CZ413199A3 - Způsob výroby adenovirových vektorů nepatřících do skupiny C - Google Patents

Abstract

Způsob produkce replikačně nedostatečného adenoviru, který obsahuje cizorodý gen aje nedostatečný v podstatné genové funkci oblasti El adenoviru. Tento způsob zahrnuje produkci adenoviru v buňce, která poskytuje in trans genové funkce oblastí El a E4 jednoho nebo více adenovirů, které nepatří do stejné séroskupiny, jako replikačně nedostatečný adenovirus

Description

✓ • ·· • · 1 • · • · ··· ·· • · • · · • · • · • · «Μ • · • ·

Způsob produkce vektorů adenovirů nepatřících do skupiny f

Oblast techniky

Vynález se vztahuje k produkci vektorů, které jsou vhodné k přenosu adenovirových genů, které za účelem exprese v buňkách obsahují cizorodý gen.

Dosavadní stav techniky Během zimy a jara 1952 až 1953 Rowe a jeho spolupracovníci z instituce National Institutes of Health (NIH) získali a převedli na tkáňovou kulturu adenoidy, které se chirurgicky odstranily malým dětem v oblasti Washington D.C. (Rowe et al., Proč. Soc. Exp. Biol. Med., 84, 570-573 (1953)). Po několika týdnech řada kultur začala vykazovat progresivní degeneraci charakterizovanou destrukcí epiteliálních buněk. Tento cytopatický účinek se mohl sériově přenášet tekutinou filtrované kultury na stabilní tkáňové kultury lidských buněčných linií. Cytopatické činidlo bylo nazváno „adenoidní degenerační činidlo" (Ad). Nakonec se pro toto činidlo stal běžným také název „adenovirus". Po těchto počátečních zjištěních následovaly objevy řady prototypových kmenů adenovirů, z nichž některé způsobují respírační onemocnění (Rowe et al., Proč. Soc. Exp. Biol. Med., 84, 570-573 (1953), Dinglě et al., Am. Rev. Respir. Dis., 97, 1-65 (1968); Horwitz, „Adenoviridae and Their Replication", in: Fundamental Virology (ed. Fields et al., Raven Press Ltd. , New York, NY, 2. vyd., 1991), pp. 771-813). Všechny adenoviry si jsou podobné jak strukturou tak morfologií. Tyto viry nemají obal, tvoří pravidelné ikosaedry o průměru 65 až 80 nm, obsahující externí kapsid a vnitřní jádro. Kapsid se skládá z dvaceti trojúhelníkových stěn nebo plošek a dvanácti vrcholů (Horné et al., J. Mol. Biol., 1, 84-86 (1959)). Plošky jsou tvořeny hexony a vrcholy pentony. Z každého vrcholu vyčnívá vlákno. Vedle hexonů, pentonů a vláken zde existuje osm menších stavebních polypeptidů, přičemž přesná poloha jejich velké části není jasná.

Virové jádro obsahuje lineární, dvouřetězcovou molekulu DNA s obrácenými koncovými repeticemi (ITR), jejichž délka u různých izolátů kolísá od 103 bp do 163 bp (Garon et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 69, 2391-2394 (1972); Wolfson et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 69, 3054-3057 (1972); Arrand et al., J. Mol. Biol., 128, 577-594 (1973); Steenberg et al., Nucleic Acids Res., 4, 4371-4389 (1977); Tooze, DNA Tumor Viruses (2nd ed., Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1981), pp. 943-1054). ITR nesou počátky replikace DNA (Garon et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 69, 2391-2394 (1972); Wolfson et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 69, 3054-3057 (1972); Arrand et al., J. Mol. Biol., 128, 577-594 (1973); Steenberg et al., Nucleic Acids Res., 4, 4371-4389 (1977)).

Virová DNA je spojena se čtyřmi polypeptidy. Jsou to polypeptid V, VII, m a terminální polypeptid (TP). TP o molekulové hmotnosti 55 000 je kovalentnš spojen s 5' koncem DNA prostřednictvím dCMP (Rekosh et al., Cell, 11, 283-295 (1977); Robinson et al., Virology, 56, 54-69 (1973)). Další tři polypeptidy jsou nekovalentně vázány k DNA a balí se takovým způsobem, že se vejdou do malého objemu kapsidu. DNA se balí do struktury, která je podobná buněčnému nukleozómu, což je patrné z paternů štěpení nukleázou (Corden et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 73, 401-404 (1976); Tate et al., Nucleic Acids Res., 6, 2769-2785 (1979); Mirza et al., Biochim. Biophys. Acta, 696, 76-86 (1982)) .

Vedle různých fyzikálních podobností, které charakterizují adenoviry, se tyto viry rozdělují do sub-divizí s ohledem na určitá kritéria, které zahrnují imunologickou reaktivitu, onkogenicitu a obsah GC v genomu daného kmene (Horwitz, 3 3 • ·

·· «· • · · · • · · · • · · · · • · · · „Adenoviridae and Their Replication," in Fundamental Virology (Fields et al., eds. Raven Press Ltd., New York, NY, 2d ed. 1991), pp. 771-813), str 777). Mezi izoláty lidských adenovirů se například izolovalo přes 40 sérotypů a čtyři hemoglutinační skupiny. Následuje tabulka shrnující klasifikaci lidských adenovirů, jak se popisuje v publikaci (Horwitz, „Adenoviridae and Their Replication," in Fundamental Virology (Fields et al., eds. Raven Press Ltd., New York, NY, 2d ed. 1991), pp. 771-813), str 777).

Onkogenní potenciál Podskupina Hemaglutina ční skupina Sérotyp Nádory u zvířat Transform ace v tkáňový ch kulturách Procento G . + C v DNA A IV(málo nebo neaglutinuj e) 12, 18, 31 Vysoký + 48 - 49 B I(úplná aglutinace opičích erytrocytů) 3, 7, 11, 14, 16 21, 34, 35 Střední + 50 - 52 C III(částečn á aglutinace krysích erytocytů) 1, 2, 5, 6 Nízký nebo žádný + 57 - 59 D II(úplná aglutinace krysích erytrocytů) 8, 9, 19 37, 10 13, 15 17, 19 20, 22-30, 32, 33, 36, 37, 38, 39, 42 Nízký nebo žádný + 57 - .61 E III 4 Nízký nebo žádný + 57 - 59 F III 40, 41 Není znám 4

«· · ·· Μ • · · · · * · · • · I · ♦ · · «· #····· • · · · · · · «· · · · · · · · V minulosti se nejvíce pozornosti věnovalo studiu adenovirových sérotypů Ad2 a Ad5, které se zcela sekvenovaly. Zjistilo se, že celá organizace adenovirového genomu je konzervativní mezi sérotypy tak, že specifické funkce mají podobné pozice. Sekvenovaly se také části jiných sérotypů, přičemž se dospělo k výsledku, který odpovídá hypotéze konzervativní genetické organizaci mezi adenoviry. Adenoviry vykazují na genetické úrovni podstatnou rozdílnost. Virové izoláty z různých skupin adenovirů vykazují v genomech různé . obsahy GC.Studie hybridizace DNA-DNA ukazují, že zde existuje méně než 20 % homologie . mezi DNA různých skupin, ačkoli podrobnější analýza ukázala, že ve srovnání se segmenty sub-genomu, se detekovaly konzervativní sekvence. Například při studiu až 30 mapovacích jednotek délky DNA se zjistilo, že alespoň 20 až 50 % sekvence DNA se mezi skupinami liší (Horwitz, „Adenoviridae and Their Replication," in Fundamental Virology (Fields et al., eds. Raven Press Ltd., New York, NY, 2d ed. 1991), pp. 771-813), str 777). Při jiné studii sekvence počátku replikace subtypů spojených s každou ze šesti skupin adenovirů se zjistilo, že tyto adenoviry jsou příbuzný ale odlišují se.

Je důležité poznamenat, ačkoli to zůstává nevysvětleno, že mezi adenoviry různých skupin nedochází k ' rekombinaci v případě, že se objeví v hostiteli ko-infekce. Naopak adenoviry ve skupině se účinně rekombinují (Sambrook et al., J. Mol. Biol. 97, 369-390, (1975)). Neschopnost adenovirů rekombinovat se mezi séroskupinami ukazuje na genetické rozdílnosti adenovirových skupin. Základní fyziologie adenovirové infekce se studovala ohledem na Ad2 a Ad5. Z této studie vyplynulo, že adenoviry začínají infikovat buňku zachycením vlákna na specifickém receptoru na buněčné membráně (Londberg-Holm et al., J. Virol., 4, 323-338 (1969); Morgan et al., J. Virol., 4, 777-796 (1969); Pastan et al., „Adenovirus entry into cells: some new obsarvations on an old problém" in Concepts in Viral Pathogenesis, Notkins et al., eds7 Springer-Verlag, New York, NY, pp. 141-146 (1987)). Pentonová báze se pak váže na buněčný receptor integrinu. Virus vázaný na receptoru pak migruje z plazmatické membrány do klatrinem potažených jamek, které tvoři endocytické vesikuly nebo receptozómy, kde hodnota pH klesne na 5,5. Pří poklesu hodnoty pH se pravděpodobně změní povrchová konfigurace viru, což vede k ruptuře receptozómů a k uvolnění viru do cytoplazmy buňky.

Když virus dosáhne jaderných pórů, virová DNA vstupuje do jádra, přičemž většina zbývajících proteinů zůstává v cytoplazmě (Philipson et al., J. Virol., 2, 1064-1075 (1968)). Virová DNA však není zcela bez proteinu, protože alespoň část virové DNA je spojena s alespoň čtyřmi virovými polypeptidy, jmenovitě s polypeptidy V, VII, TP a m, a přeměňuje se na komplex DNA-buněčný histon (Tate et al., Nucleic Acids Res., 6, 2769-2785 (1979)).

Cyklus od infekce buňky do produkce virových částic trvá 1 až 2 dny a výsledkem je produkce až 10 000 infekčních částic na jednu buňku (Green et al., Virology, 13, 169-176 (1961)).

Proces infekce adenovirů se rozděluje na časnou (E) a pozdní (L) fázi, které jsou odděleny replikací DNA, ačkoli některé pochody, které probíhají během časné fáze také probíhají v pozdní fázi a naopak. Za účelem úplného popsání dočasné exprese virových genů se provedlo další dělení adenovirových genetických oblastí do subdivizí. Během časné fáze se virová mediátorová (mRNA), která zahrnuje minoritní část celkové RNA přítomné v buňce, syntetizuje z obou řetězců adenovirové DNA přítomné v jádru buňky. Popisuje se alespoň pět oblastí označených El, E2, E3, E4 a MLP-L1 (Lewis et al., Cell, 7, 141-151 (1976); Sharp et al., Virology, 75, 442-456 (1976); Sharp, „Adenovirus transcription," in The Adenoviruses, Ginsberg, ed., Plenům Press, New York, NY, pp. 173-204 (1984)). Každá oblast má alespoň jeden odlišný promotor a zpracovává se za vzniku více specie mRNA.

Produkty časných oblasti (E) : (1) slouží jako regulátory exprese jiných virových komponentů, (2) obecně se podílí na ukončení replikace buněčné DNA a syntéze proteinů a (3) jsou nutné při replikaci virové DNA. Složité série jevů regulující časnou transkripci mRNA začínají expresí jistých bezprostředně časných oblastí, které zahrnují AlA, Ll a gen o velikosti 13 500 (Sharp, „Adenovirus transcription," in The Adenoviruses, Ginsberg, ed., Plenům Press, New York, NY, pp. 173-204 (1984); Horwitz, „Adenovirídae and Their Replication," in Eundamental Virology (Fields et al., eds. Raven Press Ltd., New York, NY, 2d ed. 1991), pp. 771-813)).Exprese opožděných časných oblastí ElB, E2A, E2B, E3 a E4 závisí na produktech genu E1A. Tři promotory (promotor E2 tvoří 72 jednotek mapy („mu"), promotor proteinu IX a promotor IVa) jsou posíleny replikací DNA, ale nejsou na ní závislý (Wilson et al., Virology, 94, 175-184 (1979)). Jejich exprese charakterizuje střední fázi exprese virových genů. Výsledkem exprese kaskády exprese časných genů je počátek replikace virové DNA.

Replikace adenovirové DNA nahrazuje jeden rodičovský řetězec kontinuální syntézou ve směru od 5'-konce do 3'-konce od počátku replikace do konce genomu (popisuje se v publikaci Kelly et al., „Initiation of viral DNA replication," in Advances in Virus Research, Maramorosch et al., eds., Academie Press, lne., San Diego, CA, 34, 1-42 (1980); Horwitz et al., in Virology, Raven Press, New Yo_rk, 2, 1679-1721 (1990); van der Vliet, „Adenovirus DNA replication in vitro," in The Eukaryotic Nucleus, Straus et al., eds., Telford Press, Caldwell, NJ, 1, 1-29 (1990)). Tři virové proteiny kódované E2 jsou podstatné při syntéze adenovirové DNA: (1) protein vázající se na jednořetězcovou DNA (DBP), (2) adenovirové DNA polymeráza (Ad pol) a (3) pre-terminální protein (pTP) . Vedle těchto proteinů experimenty in vitro ukázaly, že existuje řada ·· · • ·

+ »· · · · « · · · ··· ·♦ ·· ··· ·♦ ♦· faktorů hostitelské buňky, které jsou nezbytné pro syntézu DNA.

Syntéza DNA se iniciuje kovalentním navázáním molekuly x.-- dCMP na serinový zbytek pTP. Komplex pTP-DCMP, pak funguje jako primer pro elongaci Ad pol. Rodičovský jeden řetězec může párováním baží obrácených terminálních repetic tvořit miskovitou strukturu. Tato terminální duplexová struktura je stejná s konci rodičovského genomu a může sloužit jako počátek pro iniciaci syntézy komplementárních řetězců. Počátek replikace virové DNA je zřejmě podstatný pro vstup do pozdní fáze. Pozdní fáze virové infekce se charakterizuje produkcí velkého množství virových strukturních polypeptidů a néstrukturních proteinů, které se podílejí na sestavení kapsidu. Hlavní pozdní promotor (MLP) se stává plně aktivní a produkuje transkripty, které začínají v 16,5 mu a končí blízko konce genomu. Post-transkripční zpracování uvedeného dlouhého transkriptu dává vzniku pěti rodinám pozdní mRNA označených jako LI až L5 (Shaw et al., Cell, 22, 905-916 (1980)). Mechanizmy, které řídí posun z časné fáze do pozdní, a výsledky takových dramatického posunu v transkripčnim využití nejsou jasné. Požadavek replikace DNA může být vlastnost cis templátové DNA, protože nedojde k pozdní transkripci z superinfekčního viru v době, kdy je aktivní pozdní transkripce primárně infekčního viru (Thomas et al., Cell, 22, 523-533 (1980)). Tvorba virionů je složitý proces. V prvním kroku dochází k uspořádání hlavních strukturních jednotek z jednotlivých polypeptidových řetězců (popisuje se v publikaci Philipson, „Adenovirus Assembly," in The

Adenoviruses, Ginsbrg, ed., Plenům Press, New York, NY (1984), pp. 309-337; Horwitz, „Adenoviridae and Their Replication," in Fundamental Virology (Fields et al., eds. Raven Press Ltd., New York, NY, 2d ed. 1991)) . Hexonová a pentonová báze a vlákno uspořádané do trimérového homopolyméru se tvoří po syntéze v cytoplazmě. Protein o velikosti 100 000 funguje jako 8 • ·· ·· ·· · · · · • · · · · • · · · · · • · · ♦ · ♦ ·♦ ·· ·· • ·· ·· • · · · · · • · · · · • · · · · · • · · · · ··» ·♦ ♦♦ lešení v případě hexonové trimerizace a výsledný hexonový trimér se nazývá hexonový kapsomér. Hexonové kapsoméry se mohou samostatně sestavit za vzniku skořápky prázdného kapsidu a pentonová báze a vláknité triméry se mohou kombinovat za vzniku pentonu, kdy komponenty jsou uvnitř jádra. |p//\&ka ikosaědrx^ se skládá ze tří hexonových. kapsomérů, které je možné spatřit na základě disociace kapsidu, ale střední krok tvorby skupiny devíti hexonů nebyl pozorován. V experimentech s mutanty citlivými na teplotu se pozorovalo několik

meziproduktů. Progrese uspořádání kapsidu se jeví závislá na proteinu, který slouží jako lešení pro balení. Tento protein má molekulovou hmotnost 50 000 až 30 000. Samotná DNA s největší pravděpodobností vstupuje do kapsidu tím, že se otevře v jednom vrcholu. Poslední krok postupu zahrnuje proteolytické trimování prekurzorových polypeptidů pVI, pVII, pVIII a pTP, které stabilizují strukturu kapsidu, což způsobuje, že DNA není citlivá k ošetření nukleázou a výsledkem je úplný virion.

Replikačně deficitní adenoviry jsou známy, že nacházejí různá využití. Replikačně deficitní adenovirus se může například použít při transferu genů a jiných · genetických elementů, jako jsou ribozómy, antimediátorová RNA a segmenty DNA, které se exprimují podobným způsobem, do buněk in vivo a in vitro. Použití in vivo také zahrnuje geneticky pozměněné buňky, které jsou vhodné pro diagnostické a léčebné účely a studium biologických jevů, jako jsou poločas rozpadu proteinů regulujících elementy, rychlost transkripce a funkce proteinu. Použití in vitro dále zahrnuje studii biologického jevu uvedeného shora v textu a může být také výhodné, protože umožňuje přesnější řízení experimentálních podmínek.

Jisté rekombinantní adenovirové vektory se mohou použít v genové terapii, zvláště Ad2 a Ad5, přičemž oba viry jsou členy skupiny C. Použití rekombinantního adenovirového vektoru k přenosu jednoho nebo více rekombinantních genů umožňuje cílené zavádění genu nebo genů do orgánu, tkáně nebo buněk v případě potřeby léčby, přičemž se obchází problém zavádění, ke kterému dochází při většině formách somatické genové terapii. Dále rekombinantní adenovirové vektory nevyžadují v případě exprese adenovirových proteinů proliferaci hostitelských buněk kmene (Horwitz, „Adenoviridae and Their Replication," in Fundamental Virology (Fields et al., eds. Raven Press Ltd., New York, NY, 2d ed. 1991), pp. 771-813), Berkner, BioTechniques, 6, 616 (1988)). Jestliže orgánem, který vyžaduje léčbu jsou plíce, pak použití adenoviru jako vektoru pro genetickou informaci je výhodné, protože adenovirus je v normálním případě trofický pro respirační epitel (Straus, in Adenoviruses, Penum Press, New York, pp. 451-496 (1984)).

Jiné výhody adenovirů jako vektorů v případě genové terapie u lidí jsou: (i) v řídkých případech dochází b k rekonfinaci; (li) adenovirový genom (kterým je lineární, dvouřetězcová DNA) může být současně manipulována, aby nesla cizorodé geny, jejichž velikost je v rozmezí alespoň 7,5 kb; (iii) adenovirový vektor nezačleňuje svou DNA do chromozómu buňky, to znamená, že jeho účinek je dočasný a není pravděpodobné, že interferuje s normální funkcí buňky; (iv) adenovirus může infikovat nedělící se nebo terminálně diferenciované buňky, jako jsou buňky mozku a plic a (v) živý adenovirus, jehož podstatnou charakteristikou je schopnost se replikovat, má bezpečné využití při použití v lidských vakcínách (Horwitz, „Adenoviridae and Their Replication," in Fundamental Virology (Fields et al., eds. Raven Press Ltd., New York, NY, 2d ed. 1991), pp. 771-813), Berkner et al. , J. Virol., 61, 1213-1220 (1987); Straus et al., eds., Telford Press, Caldwell, NJ, 1, 1-29 (1990); Chanock et al., JAMA, 195, 151 (1966); Haj-Ahmad et al., J. Virol., 57, 267 (1986);

Ballay et al., EMBO, 4, 3861 (1985)). m 0m ** »* « · · · · • · I · * • · ♦ t · · • · · · * ·»* ·· *· · 10

Cizorodé geny se začlenily do různých hlavních oblastí genomu adenovirů skupiny C za účelem použiti jako expresívnich vektorů. Nejběžněji se používají oblasti El, E3 a E4. Tímto způsobem vzniká jednoduše deficitní adenovirus a vektory z něho odvozené. Začlenění do oblasti El adenovirů vede ke vzniku defektivního progenu, který požaduje buď kultivaci v komplementárních buňkách nebo přítomnost pomocného viru, který poskytuje funkci in trans nebo nemá oblast El (Berkner, BioTechniques, 6, 616 (1988); Davidson et al., J. Virol., 61, 1226-1239 (1987); Mansour et al., Mol. Cell Biol., 6, 2684- 2694 (1986)). Příklady buněčných linií, které doplňují nedostatek podstatných adenovirových genových funkcí, zahrnují buňky ledvin lidského embrya, které jsou známy jako HEK-293 (Graham et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 39, 637-650 (1975))., buňky W162 (popisují v publikaci Weinberg et

al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 80, 5383-5386 (1983)), gMDBP (Klessig et al., Mol. Cell. Biol., 4, 1354-1362 (1984); Brough et al., Virology, 190, 624-634 (1992)) a buňky 293/ORF6 (popisuje se v dokumentu WO 95/34671, Kovesdi et al.). V případě exprese cizorodé nukleové kyseliny se nej častěji používá oblast genomu El. Geny začleněné do oblasti El jsou řízeny různými promotory a geny v závislosti na expresívní kazetě produkují velké množství cizorodého produktu.

Oblast E3 není podstatná pro růst viru v tkáňové kultuře a nahrazení této oblasti expresívní kazetou obsahující cizorodou nukleovou kyselinu vede ke vzniku viru, který produktivně roste v nekomplementační buněčné linii. Například se popisuje začlenění a exprese povrchového antigenu hepatitidy B do oblasti E3 viru sérotypu Ad5, následná inokulace a tvorba protilátek u křečků (Morin et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 84, 4626-4630 (1987)). Také se popisuje analogová nedostatečnost E3 u sérotypů Ad4 a Ad7 (s ohledem na Ad4 se popisuje v publikaci Chengalvala et al., Vaccine, 9, 485-490 (1991); s ohledem na Ad7 se popisuje v publikaci Lindley et 11 • * ♦ 9 v al., Gene, 138, 165-170 (1994) a Chengalvala et al., J. Gen. Virol., 75, 125-131 (1994)). V oboru adenovirové genové terapie se v klinických studiích dodnes používaly pouze dva shora uvedené sérotypy skupiny C. Jsou to Ad2 a Ad5. Příklady takových studií se popisují v publikacích Davidson et al., Nátuře, 3, 219 (1993) a Mastrangeli et al., J. Clin. Invest., 91, 225-234 (1993).

Současné studie se zaměřují na sérotypy skupiny C s ohledem na skutečnost, že většina hlavních výzkumných projektů se soustředí na Ad2 a Ad5. (popisuje se v publikaci Fields et al., eds. Raven Press Ltd., New York, NY, 2d ed. 1991), pp. 771-813)a také The Adenoviruses (Ginsberg, ed., Plenům Press,

New York, NY, 1984). Tyto studie ukazují, že adenoviry skupiny / C jsou výjimečně účinná jako nástroje pro zavádění do různých cílových tkání, které zahrnují například rešpirační epitel (popisuje se v publikaci Bajocchi et al., Nátuře Genetics, 3, 229-23# (1993)) .

Existují však omezení při použití vektorů při genové terapii adenoviry skupiny C. U hostitele může dojít k imunitní odezvě na určitý adenovirový vektor, který se používá při genové terapii, což je výsledkem přirozeného vystavení hostitele stejnému typu adenoviru dříve než došlo k započetí genové terapie nebo to může být výsledek vystavení hostitele působení adenovirového vektoru v průběhu samotné genové terapie. Buněčná imunitní odezva může zkrátit' dobu života buněk infikovaných adenovirovým vektorem a tím redukovat expresi cizorodé nukleové kyseliny a tak omezit účinnost genové terapie. Je nutné poznamenat, že hlavní omezení současně používaných systémů genové terapie adenovirů skupiny C je krátké trvání získané exprese genů (popisuje se v publikaci Crystal et al., Nátuře Genetics, 8, 42-51 (1994).

Humorální imunitní odpověď, jejímž výsledkem je produkce protilátek, může podstatně snížit účinnost genové terapie používající určitý adenovirový vektor. Je zřejmé, že tato 12

neutralizace adenoviru narušuje genovou terapii a in vivo použiti adenovirových vektorů při aplikacích při biologickém výzkumu. V řadě aplikací je možné použít replikačně deficitní adenovirus určitého sérotypu. Důvodů je více. Jeden sérotyp například adenoviru podle definice není reaktivní s adenovirem jiného sérotypu. Proto v případě, že savci, mezi něž patří lidé, se vystaví působení jednoho sérotypu adenoviru, dojde k imunitní reakci, která je specifická pro uvedený kmen adenoviru, ale nikoli pro odlišné kmeny. Pak se tyto odlišné kmeny mohou použít, aby se zabránilo humorálním a buněčným imunitním odezvám, které jsou specifické pro jiné adenoviry. Různé sérotypy adenovirů jsou trofické pro odlišné typy buněk. Tak replikačně deficitní adenovirus, který je vhodný pro přenos cizorodých genů do buňky jednoho typu je méně vhodný než druhý adenovirus, který se používá při přenosu uvedeného cizorodého genu do druhého typu buňky. Existuje proto požadavek na vytvoření replikačně deficitního adenoviru vhodného pro více kmenů. Avšak, jestliže každý adenovirový kmen požaduje své vlastní komplementární buňky nebo dokonce, zda se uvedená komplementační buňka zkonstruovala ko-infekcí s pomocným vírem, pak proces produkce nové komplementační buněčné linie pro každý adenovirový sérotyp bude velmi nákladný a náročný na čas. Tudíž se popisuje způsob produkce vektorů adenovirů, které nepatří do skupiny C, což je předmětem US patentu 5,837,511. Tento patent popisuje, že komplementární buněčné linie, jako je HEK-293, které se připravují nebo se mohou připravovat za účelem doplnění replikační nedostatečnosti u vektorů skupiny C, se mohou překvapivě použít pro komplementaci produkce vektorů adenovirů, které nespadají do skupiny C. Použití takových komplemenatčních buněčných linií vhodných pro komplementaci růstu vektorů, které nespadají do skupiny C, vede ke slabé komplementaci. Naneštěstí při této slabé komplementaci je • ·· ·· ι · · ·· ·· « · · ··· · ·· « ··· # · · ···« • t ♦ · · · · · · · ♦ · • · · · * · U · · · ··· ·· «· «·· ·· ·· 13 obtížné získat zásobní roztoky (to znamená nekontaminovaný virus divokého typu) El-deficitních vektorů adenovirů, které nespadají do sérotypu skupiny C. To platí, zvláště, když použití homologní rekombinace izolovaného ramene viru se používá při přípravě El-deficitních vektorů, které nespadají do skupiny C.

Navíc produkce adenovirových vektorů skupiny C v doplňujících buněčných liniích vyvinutých pro adenoviry nespadající do skupiny C je použitelná, protože rekombinace mezi genomem doplňující buněčné linie a adenovirem skupiny C je velmi nevýhodná.

Vzhledem k tomu je nutné zdokonalit způsob produkce El-deficitních adenovirových vektorů, zvláště, kde nedostatečnost El vede k replikační nedostatečnosti. Vynález hledá způsob konstrukce a produkce takových vektorů.

Podstata vynálezu

Vynález popisuje způsob produkce replikačně deficitního adenovirů, který obsahuje cizorodý gen a nedostatečnost v podstatné genové funkci oblasti El. Uvedený způsob zahrnuje produkci adenovirů v buňce, která poskytuje in trans genové funkce oblastí El a E4 jednoho nebo více adenovirů, které nepatří do stejné séroskupiny jako replikačně deficitní adenovirus. Vynález dále popisuje adenoviry produkované v souladu s vynálezem.

Vynález popisuje způsob produkce replikačně deficitního adenovirů, který je deficitní v oblastí El adenovirového genomu, který obsahuje cizorodý gen odstraňující potřebu separace komplementačních buněk pro každý adenovirový kmen.

El deficitní adenoviry skupiny C účinně rostou v buňkách, které poskytují in trans deficitní důležitý genový produkt. Tento produkt se získal z adenovirů stejného nebo podobného sérotypu (např. El deficitní Ad2 a Ad5 rostou dobře v buňkách 293). Navíc buňky, které účinně doplňují podstatné genové 14 14

··· ·· · ♦ · · · ««t · · » · ··· «· · · funkční defekty, jednoho určitého sérotypu adenoviru nejsou nezbytně účinné při komplementaci růstu replikačně deficitních adenovirů jiných sérotypů. El deficitní Ad5 (séroskupiny C) se kultivuje podstatně lépe v buňkách 293, než v homologní E7 deficitní Ad7 (séroskupiny B) . Věří se, že protože El genové produkty v buňkách 293 se získaly z adenoviru skupiny C, buňky 293 jsou schopny více doplnit růst adenovirů skupiny C než jiných adenovirů. Při způsobu podle vynálezu replikačně deficitní virus, jehož genom je deficitní v podstatné genové funkci oblasti El adenovirového genomu (nebo segmentů DNA obsahujících genom replikačně deficitního adenoviru), se přenese do komplementační buňky. Jestliže genom nese více jak jeden segment DNA, . v buňce dochází k homologní rekombinaci nebo k ligaci DNA za účelem produkce replikačně deficitního adenovirového genomu. V jiném případě replikačně deficitní adenovirus se může vnést do buňky infekcí nebo jeho DNA se může začlenit do buňky libovolným vhodným transfekčním postupem, který je znám v oboru (například elektroporací). Komplementační buňka poskytuje in trans: jednu nebo více podstatných genových funkcí oblasti El adenovirového genomu a jednu nebo více genových funkcí oblasti E4 adenovirového genomu. Toto opatření in trans obou funkcí El a E4 v buňce překvapivě, spíše než pouze funkce El, umožňuje posílit produkci replikačně deficitního adenoviru, přičemž sérotyp adenoviru, ze kterého je podstatný El produkt poskytovaný in trans je odvozen, a sérotyp replikačně deficitního adenoviru spadají do různých séroskupin. Buňka obsahující genom replikačně deficitního adenoviru se pak udržuje v kultuře po dobu, která je dostatečně dlouhá, aby vznikl replikačně deficitní adenovirus. Replikačně deficitní adenovirus se může sklízet libovolným vhodným způsobem za vzniku zásobního roztoku replikačně deficitního adenoviru. 15 • ·

I • Μ » · β# " ·· * · • # • I · · * · i»· ·· * · ·· Věří se, že produkt genu E4 a podstatný produkt genu El funkčně interaguje s více doplněným adenovirem. Schopnost funkčně interagovat se jeví v sérotypech séroskupiny být absolutně konzervativní, ale méně konzervativní je mezi odlišnými sérotypy séroskupiny a není konzervativní mezi viry různých séroskupin. V některých provedeních vynálezu se preferuje, že důležité genové produkty oblastí El a E4 adenovirového genomu se odvodily ze séroskupiny a dokonce se více preferuje, že se získaly ze stejného sérotypu.

Oblast E4 obsahuje pouze jednu podstatnou genovou funkci , ale tato funkce je alespoň částečně redundantní v oblasti E4 adenovirového genomu. Zatímco genová funkce E4/ORF6 se často zmiňuje jako podstatná genová funkce oblasti E4 adenovirového genomu, tento pohled se může v některých ohledech příliš zjednodušovat. Genová funkce E4/ORF3 může částečně nahradit produkt genu E4/OR6. Navíc E4/ORF6/7 se může definovat jako podstatná funkce genu E4. Komplementace a jiné studie ukázaly, že funkce jednoho genu oblasti E4, která je nezbytná a optimálně doplňuje deleci celé oblasti E4 je 0RF6. Důležitá funkce genu oblasti E4 adenovirového genomu, který je ve formě in trans, je v řadě provedení vynálezu přednostně funkcí genu E4/ORF6. Věří se, že genový produkt 0RF6 interaguje s genovým produktem oblasti E1B adenovirového genomu. Podstatná genová funkce oblasti El adenovirového genomu, která je ve formě in trans, je v mnoha provedeních podle vynálezu přednostně genovou funkcí E1B.

Genový produkt E1B je také znám, že interaguje s nepodstatným genovým produktem E4/ORF4. Vynález také popisuje, že genový produkt E4 vyskytující se in trans v komplementační buňce je genový produkt E4/ORF4. Často je možné použít buněčnou linii, která poskytuje genové funkce oblastí El a E4 z DNA, která je stabilně začleněna do buňky, zvláště do genomu buňky. Takové buněčné 16 • · ··» ·♦ linie řeší potřebu vzniku komplementačni buněčné linie pokaždé, kdy se odborník rozhodne vytvořit replikačně deficitní adenovirus. V jiném případě libovolná genová funkce oblasti El nebo E4 se může stabilně začlenit do buňky, která pak bude vyžadovat dočasné opatření jiné genové funkce. To je možné nejjednodušeji ilustrovat v dobře známých buňkách buněčné linie HEK-293, která obsahuje podstatné genové funkce oblasti El. Pomocný virus exprimující E4/ORF6 v buňce 293 napomůže vzniku komplementární buňky. V jiném případě buněčná linie 293/ORF6 se může použít jako komplementačni buněčná linie použitelná podle vynálezu. V oboru jsou dobře známy technologie produkce buňky 293/ORF6 a jiných buněk, které mají stabilně začleněnou a exprimují DNA schopnou poskytovat El a E4 podstatné genové funkce. Tyto technologie se popisují například v dokumentu mezinárodní patentová přihláška WO 95/34671 (Kovesdi et al.).

Dokument WO 95/34671 popisuje, že komplementačni buněčné linie vhodné pro replikaci deficitních adenovirů, které nemají oblasti El a E4 adenovirového genomu, se mohou produkovat začleněním segmentů DNA kódujících podstatné genové produkty do genomu buněčné linie. Tyto segmenty DNA jsou operativně spojeny s promotory, které řídí expresi dostatečného množství genového produktu (ů), což umožňuje ' replikaci replikačně deficitního adenovirů (El(—), E4(-)).. Dokument WO 95/34671 také uvádí, že podstatné genové funkce oblasti E4 poškozují hostitelskou buňku. Proto je vhodné použít regulovatelný promotor tak, že genová funkce oblasti E4 může vzniknout pouze když replikačně nedostatečný adenovirus potřebuje toxický genový produkt pro svou replikaci. V podobném případě podstatné genové funkce oblasti El ovlivňují charakteristiky hostitelských buněk. Proto je také vhodné umístit El genové funkce tak, aby byly řízeny regulovatelným promotorem.

Zatímco existují zřejmé výhody stabilního začlenění genových funkcí El a E4 do komplementačních buněk, existují « «· <*· ♦ ·♦ · ♦ *·# ♦ · ··· * · · * ··· ·· · ·«·· ·· t t # Ψ Ψ » · ·· · »·· * · · · * · · «·· ·« ·· ··· ·* ·· 17 také důvody, že toto začlenění může být dočasné. Například alespoň jedna podstatná genová funkce oblasti El a jedna genová funkce oblasti E4 adenovirového genomu se může poskytnout pomocným virem ve formě in trans. Pomocný virus produkuje tyto genové funkce, když infikuje buňku. V podobném případě komplementační buňka se může vytvořit transfekcí hostitelské buňky plazmidy nebo jinými částmi DNA. V tomto nebo v jiném libovolném provedeni vynálezu se upřednostňuje, aby se použila transfekce nebo infekce. V jiném případě transfekované buňky se umístí pod selekční tlak, což znamená například použití antibiotik spolu s plazmidem, který nese gen rezistence na antibiotika. Podstatné výhody dočasně začleněné DNA kódující komplementační genové funkce zahrnují, ale nejsou omezeny na to, že se neudrží v buněčné linii a · dochází k relativně rychlému vývoji komplementační buňky. V souladu se shora uvedeným popisem DNA obsahující replikačně nedostatečný adenovirový genom se může přenést do komplementační buňky infekcí. Tento způsob zavedení DNA, která obsahuje adenovirový genom, do komplementační buňky je zvláště použitelný, jestliže určitý adenovirový zásobní roztok obsahuje oba požadované replikačně nedostatečné adenoviry a jiný typ adenoviru. V tomto případě požadovaný replikačně nedostatečný adenovirus prvního sérotypu se může jednodušeji čistit pomocí plaků, protože komplementační buňka poskytuje jak podstatnou oblast El a podstatné genové produkty oblasti E4 druhého (nebo druhého a třetího) sérotypu. Poměr částice ku počtu jednotek tvořících plaky podstatně klesá. Pokles je přibližně 3 až 5-ti násobný. Pokles uvedeného poměru (v případě replikačně deficitního adenoviru) znamená, že kontaminující virus (to znamená požadovaný replikačně nedostatečný adenovirus) je s nižší pravděpodobností přítomen v daném plaku. Pokles uvedeného poměru dále ukazuje, že se zvýšil stupeň komplementace nedostatečnosti replikačně nedostatečného adenoviru. Vynález dále popisuje zdokonalený 18 způsob čištěni plaky replikačně nedostatečného adenoviru produkovaného v komplementační buněčné linii exprimujíci komplementační podstatnou genovou funkci adenoviru patřícího k odlišné séroskupině.

Jiný způsob přenosu DNA, která obsahuje replikačně deficitní adenovirový genom, do komplementační buňky je transfekce. Provedení vynálezu uvedeného způsobu Ž&b^ňuje transfekci, kde adenovirový genom je dostupný alespoň ve formě dvou oddělených segmentů DNA. V tomto provedení vynálezu se může v jednom kroku replikačně deficitní adenovirový genom připravit, pomnožit a zabalit. Dříve se vyvinulo několik buněčných linií, které doplňují nedostatečnost podstatných genových funkcí Ad2 nebo Ad5, které patří mezi adenoviry skupiny C. Tyto buněčné linie zvláště zahrnují ty linie, které doplňují nedostatečnost podstatných El genových funkcí. Jsou to například buňky HEK-293 a 293/ORF6. V souladu s vynálezem tyto buněčné linie, zvláště pak ty, které doplňují podstatnou funkci genu E1A, umožňují vytvořit v buněčné linii vhodné pro pomnožení -adenovirů skupiny C replikačně nedostatečný adenovirus, který reaguje s protilátkami specifickými pro adenoviry skupiny. A, D, E nebo F. Není však nutné, aby reagovaly s protilátkami, které jsou schopné neutralizovat infekci adenoviru skupiny C. Termín „neutralizace" znamená schopnost protilátek, které jsou schopny se vázat ve stechiometrickém množství na virus (to znamená 1 protilátka na 1 částici viru), aby došlo k prevenci infekce vhodné hostitelské buňky, jenž je vhodná pro tento virus. Tento replikačně nedostatečný adenovirus se charakterizuje začleněním segmentu adenovirové DNA izolované z adenoviru nebo segmentu, který je podstatně homologní se segmentem DNA získaným z adenoviru. Adenovirus může také ovšem nést cizorodý gen.

Zatímco segment adenovirové DNA, která tvoří část adenovirového vektoru se přednostně izoluje z adenoviru, 19 4 #· • # · segment adenovirové DNA může být také podstatně homologni k segmentu DNA, jenž je obsažen v takovém adenoviru. Termín „podstatně homologni" znamená schopnost dvou nukleových kyselin hybridizovat za alespoň středně přísných hybridizačních podmínek. Přísnost hybridizace je odborný termín, který značí podmínky používané při hybridizační reakci. Komplementární jednoduché řetězce nukleové kyseliny se spojují jeden s druhým za vzniku dvouřetězcové nukleové kyseliny s určitým stupněm chybného párování. Stupeň chybného párování je funkcí používané přísnosti. Přísnost bude zvláště záviset na velikosti a složení řetězců nukleové kyseliny, které spolu reagují, na možném stupni chybného párování, na požadované zkřížené reaktivitě a podobně. Stupeň přísnosti se může ovlivnit mezi jinými použitými iontovými podmínkami a teplotou (popisuje se v publikaci Sambrook ét al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd. Ed. (1989), Cold Spring Harbor, New Yo rk). V souladu s vynálezem specifikovaná přísnost hybridizace částečně definuje segment DNA. Proto · je vhodné, aby hybridizační podmínky byly alespoň středně přísné nebo přísné. V dosavadních případech se vhodné podmínky, to znamená obsah solí, teplota, složení reakční směsi a velikosti nukleové kyseliny, stanovují na základě znalostí tak, aby došlo přibližně 45 % až 80 % nesprávného párování sekvence nukleotidů nukleové kyseliny. Upřednostňuje se, aby sé použily takové hybridizační podmínky, při kterých dochází přibližně k 55 % až 75 % chybného párování. Více se upřednostňují takové podmínky, kdy dochází přibližně k 60 % až 70 % chybného párování. V pozdějším případě vhodné podmínky pro hybridizaci jsou stanoveny na základě běžných znalostí tak, aby došlo ke vzniku přibližně 10 % až 40 % nesprávného párování. Upřednostňuje se, aby se použily přísné hybridizační podmínky, které poskytují přibližně 20 % až 40 % chybného párování. Více se upřednostňují takové podmínky, kdy dochází přibližně k 30 % 20 * · • · · · • · ψ

až 40 % chybného párování. Termín „chybné párování" znamená stupeň přiřazení nekomplementárních baží jedna k druhé v jinak duplexní DNA, čímž vznikají bublinové struktury a teplota denaturace duplexu je nižší ve srovnání s duplexem stejné délky a složení baží, který je 100 % párován.

Adenovirový vektor přednostně dále obsahuje cizorodý gen, který se v typickém případě exprimuje v hostitelské buňce a kóduje produkt, který je možný využít ve výzkumu (jako geny markérů), terapii a/nebo profylaxi. Takový cizorodý gen kóduje RNA, antimediátorovou RNA, syntetický oligonukleotid a/nebo polypeptid. Cizorodé geny, které se využívají při terapii, zahrnují geny kódující chybějící nebo porušenou funkci genu, jako je gen transmembránového regulátoru cystické fibrózy (CFTR) spojený s cystickou fibrózou (CF) . Cizorodé nukleové kyseliny, které mají profylaktické využití, zahrnují geny, které kódují genový produkt, jenž má schopnost přímo nebo nepřímo předcházet onemocnění tak, že poskytuje zdroj polypeptidu nebo jiného antigenu, aby - došlo k vyvolání imunitní odezvy. Příklady provedení vynálezu Příklad 1: V tomto příkladu se popisuje delece oblasti E1A z adenovirové DNA viru Ad7 a skupiny B, přičemž vznikají velké virové fragmenty.

Virus Ad7a se použil při inokulaci buněk HEK-293 v modifikovaném kultivačním Eagle médiu, které obsahuje 5 % koňské sérum, při 100 násobné infekci. Ze shromážděného viru Ad7a se izolovala DNA za použití způsobů popsaných v publikaci Falck-Pedersen, in Cell Biology: A Laboratory Manual (Spector et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory, Wew York, 1994). DNA Ad7a se pak podrobilo štěpení restrikční endonukleázou Aat II podle publikace Dijkema et al., Gene, 12, 287 (1980), 21

přičemž vzniká na levé straně malý fragment o velikosti 1,483 kb (fragment 1) a velký fragment přibližně o velikosti 30 kb, který se nachází ve středu genomu (fragment 2) a na pravé straně vzniká druhý velký fragment o velikosti 5 kb (fragment 3) . Malý fragment zahrnuje počátek replikace a balící sekvence, stejně jako oblast E1A, která je nezbytná při replikaci DNA. Velké fragmenty obsahují ostatní časné geny, stejně jako pozdní geny, které jsou nutné při produkci viríonů.

Velké fragmenty 2 a 3 se společně čistily a izolovaly se od malého fragmentu za použití centrifugace hustotním gradientem sacharózy. Gradient sacharózy 10 % až 20 % s polštářem 40 % sacharózy se přelil přes vrstvu DNA Ad7a štěpenou restrikčním enzymem AatlI. Následovala centrifugace a gradient se rozdělil do . frakcí. Frakce obsahující čištěné velké fragmenty se analyzovaly na agarózovém gelu elektroforézo-u a zviditelnily se barvením ethidium bromidem.

Frakce obsahující velké fragmenty, které neobsahovaly malé fragmenty se sloučily a jejich koncentrace se zvýšila srážením, a následnou rekonstitucí v menším objemu. Sloučené segmenty DNA se použily v následujících krocích při přípravě replikačně nedostatečného viru Ad7a, vzhledem k přítomnosti velkých fragmentů (2 a 3) a nepřítomnosti malého fragmentu (1), který je znám, že zahrnuje oblast E1A. Příklad 2:

Tento příklad popisuje vznik plazmidu pAd7aCMV-CATgD. Plazmid pAd7aCMV-CATgD se připravil přímým klonováním ve třech postupných krocích.

Nejdříve se za použití polymerázové řetězové reakce (PCR) amplifikovalo a izolovalo až 475 párů baží levého konce genomu Ad7a (lokalizovaných mezi 0 a 1,3 jednotek mapy (mu) na genomu Ad7a) . Primery používané při amplifikaci obsahují restrikční místo Sací (na levém konci primeru) a restrikční místo Not I (na pravém konci primeru). Amplifikovaná DNA obsahovala důležitý počátek (ori) balicí sekvence (pkg). Časné oblasti E1A část E1B, které se nacházejí mezi 1,3 a 7,7 mu se neamplifikovaly. Klónovací vektor pBS (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) se pak otevřel enzymy Sacl-Notl a do tohoto místa se začlenil PCR fragment SacI-ori/pkg-Notl.

Za druhé, za použití standardních metod se otevřel vektor pBS pomocí enzymů Notl-Sall a do elementů ori a. pkg se ligoval promotor cytomegaloviru (CMV), následovaný sekvencí bakteriální chloramfenikolacetyltransferázy (CAT) a myšího póly(A) místa B-maj globinu.

Za třetí se za účelem rekombinace s genomem Ad7a vytvořila za použití prvního a druhého primeru PCR oblast o velikosti 2,8 až 4,0 kb. První primer obsahoval restrikční. místo Nhel, které se dotýká restrikčního místa Sáli, jenž je bezprostředně vedle sekvence Ad7a od pozice 2 880 včetně do pozice 2816 včetně. Druhý primer obsahoval restrikční místo Aspal, které se dotýká restrikčního místa KpnI, jenž je bezprostředně vedle sekvence Ad7a od pozice 4 000 včetně do pozice 3 986 včetně.

Tento překrývající se rekombinační fragment se nachází na genomu Ad7a v poloze 7,7 až 11,1 mu. Vektor pBS se pak otevřel réíjsrikčními enzymy Sall-KpnI a do tohoto místa se začlenil PCR fragment SalI~Ad7 překrývající DNA 2,8-4,0 kb-Kpnl. To znamená, že se ligoval do dříve popsané konstrukce za místo póly(A), čímž vznikl plazmid pAd7aCMV-CATgD. Příklad 3: -,h

Tento příklad popisuje vytvoření rekombinajtního adenoviru Ad7-CAT a demonstruje schopnost rekombinantního adenoviru Ad7a replikovat se v buňkách HEK-293, které ho doplňují. Různé poměry mikroorganizmů virových velkých fragmentů připravených podle příkladu 1 a plazmid pAd7aCMV-CATgD připraveného podle příkladu 2 se přenesly na monovrstvu buněk HEK-293 (106 buněk na disku o průměru 60 mm) srážením « t· ·* • · » I · * • » M * f « · t · · • · · · ♦ ·♦* *♦ ·* • · t · · ψ • « t · · ·»· *♦ 23 fosforečnanem vápenatým. Po jednom týdnu se buňky shromáždily a opakovaným zmražováním a táním se připravil virový lyzát. 10 % část výsledného lyzátu (0,5 ml) se použila při infekci monovrstvy buněk HEK-293. Po 24 hodinách se tyto buňky shromáždily a připravily se lyzáty. V lyzátech se testovala aktivita reportního genu. To znamená acetyltransferáza chloramfenikolu (CAT) za použití způsobu popsaného v publikaci Gorman et al., Mol. Cell Biol., 2, 1044-1051 (1982) a Gorman, et al., PNAS, 79, 6777-6781 (1982). U výsledných virových konstrukcí se testovala jejich schopnost indukovat aktivitu CAT. Za podmínek, při kterých se nepozorovala v testu podle publikace Gorman et al. žádná CAT aktivita (například transfekce, která nezahrnuje žádnou exogenní cDNA CAT), některé konstrukce ukázaly až 50 % acetylaci chloramfenikolu, což naznačuje, že se úspěšně vytvořila virová konstrukce. Příklad 4:

Tento přiklad dále potvrzuje vytvoření rekombinantního adenoviru Ad7-CAT a schopnost rekombinantního adenoviru Ad7 se replikovat a doplňovat v buňkách HEK-293. Tento příklad zvláště popisuje test sekundárního virového lyzátu exprese genu CAT.

Alikvot primárního lyzátu o objemu 1,0 ml vytvořeného podle příkladu 3 se použil pro infekci buněk HEK-293 na plotně o průměru 60 mm. Po inkubaci po dobu jednoho týdne se buňky sebraly a vytvořil se lyzát, jak se popisuje v příkladu 3. 10 % část každého lyzátu se pak použila pro infekci čerstvé monovrstvy bur.ěk HEK-293 a ve výsledném lyzátu se testovala aktivita CAT.

Výsledky uvedených testů ukázaly, že výsledkem transfekce 4,8 mg velkého fragmentu kombinovaného s přibližně stejnou hmotností kruhového plazmidu je silná aktivita CAT v sekundárním lyzátu, která je výsledkem virové aktivity 9 24 • # ΦΦ9 ♦· ·· #·♦ progenu na začátku shromážděných rekombinantnich virových partikul!.

Vybrané buněčné lyzáty se dále charakterizovaly infekci buněk HEK-292 a přípravou virové DNA za použití upraveného způsobu podle Hirta, který se popisuje v publikaci Falck-Pedersen, in Cell Biology: A Laboratory Manual (Spector et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory, new York, 1994). Čištěná virová DNA se štěpila restrikčním enzymem Aat II za účelem charakterizace rekombinantní DNA. Kontrolní DNA se izolovala z adenovirů Ad7a a Ad5 divokého typu. Vizuální analýza velikosti restrikčních fragmentů (separovaných elektroforézou na agarózovém gelu) potvrdila, že se získaly správné konstrukce DNA. Příklad 5:

Za účelem charakterizace Ad?-CAT produkovaného podle shora v textu uvedených příkladů se provedly experimenty výtěžku upraveného viru v buňkách 293 a A549. Aktivita CAT ad7-CAT se porovnala s homologním Ad5-CAT (odvozeným z Ad5 a stejným způsobem) v buňkách 293 a A549. Když se buňky 293 infikovaly jednou částicí Ad5-CAT, v buněčném lyzátu shromážděném 18 hodin po infekci se zjistila podstatná aktivita CAT. Dále, jak se očekávalo se zvyšuje aktivita CAT v Ad5-CAT v závislosti na dávce. Naopak Ad7-CAT nevykazuje v buňkách 293 žádnou detekovatelnou aktivitu CAT pokud se poměr virových partikul! ku buňkám zvyšoval na hodnotu přibližně 10:1. Při hodnotě poměru virové partikule ku buňkám 10:1 je Ad5-CAT přibližně 35 krát účinnější při řízení produkce CAT než Ad7-CAT. Navíc aktivita CAT produkovaná v Ad7-CAT při hodnotě poměru virové partikule ku množství buněk 1 000:1 je přibližně stejná jako aktivita získaná z Ad5-CAT při hodnotě poměru virové částice ku buňkám 10:1. Ad5-CAT a Ad7-CAT vykazují pouze malé množství aktivity CAT v buňkách A549 (dvakrát menší množství ve srovnání s Ad7-CAT v buňkách 293). Tento příklad ukazuje, že • *· lf · I» ·· «· 9 · · ♦ #* * · · · • t t · I · 9 9 9 9 9 9 9 9· 9 · · 9 99 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 99· 99 99 999 «· 99 25

Ad7-CAT se neúčinně doplňuje buňkami 293 a je nedostatečný ve funkci genu oblasti El adenovirového genomu. Přiklad 6:

Tento přiklad ukazuje, že došlo ke zvýšeni účinnosti komplementace El deficitního adenoviru, který nespadá do skupiny C v buňkách 293/ORF6, ve srovnání s účinností ' komplementace v buňkách 293.

Za použití standardních protokolů tvoření plaků se stanovila schopnost viru Ad7a divokého typu tvořit plaky v různých buněčných linií. Cytopatický účinek virů odvozených od Ad7 a Ad5 je během infekce buněk A549 nebo 293 odlišný. Navíc tvoření plaků trvá o trochu déle v případě Ad7a ve srovnání s Ad5. Také poměr množství virových částic ku jednotkám tvořící plaky (pfu) v případě virů Ad7a (přibližně 2 000 částic/pfu nebo více) infikující buňky ' 293 je podstatně vyšší, než poměry množství částic ku pfu pro Ad5 infikující buňky 293 (přibližně 40 až 50 částic/pfu).

Směs Ad7-CAT a Ad7a divokého typu se nanesla na buňky 293, aby došlo k·tvorbě plaků. Při několika pokusech se neidentifikovaly žádné plaky obsahující El nedostatečný Ad7 a kontaminační virus divokého typu. Opakovaná tvorba plaků snadno zvyšuje poměr viru divokého typu ku El nedostatečnému viru.

Za použití upravených buněk 293 (které doplňují E1A a E1B) se uskutečnil stejný postup tvoření plaků. V· těchto plácích se exprimuje produkt genu ORE6 oblasti E4 adenovirového genomu (to znamená buňky 293/ORF6). Tento postup vede k podstatnému zvýšení počtu plaků ve srovnání s tvorbou plaků na normálních buňkách 293. Navíc se pozorovalo zjevné zlepšení morfologie plaků, což naznačuje vyšší stupeň komplementace v buňkách 293/ORF6, než v 293. Navíc v zásobních roztocích viru se pomocí PCR nedetekovala žádná DNA El (to znamená, že se v zásobních roztocích čištěných pomocí plaků nenašel žádný virus divokého typu). Některé tyto zásobní roztoky Ad7-CAT, které neobsahují replikačně kompetentní adenovirus (bez RCA) , zprostředkovaly produkci velkého množství CAT v infikovaných buňkách A549. Navíc se záskala koncentrace viru 1012 partikulí/ml, aniž došlo ke zvýšení titru viru. Výtěžek virů, který je přibližně 2 x 1012 virových částic z konfluentní kultury buněk 293/ORF6 na plotně o průměru 35 mm byl podstatně stejný, jak se očekávalo při infekci Ad5.

Tento příklad ukazuje, že stanovení genové funkce oblasti E4 adenovirového genomu vedle podstatných genových funkcí oblasti El adenovirového genomu překvapivě zvyšuje účinnost komplementace El nedostatečných adenovirů, kde se produkty genů El poskytované ve formě in trans získaly z adenovirů séroskupiny odlišné od séroskupiny replikačně nedostatečného adenovirů. Příklad 7: V tomto příkladu se popisuje zvýšená komplementace nedostatečnosti El tím, že se zajistí ín trans forma produktu genu E4 jiného než 0RF6. Produkce a stupeň komplementace El nedostatečného Ad7 se porovnává mezi buňkami 293 a 293/E4-ORF4 .

Buňky 293/ORF4 se produkují začleněním expresivní kazety 0RF4 do genomu buněk 293. Expresivní kazeta 0RF4 obsahuje buď promotor ovčího metalothioneinu nebo promotor LTR MMTV, které jsou operativně spojené se segmentem DNA, jenž kóduje produkt genu 0RF4 Ad5. Jestliže se použije promotor MMTV, pak se do buňky, která konstitutivně produkuje vysoké množství glukokortikoidního receptoru, také začlení druhá expresivní kazeta. V jiném případě se expresivní kazeta vhodná pro podstatné genové funkce oblasti El Ad5 a shora popsaná expresivní kazeta pro 0RF4 začlení do druhé buněčné linie, jako jsou buňky COS-1, A549, HeLa nebo 293. Výsledná buněčná linie se nazývá 293/ORF4. 27 ♦ ♦« ♦« • ·« ·· «· · ♦ · · ·· * · · · • · · · ♦ • • · · * « * · ♦ · ♦ • · • » « t ♦ ♦ t · · • • · · · ♦ ♦♦ ·· ♦ ♦♦ ·« »·

Směs Ad7-CAT a Ad7 divokého typu se nanesou na buňky 293/ORF4 za účelem vzniku plaků, aby se získaly jednotlivé plaky obsahující pouze El nedostatečný Ad7. Příklad 8:

Tento příklad hodnotí podobnost mezi adenoviry, které nespadají do skupiny C s ohledem na adenoviry skupiny C.

Podobnosti a odlišnosti mezi různými skupinami adenovirů se testovaly porovnáním podobnosti aminokyselin a shodnosti mezi produkty genů E1A a E1B Ad2 (skupiny C), Ad5 (skupiny C), Ad7 (skupiny B), Adl2 (skupiny A) a Ad40 (skupiny F). S ohledy na viry ve stejné skupině, zvláště mezi Ad2 a Ad5 ve skupině C, existuje 99 % podobnost a 98 % shoda mezi produkty genů E1A a E1B Ad2 a Ad5. Naopak porovnání virů různých skupin ukázalo značně omezenou podobnost a menší shodu. Mezi produkty genů E1A a E1B Ad7, Adl2 a Ad40 existuje například 63 až 75 % podobnost a 40. až 53 % shoda ve srovnání s produkty genů E1A a E1B Ad2 a Ad5.

Zjistilo se, že určité domény jsou mezi viry různých skupin konzervativní, například je tomu u produktů genů E1A a E1B adenovirů skupiny C a adenovirů, které nespadají do skupiny C. Tak se zjistilo, že rozdíly mezi určitými viry, kteří nepatří do skupiny C, v porovnání s viry patřící do skupiny C, jsou podobné tak, že demonstrace schopností adenovirů skupiny B ukazuje stejné schopnosti, jako vykazují jiné adenoviry, který nespadají do skupiny C. Zvláště demonstrace schopnosti El defektních adenovirů skupiny B, například Ad7, být komplementováni buňkami HEK-293 (jak se popisuje v příkladu 3) dokazuje schopnost jiných adenovirů, které nespadají do skupiny C, být komplementován buňkami HEK-293.

Odborník je schopen získat a pomnožit libovolný známý sérotyp adenovirů. Jestliže odborník získá zásobní roztok pomnoženého viru může z viru izolovat DNA a sekvenovat ji 28 • ·· 99 9 99 9 9 9 · 9 · * · * · · · • · ff * · 9 9*9 • « 9 9 · ♦ t f I «9 9 9· 9 9 9 »·· 999 9# #9 999 99 9 libovolnou rutinní metodou, to znamená, že nemusí dělat nic neobvyklého. Pak je také jednoduché identifikovat standardní oblasti adenovirového genomu rutinním porovnáním sekvencí. Tak se mohou také navrhnout oligonukleotidy a identifikovat se místa, která rozeznávají restrikční enzymy. Tak zatímco způsoby použití v příkladech ukazují použití Ad7, tyto metody je možné jednoduše aplikovat na jiné sérotypy adenovirů.

Claims (15)

1. 29 • ·

   -•'rV·' • · * I · · • 0 § • t I *·

   PATENTOVÉ NÁROKY 1. Způsob produkce replikačně nedostatečného adenoviru obsahujícího cizorodý gen, kde uvedený replikačně nedostatečný adenovirus vykazuje první sérotyp patřící do první séroskupiny a genom s nedostatečnou podstatnou genovou funkcí oblasti El adenovirového genomu, vyznačující se tím, že. uvedený způsob zahrnuje: (a) přenos DNA obsahující uvedený adenovirový genom do buňky, která poskytuje in trans (i) jednu nebo více podstatných genových funkcí oblasti El adenovirového genomu získaného z adenoviru, který má druhý sérotyp patřící do druhé séroskupiny a (ii) jednu nebo více genových funkcí oblasti E4 adenovirového genomu získaného z adenoviru, který má třetí sérotyp a patří do třetí séroskupiny, kde první séroskupina se liší od druhé a třetí séroskupiny a (b) zachování produkce uvedeného replikačně nedostatečného adenoviru uvedenou buňkou.
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedená první séroskupina se vybrala ze skupiny zahrnující séroskupinu A, B, D, E a F.
3. 3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se t í. m, ž e uvedená druhá a třetí séroskupina je stejná.
4. 4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že uvedený druhý a třetí sérotyp je stejný.
5. 5. Způsob podle nároku 3 nebo 4, vyznačující se tím, že uvedené genové funkce oblasti E4 adenovirového genomu obsahují genovou funkci E4/ORF6. 30 30 • « * • # · • · # • · « ·· *· • Φ· ·· · ·» · · t · ti I « I · ♦ · • · · * · · ··· ·* t» ··♦
6. 6. Způsob podle libovolného z nároků 3 až 5, vyznačující se tím, že uvedené podstatné genové funkce oblasti El adenovirového genomu obsahují podstatnou genovou funkci oblasti E1B adenovirového genomu.
7. 7. Způsob podle libovolných nároků 3 až 6, vyznačující se tím, že alespoň jedna genová funkce oblastí El a E4 adenovirového genomu poskytována in trans se exprimuje z DNA začleněné do genomu uvedené buňky.
8. 8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se' tím, že všechny uvedené genové funkce oblastí El a E4 adenovirového genomu poskytované in trans se exprimují z DNA začleněné do genomu uvedené buňky.
9. 9. Způsob podle libovolného z nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že uvedená buňka je buňkou 293/ORF6.
10. 10. Způsob podle libovolného z nároků 3 až 6, vyznačující setím, že alespoň jedna genová funkce oblastí El a E4 adenovirového genomu poskytována in trans se exprimuje z DNA, kterou zajišťuje pomocný virus.
11. 11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že všechny uvedené genové funkce oblastí El a E4 adenovirového genomu poskytované in trans se exprimují z DNA, kterou zajišťuje pomocný virus.
12. 12. Způsob podle libovolného z nároků 1 až 11, vyznačující se tím, že uvedená DNA obsahující uvedený adenovirový genom se přenese do uvedené buňky infekcí.
13. 13. Způsob podle nároku 12, vyznačuj ící se tím, že uvedená buňka se infikuje směsí adenovirů a uvedený replikačně nedostatečný adenovirus se čistí pomocí plaků. 31 • ·* tl · I • · · III ttt ·· If I · * • · lit t· ··· »1 II • I I t • I I · • I I · • I · I «· t«
14. 14. Způsob podle libovolného z nároků 1 až 11, vyznačující se tím, že uvedená DNA obsahující uvedený adenovirový genom se přenese do uvedené buňky transfekcí.
15. 15. Způsob podle nároku 14, vyznačuj ící se tím, že uvedená DNA obsahující uvedený adenovirový genom se zajišťuje alespoň na dvou oddělených segmentech DNA.