CZ437598A3 - Erythromyciny, způsoby jejich výroby, farmaceutická kompozice na jejich bázi, způsob léčení a použití - Google Patents

Abstract

Erythromyciny, zejména erythromyciny s novými substituentyRt /například cykloalkyl nebo cykloalkenyl se 3 až 6 atomy uhlíku/se připravují fermentací vhodných organismů za přítomnosti kyseliny obecného vzorce R1GQH. Přednostnímorganismemje Saccharopolyspora erythraea, kterápřednostně ohsahuje integrovaný plasmid schopný přímé syntézy požadovaných sloučenin.

Description

Vynález se týká nových polyketidů a způsobů jejich výroby. Zejména se vynález týká nových erythromycinů, které jsou užitečné jako antibakteriální a antiprotozoální činidla a při jiných aplikacích (například jako protirakovinová, činidla, antiatherosklerotická činidla a činidla snižující motilitu žaludku apod.) u savců, včetně člověka, jakož i u ryb a ptáků. Dále se vynález týká způsobu výroby těchto sloučenin, farmaceutických kompozic na jejich bázi a způsobů léčení bakteriálních a protozoálních infekcí u savců, ryb a ptáků.

Dosavadní stav techniky

Manipulace biosyntetických genů nebo jejich částí pro polyketidy, které mohou být odvozeny z různých shluků biosyntetických genů pro polyketidy, umožňují produkovat nové erythromyciny.

Polyketidy představují rozsáhlou a strukturně různorodou třídu přírodních látek, která zahrnuje řadu sloučenin, které vykazují antibiotické nebo jiné farmakologické vlastnosti. Takovými látkami jsou například erythromycin, tetracykliny, rapamycin, avermektin, polyetherové ionofory a FK506. Polyketidy jsou konkrétně hojně produkovány Streptomyces a příbuznými bakteriemi Actinomycetes. Syntetizují se opakovanou několikastupňovou kondenzací acylthioesterů způsobem, který je podobný biosyntéze mastných kyselin. Příčinou značné strukturální rozrůzněnosti mezi • ·

přírodními polyketidy je výběr (obvykle) acetátu nebo propionátu, jako startérových nebo extenderových jednotek; a různý stupeň přeměny β-ketoskupiny, který je pozorován po každé kondenzaci. Jako příklady procesních stupňů přeměny je možno uvést redukci na β-hydroxyacylskupinu, redukci následovanou dehydratací na 2-enoylskupinu, a úplnou redukci na nasycený acylthioester. Výsledek těchto procesních stupňů je z hlediska stereochemie rovněž specifický pro každý cyklus prodlužování řetězce. Biosyntéza polyketidů je zahajována skupinou enzymů tvořících řetězce, které jsou známé jako polyketid synthasy (PKS). V aktinomycetách byly popsány dvě třídy polyketid synthas (PKS).

Nové polyketidy podle vynálezu jsou syntetizovány PKS typu I, jejichž představiteli jsou PKS pro makrolidy erythromycin, avermektin a rapamycin (obr. 1). PKS sestávají z různých sad nebo modulů enzymů pro každý cyklus prodlužování polyketidového řetězce (obr. 2A) (Cortes, J. et al., Nátuře 1990, 348; 176 až 178; Donadio S. et al., Science (1991), 252; 675 až 679; MacNeil, D. J. et al., Gene (1992), 115:

119 až 125; Schwecke T. et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1995) 92: 7839 až 7843). Poznámka: Pojmem přírodní modul se zde označuje sada přilehlých domén, od genu α,β-ketoacylsynthasy (KS) k následujícímu genu acylového nosičového proteinu (ACP), který se zajištuje jedem cyklus prodlužování polyketidového řetězce. Pod pojmem kombinatorický modul se zde rozumí jakákoliv skupina přilehlých domén (nebo částí domén) od prvního místa v prvním přírodním modulu do druhého ekvivalentního místa v druhém přírodním modulu. První a druhé místo se budou obecně nacházet v jádrových doménách, které jsou přítomny ve všech modulech, tj. obě u ekvivalentních míst příslušných KS, AT (acyl transferasy), ACP domén nebo v linkerových oblastech mezi doménami.

Na obr. 2 je znázorněno uspořádání genů pro PKS produkující erythromycin, která je také známa jako 6-deoxy• · · · · · · ··· • · · · · ··· ·· ·· ·· erythronolid B synthasa, DEBS). DEBS polypeptidy jsou kódovány třemi otevřenými čtecími rámci. Geny jsou uspořádány do šesti opakujících se jednotek označených modulů. První otevřený čtecí rámec kóduje první multienzym nebo kazetu (DEBS1), která sestává ze tří modulů: vkládacího modulu (ery-load) a dvou prodlužovacích modulů (moduly 1 a 2). Vkládací modul zahrnuje acyl transferasu a acylový nosičový protein. To může být v rozporu s obr. 1 WO 93/13663 (viz dále). Ten znázorňuje, že 0RF1 se skládá pouze ze dvou modulů, z nichž první je ve skutečnosti jak vkládacím modulem, tak prvním prodlužovacím modulem.

rámcové deleci DNA kódující část ketoreduktasové domény modulu 5 v DEBS se ukázalo, že vede ke vzniku analog erythromycinu, 5,6-dideoxy-3-mykarosyl-5-oxoerythronolidu B, 5,6-dideoxy-5-oxoerythronolidu B a 5,6-dideoxy-6,6-epoxy-5-oxoerythronolidu B (Donadio S. et al., Science (1991) 252: 675 až 679). Podobně alterace zbytků aktivních míst v enoylreduktasové doméně modulu 4 v DEBS, když se DNA kódující PKS podrobí metodám genového inženýrství a zavede do Saccharopolyspora erythraea, vede k produkci 6,7-anhydroerythromycinu C (Donadio S et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1993) 90: 7119 až 7123).

V mezinárodní patentové přihlášce WO 93/13663, která je zde citována náhradou za přenesení celého jejího obsahu do tohoto textu, jsou popsány další typy genových manipulací genů DEBS, které jsou schopné produkovat alterované polyketidy. 0 řadě takových pokusů se však uvádí, že jsou neproduktivní (Hutchinson C. R. a Fujii I., Annu. Rev. Microbiol. (1995) 49: 201 až 238, str. 231).

Byla popsána úplná DNA sekvence genů ze Streptomvces hygroscopicus, která kóduje modulární PKS typu 1 řídící biosyntézu makrocyklického imunosupresivního polyketidu rapamycinu (Schwecke T., et al. (1995) Proč. Nati. Acad.

• · • · · · · • · · · · • · ··· · · · • · ·

Sci. USA 92: 7839 až 7843) (obr. 3). Tato sekvence DNA je uložena ve sbírce EMBL/Genbank Database pod přírůstkovým číslem X86780.

Přestože již byla identifikována celá řada terapeuticky významných polyketidů, přetrvává potřeba získat nové polyketidy, jejichž vlastnosti by byly posíleny, nebo které by vykazovaly zcela novou biologickou účinnost.

Složité polyketidy produkované modulárním typem I PKS jsou zváště hodnotné, jelikož zahrnují sloučeniny, o nichž je známo, že jsou užitečné jako anthelmintika, insekticidy, imunosupresiva, antifungální a/nebo antibakteriální činidla. Vzhledem ke své strukturní složitosti nelze takové nové polyketidy snadno získat totální chemickou syntézou nebo chemickými modifikacemi známých polyketidů. Jeden z aspektů tohoto vynálezu vychází z našeho poznatku, že genový soubor PKS typu I kóduje vkládací modul, který je následován prodlužovacími moduly. To je zvláště užitečné pro získání genového souboru hybridní PKS, kde vkládací modul je heterologní vzhledem k prodlužovacím modulům a je takový, že vede k polyketidů s alterovanou startétovou jednotkou. Tento koncept je vzhledem k dosavadnímu stavu techniky zcela neznámý, jelikož až dosud nebyla známa existence vkládacích modulů. WO 93/13663 se týká alterace genů pro PKS pomocí inaktivace jediné funkce (tj. jediného enzymu) nebo ovlivněním celého modulu delecí, insercí nebo nahrazením. Pojem vkládací soubor, jak se používá ve WO 93/13663, nepředstavuje modul.

Jestliže je vkládacím modulem modul, který přijímá řadu různých jednotek karboxylové kyseliny, potom se pro produkci řady různých polyketidů může použít hybridního genového souboru. Tak například hybridní genový soubor může využívat nukleových kyselin kódujících avr vkládací modul s ery extenderovými moduly. Vkládací modul může přijímat • ·

jednotky nepřírodních kyselin a jejich deriváty; zvláště užitečný je v tomto ohledu avr vkládací modul (Dutton et al. (1991). J. Antiobiot., 44: 357 až 365). Kromě toho lze stanovit specificitu přírodního vkládacího modulu pro nepřírodní startérové jednotky a využít výhody uvolněné specificity vkládacího modulu pro generování nových polyketidů. Dalším aspektem tohoto vynálezu je neočekávaná schopnost ery vkládacího modulu přijímat nepřírodní karboxylové kyseliny a jejich deriváty, čímž se u kmenů produkujících erythromycin, které obsahují pouze DEBS geny, dosáhne produkce nových erythromycinů. Je samozřejmě také možné provést alterace v polyketidovém produktu, zejména nahrazením prodlužovacího modulu modulem, který poskytuje ketidovou jednotku v jiném oxidačním stavu a/nebo o jiné stereochemii. Obecně se předpokládá, že stereochemie methylskupin v polyketidovém řetězci je dána acyltransferasou, což je však ve skutečnosti znak dalších domén PKS, a změnu je tedy možno provést pouze nahrazením těchto domén jednotlivě nebo nahrazením modulu. Nahrazením acyltransferasové domény nebo nahrazením celého modulu je možno zavádět nebo odstraňovat methylové a další substituenty.

V těchto souvislostech bude také odborníkům v tomto oboru zřejmé, že je možno kombinovat využití uvolněné substrátové specificity erythromycinového vkládacího modulu s nahrazením prodlužovacího modulu a substituci hybridního vkládacího modulu s nahrazením prodlužovacího modulu, jako mechanismu pro produkci široké palety nových erythromycinů. Předmětem vynálezu je tedy produkce nových erythromycinů netransformovanými organismy a dále také takové genové soubory, vektory obsahující takové genové soubory a transformované organismy, které je exprimují, za účelem produkce nových erythromycinů transformovanými organismy. Transformované organismy mohou obsahovat rekombinantní plasmidy, nebo plasmidy mohou integrovat. Plasmid s int sekvencí bude integrovat do specifického místa připojení (att) hostitel• · · ·

ského chromosomu. Transformované organimy mohou být schopné modifikovat počáteční produkty, například uskutečněním všech nebo některých biosyntetických modifikací, které jsou normální při produkci erythromycinů (viz obr. 2b). Je však možno využít takových mutantních organismů, které mají některé normální dráhy zablokovány, například za účelem produkce produktů bez jedné nebo více přírodních hydroxyskupinam nebo cukerných skupin, jak je to například popsáno ve WO 91/16334 nebo ve Weber et al. (1985) J. Bacteriol. 164: 425 až 433, které jsou zde citovány náhradou za přenesení celého jejich obsahu do tohoto textu. Alternativně lze využít organismů, v nichž jsou některé normální dráhy nadexprimovány, za účelem překonání možných stupňů, které by omezovaly rychlost produkce požadovného produktu, viz například WO 97/06266, která je zde citována náhradou za přenesení celého jejího obsahu do tohoto textu.

Tento aspekt tohoto způsobu ve velké míře souvisí s působením na genové moduly PKS, jako stavební bloky, kterých je možno použít pro sestavení enzymových systémů, a tedy nových erythromycinových produktů, požadovaného typu. To obvykle zahrnuje vyštěpení a sestavení modulů a multimodulových seskupení. Logická místa pro vytvoření a přerušení intermodulárních spojení se nacházejí ve vazebné oblasti mezi moduly. Může však být výhodné štěpení a spojování provádět přímo v doménách (tj. částech kódujících enzym), v blízkosti jejich krajů. DNA je zde mezi všemi modulárními PKS vysoce konzervovaná, což může napomáhat při konstrukci hybridů, které mohou být transkribovány. To může také napomoci k zachování vzdálenosti vazebných míst kódovaných enzymů, což může být důležité. Tak například při produkci hybridního genu nahrazením ery vkládacího modulu avr vkládájím modulem se spolu s ery modulem odstraní malé množství následující ketosynthasové (KS) domény. Počátek KS domény (v dobré vzdálenosti od aktivního místa) je vysoce ··» · · · · · · • · · · · · • · * · · · · · · • · · · ·· ·· ·· konzervován a poskytuje tedy vhodné místo sestřihu, jako alternativu k linkerové oblasti mezi vládací doménou a počátkem KS domény. Vyštěpený ery modul se poté nahradí avr vkládacím modulem.

Při substituci vkládacího modulu ve skutečnosti může být žádoucí nahradit nejen domény vkládacího modulu (obecně acyl transferasa (AT) a acylový nosičovy protein (ACP)), ale také KS v počátku následujícího prodlužovacího modulu. Vyštěpený vládací modul by obvykle poskytl propionátový startér a nahrazení má poskytnout jeden nebo více různých startérů. Propionát se však může posunovat do KS prodlužovacího modulu z propionátové skupiny v hostitelské buňce, což vede ke zředění požadovaných produktů. Tomu je možno výrazně zabránit substitucí prodlouženého vkládacího modulu včetně všech nebo většiny KS domén. (Místo sestřihu se může nacházet v koncové oblasti genu KS nebo na počátku v následujícím AT genu nebo linkerové oblasti mezi mezi nimi.)

Při nahrazování modulů neexistuje omezení na přírodní moduly. Tak například kombinatorický modul, který má být vyštěpen a/nebo nahrazen a/nebo insertován, může sahat od odpovídající domény dvou modulů přírodního typu, například od AT jednoho modulu do AT následujícího modulu, nebo od KS do KS. Místa sestřihu se budou nacházet v odpovídajících konservovaných marginálních oblastech nebo v linkerových oblastech. Kombinatorický modul také může být dvojitý nebo vícečetný, když se současně přidají 2 nebo více modulů.

Podle dalšího aspektu jsou předmětem vynálezu nové erythromyciny, které lze získat na základě výše popsaných aspektů. Takovými sloučeninami jsou:

·· · ·#·· » ·· ·· ·· ·· · · · · · * • · · · · · · • « · » ··· ··· • · ♦ · · ··· ·· ·· *♦ (i) analog erythromycinu (který je makrolidovou sloučeninou se 14-členným kruhem), kde atom uhlíku C-13 nese postranní řetězec odlišný od ethylskupiny, přičemž takovým postranním řetězcem je obecně lineární alkylskupina se 3 až 6 atomy uhlíku, rozvětvená alkylskupina se 3 až 8 atomy uhlíku, cykloalkylskupina nebo cykloalkenylskupina se vždy 3 až 8 atomy uhlíku (popřípadě substituovaná například jednou nebo více hydroxyskupinami, alkylskupinami nebo alkoxyskupinami vždy s 1 až 4 atomy uhlíku nebo atomy halogenu), nebo 3- až 6-členný heterocyklus obsahující kyslík nebo síru, který je nasycený nebo zcela nebo zčásti nenasycený a popřípadě substituovaný (například tak, jak je to uvedeno výše pro cykloalkylskupinu) , nebo R-j^ představuje fenylskupinu, která je popřípadě substituována alespoň jedním substituentem zvoleným ze souboru sestávajícího z alkylskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku a alkylthioskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, atomů halogenu, trifluormethylskupiny a kyanoskupiny; nebo R-^ může představovat skupinu obecného vzorce a

kde

X představuje kyslík, síru nebo skupinu -CH₂-, a, b, c, ad představuje každý nezávisle číslo 0 až 2, přičemž součet a+b+c+d<5.

Jako přednostní substituenty R na uhlíku C-13 je možno uvést zbytky karboxylátových jednotek RCOOR', které jsou použitelné jako substráty avr startérovým modulem nebo rapamyclnovými startérovými variantami. Přednostními substráty jsou *··· «· ·· * « · · e * · · ··« ··» » · ·· ·» karboxylové kyseliny obecného vzorce RCOOH. Jako alternativních substrátů je možno použít solí karboxylových kyselin, esterů karboxylových kyselin nebo amidů. Přednostními estery jsou thioestery N-acetylcystaminu, které mohou být avr startérovým modulem snadno využity jako substráty, jak jeto popsáno v Dutton et al. EP 0 350 187, který je zde citován náhradou za přenesení celého jeho obsahu do tohoto textu. Přednostními amidy jsou N-acylimidazoly. Jako jiné použitelné substráty lze uvést deriváty, které jsou oxidačními prekursory karboxylových kyselin. Vhodnými substráty by tedy například byly aminokyseliny obecného vzorce RCH(NH₂)COOH, glyoxylové kyseliny obecného vzorce RCOCOOH, deriváty methylaminu obecného vzorce RCH₂NH₂, deriváty methanolu obecného vzorce RCH₂OH, aldehydy obecného vzorce RCHO nebo substituované alkanové kyseliny obecného vzorce R(CH₂)_nCOOH, kde n představuje číslo 2, 4 nebo 6. Jako příklady přednostních substrátů je tedy možno uvést isobutyrát (R = isopropyl) a 2-methylbutyrát (R = 1-methylpropyl). Dalšími možnostmi jsou například n-butyrát, cyklopropylkarboxylát, cyklobutylkarboxylát, cyklopentylkarboxylát, cyklohexylkarboxylát, cykloheptylkarboxylát, cyklohexenylkarboxyláty, cykloheptenylkarboxyláty, obměny cyklických karboxylátů s methylovaným kruhem a jejich výše uvedené deriváty.

Analoga erythromycinu mohou odpovídat počátečnímu produktu PKS (6-deoxyerythronolidu) nebo produktu získanému po jednom nebo větším počtu stupňů normální biosyntézy. Tato biosyntéza zahrnuje, jak je znázorněno na obr. 2b hydroxylaci v poloze 6; O-glykosylaci v poloze 3; O-glykosylaci v poloze 5; hydroxylaci v poloze 12; a speficickou methylaci cukerných zbytků.

Jako neomezující příklady takových analog je možno uvést analoga odpovídající 6-deoxyerythronolidu B, erythro• ·

• · · · mycinu A a různým meziproduktům a alternativám, které jsou znázorněny na obr. 2b.

(ii) Analoga erythromycinu, která se od odpovídajících přírodní sloučeniny (obr. 2b) liší v oxidačním stavu jedné nebo více ketidových jednotek (jako alternativy přicházejí v úvahu skupiny -CO-, -CH(OH)-, =CH- a -CH₂-)·

Stereochemie jakékoliv jednotky -CH(OH)- je rovněž nezávisle volitelná.

(iii) Analoga erythromycinu, která se liší od odpovídajících přírodních sloučenin v absenci přírodní postranní methylskupiny. (To je dosažitelné za použití varianty AT). U normálních prodlužovacích modulů se za účelem získání nemethylovaných a methylovaných ketidových jednotek využívá jednotek se 2 nebo 3 atomy uhlíku. Nemethylované jednotky je možno získat, když jsou methylované jednotky přírodní (a naopak, u systémů, v nichž se vyskytují přírodní nemethylované jednotky). Pro ethylové substituenty je také možno poskytnout delší jednotky, například se 4 atomy uhlíku.

(iv) Analoga erythromycinu, která se od odpovídající přírodní sloučeniny odlišují ve stereochemii přírodní methylskupiny; a/nebo substituentech na kruhu odlišných od methylskupiny.

(v) Analoga erythromycinu, která vykazují dvě nebo více vlastností popsaných v odstavcích (i) až (iv).

(ví) Deriváty kterékoliv sloučeniny popsané v předchozích odstavcích, které prodělaly další zpracování ne-PKS enzymy, jako je například jedna nebo více hydroxylací, epoxidací, glykosylací a methylací.

• · • · · · · · • · · · · · • ·· ··· ··· • · · · • · · · ·»

Dále jsou popsány způsoby výroby nových erythromycinů podle vynálezu. Při nejjednodušším způsobu se nepřírodní startérové jednotky (přednostně, ale nejen, analoga karboxylových kyselin nepřirodních startérových jednotek) zavedou do netransformovaných organismů schopných produkovat erythromycin. V přednostním provedení se startérové jednotka zavede do fermentační půdy organismu produkujícího erythromycin, což je u transformovaných organismů schopných produkovat erythromycin efektivnější. Analog startérové jednotky je však také možno zavést do alternativních přípravků organismů produkujících erythromycin, například frakcionovaných nebo nefrakcionovaných přípravků s rozbitými buňkami. Toto provedení je rovněž stejně efektivní pro transformované organismy schopné produkovat erythromyciny. Při jiném způsobu se použije jednoho nebo více segmentů DNA kódující jednotlivé moduly nebo domény v heterologním PKS typu I (donorní PKS) pro nahrazení DNA kódující jednotlivé moduly nebo domény v genech DEBS organismu produkujícího erythromycin. Pro tuto donorní PKS jsou vhodné vkládací moduly a prodlužovací moduly získané z jakékoliv přírodní nebo nepřírodní PKS typu I. Zvláště vhodné pro tento účel však jsou komponenty PKS typu I pro biosyntézu erythromycinu, rapamycinu, avermektinu, tetronasinu, oleandomycinu, monensinu, amfotericinu a rifamycinu, u nichž je díky genové sekvenční analýze alespoň zčásti známa genová a modulární organizace. Jako příklady zvláště přednostních vkládacích modulů donorní PKS jsou vkládací moduly, které vykazují uvolněnou specificitu, jako je vkládací modul PKS produkující avermektin ze Streptomyces avermitilis; nebo vkládací moduly, které vykazují neobvyklou specificitu, jako jsou například vkládací moduly PKS produkujících rapamycin,

FK506 nebo askomycin, které všechny přirozeně přijímají shikimát-odvozenou startérovou jednotku. Neočekávaně bylo zjištěno, že jak netransformované, tak i geneticky modifikované organismy produkující erythromycin, když jsou • · · · • · · · · · • ···· · · · · « ··· · · · · • · · · · · ··· ··· • · · · · · • · · · · · « ·· «· · pěstovány za vhodných podmínek, produkují nepřírodní erythromyciny, a v případech, kdy je to vhodné, se mohou takové produkty podrobit stejnému zpracování jako přírodní erythromycin.

Při dalším způsobu podle vynálezu se plasmid obsahující DNA donorní PKS zavede do hostitelské buňky za podmínek, v nichž se plasmid homologní rekombinací integruje do DEBS genů na chromosomu kmene produkujícího erythromycin, za vzniku hybridní PKS. Donorní PKS DNA přednostně zahrnuje segment kódující vkládací modul tak, že se tento vkládací modul váže k DEBS genům na chromosomu. Takové hybridní PKS, když jsou kultivovány za vhodných, zde popsaných, podmínek produkují cenné a nové erythromycinové produkty. Konkrétně, když se vkládací modul DEBS genů nahradí vkládacím modulem PKS produkující avermektin (avr), nové erythromycinové produkty obsahují startérovou jednotku, která je typická pro produkty, které jsou jsou přítomny v avr PKS. Když se tedy vkládací modul ery PKS nahrací avr vkládacím modulem, zjistí se, že kmeny Saccharopolyspora erythraea obsahující takovou hybridní PKS produkují 14-členné makrolidy obsahující startérové jednotky, které jsou typicky přítomny v avr PKS.

To, že se neočekávaně zjistilo, že 14-členné makrolidové polyketidy produkované takovými rekombinantními buňkami S. erythraea zahrnují deriváty erythromycinu A, ukazuje, že bylo správně provedeno několid procesních stupňů, které jsou potřebné pro transformaci produktů hybridní PKS na nové a terapeuticky cenné deriváty erythromycinu A.

K dalšímu aspektu tohoto vynálezu vedlo neočekávané a překvapu jící zjištění, že transkripci jakýchkoliv hybridních erythromycinových genů je možno specificky zvyšovat, pokud se hybridní geny umístí pod kontrolu promotoru genu PKS typu II vázaného ke specifickému aktivátorovému genu pro tento promotor. Je zvláště pozoruhodné, že když se geneticky

- 13 9 9 9 99 99

9 9 · · ·· · · · 9 9 9 · • · · · ·· · · · · • 9 9 9 9

999 99 99 99 modifikované buňky obsahující hybridní geny pro erythromycin pod takovou kontrolou pěstují za podmínek vhodných pro produkci erythromycinu, významně se zvýší úroveň produkce nového erythromycinu. Taková specifická zvýšení výtěžků cenného erythromycinového produktu jsou také pozorována u přírodních erythromycinových PKS umístěných pod kontrolu promotoru PKS typu II a aktivátorového genu. V přednostním provedení jsou požadované geny přítomné na plasmidu odvozeném od SCP2* umístěny pod kontrolou dvousměrného promotoru actl odvozeného od aktinorhodinového biosyntetického genového shluku Streptomyces coelicolor a vektor také obsahuje strukturní gen kódující specifický aktivátorový protein Act II-orf 4. Rekombinantní plasmid se do Saccharopolyspora erythraea zavádí za podmínek, při nichž jsou zavedené geny PKS nebo geny PKS již přítomné v hostitelském kmenu exprimovány pod kontrolou promotoru actl.

Takové kmeny produkují požadovaný erythromycinový produkt a aktivátorový gen vyžaduje pouze přítomnost specifického promotoru, aby se posílila transkripční účinnost od promotoru. Překvapující je zejména to, že tyto aktivátory typu ActII-0rf4 nenáleží k poznané třídě proteinů vázajících se na DNA. Dalo by se tedy předpokládat, že pro aktivaci by bylo třeba, aby se v heterologním hostiteli, o němž není známo, že produkuje aktinorhodin nebo příbuzný isochromanchinonový pigment, vyskytovaly další proteiny nebo jiné kontrolní elementy. Rovněž je překvapivé a užitečné, že rekombinantní kmeny mohou produkovat erythromycinový produkt v množství více než desetkrát větším, než když jsou stejné PKS geny pod kontrolou přírodního promotoru, a specifický erythromycinový produkt je rovněž produkován v rostoucí kultuře, spíše než během přechodu od růstu do stacionární fáze. Takové erythromyciny jsou užitečné jako antibiotika a slouží mnoha dalším účelům v humánní i veterinární medicíně. Když je tedy buňkou modifikovanou metodami • · · · « · • · • · · · · · • · · ♦ · · • · · · · · · · · • · · · ·· ·ř ·· genetického inženýrství Saccharopolyspora erythraea, aktivátor a promotor jsou odvozeny od aktinorhodinového PKS genového shluku a actl/actll-0rf4-regulovaný eryPKS genový shluk je umístěn v chromosomu, načež následuje místně specifická integrace plasmidového vektoru o nízkém počtu kopií, může se pěstováním těchto buněk za vhodných podmínek vyrábět 14-členný makrolidový produkt ve více než desetinásobném celkovém výtěžku ve srovnání s kmenem, který pod takovou heterologní kontrolou není. Když jsou v takové geneticky modifikované buňce S. erythraea PKS geny pod touto heterologní kontrolou hybridními geny PKS typu I, jejichž vytvoření je zde popsáno, je možno ve srovnání se stejnými hybridními geny PKS typu I, které pod takovou kontrolou nejsou, získat více než desetinásobek hybridního polyketidového produktu. Konkrétně, když jsou hybridními geny PKS typu I geny ery PKS, v nichž je vládací modul nahrazen avr vkládacím modulem, zjistí se desetinásobné zvýšení celkového množství nových 14-členných makrolidů, které jsou produkovány geneticky modifikovanými buňkami, jestliže jsou pěstovány za vhodných podmínek popsaných v tomto textu.

Vhodné a přednostní způsoby pěstování netransformovaných a geneticky modifikovaných buněk produkujících erythromycin a vhodné a přednostní způsoby izolace, identifikace a praktického využití nových erythromycinů jsou podrobněji popsány v příkladech.

Předmětem vynálezu jsou sloučeniny obecného vzorce 1

• · kde

Rg představuje vodík nebo skupinu vzorce

R₁₀ představuje hydroxyskupinu nebo skupinu obecného vzorce

R^ představuje alfa-rozvětvenou alkyl-, alkenyl-, alkinyl-, alkoxyalkyl- nebo alkylthioalkylskupinu, z nichž každá obsahuje 3 až 8 atomů uhlíku a je popřípadě substituována jednou nebo více hydroxyskupinami; cykloalkylalkylskupinu s 5 až 8 atomy uhlíku, jejíž alkylová část je alfa-rozvětvená a obsahuje 2 až 5 atomů uhlíku; cykloalkylskupinu se až 8 atomy uhlíku nebo cykloalkenylskupinu s 5 až 8 atomy uhlíku, z nichž každá je popřípadě substituována methylskupinou nebo jednou nebo více hydroxyskupinami nebo jednou nebo více alkylskupinami s 1 až 4 atomy uhlíku nebo atomy halogenu; nebo tří- až šestičlenný heterocyklický kruh obsahující kyslík nebo síru, který může být nasycený nebo zcela nebo zčásti nenasycený a je popřípadě substituován jednou nebo více alkylskupinami s 1 až atomy uhlíku nebo atomy halogenu; nebo Rj před• · • · • · · · · · • · · · · · • · « ·· · ·· · ·· * · ·· stavuje fenylskupinu, která je popřípadě substituována alespoň jedním substituentem zvoleným ze souboru sestávajícího z alkylskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku a alkylthioskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, atomů halogenu, trifluormethylskupiny a kyanoskupiny; nebo R₃ může představovat skupinu obecného vzorce a

kde

X představuje kyslík, síru nebo skupinu -CH₂-;

a, b, c a d představuje každý nezávisle číslo 0 až 2, přičemž součet a + b + c + d je menší nebo roven 5;

R₂ představuje vodík nebo hydroxyskupinu;

R₃ až R₅ představuje každý nezávisle vodík nebo skupinu CH₃ nebo CH₂CH₃;

R₆ představuje vodík nebo hydroxyskupinu;

R₇ představuje vodík nebo skupinu CH₃ nebo CH₂CH₃;

R₈ představuje vodík nebo desosamin;

R_g představuje vodík nebo skupinu CH₃ nebo CH₂CH₃;

R₁₀ představuje hydroxyskupinu, mykarosu (R₁₃ představuje vodík) nebo kladinosu (R₁₃ představuje skupinu CH₃), • ·

R·^ představuje vodík; nebo ^R10 ^{= R}n ⁼ Kyslík; ^a

Rj2 představuje vodík nebo skupinu CH₃ nebo CH₂CH₃;

a jejich farmaceuticky vhodné soli.

Ve výše uvedené definici alkylskupiny se 3 nebo více atomy uhlíku mohou mít řetězec přímý nebo rozvětvený. Pod pojmem halogen se rozumí fluor, chlor, brom nebo jod. Pod pojmem alfa-rozvětvený se rozumí, že atom uhlíku připojený k uhlíkovému atomu v poloze C-13 je sekundárním uhlíkovým atomem vázaným ke dvěma dalším atomům uhlíku, přičemž zbývající část alkylového řetězce může být přímá nebo rozvětvená.

Přednost se dává sloučeninám obecného vzorce 1, kde R₃ až R₅, R₇, R₉ a R₁₂ představují skupinu CH₃ a Rj představuje isopropyl- nebo sek.butyl-, 2-buten-2-yl-, 2-penten-2-yl- nebo 4-methyl-2-penten-2-ylskupinu popřípadě substituovanou jednou nebo více hydroxyskupinami. Přednost se také dává sloučeninám obecného vzorce 1, kde R₃ až R₅, Ry, R_g a R₁₂ představují skupinu CH₃ a R-]_ představuje cykloalkylskupinu nebo cykloalkenylskupinu vždy se 3 až 6 atomy uhlíku, z nichž každá je popřípadě substituována jednou nebo více hydroxyskupinami nebo jednou nebo více alkylskupinami s 1 až 4 atomy uhlíku. Další skupinu přednostních sloučenin tvoří sloučeniny, kde Rj představuje pěti- nebo šestičlenný heterocyklický kruh obsahující kyslík nebo síru, zejména 3-thienylový nebo 3-furylový kruh, který je popřípadě substituován jednou nebo více hydroxyskupinami nebo jednou nebo více alkylskupinami s 1 až 4 atomy uhlíku nebo atomy halogenu. Jinou skupinu přednostních sloučenin tvoří sloučeniny, kde R^ představuje alkylthioalkylskupinu se 3 až 8 • · » ·

-18-.

• · · · ► * * · » * · · ·· · · · · atomy uhlíku, zejména 1-methylthioethylskupinu.

Podle dalšího provedení jsou předmětem vynálezu sloučeniny obecného vzorce 2 kde

(2) představuje vodík nebo skupinu vzorce

N(CH₃)₂

představuje hydroxyskupinu nebo skupinu obecného vzorce

Rn představuje vodík, alkylskupinu s 1 až 8 atomy uhlíku, alkenylskupinu se 2 až 8 atomů uhlíku, alkinylskupinu se 2 až 8 atomy uhlíku, alkoxyalkyl- nebo alkylthioalkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku v každé z alkylových a alkoxylových skupin, přičemž kterákoliv z uvedených alkylových, alkoxylových, alkenylových nebo alkinylových skupin je popřípadě substituována jednou nebo více hydroxyskupinami nebo jedním nebo více atomy halogenu; cykloalkylskupinu se 3 až 8 atomy uhlíku nebo cykloalkenylskupinu s 5 až 8 atomy uhlíku, z nichž každá je popřípadě substituována methylskupinou nebo jednou nebo více alkylskupinami s 1 až 4 atomy uhlíku nebo atomy halogenu; nebo tří- až šestičlenný heterocyklický kruh obsahující kyslík nebo síru, který může být nasycený nebo zcela nebo zčásti nenasycený a je popřípadě substituován jednou nebo více alkylskupinami s 1 až 4 atomy uhlíku nebo atomy halogenu; nebo skupinu SR₁₄, kde R₁₄ představuje alkylskupinu s 1 až 8 atomy uhlíku, alkenylskupinu se 2 až 8 atomy uhlíku, alkinylskupinu se 2 až 8 atomy uhlíku, cykloalkylskupinu se 3 až 8 atomy uhlíku, cykloalkenylskupinu s 5 až 8 atomy uhlíku, fenylskupinu nebo substituovanou fenylskupinu, kde substituentem je alkylskupina s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupina s 1 až 4 atomy uhlíku, halogen nebo tří- až šestičlenný heterocyklický kruh obsahující kyslík nebo síru, který může být nasycený nebo zcela nebo zčásti nenasycený a je popřípadě substituován jednou nebo více alkylskupinami s 1 až 4 atomy uhlíku nebo atomy halogenu;

R₂ představuje vodík nebo hydroxyskupinu;

R₃ až R₅ představuje každý nezávisle vodík nebo skupinu CH₃ nebo CH₂CH₃;

^R6 představuje vodík nebo hydroxyskupinu;

• · · · · ·· ······ • · ♦ · · · · · ··· ·♦ ··· ♦· ·« *·

R₇ představuje vodík nebo skupinu CH₃ nebo CH₂CH₃;

Rg představuje vodík nebo desosamin;

R₉ představuje vodík nebo skupinu CH₃ nebo CH₂CH₃;

R₁₀ představuje hydroxyskupinu, mykarosu (R₁₃ představuje vodík) nebo kladinosu (R₁₃ představuje skupinu CH₃),

R-L! představuje vodík; nebo ^R10 ^{= R}11 ~ kyslík'* ^a

R₁₂ představuje vodík nebo skupinu CH₃ nebo CH₂CH₃;

přičemž, když R₃ až R₅ představují CH₃, R_? představuje CH₃, Rg představuje CH₃ a R₁₂ představuje CH₃, potom Rj nepředstavuje vodík nebo alkylskupinu s 1 atomem uhlíku;

a jejich farmaceuticky vhodné soli.

Ve výše uvedené definici alkylskupiny se 3 nebo více atomy uhlíku mohou mít řetězec přímý nebo rozvětvený. Pod pojmem halogen se rozumí fluor, chlor, brom nebo jod.

Přednost se dává sloučeninám obecného vzorce 2, kde R₃ až R₅ představují CH₃, R₇ představuje CH₃, R_g představuje CH₃, R₁₂ představuje CH₃ a R^ představuje skupinu SR₁₄, kde R₁₄ představuje methylskupinu nebo ethylskupinu. Jinou skupinu přednostních sloučenin tvoří sloučeniny, kde Rj představuje methylskupinu, isopropylskupinu nebo sek.butylskupinu, z nichž každá je popřípadě substituována jednou nebo více hydroxyskupinami. Další skupinu přednostních sloučenin tvoří sloučeniny, kde R₃ představuje rozvětvenou alkylskupi21 “ · « ·· ·· ·« ·♦ · 4 · ♦ 4 4

4 4 4 · · 4

4 4 4 44 4 «44 • 4 4 · ·

444 44 4« ·· nu se 3 až 8 atomy uhlíku, která je substituována jednou nebo více hydroxyskupinami nebo jedním nebo více atomy halogenu, zejména l-(trifluormethyl)ethylskupinu.

Předmětem vynálezu je dále farmaceutická kompozice pro léčbu bakteriálních infekcí nebo protozoálních infekcí u savců, ryb nebo ptáků, která zahrnuje terapeuticky účinné množství sloučeniny obecného vzorce 1 nebo 2 nebo její farmaceuticky vhodné soli a farmaceuticky vhodný nosič.

Předmětem vynálezu je dále způsob léčení bakteriálních infekcí nebo protozoálních infekcí u savců, ryb nebo ptáků, při němž se takovému savci, rybě nebo ptákovi podává terapeuticky účinné množství sloučeniny obecného vzorce 1 nebo 2 nebo její farmaceuticky vhodné soli.

Pod pojmem léčení, jak se ho používá v tomto textu, pokud není uvedeno jinak, se rozumí léčení a prevence bakteriálních infekcí nebo protozoálních infekcí uvedených výše.

Pod pojmem bakteriální infekce a protozoální infekce se, pokud není uvedeno jinak, rozumí bakteriální infekce a protozoální infekce, které se vyskytují u savců, ryb a ptáků, jakož i choroby související s bakteriálními infekcemi a protozoálními infekcemi, které je možno léčit nebo jimž lze předcházet podáváním antibiotik, jako jsou sloučeniny podle vynálezu. Jako takové bakteriální infekce a protozoální infekce a choroby s nimi spojené lze uvést pneumonii, otitis media, sinusitis, bronchitis, tonsilitis a mastoiditis, které souvisejí s infekcemi Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis, Staphylococcus aureus nebo Peptostreptococcus spp; pharyngitis, rheumatickou horečku a glomerulonephritis související s infekcemi Streptococcus pyocrenes, streptokoky ····

- 22 • · • ·· ♦ · * « · · • · · · · • · · · • ··· ·· ·· · ··· skupiny C a G, Clostridium diptheriae nebo Actinobacillus haemolyticum; infekce dýchacího traktu spojené s infekcemi Mycoplasma pneumoniae, Leqionella pneumophila, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae nebo Chlamydia pneumoniae; nekomplikované infekce kůže a měkkých tkání, abscesy, osteomyelitis a horečka omladnic spojené s infekcemi Staphylococcus aureus, koagulasa pozitivními stafylokoky (tj. S. epidermidis. S. haemolyticus atd.), Steptococcus pyoqenes, Streptococcus aqalactiae, streptokoky skupin C-F (streptokoky s malými koloniemi), streptokoky viridans, Korynebacterium minutissimum, Clostridium spp. nebo Bartonella henselae; nekomplikované akutní infekce močového traktu související s infekcemi Staphylococcus saprophyticus nebo Enterococcus spp; urethritis a cervicitis; a pohlavně přenosné choroby spojené s infekcemi Chlamydia trachomatis, Heamophilus ducreyi, Treponema pallidům, Ureaplasma urealyticum nebo Neiserria qonorrheae; choroby z toxinů spojené s infekcemi S. aureus (otrava jídlem a syndrom toxického šoku) nebo streptokoky skupiny A, B a C; vředy spojené s infekcemi Helicobacter pylori; systemický febrilní syndrom spojený s infekcí Borrelia recurrentis; Lymeská nemoc spojená s infekcí Borrelia burqdorferi; conjunctivitis, keratitis a dacrocystitis pojené s infekcí Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, S. aureus, S. pneumoniae, S. pyogenes, H. influenzae nebo Listeria spp.; disseminovaná choroba z mykobakterií komplexu Mycobacterium avium spojená s infekcí Mycobacterium avium nebo Mycobacterium intracelulare; gastroenteritis spojená s infekcí

Campylobacter jejuni; střevní protozoální infekce spojené s infekcemi Cryptosporidium spp.; odontogenní infekce spojené s infekcí streptokoky viridans; persistentní kašel spojený s infekcí Bordetella pertussis; plynná snět spojená s infekcí Clostridium perfriqens nebo Bacteroides spp.; atherosklerosa spojená s infekcemi Helicobacter pylori nebo ···· • · · · · · * ·· · · · · · * • · ♦ · · · · · • · · · ·· ···*·· • · · · · ·

Chlamydia pneumoniae. Jako bakteriální infekce a protozoální infekce a choroby spojené s takovými infekcemi, které je možno léčit nebo jimž lze předcházet podáváním antibiotik, jako jsou sloučeniny podle vynálezu, je možno uvést respirační chorobu hovězího skotu spojenou s infekcí P. haem., P. multocida, Mycoplasma bovis nebo Bordetella spp.; enterickou chorobu hovězího skotu spojenou s infekcí E. coli nebo prvoky (tj. kokcidiemi, kryptosporidiemi atd.); mastitis mléčného skotu spojenou s infekcí Staph. aureus. Střep, uberis, Střep, aqalactiae, Střep, dysqalactiae, Klebsiella spp., Corynebacterium nebo Enterococcus spp.; respirační chorobu vepřů spojenou s infekcí A. pleuro., P. multocida nebo Mycoplasma spp.; enterickou chorobu vepřů spojenou s infekcí E. coli. Lawsonia intracellularis, Salmonella nebo Serpulina hyodyisinteriae; paznechtnice u hovězího skotu spojená s infekcí Fusobacterium spp. , metritis hovězího skotu spojenou s infekcí E. coli, prstovitá dermatitis (hairy warts) u hovězího skotu, spojené s infekcí Fusobacterium necrophorum nebo Bacteroides nodosus; zánět spojivek u hovězího skotu spojený s infekcí Moraxella bovis; zmetání u hovězího dobytka spojené s infekcí prvoky (tj. neosporium); infekce močového traktu u psů a koček spojené s infekcemi E. coli; infekce kůže a měkkých tkání u psů a koček spojené s infekcemi Staph. epidermidis. Staph. intermedius. koagulasa negativními Staph. nebo P. multocida; infekce zubů nebo tlamy u psů a koček spojené s infekcemi Alcaliqenes spp., Bacteroides spp., Clostridium spp., Enterobacter spp.. Eubacterium, Peptostreptococcus, Porphyromonas nebo Prevotella. Další bakteriální infekce a protozoální infekce a choroby spojené s takovými infekcemi, které je možno léčit nebo jimž lze předcházet způsoby podle vynálezu, lze nalézt v J. P.

Sanford et al., The Sanford Guide To Antimicrobial Therapy, 26. vydání (Antimicrobial Therapy, lne., 1996). Je také stále zřejmější, že sloučeniny podle vynálezu mohou být • ·· · *· · ···· · « · · • · «······ • · · · · · · ··· ··· ··· ··♦ · · ··· ·· ··· ·· ·« ·· výrazně užitečné při léčbě chorobných stavů (například rakoviny, AIDS a atherosklerosy), které normálně nejsou spojeny s bakteriálními nebo protozoálními infekcemi.

Sloučeniny obecného vzorce 1 nebo 2 je při léčbě bakteriálních infekcí nebo chorob spojených s bakteriálními infekcemi nebo rakoviny u savců, jako lidí, nebo ryb nebo ptáků možno podávat samotné nebo ve formě farmaceutických kompozic, které obsahují účinnou sloučeninu a farmaceuticky vhodné ředidlo nebo nosič. Takové kompozice lze podávat orálně, například ve formě tablet nebo tobolek, nebo parenterálně, jako například subkutánními a intramuskulárními injekcemi. Sloučeniny obecného vzorce 1 nebo 2 je rovněž možno podávat rektálně, jako ve formě čípků. Volba farmaceuticky vhodného nosiče bude záviset na zamýšleném způsobu podávání. Tak například v tabletách je jako farmaceuticky vhodného nosiče možno použít laktosu, citran sodný a soli kyseliny fosforečné spolu s rozvolňovadly (jako škrobem) a lubrikačními činidly (jako stearanem hořečnatým, natriumlaurylsulfátem a mastkem). V tobolkách se jako užitečných farmaceuticky vhodných nosičů používá laktosy a vysokomolekulárních polyethylenglykolů (například s molekulovou hmotnostní od 2000 do 4000). Za účelem parenterálního podávání je možno připravovat sterilní roztoky nebo suspenze, v nichž je farmaceuticky vhodným nosič vodný (jako je například voda, isotonický solný roztok nebo isotonická dextrosa) nebo nevodný (jako jsou například mastné oleje rostlinného původu, jako bavlníkový olej nebo arašírový olej nebo polyoly, jako glycerol nebo propylenglykol).

Při léčení in vivo bakteriálních infekcí nebo chorob spojených s bakteriálními infekcemi u savců nebo při léčení různých druhů rakoviny u lidí (zejména nemalobuněčné rakoviny plic) a jiných savců, jako psů, bude obvyklá denní orální nebo parenterální dávka kolísat v rozmezí od 0,1 do ·· · · • · · • · · • * · ··· ·· ·♦ ·· • * * · <· · · · ··· ··· ·* ··

100 mg/kg, přednostně od 0,5 do 25 mg/kg tělesné hmotnosti a lze ji podávat ve formě jediné dávky nebo několika dílčích dávek.

Pod pojmem farmaceuticky vhodná sůl se rozumí, pokud není uvedeno jinak, soli kyselých nebo bázických skupin, které se mohou vyskytovat ve sloučeninách podle vynálezu. Sloučeniny podle vynálezu, které mají bázickou povahu jsou schopny tvořit různé soli s různými anorganickými a organickými kyselinami. Pro výrobu farmaceuticky vhodných adičních solí bázických sloučenin podle vynálezu s kyselinami se používá kyselin, které tvoří netoxické adiční soli, tj. soli obsahující farmakologicky vhodné anionty. Jako příklady takových solí je možno uvést hydrochloridy, hydrobromidy, hydrojodidy, nitráty, sulfáty, hydrogensulfáty, fosfáty, hydrogenfosfáty, isonikotináty, acetáty, laktáty, salicyláty, citráty, hydrogencitráty, tartráty, pantothenáty, hydrogentartráty, askorbáty, sukcináty, maleáty, gentisináty, fumaráty, glukonáty, glukaronáty, sacharáty, formiáty, benzoáty, glutamáty, methansulfonáty, ethansufonáty, benzensulfonáty, p-toluensulfonáty a pamoáty (tj. 1,1'-methylenbis(2-hydroxy-3-naftoáty)).

Sloučeniny podle vynálezu, které mají kyselou povahu, jsou schopny tvořit soli s bázemi, které obsahují farmakologicky vhodné kationty. Jako příklady takových solí je možno uvést soli s alkalickými kovy a kovy alkalických zemin, zejména soli sloučenin podle vynálezu s vápníkem, hořčíkem, sodíkem a draslíkem.

Některé sloučeniny podle vynálezu mohou obsahovat centra asymetrie a vyskytují se tedy v různých enantiomerních a diastereomerních formách. Předmětem vynálezu je použití všech optických isomerů a stereoisomerů sloučenin • · • ·· • · · · · · • · « · · « · · ··· ··« • · · · ·· ·· ·· podle vynálezu a jejich směsí a všechny farmaceutické kompozice a způsoby léčení, při nichž se jich využívá nebo které je obsahují.

Do rozsahu vynálezu rovněž spadají sloučeniny podle vynálezu a jejich farmaceuticky vhodné soli, v nichž je jeden nebo více vodíkových, uhlíkových nebo jiných atomů nahrazeno jejich isotopy. Takové sloučeniny mohou být užitečné při výzkumu a jako diagnostické prostředky při farmakokinetických studiích a vazebných zkouškách.

Sloučeniny podle vynálezu se připravují fermentací netransfomovaného nebo transformovaného organismu, který je schopný produkovat erythromyciny. Jako neomezující příklady takových organismů je možno uvést Saccaropolyspora species. Streptomyces crriseoplanus, Nocardia sp. , Micromonospora sp. , Arthobacter sp. a Streptomyces antibioticus, nikoliv však S. coelicolor. Jako zvláště vhodné jsou v tomto směru netransformované a transformované kmeny Saccharopolvspora erythraea, například NRRL 2338, 18643, 21484. Zvláštní přednost se dává transformovaným kmenům, v nichž je erythromycinový vkládací modul nahrazen vkládacím modulem z organismu produkujícího avermektin, Streptomyces avermitilis. nebo organismu produkujícího rapamycin, Streptomyces hycrroscopicus. Přednostním způsobem výroby sloučenin podle tohoto vynálezu je fermentace vhodného organismu za přítomnosti vhodné karboxylové kyseliny obecného vzorce RjCOOH, kde R^ má význam uvedený výše u obecných vzorců 1 a 2, nebo její soli, esteru (zvláště přednostně thioesteru N-acetylcystaminu) nebo amidu nebo oxidačního prekursoru. Kyselina nebo její derivát se k fermentační směsi přidává buď v době inokulace nebo v intervalech během fermentace. Produkci sloučenin podle vynálezu je možno monitorovat tak, že se oddeberou vzorky fermentační směsi, které se extrahují organickým rozpouštědlem a přítomnost sloučenin podle vynálezu se stanoví ····

* · ♦ · · · · • · · · · » · · • · · · « · « • · · · ··· ·Φ« » · · · · ·· · «· · · ·« chromatograficky, například vysokotlakou kapalinovou chromatografií. Inkubace se provádí až do maximálního výtěžku sloučeniny obecného vzorce 1 nebo 2, obvykle po dobu 4 až 10 dnů. Karboxylová kyselina nebo její derivát se při každém přídavku přidává v množství 0,05 až 4,0 g/litr.

Nej lepších výtěžků sloučenin obecného vzorce 1 nebo 2 se obvykle dosáhne tak, že se kyselina nebo její derivát k fermentační směsi přidává postupně, například denně po dobu několika dnů. Jako fermentačního média je možno použít obvyklého komplexního média, které obsahuje asimilovatelné zdroje uhlíku, dusíku a stopových prvků.

Vhodné a přednostní způsoby pěstování netransformovaných a geneticky modifikovaných buněk produkujících erythromycin a vhodné a přednostní způsoby izolace, identifikace a praktická užitečnost sloučenin obecných vzorců 1 a 2 jsou úplněji popsány v příkladech.

Popis obr, na výkresech

Na obr. 1 jsou znázorněny chemické vzorce tří známých polyketidů.

Na obr. 2a je znázorněn diagram, který ukazuje funkci 6-deoxyerythronolid synthasy B (DEBS), PKS produkující 6-deoxyerythronolid B (6-DEB), prekursor erythromycinu A.

Na obr. 2b je znázorněna biosyntéza post-PKS erythromycinů zahrnující konverzi 6-DEB na erythromycin A.

Na obr. 3a a 3b jsou znázorněna schémata, která zobrazují konstrukci plasmidu pIGl.

Na obr. 4a, 4b a 4c jsou znázorněna schémata, která zobrazují konstrukci plasmidu pND30.

• · · ·

- 28 ·· · • · • · · ··

Na obr. 5 je znázorněno schéma zobranující konstrukci plasmidu pAVLD.

Na obr. 6 je znázorněna integrace pAVLD do genomu S. erythraea NRRL2338.

Na obr. 7 je schematicky znázorněna biosyntéza rapamycinu.

Na obr. 8 je schematicky znázorněna konstrukce plasmidu pMO6.

Na obr. 9. je schematicky znázorněna konstrukce plasmidu pCJR26.

Na obr. 10 je schematicky znázorněna konstrukce plasmidu pC-ATX.

Na obr. 11 je schematicky znázorněna konstrukce plasmidu pC-AT12.

Na obr. 12 je schematicky znázorněna konstrukce plasmidu pCJR49.

Následuje podrobnější popis vynálezu.

Velký rozsah startérových jednotek přijímaných avr vkládacím modulem byl souhrnně popsán v předcházejících studiích (například v evropských patentových přihláškách 0 214 731, 0 350 187 a 0 317 148, které jsou zde citovány náhradou za přenesení celého jejich obsahu do tohoto textu) V souvislosti s tím je třeba chápat, že se vynález neomezuj na konkrétní podrobnosti uváděných příkladů, které pouze slouží pro potvrzení účinnosti avr vkládacího modulu. Kromě toho se v příkladech používá konstruktu pIGl nebo pND30 • · ··♦ »· ··

• * • « ·· ·» ·· ·· • · « « * · · * čistě pro demonstraci schopnosti actl promotoru a jeho rozpoznávacího aktivátorového genu actll-orf4 zvyšovat expresi nových sloučenin podle vynálezu, je-li připojen k avr vkládacímu modulu. Z příkladů je také zřejmé, že netransformované kmeny Saccharopolyspora erythraea jsou snadno schopny vstřebávat zevně dodávané substráty za vzniku nových erythromycinových polyketidů. Odborníkům v tomto oboru bude také zřejmé, že konkrétní nové sloučeniny podle vynálezu je možno snadno produkovat tak, že se zvolí vhodný kmen produkující erythromycin (popřípadě se začleněním plasmidu pIGl nebo pND30 do požadovaného kmene) a fermentační směs se doplní vhodnou startérovou jednotkou. Deriváty 6-deoxyerythromycinu a 6,12-dideoxyerythromycinu podle vynálezu je tedy možno snadno získat za použití Saccharopolyspora erythraea NRRL 18643 nebo NRRL 21484, jak je to uvedené v US patentu č. 5 141 926 a WO 97/06266. Podobně lze za účelem získání požadovaných nových analog podle vynálezu možno použít kmenů Saccharopolyspora erythraea způsobem popsaným ve Weber et al., J. Bacteriol. 164: 425 až 433. Tak je například za účelem získání nových analog erythronolidu B možno použít kmene UW24 (popřípadě transformovaného pIGl nebo pND30).

UV spektra byla zaznamenána za použití diodového spektrofotometru Hewlett-Packard 1090M. Všechna spektra NMR, pokud není uvedeno jinak, byla měřena v CDC1₃ za použití spektrometru Varian Unity 500 MHz a polohy píků jsou vyjádřeny v dílech na milion dílů (ppm) směrem dolů od tetramethylsilanu. Tvary píků jsou označeny následovně: s = singlet, d = dublet, t = triplet, q = kvartet, m = multiplet a br = široký. Čísla atomů v NMR strukturách nepředstavují číslování podle standardní nomenklatury, ale spojují NMR data s konkrétním příkladem. Data HPLC-MS byla získána za použití kapalinového chromatografu Hewlett-Packard 1090M spojeného s hmotnostním spektrometrem VG Platform II vyba«··· ·*· »· ·· « · • · • · · • · • <· ·€ ·* • · · · • · · · ·«· ··« • a * · ·>· veným zdrojem APCI (postup A), nebo za použití kapalinového chromátografu Hewlett-Packard 1050 spojeného s hmotnostním spektrometrem VG Platform II vybaveným zdrojem APCI (postup B a postup C).

HPLC postup A:

Kolona

Průtok

Mobilní fáze

Beckman Ultrasphere 5 μιη ODS, mm x 25 cm 0,85 ml/min gradient: acetonitril : 0,05M octan amonný (28 : 72) až acetonitril :

: 0,05M octan amonný (50 : 50) během 22 minut, poté směs acetonitril :

: 0,05M octan amonný (50 : 50) po dobu 22 až 25 minut, poté návrat k původním podmínkám 25 až 30 minut

HPLC postup B:

Kolona

Průtok

Mobilní fáze

MetaChem Inertsil 5 μπι C8, mm x 150 mm

0,5 ml/min isokratická: methanol : 0,05M octan amonný s 0,1 % trifluoroctové kyseliny (60 : 40)

HPLC postup C:

Kolona

Průtok Mobilní fáze

Waters Symmetry 5 μπι C18

2,11 mm x 150 mm

0,22 ml/min gradient: acetoniril : 0,05M octan amonný (30 : 70) až acetonitril :

: 0,05M octan amonný (50 : 50) během 30 minut • « · · · · • · · · · · • ·· ··· ··· • · · · • · · · · ·

Používá se následujících médií a roztoků:

Sacharosové-sukcinátové definované médium sacharosa dusičnan draselný kyselina jantarová dihydrogenfosforečnan draselný heptahydrát síranu horečnatého (MgSO₄.7H₂O) chlorid zinečnatý (ZnCl₂) tetrahydrát chloridu manganatého (MnCl₂.4H₂O) dihydrát chloridu měďnatého (CuCl₂.2H₂O) chlorid kobaltnatý (CoCl₂) heptahydrát síranu železnatého (FeSO₄.7H₂O) dihydrát chloridu vápenatého (CaCl₂.2H₂O) voda milli-Q hydroxid draselný (KOH) g 10 g 2,36 g 2,7 g

1.2 g 10 mg

6.2 g 0,53 mg 0,55 mg 2,5 mg 38 mg do 1 litru do pH 6 až 6,4

Médium s vodou z vodovodu glukosa trypton kvasinkový extrakt EDTA voda z vodovodu hydroxid draselný g 5 g 2,5 g 36 mg do 1,0 litru do pH 7,1

Médium ERY-P dextrosa mouka Nutrisoy^^R^* síran amonný ((NH₄)₂SO₄) chlorid sodný (NaCl) uhličitan vápenatý (CaC0₃) pH nastaveno na 7,0 g/litr 30 g/litr g/litr g/litr g/litr • φ • · · · · · • · · · · • · · · · · • · · · ο· ·· · ·· * Mouka Nutrisoy(^R) byla získána od firmy British Arkády Group, Skerton Road, Manchester, Velká Británie.

Vynález je blíže objasněn v následujících příkladech provedení. Tyto příklady mají výhradně ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádném ohledu neomezují.

Příklad la

Konstrukce plasmidu pIGl

Plasmid pIGl sestává z plasmidu odvozeného od

Λ * t t

SCP2 , který obsahuje hybridní gen PKS typu I zahrnující avr vkládací modul namísto ery vkládacího modulu, první dva prodlužovací moduly ery PKS a thioesterasu ery PKS. Tento plasmid se zkonstruuje přes několik intermediárních plasmidů, dále popsaným postupem (viz obr. 3).

i) Konstrukce plasmidu pVE3.4

Plasmid pVE1446, který obsahuje část genů pro avermektin (avr) PKS se získá z E. coli kmene ATCC 68250 (MacNeil, D. J. et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 1994, 721:

123 až 132). Plasmid pVE1446 se štěpí BamHI a 7,6kbp fragment mezi sou- řadnicemi 32.15 a 3.40 (MacNeil D. J. et al.,,Ann. N. Y. Acad. Sci., 1994, 721: 123 až 132) se přečistí elektroforé- zou na gelu a recirkularizuje. Směs obsahující požadovaný plasmid pVE3.4 se izoluje po transformaci E. coli kmene TGlrecO (konstrukce: Dr. P. Oliver, Dept. Genetics, U. Cambridge; Kolodner, R. et al., J. Bacteriol, 1985, 163: 1060 až 1066; T. Gibson, Ph.D., diplomová práce, U. Cambridge, 1985).

• · · · • * • · · · · ·· · • · · « · · ·

Μ · · · ··· ··· • · · · · • ·· · · ·· ··

ii) Konstrukce plasmidu pNCO12

Plasmid pBK25 (Bevitt, D. J. et al., Eur. J. Biochem, 1992, 204: 39 až 49) se rozštěpí Ncol a konce 12kbp fragmentu se reparují a fragment se liguje do plasmidu pUC18, který byl linearizován Smál. Ligační směs se transformuje do E. coli TG1 recO a jednotlivé kolonie se zkontrolují na obsah plasmidu. Požadovaný plasmid pNCO12 se identifikuje restrikční analýzou.

iii) Konstrukce plasmidu pCRabc

Plasmid pCRabc (obr. 3) se zkonstruuje následujícím postupem. Provedou se tři oddělené PCR reakce: 1. Pro amplifikaci l,0kbp produktu z 100 ng templátu pNCO12 se použije 20 pmol každého ze syntetických oligonukleotidů Al (5'-CTC GTC GGT GGC TTT GCG-3') a A2 (5'-CCC GGG AAA AAC GAA GAC TAG TGG CGC GGA CGG CCG-3'). Konce PCR produktu se reparují a produkt se fosforyluje a klonuje do pUC18 štěpeného Smál, čímž se získá plasmid pCRa. 2. Pro amplifikaci l,5kbp produktu ze 100 ng pNC012 templátu se použije 20 pmol každého ze syntetických oligonukleotidů Cl (5'-CAC GCG CAG CGC GGC GGA-3') a C2 (5'-CGA ACC GCT AGC GGT CGT CGC GAT GGC CT-3')· Konce PCR produktu se reparují a produkt se fosforyluje a klonuje do pUC18 štěpeného Smál, čímž se získá plasmid pCRc. 3. Pro amplifikaci l,4kbp produktu z 100 ng pVE3.4 templátu se použije 20 pmol každého ze syntetických oligonukleotidů B1 (5'-GTG GCC CGG CCG TCC GCG CCA CTA GTC TTC GTT TTT-3') a B2 (5'-AAC AGC TAG CGG TTC GTC CGC CGC TGC CGT GCC-3'. Konce PCR produktu se reparují a produkt se fosforyluje a klonuje do pUC18 štěpeného Smál, čímž se získá plasmid pCRb.

Plasmid pCRa se štěpí HindlII a Spěl a l,0kbp insert se liguje s plasmidem pCRb, který byl dříve štěpen • · · · • · • · · · · · • · · e · · • ·· · · · ··· • · · · • · · «· · ·

HindlII a Spěl, čímž se získá plasmid pCRab. Plasmid pCRc se štěpí Nhel a EcoRI a l,5kbp insert se liguje s plasmidem pCRab, který byl dříve štěpen Nhel a EcoRI, čímž se získá plasmid pCRabc.

iv) Konstrukce plasmidu pNEWAVETE

Plasmid pCRabc se štěpí Mfel a Sfil a DNA fragment obsahující vkládací doménu avr PKS se purifikuje elektroforézou na gelu a liguje s plasmidem pNTEP2, který byl dříve štěpen Mfel a Sfil. Delší fragment se purifikuje elektroforézou na gelu. Ligační směs se transformuje do E. coli TG1 recO a jednotlivé kolonie se zkontrolují na obsah plasmidu. Požadovaný plasmid pNEWAVETE (13,7 kbp) se identifikuje restrikční analýzou.

(v) Konstrukce plasmidu pRM52

Plasmid pRM52 je derivátem plasmidu pRM5 (McDaniel R. et al., Science, 1993, 262: 1546 až 1550). pRM5 se nejprve linearizuje štěpením Ndel, reparují se konce a produkt se znovu liguje za vzniku pRM51. pRM51 se štěpí PacI a Nsil. Izoluje se velký Pacl-Nsil fragment, který se liguje na krátký dvouřetězcový oligonukleotidový linker obsahující místo Ndel, který byl zkonstruován anelací syntetických oligonukleotidů 5'-TAA GGA GGA CAC ATA TGC A-3' a 5'-TAA TTC CTC CTG TGT AT-3'. Ligační směs se transformuje do E. coli TGIrecO a izolované kolonie se zkoušejí na obsah plasmidu. Požadovaný plasmid (19,6 kbp) se identifikuje pomocí restrikční mapy a označí se jako pRM52.

vi) Konstrukce plasmidu pIGl

Plasmid pNEWAVETE se štěpí Ndel a Xbal a insert se purifikuje sedimentací v gradientu sacharosy. Purifikovaný • · · · • · · · · » • · · · · · • · » · · · · · · • · · · • · · · · ·

- 35 insert se liguje na plasmid pRM52 (19,6 kbp), který byl štěpen Ndel a Xbal. Vektor se purifikuje sedimentací v gradientu sacharosy. Ligační směsi se použije pro transformaci E. coli. Jednotlivé kolonie se zkoušejí na obsah plasmidu. Požadovaný plasmid pIGl se identifikuje restrikční analýzou.

Příklad lb

Konstrukce plasmidu pND30

Plasmid pND30 sestává z plasmidu odvozeného od SCP2*, který obsahuje hybridní gen PKS typu I zahrnující avr vkládací modul namísto ery vkládacího modulu, první dva prodlužovací moduly ery PKS a thioesterasu ery PKS. Tento plasmid se zkonstruuje přes několik intermediárních plasmidů, dále popsaným postupem (viz obr. 4).

i) Konstrukce rekombinantního vektoru pCJRlOl pCJRlOl (obr. 4) je shuttle plasmid, zkonstruovaný za účelem exprese genů PKS v aktinomycetes. Obsahuje replikon ColEl, který mu umožní replikovat se v E. coli, streptomycetový replikon SCP2* o malém počtu kopií (Bibb, M. J. a Hopwood, D. A., J. Gen. Microbiol (1981) 126: 427) a aktivátorový gen actll-orf4 ze shluku act, který aktivuje transkripci od promotoru act během přechodu od růstové ke stacionární fázi ve vegetativním myceliu. Zkonstruuje se následujícím postupem: přibližně 970bp DNA fragment z pMF1015 (který obsahuje aktivátorový gen actll orf4) (Fernandes-Moreno, M. A. et al., Cell (1991) 66: 769 až 780) se amplifikuje pomocí PCR za použití syntetických oligonukleotidů 5'-ACT AGT CCA CTG CCT CTC GGT AAA ATC CAG C-3' a 5'-CTT AAG AGG GGC TCC ACC GCG TTC ACG GAC-3', jako primerů, přičemž se rovněž zavedou lemující restrikční místa • « · * • · • · • · · * » · · « • · · · « · • « · · «· · ··· • · · · · ··· ·· ·· · ·

Spěl a AfIII. Tento fragment se klonuje do AatlI místa plasmidu pUC19 s reparovanými konci, čímž se získá plasmid pCJR18. Přibližně 215bp DNA fragment se amplifikuje z pMV400, který obsahuje dvojsměrný promotorový pár PactlII/Pactl (Parro, V. et al., Nucl. Acids Res. (1991)

19: 2623-2627), přičemž se jako primerů použije syntetických oligonukleotidů 5' -ACA TTC TCT ACG CCT AAG TGT TCC CCT CCC TGC CTC-3' a 5'-GTG ATG TAT GCT CAT ATG TGT CCT CCT TAA TTA ATC GAT GCG TTC GTC CGG TG-3', přičemž se také zavedou lemující Ndel a AfIII místa. PCR produkt se štěpí Ndel a AfIII a liguje s plasmidem pCJR18, který byl štěpen Ndel a AfIII, čímž se získá plasmid pCJR19. l,lkbp HindlII Sphl fragment obsahující gen tsr, který propůjčuje resistenci vůči thiostreptonu, se získá pomocí PCR z plasmidu pIJ922 (Lydiate, D. J. et al., Gene (1985), 35: 223 až 235), jako templátu, přičemž se jako primerů použije oligonukleotidů 5'-TGA ACA CCA AGC TTG CCA GAG AGC GAC GAC TTC CCC-3' a 5'-GAC AGA TTG CAT GCC CTT CGA GGA GTG CCC GCC CGG-3 ' , čímž se rovněž zavedou lemující místa HindlII a Sphl.

PCR produkt se štěpí HindlII a Sphl a liguje s plasmidem pCJR19 štěpeným HindlII a Sphl, čímž se získá plasmid pCJR24. Plasmid pIJ922 se štěpí BamHI a Sstl a fragment obsahující část loku fertility a počátek replikace (Lydiate D. J. et al., Gene (1985) 35: 223 až 235) se liguje do pUC19, který byl štěpen BamHI a Sstl, za vzniku bifunkčního plasmidu pCJR16 (14,7 kbp). Plasmid pCJR24 se štěpí Sáli a Sphl, dva větší fragmenty ze štěpení se purifikují elektroforézou na gelu a spojí při čtyřsložkové ligaci s plasmidem pCJR16, který byl štěpen Xhol a Sphl. Ligační směsi se použije pro transformaci Streptomyces lividans. Kolonie se selektují za přítomnosti thiostreptonu. Ukáže se, že jedna taková kolonie obsahuje požadovaný plasmid pCJRlOl (přibližně 12,4 kbp), který se identifikuje restrikční analýzou.

• · · · • · • · ♦ ·· • · · ·· · · ·· • * · · · · · • ·· · » ·· · · ♦ ii) Konstrukce plasmidu pCJR29

Konstrukce plasmidu pCJR29 je znázorněna na obr. 4. l,lkbp HindlII-Xhol fragment obsahující gen tsr, který propůjčuje resistenci vůči thiostroptonu, se získá PCR z plasmidu pIJ922, jako templátu, za použití oligonukleotidů 5'-TGA ACA CCA AGC TTG CCA GAG AGC GAC GAC TTC CCC-3' a 5'-GAC AGA TTC TCG AGC CTT CGA GGA GTG CCC GCC CGG-3', jako primerů, čímž se také zavedou lemující místa HindlII a Xhol. PCR produkt se štěpí HindlII a Xhol a liguje s plasmidem pCJR16, který byl štěpen HindlII a Xhol za vzniku plasmidu pCJR25. Plasmid pCJR25 se štěpí HindlII a Sphl a liguje s plasmidem pCJR19, který byl štěpen HindlII a Sphl, čímž se získá požadovaný plasmid pCJR29 (asi 12,4 kbp), identifikovaný svojí restrikční mapou. Plasmid pCJR29 se od plasmidu pCJRlOl liší orientací genu tsr, genu ActII-orf4 a promotoru actl/actlll vzhledem k SCP2 -odvozenému počátku replikace.

iii) Konstrukce plasmidu pND30

Plasmid pNEWAVETE se štěpí Ndel a Xbal a insert se purifikuje sedimentací v gradientu sacharosy. Purifikovaný insert se liguje do plasmidu pCJR29 (přibližně 12,4 kbp), který byl štěpen Ndel a Xbal a vektor se přečistí sedimentací v gradientu sacharosy. Ligační směsi se použije pro transformaci E. coli a jednotlivé kolonie se zkoušejí na obsah plasmidu. Požadovaný plasmid pND3O se identifikuje pomocí své restrikční mapy.

Příklad lc

Konstrukce plasmidu pCJR26

Nejprve se několikastupňovým postupem zkonstruuje plasmid pM06 (obr. 8).

• · · · • · • ·

- 38 i) Konstrukce plasmidu pMOl

Přibližně l,3kbp DNA segment genu eryAI S. erythraea od nukleotidu 1948 do nukleotidu 3273 eryAI (Donadio S. et al., Science (1991) 252, 675 až 679) se amplifikuje PCR za použití syntetických oligonukleotidů 5'-CAT GCT CGA GCT CTC CTG GGA AGT-3' a 5'-CAA CCC TGG CCA GGG AAG ACG AAG ACG G-3', jako primerů a plasmidu pNTEP2, jako templátu. PCR produkt se po reparaci konců liguje s plasmidem pUC18, který byl linearizován štěpením Smál a poté zpracován alkalickou fosfatasou. Ligační směsi se použije pro transformaci E. coli TG1 recO a jednotlivé kolonie se zkoušejí na obsah plasmidu. Požadovaný plasmid pMOl (3,9 kbp), v němž Stul místo lemující insert sousedí s HindlII místem v polylinkeru, se identifikuje pomocí restrikční mapy.

ii) Konstrukce plasmidu pM02

Přibližně 0,85kbp DNA segment genu rapA Streptomyces hygroscopicus od nukleotidu 1643 do nukleotidu 2486 rapA se PCR amplifikuje za použití následujících oligonukleotidů 5'-TTC CCT GGC CAG GGG TCG CAG CGT G-3' a 5'-CAC CTA GGA CCG CGG ACC ACT CGA C-3', jako primerů, a DNA z rekombinantního bakteriofágu lambda-ΙΕ (Schwecke T. et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1995) 92: 7839 až 7843), jako templátu. PCR produkt se po reparaci konců liguje s plasmidem pUC18, který byl linearizován štěpením Smál a poté ošetřen alkalickou fosfatasou. Ligační směsi se použije pro transformaci E. coli TG1 recO a jednotlivé kolonie se zkoušejí na obsah plasmidu. Požadovaný plasmid pMO2 (3,5 kbp) se identifikuje restrikční mapou.

• · 9 · · · • . 9 9 · · * • 9 9 · 9 9 99 9 • · · · «« · · ·· iii) Konstrukce plasmidu pMO3

Přibližně l,7kbp DNA segment genu eryAI S. erythraea od nukleotidu 4128 do nukleotidu 5928 eryAI se PCR amplifikuje za použití syntetických oligonukleotidů 5’-TGG CCA GGG AGT CGG TGC ACC TAG GCA-3' a 5'-GCC GAC AGC GAG TCG ACG CCG AGT T-3', jako primerů, a plasmidu pNTEP2, jako templátu. PCR produkt se po reparaci konců liguje s plasmidem pUC18, který byl linearizován štěpením Smál a poté zpracován alkalickou fosfatasou. Ligační směsi se použije pro transformaci E. coli TG1 recO a jednotlivé kolonie se zkoušejí na obsah plasmidu. Požadovaný plasmid pMO3 (4,4 kbp), v němž místa Balí a AvrlI sousedí s místem HindlII polylinkeru, se identifikuje pomocí restrikční mapy.

vi) Konstrukce plasmidu pMO4

Plasmid pMOl se štěpí HindlII a Balí a l,3kbp insert se liguje s plasmidem pMO3, který byl štěpen HindlII a Balí. Ligační směsi se použije pro transformaci E. coli TG1 recO a jednotlivé kolonie se zkoušejí na obsah plasmidu. Požadovaný plasmid pM04 (5,6 kbp) se identifikuje pomocí restrikční mapy.

v) Konstrukce plasmidu pM05

Plasmid pMO4 se štěpí Stul a 3,Okbp insert se liguje s plasmidem pNTEP2, který byl štěpen Stul a purifikován elektroforézou na gelu, za účelem odstranění 3,8kbp insertu. Ligační směs se transformuje do E. coli TG1 recO a jednotlivé kolonie se zkoušejí na obsah plasmidu. Plasmid pMO5 (12,8 kbp) se identifikuje pomocí restrikční mapy.

• · · · • · » · · · «»· ··· vi) Konstrukce plasmidu pMO6

Plasmid pMO2 se štěpí Balí a AvrlI a insert se liguje s plasmidem pMO5, který byl štěpen Balí a AvrlI. Ligační směsi se použije pro transformaci E. coli TG1 recO a jednotlivé kolonie se zkoušejí na obsah plasmidu. Požadovaný plasmid pMO6 (13,5 kbp) se identifikuje pomocí restrikční mapy.

vii) Konstrukce plasmidu pCJR26

Plasmid pCJR26 je plasmid založený na SCP2*, který zahrnuje gen PKS obsahující ery vkládací modul, první a druhý rozšiřovací modul ery PKS a ery thioesterásu pro terminaci řetězců, kde však byl DNA segment kódující methylmalonyl-CoA:ACP acyltransferasu v prvním rozširovacím modulu specificky nahrazen DNA kódující malonyl-CoA:ACP acyltransferasu modulu 2 rap PKS. Zkonstruuje se dále popsaným způsobem (viz obr. 9): plasmid pM06 se štěpí Ndel a Xbal a insert se liguje s plasmidem pCJR24, který byl štěpen Ndel a Xbal a přečištěn elektroforézou na gelu. Ligační směs se transformuje do E. coli TG1 recO a jednotlivé kolonie se zkoušejí na obsah plasmidu. Požadovaný plasmid pCJR26 se identifikuje pomocí restrikční mapy.

Příklad ld

Konstrukce S. erythraea JC2/pCJR26 a produkce TKL derivátů

Pro transformaci protoplastů S. erythraea JC2 se použije plasmidu pCJR26. Na médiu R2T20 obsahujícím 10 μg/ml thiostreptonu se vyselektují kolonie resistentní vůči thiostreptonu. Několik klonů se Southernovou hybridižací genomové DNA za použití genu DEBS1-TE značeného DIG zkouší na přítomnost pCJR26 integrovaného do chromosomu.

• · · · • · · · · · • · · · · · · · · • · · · · · · · 9 · · · · » · · · · · ·

9 9 9 9 9

999 99 ** ··

Klon s integrovanou kopií pCJR26 se pěstuje v médiu SSM, které obsahuje 5 μg/ml thiostreptonu po dobu 7 dní při 28 až 30 °C. Poté se živné médium přefiltruje, aby se odstranilo mycelium a pH filtrátu se nastaví na 3. Médium se extrahuje dvěma objemy ethylacetátu a spojené ethylacetátové extrakty se promyjí stejným objemem nasyceného chloridu sodného, vysuší bezvodým síranem sodným a za sníženého tlaku se odstraní ethylacetát. Získá se asi 500 mg surového produktu. Ukáže se, že produkty jsou δ-lakton (2S,3R,5R)-2-methyl-3,5-dihydroxy-N-hexanové kyseliny a 5-lakton (2S,3R,5R)-2-methyl-3,5-dihydroxy-n-heptanové kyseliny, které odpovídají následujícím vzorcům:

Příklad le

Konstrukce S. erythraea NRRL 2338/pCJR26 a jeho použití při produkci 14-členných makrolidů

Pro transformaci protoplastů S. erythraea NRRL2338 se použije přibližně 5 mg DNA pCJR49, čímž se získá kmen, který má plasmid integrován v chromosomu. Z několika kolonií se získá úplná DNA, která se analyzuje Southernovou hybridizací, aby se potvrdilo že se plasmid začlenil do modulu 2 EryAI za vzniku nové makrolidové biosyntetické dráhy. Došlo k dalším začleněním za vzniku kopií plasmidových sekvencí. S. erythraea NRRL 2338/pCJR49 se zaočkuje půda tryptic soy broth obsahující 5 mg/ml thiostreptonu a inkubuje 3 dny při 30°C. 100 ml této inokulační kultury se použije pro

4444

- 42* • ·· 44 ··

4 4 4 4 44 4

4 4 4 4 4 4 • 4 44 444 444

4 4 4 4

444 44 ·4 44 zaočkování 2 litrů sacharosového sukcinátového definovaného média obsahujícího 5 mg/ml thiostreptonu v 5 x 21itrových lahvích, z nichž každá obsahuje 500 ml média se 2 pružinami pro usnadnění dispergace, a třepe při frekvenci 300 min“¹.

Po dalším pětidenním růstu se kultury centrifugují a pH supernatantu se nastaví na 9. Supernatant se poté extrahuje třikrát stejným objemem ethylacetátu. Rozpouštědlo se odpaří a produkty se analyzují HPLC/MS. Identifikují se dva makrolidy, jako analoga erythromycinu:

Příklad lf

Konstrukce plasmidu pC-ATX

Plasmid pC-ATX je plasmidem na bázi SCP2*, který obsahuje geny PKS zahrnující ery vkládací modul, první a druhý prodlužovací modul ery PKS a ery thioesterasu pro terminaci řetězců, přičemž však DNA segment kódující methylmalonyl-CoA:ACP acyltransferasu v prvním prodlužovacím modulu je specificky nahrazen DNA kódující malonyl-CoA:ACP acyltransferasu z putativního genového shluku PKS typu I klonovaného ze Streptomyces cinnamonensis ATCC 14513 (který produkuje polyetherový polyketid monensin). Tento plasmid se zkonstruuje přes několik intermediárních plasmidů následujícím postupem (viz obr. 10).

• · · · ·* ·· • · · ·· · ♦ · · * • · ······ « · · · · · · ··· ··· · · · · · ··· ·· ·«· ·· ·· *· - 43 i) Isolace kosmidu pSCIN02

Z velikostně fraktionovaných 35 až 45kbp Sau3A fragmentů chromosomální DNA ligovaných na kosmidový vektor pWE15 linearizovaného BamHI a ošetřeného alkalickou fosfatasou se sestaví genomová knihovna Streptomyces cinnamonensis ATCC 14513 (organismus produkující monensin). Ligační směs se za použití balicích extraktů Gigapack zabalí do lambda částic a transfekuje do E. coli NMlblue. Přibližně 600 kolonií knihovny se pěstuje na povrchu nylonové membrány, lysuje a jejich DNA se pomocí ozáření paprsky UV křížově váže k membráně. Membrány se následně použije pro screening. Insert pMO8 obsahující ketosynthasovou doménu z modulu 2 DEBS se značí nahodilým primingem za přítomnosti ³³PaATP a použije jako sondy pro hybridizaci DNA. Sonda se hybridizuje 16 hodin při 68°C v 4,0xSSC pufru a následně vymývá po dobu 1 hodiny při 68°C v 0,8xSSC pufru. Izolují se tři pozitivní klony. DNA insertů všech tří klonů se sekvenuje od T3 a T7 primovacích míst přítomných ve vektoru pWE15. V DNA sekvenci od primovacího místa T7 je za použití klonu 2 (nazvaného jako pSCIN02), jako templátu objevena oblast homologní s doménou ketosynthasy typu I a malonyl-CoA:ACP transferasy. Částečným DNA sekvenováním malonyl-CoA:ACP acyltransferasové domény (nazvané jako ATX) se zjistí neobvyklý sekvenční motiv v putativní části domény rozpoznávacící substrát, která se podstatně liší od výše popsaných malonát- nebo methylmalonát-specifických CoA:ACP acyltransferas (Haydock, S. F. et al., FEBS (1995) 374: 246 až 248).

ii) Konstrukce plasmidu pMO38

Přibližně 0,9kbp segment DNA domény ATX se amplifikuje pomocí PCR za použití následujících oligonukleogidů, jako primerů: 5'-CTG GCC AGG GCG CGC AAT GGC CGA GCA T-3' a ···· • ·· · · 9 • 9 · · · • « · · · * « · · · · · • ft ··· 99 99 99

5'-CCC TAG GAG TCG CCG GCA GTC CAG CGC GGC GCC C-3' a kosmidu pSCLN02, jako templátu. PCR produkt se koncově reparuje a liguje s plasmidem pUC18, který byl linearizován štěpením Smál a ošetřen alkalickou fosfatasou. Ligační směsi se použije pro transformaci E. coli TGI recO. Jednotlivé kolonie se zkontrolují na obsah plasmidu. Požadovaný plasmid pMO38 (3,5 kbp) se identifikuje pomocí restrikční mapy.

iii) Konstrukce plasmidu pMO34

Plasmid pMO34 je derivát pM06 s polyklonovacím místem insertovaným za stop kodonem insertovaného genu D1-AT2. Plasmid pM06 se štěpí EcoRI a HindlII a aneluje se dvěma oligonukleotidy, které tvoří dvouřetězcovou oblast polyklonovacího místa: 5'-AAT TCA TAA CTA GTA GGA GGT CTG GCC ATC TAG A-3' a 5'-TCG AAG ATC TAC CGG TCT GGA GGA TGA TCA ATA C-3'. Směs se liguje a transformuje do E. coli TGI recO. Jednotlivé kolonie se zkontrolují na obsah plasmidu. Požadovaný plasmid pMO34 (13,5 kbp) se identifikuje restrikční mapou.

vi) Konstrukce plasmidu pMO35

Plasmid pMO35 je derivátem pMO34, který obsahuje gen TKLS-AT2 a translačně kopulovaný gen pro krotonyl-CoA-reduktasu ze Streptomvces collinus (Wallace et al., E. J. Biochem (1995) 233: 954 až 962). Gen pro krotonyl-CoA-reduktasu se vyštěpí z plasmidu pZYB3 (dar od prof. K. Reynoldse), jako fragment Ndel-BamHI, který se ošetří nukleasou z fazolu mungo, čímž se dosáhne otupení konců a liguje do pMO34, který byl štěpen Spěl, s konci podobně otupenými za použití nukleasy fazolu mungo. Ligační směsi se použije pro transformaci E. coli TGI recO. U jednotlivých kolonií se ověří obsah plasmidu. Požadovaný plasmid pMO35 • · « ·

- 45 'i* ” ·· ·· ·· ··· · · · · · • · · · · · · • · · · ··· · · · • · · · · ··· ·· ♦· (14,2 kbp) se správnou orientací genu pro krotonyl-CoA-ketoreduktasu se identifikuje pomocí restrikční mapy.

v) Konstrukce plasmidu pMO36

Plasmid pMO38 se štěpí Balí a AvrlI. Insert se liguje s plasmidem pMO35, který byl štěpen Balí a AvrlI. Ligační směsi se použije pro transformaci E. coli TG1 recO. U jednotlivých kolonií se ověří obsah plasmidu. Požadovaný plasmid pMO36 (13,5 kbp) se identifikuje pomocí restrikční mapy.

vi) Konstrukce plasmidu pC-ATX

Plasmid pMO36 se štěpí Ndel a Xbal. Insert se liguje s plasmidem pCJR29, který byl štěpen Ndel a Xbal a přečištěn gelovou elektroforézou. Ligační směs se transformuje do E. coli TG1 recO. U jednotlivých kolonií se ověří obsah plasmidu. Požadovaný plasmid pC-ATX se identifikuje pomocí restrikční mapy.

Příklad lg

Konstrukce S. erythraea JC2/pC-ATX a produkce derivátů TKL

Pro transformaci protoplastů S. erythraea JC2 se použije plasmidu pC-ATX. Na médiu R2T20 obsahujícím 10 μg/ml thiostreptonu se vyselektují kolonie resistentní vůči thiostreptonu. Několik klonů se zkouší na přítomnost pC-ATX integrovaného do chromosomu tak, že se jejich genomová knihovna podrobí Southernově hybridizaci s DNA kódující gen DEBS1-TE značenou DIG.

Klon s integrovanou kopií pC-ATX se vypěstuje v SSM médiu obsahujícím 5 μg/ml thiostreptonu a nechá růst po · · · · · · · • ·· · · · ♦ ♦ · • · · · * · · · • « · · · · ··· ··· dobu 7 dní při 28 až 30°C. Poté se živná půda přefiltruje, aby se odstranilo mycelium a pH filtrátu se nastaví na 3. Živná půda se extrahuje dvakrát dvěma objemy ethylacetátu. Spojené ethylacetátové extrakty se promyjí stejným objemem nasyceného chloridu sodného, vysuší bezvodým síranem sodným a za sníženého tlaku se z nich odstraní ethylacetát. Získá se 500 mg surového produktu. Produkty se charakterizují plynovou chromatografií, hmostnostní spektrometr! a NMR. Ukáže se, že se získá δ-lakton (2S,3R,4S,5R)-2-methyl-4-ethyl-3,5-dihydroxy-N-hexanové kyseliny a 5-lakton ( 2S , 3R, 4S, 5R)-2-methyl-4-ethyl-3,5-dihydroxy-N-heptanové kyseliny.

Příklad lh

Konstrukce S. erythraea NRRL 2338/pC-ATX a jeho použití při produkci 14-členných makrolidů

Pro transformaci protoplastů S. erythraea NRRL 2338 se použije přibližně 5 mg DNA pC-ATX, čímž se získá kmen s plasmidem integrovaným do chromosomu. Z několika kolonií se získá úplná DNA, která se analyzuje Southernovou hybridizací, aby se potvrdilo že se plasmid začlenil do modulu 2 EryAI za vzniku nové makrolidové biosyntetické dráhy. Došlo k dalším začlenění za vzniku kopií plasmidových sekvencí. S. erythraea NRRL 2338/pC-ATX se zaočkuje půda tryptic soy broth obsahující 5 mg/ml thiostreptonu a inkubuje 3 dny při 30°C. 100 ml této inokulační kultury se použije pro

99 99 • 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9

99 999 999

9 9 9 «9 99 inokulaci 2 litrů sacharosového sukcinátového definovaného média obsahujícího 5 mg/ml thiostreptonu v 5 x 21itrových lahvích, z nichž každá obsahuje 500 ml média se 2 pružinami pro usnadnění dispergace, a třepe při frekvenci 300 min^-1.

Po dalším pětidenním růstu se kultury centrifugují a pH supernatantu se nastaví na 9. Supernatant se poté extrahuje třikrát stejným objemem ethylacetátu. Rozpouštědlo se odpaří a produkty se analyzují HPLC/MS. Identifikují se dva makrolidy:

O

OH

OH

Příklad

Konstrukce plasmidu pC-AT12

Plasmid pC-AT12 je plasmidem na bázi SCP2*, který obsahuje gen PKS zahrnující ery vkládací modul, první a druhý prodlužovací modul ery PKS a ery terminační thioesterasu, přičemž však DNA segment kódující methylmalonyl-CoA:ACP acyltransferasu v druhém prodlužovacím modulu je specificky nahrazen DNA kódující malonyl-CoA:ACP acyltransferasu modulu 2 rap PKS. Plasmid se zkonstruuje přes několik intermediárních plasmidů následujícím postupem (viz obr. 11)

i) Konstrukce plasmidu pMO25

Přibližně l,0kbp DNA segment genu eryAI S. erythraea od nukleotidu 6696 do nukleotidu 7707 eryAI ···· ·· • · • ·

’·

··« · · * • · ·· ·· (Donadio S. et al., Science (1991) 252, 675 až 679) se amplifikuje PCR za použití syntetických oligonukleotidů 5'-GGC GGG TCC GGA GGT GTT CAC CGA GTT-3' a 5'-ACC TTG GCC AGG GAA GAC GAA CAC TGA-3', jako primerů a plasmidu pNTEp2, jako templátu. PCR produkt se po reparaci konců liguje s plasmidem pUC18, který byl linearizován štěpením Smál a poté ošetřen alkalickou fosfatasou. Ligační směsi se použije pro transformaci E. coli TGI recO a jednotlivé kolonie se zkoušejí na obsah plasmidu. Požadovaný plasmid pMO25 (3,6 kbp), v němž Stul místo lemující insert sousedí s HindlII místem v polylinkeru, se identifikuje pomocí restrikční mapy.

ii) Konstrukce plasmidu pMO26

Přibližně 0,6kbp DNA segment genu eryAI S.

erythraea od nukleotidu 8660 do nukleotidu 9258 eryAI se PCR amplifikuje za použití syntetických oligonukleotidů 5'-TCC TAG GCC GGG CCG GAC TGG TCG ACC TGC CGG GTT-3' a 5'-AAA CAC CGC GAC CTG GTC CTC CGA GC-3', jako primerů, a plasmidu pNTEP2, jako templátu. PCR produkt se po reparaci konců liguje s plasmidem pUC18, který byl linearizován štěpením Smál a poté ošetřen alkalickou fosfatasou. Ligační směsi se použije pro transformaci E. coli TGI recO a jednotlivé kolonie se zkoušejí na obsah plasmidu. Požadovaný plasmid pMO26 (3,2 kbp), v němž místo AvrlI sousedí s místem HindlII polylinkeru, se identifikuje pomocí restrikční mapy.

iii) Konstrukce plasmidu pMO27

Plasmid pMO25 se štěpí EcoRI a Balí a l,0kbp insert se liguje s plasmidem pMO2, který byl štěpen EcoRI a Balí. Ligační směsi se použije pro transformaci E. coli TGI recO. U jednotlivých kolonií se ověří obsah plasmidu.

«···

- 49 »· ·* ·· • »»*· · ·· · * · · · ···· • · · fc · · ··· ·<* • · · · « · · «· ··· ·· ··

Požadovaný plasmid pMO27 (4,4 kbp) se identifikuje pomocí restrikční mapy.

iv) Konstrukce plasmidu pMO32

Plasmid pMO26 se štěpí AvrlI a HindlII a 0,6kbp insert se liguje s plasmidem pMO27, který byl štěpen AvrlI a HindlII. Ligační směsi se použije pro transformaci E. coli TG1 recO. U jednotlivých kolonií se ověří obsah plasmidu. Požadovaný plasmid pMO32 (5,1 kbp) se identifikuje pomocí restrikční mapy.

v) Konstrukce plasmidu pMO33

Plasmid pMO32 se štěpí BspEI a SexAI a 2,7kbp insert se liguje s plasmidem pNTEP2, který byl štěpen dvěma stejnými enzymy a přečištěn gelovou elektroforézou, aby se odstranil 2,8kbp insert. Ligační směs se transformuje do E. coli TG1 recO. U jednotlivých kolonií se ověří obsah plasmidu. Plasmid pMO33 (12,8 kbp) se identifikuje pomocí restrikční mapy.

vi) Konstrukce plasmidu pC-AT12

Plasmid pMO33 se štěpí Ndel a Xbal a insert se liguje s plasmidem pCJR29, který byl štěpen Ndel a Xbal a přečištěn gelovou elektroforézou. Ligační směs se transformuje do E. coli TG1 recO. U jednotlivých kolonií se ověří obsah plasmidu. Požadovaný plasmid pC-AT12 se identifikuje pomocí restrikční mapy.

Příklad lj

Konstrukce S. erythraea JC2/pC-AT12 a produkce derivátů TKL ···· • re ·· · · • · · « · · • · · ··· ·<

♦» ·· • · · · • · · · ··· ·«· • · re r«

Pro transformaci protoplastů S. erythraea JC2 se použije plasmidu pC-AT12. Na médiu R2T20 obsahujícím 10 μ9^1 thiostreptonu se vyselektují kolonie resistentní vůči thiostreptonu.

Klon s integrovanou kopií pC-AT12 se vypěstuje v SSM médiu obsahujícím 5 μg/ml thiostreptonu a nechá růst po dobu 7 dní při 28 až 30°C. Poté se živná půda přefiltruje, aby se odstranilo mycelium a pH filtrátu se nastaví na

3. Živná půda se extrahuje dvakrát dvěma objemy ethylacetátu. Spojené ethylacetátové extrakty se promyjí stejným objemem nasyceného chloridu sodného, vysuší bezvodým síranem sodným a za sníženého tlaku se z nich odstraní ethylacetát. Získá se 500 mg surového produktu. Ukáže se, že se získá S-lakton (3R,4S,5R)-4-methyl-3,5-dihydroxy-N-hexanové kyseliny a δ-lakton (3R,4S,5R)-4-methyl-3,5-dihydroxy-N-heptanové kyseliny.

Příklad lk

Konstrukce S. erythraea NRRL 2338/pC-AT12 a jeho použití při produkci 14-členných makrolidů

Pro transformaci protoplastů S. erythraea NRRL 2338 se použije přibližně 5 μg DNA pC-AT12, čímž se získá kmen s plasmidem integrovaným do chromosomu. Z několika kolonií se získá úplná DNA, která se analyzuje Southernovou hybridizací, aby se potvrdilo že se plasmid začlenil 3' vzhledem ··· • ·

- 51··k modulu 2 EryAI za vzniku nové makrolidové biosyntetické dráhy. Došlo k dalším začleněním za vzniku kopií plasmidových sekvencí. S. erythraea NRRL 2338/pC-AT12 se inokuluje půda tryptic soy broth obsahující 5 mg/ml thiostreptonu a inkubuje 3 dny při 30°C. 100 ml této inokulační kultury se použije pro zaočkování 2 litrů sacharosového sukcinátového definovaného média obsahujícího 5 μg/ml thiostreptonu v 5 x 21itrových lahvích, z nichž každá obsahuje 500 ml média se 2 pružinami pro usnadnění dispergace, a třepe při frekvenci 300 min^-1. Po dalším pětidenním růstu se kultury centrifugují a pH supernatantu se nastaví na 9. Supernatant se poté extrahuje třikrát stejným objemem ethylacetátu. Rozpouštědlo se odpaří. Produkty se analyzují HPLC/MS a identifikují se dva makrolidy:

Příklad 11

Konstrukce plasmidu pCJR49 pCJR49 je plasmidem naloženým na plasmidu pCJR24 a obsahuje mutantní gen DEBS1-TE, který nemá žádnou ketoreduktasu v modulu 2 a AT doména v modulu 2 je nahrazena RAPS AT2, za účelem začlenění malonylového extenderu namísto methylmalonylového extenderu ve druhém modulu (obr. 12).

• ·

- 52·“ » · · · · • · · · * ·· ··· ··· • · · • · «· · · pMO3 2 se štěpí BspEI a SexAI. Fragment obsahující AT z RAP modulu 2 se klonuje do pUCl-O, který byl štěpen BspEI a SexAI, čímž se získá plasmid pCJR43.

pCJR43 se štěpí Ndel a Xbal a fragment obsahující mutantní gen DEBS1-TE se klonuje do pCJR24, který byl štěpen Ndel a Xbal, čímž se získá plasmid pCJR49. pCJR49 se potvrdí pomocí restrikční mapy.

Příklad lm

Konstrukce S. erythraea JC2/pCJR49 a produkce TKL derivátů

Pro transformaci protoplastů S, erythraea JC2 se použije přibližně 5 gg DNA pCJR49, čímž se získá kmen s plasmidem integrovaným do chromosomu. Z několika kolonií se získá úplná DNA, která se analyzuje Southernovou hybridizací, aby se potvrdilo že se plasmid začlenil do EryTE. S. erythraea JC2/pCJR49 se inokuluje půda tryptic soy broth obsahující 5 gg/ml thiostreptonu a inkubuje 3 dny při 30°C. 100 ml této inokulační kultury se použije pro zaočkování 2 litrů sacharosového sukcinátového definovaného média obsahujícího 5 μg/ml thiostreptonu v 5 x 2litrových lahvích, z nichž každá obsahuje 500 ml média se 2 pružinami pro usnadnění dispergace, a třepe při frekvenci 300 min“¹. Po dalším pětidenním růstu se kultury centrifugují a pH supernatantu se nastaví na 3. Supernatant se poté extrahuje třikrát stejným objemem ethylacetátu. Rozpouštědlo se odpaří. Produkty se rozpustí v methanolu a analyzují GCMS za použití zařízení Finnegan-MAT GCQ System. Tato analýza ukáže, že na rozdíl od syntetických standardů se zde vyskytují dva nové laktony. Těmito produkty jsou δ-lakton (4S,5R)-4-methyl-3-keto-5-hydroxyhexanové kyseliny a δ-lakton (4S,5R)-4-methyl-3-keto-5-hydroxyheptanové kyseliny, které odpovídají následujícím vzorcům:

• ·

Příklad ln

Konstrukce S. erythraea NRRL 2338/pCJR49 a jeho použití při produkci 14-členných makrolidů

Pro transformaci protoplastů S. erythraea NRRL 2338 se použije přibližně 5 μg DNA pCJR49, čímž se získá kmen s plasmidem integrovaným do chromosomu. Z několika kolonií se získá úplná DNA, která se analyzuje Southernovou hybridizací, aby se potvrdilo že se plasmid začlenil do modulu 2 EryAI za vzniku nové makrolidové biosyntetické dráhy. Došlo k dalším začleněním za vzniku kopií plasmidových sekvencí. S erythraea/pCJR49 se inokuluje půda tryptic soy broth obsahující 5 μg/ml thiostreptonu a inkubuje 3 dny při 30°C. 100 ml této inokulační kultury se použije pro zaočkování 2 litrů sacharosového sukcinátového definovaného média obsahujícího 5 μg/ml thiostreptonu v 5 x 2litrových lahvích, z nichž každá obsahuje 500 ml média se 2 pružinami pro usnadnění dispergace, a třepe při frekvenci 300 min^-1. Po dalším pětidenním růstu se kultury centrifugují a pH supernatantu se nastaví na 9. Supernatant se poté extrahuje třikrát stejným objemem ethylacetátu. Rozpouštědlo se odpaří. Produkty se analyzují HPLC/MS a identifikují se dva makrolidy:

Příklad 2

Konstrukce S. erythraea ERMD1 nesoucí hybridní gen pro PKS, v němž je avr vkládací didoménou nahrazena ery vkládací didoména S. erythraea NRRL 2338

i) Konstrukce plasmidu pAVLD

Plasmid pCRabc (viz příklad 1) se linearizuje pomocí BamHI a liguje k pXJ702 štěpenému BglII. Směs obsahuje požadovaný plasmid pAVLD (obr. 5). Liganční směs se transformuje do E. coli TG1 recO a u jednotlivých kolonií se ověří obsah plasmidu. Požadovaný plasmid pAVLD se identifikuje pomocí restrikční mapy (obr. 5) ii) Konstrukce S. erythrea ERMD1

Přibližně 5 až 10 μg pAVLD izolovaného z E. coli TGlrecO(pAVLD) se transformuje do S. erythraea NRRL 2338 a izolují se stabilní kolonie resistentní vůči thiostreptonu. Vybere se jedna z těchto kolonií a celá DNA se štěpí Pstl a analyzuje Southernovou hybridizací za použití insertu z plasmidu pCRc, který obsahuje fragment genu ery AI kódujícího ketosynthasovou doménu KS1, jako sondy. Analýza ukáže pozitivně hybridizační Pstl fragmenty o velikosti 8,5 kbp, • · · · • · • ·

4,8 kbp a 33 kbp, které indikují přítomnost dvou za sebou integrovaných kopií pAVLD (obr. 6).

Příklad 3

Příprava isopropyl- a sek.butylerythromycinů za použití S. erythraea ERMD1

Fermentace (50 ml) S. erythraea ERMD1 se provede za použití média s vodou z vodovodu. Po 4 dnech při 30°C se sklidí mycelium a použije se ho pro zaočkování 1,5 litru sacharosového-sukcinátového média obsahujícího thiostrepton (50 μg/ml). Po čtyřdenním růstu při 30°C se celá živná půda extrahuje dvakrát stejným objemem ethylacetátu.

Spojené extrakty se zkoncentrují za sníženého tlaku a dvakrát podrobí chromatografii na tenké vrstvě silikagelu za použití desek 20 x 20 cm a směsi chloroformu, methanolu a 0,88 amoniaku v poměru 8 : 2 : 0,01 (objemově). Produkty se dále rozdělí HPLC na PhaseSep C18, bázicky deaktivovaném sloupci s reversními fázemi S5 ODS (oktadecylsilan) 6 (4,6 mm x 25 cm), za použití směsi methanolu a 0,5% octanu amonného v poměru 70 : 30 (objemově), jako elučního činidla, při rychlosti průtoku 1 ml/min. Frakce eluované v rozmezí od 7 do 11 minut ze tří oddělených nástřiků se shromáždí a znovu nastříknou v deseti oddělených nástřicích. Analoga obsahující isopropylový postranní řetězec (R-^ v obecném vzorci 1 představuje isopropylskupinu) odvozená začleněním C-4 (uhlík v poloze 4; isobutyryl) startérové jednotky se eluují dříve, analoga obsahující sek.butylový postranní řetězec (R₁ = sek.butyl v obecném vzorci 1) odvozená začleněním C-5 (uhlík v poloze 5, 2-methylbutyryl) startérové jednotky se eluují o několik minut později. Hmotnostní spektroskopie s vysokým rozlišením poskytne výsledky pro C-4 analoga eryA, • ·

- 56 ·** eryB a eryD a analoga C-5 eryA a eryB, které blízce korespondují s teorií:

Analog

HRMS vypočteno

HRMS nalezeno

C5-eryA

C4-eryA

C5-eryB

C4-eryB

762,5004

748,4847

746.4898

732.4898

762,5021

748,4820

748,5077

732,4933

Při těchto zkouškách byly přírodní erythromyciny přítomny pouze v nízkých nebo nedetegovatelných množstvích a nevyskytla se zde žádná detegovatelná množství analog eryC. Poměr celkové koncentrace sloučenin C-4/C-5 ve fermentační půdě, stanovený pomocí ESMS ethylacetátových extraktů živné půdy, je mezi 4 : 1 a 6 : 1 ve prospěch sloučenin C-4. Poměr analog A:B:D je proměnlivý, okolo 15:60:25, ale v průběhu fermentace se zvyšuje podíl analog A. Celkový výtěžek erythromycinů je okolo 400 μg/litr. Žádná isomáselná ani 2-methylmáselná kyselina se nedoplňuje. Zdá se tedy, že isobutyrylové a 2-methylbutyrylové startérové jednotky jsou odvozeny od endogenně dodávaných prekursorů, podobně jak je tomu u syntézy přírodních avermektinů (např. Hafner et al., 1991), J. Antibiot., 44: 349 až 356).

Příklad 4a

Konstrukce S. erythraea NRRL 2338/pIGl

Přibližně 5 μg plasmidu pIGl se transformuje do protoplastů S. erythraea NRRL 2338 a stabilní kolonie resistentní vůči thiostreptonu se izolují. Úplná DNA získaná z několika takových kolonií se analyzuje Southernovou hybridizací, aby se potvrdilo specifické začlenění plasmidu do eryAI. Southernova analýza také ukáže, že místo začlenění • · · ♦

- 57 je vhodné pro vytvoření mutantu schopného produkovat pozměněné makrolidy prostřednictvím ave vkládacího modulu.

Příklad 4b

Konstrukce S. erythraea NRRL 2338/pND30

Přibližně 5 μg plasmidu pND30 se transformuje do protoplastů S. erythraea NRRL 2338 a stabilní kolonie resistentní vůči thiostreptonu se izolují. Úplná DNA získaná z několika takových kolonií se analyzuje Southernovou hybridizací, aby se potvrdilo specifické začlenění plasmidu do eryAI. Southernova analýza také ukáže, že místo začlenění je vhodné pro vytvoření mutantu schopného produkovat pozměněné makrolidy prostřednictvím ave vkládacího modulu.

Příklad 5a

Příprava 13-isopropyl- a 13-sek.butylerythromycinů za použití S. erythraea NRRL 2338/pIGl

S. erythraea NRRL 2338/pIGl se zaočkuje do média s vodou z vodovodu obsahujícího 50 μg/ml thiostreptonu a nechá růst několik dní při 30°C. Poté se 20 ml mycelia použije pro zaočkování 500 ml sacharosového-sukcinátového média obsahujícího 50 μg/ml thiostreptonu ve dvoulitrové nádobě, která je za účelem zabránění tvorbě shluků vybavena jednou spirálou, a směs se třepe při frekvenci 280 min“¹. Po 3,5 až 6 dnech se živná půda přefiltruje, aby se odstranilo mycelium a extrahuje třikrát čtvrtinovým objemem ethylacetátu. Spojené ethylacetátové extrakty se vysuší bezvodým síranem sodným a rozpouštědlo se odpaří. Analýzou směsi produktů za použití GC a elektrosprejové MS se zjistí, že v celkem 5 až 6 mg/litr 14-členných makrolidových produktů je hlavní složkou sek.butylerythromycin D (asi 1,5 mg/1), přičemž jako • · • ·

další složky jsou přítomny sek.butylerythromycin B a sek.butylerythromycin A; isopropylerythromyciny A, B a D; a malá množství přírodních erythromycinů A, B a D. Ve srovnání s ekvivalentním konstruktem S. erythraea ERMD1 (viz příklad 2) S. erythraea NRRL 2338/pIGl produkuje přibližně asi 10 až 15x více nových isopropyl- a sek.butylerythromycinů, což jasně demonstruje schopnost promotoru actl a jeho rozpoznávacího aktivátorového genu actll-orf4 posilovat expresi PKS typu I. Ani kyselina isomáselná ani 2-methylmáselná se opět nedoplňují. Zdá se tedy, že isobutyrylové a 2-methylbutyrylové startérové jednotky jsou odvozeny od endogenně dodávaných prekursorů

Příklad 5b

Příprava 13-isopropyl- a 13-sek.butylerythromycinů za použití S. erythraea NRRL 2338/pND30

S. erythraea NRRL 2338/pND30 se zaočkuje do média s vodou z vodovodu obsahujícího 50 μg/ml thiostreptonu a nechá růst 4 dny při 30°C. Poté se 20 ml mycelia použije pro zaočkování 500 ml sacharosového-sukcinátového média obsahujícího 50 μg/ml thiostreptonu ve dvoulitrové nádobě, která je za účelem zabránění tvorbě shluků vybavena jednou spirálou, a směs se třepe při frekvenci 280 min“¹. Po 3,5 až 6 dnech se živná půda přefiltruje, aby se odstranila mycelium a extrahuje třikrát čtvrtinovým objemem ethylacetátu. Spojené ethylacetátové extrakty se vysuší bezvodým síranem sodným a rozpouštědlo se odpaří. Analýzou směsi produktů za použití GC a elektrosprejové MS se zjistí, že v celkovém výtěžku 5 až 6 mg/litr 14-členných makrolidových produktů je hlavní složkou sek.butylerythromycin D (asi 1,5 mg/1), přičemž jako další složky jsou přítomny sek.butylerythromycin B a sek.butylerythromycin A; isopropylerythromyciny A, B a D; a malá množství přírodních erythromycinů A, B a D.

• · • ·

«.··

Ve srovnání s ekvivalentním konstruktem S. erythraea ERMD1 (viz příklad 2), S. erythraea NRRL 2338/pND30 produkuje přibližně 10 až 15x více nových isopropyl- a sek.butylerythromycinů, což jasně demonstruje schopnost promotoru actl a jeho rozpoznávacího aktivátorového genu actll-orf4 posilovat expresi PKS typu I. Ani kyselina isomáselná ani 2-methylmáselná se opět nedoplňují. Zdá se tedy, že isobutyrylové a 2-methylbutyrylové startérové jednotky jsou odvozeny od endogenně dodávaných prekursorů

Příklad 6a

Příprava 13-cyklopentylerythromycinu B za použití S. erythraea NRRL 2338/pIGl

Kulturou S. erythraea NRRL 2338/pIGl se zaočkuje 50 ml média s vodou z vodovodu ve 300ml Erlenmeyerově baňce. Po 36hodinové inkubaci při 28°C se obsahu baňky použije pro zaočkování 3,5 litru média ERY-P v 51itrové nádobě. Živná půda se inkubuje při 28°C za aerace rychlostí 1,75 litru/min Po 24 hodinách se k ní přidá cyklopentankarboxylová kyselina (1,4 ml) a ve fermentaci se pokračuje 168 hodin. Poté se celá živná půda vodným hydroxidem sodným zalkalizuje na pH 8,5 a extrahuje ethylacetátem (10 litrů). Ethylacetátový extrakt se zkoncentruje do sucha, čímž se získá surový produkt ve formě pryskyřice (4,2 g). 1 gram tohoto extraktu se rozpustí v ethylacetátu (5 ml) a umístí do patrony se silikagelovou náplní (10 g, International Sorbent Technology)/ která byla předem kondiciována ethylacetátem (10 ml). Sloupec se postupně eluuje ethylacetátem (4 x 10 ml), směsí dichlormethanu a methanolu (1 : l) (2 x 10 ml), směsí dichlormethanu, methanolu a amoniaku (90 : 9 : 1) (1 x 10 ml), směsí dichlormethanu, methanolu a amoniaku (80 : 19 :

1) (1 x 10 ml) a methanolem (2 x 10 ml). Frakce 7 až 10 se spojí a odpaří do sucha. Pryskyřičný zbytek (3,2 g) se znovu • · · · • · ··

frakcionuje. Při tomto obohacovacím stupni se získá přibližně 920 mg pryskyřičné pevné látky, která obsahuje požadovaný produkt. Tato pevná látka se dále přečistí preparativní HPLC s obrácenými fázemi na sloupci Zorbax 7 μιη ODS (21,2 mm x x 25 cm) za použití směsi acetonitrilu a 0,05M octanu amonného (7 : 3), jako mobilní fáze při průtoku 8 ml/min. Frakce obsahující produkt, který je předmětem zájmu, ze čtyř oddělených nástřiků se spojí a odpaří do sucha. Zbytek se znovu podrobí preparativní HPLC s obrácenými fázemi na sloupci Beckman 5 μπι Ultrasphere ODS (10 mm x 25 cm) za použití gradientu: acetonitril : 0,05M octan amonný (28 : 72) až acetonitril : 0,05M octan amonný (50 : 50) během 18 minut, jako mobilní fáze, při průtoku 4 ml/min. Frakce obsahující produkt, který je předmětem zájmu, z pěti oddělených nástřiků se spojí a odpaří do sucha, čímž se získá čistá bílá pevná látka (7 mg). Struktura produktu se potvrdí hmotnostní spektrometrií (MS) a nukleární magnetickou resonancí (NMR), viz dále:

HPLC retenční doba - postup A - 26,0 minuty

APCI-MS-(M+H)⁺ pro C₄₀H₇₂ ^noi2^{: na}l^ezeno při m/e 758, vypočteno 758 • · · · • ·

Údaje NMR:

Číslo atomu	13C chemický posun, ze spektra 13C NMR	η H chemický posun a multiplicita
1	176,0	-
2	45,0	2,89 1Hdq J = 9,4, 7,1
3	80,4	4,02 1Hdd J = 9,4, 1,7
4	39,2	2,08 1H multiplet
5	83,8	3,59 1Hd J = 7,4
6	75,4	-
7	38,0	2,00 1Hdd J = 14,7,10,; ca. 1,65 1H multiplet
8	45,0	2,71 1Hdqd J = 10,6, 6^
9	ca. 220,0	-
10	38,9*	2,98 1Hqd J = 6,8, 1,5
11	69,4	3,73 1HddJ = 9,9, 1,2
12	38,8*	1,71 1H multiplet
13	78,3	5,19 1Hdd J = 10,5, 1,0
14	41,7	3.15 1H br sextet

• 9 · ·

1'

2'

3'

4'

5'

6'

7',8'

30.4

25.4

25,1

29,0

15.8 9,24

27.4

18.5

9.5

9,16

103,2

70.9

65.4 29,0

68,8

21.5 40_?1

96.5 35,1

72.6 78,0 ·

9

9

9 9

9 9 9

9· ·« ·· • 99 9 9 99 ·

9 9 9 9 9 9

99 999999 • 9 9 9 ·

999 99 99 9· ca. 1,69 1Η multiplet ca. 1,21 1H multiplet ca. 1,63 1H multiplet ca. 1,52 1H multiplet ca. 1,63 1H multiplet ca. 1,52 1H multiplet ca. 1,69 1H multiplet _K ca. 1,21 1H multiplet 1,183Hd J = 7,1

1.13 3Hd J = 7,0

1,46 3Hs

1.14 3Hd J = 6,8

0,99 3Hd J = 6,8

0,86 3Hd J = 7,1

4,43 1Hd J = 7,3

3,24 1Hdd J = 10,3, 7,3

2,51 1Hddd J = 12,0, 10,6, 4,1 ca. 1,68 1H multiplet ca. 1,24 1H multiplet

3,50 1H br sextet

1,223Hd J = 6,1

2,322x3Hs

4,90 1Hd J = 4,6

2,36 1H d J = 15,2 + malá hodnota (méně než 1 Hz)

1,58 1H multiplet

3,02 1Hd J = 9,1 ··· ·

5	65,6	4,01 1H multiplet
6	18,7	1,29 3Hd J = 6,3
7	21,4	1,24 3H s
8	49,5	3,31 3H s

přiřazení označená hvězdičkou mohou být zaměnitelná

Příklad 6b

Příprava 13-cyklopentylerythromycinu B za použití S. erythraea NRRL 2338/pND 30

Podobným postupem, jaký je popsán v příkladu 6a se za použití S. erythraea NRRL 2338/pND30 vyrobí sloučenina uvedená v příkladu 6a.

Příklad 7a

Příprava 13-cyklobutylerythromycinu B za použití S. erythraea NRRL 2338/pIGl

Kulturou S. erythraea NRRL 2338/pIGl se zaočkuje 50 ml média s vodou z vodovodu ve třech 300ml Erlenmeyerových baňkách. Po 72hodinové inkubaci při 28°C se obsahu baňky použije pro zaočkování 3,5 litru média ERY-P ve třech 51itrových nádobách. Živná půda se inkubuje při 28°C za aerace rychlostí 2,0 litru/min a míchání rychlostí 500 min¹. Po 24 a 48 hodinách se k ní přidá další cyklobutankarboxylová kyselina (1,4 ml) a ve fermentaci se pokračuje 168 hodin. Poté se celá živná půda vodným hydroxidem sodným zalkalizuje na pH 8,5 a extrahuje ethylacetátem (20 litrů). Ethylacetátový extrakt se zkoncentruje do sucha, čímž se získá surový produkt ve formě pryskyřice (9,2 g). Část (2,3 g) tohoto extraktu se rozpustí v ethylacetátu (12,5 ml) ·· ·· ··

• · · · · · • ·· «·· · · · • * · · • ·· · · ·· a umístí do patrony se silikagelovou náplní (10 g, International Sorbent Technology), která byla předem kondiciována ethylacetátem (10 ml). Sloupec se postupně eluuje ethylacetátem (4 x 24 ml), směsí dichlormethanu a methanolu (9 : 1) (1 x 24 ml), směsí dichlormethanu a methanolu (8 : 2) (2 x 24 ml), směsí dichlormethanu, methanolu a amoniaku (80 :

: 1) (1 x 24 ml) a methanolem (1 x 24 ml). Frakce 6 až 8 se spojí a odpaří do sucha. Vzorek pryskyřičného zbytku (4,7 g) se znovu frakcionuje. Při tomto obohacovacím stupni se získá přibližně 415 mg pevné látky, která obsahuje požadovaný produkt. Tato pevná látka se dále přečistí preparativní HPLC s obrácenými fázemi na sloupci Zorbax 7 μιη ODS (21,2 mm x 25 cm) za použití směsi acetonitrilu a 0,05M octanu amonného (3 : 1), jako mobilní fáze při průtoku 8 ml/min. Frakce obsahující produkt, který je předmětem zájmu, z pěti oddělených nástřiků se spojí a odpaří do sucha.

Zbytek se znovu podrobí preparativní HPLC s obrácenými fázemi na sloupci Beckman 5 μιη Ultrasphere ODS (10 mm x 25 cm) za použití gradientu: acetonitril : 0,05M octan amonný (28 : 72) až acetonitril : 0,05M octan amonný (50 : 50) během 18 minut, jako mobilní fáze, při průtoku 4 ml/min. Frakce obsahující produkt, který je předmětem zájmu, se spojí a odpaří do sucha, čímž se získá čistá bílá pevná látka (27 mg). Struktura produktu se potvrdí hmotnostní spektrometrií (MS) a nukleární magnetickou resonancí (NMR), viz dále:

HPLC retenční doba - postup A - 22,3 minuty

APCI-MS-(M+H)⁺ pro C_3gH₇₀NO₁₂: nalezeno při m/e 744 vypočteno 744 • ···· · ·· ·· **_ ·· · ·· · · · !! I _a · · · · ·*** • . . · * · · «♦· ··· *·* «·· · · gj- ,·. ·· ··· ·♦ ·· ··

Údaje NMR:

Číslo	13C chemický posun,	chemický posun
atomu	ze spektra 13C NMR	a multiplicita
1	176,3	-
2	44,5	2,87 1Hdq J = 9,1,7,1
3	80,4	4,03 iHd J = 9,1
4	39,2	2,08 IHmultipIet
5	83,9	3,59 1Hd J = 7,4
6	75,4	-
7	37,7	1,99 IHmultipIet 1,64 1Hdd J = 15,0, 3,0
8	44,5	2,73 1H br dublet pentetů J = ca. 7,0, 3,0
9	219,4	-
10	38,9	2,97 1Hqd J = 6,9, 1,1
11	69,1	3,75 1Hdd J = 10,2+malá hodnota
12	37,3	1,62 IHmultipIet
13	77,4	5,39 1Hdd J = 9,3, 1,1
14	37,0	2,60 1Hbr sextet
15	25,2	ca 1,97 1H multiplet

ca 1,82 1H multipf et • *· ·· ·· ·· · · · · · · • · · · * · · • · · · ·····« • · · · · ··· ·· ·· ·· ·· · • · • · — 66 ··· ··

16	17,7	ca 1,83 2H muttiplet
17	24,2	ca 1,93 IHmultiplet ca 1,75 IHmultiplet
18	15,5	1,17 3Hd J = 7,1
19	9,3	1,12 3Hd J = 7,5
20	27,0	1,46 3HS
21	18,0	1,14 3Hd J = 7,1
22	9,1	0,98 3Hd J = 6,9
23	9,3	0,81 3Hd J = 7,1
1'	103,4	4,43 1Hd J = 7,3
2'	70,9	3,27 1Hdd J = 10,3, 7,3
3'	65,2	2,64 IHmultiplet
4'	29,1	ca 1,72 IHmultiplet ca 1,22 IHmultiplet
5'	68,7	3,52 1H br sextet J = ca. 6,1
6'	21,0	1,23 3Hd J = 6,1
7', 8'	40,0	2,38 2x3Hs
1	96,8	4,89 1Hd J = 4,5
2	34,7	2,38 IHmultiplet,, 1,57 1HddJ = 15,0, 5,0
3	72,5	-
4	77,8	3,02 1Hd J = 9,2
5	65,3	4,02 IHmultiplet
6	18,2	1,29 3Hd J = 6,2
7	21,2	1,24 3Hs
8	49,1	3,31 3Hs

• · · ·

- 67 *** ·· ·· ·· ·· • · · * · · • · · · · · • · · · · · · · · • · · · ·· ·· ··

Příklad 7b

Příprava 13-cyklobutylerythromycinu B za použití S. erythraea NRRL 2338/pND30

Podobným postupem, jaký je popsán v příkladu 7a se za použití S. erythraea NRRL 2338/pND30 vyrobí sloučenina uvedená v příkladu 7a.

Příklad 8a

Příprava 13-(3-furyl)erythromycinů B za použití S. erythraea NRRL 2338/pIGl

Kulturou S. erythraea NRRL 2338/pIGl se zaočkuje 50 ml média s vodou z vodovodu ve 300ml Erlenmeyerově baňce. Po 72hodinové inkubaci při 28“C se obsahu baňky použije pro zaočkování 3,5 litru média ERY-P v Slitrové nádobě. Živná půda se inkubuje při 28°C za aerace rychlostí 1,75 litru/min Po 24 hodinách se k ní přidá 3-furoová kyselina (1,4 g v 6 ml methanolu) sterilizovaná filtrací a ve fermentaci se pokračuje 138 hodin. Poté se celá živná půda vodným hydroxidem sodným zalkalizuje na pH 8,5 a extrahuje ethylacetátem (10 litrů). Ethylacetátový extrakt se zkoncentruje do sucha, čímž se získá surový produkt ve formě pryskyřice (3,8 g). Část (1,9 g) tohoto extraktu se rozpustí v ethylacetátu (10 ml) a umístí do patrony se silikagelovou náplní (10 g, International Sorbent Technology), která byla předem kondiciována ethylacetátem (10 ml). Sloupec se postupně eluuje ethylacetátem (4 x 24 ml), směsí dichlormethanu a methanolu (9 : 1) (1 x 24 ml), směsí dichlormethanu a methanolu (8 :

2) (2 x 24 ml), směsí dichlormethanu, methanolu a amoniaku (80 : 19 : 1) (1 x 36 ml) a methanolem (1 x 24 ml). Frakce 8 a 9 se spojí a odpaří do sucha. Pryskyřičný zbytek (1,9 g) se znovu frakcionuje. Při tomto obohacovacím stupni se získá

9« ·9 ·· • • 9 9 9 9 9 9

9 9 9 · · ·

99 999 999

9 9 9 9 pryskyřičná pevná látka, která obsahuje požadovaný produkt. Tato pevná látka se dále přečistí preparativní HPLC s obrácenými fázemi na sloupci Zorbax 7 μιη ODS (21,2 mm x x 25 cm) za použití směsi acetonitrilu a 0,05M octanu amonného (3 : 1), jako mobilní fáze při průtoku 8 ml/min. Frakce obsahující produkt, který je předmětem zájmu, ze tří oddělených nástřiků se spojí a odpaří do sucha. Zbytek se znovu podrobí preparativní HPLC s obrácenými fázemi na sloupci Beckman 5 μιη Ultrasphere ODS (10 mm x 25 cm) za použití gradientu: acetonitril : 0,05M octan amonný (28 : 72) až acetonitril : 0,05M octan amonný (50 : 50) během 18 minut, jako mobilní fáze, při průtoku 4 ml/min. Frakce obsahující produkt, který je předmětem zájmu, z pěti oddělených nástřiků se spojí a odpaří do sucha, čímž se získá čistý 13-(3-furyl)erythromycin B ve formě bílé pevné látky (9 mg). Struktura produktu se potvrdí hmotnostní spektrometrií (MS).

HPLC retenční doba - postup A - 17,0 minuty

APCI-MS-(M+H)⁺ pro C_3gH₆₆NO₁₃: nalezeno při m/e 756, vypočteno 756 ··«· ·· · • · • * ·

- · · · — 69 ♦** ·· * *· ·· · · • · · • · · ♦ • · · »«· ·· • « » · ··· «· ·· • · • · <·

Údaje NMR:

Číslo atomu	13C chemický posun, ze spektra NMR	1H chemický posun a multiplicita
1	174,7	-
2	44,4	2,93 1Hdq J = 8,1, 7,0
3	80,3	4,14 1Hd J = 8,1
4	39,5	2,18 1HmJ = 7,0, 7,2
5	83,9	3,61 1Hd J = 7,2
6	75,0	-
7	37,8	2,07 1Hdd J = 14,6, 11,3 1,70 1H dd J = 14,6, nerozlišeno
8	44,8	2,78 1Hbrm J = 11,3, 7,0, 2,2
9	219,7	-
10	39,2	3,05 1Hdq J = 6,9, nerozlišeno
11	69,5	3,95 1Hdd J = 10,0, nerozlišeno
12	41,4	1,88 1Hdq J = 10,0, 7,0
13	69,2	6,47 1H komplex m

• · · · • ·

	- 70 -	• · · · · • · · • · • · · • · · • · · · ♦	« ·· ·· ·· ··· · · · · · • · · · · · · • · ·· ··· ··· • · · 9 · »·· · · · · ··
14	138,3	7,31	1H komplex m J= 0,7, 1,8
15	124,3	-
16	108,6	6,31	1H komplex m, J = 1,8, 0,7
17	142,8	7,39	1HÍ J = 1,8
18	15,5	1,21	3Hd J = 7/0
19	8,7	1,16	3Hd J = 7,0
20	27,0	1,48	3Hs . Λ
21	18,3	1,18	3Hd J = 7,0
22	8,4	1,03	3Hd J = 6,9
23	8,7	0,88	3Hd J = 7,0
1'	103,3	4,46	1Hd J = 7,4
2’	71,1	3,29	1Hm
3'	65,1	2,60	1H br m
4'	29,3	1,78	1H m
		1,24	1Hm
5'	68,8	3,54	1Hm
6'	20,7	1,24	3H d (zastřeno)
7',8'	40,0	2,39	2x3Hs
1	96,6	4,88	1Hbrd J = 4,9
2	35,2	2,39	1Hm
		.1,59	1Hdd J = 15,0,4f9
3	71,7	-
4	77,8	3,03	1Hd (zastřeno)
5	66,1	4,03	1Hdq J = 9,0, 6,1
6	18,3	1,30	3Hd J = 6,1
7	21,2	1,26	3Hs
8	49,1	3,33	3Hs

• · · · přiřazení označená hvězdičkou mohou být zaměněna

Příklad 8b

Příprava 13-(3-furyl)erythromycinu B za použití S. erythraea NRRL 2338/pND 30

Podobným postupem, jaký je popsán v příkladu 8a se za použití kultury S. erythraea NRRL 2338/pND30 vyrobí sloučenina uvedená v příkladu 8a.

Příklad 9a

Příprava 13-cyklopropylerythromycinu B za použití S. erythraea NRRL 2338/pIGl

Kulturou S. erythraea NRRL 2338/pIGl se zaočkuje 50 ml média s vodou z vodovodu ve 300ml Erlenmeyerově baňce. Po 72hodinové inkubaci při 28°C se obsahu baňky použije pro zaočkování 3,5 litru média ERY-P. K zaočkovanému médiu se přidá thiostrepton (105 mg) bezprostředně po sterilizaci. Živná půda se inkubuje při 28°C za aerace rychlostí 2 litry/min a míchání při frekvenci otáčení 500 min^-1.

Po 24 hodinách se k ní přidá cyklopropankarboxylová kyselina (1,2 ml) a ve fermentaci se pokračuje 144 hodin. Poté se celá živná půda vodným hydroxidem sodným zalkalizuje na pH 8,5 a extrahuje ethylacetátem (3 litry). Ethylacetátový extrakt se zkoncentruje do sucha, čímž se získá surový produkt ve formě pryskyřice (1,7 g). Tento extrakt (0,85 g) se rozpustí v ethylacetátu (10 ml) a umístí do patrony se silikagelovou náplní (10 g, International Sorbent Technology)/ která byla předem kondiciována ethylacetátem (20 ml). Sloupec se postupně eluuje ethylacetátem (4 x 24 ml), směsí dichlormethanu a methanolu (9 : 1) (1 x 24 ml), směsí dichlormethanu a methanolu (8 : 2) (1 x 24 ml), směsí • · · · 4

- 72 : 19 : 1) (3 x 24 9 se spojí

a) se znovu dichlormethanu, methanolu a amoniaku (80 ml) a methanolem (1 x 24 ml). Frakce 6 až a odpaří do sucha. Pryskyřičný zbytek (0, frakcionuje. Při tomto obohacovacím stupni se získá pevná látka, která obsahuje požadovaný produkt. Tato pevná látka se dále přečistí preparativní HPLC s obrácenými fázemi na sloupci Zorbax 7 μιη ODS (21,2 mm x x 25 cm) za použití směsi acetonitrilu a 0,05M octanu amonného (3 : l), jako mobilní fáze při průtoku 8 ml/min. Frakce obsahující produkt, který je předmětem zájmu, ze 4 oddělených nástřiků se spojí a odpaří do sucha. Zbytek se znovu podrobí preparativní HPLC s obrácenými fázemi na sloupci Beckman 5 μιη Ultrasphere ODS (10 mm x 25 cm) za použití gradientu: acetonitril : 0,05M octan amonný (28 : 72) až acetonitril : 0,05M octan amonný (50 : 50) během 18 minut, jako mobilní fáze, při průtoku 4 ml/min. Frakce obsahující produkt, který je předmětem zájmu, ze 3 oddělených nástřiků se spojí a odpaří do sucha, čímž se získá čistý 13-cyklopropylerythromycin B ve formě bílé pevné látky (9 mg). Struktura produktu se potvrdí hmotnostní spektrometrií (MS).

HPLC retenční doba - postup A - 17,9 minuty

APCI-MS-(M+H)⁺ pro C₃₈H₆₈NO₁₂ ^: nalezeno při m/e 730, vypočteno 730 • · * · t :.

é · • · • · · · • · · • · · ♦ · · · · · • · • · · ·

Údaje

Číslo atomu

NMR:

¹³C chemický posun, ze spektra ¹³C NMR ¹H chemický posun a multiplicita

176,4 44,8	2,88	1Hdq J = 8,5, 7,1
80,3	4,04	1Hdd J = 8,5, 1,9
39,5	2,11	1H br pentet J = ca 7
83,7	3,58	1Hd J = 7,5
75,2	-
38,0	2,02	1Hdd J= 14,7, 10,9

• · * · • · · « • · · « • · · · · «

		1,66 1Hdd J = 14,7, 2,8
8	45,1	2,74 1Hdqd J = 10,9, 7,1, 2,8
9	220,0	-
10	39,0	3,01 IHmuítiplet
11	69,8	3,76 1Hdd J = 10,0, ca 1,4
12	40,4	1,84 1Hdqd J = 10,0, 6,9, 1,2
13	78,5	4,68 1Hdd J = 9,2, 1,2
14	13,2	1,09 IHmultipleí
15	V	0,51 IHmultipleí
		0,42 1H multiplet
16	2,7	0,51 IHmuítiplet
		0,29 IHmuítiplet
17	15,1	1,19 3Hd J = 7.1
18	9,3	1,14 3Hd J = ca7.1
19	27,4	1,46 3Hs
20	18,3	1,16 3Hd J = 7,1
21	9,3	1,001 3Hd J = ca7,2‘
22	9,3	0,998 3Hd J = ca6,9*
1'	103,3	4,43 1Hd J = 7,2
2'	71,0	3,25 1Hdd J = 10,3, 7,2
3'	65,6	2,54 IHbrddd J = ca 12,5,10,3,4
4'	29,0	1,69 IHmuítiplet
		1,25 IHmuítiplet
5'	69,2	3,51 IHbrdq J = ca11,6
6'	20,9	1,22 3Hd J = 6,2
7',8'	39,9	2,33 2x3Hs
1	97,1	4,87 1H brd J = ca5

• · · · • · · · · · • · · · · · » · · · « • · · · · · · · * · · · 4 · · ······ • · · · · · « « ·» · «· · · · ·♦ · · · ·

2	35,0	2,37 1Hbrd J = ca. 15
		1,57 1Hdd J = 15,1,5,
3	72,5	-
4	78,1	3,01 1Hbrd J = 9,2
5	66,0	4,02 1Hdq J = 9,2, 6,2
6	18,3	1,28 3Hd J = ca6,2
7	21,0	1,24 3Hs
8	49,3	3,32 3Hs
přiřazení	označená hvězdičkou	mohou být zaměněna

Příklad 9b

Příprava 13-(cyklopropyl)erythromycinu B za použití S. erythraea NRRL 2338/pND30

Podobným postupem, jaký je popsán v příkladu 9a se za použití kultury S. erythraea NRRL 2338/pND30 vyrobí sloučenina uvedená v příkladu 9a.

Příklad 10a

Příprava 13-(1-methylthioethyl)erythromycinu B za použití S. erythraea NRRL 2338/pIGl

Kulturou S. erythraea NRRL 2338/pIGl se zaočkuje 1 litr média s vodou z vodovodu ve 2,8litrové Fernbachově baňce. Bezprostředně po inokulaci se přidá thiostrepton (50 mg). Po 84hodinové inkubaci při 29°C se obsahu baňky použije pro zaočkování 8 litrů doplněného média ERY-P (50 g/litr dextrosy, 30 g/litr mouky Nutrisoy, 3 g/litr síran amonný, g/1 chlorid sodný, 6 g/litr uhličitan vápenatý, 10 g/litr sacharosy, 5 g/litr sušiny z kukuřičného výluhu, 0,5 g/litr síran hořečnatý a 1 ml/litr P2000) ve 141itrové fermentační • · · · • · « · « · ► · · · ► · · » • · » ·· · » · • · Λ ·

- 76 nádobě. Živná půda se inkubuje při 28°C za aerace rychlostí 8 litrů/min a míchání při frekvenci otáčení 800 min^-1, přičemž se pH hydroxidem sodným nebo kyselinou sírovou (15%) udržuje mezi 6,9 až 7,3. Po 24 a 48 hodinách se k živné půdě přidá methylthiomléčná kyselina (3,2 ml). Po 120 hodinách se přidá další dávka methylthiomléčné kyseliny (1,6 ml) a ve fermentaci se pokračuje 144 hodin. Poté se celá živná půda odstředí za vzniku centrifugátu (34 litrů), který se nanese na sloupec pryskyřice XAD-16 (600 ml, Rohm and Haas).

Sloupec pryskyřice se promyje vodou (1,8 litruú a eluuje ethylacetátem (2,5 litru). Ethylacetát se zčásti odpaří (do zbytkového objemu 250 ml) a potom se požadovaný produkt extrahuje do lOOmM pufru na bázi fosforečnanu sodného o pH 3,5 (1,3 litru). Produkt se znovu převede do ethylacetátu, nastavením pH vodné směsi na 9 pomocí hydroxidu sodného a přidáním ethylacetátu (450 ml). Ethylacetátová vrstva bohatá na erythromycin se oddělí a odpaří na pryskyřici (5,0 g). Tento zbytek se resuspenduje ve 20% methanolu (120 ml) a suspenze se nanese na sloupec pryskyřice CG 161 (100 ml, Toso Haas). Sloupec pryskyřice se postupně eluuje 20%

methanolem (3	x 100	ml),	40%	methanolem	(3	X	100	ml), 60 %
methanolem (3	x 100	ml),	80%	methanolem	(3	X	100	ml)
a čistým methanolem	(4 x	100	ml). Frakce	2	a	3 eluované

čistým methanolem obsahující produkt, který je předmětem zájmu, se odpaří. Pevný zbytek (220 mg) se dále přečistí vysokotlakou kapalinovou chromatografií s obrácenými fázemi na sloupci Kromasil C18 (10 μιη) (75 mm x 25 cm) za použití gradientu acetonitril : 0,05M octan amonný s 0,1 % trifluoroctové kyseliny 32 : 68 až 38 : 62 během 60 minut, jako mobilní fáze, při průtoku 215 ml/min. Frakce obsahující produkt, který je předmětem zájmu, se spojí (1,7 litru), hydroxidem sodným zalkalizují na pH 9 a extrahují methylenchloridem (300 ml). Methylenchloridová vrstva se oddělí a odpaří do sucha na částečně čistý produkt. Stupeň preparativní HPLC a extrakce se opakuje, čímž se získá čistý • · · ·

• · « • · • · ®· · «

- 77 13-(1-methylthioethyl)erythromycin B (31 mg). Struktura produktu se potvrdí MS a NMR spektroskopií, za použití spektrometru Bruker DMX 500 MHz:

Retenční doba HPLC - postup B - 14,9 minuty

APCI-MS-(M+H)⁺ pro C₃qH^qNO^2^S: nalezeno při m/e 764 vypočteno 764 · · · » · · ·99 99·

9 · « * 9 « · 4 ·

NMRdata:

Číslo atomu

13C(ppm)	Počet přiy pojených H	Ή (ppm)
221,08	0
176,10	0
103,42	1	4,49
96,93	1	4,94
84,31	1	3,63
80,69	1	4,06
78,30	1	3,07
76,17	1	5,42
75,75	0
73,11	0
71,23	1	3Z32
69,84	1	3,77
69,03	1	3,56
66,18	1	.4.06 7

* · ·

4 4 4 • 4 4 · »444

4 4 444 444

4 · 4

4 4 · · «4

15	65,99	1	2,68
16	49,91	3	3,36
17	45,62	1	2,74
18	45,26	1	2,96
19	40,61	3	2,46
20	40,01	1	2,83
21	39,60	1	2,14
22	38,94	1	3,04
23	38,44	2	2,03/1,70
24	37,68	1	2.44
25	35,47	2	2,41/1,63
26	29,66	2	1,79/1,32
27	27,70	3	1,51
28	21,89	3	1,29
29	21,77	3	1,28
30	19,08	3	1,33
31	18,92	3	1,20
32	18,19	3	1,33
33	16,29	3	1,23
34	11,11	3	2,12
35	10,16	3	1,07
36	9,70	3	1,17
37	9,62	3	0,90

« ·« · • · · · · · · · « · · * · ······· • · · ·· · · ··««·· • · · · · ♦ · · »· * · fr · · · · * · · · ·

- 80 Příklad 10b

Příprava 13-(l-methylthioethyl)erythromycinu B za použití S. erythraea NRRL 2338/pND30

Podobným postupem, jaký je popsán v příkladu 10a se za použití kultury S. erythraea NRRL 2338/pND30 vyrobí sloučenina uvedená v příkladu 10a.

Příklad 11

Příprava 13-cyklobutylerythromycinu B za použití S. erythraea NRRL 2338

Kulturou S. erythraea NRRL 2338 se zaočkuje 50 ml média s vodou z vodovodu ve 300ml Erlenmeyerově baňce. Po 48 hodinách inkubace při 28°C se obsahu baňky použije pro zaočkování 50 ml média ERY-P ve 300ml Erlenmayerově baňce. Živná půda se inkubuje při 28°C, po 24 hodinách se k ní přidá cyklobutankarboxylová kyselina (20 ml) a ve fermentaci se pokračuje po dobu 168 hodin. Poté se celá živná půda vodným hydroxidem sodným zalkalizuje na pH 8,5 a poté extrahuje ethylacetátem (50 ml). Ethylacetátová vrstva se oddělí a zkoncentruje do sucha. Vzorek se za účelem analýzy HPLC-MS znovu rozpustí v methanolu (1 ml). Touto analýzou se potvrdí, že netransformovaným nerekombinantním kmenem NRRL 2338 byl vyprodukován 13-cyklobutylerythromycin B, viz příklad 7 pro geneticky modifikovaný kmen obsahující avr vkládací modul (konstrukt NRRL 23 338/pIGl).

Retenční doba HPLC - postup A - 22,3 minuty

APCI-MS-(M+H)⁺ pro C₃gH₇₀NO₁₂ ^: nalezeno při m/e 744 vypočteno 744

• 9

Příklad 12

Příprava 13-cyklopropylerythromycinu B S. erythraea NRRL 2338 za použití

Kulturou S. erythraea NRRL 2338 se zaočkuje 50 ml média s vodou z vodovodu ve 300ml Erlenmeyerově baňce. Po 48 hodinách inkubace při 28C se obsahu baňky použije pro zaočkování 50 ml média ERY-P ve 300ml Erlenmeyrrově baňce. Živná půda se inkubuje při 28 °C, po 24 hodinách se k ní přidá cyklopropankarboxylová kyselina (20 ml) a ve fermentaci se pokračuje po dobu 168 hodin. Poté se celá živná půda vodným hydroxidem sodným zalkalizuje na pH 8,5 a poté extrahuje ethylacetátem (50 ml). Ethylacetátová vrstva se oddělí a zkoncentruje do sucha. Vzorek se za účelem analýzy HPLC-MS znovu rozpustí v methanolu (1 ml).

Touto analýzou se potvrdí, že netransformovaným nerekombinantním kmenem NRRL 2338 byl vyprodukován 13-cyklopropylerythromycin B, viz příklad 9 pro geneticky modifikovaný kmen obsahující avr vkládací modul (konstrukt NRRL 23 338/pIGl).

Retenční doba HPLC - postup A - 17,9 minuty

APCI-MS-(M+H)⁺ pro C₃₈H₆gNO₁₂ ^: nalezeno při m/e 730 vypočteno 730

Příklad 13a

Příprava 13-cyklobutylerythromycinu A za použití S. erythraea NRRL 2338/pIGl

Kulturou S. erythraea NRRL 2338/pIGl se zaočkuje 50 ml média s vodou z vodovodu ve třech 300ml Erlenmeyero9 99 9 • · · * «9 • 9 9 9 9 9

9 · 9 9 9

9 9 999 999

9 · ·

9 9 99

- 82 vých baňkách. Po 72hodinové inkubaci při 28°C se obsahu baňky použije pro zaočkování 3,5 litru média ERY-P ve třech 51itrových nádobách. Živná půda se inkubuje při 28“C za aerace rychlostí 2,0 litru/min a míchání rychlostí 500 min“¹. Po 24 a 48 hodinách se k ní přidá další cyklobutankarboxylová kyselina (1,4 ml) a ve fermentaci se pokračuje 168 hodin. Poté se celá živná půda vodným hydroxidem sodným zalkalizuje na pH 8,5 a extrahuje ethylacetátem (20 litrů). Ethylacetátový extrakt se zkoncentruje do sucha, čímž se získá surový produkt ve formě pryskyřice (9,2 g). Část (2,3 g) tohoto extraktu se rozpustí v ethylacetátu (12,5 ml) a roztok se umístí do patrony se silikagelovou náplní (10 g, International Sorbent Technology), která byla předem kondiciována ethylacetátem (10 ml). Sloupec se postupně eluuje ethylacetátem (4 x 24 ml), směsí dichlormethanu a methanolu (9 : 1) (1 x 24 ml), směsí dichlormethanu a methanolu (8 : 2) (2 x 24 ml), směsí dichlormethanu, methanolu a amoniaku (80 : 19 : 1) (1 x 24 ml) a methanolem (2 x 24 ml). Frakce 6 až 8 se spojí a odpaří do sucha.

Vzorek pryskyřičného zbytku (4,7 g) se znovu frakcionuje.

Při tomto obohacovacím stupni se získá přibližně 415 mg pevné látky, která obsahuje požadovaný produkt. Tato pevná látka se dále přečistí preparativní HPLC s obrácenými fázemi na sloupci Zorbax 7 μιη ODS (21,2 mm x 25 cm) za použití směsi acetonitrilu a 0,05M octanu amonného (3 : 1), jako mobilní fáze při průtoku 8 ml/min. Frakce obsahující produkt, který je předmětem zájmu, z pěti oddělených nástřiků se spojí a odpaří do sucha. Zbytek se znovu podrobí preparativní HPLC s obrácenými fázemi na sloupci Beckman 5 μιη Ultrasphere ODS (10 mm x 25 cm) za použití gradientu: acetonitril : 0,05M octan amonný (28 : 72) až acetonitril : 0,05M octan amonný (50 : 50) během 18 minut, jako mobilní fáze, při průtoku 4 ml/min. Frakce obsahující produkt, který je předmětem zájmu, se spojí a odpaří do sucha, čímž se získá čistá bílá pevná látka (4 mg). Struktura produktu se ·♦»· • 4* ·· ·* ♦ * » ♦ • t · · ♦ ·· »M

- 83 potvrdí hmotnostní spektrometrií (MS) a nukleární magnetickou resonancí (NMR), viz dále:

HPLC retenční doba postup A - 17,5 minuty

APCI-MS-(M+H)⁺ pro C₃₉H₇qNO₁₃: nalezeno při m/e 760 vypočteno 760

Údaje NMR:

Číslo atomu ¹³C chemický posun, z korelace

H chemický posun a multiplicita

1	176,1
2	44,7	2,88	1H multiplet
3	79,8	3,99	1H multiplet
4	39,3	1,97	1H multiplet
5	83,4	3,57	1Hd J = 7.6
6	75,4	-
7	38,3	1,92	1H multiplet
		1,72.	1H multiplet

··· · * · ♦ · · # ♦ ··· ♦·· • · · · · ♦ « ' ♦ »« ·· ··· ·♦ ·* »«

8	45,1	2,70 1H multiplet
9	222,5	-
10	37,4	3,07 1HbrqJ = 7,0
11	69,1	3,77 1Hbrs
12	76,1	-
13	77,1	5,10 1Hd J=7,1
14	34,8	2,86 1H multiplet
15	26,7	1,98 1H multiplet 1,80 1H multiplet
16	18,8	1,88 1H multiplet 1,71 1H multiplet
17	24,8	1,89 2H multiplet
18	15,8	1,19 3Hd J = 7.0
20	26,9	1,47 3Hs
21	18,1	1,16 3Hd J = 7,0
1'	103,0	4,42 1Hd J = 7,2
2'	71,0	3,24 1Hdq J = 10,4, 7,2
3'	65,3	2,51 1H multiplet
4'	28,7	1,68 1H multiplet 1,26 1H multiplet
5'	69,2	3r49 1H multiplet
6'	21,3	1,23 3Hd J = 6,2
7',8'	40,0	2,38 2x3Hs
1	96,3	4,89 1Hd J = 4,5
2	34,7	2,38 1H multiplet 1,57 1HddJ = 15,0. 5,0

73.0

	- 85 -	• ·#·· · ·· ·· ·· *· · ♦··· » » · » • · ·*·*·«* * · ♦ · · # · ··· • · · · · ♦ · Φ ··» »· ··· ··
4	78,0	3,02 1Hd J = 9,4
5	65,6	4,00 IHmultiplet
6	18,4	1,29 3Hd J = 6,2
7	21,3	1,24 3Hs
8	49,4	3,.32 3Hs
	Příklad	13b

Příprava 13-cyklobutylerythromycinu A za použití S. erythraea NRRL 2338/pND30

Podobným postupem, jaký je popsán v příkladu 13a se za použití kultury S. erythraea NRRL 2338/pND30 vyrobí sloučenina uvedená v příkladu 13a.

Příklad 14a

Příprava 13-cyklopropylerythromycinu A za použití S. erythraea NRRL 2338/pIGl

Šest 2800ml Fernbachových baněk se zaočkuje S. erythraea NRRL 2338/pIGl. Každá z baněk obsahuje 1 litr média s vodou z vodovodu s přídavkem 50 mg thiostreptonu. Po 24hodinové inkubaci při 28°C se do každé baňky přidá 200 ppm cyklopropankarboxylové kyseliny. Baňky se inkubují 90 hodin a jejich obsah se umístí do sterilní 8 litrové odsávané nádoby. Obsahu odsávané nádoby se použije pro zaočkování 1426 litrů média ERY-P v 22701itrové poloprovozní nádobě. Živná půda se inkubuje při 27 až 29°C při pH od 6,7 do 7,4 za aerace 0,57 m³/min a míchání při frekvenci 175 min^-1 a po 33, 81 a 117 hodinách se k ní přidá cyklopropankarboxylové kyselnia (200 mg/1). Ve fermentaci se pokračuje po dobu 198 hodin. Poté se celá fermentační půda přefiltruje přes keramický filtr (0,2 ··· ·

- 86 • · · * · 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9 9

9 · · 99 999 999

9 9 9 9 9

999 99 99 9· μπι, 2,8 m² , U.S. Filter). Filtrát se nanese na sloupec pryskyřice XAD-16 (12 litrů, Rohm and Haas). Sloupec pryskyřice se poté eluuje ethylacetátem (60 litrů). Ethylacetátový eluát se zkoncentruje na pryskyřičný zbytek (302 g). K tomuto zbytku se přidají 2 litry methylenchloridu. Výsledný methylenchloridový roztok se promyje 8 litry 250mM tlumivého roztoku hydrogenuhličitanu sodného, pH 9. Methylenchloridová vrstva bohatá na erythromycin se oddělí a odpaří na pryskyřičný zbytek (200 g). Tento zbytek se resuspenduje ve 40% methanolu (10 litrů) a vzniklá suspenze se nanese na sloupec pryskyřice CG-161 (9 litrů, Toso Haas), která se poté promyje 40% methanolem (30 litrů) a postupně eluuje 75% methanolem (8 x 10 litrů) a neředěným methanolem (3 x 10 litrů). Frakce 5 až 8 eluované 75% methanolem obsahující produkt, který je předmětem zájmu, se spojí a odpaří na objem 3,2 litru. Hodnota pH tohoto koncentrátu se nastaví na 9 a přidá se k němu 0,95 litru methylenchloridu. Methylenchloridová vrstva se oddělí a odpaří na 12,4 g pryskyřice. Část tohoto zbytku (6 g) se dále přečistí preparativní vysokotlakou chromatografii s obrácenými fázemi na sloupci Kromasil 10 μιη C18 (75 mm x 25 cm) za použití směsi methanolu a 0,05M octanu amonného s obsahem 0,1 % trifluoroctové kyseliny v poměru 50 : 50, jako mobilní isokratické fáze, při průtoku 215 ml/min. Frakce obsahující produkt, který je předmětem zájmu, se spojí (230 ml) a odpařením zkoncentrují (110 ml). Koncentrát se hydroxidem sodným zalkalizuje na pH 9 a extrahuje methylenchloridem (50 ml). Methylenchloridová vrstva se oddělí a odpaří do sucha, čímž se získá 630 mg částečně znečištěného produktu. Další část pryskyřice (1 g) se dále přečistí preparativní vysokotlakou kapalinovou chromatografií s obrácenými fázemi na sloupci MetaChem Inertsil 10 μιη C8 (50 mm x 25 cm) za použití gradientu acetonitril : 0,05M octan amonný s obsahem 0,1 % trifluoroctové kyseliny (20 : 80) až (25 : 75) během 50 minut, jako mobilní fáze, při průtoku 125 ml/min. Frakce ···· • · · ·· · ·· • · ··♦ • · ♦ · • « • »

9* • « · · • ♦ · · * · · · « ·· · ·· · » · ·· ·« obsahující produkt, který je předmětem zájmu (28 až 46 minut) se spojí, nasytí hydrogenuhličitanem sodným a extrahují methylenchloridem. Methylenchloridová vrstva se oddělí a odpaří do sucha, čímž se získá 361 mg částečně znečištěného produktu. Část těchto částečně znečištěných produktů se dále přečistí vysokotlakou kapalinovou chromatografií s obrácenými fázemi, jako například na sloupci Phenomenex Prodigy 10 μιη C18 (50 x 250 mm) za použití směsi methanolu a 0,05M octanu amonného s 0,1 % kyseliny trifluoroctové (50 : 50), jako isokratické mobilní fáze, při průtoku 100 ml/min. Frakce obsahující produkt, který je předmětem zájmu (27 až 31 minut) se spojí, nasytí hydrogenuhličitanem sodným a extrahují methylenchloridem. Methylenchloridová vrstva se oddělí a odpaří do sucha, čímž se získá částečně znečištěný produkt. Tato látka se dále přečistí vysokotlakou kapalinovou chromatografií s obrácenými fázemi na sloupci Phenomenex Prodigy 10 μιη C18 (50 x 250 mm) za použití směsi methanolu a 0,05M octanu amonného s 0,1 % kyseliny trifluoroctové (48 : 52), jako isokratické mobilní fáze, při průtoku 100 ml/min. Frakce obsahující produkt, který je předmětem zájmu (41 až 45 minut) se spojí, nasytí hydrogenuhličitanem sodným a extrahují methylenchloridem. Methylenchloridová vrstva se oddělí a odpaří do sucha, čímž se získá 13-cyklopropylerythromycin A ve formě pevné látky (20 mg). Struktura produktu se potvrdí MS a NMR spektroskopií, za použití spektrometru Bruker DMX 500 MHz:

Retenční doba HPLC - postup B - 5,6 minuty

APCI-MS-(M+H)⁺ pro C₃₈H₆₈NO₁₃: nalezeno při m/e 746 vypočteno 746 »·*· • ·

Číslo atomu

13C(ppm)	Počet připojených atomů H	1H (ppm)
222,41	0
175,88	0
103,63	1	4,45
96,75	1	4,92
83,92	1	3,60
80,25	1	4,02
78,52	1	4,74
78,42	1	3,05
75,99	0

»··· · *9 • 9 · · 9 · · · 9 · · • 9 999 9999

9 9 99 99 9·9 9·9

999 999 9 9

999 99 999 99 99 99

10	75,49	0
11	73,05	0
12	71,31	1	3,27
13	69,46	1	3,84
14	69,39	1	3,52
15	66,02	1	4,04
16	65,95	1	2,49
17	49,93	3	3,36
18	45,47	1	2.74 I
19	45,23	1	2,89
20	40,70	1	2,34
21	40,00	1	2,02
22	38,94	2	1,96/1,76
23	38,46	1	3,15
24	35,38	2	2,41/1,61
25	29,07	2	1,71/1,28
26	27,36	3	1,50
27	21,94	3	1,28
28	21,84	3	1,26
29	19,08	3	1,32
30	18,69	3	1,21
31	17,38	3	1,31
32	16,11	3	1,21
33	12,38	3	1,20
34	10,64	1	1,20
35	9,60	3	1,16
36	4,23	2	0,67/1,33
37	1,64	2	0,47/0,32

··♦· • ·« ·· ·· • · · · · >· · • · · · · « « • · · · ·· · ··· • · » · · ·· · *· · · »«

Příklad 14b

Příprava 13-cyklopropylerythromycinu A za použití S. erythraea NRRL 2338/pND30

Podobným postupem, jaký je popsán v příkladu 14a se za použití kultury S. erythraea NRRL 2338/pND30 vyrobí sloučenina uvedená v příkladu 14a.

Příklad 15a

Příprava 13-(3-thienyl)erythromycinu B za použití S. erythraea NRRL 2338/pIGl

Kulturou S. erythraea NRRL 2338/pIGl se zaočkuje 50 ml média s vodou z vodovodu ve 300ml Erlenmeyerově baňce. Po 48hodinové inkubaci při 28°C se 5 ml inokula použije pro zaočkování 50 ml média ERY-P ve 300ml Erlenmeyerově baňce. Živná půda se inkubuje při 28°C, po 24 hodinách se k ní přidá N-acetylcystaminthioester 3-thiofenkarboxylové kyseliny (20 mg) v 0,5 ml methanolu sterilizovaný filtrací a ve fermentaci se pokračuje po dobu 168 hodin. Poté se celá živná půda vodným hydroxidem sodným zalkalizuje na pH 8,5 a extrahuje ethylacetátem (50 ml). Ethylacetátová vrstva se oddělí a zkoncentruje do sucha. Vzorek se za účelem analýzy HPLC-MS znovu rozpustí v methanolu (1 ml). Potvrdí se, že byl vyprodukován 13-(3-thienyl)erythromycin B.

Retenční doba HPLC - postup A - 20,0 minuty

APCI-MS-(M+H)⁺ pro C₃₈H₆₆NO₁₂S^: nalezeno při m/e 772 vypočteno 772 ··*·

• · » · · * » · · · ·· · ··· • · ·· ··

Příklad 15b

Příprava 13-(3-thienyl)erythromycinů B za použití S. erythraea NRRL 2338/pND30

Podobným postupem, jaký je popsán v příkladu 15a se za použití kultury S. erythraea NRRL 2338/pND30 vyrobí sloučenina uvedená v příkladu 15a.

Příklad 16

Příprava 6-deoxy-13-cyklopropylerythromycinu B za použití S. erythraea NRRL 18643

Kulturou S. erythraea NRRL 18643, eryF mutantem S. erythraea (Science, 252: 114, 5. dubna 1991), se inokuluje 1 litr média z vody z vodovodu ve 2,8litrové Fernbachově baňce. Po 24hodinové inkubaci při 29°C za míchání při frekvenci 200 min^-1 se do baňky přidá cyklopropankarboxylová kyselina (200 ml). Po celkem 3 dnech inkubace se obsahu baňky použije pro zaočkování 8 litrů doplněného média ERY-P (60 g/litr cerelosy, 30 g/litr mouky Nutrisoy, 3 g/litr síranu amonného, 5 g/litr chloridu sodného, 6 g/litr sušiny z kukuřičného výluhu, 0,5 g/litr síranu hořečnatého a 1 ml/litr P2000) ve 141itrové fermentační nádobě. Živná půda se inkubuje při 28°C za aerace rychlostí 8 litrů/min a míchání při frekvenci otáčení 800 min^-1, přičemž se pH hydroxidem sodným nebo kyselinou sírovou (15%) udržuje mezi 6,9 až 7,3. Po 24 a 48 hodinách se k živné půdě přidá cyklopropankarboxylová kyselina (1,6 ml). Produkt fermentace, prováděné dvojmo, se sklidí po 163 hodinách celkové doby inkubace. Hodnota pH celé půdy se pomocí hydroxidu sodného nastaví na 9 a půda se extrahuje ethylacetátem (16 litrů). Ethylacetátový extrakt se v Buchiho rotační odpařovací jednotce zkoncentruje. Olejovitý zbytek se rozpustí • · ··· ·«·· t

* * • · ·· • · ·· ·· ·· · · » · · · • · · · · · · • · · · ··· ··· • · · · · ··· ·* ·· ft« v 500 ml methylenchloridu. Ke vzniklé kapalině se přidá 500 ml vody a pH vodné fáze se 10% hydroxidem amonným nastaví na

9. Po intenzivním třepání se shromáždí methylenchloridová vrstva, která se odpaří v llitrovém rotačním odpařováku, čímž se získá 11,0 g olejovitého zbytku. Tento zbytek se rozpustí ve 250 ml směsi methanolu a vody v poměru 4 : 6 a vzniklý roztok se umístí na sloupec 80 ml pryskyřice CG-161 (Toso Haas). Sloupec se promyje 350 ml směsi methanolu a vody v poměru 4:6a poté krátce eluuje při průtoku 8 ml/min směsí methanolu a vody v poměru 7:3, dokud ze z kolony nezačnou eluovat barevné nečistoty (promytí asi 2 objemy lože). Poté se zahájí jednohodinová eluce gradientem se zvyšující se koncentrací methanolu od 70 do 100 % během jedné hodiny při průtoku 8 ml/min. Frakce obsahující produkt, který je předmětem zájmu, se odpaří do sucha a dále přečistí vysokotlakou kapalinovou chromatografií s obrácenými fázemi na sloupci Kromasil 10 μιη C18 (50 mm x 25 cm) za použití směsi acetonitrilu a pufru sestávajícího z 0,01M octanu amonného, 0,02% trifluoroctové kyseliny a 26% acetonitrilu v poměru (5:95) po dobu 50 minut při průtoku 120 ml/min, jako mobilní fáze. Poté se eluce provádí lineárním gradientem této směsi (5 : 95) až (33 :

67) během 40 minut. Frakce obsahující produkt, který je předmětem zájmu, se spojí (530 ml), 10% hydroxidem amonným zalkalizují na pH 9 a extrahují methylenchloridem (400 ml). Methylenchloridová vrstva se oddělí a odpaří do sucha. Získá se purifikovaný 6-deoxy-13-cyklopropylerythromycin B (12 mg). Struktura produktu se potvrdí hmotnostní spektroskopií.

Retenční doba HPLC - postup B - 21,4 minuty

APCI-MS-(M+H)⁺ pro C₃gH₆₈NO₁₂ ^: nalezeno při m/e 714 vypočteno 714 ···· • * • · • ·* • ·· ·· ·· ·· » · · · · · • · · · · · · • · · · ··· ··· • · « · · »«<r ·· ί· ··

Příklad 17

Příprava 6-deoxy-13-propylerythromycinu B za použití S. erythraea NRRL 18643

Kulturou S. erythraea NRRL 18643, z třídenní vrstvy na agaru YPD (0,5% kvasinkový extrakt Difco, 0,5% Bacto pepton Difco, 0,25% dextrosa, 0,5% MOPS, 1,7% agar Bašto Difco, o pH nastaveném na 7,0) se zaočkuje 25 ml půdy YPD (0,5% kvasinkový extrakt Difco, 0,5% Bacto pepton Difco, 0,25% dextrosa, 0,5% MOPS, o pH nastaveném na 7,0) ve 250ml Erlenmeyerově baňce. Obsah baňky se inkubuje při 225 min^-1 a 29°C po dobu 48 hodin a 2,5 ml obsahu se zaočkuje 25 ml média ERY-P (5% dextrosa, 3% mouka Nutrisoy, 0,3% síran amonný, 0,5% chlorid sodný, 0,6% uhličitan vápenatý, pH nastaveno na 7,0) a inkubuje při 225 min^-1 a 29°C po dobu celkem 6 dnů. Do baňky se přidává kyselina máselná: v době 24 hodin (400 ppm), 72 hodin (400 ppm) a 120 hodin (200 ppm). Hodnota pH celé půdy se poté 1M hydroxidem sodným nastaví na 9,1 a její vzorek se extrahuje dvakrát stejným objemem ethylacetátu. Ethylacetátové fáze se zkoncentrují do sucha pod atmosférou dusíku (vodná lázeň, 50°C) a poté za účelem analýzy HPLC-MS resuspendují v 1,0 ml methanolu. Potvrdí se, že byl získán 6-deoxy-13-propylerythromycin B.

Retenční doba HPLC - postup C - 23,5 minuty

APCI-MS-(M+H)⁺ pro ^c38^H70^NOll^: nalezeno při m/e 716 vypočteno 716

Příklad 18

Hodnocení antibakteriální účinnosti

In vitro mikrotitrová zkouška antibakteriální účinnosti se interpretuje v souladu se směrnicemi • · · · • · · · · · • · · · · · • · · ··· ···

Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests - 6. vydání; Approved Standard, publikovanými The National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). Stanoví se minimální inhibiční koncentrace (MIC) proti různým bakteriím. Tak například Staphylococcus aureus 80CR5 (kmen citlivý vůči makrolidům) vykazuje obvykle hodnoty v rozmezí od <0,1 do 1,56 pg/ml.

• · · · · ·

Claims (31)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Erythromyciny obecného vzorce 1 kde

   R<

   (l) představuje hydroxyskupinu nebo skupinu obecného vzorce

   R·, představuje alfa-rozvětvenou alkyl-, alkenyl-, alkinyl-, alkoxyalkyl- nebo alkylthioalkylskupinu, z nichž každá obsahuje 3 až 8 atomů uhlíku a je • · popřípadě substituována jednou nebo více hydroxyskupinami; cykloalkylalkylskupinu s 5 až 8 atomy uhlíku, jejíž alkylová část je alfa-rozvětvená a obsahuje 2 až 5 atomů uhlíku; cykloalkylskupinu se

   3 až 8 atomy uhlíku nebo cykloalkenylskupinu s 5 až 8 atomy uhlíku, z nichž každá je popřípadě substituována methylskupinou nebo jednou nebo více hydroxyskupinami nebo jednou nebo více alkylskupinami s 1 až 4 atomy uhlíku nebo atomy halogenu; nebo tří- až šestičlenný heterocyklický kruh obsahující kyslík nebo síru, který může být nasycený nebo zcela nebo zčásti nenasycený a je popřípadě substituován jednou nebo více alkylskupinami s 1 až

   4 atomy uhlíku nebo atomy halogenu; nebo R-l představuje fenylskupinu, která je popřípadě substituována alespoň jedním substituentem zvoleným ze souboru sestávajícího z alkylskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku a alkylthioskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, atomů halogenu, hydroxyskupiny, trifluormethylskupiny a kyanoskupiny; nebo Rj může představovat skupinu obecného vzorce a kde

   X představuje kyslík, síru nebo skupinu -CH₂-;

   a, b, c a d představuje každý nezávisle číslo 0 až 2, přičemž součet a+b+c+dje menší nebo roven 5;

   představuje vodík nebo hydroxyskupinu;

   • · · · • · · · · · • · · · · · • · · ··· ···

   R₃ až R₅ představuje každý nezávisle vodík nebo skupinu CH₃ nebo CH₂CH₃;

   Rg představuje vodík nebo hydroxyskupinu;

   R₇ představuje vodík nebo skupinu CH₃ nebo CH₂CH₃;

   Rg představuje vodík nebo desosamin;

   R₉ představuje vodík nebo skupinu CH₃ nebo CH₂CH₃;

   R₁₀ představuje hydroxyskupinu, mykarosu (R₁₃ představuje vodík) nebo kladinosu (R₁₃ představuje skupinu CH₃) ,

   R_i;l představuje vodík; nebo ^Rio ^{= R}n ~ ^kY^siik; ^a

   R₁₂ představuje vodík nebo skupinu CH₃ nebo CH₂CH₃;

   nebo kterékoliv z výše definovaných sloučenin modifikované nahrazením jedné nebo více skupin -CHOH nebo -CHOŘ ketoskupinou;

   a jejich farmaceuticky vhodné soli.
2. 2. Erythromyciny obecného vzorce 2

   O

   Řl₂ (2)

   - 98 • · kde

   R₈ představuje vodík nebo skupinu vzorce

   R_lo představuje hydroxyskupinu nebo skupinu obecného vzorce

   R^_ představuje vodík, alkylskupinu s 1 až 8 atomy uhlíku, alkenylskupinu se 2 až 8 atomů uhlíku, alkinylskupinu se 2 až 8 atomy uhlíku, alkoxyalkyl- nebo alkylthioalkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku v každé z alkylových a alkoxylových skupin, přičemž kterákoliv z uvedených alkylových, alkoxylových, alkenylových nebo alkinylových skupin je popřípadě substituována jednou nebo více hydroxyskupinami nebo jedním nebo více atomy halogenu; cykloalkylskupinu se 3 až 8 atomy uhlíku nebo cykloalkenylskupinu s 5 až 8 atomy uhlíku, z nichž každá je popřípadě substituována methylskupinou nebo jednou nebo více alkylskupinami s 1 až 4 atomy uhlíku nebo atomy halogenu; nebo tří- až šestičlenný heterocyklický kruh obsahující kyslík nebo síru, • · · · ·· ·· ·· • · · · · · • · · · · · • · · ··· ··· • · · ··· · · _ 99 L.............

   který může být nasycený nebo zcela nebo zčásti nenasycený a je popřípadě substituován jednou nebo více alkylskupinami s 1 až 4 atomy uhlíku nebo atomy halogenu; nebo skupinu SR₁₄, kde R₁₄ představuje alkylskupinu s 1 až 8 atomy uhlíku, alkenylskupinu se 2 až 8 atomy uhlíku, alkinylskupinu se 2 až 8 atomy uhlíku, cykloalkylskupinu se 3 až 8 atomy uhlíku, cykloalkenylskupinu s 5 až 8 atomy uhlíku, fenylskupinu nebo substituovanou fenylskupinu, kde substituentem je alkylskupina s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupina s 1 až 4 atomy uhlíku, halogen nebo tří- až šestičlenný heterocyklický kruh obsahující kyslík nebo síru, který může být nasycený nebo zcela nebo zčásti nenasycený a je popřípadě substituován jednou nebo více alkylskupinami s 1 až 4 atomy uhlíku nebo atomy halogenu;

   R₂ představuje vodík nebo hydroxyskupinu;

   R₃ až R₅ představuje každý nezávisle vodík nebo skupinu CH₃ nebo CH₂CH₃;

   R₆ představuje vodík nebo hydroxyskupinu;

   R₇ představuje vodík nebo skupinu CH₃ nebo CH₂CH₃;

   Rg představuje vodík nebo desosamin;

   Rg představuje vodík nebo skupinu CH₃ nebo CH₂CH₃;

   R_lo představuje hydroxyskupinu, mykarosu (R₁₃ představuje vodík) nebo kladinosu (R₁₃ představuje skupinu ch₃),

   R_i;l představuje vodík; nebo

   - 100 ·• ·· ·· ·· • · * · · · · · • · · · · · * • · · · ··· ··· • · · · · • · · t · · · ·· ^Rio ^{= R}n ^{= k}y^slí^k'· ^a

   R₁₂ představuje vodík nebo skupinu CH₃ nebo CH₂CH₃;

   přičemž, když R₃ až R₅ představují CH₃, R_? představuje CH₃, R_g představuje CH₃ a R₁₂ představuje CH₃, potom R-^ nepředstavuje vodík nebo alkylskupinu s 1 atomem uhlíku;

   nebo kterékoliv z výše definovaných sloučenin modifikované nahrazením jedné nebo více skupin -CHOH nebo -CHOŘ ketoskupinou;

   a jejich farmaceuticky vhodné soli.
3. 3. Erythromyciny obecného vzorce 1 podle nároku 1, kde R-j_ představuje cykloalkylskupinu nebo cykloalkenylskupinu, vždy se 3 až 6 atomy uhlíku, která je popřípadě substituována jednou nebo více hydroxyskupinami nebo jednou nebo více alkylskupinami s 1 až 4 atomy uhlíku; a jejich farmaceuticky vhodné soli.
4. 4. Erythromyciny obecného vzorce 1 podle nároku 3, kde R_x přestavuje cyklopropylskupinu; a jejich farmaceuticky vhodné soli.
5. 5. Erythromyciny obecného vzorce 1 podle nároku 3, kde Rj přestavuje cyklobutylskupinu; a jejich farmaceuticky vhodné soli.
6. 6. Erythromyciny obecného vzorce l podle nároku 3, kde Rj přestavuje cyklopentylskupinu; a jejich farmaceuticky vhodné soli.
7. 7. Erythromyciny obecného vzorce 1 podle nároku 3, kde R₁ přestavuje cyklohexylskupinu; a jejich farmaceuticky vhodné soli.

   ·· · ·· · · • · · · · • » · · < · • · · · 9 * __ ίοι·° ·♦ ··· ♦· ·» • · ·

   9 9 ·

   999 999

   9 · f* ··
8. 8. Erythromyciny obecného vzorce 1 podle nároku 1, kde R^ přestavuje alfa-rozvětvenou alkyl-, alkenyl-, alkinyl-, alkoxyalkyl- nebo alkylthioalkylskupinu vždy se

   3 až 8 atomy uhlíku; a jejich farmaceuticky vhodné soli.
9. 9. Erythromyciny obecného vzorce 1 podle nároku 8, kde R^ přestavuje isopropylskupinu;a jejich farmaceuticky vhodné soli.
10. 10. Erythromyciny obecného vzorce 1 podle nároku 8, kde R^ přestavuje sek.butylskupinu; a jejich farmaceuticky vhodné soli.
11. 11. Erythromyciny obecného vzorce 1 podle nároku 8, kde Rj přestavuje 2-buten-2-ylskupinu, 2-penten-2-ylskupinu nebo 4-methyl-2-penten-2-ylskupinu; a jejich farmaceuticky vhodné soli.
12. 12. Erythromyciny obecného vzorce 1 podle nároku 8, kde R^ přestavuje 1-methylthioethylskupinu; a jejich farmaceuticky vhodné soli.
13. 13. Erythromyciny obecného vzorce 1 podle nároku 1, kde R-l přestavuje pěti- nebo šestičlenný heterocyklický kruh obsahující kyslík nebo síru, který je popřípadě substituován jednou nebo více hydroxyskupinami, alkylskupinami s 1 až 4 atomy uhlíku nebo atomy halogenu; a jejich farmaceuticky vhodné soli.
14. 14. Erythromyciny obecného vzorce 1 podle nároku 13, kde Rjl přestavuje 3-thienylskupinu; a jejich farmaceuticky vhodné soli.

    - 102 • · · · · · ·
15. 15. Erythromyciny obecného vzorce 1 podle nároku 13, kde R-]_ přestavuje 3-furylskupinu; a jejich farmaceuticky vhodné soli.
16. 16. Erythromyciny obecného vzorce 1 podle nároku 1, kde R.j_ přestavuje fenylskupinu; a jejich farmaceuticky vhodné soli.
17. 17. Erythromyciny obecného vzorce 1 podle nároku 1, kde R-j_ přestavuje skupinu obecného vzorce (a), kde a a b představuje vždy číslo 0, c a d představuje vždy číslo 1 a X představuje skupinu -CH₂-; a jejich farmaceuticky vhodné soli.
18. 18. Erythromyciny obecného vzorce 1 podle nároku 1, kde R-^ přestavuje skupinu obecného vzorce (a), kde a a b představuje vždy číslo 0, c představuje číslo 1, d představuje číslo 2 a X představuje skupinu -CH₂-; a jejich farmaceuticky vhodné soli.
19. 19. Erythromyciny obecného vzorce 1 podle nároku 1, kde R^ přestavuje skupinu obecného vzorce (a), kde a a b představuje vždy číslo 0, c a d představuje vždy číslo 1 a X představuje kyslík; a jejich farmaceuticky vhodné soli.
20. 20. Erythromyciny obecného vzorce 2 podle nároku 2, kde Rj přestavuje skupinu obecného vzorce SR₁₄, kde R₁₄ představuje methylskupinu nebo ethylskupinu; a jejich farmaceuticky vhodné soli.
21. 21. Erythromyciny obecného vzorce 2 podle nároku 2, kde R^^ přestavuje ethylskupinu, propylskupinu, butylskupinu, isopropylskupinu nebo sek.butylskupinu; a jejich farmaceuticky vhodné soli.

    103
22. 22. Erythromyciny obecného vzorce 2 podle nároku 2, kde R^ přestavuje l-(trifluormethyl)ethylskupinu; a jejich farmaceuticky vhodné soli.
23. 23. Způsob výroby erythromycinů obecného vzorce 1 podle nároku 1 nebo obecného vzorce 2 podle nároku 2, vyznačující se tím, že se fermentuje organismus schopný produkovat erythromycin za přítomnosti karboxylové kyseliny obecného vzorce R₁C0₂H, kde Rj má význam uvedený v nároku 1 nebo nároku 2 nebo její soli, esteru nebo amidu nebo oxidačního prekursoru, a izoluje se sloučenina obecného vzorce 1 nebo 2.
24. 24. Způsob podle nároku 23, vyznačující se t i m , že organismem je Saccharopolyspora erythraea popřípadě obsahující efektivně integrovaný plasmid schopný řídit biosyntézu erythromycinů obecného vzorce 1, kterýžto plasmid popřípadě obsahuje promotorový/aktivátorový gen PKS typu II.
25. 25. Způsob podle nároku 24, vyznačující se t í m , že organismus Saccaropolyspora erythraea je zvolen z kmenů NRRL 2338, 18643 nebo 21484 popřípadě obsahujících efektivně integrovaný plasmid schopný řídit biosyntézu erythromycinů obecného vzorce 1, kterýžto plasmid popřípadě obsahuje actl promotor a jeho rozpoznávací aktivátorový gen actll-orf4.
26. 26. Způsob podle nároku 25, vyznačující se t í m , že případným efektivně integrovaným plasmidem je pAVLD, pIGl, pND30, pCJR26, pCJR49, pC-AT12, pC-ATX nebo jiný podobný konstrukt.
27. 27. Způsob podle nároku 25, vyznačující se t í m , že organismem je S. erythraea ERMD1, S.

    • · · 9

    - 104 erythraea NRRL 2338/pIGl, S. erythraea NRRL 2338/pND30 nebo jiný podobný transformant.
28. 28. Farmaceutická kompozice, vyznačuj ící se t i m , že obsahuje terapeuticky účinné množství eryth romycinu podle nároku 1 nebo 2 v kombinaci s farmaceuticky vhodným nosičem.
29. 29. Způsob léčení bakteriální infekce nebo poruchy spojené s bakteriální infekcí nebo protozoální infekce u savců, ryb a ptáků, vyznačující se tím, že se těmto savcům, rybám nebo ptákům podá terapeuticky účinné množství erythromycinu podle nároku 1 nebo 2.
30. 30. Použití erythromycinu podle nároku 1 nebo 2 pro výrobu léčiva pro léčení bakteriálních infekcí u savců, ryb nebo ptáků.
31. 31. Použití erythromycinu podle nároku 1 nebo 2 pro zlepšení ukazatelů efektivnosti chovu, jako jsou hmotnostní přírůstek, efektivnost využití krmiv, dojivost atd. u savců, ryb nebo ptáků.