 - v · * * · · · • 9 * * * · · • · · ♦ · · · · Sí » ♦ * » ♦ ♦ · • · « * · ♦ · « » » · · · · • · * · ···· · • · · · * · · «· ·· «« * ·
nebo použitím téhož či mdlá u zvířat, u nichž se
předpokládá, že postrádáj i příslušné receptory (myši db/db,
krysy fa/fa nebo cp/cp). Proteiny, vykazující účinnost v
těchto modelech budou vykazovat podobnou účinnost. u
ostatních savců, speciálně u člověka.
Jelikož se předpokládá, že cílová tkáň je hypothaiamus, ve kterým je regulován příjem potravy a lipogenní stav, podobný model zahrnuje injekci testované látky přímo do mozku, například injekcí laterálními nebo třetími ventrikuly (i.c.v.) nebo přímo do specifického hypothalámového jádra jako je obloukové, paraventrikulární nebo peřífornikální jádro. Mohou být měřeny stejné parametry jako výše uvedené a nebo může být monitorováno uvolňování neurotransmíterů, o nichž je známo, že regulují příjem potravy nebo metabolismus (např. uvolňování NPY, gaianinu, norepinefřinu, dopamínu, βendorf inu).
Reprezentativní proteiny zmíněné v příkladech 6 a 7 byly připraveny způsobem podle popisu a příkladů uvedených výše. Označení Met-Arg- znamená proteiny připravené a testované s připojenou leader sekvencí Met-Arg. Aminokyselinová sekvence proteinů podle příkladů byla potvrzena hmotovou spektroskopií a/nebo aminokyselinovou analýzou. Pro testy byly proteiny konfigurovány s Cys zbytky křížově spojenými disulfidovými můstky. Schopnost proteinů podle vynálezu působit na obezitu u ob/ob myší je dokumentována v Tabulkách 1-3. Podobné studie byly provedeny in vbro za použita isolovaných hypothaiamických tkání v perifúzní nebo tkáňové lázni. V této situaci bylo monitorováno uvolrůování neurotransmiterů a elektrofyziologické změny.
• * · * «« • · «·· · ♦ · · « · «4 U « ·
Příklad 6
Testování Ob proteinů SEQ ID N0:2, 3 a 6 u samců ob/ob myší
Samci ob/ob myší fHarlan, Ltd. Bíackthorn, Encílandl byly chovány ve skupinách po 5 zvířatech a bylo jim podávána ad libitum Purina 5008 potrava a voda. Myší byly udržovány při revezním osvětlovacím režimu (světlo vypnuto 9.00 hod a zapnuto v 21.00) . Myši byly denně váženy v 8.30. V tutéž dobu byly vyhodnocována jejich spotřeba vody a potravy. Podávání testované látky bylo prováděno, jak je uvedeno níže, po ranním vážení, těsně před vypnutím osvětlení. Myším byla testovaná látka podávána denně po 4 dny.
Skupina Ošetření (n-5)
1 PBS 0,2 ml denně. S.C,
2 Protein 30 pg/O,2 ml denně, S.C.
3 Protein 300 pg/O,2 ml denně, S.C.
Účinek tohoto působení na spotřebu potravy a kumulativní tělesnou hmotnost jsou ilustrovány pro reprezentativní proteiny podle předkládaného vynálezu v následujících tabulkách 1-3.
•« * · • · » » « · · · • ·« « « • · » •« · ·
Tabulka 1. Účinek proteinu SEQ ID N0:2 na spotřebu potravy a změnu kumulativní tělesné hmotnosti u ob/ob myši.
Spotřeba potravy (g/den) Změna tělesné hmotnosti (g)
Den Skup.1 Skup. 2 Skup.3 Skup.1 S kup.2 Skup.3
1 4,4 4,1 2,4 + 0,5 -0,6 -0,8
2 5,3 4,3 3, 0 + 0, 4 -0,2 -1,3
3 4,8 4,2 2,4 + 0,6 -0,2 -2,3
4 5, 1 3, 8 1,5 t 0, 9 -0, 6 -3,5
Tabulka 2. Účinek proteinu SEQ ID NO:3 na spotřebu potravy a změnu kumulativní tělesné hmotnosti u ob/ob myší
Spotřeba potravy (g/den) Změna tělesné hmotnosti (g)
Den Skup.1 Skup.2 Skup.3 Skup.1 Ξ kup.2 Skup.3
1 5,6 4,9 4,0 + 0,3 -0,2 -0,5
2 6, 1 4,0 3, 1 10, 5 -0,3 -1,0
3 5,9 3,5 2,3 + 0, 6 -0, 5 -2,0
Tabulka 3. Účinek proteinu SEQ ID NO:6 na spotřebu potravy a změnu kumulativní tělesné hmotnosti u ob/ob myší
Spotřeba potravy (g/den) Změna tělesné hmotnosti (g)
Den Skup.1 Skup.2 Skup.3 Skup.1 Skup.2 S kup. 3
1 6,2 4,6 4,0 + 0,4 -o, 1 -o//
2 6,4 3, 9 3,5 + 0,4 1 o -0, 9
3 5,5 3,4 2,1 + 0,5 -0,6 -1,3
4 5, 5 2,8 1,6 i 0, 4 -1,3 -2,5
• ·
Příklad 7
Analýza agregace dynamickým rozptylem světla (DLS - Dynamic Light Scattering)
Fyzikální vlastnosti sloučenin podle vynálezu byly demonstrovány následujícím způsobem. V závislosti na dostupnosti látky byl roztok pro analýzu dynamickým rozptylem světla připraven jedním ze dvou způsobů. Materiál byl dodán v roztoku z posledního purifikačního kroku, prováděného vylučovací chromatografií v PBS v koncentrací přibližně 1,5 mg/ml a byl buď koncentrován na 5 mg/ml diafiltrací nebo dialyzován proti vodě, lyofilizován a rekonstituován na 3-5 mg/ml.
V prvním případě byl proteinový roztok s koncentrací přibližně 1,5 mg/ml koncentrován na více než 3-5 mg/ml v nízkoobjemové míchací buňce (10 ml) použitím Amicon YM10 25 mm membrány. Operace byla prováděna za snížené teploty (asi 5 °C) . Proteinová koncentrace byla určena UV absorpcí a roztok byl zředěn na 3,0 mg/ml pomocí PBS (10 násobné zředění vodou lOx PBS bez Ca/MG, GTRCO RRL) .
Druhá alternativní metoda byla používána v případě, že byla možná lyofilizace a spočívala v dialýze roztoku proteinu proti vodě použitím tří až pěti vyměň vody při teplotě asi 4
C. Typická diaiyzacní membrána byla Spectra/Dor-7 dialyzační membrána s mezní velikostí danou molekulární hmotností 2000 (Spectrum Medical Industries, Los Angeles, CA). Materiál byl koncentrován podobné jako výše na 3 až 4 »· ···· ml nádobce. Pro )ván vodou na více /ml. Najednou bylo
- 53 * mg/ml a typicky bylo lyofilizováno 2mg v DLS analýzu byl tento vzorek rekonstituc než 3,3 mg/ml nebo na více než 5,5 mg typicky používáno několik nádobek. Proteinová koncentrace byla určena UV metodou při špičkovém maximu (typicky 280 nm). Proteinová koncentrace byla zředěna na asi 3 mg/ml nebo na asi 5 mg/ml kombinací vody a lOx PBS (bez Ca/MG, GIBCO BRL), čímž se získala konečná PBS koncentrace lx.
Proteinový roztok s koncentrací 3 mg/ml nebo 5 mg/ml v lx PBS byl upraven na pH 7,4 pomocí HCl/NaOH a přefiltrován přes 0,1 μιη AnotopIM-10 filtr (Whatman International, Ltd., Maidstone, England) do DLS komory. Střední kumulativní velikost částice byla měřena na přístroji Brookhaven BI900 DLS (Brookhaven Instruments, Holtsville, NY) pomocí arqoniontového laseru Lexel každých 15 minut s 30 vteřinovou dobou trvání a úhlem 90°. Byl použit 488 nm filtr s otvorem
400 μιη. Při inkubacni teplot 0,6915 centipoise (cP) a re velikost částic byla určena měřené autokorelační základní
Odhadovaný čas, potřebný k proteinové sloučeniny dosáhly roztoku při pH 7,4 a teplotě Střední, velikost částic byl; binodální distribuce složené v y s s i c h a g r e g a c n i c h řadu. Č a agregované velikosti 50 nm i
37 C byla použita viskozi.ta fraktivní index 1,333. Střední kumulantovou metodou použitím úrovně.
tomu, aby různé ant i o b e 7 i t n i
’ velikosti částic 50 nm v PBS
37 °C jsou ukázány v Tabulce 4.
i určena kumulantovou analýzou
z monomem! populace a popu lácí
s, potřebný k dosažen 1 střední
yl určován vynášením ve íí kost i
jako funkce času. Testované proteiny byly skládány s Cys zbytky křížově vázanými disulfidovou vazbou. Jako reference « » »4
4 4 4 4« 4 *·« • 44 *4 4 · · 4 4 »4 4 4 4 4 44 »4+4 *
444 »444 +44
4 4 4 4 »4 4» 44 44 jsou podány lidský Ob Označení „u.d. znamená „n.d. znamená hodnotu, ID NO:18 má následující protein a protein SEQ ID NO:18. nemožnost určit hodnotu a označení která nebyla určována. Protein SEQ sekvenci:
10 15
Met Arg Val Pro Ile Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Leu 1 le
20 2 5 30
tys Thr I le Va 1 Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gin S e r Val·
35 40 15
Ser Ser Lys Gin Lys Va 1 Thr Gly Leu Asp hh e Ile Pro Gly Leu His
50 5 5 60
Pro Ile Leo Thr Leu Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu AI a Vd^ Tyr Gin
65 7 0 75 0 0
G i n T ] e Leu Thr S e r MeL Pro Ser Arg Asp V a 1 T 1 e Gin Ile Ser Asn
fí 5 90 95
As ρ Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ger As
100 10 5 110
Se r CyS His Leu Pro Trp Ala Ser G i y Leu G1 u Tr,r Leu Asp Ser Lea
1 4, J 1 Z u Ί z 5
G 1 v Gly V u 1 Leu ~ 1 u Ala y t G1 v Ϊ r G c r Thr G1 u '·/ id _L 1/ O. ΰ 1 a r a i'
·· ·«·· ·* *· • · · · · · · · • · · · ♦ * · • * v · · * · · · · · ·«· » · · · · · · »·« ·· «V ·« ·· ·*
130 135 140
Ser Arg Leu Glr. Gly Ser Lnu Gin Asp Met Leu Trp Gin T.eu Asp Leu
145
Ser Pro Gly Cys (SEQ ID NO:19}
Table 4. Odhadovaný čas (v minutách), nutný k tomu, aby různé anti-obezítní proteiny dosáhly střední velikosti částic 50 nra v PBS roztoku při pH 7.4 a 37 °C.
Odhadovaný čas pro dosažení 50 nm (min)
Protein 3 mg/ml 5 mg/ml
Lidský Ob Protein 2 u. d.
SEQ ID NO:2 604 n. d.
SEQ ID NO:3 572 44
SEQ ID NO:6 1.356 527
SEQ ID NO:18 124 n. d.
Sloučeniny jsou aktivní v alespoň jednom z výše uvedených biologických testů a představují anti-obezitni činidla. Jako taková mohou být používána v léčení obezity a poruch, zahrnujících obezitu. Proteiny podle předkládaného vynálezu však nejsou užitečná jako terapeutické látky, ale odborníkovi je zřejmé, že proteiny mohou být také používány pří výrobě protilátek pro diagnostické použití a jako proteiny jsou také použitelné jako krmná aditiva pro zvířata. Sloučeniny podle vynálezu jsou také použitelné pro φ · • · · φ φ ·
řízení váhy pro kosmetické účely u savců. Kosmetické účely znamenají snahu ovládat tělesnou hmotnost savců pro zlepšení vzhledu těla. Přitom savec nemusí nutně být obézní. Takové kosmetické použití tvoří část předkládaného vynálezu.
Principy, výhodná provedení a způsoby provádění předkládaného vynálezu byly popsány ve výše uvedeném popisu a příkladech. Vynález, který je předkládán k ochraně však není omezen žádnou speciální formou zde popsanou, neboť výše uvedený popis je třeba chápat jako ilustrativní a ne jako restriktivní. Odborník může provést různé změny a variace, aniž by se odchýlil od ducha předkládaného vynálezu.
Zastupuj e:
Dr. Otakar Švorčík v.r.
♦ * 4 *44
JUDr, Otakar Švorčík advokát
120 00 Praha 2, Hálkova 2

Claims (9)

  1. ·*·** «« 44 ·* «4
    PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Protein obecného vzorce (I) :
    5 1.0
    Vd 1 Pro ile Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys Thr Lnu T le Lys Thr 20 25 30 ile Val Thr Arg Ile Xaa Asp Ile Ser His Thr Xaa Ser Val Ser S e r 35 4 0 45 Lys G.ln Lys Val 1‘hr G1 y Leu Asp Phe T 1 e Pro Gly Leu H i s Pro 11 e 7 r. -1 60 Lou Thr T,su Ser Lys Met Asp Gin Thr Leu Ala Val Tyr G 1 n Gin Ile 6 5 '! 0 7 r 8 C Leu '1' h r Ser [Set Pro Ser Arg Xaa X a a Ile G1 n I le Ser Asn Asp Leu 3 5 90 95 G 1 u Asn Leu Arg A.sp Leu Leu His Val Leu Ala Pne Ser Lys C - v Gvs 100 0 5 11 o His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu G ! u m Ι- Leu Asp Ser Leu Gly o i. y l· 1 5 i 2 0 12 5 v a _l Leu G._u A1 a S e r Gly Tyr S e r !'T,r Α 1 LI Val Val Ala - f.,,. Arg
    ·* ·4« *
    4 4 4 4
    4 « » · ·«« • · 4 · · » · ·
    4 4« » *4 *44 « 4
    4 444» 4 4 *
    4* 44 44 44 44
    130 130 140
    Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Trp Gin Leu Asp Leu Ser Pro
    1 4 5
    Gly Cys (SEQ ID NO:1) ve kterém
    Xaa v poloze '1 o Z. ά. je Asn nebo Ser; Xaa v poloze 28 je Gin nebo chybí; Xaa v poloze 7 2 je Asn, Gin, Glu, nebo Asp; Xaa v poloze 73 je Val nebo Met;
    a protein zahrnuje alespoň jednu z následujících substitucí:
    Trp v poloze 100 je nahrazen Glu, Trp v poloze 138 je nahrazen Glu,
    Asp, His, Lys nebo Arg; Asp, His, Lys nebo Arg;
    nebo jeho farmaceutíoky přijatelná sůl.
  2. 2. Protein podle nároku 1, ve kterém Cys v poloze 96 je spojen disulfidovým můstkem s Gvs v poloze 146.
    Protein podle nároku Xaa v poloze 22 je Xaa v poloze 28 je Xaa v p O i O Z £ / z. je Xaa v poloze 73 je Trp v poloze 100 j
    2, ve kterém
    Asn ;
    G1 n ;
    Asn nebo Asp;
    Val; a nahrazen Glu nebo Asp.
    ·· φφ·# f φ «
    I Φ Φ 4
    ΦΦ Φ*
    Φ Φ I » · φ > · 4
    ΦΦΦΦ Φ Φ «4 4
  3. 4. Protein podle nároku 1, který má sekvenci zvolenou ze souboru, zahrnujícího sekvence SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:3, SEQ ID N0:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 a SEQ ID
    NO: 8 .
  4. 5. Protein sestávající z proteinu podle kteréhokoli z nároků 1 až 4 a leader sekvence, která je vázána k N-konci proteinu, nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl.
  5. 6. Protein podle nároku 5, ve kterém leader sekvence je Met-Fů, kde Ri chybí nebo je to libovolná aminokyselina různá od Pro.
    7 . Protein podle nároku 6, ve kterém leader sekvence je Met-Arg, Met-Asp nebo Met-Tyt. 8 . Protein podle nároku 7 který má sekvenci. zvolenou ze souboru, obsahujícího SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID
    NO: 11 a SEQ ID NO:12.
  6. 9. Farmaceutický prostředek, obsahující jako aktivní činidlo protein podle kteréhokoi.i z nároků 1 až 8 nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl, spolu s jedním nebo více farmaceuticky přijatelnými ředidly, nosiči nebo excipienty aktivního činidla.
  7. 10. DNA po.l yn u k l.eot ído vá sloučenina obsahující DNA kóduj led protein podle kteréhokoli z nároků 1 až 8.
  8. 11. Způsob výroby proteinu podle kteréhokoli z nároků
    44 4444 «· 4
    4 4 •
    4 4 • « *
    4 · • I 4 4 • 4 4 4 • 4 II
    4« ·«
    4 4 « I • 4 · ♦
    4 4* · ·
    4 4 4
    4 4 4 4 až 8, zahrnující následující kroky:
    a) transformace hostitelské buňky pomocí DNA, která kóduje uvedený protein,
    b) kultivace transformované hostitelské buňky taková, že je exprimován uvedený protein,
    c) získání exprimovaného proteinu.
  9. 12. Způsob výroby proteinu podle kteréhokoli z nároků 1 až 4, zahrnující kroky způsobu podle nároku 11 a následující kroky:
    d) enzymatické odštěpení leader sekvence exprimovaného proteinu a vytvoření proteinu podle některého z nároků 1 až 4 a
    e) získání proteinu.
CZ974070A 1996-12-20 1997-12-17 Anti-obezitní proteiny, způsob jejich výroby a farmaceutický prostředek s jejich obsahem CZ407097A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US3356196P 1996-12-20 1996-12-20

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ407097A3 true CZ407097A3 (cs) 1998-07-15

Family

ID=21871119

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ974070A CZ407097A3 (cs) 1996-12-20 1997-12-17 Anti-obezitní proteiny, způsob jejich výroby a farmaceutický prostředek s jejich obsahem

Country Status (23)

Country Link
EP (1) EP0849276A1 (cs)
JP (1) JPH10179158A (cs)
KR (1) KR19980064258A (cs)
CN (1) CN1194986A (cs)
AR (1) AR013886A1 (cs)
AU (2) AU4843297A (cs)
BR (1) BR9706358A (cs)
CA (1) CA2217698A1 (cs)
CO (1) CO4700343A1 (cs)
CZ (1) CZ407097A3 (cs)
HU (1) HUP9702500A3 (cs)
ID (1) ID19257A (cs)
IL (1) IL122569A0 (cs)
NO (1) NO975938L (cs)
NZ (1) NZ329413A (cs)
PE (1) PE47599A1 (cs)
PL (1) PL323956A1 (cs)
SG (1) SG65040A1 (cs)
SV (1) SV1997000107A (cs)
TR (1) TR199701666A3 (cs)
WO (1) WO1998028335A1 (cs)
YU (1) YU48997A (cs)
ZA (1) ZA9710877B (cs)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2338235B (en) 1997-04-15 2001-11-14 Csir Appetite suppressing plant extracts
WO1999044598A2 (en) * 1998-03-03 1999-09-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for inhibiting βcell apoptosis
GB9924484D0 (en) * 1999-10-15 1999-12-15 Isis Innovation Altered polypeptide aggregation
GB2396815B (en) 1999-10-27 2004-09-08 Phytopharm Plc A composition comprising a pregnenone derivative and an NSAID
US7022674B2 (en) 1999-12-16 2006-04-04 Eli Lilly And Company Polypeptide compositions with improved stability
GB2363985B (en) 2000-06-30 2004-09-29 Phytopharm Plc Extracts,compounds & pharmaceutical compositions having anti-diabetic activity and their use
US7985734B2 (en) 2006-06-01 2011-07-26 Yun Cheng Peptides for preventing or treating liver damage
US12466883B1 (en) * 2024-05-13 2025-11-11 Lumen Bioscience, Inc. Leptin compositions and methods of making and using the same to support weight loss and/or maintenance

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6309853B1 (en) * 1994-08-17 2001-10-30 The Rockfeller University Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof
US5827734A (en) * 1995-01-20 1998-10-27 University Of Washington Materials and methods for determining ob protein in a biological sample
JPH10513450A (ja) * 1995-01-31 1998-12-22 イーライ・リリー・アンド・カンパニー 抗肥満症タンパク質
WO1996024670A1 (en) * 1995-02-06 1996-08-15 Eli Lilly And Company Human obesity gene
WO1996031526A1 (en) * 1995-04-06 1996-10-10 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Anti-obesity agents
GB9509164D0 (en) * 1995-05-05 1995-06-28 Smithkline Beecham Plc Novel compounds
CA2224867A1 (en) * 1995-06-22 1997-01-09 Eli Lilly And Company Obesity protein intermediates and their preparation and use

Also Published As

Publication number Publication date
NZ329413A (en) 1999-10-28
HU9702500D0 (en) 1998-03-02
JPH10179158A (ja) 1998-07-07
ID19257A (id) 1998-06-28
CA2217698A1 (en) 1998-06-20
NO975938L (no) 1998-06-22
CN1194986A (zh) 1998-10-07
WO1998028335A1 (en) 1998-07-02
AU5384698A (en) 1998-07-17
NO975938D0 (no) 1997-12-17
TR199701666A2 (xx) 1999-10-21
CO4700343A1 (es) 1998-12-29
IL122569A0 (en) 1998-06-15
TR199701666A3 (tr) 1999-10-21
ZA9710877B (en) 1999-06-03
PL323956A1 (en) 1998-06-22
BR9706358A (pt) 1999-05-04
SG65040A1 (en) 1999-05-25
PE47599A1 (es) 1999-05-14
AR013886A1 (es) 2001-01-31
SV1997000107A (es) 1999-01-18
HUP9702500A2 (hu) 1998-07-28
HUP9702500A3 (en) 1999-07-28
AU4843297A (en) 1998-06-25
YU48997A (sh) 1999-09-27
EP0849276A1 (en) 1998-06-24
KR19980064258A (ko) 1998-10-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN100354306C (zh) Glp－1衍生物及其经粘膜吸收的制剂
EP2152297B1 (en) Unacylated ghrelin as therapeutic agent in the treatment of metabolic disorders
US5719266A (en) Anti-obesity proteins
WO1996023517A1 (en) Anti-obesity proteins
US5594104A (en) Anti-obesity proteins
WO1996023513A1 (en) Anti-obesity proteins
WO2004022004A2 (en) Modified glp-1 receptor agonists and their pharmacological methods of use
CN104487082A (zh) 长效胃泌酸调节素变体及其生产方法
US5567678A (en) Anti-obesity proteins
US5569744A (en) Anti-obesity proteins
US5563243A (en) Anti-obesity proteins
US5574133A (en) Anti-obesity proteins
US5563245A (en) Anti-obesity proteins
US5563244A (en) Anti-obesity proteins
ZA200607492B (en) Y2/Y4 selective receptor agonists for therapeutic interventions
JPH11505706A (ja) 肥満症遺伝子産物
CZ407097A3 (cs) Anti-obezitní proteiny, způsob jejich výroby a farmaceutický prostředek s jejich obsahem
JP2000504318A (ja) 肥満症タンパク質製剤
WO2008151512A1 (fr) Dérivés de calcitonine de saumon linéaires, pégylés, spécifiques de site
JP2001507228A (ja) 抗肥満タンパク質
MXPA97010239A (en) Anti-obesi proteins
AU703316B2 (en) Anti-obesity proteins
HK1014336A (en) Anti-obesity proteins
AU3022400A (en) Proteins and methods
WO2001025428A1 (en) A novel human leptin homolog

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic