CZ433199A3

CZ433199A3 - Způsob léčení trorabotických poruch

Info

Publication number: CZ433199A3
Application number: CZ19994331A
Authority: CZ
Inventors: Brian William Grinnell; Joseph Anthony Jakubowski
Original assignee: Eli Lilly And Company
Priority date: 1998-06-01
Filing date: 1998-06-01
Publication date: 2000-05-17

Abstract

Řešení se týká použití lidského aPC a protidestičkového činidla, zahrnujícího, aniž by tím bylo omezeno, aspirin (ASA), clopidogrel, ReoPrcŽ (abciximab), dipyridamol, ticlopidin a antagonisty receptoru Ilb/IIIa. Synergje vede k možnosti snížit dávky činidel, použitých v kombinované terapii při léčbě trombotických poruchjakoje mrtvice, infarkt myokardu, nestabilní angína atd.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká lékařské vědy a konkrétně léčení trombotických poruch aktivovaným lidským proteinem C v kombinaci s protidestičkovými činidly.

Dosavadní stav techniky

Protein C je serinová proteáza a přirozeně se vyskytující antikoagulant který hraje roli při regulaci hemostázy inaktivací faktorů Va a Vlila v koagulační kaskádě. Lidský protein C obíhá jako zymogen se 2 řetězci, který je aktivován in vivo thrombinem a trombomodulinem na povrchu fosfolipidů, což vede k vytvoření aktivovaného proteinu C (aPC).

Krevní koagulace je vysoce složitý proces regulovaný rovnováhou mezi prokoagulačními a protikoagulačními mechanismy. Tato rovnováha určuje buď podmínky normální hemostázy nebo abnormálního patologického vytváření sraženin, které vede k událostem jako je mrtvice, infarkt myokardu a cévní trombóza. Tuto rovnováho ovlivňují dva hlavní faktory; vytváření fibrinu a aktivace následné agregace krevních destiček. Kritickým faktorem, řídícím oba procesy, je vytváření enzymu thrombinu, ke kterému dochází • ·

po aktivaci kaskády srážení krve. Thrombin je prokoagulační enzym, který agreguje destičky a přeměňuje fibrinogen v krevním oběhu na nerozpustný fibrin, což vede k vytváření krevní sraženiny. Thrombin také působí jako silný antikoagulant, protože aktivuje zymogen proteinu C na aktivovaný protein C, což zase inhibuje vytváření thrombinu. Tímto zpětnovazebným řízením vytváření thrombinu tedy aPC funguje jako patrně nedůležitější regulátor snižující krevní koagulaci, což vede k ochraně proti trombóze.

Kritickou roli proteinu C v řízení hemostázy je možno prokázat na příkladu zvýšeného výskytu trombózy při heterozygotové nedostatečnosti, odolnosti na protein C (například v důsledku běžné Leidenské mutace Faktoru V) a fatální následky neléčené heterozygotové nedostatečnosti proteinu C. Bylo dokázáno, že lidský aktivovaný protein C, jak získaný z plasmy, tak i rekombinantní, je účinné a bezpečné protitrombotické činidlo u řady zvířecích modelů jak cévní, tak i arteriální trombózy.

V běžné klinické praxi je inhibice destiček, například použitím aspirinu (ASA), dobře dokumentována jako účinný prostředek jak pro prevenci, tak i pro léčení trombotických onemocnění. Navíc v případech jako je infarkt myokardu a mrtvice se inhibice destiček stala standardní součástí léčby. Použití protidestičkových činidel jako je ASA však zvyšuje riziko krvácení, což omezuje dávku činidly a dobu trvání léčení. Pro blokování účinku thrombinu při vytváření fibrinu zůstává heparin standardním antikoagulantem při léčení akutních případů. Heparin však má úzký terapeutický • 9 ·

• ·

index a přináší významné riziko krvácení obzvláště v kombinaci s protidestičkovými činidly.

Kombinovaná terapie aspirinem a syntetickými inhibitory thrombinu aktivátory tkáňového plasminogenu nebo monoklonálními protidestičkovými glykoproteinovými Ilb/IIIa protilátkami bylo studováno u psího modelu koronární arteriální trombózy [Yasuda a kol., J. Am. Coli. Cardiol., 16:714-22 (1990)]. Aspirin v kombinaci s těmito činidly prodlužuje dobu krvácení a nezabránuje opětné okluzi koronární artérie. Kromě toho byla navržena kombinovaná terapie aPC s trombolytickými činidly jako je aktivátor tkáňového plasminogenu, urokináza nebo streptokináza [Griffin a kol., U.S. patent č. 5,350,578]. Nicméně tyto kombinace nebyly úspěšné. Proto zůstává potřeba nalézt účinnou terapii pro léčbu trombotických poruch.

Podstata vynálezu

Předložený vynález se týká kombinace aPC s protidestičkovými činidly při léčení trombózy. V souladu s tím se předložený vynález týká použití aPC v kombinaci s protidestičkovými činidly pro léčení trombotických poruch. Tato kombinovaná terapie vede ke zvýšené účinnosti u řady trombotických poruch které zahrnují, aniž by tím byly omezeny, mrtvici, infarkt myokardu, nestabilní angínu, ucpání následkem odtržení po provedené angioplastice nebo umístění stentu a trombózu následkem chirurgického zákroku na periferálním cévním systému. Kromě toho kombinace aPC a protidestičkových činidel vede k synergickému působení, • 9 • * · ♦ · · · »·· ······ • · · . · · · • · · · · · ·· · · které umožňuje snížení dávek jak aPC, tak i protidestičkových činidel. Snížení dávek činidel v kombinované terapii zase vede ke snížení vedlejších účinků jako je snížení náchylnosti ke krvácení, která je často pozorována u kombinované protikoagulační/protidestičkové terapie.

Předložený vynález se týká způsobu léčení trombotické poruchy u pacienta, který má jeho potřebu, který zahrnuje podávání uvedenému pacientovi farmaceuticky účinného množství aktivovaného proteinu C v kombinaci s protidestičkovým činidlem. Dále se předložený vynález týká způsobu léčení trombotické poruchy u pacienta, který má jeho potřebu, který zahrnuje podávání uvedenému pacientovi farmaceuticky účinného množství protidestičkového činidla a aktivovaného proteinu C pro dosažení úrovně aktivovaného proteinu C v plasmě od 10 ng/ml do méně než 100 ng/ml.

Pro potřebu vyložení předloženého vynálezu v jeho podobě dané patentovými nároky jsou dále definovány některé výrazy.

aPC neboli aktivovaný protein C, buď rekombinantní nebo získaný z plasmy. aPC zahrnuje a je výhodně představován lidským proteinem C, ačkoliv aPC může také zahrnovat další druhy nebo deriváty, které mají proteolytické, amidolytické, esterolytické a biologické (protikoagulační nebo profibrinolytické) účinky proteinu C. Příklady derivátů proteinu C popsal Gerlitz a kol., U.S. patent č. 5,453,373, a Foster a kol., U.S. patent No. 5,516,650, který je zde ve své celistvosti zahrnut jako reference.

« «

ΑΡΤΤ - aktivovaný částečný tromboplastinový čas.

HPC - zymogen lidského proteinu C.

r-hPC - rekombinantní zymogen lidského proteinu C, vytvářený prokaryotními buňkami, eukaryotními buňkami nebo transgenovými zvířaty.

r-aPC - rekombinantní lidský aktivovaný protein C vytvořený aktivací r-hPC in vitro nebo přímou sekrecí aktivované formy proteinu C z prokaryotních buněk, eukaryotních buněk nebo transgenových zvířat [Cottingham, W097/200433 v to počítaje například sekreci z lidských ledvinových buněk 293 ve formě zymogenu a následné čištění a aktivování způsoby dobře známými odborníkovi v oboru, viz Yan, U.S. patent č. 4,981,952, který je zde ve své celistvosti zahrnut jako reference.

Zymogen - znamená vylučované neaktivní formy buď jednoho řetězce nebo dvou řetězců proteinu C.

Protidestičkové činidlo - jedno nebo více činidlel samotných nebo v kombinaci, které snižuje schopnost destiček agregovat. Činidla, která jsou tím míněna a která jsou známá odborníkům v oboru zahrnují například činidla, uvedená v monografii Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 19. vydání, svazek 11, strany 324-25, Mack Publishing Co., která je zde zahrnuta jako reference. Taková činidla zahrnují, aniž by tím byla omezena, aspirin (ASA), clopidogrel, ReoPro® (abciximab), dipyridamol, • · ticlopidin a antagonisty Ilb/IIIa.

Léčení - popisuje ošetřování a péči o pacienta s cílem zvládnout onemocnění, stav nebo poruchu a zahrnuje podávání sloučenin podle předloženého vynálezu pro prevenci vypuknutí symptomů nebo komplikací, úlevu symptomů nebo komplikací nebo eliminaci onemocnění, stavu nebo poruchy.

Nepřetržitá infúze - neustálé v zásadě nepřerušené podávání roztoku do cévy po určenou dobu.

Jednorázová injekce - injekce látky v určeném množství po dobu až do přibližně 120 minut.

Farmaceuticky účinné množství - představuje množství sloučeniny podle předloženého vynálezu, které je schopno inhibovat trombotickou poruchu u savců. Konkrétní velikost dávky sloučeniny podávané podle předloženého vynálezu bude pochopitelně určena ošetřujícím lékařem po zhodnocení konkrétních okolností uvažovaného případu, v to počítaje podávanou sloučeninu, stav, který je léčen a další podobné okolnosti.

Trombotická porucha - porucha, vztahující se nebo ovlivněná sraženin v krevní aniž by tím byly nestabilní angínu, vytvářením nebo přítomností krevních cévě. Trombotické poruchy zahrnují, omezeny, mrtvici, infarkt myokardu, ucpání následkem odtržení po provedené angioplastice nebo umístění stentu a trombózu následkem chirurgického zákroku na periferálním cévním systému.

Předložený vynález se výhodně vztahuje k léčení trombotických poruch aktivovaným proteinem C v kombinaci s protidestičkovým činidlem. aPC použitý v takové kombinaci může být výhodně ve formě známé pro přípravu farmaceuticky použitelných kompozic. aPC se podává parenterálně pro zajištění jeho podání do krevního oběhu v účinné formě injekcí odpovídající dávky nepřetržitou infuzí po dobu od přibližně 24 hodin do přibližně 144 hodin.

Při použití při léčení spolu s protidestičkovým činidlem je množství podávaného aPC od přibližně 4 mg/70 kg/24 hodin to 160 mg/70 kg/24 hodin nebo ekvivalentní určení od 0,1 mg/m²do 4 mg/m² nebo od 2 gg/kg/hod do 96 μg/kg/hod. Výhodné množství podávaného aPC od přibližně 4 mg/70 kg/24 hodin do 120 mg/70 kg/24 hodin nebo ekvivalentní určení od 0,1 mg/m²do 3 mg/m² nebo 2,4 gg/kg/hod do 72 gg/kg/hod. Výhodněji je množství podávaného aPC od přibližně 4 mg/70 kg/24 hodin do 80 mg/70 kg/24 hodin nebo ekvivalentní určení od 0,1 mg/m²do 2 mg/m² nebo od 2,4 gg/kg/hod do 48 gg/kg/hod. Ještě výhodněji je množství podávaného aPC od přibližně 4 mg/70 kg/24 hodin do 60 mg/70 kg/24 hodin nebo ekvivalentní určení od 0,1 mg/m² do 1,5 mg/m² nebo od 2,4 gg/kg/hod do 36 μg/kg/hod. Ještě dále výhodněji je množství podávaného aPC od přibližně 10 mg/70 kg/24 hodin do 50 mg/70 kg/24 hodin nebo ekvivalentní určení od 0,25 mg/m² do 1,25 mg/m²nebo 6 μg/kg/hod to 30 μg/kg/hod. Ještě více výhodněji je množství podávaného aPC od přibližně 20 mg/70 kg/24 hodin do 40 mg/70 kg/24 hodin nebo ekvivalentní určení od 0,5 mg/m² do 1,0 mg/m² nebo od 12 μg/kg/hod do 24 pg/kg/hod.

• φ

Nej výhodněji je množství podávaného aPC od přibližně 40 mg/70 kg/24 hodin nebo ekvivalentní určení od 1,0 mg/m² nebo 24 μg/kg/hod. Vhodné dávky aPC podávaného při protidestičkové terapii vedou buď ke zvýšené účinnosti nebo ke snížení dávky jednoho nebo obou činidel.

Úrovně v plasmě získané z daného množství podávaného aPC jsou od 2 ng/ml do méně než 100 ng/ml. Výhodné úrovně v plasmě jsou v rozmezí od přibližně 20 ng/ml do 80 ng/ml. Nejvýhodnější úrovně v plasmě jsou v rozmezí od přibližně 30 ng/ml do přibližně 60 ng/ml a ještě výhodněji přibližně 50 ng/ml.

Alternativně se aPC podává injekcí jedné třetiny vhodné hodinové dávky jako jednorázová injekce následované zbývajícími dvěma třetinami hodinové dávky ve formě nepřetržité infúze po dobu jedné hodiny následovanými nepřetržitou infúzí vhodné dávky po dobu dvacet tři hodin, což vede k vhodné dávce podávané v průběhu 24 hodin.

Výraz v kombinaci s se vztahuje k podávání ♦

protidestičkových činidel s aPC buď současně nebo postupně nebo kombinací těchto postupů. Podávání inhibitorů destiček v kombinaci s aPC vede ke zvýšené účinnosti u řady trombotických poruch které zahrnují, aniž by tím byly omezeny, mrtvici, cévní trombózu, infarkt myokardu, nestabilní angínu, ucpání následkem odtržení po provedené angioplastice nebo umístění stentů a trombóza následkem chirurgického zákroku na periferálním cévním systému. Synergie také vede k možnosti snížit dávky činidel v kombinované terapie, což vede ke snížení vedlejších účinků ·· ·· ·· ·* » · · · · · · ’ jako je snížení náchylnosti ke krvácení, která je často pozorována při kombinované protikoagulační/protidestičkové terapie.

Použitelné protidestičkové činidlo a vhodné úrovně dávkování jsou zřejmé odborníkům v oboru. Odborník je schopen určit vhodné dávky pro použití libovolného protidestičkového činidla pro dosažení farmaceuticky účinného množství pro léčení trombotických poruch. Protidestičkové činidla vhodná pro použití způsobem podle předloženého vynálezu zahrnují, aniž by tím byla omezena, klinicky uznávaná a komerčně dostupná činidla jako je aspirin (ASA), clopidogrel, ReoPro® (abciximab), dipyridamol, ticlopidín a antagonisty Ilb/IIIa. Množství protidestičkového činidla aspirin (ASA) podávaného spolu s aPC je přibližně od 10 mg do 1000 mg, podáváno jednou denně. Množství protidestičkového činidla ticlopidín podávaného spolu s aPC je přibližně od 50 mg do 1250 mg, podáváno dvakrát denně (B.I.D.). Množství protidestičkového činidla dipyridamol podávaného spolu s aPC je přibližně od 15 mg do 500 mg, podáváno čtyřikrát denně. Množství protidestičkového činidla clopidogrel podávaného spolu s aPC je přibližně od 40 mg do 1000 mg, podáváno jednou denně. Množství protidestičkového činidla ReoPro® (abciximab) podávaného spolu s aPC je přibližně od 0,025 μρ/^/ιηίη do 1 pg/kg/min podáváno jako infúze po dobu dvanácti hodin. Alternativně, ReoPro® může být podáván spolu s aPC jako jednorázová injekce v dávce přibližně od 0,05 mg/kg do 1,0 mg/kg. Kromě toho ReoPro® může být podáván spolu s aPC jako jednorázová injekce následovaná infúzí po dobu dvanácti hodin. Množství antagonisty Ilb/IIIa používaného v kombinaci s aPC je od přibližně 0,1 mg/kg do přibližně 100 mg/kg v závislosti na konkrétním použitém činidle [viz například Fisher a kol., US patent č. 5,618,843, který je zde zahrnut ve své celistvosti jako reference]. Odborník v oboru je schopen určit vhodné dávkové úrovně pro dosažení farmaceuticky účinného množství.

Protein aPC spolu s protidestičkovými činidly zvyšuje protitrombotický účinek samotného protidestičkového činidla. Tato kombinovaná terapie proto může dosáhnout snížení terapeutických dávek aPC stejně tak jako snížení dávek protidestičkových činidel požadované pro terapeutické léčení trombózy, čímž je možno vyloučit komplikace jako je náchylnost ke krvácení, toxicita a obecné vedlejší účinky vysokých dávek protidestičkových činidel.

9

9 • 99 9 9

Příklady provedení vynálezu

Příprava 1

Příprava lidského proteinu C

Rekombinantní lidský protein C (r-hPC) byl získán v lidských ledvinových buňkách 293 způsoby dobře známými odborníkům v oboru, jako jsou způsoby, které popsal Yan, U.S. patent č. 4,981,952, který je zde ve své celistvosti zahrnut jako reference. Sekvence genu lidského proteinu C byla objevena a nárokována v Bang a kol., U.S. patent č. 4,775,624, který je zde ve své celistvosti zahrnut jako reference. Plasmid použitý pro expresi lidského proteinu C v buňkách 293 byl plasmid pLPC, který byl popsán v Bang a kol., U.S. patent č. 4,992,373, který je zde ve své celistvosti zahrnut jako reference. Konstrukce plasmidu pLPC byla také popsána v Evropské patentové publikaci č. 0 445 939 a v Grinnell a kol., 1987, Bio/Technology 5:11891192, který jsou zde ve své celistvosti zahrnuty jako reference. Stručně řečeno byl plasmid transfektován do buněk 293, potom byly identifikovány stabilní transformanty, které byly pěstovány na médiu prostém séra. Po ukončení fermentace bylo médium prosté buněk získáno mikrofiltrací.

Lidský protein C byl z kultivační tekutiny separován způsobem, který je úpravou technik, které popsal Yan, U.S. patent č. 4,981,952, který je zde ve své celistvosti zahrnut jako reference. Čisté médium bylo upraveno na 4 mM v EDTA před absorbcí v aniontoměničové pryskyřici (East12

9 99 99 99 99

9 99 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

9999 999 99 9999 99 99

Flow Q, Pharmacia). Po promývání 4 objemy kolony pufru 20 mM Tris, 200 mM NaCl, pH 7,4 a 2 objemy kolony 20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,4 byl vázaný rekombinantní zymogen lidského proteinu C vymýván pomocí 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,4. Vymytý protein měl po vymývání stupeň čistoty vyšší než 95%, jak bylo určeno elektroforézou na SDS-polyakrylamidovém gelu.

Další čištění proteinu bylo dosaženo úpravou proteinu na 3 M v NaCl následovanou adsorpcí do hydrofobní interakční pryskyřice (Toyopearl Phenyl 650 M, TosoHaas) ekvilibrované v 20 mM Tris, 3 M NaCl, 10 mM CaCl₂, pH 7,4. Po promývání 2 objemy kolony ekvilibračního pufru bez CaCl₂ byl rekombinantní lidský protein C vymýván pomocí 20 mM Tris, pH 7,4.

Vymytý protein byl připraven pro aktivaci odstraněním residuálního vápníku. Rekombinantní lidský protein C byl ponechán přecházet přes kovovou afinitní kolonu (Chelex100, Bio-Rad) pro odstranění vápníku a znovu vázán na aniontoměnič (Fast Flow Q, Pharmacia). Obě tyto kolony byly umístěny za sebou a ekvilibrovány v 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 6,5. Při následujícím vložení proteinu byla kolona Chelex-100 promývána jedním objemem kolony téhož pufru jako předtím s jejím odpojením ze série. Aniontoměničová kolona byla promývána 3 objemy kolony ekvilibračního pufru před vymýváním proteinu 0,4 M NaCl, 20 mM Tris-acetát, pH 6,5. Proteinové koncentrace roztoků rekombinantního lidského proteinu C a rekombinantního aktivovaného proteinu C byly měřeny pomocí UV 280 nm extinkce E°'^1% = 1,81 respektive 1,85.

«· • · · • ♦ «9*· ··· • « · »· ·«·» ♦ · «· • * * · • · · β • · · · • · · · ·· 99

Příprava 2

Aktivace rekombinantního lidského proteinu C

Hovězí thrombin byl kopulován do aktivované CH-Sepharose 4B (Pharmacia) v přítomnosti 50 mM HEPES, pH 7,5 při teplotě 4 °C. Kopulační reakce byla provedena na pryskyřici předtím vložené do kolona použitím přibližně 5000 jednotek thrombinu na 1 ml pryskyřice. Thrombinový roztok byl ponechán obíhat kolonou po dobu přibližně 3 hodiny před přidáním MEA na koncentraci 0,6 ml/1 obíhajícího roztoku. Roztok obsahující MEA byl ponechán obíhat po dobu dalších 10-12 hodin pro zajištění úplného blokování nezreagovaných aminů na pryskyřici. Po ukončení blokování byla s thrombinem kopulovaná pryskyřice promývána 10 objemy kolony 1 M NaCl, 20 mM Tris, pH 6,5 pro odstranění veškerého nespecificky vázaného proteinu a byla použita v aktivačních reakcích po ekvilibraci v aktivačním pufru.

Čistý r-hPC byl upraven na 5 mM v EDTA (pro chelaci veškerého reziduálního vápníku) a zředěn na koncentraci 2 mg/ml pomocí 20 mM Tris, pH 7,4 nebo 20 mM Tris-acetát, pH 6,5. Tento materiál byl ponechán procházet thrombinovou kolonou ekvilibrovanou při teplotě 37 °C pomocí 50 mM NaCl a buď 20 mM Tris pH 7,4 nebo 20 mM Tris-acetát pH 6,5. Velikost průtoku byla upravena aby umožnila přibližně 20 minut kontaktu mezi r-hPC a thrombinovou pryskyřicí. Vytékající složka byla shromážděna a okamžitě testována na amidolytickou aktivitu. Pokud tento materiál neměl specifickou (amidolytickou) aktivitu ve srovnání se • ·· · ·· * · * · • · · · · II ϊ » · · · · · · • φ ·#···· « · · · · · · •· ···· ·· ·· standardem aPC, byl recyklován do thrombinové kolony pro úplné ukončení aktivace r-hPC.

Tento postup byl následován zředěním materiálu 1:1 pomocí výše popsaného 20 mM pufru s pH v rozmezí 7,4 až 6,0 (nižší pH je přitom výhodnější pro zabránění autodegradaci) pro udržení aPC při nižších koncentracích před provedením dalšího kroku zpracování.

Odstranění vytouženého thrombinu z aPC materiálu bylo dosazeno vazbou aPC na aniontoměničovou pryskyřici (Fast Flow Q, Pharmacia) ekvilibrovanou v aktivačním pufru (buď 20 mM Tris, pH 7,4 nebo výhodně 20 mM Tris-acetát, pH 6,5) s 150 mM NaCl. Thrombin procházel kolona a vymýval během promývání 2-6 objemy kolony 20 mM ekvilibračního pufru. Vázaný aPC byl vymýván krokovým gradientem použitím 0,4 M NaCl buď v 5 mM Tris-acetát, pH 6,5 nebo v 20 mM Tris, pH 7,4. Promývání kolony vyššími objemy usnadňovalo úplnější odstranění dodekapeptidu. Materiál vymytý z této kolony byl uchováván buď v zmrazeném roztoku (-20 °C) nebo jako lyofilizovaný prášek.

Amidolytická aktivita (A(J) aPC byla určena uvolňováním pnitroanalinu ze syntetického substrátu H-D-Phe-Pip-Arg-pnitroanilid (S-2238) zakoupeného od společnosti Kabi Vitrum použitím spektrofotometru Beckman DU-7400 s diodovým polem. Jedna jednotka aktivovaného proteinu C byla definována jako množství enzymu požadovaného pro uvolnění 1 pmol pnitroanilinu za 1 minutu při teplotě 25 °C, pH 7,4, použitím extinkčního koeficientu pro p-nitroanilin při 405 nm o velikosti 9620 M”¹cm'¹.

• ·

Protikoagulační aktivita aktivovaného proteinu C byla určena měřením prodloužení doby srážení ve srážecím testu aktivované částečné tromboplastinové doby (APTT). Standardní křivka byla připravena ve zředěném pufru (1 mg/ml BSA radioimunologického stupně, 20 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,02% NaN3) s koncentracemi proteinu C v rozmezí 125-1000 ng/ml, kdy vzorky byly připraveny z několika zředění v tomto rozmezí koncentrací. Do každé vzorkové zkumavky bylo přidáno 50 μΐ studené koňské plasmy a 50 μΐ rekonstituovaného reagentů pro test aktivované částečné tromboplastinové doby (APTT Reagent, Sigma) a byla provedena inkubace při teplotě 37 °C po dobu 5 minut. Po inkubaci bylo do každé zkumavky přidáno 50 μΐ odpovídajících vzorků nebo standardů. Pufr použitý pro ředění byl použit namísto vzorků nebo standardů pro určení základní doby srážení. Časovač fibrometru (CoA Screener Hemostasis Analyzer, American Labor) byl nastartován po přidání 50 μΐ 37 °C 30 mM CaCl2 do každého vzorku nebo standardu. Koncentrace aktivovaného proteinu C ve vzorcích byla vypočtena z lineární regresní rovnice standardní křivky. Doby srážení, které jsou zde uvedeny jsou průměry nejméně tří opakování, v to počítaje i vzorky pro standardní křivky.

Příprava 3

Přípravky s aktivovaným proteinem C • · • · ·· ·«·*

Stabilní lyofilizovaný přípravek s obsahem aktivovaného proteinu C byl připraven způsobem, který zahrnuje lyofilizaci roztoku obsahujícího přibližně 2,5 mg/ml aktivovaného proteinu C, přibližně 15 mg/ml sacharózy, přibližně 20 mg/ml NaCl, a pufr z citrátu sodného, který má pH větší než 5,5 ale menší než 6,5. Příprava dalšího stabilního lyofilizovaného přípravku s obsahem aktivovaného proteinu C zahrnuje lyofilizaci roztoku obsahujícího přibližně 5 mg/ml aktivovaného proteinu C, přibližně 30 mg/ml sacharózy, přibližně 38 mg/ml NaCl a pufr z citrátu sodného, který má pH větší než 5,5 ale menší než 6,5.

Hmotnostní poměr aPC:sůl:objemové činidlo je důležitým faktorem pro získání přípravku vhodného pro sušení vymrazováním. Tento poměr se mění v závislosti na koncentraci aPC, volbě soli a její koncentraci a na volbě objemového činidla a jeho koncentraci. Výhodný je poměr přibližně 1 díl aktivovaného proteinu C na přibližně 7,6 dílů soli na přibližně 6 dílů objemového činidla.

Přípravek ve formě jednotkové dávky aktivovaného proteinu C, vhodný pro podávání nepřetržitou infúzí byl připraven smícháním aktivovaného proteinu C, NaCl, sacharózy a pufru z citrátu sodného. Po smíchání byly 4 ml roztoku přeneseny do nádobky pro jednotkovou dávku a lyofilizovány. Nádobka pro jednotkovou dávku, obsahující od přibližně 5 mg do přibližně 20 mg aktivovaného proteinu C, vhodného pro podávání dávky od přibližně 0,01 mg/kg/hod do přibližně 0,05 mg/kg/hod pacientovi, který jej potřebuje, byla uzavřena a uchovávána do použití.

• · • 4 9 4

4 9 4

9 4 9

9 9 9 • 9 «β ί

Příklad 1

Morčecí AV zkratový model trombózy

Jelikož byla dokázána klinická účinnost inhibice destiček a aPC hraje kritickou roli při řízení hemostázy, byla zkoumána možná synergie mezi aPC a ASA v morčecím arteriálním/žilním (AV) zkratovém modelu trombózy. V tomto modelu trombózy bylo dokázáno, že aPC je účinné protitrombotické činidlo, které způsobuje dávkově závislou inhibici vytváření trombů.

Pro prozkoumání účinku aPC a aspirinu byla morčata (přibližně 500 g) anestetiziována pomocí 20 mg/kg Rompunu a 125 mg/kg Ketasetu a byl jim zaveden zkrat, spojující pravou karotidu a levou jugulární cévu. Zkrat obsahoval bavlněné vlákno, které stimulovalo vytváření trombů. aPC byl podáván pro inhibici vytváření trombů v jednorázovém plus infúzním dávkovém režimu (0,5 mg/kg jednorázově plus 3 mg/kg/hod). Kromě toho byl prováděn aPTT úplné krve před a v průběhu dávkového režimu a plasmové úrovně aPC byly měřeny imunozáchytným amidolytickým testem. Aspirin byl podáván v dávkách 10 mg/kg intravenózně a ve studiích s heparinem byla používána dávka 30 jednotek/kg jednorázově následovaný infúzí 40 jednotek/kg/hod. Jednorázové dávkování bylo prováděno kanylací levé jugulární cévy a vzorky krve byly získávány kanylací pravé jugulární cévy. Krevní vzorky byly odebírány v po sobě následujících okamžicích do 3,8 % Na₃ citrátu obsahujícího 300 mM Benzamidin HCI (9 objemy krve na 1 objem * · citrát/benzamidinového roztoku). Objem krve byl u zvířat nahrazen fyziologickým roztokem po každém odebrání. Plasma byla separována centrifugací a zmrazená při teplotě -20 °C. Plasmové koncentrace aPC byl určovány imunozáchytným amidolytickým testem.

Pro určení potenciální protitrombotické synergie mezi aPC a protidestičkovým činidlem ASA byla dávka ASA zvolena pro získání takřka úplné inhibice destičkové cyklooxygenázy, jak bylo měřeno inhibici uvolňování tromboxanu B2. Jak je ukázáno v Tabulce 1, dávka 10 mg/kg ASA účinně inhibuje destičkovou cyklooxygenázu, ale nemá významný účinek na hmotnost trombů. Použitím této dávky ASA, která nezpůsobovala žádný účinek na hmotnost trombů, byly prováděny experimenty ve spojení s aPC. Pro účely porovnání byl také prováděny testy s heparinem, standardním klinickým antikoagulantem. Jak je ukázáno v Tabulce 2, dávky aPC a heparinu byly zvoleny tak aby obě daly přibližně stejný protitrombotický účinek v daném modelu model (45,9 respektive 43,3% inhibice). Kombinace ASA a aPC vedla k významně větší inhibici vytváření trombů, než bylo pozorováno se samotným aPC (p=0,01). Na rozdíl od toho kombinace antikoagulantu heparinu s ASA nevykázala žádný významněji větší účinek, než který byl pozorován se samotným heparinem. Tato data dokazují synergii mezi protidestičkovými činidly a aPC a vyplývá z nich, že:

(a) u pacientů, léčených terapií buď s ASA nebo jiným protidestičkovým činidlem, bude dosaženo zvýšené účinnosti při kombinované terapii s aPC, a (b) terapeutické dávky aPC mohou být sníženy v přítomnosti protidestičkové terapie.

I « · · · * · · · • · · • · * · » · · ·· ···· ·· ·* « · « « • · · • · · · ¹ • · · • · «·

Tabulka 1

Účinek ASA na destičkové uvolňování Tromboxanu B2 a hmotnost trombů v morčecím AV-zkratovém modelu. Data ukazují, že i přes takřka maximální inhibici uvolňování Tromboxanu B2 nemá ASA žádný účinek na hmotnost trombů.

Léčba	Uvolňování Tromboxanu B2	Hmotnost trombů
Kontrolní (PBS)	638 ng/ml	38,3±1,1 mg (n=10)
ASA (10 mg/kg)	10 ng/ml	36,4±1,3 mg (n=8)

Tabulka 2

Protitrombotická synergie mezi aPC a ASA ale nikoli mezi heparinem a ASA.

k » · * » · · « •» ·

Léčba	Hmotnost trombů* (minus ASA)	Hmotnost trombů* (plus ASA)
Kontrolní	100±3	95±3
a PC	4 6±5	27±5 (p-0,01)
Heparin	4 3±5	39±6

* % kontrolní skupiny

Příklad 2

Účinek aPC a antagonistů Ilb/IIIa v morčecím AV zkratovém modelu trombózy

Pro určení účinků kombinované terapie používající aPC a representativního syntetického antagonistu Ilb/IIIa receptorů byl použit morčecí AV zkratový model trombózy, jak byl popsán v Příkladu 1. Byl používán trifluoracetát 2-([6-karboxy-n-hexyl] karboxamidyl)-5-amidino-benzofuranu, připravený způsobem, který popsali Fisher a kol., US patent č. 5,618,843. Kombinace aPC a Ilb/IIIa antagonisty vedla k významně větší inhibici vytváření trombů, než která byla pozorována se samotným aPC (Tabulka 3) . Tato data demonstrují synergii mezi aPC a syntetickým Ilb/IIIa antagonistou.

• 0 • 0 »0 0000

Tabulka 3

Protitrombotická synergie mezi aPC a Ilb/IIIa antagonistou.

Léčení	Hmotnost trombů*	Hmotnost trombů* (plus Ilb/IIIa antagonista)
(minus antagonista)	Ilb/IIIa
kontrolní	100+3	82±3
a PC	4 6±5	9±1

* % kontrolní skupiny

Příklad 3

Účinek aPC a abciximab při léčení trombotických poruch

Abiciximab (ReoPro®) je činidlo, které inhibuje destičkovou agregaci vazbou k Ilb/IIIa receptorům na buněčném povrchu destiček. Kombinovaná terapie s aPC a abciximabem je účinná pro inhibici trombózy regulací koagulačního procesu k nižším hodnotám a inhibicí destičkové agregace. Abciximab se podáván jako jednorázová injekce s dávkováním od přibližně 0,05 mg/kg do přibližně 1,0 mg/kg následovaná nepřetržitou infúzí od přibližně 0,025 gg/kg/min do přibližně 1 μg/kg/min po dobu 12 hodin. aPC se podává jako jednorázová injekce následovaná nepřetržitou infúzí nebo jako nepřetržitá infúze od přibližně 2 μg/kg/hod do přibližně 96 pg/kg/hod po dobu přibližně 24 do přibližně 144 hodin.

·

Tato kombinovaná terapie vede k synergii, která je bezpečnější a účinnější a redukuje dávky jak aPC, tak i abciximabu, které jsou nutné k léčbě trombotických poruch.

Zastupuje:

Dr. Otakar Švorčík • ·

-23JUDr. Otakar Švorčík advokát

120 00 Praha 2, Hálkova 2 «

·· ·,···

Claims

···· ·· Upravená strana PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použití aktivovaného proteinu C v kombinaci s protidestičkovým činidlem pro výrobu léčiva pro léčení trombotické poruchy u pacienta, který má jeho potřebu.

2. Použití podle nároku 1, vyznačující se tím, že trombotická porucha je akutní trombotická mrtvice, cévní trombóza, infarkt myokardu, nestabilní angína, ucpání následkem odtržení po provedené angioplastice nebo umístění stentu nebo trombóza následkem chirurgického zákroku na periferálním cévním systému.

3. Použití podle nároku 2, vyznačující se tím, že dávka aktivovaného proteinu C je od přibližně 2 pg/kg/hod do přibližně 96 μρ/^/Ιιοό.

4. Použití podle nároku 3, vyznačující se tím, že uvedené protidestičkové činidlo je zvoleno ze souboru, zahrnujícího aspirin (ASA), clopidogrel, abciximab, dipyridamol, ticlopidin, antagonisty receptoru Ilb/IIIa nebo jejich kombinace.

5. Použití aktivovaného proteinu C v kombinaci s protidestičkovým činidlem pro výrobu léčiva pro léčení trombotické poruchy u pacienta, který má jeho potřebu, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání uvedenému pacientovi farmaceuticky účinného množství protidestičkového činidla a aktivovaného proteinu C pro dosažení úrovně aktivovaného proteinu C v plasmě od 10 ·· 99 ·* ··

Upravená strana

6. Použití podle nároku 4, vyznačující se tím, že uvedená protidestičková činidla jsou aspirin (ASA) a clopidogrel.

7. Použití podle nároku 4, vyznačující se tím, že uvedená protidestičková činidla jsou aspirin (ASA) a ticlopidin.

8. Použití podle nároku 4, vyznačující se tím, že uvedená protidestičková činidla jsou aspirin (ASA) a dipyridamol.

S. Použití podle nároku 4, vyznačující se tím, že uvedené protidestičkové činidlo je aspirin (ASA) a abciximab.

9 · · • e ···· ng/ml do méně než 100 ng/ml.

10. Použití podle nároku 4, vyznačující se tím, že uvedené protidestičkové činidlo je aspirin (ASA) a antagonista receptoru Ilb/IIIa.