CZ473699A3

CZ473699A3 - Téměř čistý nebo rekombinantní polypeptid DCMP1 a DCMP2, fúzní protein, vazebná ■ sloučenina, nukleová kyselina, kódující DCMP1 nebo DCMP2, expresní vektor, hostitelská , buňka pro expresní vektor a způsob rekombinantní přípravy polypeptidu

Info

Publication number: CZ473699A3
Application number: CZ19994736A
Authority: CZ
Inventors: Jenny Valladeau; Odile Ravel; Elizabeth Esther Mary Bates; John Ford; Sem Saeland; Serge J. E. Lebecque
Original assignee: Schering Corporation
Priority date: 1998-07-08
Filing date: 1998-07-08
Publication date: 2000-08-16

Abstract

Nukleové kyseliny, které kódují různé buněčné proteiny u savců včetně primátů, činidla, která se k nim vztahují včetně specifických protilátek a purifikované proteiny. Způsoby použití těchto činidel a diagnostické soupravy. Tyto proteiny jsou membránové proteiny dendritických buněk (DCMP), které vykazují podobnost s lektiny a asialoglykoproteinovými receptory. Fúzní proteiny, obsahující zmíněné polypeptidy, expresní vektor, obsahující zmíněnou nukleovou kyselinu a jeho hostitelská buňka

Description

TÉMĚŘ ČISTÝ NEBO REKOMBINANTNÍ POLYPEPTID DCMP1 A DCMP2, FÚZNÍ PROTEIN, VAZEBNÁ SLOUČENINA, NUKLEOVÁ KYSELINA, KÓDUJÍCÍ DCMP1 NEBO DCMP2, EXPRESNÍ VEKTOR, HOSTITELSKÁ BUŇKA PRO EXPRESNÍ VEKTOR A ZPŮSOB REKOMBINANTNÍ PŘÍPRAVY POLYPEPTIDŮ.

Toto podání nárokuje prioritu podle patentové přihlášky Provisional U.S. Patent Application USSN 60/053080, podané 9. července 1997, která je zde začleněna jako odkaz.

Oblast techniky

Předmětný vynález se zabývá prostředky, které se týkají genů, nalezených např. v lymfocytech tj. buňkách, které mají určitou funkci v imunitním systému. Tyto geny jsou užitečnými ukazateli a mohou mít určitou funkci při regulaci vývoje, při diferenciaci a/nebo ve fyziologii savčího imunitního systému. Přihláška konkrétně poskytuje nukleové kyseliny, proteiny, protilátky a způsoby jejich použití.

Dosavadní stav techniky

Cirkulující složka savčího oběhového systému zahrnuje různé typy buněk včetně červených a bílých krvinek erytroidních a myeloidních buněčných linií. Viz. např. Rapaport (1987) Introduction to Hematology (2. vydání) Lippincott, Philadelphia, PA; Jandl (1987) Blood: Textbook of Hematology, Little, Brown a Co., Boston, MA a Paul (1993) Fundamental Immunology (3. vydání) Raven Press, N. Y.

Dendritické buňky (DC) jsou antigen-zpracovávající nebo antigen-prezentující buňky a byly nalezeny ve všech tkáních těla. Viz. Steinman (1991) Annual Review of Immunology 9:271 ' až 296 a Banchereau a Schmitt (1994) Dendritic Cells in Fundamental and Clinical Immunology.

i < Plenům Press, NY. Tyto DC mohou být klasifikovány do různých kategorií včetně:

intersticiálních dendritických buněk srdce, ledviny, střeva a plíce, Langerhansových buněk v kůži a mukózních membránách; zapadajících dendritických buněk v brzlíkové dřeni a sekundární lymfoidní tkáni a dendritických buněk krve a lymfy. Ačkoliv dendritické buňky v každé z těchto částí jsou CD45+ leukocyty, které očividně vznikají v kostní dřeni, mohou 'vykazovat rozdíly, které souvisí se stádiem zralosti a mikroprostředím.

Tyto dendritické buňky účinně zpracovávají a prezentují antigeny např. T buňkám. Stimulují odezvy naivních a paměťových T buněk.

• · • ·

Primární a sekundární folikuly B-buněk obsahují foíikulámí dendritické buňky, které zachycují a dlouhou dobu zadržují neporušený antigen ve formě imunitních komplexů. Tyto dendritické buňky prezentují nativní antigen B buňkám a jsou pravděpodobně zahrnuty do afinitního zrání protilátek, do vytváření imunitní paměti a do udržování humorálních imunitních odpovědí.

Monocyty jsou fagocyty, které patří do mononukleámího fagocytového systému a účastní se cirkulace. Viz. Roitt Encvklopedia of Immunologv Academie Press, San Diego. Tyto buňky vznikají v kostní dřeni a jakmile se diferencují, zůstávají ve dřeni pouze krátkou dobu. Poté vstupují do cirkulace a mohou zde zůstat relativně dlouho např. několik dní. Monocyty mohou vstupovat do tkání a tělních dutin procesem, označovaným jako diapedéze, kde se diferencují na makrofágy a eventuálně dendritické buňky. Jako odezva na zánět se může počet monocytů v oběhu zdvojnásobit a mnoho z těchto zvýšených monocytů prochází diapedézou do místa zánětu.

Jako prezentace antigenů jsou označovány případy, kdy je proteinový antigen buňkou zachycen, zpracován antigen-prezentujícími buňkami (APC) a poté rozpoznán, čímž je zahájena imunitní odpověď. Jako nejaktivnější antigen-prezentující buňky byly charakterizovány makrofágy, které jsou přímými vývojovými produkty monocytů, dendritické buňky a určité B buňky.

Makrofágy byly zjištěny ve většině tkání a jsou vysoce aktivní při internalizaci různých proteinových antigenů a mikroorganismů. Mají vysoce vyvinutou endocytickou aktivitu a vylučují mnoho produktů, důležitých při zahájení imunitní odpovědi. Z tohoto důvodu se předpokládá, že mnoho genů, exprimovaných monocyty nebo indukovaných v důsledku aktivace monocytů, je pravděpodobně důležitých při porozuměmí, zpracování a prezentaci antigenů nebo při regulaci vznikající imunitní odpovědi.

Dendritické buňky a monocyty jsou však pokud jde o proteiny, které exprimují, ale i z hlediska mnoha jejich funkcí a mechanismů působení včetně jejich aktivovaných stavů, málo charakterizované. Konkrétně procesy a mechanismy, týkající se zahájení imunitní odpovědi, včetně zpracování a prezentace antigenů, zůstávají nejasné. Neznalost strukturálních, biologických a fyziologických vlastností těchto buněk omezuje jejich pochopení. Stavy, kdy dochází k neobvyklým regulacím, vývoji nebo fyziologii antigen-prezentujících buněk, zůstávají tedy nekontrolovatelné.

Podstata vynálezu

Předmětný vynález je zčásti založen na objevu různých genů pro membránové proteiny savčích dendritických buněk (Dendritic Cell Membrane Protein, DCMP), což je doloženo specifickými DCMP1 a DCMP2 provedeními.

Údaje, týkající se distribuce, naznačují širší buněčnou distribuci a data, týkající se £ struktury, naznačuji některou funkci. DCMP1 vykazuje podobnost se třídou lektinů a asialoglykoproteinovými receptory. Popsaná DCMP2 provedení vykazují významnou sekvenční podobnost s asialoglykoproteinovým receptorem makrofágové buňky. Předmětný vynález zahrnuje agonisty a antagonisty genových produktů např. mutace (muteiny) přirozených * sekvencí, fuzní proteiny, chemické mimetiky, protilátky a další strukturální a funkční analoga.

Předmětný vynález je také zaměřen na izolované geny, kódující proteiny předmětného vynálezu. Rovněž jsou poskytována různá použití těchto odlišných proteinových prostředků nebo prostředků, obsahujících nukleové kyseliny.

V konkrétních provedeních poskytuje předmětný vynález vazebnou sloučeninu, obsahující vazebné místo pro protilátku, která se specificky váže na protein DCMP1 nebo na polypeptid, vybraný z: Gly Val Ser Glu Leu Gin Glu His Thr Thr Gin Lys Ala His Leu Gly His

Cys Pro His Cys Pro Ser Val Cys Val Pro (zbytky 118 až 144 SEQ ID č: 4); Gin Val Ala Thr

Leu Asn Asn Asn Ala Ser Thr Glu Gly Thr Cys Cys (zbytky 166 až 181 SEQ ID č. 4) nebo Trp

Lys Pro Gly Gin Pro Asp Asn Trp Gin Gly His Gly Leu Gly (zbytky 263 až 277 SEQ ID č: 4).

V upřednostňovaných provedeních je ve vazebné sloučenině vazebné místo pro protilátku:

specificky imunoreaktivní s proteinem o SEQ ID č: 2 nebo 8, specificky imunoreaktivní s proteinem, který je složen ze zbytků 118 až 144 SEQ ID č: 4, vytvořené proti purifikovanému nebo rekombinantně připravenému lidskému proteinu DCMP1, vytvořené proti purifikovanému nebo rekombinantně připravenému lidskému proteinu, obsahujícímu sekvenci, složenou ze zbytků 118 až 144 ze SEQ ID č: 4, v monoklonální protilátce, Fab nebo F(ab)2 nebo vazebná t

sloučenina je: detekovatelně označená, sterilní nebo v pufrováném prostředku.

Předmětný vynález zahrnuje způsoby, používající tyto vazebné sloučeniny. Tyto způsoby zahrnují kontakt vazebné sloučeniny s biologickým vzorkem, který obsahuje antigen s cílem vytvořit komplex vazebná sloučenina: antigen. V určitých provedeních je biologický vzorek lidský a vazebnou sloučeninou je protilátka. Předmětný vynález rovněž poskytuje soupravu pro detekci, obsahující tuto vazebnou sloučeninu a instruktážní materiál, týkající se použití této vazebné sloučeniny pro detekcí nebo složku, poskytující separaci vazebné sloučeniny.

• ·

Předmětný vynález také poskytuje téměř čistý nebo izolovaný polypeptid, který se specificky váže na tyto vazebné sloučeniny. V různých provedeních polypeptid: obsahuje alespoň fragment, obsahující minimálně 14 aminokyselinových zbytků proteinu DCMP1 z primáta; obsahuje alespoň 14 aminokyselinových zbytků z řetězce aminokyselin 118 až 144 v SEQ ID č: 4; je rozpustný polypeptid; je detekovatelně označený; je ve formě sterilního prostředku; je pufrovaný prostředek; váže se na zbytek kyseliny sialové; je rekombinantnČ vyrobený nebo má přirozeně se vyskytující polypeptidovou sekvenci.

Jsou poskytována provedení nukleových kyselin včetně nukleové kyseliny, kódující výše uvedený polypeptid a to tehdy, jestliže je purifikována. Nukleová kyselina často: obsahuje alespoň 30 nukleotidů kódujícího podílu SEQ ID č: 1 nebo 7; obsahuje alespoň 30 nukleotidů * z nukleotidů 608 až 688 SEQ ID č: 3 nebo obsahuje alespoň 30 nukleotidů z nukleotidů 752 až

799 SEQ ID č: 3 nebo může obsahovat inzert, který selektivně hybridizuje snukleovou kyselinou, kódující výše definovaný polypeptid. Předmětný vynález rovněž poskytuje buňku, transfektovanou touto nukleovou kyselinou, která se např. skládá z částí SEQ ID č: 1,7, které kódují protein nebo z odpovídajících částí SEQ ID č: 3.

Předmětný vynález poskytuje způsoby, používající alespoň jedno vlákno těchto nukleových kyselin pro vytvoření duplexní nukleové kyseliny. Tyto způsoby zahrnují kontakt tohoto vlákna s komplementárním řetězcem, schopným specifického hybridizování, který je obsažen ve vzorku. V upřednostňovaných provedeních umožňuje tento způsob detekci duplexu nebo umožňuje histologickou lokalizaci duplexu.

Předmětný vynález také poskytuje způsoby použití popsaných vazebných prostředků, kde je zahrnut krok, během kterého dochází ke kontaktu vazebného prostředku se vzorkem, s cílem vytvořit komplex vazebný prostředek:antigen. V upřednostňovaných provedeních je vzorek biologický vzorek včetně tělní tekutiny; antigen je na buňce nebo antigen je dále purifikován.

Předmětný vynález dále zahrnuje způsoby použití těchto polypeptidů, zahrnující kontakt polypeptidů se vzorkem pro vytvoření komplexu vazebný prostředek.polypeptid.

á

V upřednostňovaných provedeních je polypeptid dále purifikován.

Jiný poskytovaný způsob je modulace fyziologie nebo funkce dendritické buňky, zahrnující krok, kdy dochází ke kontaktu buňky s popsaným vazebným prostředkem, s popsaným proteinem DCMP1 nebo s popsaným polypeptidem. Výsledkem funkce může být zahájení nebo pokračování imunitní odpovědi. Kontakt je většinou v kombinaci s antigenem, včetně buněčného povrchu, s MHC antigenem Třídy I nebo MHC antigenem Třídy Π.

·· ···· · · · · ·* ··· ···· · ···· · · · · • ·

Podrobný popis

Všechny zde citované odkazy jsou zahrnuty jako odkazy a to ve stejném rozsahu jako kdyby bylo u každé individuální publikace nebo patentové přihlášky specificky a individuálně označeno, aby byla zahrnuta jako odkaz.

I. Obecně

Předmětný vynález poskytuje DNA sekvence, kódující savčí proteiny, exprimované na dendritických buňkách (DC). Souhmý článek, týkající se dendritických buněk viz. Steinman (1991) Annual Review of Immunology 9:271 až 296 a Banchereau a Schmitt (1994) Dendritic Cells in Fundamental and Clinical Immunology, Plenům Press, NY. Tyto proteiny jsou označeny jako proteiny dendritických buněk (DC proteiny), protože jsou nalezeny na těchto buňkách a zdá se, že existuje určitá specifita v jejich expresi.

Specifická primátová např. lidská provedení těchto proteinů jsou poskytnuta níže. Rovněž existují protějšky u hlodavců např. myší. Níže uvedené popisy jsou pro účely příkladů zaměřeny na lidské DC geny, ale mimoto je možno je aplikovat na strukturálně např. sekvenčně podobná provedení z jiných zdrojů nebo savčích druhů včetně polymorfních nebo individuálních variant. Tyto budou zahrnovat např. proteiny, které vykazují relativně málo změn v sekvenci např. méně než asi 5 % a počet substitucí např. méně než 20, většinou méně než 15, výhodněji méně než 10 a nejvýhodněji méně než 5 substitucí včetně 4,3,2 nebo 1. Tyto také zahrnují verze, jejichž celá délka je zkrácena, jak je popsáno, a fuzní proteiny, obsahující podstatné úseky těchto sekvencí.

II. Definice

Termín „vazebný prostředek“ označuje molekuly, které se specificky vážou na tyto DC proteiny např. prostřednictvím interakce antigen-protilátka. Jiné sloučeniny, např. proteiny, se mohou rovněž specificky spojovat s příslušným proteinem. Většinou bude specifické spojení v podobě přirozené fyziologicky významné kovalentní nebo nekovalentní interakce proteinprotein a může zahrnovat členy multiproteinového komplexu včetně nosičových sloučenin nebo dimerizačních partnerů. Molekula může být polymer nebo chemické činidlo. Funkční analog může být protein se strukturálními modifikacemi nebo to může být zcela nepodobná molekula, např. taková, která má takový tvar molekuly, který interaguje s odpovídajícími interakčními determinantami. Varianty mohou sloužit jako agonisty nebo antagonisty proteinu viz např.

·· ··«· * · «· ·· ·· ··· ·«·· ··«« ···· · · · * · · · • ···· ······ • ···· ···« «······ ·· «··· ·· · ·

Goodman a kol. (1990) Goodman and Gilmans: The Pharmacological Bases of Therapeutics (8. vydání) Pergamon Press, Tarrytown, N.Y.

Termín „komplex vazebné činidlo.DC protein“, jak je zde používán, označuje komplex vazebného činidla a DC proteinu. Specifická vazba vazebného činidla znamená to, že vazebné činidlo má specifické vazebné místo, které rozpozná místo na poslušném DC proteinu. Např. protilátky, vyrobené proti DC proteinu, které rozpoznávající epitop na DC proteinu, jsou schopny specifickým navázáním vytvořit komplex protilátka:DC protein. Tvorba komplexu vazebné činidlo:DC protein většinou umožňuje měření tohoto DC proteinu ve směsi dalších )

proteinů a biologických látek. Termín „komplex protilátka.DC protein“ označuje komplex vazebné činidlo:DC protein, ve kterém je vazebným činidlem protilátka. Protilátka může být monoklonální, polyklonální nebo dokonce fragment protilátky, který váže antigen např. včetně fragmentů Fv, Fab nebo Fab2.

„Homologní“ sekvence nukleových kyselin, jsou-li porovnány, vykazují významnou podobnost. Standardní postupy pro zjišťování homologii nukleových kyselin zahrnují buď stanovení homologie pomocí srovnávání sekvencí a/nebo fylogenetických souvislostí, což je obecně používané v této oblasti techniky nebo jsou založeny na hybridizaci. Oba postupy srovnávání sekvencí a hybridizace jsou detailněji popsány níže.

„Izolovaná“ nukleová kyselina je nukleová kyselina např. RNA, DNA nebo směsný polymer, která je téměř separovaná od ostatních složek, které ji běžně doprovází např. proteiny a postranní genomové sekvence z původních druhů. Termín zahrnuje sekvenci nukleové kyseliny, která byla odstraněna z prostředí, kde se vyskytuje přirozeně a zahrnuje rekombinantní nebo klonované DNA izoláty, chemicky syntetizovaná analoga nebo analoga, biologicky syntetizovaná heterologními systémy. Téměř čistá molekula zahrnuje izolované formy molekuly. Obecně bude izolovaná nukleová kyselina homogenní prostředek molekul, ale v některých provedeních bude obsahovat minoritní heterogenitu. Tato heterogenita je většinou zjištěna na koncích polymeru nebo v podílech, které nejsou podstatné pro žádoucí biologickou íunkci nebo aktivitu.

Zde použitý termín „DCMP1 protein“ by měl, v případě, že je použit v souvislosti s proteinem, zahrnovat protein, mající takové aminokyselinové sekvence jako jsou ukázány v SEQ ID č: 2 nebo 8 nebo obsahující významný fragment tohoto proteinu. Tzn. polypeptid, který interaguje s příslušnými specifickými vazebnými komponentami DCMP1 proteinu. Tyto vazebné komponenty např. protilátky, se většinou vážou na DCMP1 protein s vysokou afinitou např. alespoň asi 100 nM, obvykle lepší než asi 30 nM, výhodněji lepší než asi 10 nM a nej výhodněji lepší než asi 3 nM.

• · ···· ·· · · ·· ·· • ♦ * · · · · · · · · ···· · · · · ·· · • ···· ······ • ···· ···· ······· · · ···· ·· · ·

Termín „DCMP2 formy“ označuje sekvence, poskytované v SEQ ID č: 4 a 10. V SEQ ID č: 3 a 4 byly poskytnuty nukleotid a odpovídající aminokyselinová sekvence proteinu primáta, např. lidského, který je příbuzný se členy lektin/asialoglykoproteinové rodiny, je označen

DCMP2 a je izolován z knihovny dendritických buněk. Dlouhá forma je stejná jako ta forma, kteráje uvedena, zatímco krátká forma postrádá sekvenci, odpovídající zbytkům 118 až 144.

Krátká forma se rovněž může lišit v nukleotidu 1064. To je podobné jako u monocytové formy j ASGPR, lišící se inzercí mezi zbytky 173 a 174 a zbytkem 270, viz tab. 1 a inzertem sekvence, kódující GEE, mezi nukleotidy 775 až 776. Jiná variantní forma je popsána v SEQ ID č: 9 a 10.

» _t Zde používaný termín „polypeptid“ nebo „protein“ zahrnuje významný fragment nebo úsek zmiňovaného proteinu a zahrnuje řetězec aminokyselinových zbytků, který se skládá • alespoň z 8 aminokyselin, obecně alespoň z 10 aminokyselin, obecněji alespoň z 12 aminokyselin, často alespoň ze 14 aminokyselin, častěji alespoň ze 16 aminokyselin, typicky alespoň z 18 aminokyselin, většinou alespoň ze 20 aminokyselin, obvykle alespoň z 22 aminokyselin, obvykleji alespoň z 24 aminokyselin, výhodněji alespoň z 26 aminokyselin, nej výhodněji alespoň z 28 aminokyselin a v konkrétně upřednostňovaných provedeních alespoň ze 30 nebo více aminokyselin např. 35,40, 45, 50, 60, 70 atd..

Upřednostňovaná provedení vykazují pluralitu vzdálených např. nepřekrývajících se, úseků o dané délce. Pluralita bude většinou alespoň dvě, obvykleji alespoň tři a výhodněji 5, 7 nebo ještě větší. Zatímco jsou poskytovány minimální délky, mohu existovat delší úseky různých velikostí např. jeden o délce 7 a dva o délce 12. Úseky se mohou vztahovat buď k peptidům nebo k oligonukleotidům.

„Rekombinantní“ nukleová kyselina je většinou definována svou strukturou. Může to být nukleová kyselina, připravená vytvořením sekvence, obsahující fůzi dvou fragmentů, které jeden s druhým přirozeně nesousedí. Tato nukleová kyselina má sloužit jako možnost, jak vyloučit produkty přírody např. přirozeně se vyskytující mutantní formy.

f Určité formy jsou definovány způsobem výroby. Např. v souvislosti s produktem, vyrobeným určitým způsobem, zahrnuje tento způsob použití rekombinantních technik pro nukleové kyseliny, např. lidský zásah do nukleotidové sekvence, většinou výběr nebo výrobu.

Předmětný vynález tedy obsahuje např. nukleové kyseliny, obsahující sekvence, odvozené pomocí syntetických oligonukleotidů a produkty, připravené transformováním buněk vektorem, který se přirozeně nevyskytuje a který kóduje tyto proteiny. Toto se často dělá proto, aby byl nahrazen kodón u redundantního kodónu, který kóduje stejnou nebo konzervativní aminokyselinu, zatímco typicky je to zajišťováno začleněním nebo odstraněním sekvenčního rozpoznávacího místa, např. pro restrikční enzymy. Eventuálně je toto prováděno proto, aby byly ··· ···· · · · · ···· · · · · · · · • ···· ······ • · · · · ···· «······ · · ···· · · ·· spojeny úseky nukleových kyselin žádoucích funkcí s cílem vytvořit jediný genetický celek, obsahující žádoucí kombinaci funkcí, kterou nelze nalézt v běžně dostupných přirozených formách. Cílem těchto doplňkových manipulací jsou často rozpoznávací místa pro restrikční enzymy, ale úpravou mohou být začleněny další místně specifické cíle např. promotory, replikační místa pro DNA, regulační sekvence, kontrolní sekvence nebo další užitečné části např. segmenty primeru. Podobný přístup je určen pro rekombinantní např. fuzní polypeptid.

| Specificky zahrnuty jsou syntetické nukleové kyseliny, které v důsledku redundance genetického kódu, kódují polypeptidy, podobné fragmentům těchto antigenů a fuze sekvencí, pocházejících , z různých variant odlišných druhů.

„Rozpustnost“ je vyjádřena sedimentací, měřenou v jednotkách Svedberg, které jsou • měřítkem rychlosti sedimentace molekuly za konkrétních podmínek. Stanovení rychlosti sedimentace je klasicky prováděno v analytické ultracentrifuze, ale nyní je většinou prováděno ve standartní ultracentrifuze. Viz. Freifelder (1982) Physical Biochemistry (2.vydání) W.H. Freeman a Co., San Francisco, CA a Cantor a Schimmel (1980) Biophysical Chemistry části 1 až 3, W.H. Freeman a Co., San Francisco, CA. Jako hrubé stanovení je použit postup, kdy je vzorek, obsahující rozpustný polypeptid, odstředěn ve standartní ultracentrifuze při asi 50 000 rpm po dobu asi 10 min., přičemž rozpustné molekuly budou zůstávat v supematantu. Pro rozpustnou částici nebo polypeptid budou hodnoty typicky menší než 30 S, většinou menší než asi 15 S, obvykle menší než asi 10 S, obvykleji menší než asi 6 S a v konkrétních provedeních výhodněji menší než asi 4 S a nejvýhodněji menší než asi 3 S. Rozpustnost polypeptidu nebo fragmentu závisí na prostředí a na polypeptidu. Rozpustnost polypeptidu zhoršuje mnoho parametrů včetně teploty, elektrolytického prostředí, velikosti a molekulových charakteristik polypeptidu a povahy rozpouštědla. Teplota, při které je polypeptid používán, se většinou pohybuje v rozmezí od 4 °C do 65 °C. Obvykle je používaná teplota vyšší než asi 18 °C a obvykleji vyšší než asi 22 °C. Pro diagnostické účely bude teplota obvykle okolo teploty *

místnosti nebo vyšší, ale bude nižší než denaturační teplota jednotlivých součástí stanovení. Pro terapeutické účely bude teplota obvykle stejná jako teplota těla, většinou okolo 37 °C pro lidi, ale v určitých situacích může být teplota zvýšena nebo snížena in šitu nebo in vitro.

Velikost a struktura polypeptidu by obecně měla být stejná jako struktura v téměř stabilním fyziologickém aktivním stavu a obvykle nikoliv v denaturovaném stavu. Polypeptid může být spojen např. z důvodu rozpustnosti s dalšími polypeptidy za vzniku kvarterní struktury nebo může být spojen s lipidy nebo detergenty, čímž je přiblížen charakter interakcí, existujících v přirozené lipidové dvojvrstě.

·· ·«·· ·· ·· ·· ··

Q · · · ···· ···· ⁷ ···· ·· · · · · · • ···· ······ ········· ······· « · ···· ·· ··

Rozpouštědlo bude obvykle biologicky přijatelný pufr takového typu, který je používán pro ochranu biologických aktivit a bude obvykle podobný fyziologickému roztoku. Rozpouštědlo bude mít obvykle neutrální pH, většinou mezi 5 až 10 a výhodněji asi 7,5. V některých případech bude přidán detergent, většinou buď slabý nedenaturující detergent např. CHS (cholesterylhemisukcinát) nebo CHAPS (3-([3-cholamidopropyl]dimetyl-amonio)-lpropansulfonát) nebo v dostatečně nízké koncentraci detergentu. Toto je nezbytné proto, aby se £ zabránilo významnému narušení strukturálních nebo fyziologických vlastností proteinu.

„Téměř čistý“ většinou znamená to, že protein je izolován od ostatních kontaminujících , proteinů, nukleových kyselin nebo dalších biologických materiálů, pocházejících z organismu, který byl původním zdrojem. Čistota nebo „izolace“ může být stanovena standartními způsoby, * většinou na základě velikosti a běžně se bude pohybovat okolo alespoň 50 %, běžněji alespoň asi %, obecně alespoň asi 70 %, obecněji alespoň asi 80 %, často alespoň asi 85 %, častěji alespoň asi 90 %, výhodněji alespoň asi 95 %, nejvýhodněji alespoň asi 98 % a ve většině upřednostňovaných provedeních bude čistota alespoň 99 %. Často jsou přidávány nosiče nebo pomocné látky nebo formulace může být sterilní nebo může obsahovat složky pufru.

„Podstatná podobnost“ sekvencí nukleových kyselin v souvislosti s jejich porovnáváním znamená, že buď úseky nebo jejich komplementární vlákna, jsou-li porovnána a v případě, že jsou optimálně srovnány, s odpovídajícími nukleotidovými inzercemi a delecemi, mají identických alespoň asi 50 % nukleotidů, obecně alespoň 56 %, obecněji alespoň 59 %, běžně alespoň 62 %, běžněji alespoň 65 %, často alespoň 68 %, častěji alespoň 71 %, typicky alespoň 74 %, většinou alespoň 77 %, obvykle alespoň 80 %, obvykleji alespoň asi 85 %, výhodněji alespoň asi 90 %, nejvýhodněji alespoň asi 95 až 98 % nebo více a v konkrétních provedeních více než asi 99 % nukleotidů.

Podstatná podobnost existuje také v případě, že budou za selektivních hybridizačních podmínek hybridizovat úseky s řetězcem nebo jeho komplementem, většinou za použití sekvence, odvozené od SEQ Π) c: 1 nebo 7 nebo odpovídajících částí 3 a 9. Selektivní hybridizace se většinou bude vyskytovat tehdy, jestliže je zde alespoň asi 55 % podobnost v řetězci alespoň asi 30 nukleotidů, výhodně alespoň asi 65 % podobnost v řetězci alespoň asi 25 nukleotidů, výhodněji alespoň asi 75 % podobnost a nej výhodněji alespoň asi 90 % podobnost v řetězci asi 20 nukleotidů. Viz. Kanehisa (1984) Nuc. Acids Res. 12:203 až 213. Délka řetězce, kde je porovnávána podobnost, jak je popsáno, může být delší a v určitých provedeních bude v rámci řetězce alespoň asi 17 nukleotidů, obvykle alespoň asi 20 nukleotidů, obvykleji alespoň asi 24 nukleotidů, typicky alespoň asi 28 nukleotidů, většinou alespoň asi 40 nukleotidů, výhodněji • · • · alespoň asi 50 nukleotidů a nejvýhodněji alespoň asi 75 až 100 nebo více nukleotidů. Měřítko pro srovnávání DCMP1 neodpovídá měřítku pro DCMP2 provedení.

„Přísně regulované (stringentní) podmínky“, vztahující se k homologií nebo podstatné podobnosti v souvislosti s hybridizaci, budou přísně regulované kombinované podmínky, zahrnující sůl, teplotu, organická rozpouštědla a ostatní parametry, většinou ty, které jsou v hybridizačních reakcích kontrolovány. Kombinace parametrů je důležitější než jakýkoliv jednotlivý parametr. Viz. např. Wetmur a Davidson (1968) J, Mol. Biol, 31:349 až 370. Próba nukleové kyseliny, která se za přísně regulovaných podmínek váže na cílovou nukleovou kyselinu, je pro zmíněnou cílovou nukleovou kyselinu specifická. Tato próba je většinou delší než 11 nukleotidů a je v oblasti, specifikované sekvencí próby, dostatečně komplementární k cílové nukleové kyselině nebo je s ní identická, což je třeba proto, aby se cíl za přesných hybridizačních podmínek navázal.

Protějškové DCMP proteiny z jiných savčích druhů mohou být klonovány a izolovány mezidruhovou hybridizaci velmi podobných druhů. Víz např. níže. Protože podobnost mezi vzdáleně příbuznými druhy může být relativně nízká, je hybridizace relativně velmi blízkých druhů účelná. Příprava preparátu protilátky, který vykazuje nižší specifitu vůči druhu, může být užitečná při expresi při klonování.

Fráze „specificky se váže na protilátku“ nebo „specificky imunoreaktivní s“ znamená, v případě, že se jedná o protein nebo peptid, vazebnou reakci, která blíže určuje přítomnost proteinu za přítomnosti heterogenní populace proteinů a dalších biogických látek. Za podmínek, které jsou dány pro určité imunostanovení, se tedy specifikované protilátky vážou na konkrétní protein, zatímco na jiné proteiny ve vzorku se nijak podstatně nevážou. Specifická vazba na protilátku za těchto podmínek vyžaduje takovou protilátku, která vykazuje specifitu vůči konkrétnímu proteinu. Např. mohou být vybrány protilátky, připravené proti imunogenu, kterým je lidský DCMP1 protein s aminokyselinovou sekvencí uvedenou v SEQ ID č: 2 nebo 8 proto, aby byly získány protilátky, specificky imunoreaktivní s tímto DCMP proteinem a nikoliv s jinými proteiny. Tyto protilátky rozpoznají proteiny, vykazující vysokou podobnost s homologní m lidským DCMP1 proteinem.

III. Nukleové kyseliny

Tyto geny pro DCMP jsou selektivně exprimovány na dendritických buňkách. Upřednostňovaná provedení, jak jsou odhalena, budou užitečná ve standartních postupech pro izolaci genů z dalších druhů např. teplokrevných zvířat jako jsou ptáci a savci. Křížová • · hybridizace umožňuje izolaci podobných proteinů z různých jedinců, kmenů nebo druhů. Je dostupná řada různých přístupů jak úspěšně izolovat vhodný klon nukleové kyseliny, které jsou založeny na zde poskytnutých informacích. Studie, vycházející z hybridizace pomocí Southern blotu, by za vhodných hybridizačních podmínek měly identifikovat homologní geny v dalších druzích.

Purifikovaný protein nebo definované peptidy jsou užitečné pro vytvoření protilátek standartními způsoby, které jsou popsány níže. Aby byly vytvořeny polyklonální nebo monoklonální protilátky mohou být imunitnímu systému prezentovány syntetické peptidy nebo purifikovaný protein. Viz např. Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene, NY a Harlow a Lané (1989) Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, NY, které jsou zde začleněny jako odkaz. DCMP antigenový vazebný prostředek může být také užitečný jako specifické vazebné činidlo a výhodou může být specifita jeho vazby např. při purifikaci DCMP proteinu.

Specifický vazebný prostředek může být použit pro testování expresní knihovny, vytvořené z linie buněk, která exprimuje příslušný DCMP protein. Je dostupná řada způsobů testování např. standartní detekování povrchově exprimovaného ligandu nebo pomocí afinitní techniky („panning“). Rovněž může být provedeno testování intracelulární exprese pomocí různých detekčních nebo imunofluorescenčních postupů. Vazebné prostředky mohou být použity pro afinitní purifikaci nebo vytřídění buněk, exprimujících antigen.

Tabulka 1: Seřazení primátových např. lidských členů lektin/ASGPR rodiny. ASGPRhl a ASGPRhž jsou jaterní asialoglykoproteinové receptory (viz SEQ ID č: 5 a 6); ASGPRm je ASGPR, odvozený od makrofága; DCMP2 má krátkou, dlouhou a variantní formu, SEQ ID č: 4 a 10; DCMP1 je uveden v SEQ ID č: 2 a 8).

ASGPRhl

ASGPRh2

ASGPRm

DCMP2B

DCMP21

DCMP2v

DCMP1 feature

MTKE. . YQDLQHLDNEESDHHQLRKGPPPPQPLLQRLCSGP................RLLLLSLG

MAKD . . FQDIQQLSSEENDHP . FHQGPPPAQPIAQRLCSMV................CFSLLALS

MTRT. . YENFQYLENKVKVQG. FKNGPLPLQSLLQRLRSGP................CHLLLSLG

MTRT. . YENFQYLENKVKVQG . FKNGPLPLQS.................................

MTSEITYAEVR...........FKNEFKSSGINTASSAASKERTAPHKSNTGFPKLLCASLLIFF **** +++++

ASGPRhl LSLLLLVWCVIGS . QNSQLQEELRGLRETFSNFTASTEAQVKGLSTQGGNVGRKMKSLESQLE.

« · · 4 • · ·

ASGPRh2

ASGPRm

DCMP2E

DCMP21

DCMP2v

DCMP1 feature

ASGPRhl

ASGPRH2

ASGPRm DCMP2G DCMP21 DCMP2v

DCMP1 feature

ASGPRhl

ASGPRh2

ASGPRm

DCMP2S

DCMP21

DCMP2v

DCMP1 feature

ASGPRhl

ASGPRh2

ASGPRm DCMP2E DCMP21 DCMP2v

DCMP1 feature

ASGPRhl

ASGPRh2

ASGPRm DCMP2E DCMP21 DCMP2v

DCMP1 feature

FNILLLWICVTGS .QSAQLQAELRSLKEAFSNFSSSTLTEVQAISTHGGSVGDKITSLGAKLE . LGLLLLVIICWG. FQNSKFQRDLVTLRTDFSNFTSNTVAEIQALTSQGSSLEETIASLKAEVEG LGLLLLVIICWG. FQNSKFQRDLVTLRTDFSNFTSNTVAEIQALTSQGSSLEETIASLKAEVEG LGLLLLVIICWG. FQNSKFQRDLVTLRTDFSNFTSNTVAEIQALTSQGSSLEETIASLKAEVEG . . LLLLVIICWG. FQNSKFQRDLVTLRTDFSNFTSNTVAEIQALTSQGSSLEETIASLKAEVEG LLLAISFFIAFVIFFQKYS . Q. . LLEKKTT. KELVHTTLE.... CVKKNMPVEETAWS.......

. KQQK.........................DLSEDHSSLLLHVKQFVSDLRSLSCQMAALQGNGS

- KQQQ.........................DLKADHDALLFHLKHFPVDLRFVACQMELLHSNGS

FKQERQA...........................VHSEMLLRVQQLVQDLKKLTCQVATLNNNGE

FKQERQA...........................VHSEMLLRVQQLVQDLKKLTCQVATLNNN. .

FKQERQAGVSELQEHTTQKAHLGHCPHCPS VCVPVHSEMLLRVQQLVQDLKKLTCQVATLNNN. . FKQERQA...........................VHSEMLLRVQQLVQDLKKLTCQVATLNNNGE

ER. . . .TCCPVNWVEHERSCYWFSRSGKAWADADNYCRLEDAHLVWTSWEEQKFVQHHIGPVNT QR. . . .TCCPVNWVEHQGSCYWFSHSGKAWAEAEKYCQLENAHLWINSWEEQKFIVQHTNPFNT EASTEGTCCPVNWVEHQDSCYWFSHSGMSWAEAEKYCQLKNAHLWINSREEQNFVQKYLGSAYT .ASTEGTCCPVNWVEHQDSCYWFSHSGMSWAEAEKYCQLKNAHLWINSREEQNFVQKYLGSAYT .ASTEGTCCPVNWVEHQDSCYWFSHSGMSWAEAEKYCQLKNAHLWINSREEQNFVQKYLGSAYT EASTEGTCCPVNWVEHQDSCYWFSHSGMSWAEAEKYCQLKNAHLWINSREEQNFVQKYLGSAYT .......CCPXNWKSFSSNCYFISTESASWQDSEKDCARMEAHLLVINTQEEQDFIFQNLQEESA

W.MGLHDQNGP. . WKWVDGTDYETGFKNWRPEQPDDWYGHGLGGGEDCA. .HFTDDGR WNDD

W.IGLTDSDGS. . WKWVDGTDYRHNYKNWAVTQPDNWHGHELGGSEDCV. .EVQPDGR. . .WNDD

W.MGLSDPEGA. . WKWVDGTDYATGFQNWKPGQPDDWQGHGLGGGEDCA. .HFHPDGR WNDD

W.MGLSDPEGA. . WKWVDGTDYATGFQNWKPGQPDNWQGHGLGGGEDCA. .HFHPDGR. . .WNDD W.MGLSDPEGA..WKWVDGTDYATGFQNWKPGQPDDWQGHGLGGGEDCA. .HFHPDGR. . .WNDD W.MGLSDPEGA. .WKWVDGTDYATGFQNWKPGQPDDWQGHGLGGGEDCA. .HFHPDGR. . .WNDD

YFVGLSDPEGQRHWQWVDQTPYNESSTFWHPREPSD.......PNERCWLNFRKSPKRWGWNDV

................................XXX..............................

VCQRPYRWVCETELDKASQEPPLL

FCLQVYRWVCEKRRNATGE...VA

VCQRPYHWVCEAGLGQTSQESH

NCLGPQRSVCEMMKIH.......L

Znaky: **+ intemalizační doména (doména EITYAEV je viděna v NK receptorů NKA); +++ transmembránová doména; ... lektinová doména C-typu; XXX doména, specifická pro sacharid. DCMP1 receptor je co se týče homologie nejpodobnější makrofágovému lektinu v lektinové doméně.

Sekvenční analýzy naznačují, že tyto DCMP jsou členy lektin/asialoglykoproteinové superrodiny receptorů. Peptidové úseky také mohou být použity pro navrhování a přípravu odpovídajících oligonukleotidů pro testování knihovny s cílem stanovit přítomnost podobného genu např. identické nebo polymorfní varianty nebo s cílem identifikovat DC. Genetický kód může být použit pro výběr odpovídajících oligonukleotidů, které lze použít jako próby při • « * · · · · ··«· « · · · · · · «··· • · · · · ······ * ········· ·····«· · * ···· · » 9 9 testování. V kombinaci s technikami polymerázové řetězové reakce (PCR) lze syntetické oligonuklotidy využít při výběru požadovaných klonů z knihovny.

Jako próby nebo primery budou rovněž použity komplementární sekvence. Na základě identifikace pravděpodobného aminokonce by měly být konkrétně užitečné další peptidy např. spojené se zakotveným vektorem nebo komplementární PCR techniky s poly-A nebo spolu s komplementární DNA jiných peptidů.

Techniky pro manipulaci nukleových kyselin v genech, kódujících tyto DC proteiny např. subklonování sekvencí nukleových kyselin, kódujících polypeptidy, do expresních vektorů, značení prób, DNA hybridizace apod. jsou obecně popsány v Sambrook a kol. (1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2. vydání) Sv. 1 až 3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY, který je zde začleněn jako odkaz a dále je uváděn jako „Sambrook a kol“. Viz také Coligan a kol. (1987 a periodické doplňky) Current Protocols in Molecular Biology Greene/Wiley. New York, NY, dále uváděné jako „Coligan a kol“.

Existují různé způsoby izolace DNA sekvencí, kódujících tyto DC proteiny. Např. DNA je z genomové nebo cDNA knihovny izolována pomocí značených oligonukleotidových prób, které mají sekvence identické se sekvencemi, které jsou zde uvedené nebo jsou k nim komplementární. Mohou být použity celé próby nebo mohou být oligonukleotidové próby vytvořeny na základě porovnání popsaných sekvencí sjinými proteiny a pomocí výběru specifických primerů.

Tyto próby mohou být použity přímo v hybridizačních stanoveních při izolaci DNA, kódující DC proteiny nebo mohou být navrženy próby pro použití v amplifikačních technikách jako je PCR.

Pro přípravu cDNA knihovny je z buněk, které exprimují DC protein, izolována mRNA. cDNA je připravena z mRNA a ligo vána do rekombinantního vektoru. Vektor je transfektován do rekombinantního hostitele, aby mohlo proběhnout rozmnožení, výběr a klonování. Způsoby přípravy a testování cDNA knihoven jsou velmi dobře známé. Viz Gubler a Hoffman (1983) Gene 25:263 až 269; Sambrook a kol. nebo Coligan a kol.

Pro genomickou knihovnu může být DNA extrahována z tkáně a buď mechanicky nastříhána nebo enzymově naštěpena na fragmenty o velikosti asi 12 až 20 kb. Fragmenty jsou poté separovány gradientovým odstředěním a klonovány v bakteriofágu λ. Tyto vektory a fágy jsou sbaleny in vitro, jak je popsáno např. v Sambrook a kol. nebo Coligan a kol.. Rekombinantní fágy jsou analyzovány hybridizací plaků jak je popsáno v Benton a Davis (1977) Science 196:180 až 182. Hybridizace kolonií je prováděna obecně popsaným postupem podle např. Grunstein a kol. (1975) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 72:3961 až 3965.

·· ·»4>· v r r* 44 ·· • *t 4 4 4 4 4 4 · 4 •44« · ® · « «« 4 • 444 4 4 9 4 * 4 4

4444 4944

4494 444 4 *“ 4444 »4 44 *

DNA, kódující DC protein, může být identifikována buď v knihovnách cDNA nebo v genomických knihovnách a to díky své schopnosti hybridizovat s próbami nukleových kyselin, které jsou zde popsané, např. při hybridizaci kolonií nebo plaků. Odpovídající oblasti DNA jsou izolovány standartními postupy, které jsou důvěrně známé odborníkům v dané oblasti techniky. Viz Sambrook a kol..

Pro přípravu DNA, kódující DC proteiny, mohou být rovněž použity různé způsoby amplifíkace cílových sekvencí jako je polymerázová řetězová reakce. Technologie polymerázové řetězové reakce (PCR) je používána pro amplifikaci sekvencí nukleových kyselin přímo z mRNA, z cDNA a z genomických nebo cDNA knihoven. Izolované sekvence, kódující DC proteiny, mohou být rovněž použity jako templáty pro amplifikaci PCR.

Při PCR jsou syntetizovány olionukleotidové primery, komplementární ke dvěma 5 oblastem v oblasti DNA, která má být amplifikována. Polymerázová řetězová reakce je poté provedena pomocí dvou primerů. Viz Innis a kol. (1990) PCR Protokols: Guide to Methods and Applications Academie Press, San Diego, CA. Primery mohou být vybrány buď pro amplifikaci celých oblastí, kódujících celý vybraný DC protein nebo pro amplifikaci menších požadovaných úseků DNA. Jakmile jsou tyto oblasti amplifikovány, mohou být sekvenovány a ze sekvencí, získaných standartními technikami, mohou být připraveny oligonukleotidové próby. Tyto próby mohu být použity pro izolaci DNA, kódujících jiné formy DC proteinů.

Oligonukleotidy, určené pro používání jako próby, jsou chemicky syntetizovány na pevné fázi, pomocí triesteru fosforamiditu. Tento postup byl poprvé popsán autory Beaucage a Carruthers (1983) Tetrahedron Lett. 22(20):1859 až 1862. Syntéza může probíhat pomocí automatického zařízení, jak je popsáno v Needham-VanDevanter a kol. (1984) Nucleic Acids Res. 12:6159 až 6168. Oligonukleotidy jsou purifikovány např. nativní elektroforézou v akrylamidovém gelu nebo aniontovou HPLC chromatografií, popsanou v Pearson a Regnier (1983) J. Chrom. 255:137 až 149. Sekvence syntetického oligonukleotidu může být ověřena chemickým degradačním způsobem podle Maxama a Gilberta, uvedeným v Grossman a Moldave (1980) Methods in Enzymology 65:499 až 560 Academie Press, New York.

Tento vynález poskytuje izolovanou DNA nebo fragmenty, kódující DC protein. Dále vynález poskytuje izolovanou nebo rekombinantní DNA, která kóduje biologicky aktivní protein nebo polypeptid, který je schopný za odpovídajících podmínek, např. přísně regulovaných, hybridizovat se zde popsanými sekvencemi DNA. Zmíněný biologicky aktivní protein nebo polypeptid může být přirozeně se vyskytující forma nebo rekombinantní protein nebo fragment a má takovou aminokyselinovou sekvenci jako je odhalená v SEQ ID č: 2,4,8 nebo 10. Upřednostňovaná provedení mohou být celé přirozené izoláty např. z primáta. V glykosylované • · * · · · · • · · · · · · • · · · · · • · · · · ···· ··· ·· ···· ·· ·» formě by měly mít proteiny větší velikosti. Dále tento vynález zahrnuje použití izolované nebo rekombinantní DNA nebo jejích fragmentů, které kódují proteiny, které jsou homologní s každým příslušným DC proteinem. Izolovaná DNA může mít příslušné regulační sekvence na 5 a 3' přesahujících koncích např. promotory, zesilující sekvence, poly-A přídavné signály a další.

IV. Příprava produktů genů DC

DNA, které kódují tyto DC proteiny nebo jejich fragmenty, mohou být získány chemickou syntézou, testováním cDNA knihoven nebo testováním genomických knihoven, připravených z různých linií buněk nebo vzorků tkání.

Tyto DNA mohu být exprimovány v řadě různých hostitelských buněk, kde dochází k syntéze celého proteinu nebo fragmentů, které mohou být použity např. pro vytvoření polyklonálních nebo monoklonální ch protilátek, pro vazebné studie, pro konstrukci a expresi modifikovaných molekul a pro studie struktury/funkce. Každý z těchto DC proteinů nebo jejich fragmentů může být exprimován v hostitelských buňkách, které jsou transformovány nebo transfektovány odpovídajícími expresními vektory. Tyto molekuly mohou být purifikovány tak, že neobsahují téměř žádné jiné proteiny nebo buněčné kontaminanty, než které pocházejí z rekombinantního hostitele a proto jsou, v případě, že jsou kombinovány s farmaceuticky přijatelným nosičem a/nebo ředidlem, konkrétně užitečné ve farmaceutických prostředcích. Antigen nebo jeho části mohou být exprimovány jako fuze s jinými proteiny.

Expresní vektory jsou většinou samoreplikující DNA nebo RNA konstrukty, obsahující žádoucí DC gen nebo jeho fragmenty, obvykle vhodně napojené na vhodné genetické kontrolní prvky, které jsou rozpoznávány ve vhodné hostitelské buňce. Tyto kontrolní prvky jsou schopné ovlivňovat expresi v hostitelské buňce. Specifický typ kontrolních prvků, nezbytný pro ovlivnění exprese, bude záviset na eventuální použité hostitelské buňce. Obecně mohou genetické kontrolní prvky zahrnovat prokaryotní promotorový systém nebo eukaryotní promotorový expresní regulační systém a většinou zahrnují transkripční promotor, příležitostný operátor pro regulaci zahájení transkripce, prvky zvyšující transkripci za účelem zvýšení exprese mRNA, sekvence, kódující vhodné ribozomální vazebné místo a sekvence, které ukončují transkripci a translaci. Obvykle expresní vektory rovněž obsahují počátek replikace, které umožňuje replikaci vektoru nezávisle na hostitelské buňce.

Vektory předmětného vynálezu obsahují DNA, které kódují různé DC proteiny nebo jejich fragmenty, většinou kódující např. biologicky aktivní polypeptid nebo protein. DNA může • · • · · • · · · · · být kontrolována virálním promotorem a může kódovat selekční značku. Předmětný vynález se dále zabývá použitím těch expresních vektorů, které jsou schopné exprimovat eukaryotní cDNA, kódující DC protein, v prokaryotické nebo eukaryotické hostitelské buňce, kde je vektor slučitelný s hostitelem a kde je eukaryotická cDNA, kódující protein, inzertována do vektoru tak, že během růstu hostitele, obsahujícího vektor, dochází k expresi zmíněné cDNA. Expresní vektory jsou obvykle určeny pro stabilní replikaci ve svých hostitelských buňkách nebo pro amplifikaci, aby byl zvýšen celkový počet kopií žádoucího genu, připadající na jednu buňku. Vždy není nezbytné požadovat, aby se expresní vektor replikoval v hostitelské buňce např. je možné pomocí vektorů, které neobsahují počátek replikace, který je rozpoznáván hostitelskou buňkou, ovlivnit přechodnou expresi proteinu nebo jeho fragmentů v různých hostitelích. Je také možné použít vektory, které rekombinací způsobují integraci DC genu nebo jeho fragmentů do hostitelské DNA nebo je možné integrovat promotor, který kontroluje expresi endogenního genu.

Vektory, které jsou zde použity, zahrnují plasmidy, viry, bakteriofágy, začlenitelné DNA fragmenty a jiné pomocné látky, které umožňují intergraci DNA fragmentů do genomu hostitele. Expresní vektory jsou specializované vektory, které obsahují genetické kontrolní prvky, které ovlivňují expresi připojených genů. Plasmidy jsou nejběžněji používanou formou vektoru, ale je možné použít všechny ostatní formy vektorů, které mají ekvivalentní funkci. Viz. např. Pouwels a kol. (1985 a doplňky) Cloning Vectors: A Laboratory Manual Elsevier, NY a Rodriquez a kol. (1988) Vectors: A Survev of Molecular Cloning Vectors and Their Uses Buttersworth, Boston, MA.

Mezi vhodné hostitelské buňky patří prokaryota, nižší eukaryota a vyšší eukaryota. Prokaryota zahrnují gramnegativní i grampozitivní organismy např. E. coli a B. subtilis. Nižší eukaryota zahrnují kvasinky např. S. cerevisiae a Pichia a druhy rodu Dictyostelium. Vyšší eukaryota zahrnují určité linie buněk tkáňových kultur, pocházejících ze zvířecích buněk a to jiných než savčích např. hmyzích a ptačích a savčích buněk např. lidských, primátových a buněk hlodavců.

Prokaryotické systémy hostitel-vektor zahrnují široké spektrum vektorů pro mnoho různých druhů. Pro začlenění ekvivalentních vektorů, použitých v jiných prokaryotech, jsou všeobecně používány E. coli a její vektory. Reprezentativní vektor pro amplifikaci DNA je pBR322 nebo vektory od něj odvozené. Mezi vektory, které mohou být použity, ale není to omezeno pouze na ně, pro expresi DC proteinů nebo fragmentů patří takové vektory, které obsahují lac promotor (pUC-série); trp promotor (pBR322-trp); Ipp promotor (pIN-série); lambda-pP nebo pR promotory (pOTS) nebo hybridní promotory jako je ptač (pDR540). Viz Brosius a kol. (1988) „Expression Vectors Employing Lambda-, trp-, lac- a Ipp-derived ·· ···· · · · · ···· · · · · · · · ··· · · ·· ·· · • · · · ···· ···· · · ···· · · ··

Promoters“ v Rodriquez a Denhardt Vectors: A Survev of Molecular Cloning Vectors and Their

Uses 10:205 až 236 Buttersworth, Boston, MA.

Nižší eukaryota např. kvasinky a Dictyostelium mohou být transformovány vektory, které obsahují sekvenci DC genu. Pro účely předmětného vynálezu je nejběžnějším nižším eukaryotickým hostitelem pekařská kvasinka Saccharomyces cerevisiae. Ta může být všeobecně použita jako reprezentant nižších eukaryot, ačkoliv je dostupná řada dalších druhů a kmenů. Kvasinkové vektory se většinou skládají zpočátku replikace (kromě integračního typu), selekčního genu, promotoru, DNA, kódující žádoucí protein nebo jeho fragmenty a sekvence pro ukončení translace, pro polyadenylaci a pro ukončení transkripce. Mezi expresní vektory, vhodné pro kvasinky, patří takové konstitutivní promotory jako je 3-fosfoglycerátkináza a různé další promotory genu pro glykolytické enzymy nebo takové indukovatelné promotory jako je promotor alkoholdehydrogenázy 2 nebo metalothioninový promotor. Vhodné vektory zahrnují deriváty následujících typů: samoreplikující, poskytující nízký počet kopií (jako je Yrp-série), samoreplikující, poskytující vysoký počet kopií (jako je Yep-série), integrační typy (jako je YIpsérie) nebo mini-chromozómy (jako je YCp-série).

Buňky tkáňových kultur vyšších eukaryotů jsou upřednostňované hostitelské buňky pro expresi DC proteinu. V principu je možno říci, že může být použita většina buněk tkáňových kultur vyšších eukaryotů ať již pochází z obratlovců nebo bezobratlích např. expresní systém hmyzího bakuloviru. Avšak pro dosažení vlastního kotranslačního i posttranslačního zpracování jsou upřednostňované savčí buňky. Transformace nebo transfekce a rozmnožování těchto buněk je rutinní záležitost. Mezi užitečné linie buněk patří HeLa buňky, linie ovariálních buněk čínského křečka (CHO), linie buněk ledvin mladého potkana (BRK), linie hmyzích buněk, linie ptačích buněk a linie opičích buněk (COS). Expresní vektory pro tyto buněčné linie obvykle zahrnují počátek replikace, promotor, místo pro zahájení translace, místa pro sestřih RNA (např. když je použita genomická DNA), polyadenylaČní místo a místo pro ukončení transkripce. Tyto vektory mohou také obsahovat selekční nebo amplifikační gen. Vhodnými expresními vektory mohou být plasmidy, viry nebo retroviry, nesoucí promotory, pocházející např. ze zdrojů jako je adenovirus, SV40, parvovirus, virus kravských neštovic nebo cytomegalovirus.

Reprezentativní příklady vhodných expresních vektorů jsou pCDNAl, pCD viz Okayama a kol. (1985) Mol, Cell Biol. 5:1136 až 1142, pMClneo Poly-A viz Thomas a kol. (1987) Cell 51:503 až 512 a bakulovirální vektor jako je pAC373 nebo pAC610.

V určitých případech není třeba, aby byly DC proteiny glykosylovány, aby byla během určitých měření vyvolána biologická odezva. Avšak často je žádoucí exprimovat DC polypeptid v systému, který poskytuje specifický nebo definovaný profil glykosylace. V tomto ········· ······· ·· ·»·· ·· · · případě bude obvyklý profil takový, jako je přirozeně poskytován expresním systémem. Profil je však možno modifikovat prostřednictvím vystavení polypeptidu např. v neglykosylované formě, odpovídajícím glykosylačním proteinům, které jsou součástí heterologního expresního systému. Např. DC gen může být transformován společně s jedním nebo více geny, které kódují savčí nebo jiné glykosylační enzymy. Dále je známo, že velký stupeň glykosylace může být škodlivý pro biologickou aktivitu DC proteinu a je možno provést rutinní testování a tím optimalizovat takový stupeň glykosylace, který uděluje proteinu optimální biologickou aktivitu.

DC protein nebo jeho fragment může být zkonstruován tak, že fosfatidylinositol (PI) je vázán na buněčnou membránu, ale je možno ho z membrán odstranit působením enzymu, který štěpí fosfatidylinositol např. fosfatidylinositolfosfolipáza C. Ta uvolňuje antigen v biologicky aktivní formě a umožňuje purifikaci postupy, které jsou v proteinové chemii standartně používány. Viz např. Low (1989) Biochem. Biophys. Acta 988:427 až 454; Tse a kol. (1985) Science 230:1003 až 1008; Brunner a kol. (1991) J, Cell Biol. 114:1275 až 1283 a Coligan a kol. (1996 a periodické doplňky) Current Protocols in Protein Science John Wiley & Sons, New York, NY.

Nyní, když byly tyto DC proteiny charekterizovány, mohou být běžnými postupy pro syntézu peptidů připraveny jejich fragmenty nebo deriváty. Toto zahrnuje postupy, popsané v Stewart a Young (1984) Solid Phase Peptide Synthesis Pierce Chemical Co. Rockford, EL; Bodanszky a Bodanszky (1984) The Practice of Peptide Synthesis Springer-Verlag, New York, NY a Bodanszky (1984) The Principles of Peptide Synthesis Springer-Verlag, New York, NY. Viz také Merrified (1986) Science 232:341 až 347 a Dawson a kol. (1994) Science 266:776 až 779. Mohou být použity např. azidový postup, postup, používající kyselý chlorid, postup, používající kyselý anhydrid, kombinovaný anhydridový postup, postup, používající aktivní ester (např. p-nitrofenylester, ester N-hydroxysukcinimidu nebo kyanometyl ester), karbodiimidazolový postup, oxidacně-redukční postup nebo postup, používající systém dicyklohexylkarbodiimid (DCCD)/aditivum. Výše zmíněné postupy je možno aplikovat na bázi pevné i kapalné fáze. Připravený protein a jeho fragmenty mohou být z reakční směsi izolovány a purifikovány způsoby, používané pro separaci peptidů, například extrakcí, precipitací, elektroforézou a různými formami chromatografií apod. Získané DC proteiny předmětného vynálezu mohou mít různý stupeň čistoty, který je dán požadovaným použitím. Purifikace může být doplněna známými technikami pro purifikaci proteinů nebo použitím zde popsaných protilátek nebo vazebných partnerů např. v imunoabsorbční afinitní chromatografii. Při imunoabsorbční afinitní chromatografii je nejdříve navázána protilátka na pevný nosič, následuje kontakt navázaných protilátek s rozpuštěným lyzátem vhodných buněk, s lyzáty jiných buněk, • · • · • « · * · · · · · ····«·· ·· · · ·· ·· · · exprimujících protein nebo s lyzáty nebo supematanty buněk, produkujících jako výsledek DNA technik protein viz níže.

U mnohočetných buněčných linií může být testováno, která z nich v porovnání s ostatními buňkami exprimuje zmíněný protein ve vysokých hladinách. Jsou testovány různé buněčné linie např. linie stromatických buněk myššího brzlíku TA4, a je vybrána taková, která je nejvhodnější z důvodu dobrých manipulačních vlastností. Přirozené proteiny DC buněk mohou být izolovány z přirozených zdrojů nebo mohou být získány expresí z buňky, transformované vhodným expresním vektorem. Exprimovaný protein je purifikován standartními postupy nebo tyto postupy mohou být kombinovány s upravenými postupy a to proto, aby byla purifikace z buněčných Iyzátů nebo supernatantů účinější. Pro tuto purifikaci mohou být použity FLAG nebo Hisé úseky.

V. Protilátky

Protilátky mohou být připraveny proti různým DC proteinům včetně individuálních, polymorfní ch, alelických, kmenových nebo druhových variant a proti jejich fragmentům, které jsou ve svých přirozeně se vyskytujících formách (celá délka) nebo v rekombinantních formách. Protilátky mohou také být připraveny proti aktivní nebo inaktivní formě DC proteinů. Rovněž mohou být použity anti-idiotypické protilátky.

a. Výroba protilátek

Pro výrobu protilátek, specificky reagujících s těmito DC proteiny, může být použita řada imunogenů. Pro výrobu monoklonálních nebo polyklonálních protilátek je upřednostňovaným imunogenem rekombinantní protein. Rovněž může být použit přirozeně se vyskytující protein v čisté nebo ne zcela čisté formě. Pro výrobu protilátek proti DC proteinům mohou být jako imunogen použity syntetické peptidy, připravené pomocí zde popsaných sekvencí lidského DC proteinu. Rekombinantní protein může být exprimován ve zde popsaných eukaryotických nebo prokaryotických buňkách a může být purifikován zde popsaným postupem. Produkt je poté injekčně aplikován zvířeti, které je schopno produkovat protilátky. Mohou být vytvořeny buď monoklonální nebo polyklonální protilátky, které jsou následně používány při imunochemickém měření proteinu.

Způsoby výroby polyklonálních protilátek jsou odborníkům vdané oblasti techniky známé. Ve stručnosti lze říci, že imunogen, výhodněji purifikovaný protein, je smíchán

4·· ···· ···· ···· · · · · · · · • ···« ······ f ········· ······· ·· ···· · · · · s adjuvants a touto směsí jsou imunizována zvířata. Imunitní odpověď zvířete na preparát imunogenu je monitorována v odebraných vzorcích krve a je stanovován titr reaktivity vůči sledovanému DC proteinu. V okamžiku, kdy jsou získány vhodně vysoké titry protilátky proti imunogenu, je zvíře vykrveno a jsou připravena antiséra. Je-li to třeba, je provedena další frakcionace antiséra s cílem zvýšit koncentraci protilátek, reaktivních s proteinem. Viz např. Harlow a Lané.

Monoklonální protilátky mohou být získány různými technikami, které odborníci v dané oblasti techniky znají. Stručně, buňky ze sleziny zvířat, imunizovaných žádoucím antigenem, jsou učiněny nesmrtelnými, což se běžně dělá fůzí s myelomovými buňkami. Viz např. Kohler a Milstein (1976) Eur. J. Immunol. 6:511 až 519, který je začleněn jako odkaz. Metody, které lze použít místo fuze s myelomovými buňkami, zahrnují transformaci Epstein Barr Virem, onkogeny nebo retroviry nebo jiné způsoby, známé vdané oblasti techniky. U kolonií, vznikajících pouze z nesmrtelných buněk, je testována přítomnost protilátek žádoucí specifity a afinity k antigenu. Výtěžek monoklonálních protilátek, vyrobených proti těmto buňkám může být různými technikami včetně aplikace do perinoteální dutiny hostitelů, náležících k obratlovcům, ještě zvýšen. Sekvence DNA, kódující monoklonální protilátku nebo její vazebný fragment, může být také izolována testováním knihovny DNA z lidských B buněk podle obecného protokolu, který je nastíněn v Huse a kol. (1989) Science 246:1275 až 1281.

Jsou-li zvířata imunizována konjugáty, které jsou složené z fragmentů a nosičových proteinů, jak je popsáno výše, mohou být vytvořeny protilátky, včetně vazebných fragmentů a jednořetězcových verzí, proti předem stanoveným fragmentům těchto DC proteinů. Monoklonální protilátky jsou připraveny z buněk, které vylučují žádoucí protilátku. U těchto protilátek může být testována schopnost vázat normální nebo poškozené DC proteiny nebo může být testována agonistická nebo antagonistická aktivita. Tyto monoklonální protilátky se obvykle vážou s Kd, jehož hodnota je alespoň asi 1 mM, obvykleji alespoň asi 300 μΜ, typicky alespoň 10 μΜ, většinou alespoň asi 30 μΜ, výhodněji alespoň 10 μΜ a nejvýhodněji alespoň asi 3 μΜ nebo lepší.

V některých případech je žádoucí připravit monoklonální protilátky z různých savčích hostitelů, jako jsou myš, hlodavci, primáti, lidé apod. Popis technik přípravy těchto monoklonálních protilátek je možno najít v např. Stites a kol. Basic and Clinical Immunology (4. vydání) Lange Medical Publications, Los Altos, CA a v odkazech, tam citovaných: Harlow a Lané (1988) Antibodies: A Laboratory Manual CSH Press; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2. vydání) Academie Press, New York, NY a konkrétně v Kohler a Milstein (1975) Nátuře 256:495 až 497, kde je diskutován jeden způsob přípravy • · • · · · * ··«··· • ···· · · · · ······· ·· · · ·· ·· ·· monoklonálních protilátek. Stručně shrnuto, tento způsob spočívá v tom, že je zvířeti aplikován imunogen, aby byla zahájena humorální imunitní odpověď. Poté co je zvíře usmrceno jsou buňky, odebrané z jeho sleziny, fúzovány s myelomovými buňkami. Výsledkem je hybridní buňka nebo „hybridom“, která je schopna se reprodukovat in vitro. Z hybridomové populace jsou poté izolovány jednotlivé klony, z nichž každý vylučuje jediný typ protilátek proti imunogenu. V tomto případě jsou jednotlivé druhy získaných protilátek produkty nesmrtelných a klonovaných jednotlivých B buněk z imunizovaného zvířete, vytvořené jako odezva na specifické místo, rozpoznané imunogenní látkou.

Mezi ostatní vhodné techniky patří selekce knihoven protilátek ve fágu nebo podobných vektorech. Viz např. Huse a kol. (1989) „ Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda“, Science 246:1275 až 1281 a Ward a kol. (1989) Nátuře 341:544 až 546. Polypeptidy a protilátky předmětného vynálezu včetně chimérických a polidštěných protilátek mohou být použity po předchozí modifikaci nebo bez ní. Polypeptidy a protilátky budou Často značeny a to tím, že budou kovalentně nebo nekovalentně spojeny s látkou, která poskytuje detekovatelný signál. Existuje mnoho různých technik značení a konjugace a jsou uváděny ve vědecké nebo patentové literatuře. Mezi vhodné značky patří radionuklidy, enzymy, substráty, kofaktory, inhibitory, fluorescenční skupiny, chemiluminiscenční skupiny, magnetické částice apod. Patenty, které slouží jako návod jak tyto značky použít, jsou U.S. Patent č. 381 837; 3850752; 3939350; 3996345; 4277437; 4275149 a 4366241. Mohou být vyráběny rovněž rekombinantní imunoglobuliny. Viz Cabilly, U.S. Patent č. 4716567 a Queen a kol. (1989) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86:10029 až 10033.

Protilátky předmětného vynálezu mohou být také použity při izolaci každého DC proteinu afinitní chromatografii. Mohou být připraveny kolony, kde jsou protilátky navázány na pevný nosič např. částice jako jsou agaróza, SEPHADEX a jiné. Lyzát buněk prochází kolonou, kolona je promyta a následuje aplikace rostoucích koncentrací slabého denaturačního činidla, v důsledku čehož dojde k uvolnění purifikovaného DC proteinu.

Protilátky mohou být také použity při testování expresních knihoven na konkrétní produkty exprese. Protilátky, používané v tomto postupu, budou obvykle označeny skupinou, která umožňuje snadnou detekci vazby antigenů a protilátky.

Protilátky proti DC proteinům mohou být použity při analýze nebo identifikaci specifických součástí buněčné populace, které exprimují příslušný protein. Na základě stanovení produktů exprese buněk, které exprimují DC proteiny, je možné diagnostikovat onemocnění např. stavy, kdy je ohrožena imunita, kdy jsou vyčerpány DC nebo kdy dochází k nadměrné produkci DC.

Protilátky, vytvořené proti každé DC, budou rovněž užitečné pri přípravě antiidiotypických protilátek. Ty budou užitečné pri detekci nebo diagnostikování různých imunologických stavů, souvisejících s expresí příslušných antigenů.

b. Imunostanovení

Konkrétní protein může být měřen pomocí různých imunometod. Souhrn imunologických postupů a imunostanovení je obecně uveden vStites a Terr (1991) Basic and Clinical Immunology (7. vydání). Imunostanovení předmětného vynálezu může být navíc realizováno v kterémkoliv uspořádání, která jsou shrnuta vMaggio (1980) Enzyme Immunoassay CRC Press, Boča Raton, Florida; Tijan (1985) „Practice and Theory of Enzyme Immunoassays“ Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam a Harlow a Lané Antibodies. A Laboratory Manual, přičemž každá publikace je zde začleněna jako odkaz. Viz také Chán (1987) Immunoassay: A Practical Guide Academie Press, Orlando, FL; Price a Newman (1991) Principles and Practice of Immunoassays Stockton Press, NY a Ngo (1988) Non-isotopic Immunoassays Plenům Press, NY.

Imunostanovení pro měření těchto DC proteinů může být uskutečněno různými způsoby, které jsou odborníkům v dané oblasti techniky známé. Ve stručnosti, imunostanovení, kdy je měřen protein, může vycházet ze stanovení kompetitivní nebo nekompetitivní vazby. Při stanovení kompetitivní vazby soutěží analyzovaný vzorek se značeným analytem o specifická vazebná místa na zachytávacím činidle, které je vázáno na pevném povrchu. Výhodněji je zachytávací činidlo protilátka, která specificky reaguje s DC proteinem a která je produkována výše popsaným postupem. Koncentrace značeného analytu, vázaného na zachytávací činidlo, je nepřímo úměrná množství volného analytu ve vzorku.

Při stanovení kompetitivní vazby, soutěží DC protein, přítomný ve vzorku, se značeným proteinem o vazbu na specifické vazebné činidlo např. protilátku, která specificky reaguje s DC proteinem. Vazebné činidlo může být vázáno na pevný povrch, aby byla zlepšena separace vázaného značeného proteinu od nenavázaného značeného proteinu. Stanovení kompetitivní vazby může být provedeno i v kapalné fázi a pro separaci navázaného a nenavázaného značeného proteinu může být použita jakákoliv technika, známá v dané oblasti techniky. Po separaci je stanoveno množství navázaného značeného proteinu. Množství proteinu, přítomného ve vzorku, je nepřímo úměrné množství značeného navázaného proteinu.

Příležitostně může být provedeno homogení imunostanovení, kdy není potřeba začlenit separační krok. V těchto imunostanovení ch je značka na proteinu nahrazena navázáním proteinu ·· ···· · · ·· ·· ·· ··· ···· · · · · ···· · · · · ·· · • ·»·· ······ • · · · · ···· «·····« ·· ···· · · ·· na jeho specifické vazebné činidlo. Výsledkem této změny je snížení nebo zvýšení signálu, který vysílá značka, takže měření značky na konci imunostanovení umožňuje detekci nebo kvantifikaci proteinu.

Tyto DC proteiny mohou být rovněž kvantitativně stanoveny různými nekompetitivními imunometodami. Např. může být použito oboustranné, sendvičové imunostanovení, využívající pevnou fázi. V tomto typu stanovení je vazebné činidlo, které váže protein, např. protilátka, zachyceno na pevný nosič. Druhé vazebné činidlo pro protein, což může být také protilátka, a které se váže na protein v jiném místě, je označeno. Poté, co dojde k vazbě na obě místa proteinu, je nenavázané značené vazebné činidlo odstraněno a je měřeno množství značeného vazebného činidla, vázaného na pevnou fázi. Množství navázaného značeného vazebného činidla je přímo úměrné množství proteinu ve vzorku.

Pro stanovení přítomnosti DC proteinu ve vzorku může být použit Western blot. Je provedena elektroforéza např. vzorku tkáně, kde lze očekávat protein. Po elektroforéze, kdy dojde k separaci proteinů a po přenosu proteinů na vhodný pevný nosič jako je nitrocelulózová membrána, je pevný nosič inkubován s protilátkou, která reaguje s denaturovaným proteinem. Tato protilátka může být označena nebo může být taková, zeji lze detekovat následnou inkubací se sekundární značenou protilátkou, která se váže na primární protilátku.

Imunostanovení, popsaná výše, využívají stanovení značených složek. Značka může být v různých formách. Značka může být přímo nebo nepřímo navázána na žádoucí složku stanovení a to způsoby, které jsou dobře známé v dané oblasti techniky. Může být použita řada různých značek. Složka může být označena jakýmkoliv z několika způsobů. Mezi tradičně používané radioaktivní značky patří ³H, ¹²⁵I, ³⁵S, ¹⁴C nebo ³²P. Mezi neradioaktivní značky patří ligandy, které se váží na značené protilátky, fluorofoiy, chemiluminiscenční činidla, enzymy a protilátky, které mohou sloužit jako člen specifického vazebného páru pro značený protein. Výběr značky závisí na požadované citlivosti, jednoduchosti napojení na sloučeninu, na požadavcích, týkajících se stability a na dostupném zařízení. Souhrn různých systémů pro značení nebo pro vytváření signálu, které mohou být použity, je uveden v U.S. Patentu č. 4391904, který je zde začleněn jako odkaz.

Protilátky, které reagují s konkrétním proteinem, mohou být také měřeny různými imunometodami. Souhrn imunologických postupů a imunostanovení, které je možno aplikovat při měření protilátek pomocí imunostanovení, je uveden v Stites a Terr Basic and Clinical Immunology (7. vydání); Maggio Enzyme Immunoassay a Harlow a Lané Antibodies, A Laboratory Manual.

Pro měření specifických proteinů může být použita rovněž řada různých uspořádání imunostanovení, separačních technik a značek, které jsou podobné těm, které jsou uvedeny výše.

VI. Purifikované DC proteiny

Nukleotidová a aminokyselinová sekvence pro DCMP1 z primáta, např. pro lidský DCMP1, jsou poskytovány v SEQ ID č: 1 a 2. Nukleotidová a aminokyselinová sekvence pro DCMP1 z hlodavce např. myši jsou poskytovány v SEQ ID č: 7 a 8. Nukleotidová a aminokyselinová sekvence pro DCMP2 z primáta, např. pro lidský DCMP2, jsou poskytovány v SEQ ID č: 3 a 4. Jiná varianta je popsána v SEQ ID č: 9 a 10. Podobné sekvence hepatického asialoglykoproteinu primáta jsou poskytovány v SEQ ID č: 5 a 6. Peptidové sekvence umožňují přípravu peptidů pro vytvoření protilátek, které by rozpoznávaly tyto úseky a umožňují přípravu oligonukleotidů, které kódují tyto sekvence.

VII. Fyzikální varianty

Tento vynález se také zabývá proteiny nebo peptidy, jejichž aminokyselinové sekvence vykazují podstatnou podobnost s aminokyselinovými sekvencemi SEQ ID č: 2 nebo 8 nebo s vybranými podíly SEQ ID č: 4 nebo 10. Varianty, vykazující např. 20 nebo méně, výhodněji 10 nebo méně a nej výhodněji 5 nebo méně substitucí, jsou také možné. V případech, kdy jsou substituce konzervativní, budou mít varianty stejnou imunogenní nebo antigenní podobnost nebo křížovou reaktivitu jako příslušný protein s přirozenou sekvencí. Přirozené varianty zahrnují individuální, alelické, polymorfní, kmenové nebo druhové varianty.

Podobnost aminokyselinových sekvencí nebo jejich identita je stanovena optimalizováním shod ve zbytcích a je-li to nezbytné zahrnutím mezer. To se změní tehdy, jsouli za tyto shody považovány konzervativní substituce. Konzervativní substituce většinou zahrnují substituce v následujících skupinách: glycin, alanin, valin, isoleucin, leucin; asparágová kyselina, glutamová kyselina; asparagin, glutamin; serin, threonin, lysin, arginin a fenylalanin, tyrosin. Homologní aminokyselinové sekvence zahrnují přirozené alelické a mezidruhové variace v každé příslušné proteinové sekvenci. Typické homologní proteiny nebo peptidy budou s aminokyselinovou sekvencí odpovídajícího DC proteinu vykazovat 50 až 100 % podobnost (jestliže mohou být začleněny mezery) až 75 až 100 % podobnost (jsou-li zahrnuty konzervativní substituce). Mírou totožnosti bude totožnost alespoň asi 50 %, obecně alespoň 60 %, obecněji alespoň 65 %, obvykle alespoň 70 %, obvykleji alespoň 75 %, výhodněji alespoň 80 % a • · · • · # * · · · · · · nejvýhodněji alespoň 80 % a v konkrétně upřednostňovaných provedeních alespoň 85 % a více. Viz také Needleham a kol. (1970) J, Mol. Biol. 48:443 až 453; Sankoff a kol. (1983) Time Warps, String Edits a Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison

Kapitola 1, Addison-Wesley, Reading, MA a software od IntelliGenetics, Mountain View, CA od genetické počítačové skupiny University of Wisconsin Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI.

Při porovnávání sekvencí většinou jedna sekvence vystupuje jako referenční sekvence, se kterou jsou testované sekvence srovnávány. Jestliže je použit algoritmus pro porovnávání sekvencí, jsou testovaná a referenční sekvence zadány do počítače, je-li to třeba jsou označeny souřadnice subsekvencí a jsou označeny parametry programu sekvenčního algoritmu. Algoritmus na porovnávání sekvencí poté na základě označených parametrů spočítá procenta totožnosti testovaných(é) sekvencí(e) vůči referenční sekvenci.

Pro porovnání může být provedeno optické srovnání sekvencí např. pomocí algoritmu, založeného na místní homologii podle Smith a Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482, pomocí algoritmu na seřazení homologii podle Needlman a Wunsch (1970) J. Mol, Biol. 48:443, výběrem podle podobnosti způsobem podle Pearson a Lipman (1988) Proč. Nati. Acad. Sci USA 85:2444, počítačovými zpracováními těchto algoritmů (GAP, BESTFIT, FASTA a TFASTA ve Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) nebo vizuálním porovnáním {viz obecně Ausubel a kol}.

Jedním příkladem užitečného algoritmu je PILEUP. PILEUP vytváří mnonásobné srovnání podobných sekvencí pomocí postupného srovnávání na základě dvojic s cílem ukázat vztah a procentuálně vyjádřenou totožnost sekvencí. Je také vytvořen strom nebo dendogram, ukazující vztahy, použité pro vytvoření tohoto uspořádání. PILEUP používá zjednodušený způsob postupného srovnávání podle Feng a Doolittle (1987) J, Mol. Evol. 35:351 až 360. Použitý způsob je podobný způsobu, který popsali Higgins a Sharp (1989) CABIOS 5:151 až 153. Program může srovnat až 300 sekvencí, z nichž každá má délku maximálně 5 000 nukleotidů nebo aminokyselin. Postup mnohonásobného srovnávání začíná srovnáním páru dvou nejpodobnějších sekvencí a vzniká seskupení dvou srovnaných sekvencí. Toto seskupení je poté srovnáváno s další nejpodobnější sekvencí nebo seskupením srovnaných sekvencí. Dvě seskupení sekvencí jsou srovnány jednoduchým prodloužením párového srovnání dvou jednotlivých sekvencí. Konečného srovnání je dosaženo sérií postupných párových srovnávání. Program je spuštěn označením specifických sekvencí a jejich aminokyselinových nebo nukleotidových souřadnic oblastí, kde je sekvence porovnávána a označením parametrů programu. Např. referenční sekvence může být porovnávána s dalšími testovanými sekvencemi proto, aby bylo stanoveno procento totožnosti sekvencí pomocí následujících nastavených parametrů: velikost mezery (3,00), délka mezery (0,1) a koncové mezery.

Jiným příkladem algoritmu, který je vhodný pro stanovení procenta identity sekvencí a pro stanovení podobnosti sekvencí je algoritmus BLAST, který popsali Altschul a kol. (1990) I Mol. Biol. 215:403 až 410. Software pro analýzu pomocí algoritmu BLAST je věřejně dostupný v National Center for Biotechnology Information (http:www.ncbi.nlm.nih.gov/). Tento algoritmus provádí nejdříve identifikaci sekvenčních párů s vysokou mírou podobnosti (HSP) tím, že identifikuje krátká slova o délce W v dotazované sekvenci, která, jsou-li porovnána se slovem o stejné délce, které se nachází v databázi sekvencí, se buď shodují nebo vyhovují jisté pozitivní prahové hodnotě T. Jako T je označována prahová hodnota blízkého slova (Altschul a kol.). Tato počáteční slova slouží pro zahájení hledání s cílem nalézt delší HSP, které je obsahují. Slova jsou poté prodloužena v obou směrech podél každé sekvence a to tak dlouho, až může být zvýšena celková míra srovnání. Prodloužení slov v obou směrech jsou zastavena, když: celková míra srovnání poklesne kvantitou X ze své maximální dosažené hodnoty; celková míra se vzhledem k akumulaci jednoho nebo více negativně skórujících srovnání blíží nule nebo níže nebo je-li dosaženo konce jedné nebo druhé sekvence. Parametry W, T a X algoritmu BLAST určují citlivost a rychlost srovnání. Program BLAST používá jako předem dané délku slova (W) 11, BLOSUM62 skórovací matici (viz Henikoff a Henikoff (1989) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89:10915) srovnání (B) 50, pravděpodobnost (E) 10, M=5, N=4 a porovnání obou řetězců.

Kromě výpočtu procent totožnosti sekvencí provádí také algoritmus BLAST statistickou analýzu podobnosti mezi dvěma sekvencemi (viz např. Karlin a Altschul (1993) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90:5873 až 5787). Jedním měřítkem podobnosti, které poskytuje algoritmus BLAST, je nejmenší celková pravděpodobnost (P(N)), která naznačuje pravděpodobnost, se kterou se mezi dvěma nukleotidy nebo aminokyselinovými sekvencemi vyskytne náhodná shoda. Např. nukleová kyselina je považována za podobnou referenční sekvenci tehdy, jestliže nejmenší celková pravděpodobnost je při porovnání testované nukleové kyseliny a referenční nukleové kyseliny menší než asi 0,1, výhodněji menší než asi 0,01 a nej výhodněji menší než asi 0,001.

Dalším náznakem toho, že jsou dvě sekvence nukleových kyselin polypeptidů téměř identické je to, že polypeptid, kódovaný první nukleovou kyselinou, vykazuje křížovou imunoreaktivitu s polypeptidem, kódovaným druhou nukleovou kyselinou, jak je popsáno níže. Polypeptid je tak většinou téměř identický s druhým polypeptidem např. tehdy, když se dva peptidy liší pouze konzervativními substitucemi. Jiným náznakem toho, že jsou dvě nukleové kyseliny téměř identické je to, že dvě molekuly hybridizují jedna s druhou za přísně regulovaných podmínek, jak je popsáno níže.

··« ···· ···· ···· · · · · « · « • · · · · «····· • ···· · · · · ······· ·· · · · · · · ··

Nukleové kyseliny, kódující savčí DC proteiny, budou za přísně regulovaných podmínek většinou hybridizovat se SEQ ID č: 1 nebo 7 nebo s odpovídajícími podíly SEQ 3. Např. nukleové kyseliny, kódující příslušné DC proteiny, budou většinou hybridizovat s nukleovou kyselinou o SEQ ID č: 1,7,3 nebo 9 za přísně regulovaných hybridizačních podmínek, ale i přesto poskytují malé falešné pozitivní hybridizační signály. Obecně jsou přísně regulované podmínky vybírány tak, aby teplota byla asi o 10 °C nižší než teplota tání (Tm) sekvence, která je hybridizována, definována je iontová síla a pH. Tm je teplota (při definované iontové síle a pH), při které 50 % cílové sekvence hybridizuje se zcela shodnou připravenou próbou. Přísně regulované podmínky budou většinou takové podmínky, při kterých je koncentrace soli v promývacím roztoku asi 0,02 M při pH 7 a teplota je alespoň asi 50 °C. Ostatní faktory včetně mimo jiného také složení báze a velikosti komplementárních vláken, přítomnosti organických rozpouštědel jako je formamid a rozsahu nesouhlasných bází, mohou hybridizací podstatně zhoršovat. Upřednostňované provedení bude zahrnovat nukleové kyseliny, které se budou na uvedené sekvence vázat v 50 % formamidu, v 20 až 50 mM NaCl a při 42 °C. Hybridizace za přísně regulovaných podmínek bude dávat alespoň 2 násobně rozdílné pozadí oproti pozadí, které je poskytováno bez použití přísně regulovaných podmínek, výhodněji alespoň 3 až 5 x rozdílné.

Izolovaná DNA DC genu může být snadno modifikována substitucemi nukleotidů, nukleotidovými delecemi, nukleotidovými inzercemi a převrácením nukleotidových řetězců. Výsledkem těchto modifikací jsou nové sekvence DNA, které kódují tyto DC antigeny, jejich deriváty nebo proteiny, které vykazují vysoce podobnou fyziologickou, imunogenní nebo antigenní aktivitu.

Modifikované sekvence mohou být použity pro přípravu mutantních antigenů nebo pro zvýšení exprese. Zvýšená exprese může zahrnovat amplifikaci genu, zvýšenou transkripci, zvýšenou translaci a jiné mechanismy. Tyto mutantní deriváty DC proteinů zahrnují předem určené nebo místně specifické mutace příslušného proteinu nebo jeho fragmentů. ,Mutantní DC protein“ obsahuje polypeptid, jinak splňující definici homologního DC proteinu, která je uvedena výše, ale který, má ať již v důsledku delece, substituce nebo inzerce, odlišnou aminokyselinovou sekvenci v porovnání se sekvencí DC proteinu, nalezeného v přírodě. Konkrétně „místně specifický mutantní DC protein“ obecně zahrnuje proteiny, vykazující významnou podobnost s proteinem, který má sekvenci SEQ ID č: 2 nebo 8.

Obecně bude mít varianta mnoho fyziochemických a biologických aktivit, např. antigenní nebo imunogenní, stejných jako zmíněné sekvence a v upřednostňovaných provedeních bude obsahovat podstatnou část nebo celou odhalenou sekvenci.

• · • · · · «

• · ·

Podobné postupy je možno aplikovat na různé DC proteiny, konkrétně na ty, nalezené v různých teplokrevných zvířatech např. primátech a savcích.

Ačkoliv jsou místa pro místně specifickou mutaci předem určené, mutanty nemusí být místně specifické. Mutageneze DC proteinu může být provedena inzercemi nebo delecemi aminokyselin. Aby se dospělo ke konečnému konstruktu, může být použita substituce, delece, inzerce nebo jakákoliv jejich kombinace. Inzerce zahrnují fuze amino nebo karboxy-konců. Libovolná mutageneze může být uskutečněna na cílovém kodónu a u exprimovaných mutantů může být poté testována žádoucí aktivita. Způsoby provedení substitučních mutací na předem určených místech DNA, která má známou sekvenci např. mutageneze pomocí Ml3 primerů nebo polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) jsou velmi dobře známé v dané oblasti techniky. Viz také Sambrook a kol. (1989) a Ausubel a kol. (1987 a doplňky). Důsledkem mutací v DNA by nemělo být umístění kódující sekvence mimo čtěcí rámce a výhodněji nebude docházet k tvorbě takových komplementárních oblastí, které by mohly hybridizovat a produkovat sekundární struktury mRNA jako jsou smyčky nebo ostré ohyby.

Předmětný vynález rovněž poskytuje rekombinantní proteiny např. heterologní fuzní proteiny použitím úseků těchto proteinů. Heterologní fuzní protein je fůzí proteinů nebo úseků, které nejsou přirozeně běžně fúzovány stejným způsobem. Produktem fuze imunoglobulinu a příslušného DC polypeptidu je spojitá proteinová molekula, která má sekvence fúzované v typické peptidové spojení, je většinou vytvořená jako jediný produkt translace a vykazuje vlastnosti, pocházející od každého zdroje peptidu. Podobný způsob je aplikován na heterologní sekvence nukleových kyselin.

Dále mohou být nové konstrukty připraveny kombinací podobných fúnkčních domén z jiných proteinů. Např. domény nebo jiné úseky mohou být „vyměněny“ mezi odlišnými novými fúzními polypeptidy nebo fragmenty, většinou u podobných proteinů např. u lektinu nebo asialoglykoproteinových rodin. Výhodněji budou použity neporušené strukturní domény např. neporušené části Ig. Viz např. Cunningham a kol. (1989) Science 243:1330 až 1336 a O Dowd a kol. (1988) J, Biol, Chem. 263:15985 až 15992. Z fúnkčního spojení specifit, vážících protein a ostatních fúnkčních domén, budou tedy vznikat nové chimérické polypeptidy, vykazující nové kombinace specifit. Rovněž mohou být aplikovány mutageneze alaninu, výhodněji u zbytků, které jsou z hlediska struktury vně sekundární struktury, čímž bude vyloučena většina kritických zbytků, které obecně rozrušují terciární strukturu.

„Deriváty“ těchto DC antigenů zahrnují mutanty aminokyselinových sekvencí, glykosylační varianty a kovalentní nebo agregované konjugáty s jinými chemickými skupinami. Kovalentní deriváty mohou být připraveny připojením fúnkčních částí ke skupinám, které se • · ···· ·· · · ·· ·· • * « · · · · ···· ·«·· · · · · · · · • ···· ······ • · · · · · · · · ···· ··· ·· ···· ·· ·· nacházejí v postranních aminokyselinových řetězcích těchto DC proteinů nebo na N- nebo Ckonci, a to způsoby, které jsou v dané oblasti techniky dobře známé. Mezi tyto deriváty je možno zařadit, aniž by tím bylo zařazení limitováno, alifatické estery nebo amidy karboxylových konců nebo zbytků, obsahujících karboxylové postranní řetězce, O-acyl deriváty zbytků, obsahujících hydroxylové skupiny a N-acyl deriváty N-koncové aminokyseliny nebo zbytků, obsahujících aminoskupinu např. lysin nebo arginin. Acylové skupiny jsou vybírány ze skupiny alkylových skupin včetně běžných C3 až Cl 8 alkylů, čímž jsou tvořeny alkanoyl aroylové druhy. Kovalentní připojení k nosičovým proteinům může být důležité tehdy, když jsou imunogeními složkami hapteny.

Konkrétně jsou zahrnuty glykosylační alternativy např. vytvořené modifikováním průběhu glykosylace polypeptidu během jeho syntézy a zpracování nebo během dalších kroků, kdy je zpracováván. Konkrétně upřednostňované způsoby, jak toto provést, používají vystavení polypeptidu působení glykosylačních enzymů, pocházejících z buněk, které běžně tato zpracování realizují např. savčí glykosylační enzymy. Deglykosylační enzymy jsou rovněž sledovány. Rovněž jsou zahrnuty verze se stejnou primární aminokyselinovou sekvencí, které mají další minoritní modifikace včetně fosforylovaných aminokyselinových zbytků např. fosfotyrosin, fosfoserin nebo fosfothreonin nebo jiné skupiny včetně ribosylových skupin nebo zesíťovacích činidel. Jsou také zahrnuty proteiny, obsahující substituce, které by si měly udržovat významnou imunogenicitu pro přípravu protilátek, které rozpoznají protein o SEQ ID č: 2,4,8 nebo 10. Tyto proteiny budou v porovnání s odhalenou sekvencí obsahovat typicky substituce méně než 20 zbytků, většinou méně než 10 substitucí, výhodněji méně než 5 a nej výhodněji méně než 3. Jinak proteiny, které začínají a končí ve strukturních doménách si obvykle budou zachovávat antigenicitu a křížovou imunogenicitu.

Hlavní skupinu derivátů tvoří kovalentní konjugáty DC proteinů nebo jejich fragmentů s jinými proteiny nebo polypeptidy. Tyto deriváty mohou být syntetizovány v rekombinantní kultuře jako jsou N- nebo C-koncové fuze nebo použitím činidel, které jsou v dané oblasti techniky známé pro svou použitelnost v prokřížení proteinů, kdy se využívají jejich vedlejší reaktivní skupiny. Upřednostňovaná derivatizační místa proteinu pro zesíťovací činidla se nacházejí na volných amino skupinách, sacharidových částech a cysteinových zbytcích.

Rovněž jsou poskytovány fuzní polypeptidy těchto DC proteinů a jiných homologních nebo heterologních proteinů. Heterologní polypeptidy mohou být fůzemi mezi různými povrchovými značkami, za vzniku např. hybridního proteinu. Kromě toho mohou být heterologní fuze konstruovány tak, aby vykazovaly kombinaci vlastností nebo aktivit derivatizovaných proteinů. Typickými příklady jsou fuze oznamovatelského polypeptidu např. luciferázy s částí « « • · nebo doménou proteinu např. část pro vazbu receptorů, tak, že přítomnost nebo umístění fúzovaného proteinu může být snadno určeno. Viz např. Duli a kol., U.S. Patent č. 4859609. Jiní fuzní partneři jsou bakteriální β-galaktozidáza, trpE, Protein A, β-laktamáza, alfa amyláza, alkoholdehydrogenáza a α-feromon kvasinek. Viz např. Godowski a kol. (1988) Science 241:812 až 816.

Tyto polypeptidy mohou mít také aminokyselinové zbytky, které byly chemicky modifikovány fosforylací, sulfonací, biotinylací nebo přidáním nebo odstraněním dalších skupin, konkrétně těch, které mají molekulární tvar podobný fosfátovým skupinám. V některých provedeních budou modifikace sloužit jako užitečná značkovací činidla nebo budou sloužit jako purifikační cíle např. afmitní ligandy.

Předmětný vynález se také zabývá použitím jiných derivátů těchto DC proteinů než těch, které vznikly v důsledku změny v aminokyselinové sekvenci nebo při glykosylaci. Tyto deriváty mohou obsahovat kovalentní spojení s chemickými skupinami nebo jejich spojení za vzniku agregátu. Obecně tyto deriváty patří do 3 tříd: (1) soli, (2) kovalentní modifikace postranních řetězců nebo koncových zbytků a (3) adsorpční komplexy např. s buněčnými membránami. Tyto kovalentní nebo agregované deriváty jsou užitečné jako imunogeny, jako činidla při imunostanoveních nebo při purifikacích jako je afmitní purifikace ligandů nebo jiných vazebných ligandů. Např. pro použití při stanovení nebo purifikaci protilátek proti DC proteinu může být DC proteinový antigen známými způsoby imobilizován kovalentní vazbou na pevný nosič jako je Sepharosa, aktivovaná bromkyanem nebo adsorbován na polyolefínové povrchy, přičemž může, ale nemusí být použito prokřížení glutaraldehydem. Pro použití v diagnostických stanoveních mohou být také DC proteiny označeny detekovatelnou skupinou např. radiojodací s chloraminem T, kovalentně vázáným na cheláty kovů vzácných zemin nebo konjugováním na jinou fluorescenční skupinu. Purifikace těchto proteinů může být zlepšena použitím imobilizovaných protilátek.

Izolované geny pro DC protein umožňují transformaci buněk, kde nedochází k expresi odpovídajícího DC proteinu např. druhové typy nebo buňky, které postrádají odpovídající proteiny a vykazují negativní zpětnou aktivitu. U definovaných variant nebo u variant jediného druhu umožňuje exprese transformovaných genů izolaci antigenně čistých buněčných linií. Tento přístup umožňuje mnohem citlivější detekci a rozpoznání fyziologických účinků těchto DC proteinů. Subcelulámí části např. cytoplasty nebo části membrán mohu být izolovány a použity.

* · * · · · · · · · · · • 4 < ···· «

44·· · · · · *· « • ···· ······ • ···« ···· ···· ··· ·· ···· ·· ··

VIII. Komplexy vazebné činidlo: DC protein

DC protein, který se specificky váže nebo je specificky imunoreaktivní s protilátkou, vytvořenou proti definovanému imunogenu jako je imunogen, obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č: 2,4,8 nebo 10, je imunochemicky stanoven. Imunostanovení používá polyklonální antisérum, které je vytvořeno proti proteinu o SEQ ID č: 2,4,8 nebo 10. Toto antisérum je vybráno tak, aby vykazovalo malou křížovou reaktivitu s jinými členy příbuzných rodin a než je provedeno imunostanovení, je jakákoliv tato křížová aktivita odstraněna imunoabsorbcí.

Aby byla připravena antiséra pro použití v imunochemickém stanovení, je protein o SEQ ID č: 2,4,8 nebo 10 izolován postupem, který je zde popsán. Např. rekombinantní protein může být připraven v linii savčích buněk. Inbrední kmen myši jako je balb/c je s použitím standartního adjuvants, jako je Freundovo adjuvants, imunizován příslušným proteinem. Při imunizaci je postupováno podle standartního protokolu pro imunizaci myši (viz Harlow a Lané). Jako imunogen může být také použit syntetický peptid, odvozený od zde odhalených sekvencí a konjugovaný na nosičový protein. Při imunostanovení např. imunostanovení na pevné fázi s imunogenem, imobilizovaným na pevný nosič, jsou spojená polyklonální séra titrována proti imunogennímu proteinu. Jsou vybrána polyklonální antiséra stitrem 10⁴ a vyšším a je u nich pomocí imunostanovení, využívajícího kompetitivní vazbu jako je např. postup, popsaný v Harlow a Lané na stránkách 570 až 573, testována jejich křížová reaktivita s jinými příbuznými proteiny. Výhodněji jsou při tomto stanovení současně s daným DC proteinem použity dva odlišné příbuzné proteiny. Např. u lektinového proteinu jsou použity alespoň dva další členové rodiny proto, aby adsorbovali sdílené epitopy. Současně s DCMP1 jsou použity další dva členové této rodiny. Tito další členové mohou být připraveny jako rekombinantní proteiny a mohou být izolovány pomocí standartních technik, používaných v molekulární biologii a proteinové chemii, které jsou zde popsány.

Pro stanovení křížové reaktivity může být použito imunostanovení na základě kompetitivní vazby. Např. protein o SEQ ID č: 2 nebo 8 může být imobilizován na pevný nosič. Proteiny, přidané do stanovení, soutěží s antisérem o vazbu na imobilizovaný antigen. Schopnost výše uvedených proteinů soutěžit o vazbu na imobilizovaný protein je porovnávána s proteinem o SEQ ID č. 2 nebo 8. Procento křížové reaktivity pro výše uvedené proteiny je vypočítáno pomocí standartních výpočtů. Ta antiséra, jejichž křížová reaktivita s každým s výše uvedených proteinů je nižší než 10 %, jsou vybrána a shromážděna. Protilátky, které křížově reagují, jsou z antiséra odstraněny imunoabsorbcí výše uvedenými proteiny.

9 9 9 9 9 9 9 9 9 · 9 • t · · · · · · « » • 9 99 · · 9 9 99 9 ) 9 999 9 999 99 9 • 9 9 9 9 9 9 9 9

99 9 999 ·· 9999 99 99

Imunoabsorbovaná a spojená antiséra jsou poté použita při imunostanovení, využívajícího kompetitivní vazby, jak je popsáno výše, pro porovnání druhého proteinu s imunogenním proteinem (např. DC protein o SEQ ID č: 2 nebo 8). Aby bylo možno proteiny porovnat, je každý protein měřen v širokém rozsahu koncentrací a je stanoveno množství každého proteinu, které je potřebné pro 50 % inhibici vazby antiséra na imobilizovaný protein. Jestliže je množství druhého požadovaného proteinu nižší než dvojnásobek požadovaného množství proteinu o SEQ ID č. 2 nebo 8, pak je druhý protein označen za specificky se vážící na protilátku, vytvořenou proti imunogenu.

Je známo, že DC proteiny pravděpodobně tvoří rodinu homologních proteinů, které obsahují dva nebo více genů. Předmětný vynález neobsahuje zde odhalené aminokyselinové sekvence pouze pro konkrétní produkt genu jako je protein, patřící do rodiny lidských Ig, ale také pro další proteiny, jako jsou alelické, polymorfní, nealelické nebo druhové varianty. Je také známo, že termín „lidský DC protein“ zahrnuje nepřirozené mutace, způsobené záměrnou mutací běžnými rekombinantními technologiemi jako jsou jednobodová mutace nebo vystřihnuti krátkých úseků DNA, kódujících tyto proteiny nebo jako jsou střižné varianty z genu nebo substituce nebo přidání nových aminokyselin. Tyto minoritní změny musí zachovávat podstatnou imunoidentitu původní molekuly a/nebo její biologickou aktivitu. Tyto změny proto zahrnují proteiny, které jsou specificky imunoreaktivní s označeným přirozeně se vyskytujícím příslušným DC proteinem např. lidským DC proteinem o SEQ ID č: 4. Konkrétní proteinové modifikace, považované za minoritní, by měly zahrnovat konzervativní substituce aminokyselin s podobnými chemickými vlastnostmi, jak je popsáno výše pro každou rodinu proteinů jako celek. Optimálním uspořádáním proteinu s proteinem o SEQ ID č: 2 nebo 8 a použitím obvyklých imunostanovení, zde popsaných pro stanovní imunoidentity, lze určit proteinové prostředky vynálezu.

IX. Použití

Předmětný vynález poskytuje činidla, která budou nacházet použití v diagnostických aplikacích, což je zde popsáno, např. při obecném popisu vývojových abnormalit nebo níže při popisu diagnostických souprav. Konkrétně budou geny užitečné jako ukazatelé pro rozlišení buněčných typů včetně genomických buněčných aspektů, mRNA i průběhů exprese proteinu.

DC geny např. DNA nebo RNA mohou být použity jako součást forézních stanovení. Například poskytované nukleotidové sekvence mohou být označeny např. ³²P nebo biotinem a použity pro bloty pro zjištění polymorfismu standartních restrikčních fragmentů, čímž je získán * · «V·· ·« 99 ·· · » « · · · 9 ···* • · · · · * 9 · « · « • · · · · ·»«««· » · 9*9 · · · >

····*« · · ··♦» ·· 9» měřitelný charakter, což pomáhá při rozlišení jednotlivců. Tyto próby mohou být použity v dobře známých forézních technikách jako např. u otisků prstů. Nukleotidové próby, vytvořené ze sekvencí DC, mohou být dále použity při stanoveních, určených pro detekci chromozomálních abnormalit in šitu.

Protilátky a další vazebná činidla zaměřená na DC proteiny nebo nukleové kyseliny mohou být použity pro purifikaci odpovídající molekuly DC proteinu. Jak je popsáno níže v příkladech, purifikace DC proteinů pomocí protilátky je možná. Protilátky a další vazebná činidla mohou být rovněž použita v diagnostice pro určení, zdali jsou složky DC přítomny ve vzorku tkáně nebo buněčné populace. K tomu se používají zde popsané dobře známé techniky. Možnost navázat vazebné činidlo na DC protein poskytuje způsoby jak diagnostikovat onemocnění, která souvisí se špatnou regulací exprese. Protilátky a další vazebná činidla mohou být užitečné jako histologické nebo forézní ukazatele. Jak je popsáno v níže uvedených příkladech, je exprese každého z těchto proteinů omezena na specifické typy tkání. Použitím próby, jako je protilátka nebo nukleová kyselina, která přesně odpovídá příslušnému DC proteinu, je možné rozlišit tkáně nebo typ buňky in šitu nebo in vitro.

Předmětný vynález také poskytuje činidla, která mohou mít významnou terapeutickou hodnotu. DC proteiny (přirozeně se vyskytující nebo rekombinantní), jejich fragmenty a protilátky proti nim současně se sloučeninami, které byly identifikovány jako sloučeniny, vykazující vazebnou afinitu kDC proteinu, mohou být použity při léčbě stavů, spojených s abnormální fyziologií nebo vývojem včetně abnormálního rozmnožování např. kancerózní stavy nebo degenerativní stavy. Abnormální rozmnožování, regenerace, degenerace a atrofie mohou být odpovídající terapeutickou léčbou pomocí zde poskytovaných prostředků zmírněny. Např. onemocnění nebo porucha, související s abnormální expresí nebo abnormálním projevem DC např. jako antigen prezentující buňky, je cílem pro agonisty nebo antagonisty proteinu. Proteiny pravděpodobně hrají roli v regulaci nebo vývoji krvetvorných buněk např. lymfoidních buněk, které zhoršují imunologické odezvy např. prezentaci antigenů a vznikající funkce efektoru.

Další stavy, spojené s abnormálním vývojem, jsou známé v takových typech buněk, u kterých bylo pomocí Nothem blotu zjištěno, že mají mRNA pro DC protein. Viz Berkow The Merck Manual of Diagnosis and Therapy. Merck & Co. Rahway, NJ a Thom a kol Harrison s Principles of Intemal Medicine. McGraw-Hill, NY. Vývojové a funkční abnormality např. imunitního systému, způsobují abnormality, významné z pohledu medicíny a stavy, které lze ovlivnit a tím lze zahájit prevenci nebo léčbu pomocí prostředků, které jsou zde poskytovány.

·· ·«*· ·· 90 ·< ·· »*s ·····*«« »·» · · 9 · t « 0

9*99··· ·· • · 0 · 0 909»

9··· 000 00 ·>·· 00 ··

Rekombinantní DC proteiny nebo protilátky by mohly být purifikovány a poté podávány pacientovi. Pro terapeutické použití mohou být tato činidla kombinována s dalšími aktivními nebo inertními přísadami např. ve vhodných farmaceuticky přijatelných nosičích nebo ředidlech např. adjuvants pro imunizaci, spolu s fyziologicky neškodnými stabilizátory a pomocnými látkami. Konkrétně mohou být použity v souvislosti s očkovací látkou, kde je antigen kombinován s jednou z těchto terapeutických verzí agonistů nebo antagonistů. Tyto kombinace mohou být sterilně filtrovány a umístěny do dávkovačích forem např. lyofilizaci v dávkovačích lahvičkách („vialkách“) nebo mohou být skladovány ve formě stabilizovaných vodných preparátů. Tento vynález také obsahuje použití protilátek nebo jejich vazebných fragmentů včetně forem, které nejsou komplementně vazebné.

Testování léků pomocí protilátek nebo receptoru nebo jejich fragmentů může identifikovat sloučeniny, mající vazebnou afinitu k těmto DC proteinům včetně izolace s nimi spojených složek. Následující biologická stanovení mohou být poté využita pro stanovení, zdali má sloučenina vlastní stimulační aktivitu a tudíž je blokátorem nebo antagonistou v tom smyslu, že blokuje aktivitu proteinu. Sloučenina, disponující vlastní stimulační aktivitou by měla přes protein aktivovat buňku a tím je vlastně agonista vtom, že stimuluje buňku. Předmětný vynález dále obsahuje terapeutické použití protilátek proti proteinům jako antagonistů.

Množství látek, nezbytné pro účinnou terapii bude záviset na mnoha různých faktorech včetně způsobů podávání, cílového místa, fyziologického stavu pacienta a na dalších podávaných lécích. Dávky by tedy měly být titrovány, aby byla optimalizována bezpečnost a účinnost. Dávky, používané in vitro, mohou většinou poskytovat užitečný návod co se týče množství pro podávání těchto látek in šitu. Na základě testování dávek, účinných pro léčbu konkrétních onemocnění, u zvířat bude možno dále předpokládat dávkování u lidí. Různé úvahy jsou popsány např, vGilman a kol. (1990) Goodman and Gilmafrs: The Pharmacological Bases of Therapeutics (8. vydání) Pergamon Press a (1990) Remington s Pharmaceutical Sciences (17. vydání) Mack Publishing Co., Easton, PA. V těchto odkazech i dále v textu jsou diskutovány způsoby podávání např. orální, intravenózní, intraperitoneální nebo intramuskulámí podávání, transdermální difúze a další. Mezi farmaceuticky přijatelné nosiče je možno zařadit vodu, fyziologický roztok, pufry a další sloučeniny, popsané např. v Merck Index. Merck & Co., Rahway, NJ. U odpovídajícího nosiče lze rozmezí dávek očekávat v množstvích nižších než je koncentrace 1 mM, většinou bude koncentrace nižší než asi 10 μΜ, obvykle nižší než asi 100 nM, výhodněji nižší než asi 10 pM (pikomolámí) a nej výhodněji nižší než asi 1 fM (femtomolární). Pro kontinuální podávání budou často využívány formulace nebo aparáty, kdy dochází k pomalému uvolňování.

• ' · · · · • · · · • · · · · • ·

DC proteiny, jejich fragmenty a protilátky proti nim nebo jejich fragmentům, antagonisty a agonisty mohou být podávány přímo léčenému hostiteli nebo v závislosti na velikosti sloučenin může být žádoucí navázat je před jejich aplikací na nosičové proteiny jako je ovalbumin nebo sérový albumin. Terapeutické formulace mohou být podávány v mnoha vhodných dávkovačích formulacích. Zatímco účinné přísady je možno podávat samostatně, je upřednostňováno, aby byly prezentovány jako farmaceutické formulace. Formulace většinou obsahují alespoň jednu účinou složku, jak je definována výše, spolu s jedním nebo více přijatelnými nosiči. Každý nosič by měl být přijatelný jak farmaceuticky tak i fyziologicky v tom smyslu, že je slučitelný s ostatními složkami a není pro pacienty škodlivý. Formulace zahrnují takové, které jsou vhodné pro orální, rektální, nazální nebo parenterální (včetně podkožní, intramuskulární, intravenózní a intradermální) podávání. Formulace mohou být obyčejně prezentovány v jednotkových dávkovačích formách a mohou být připraveny jakýmkoliv způsobem, který je dobře znám ve farmaceutické oblasti. Viz např. Gilman a kol. (1990) Goodman and Gilman s: The Pharmacological Bases of Therapeutics (8. vydání) Pergamon Press a (1990) Remington s Pharmaceutical Sciences (17. vydání) Mack Publishing Co., Easton, PA; Avis a kol. (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications Dekker, NY; Lieberman a kol. (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets Dekker, NY a Lieberman a kol. (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems Dekker, NY. Terapie předmětného vynálezu může být kombinována s dalšími chemoterapeutickými nebo chemopreventivními činidly nebo může být použita ve spojení s nimi.

Přirozeně se vyskytující i rekombinantní forma DC proteinů předmětného vynálezu jsou konkrétně užitečné jako součást souprav a stanovení, pomocí kterých je možno u sloučenin testovat vazebnou aktivitu k proteinům. V poslední době bylo vyvinuto několik způsobů automatického stanovení, které umožňují testování desítek tisíců sloučenin během krátké doby. Viz např. Fodor a kol. (1991) Science 251:767 až 773. Také byly vyvinuty chemické rozmanité knihovny, které popisují způsoby testování vazebné afinity pomocí mnoha sloučenin. Vývoj vhodných stanovení může být velmi ulehčen tím, že bude dostupné velké množství purifikovaných např. rozpustných verzí DC proteinu, jak je poskytováno v předmětném vynálezu.

Jakmile je protein strukturálně definován, mohou být často nalezeny antagonisty. Testování případných proteinových analogů je nyní možné díky vývoji vysoce automatizovaných stanovení, využívajících purifikované povrchové proteiny. Konkrétně budou pomocí zde popsaných testovacích technik objeveny nové antagonisty a agonisty. Předmětem konkrétního zájmu jsou sloučeniny, u kterých byla nalezena kombinovaná vazebná afinita pro • · • · • · • · • · ···· ···« ···· ·· · ···« ··· · · · · ·· · • ··· ···· • t * · «· «·«· ·· «· mnohočetné podobné buněčné povrchové antigeny např. sloučeniny, které mohou sloužit jako antagonisty pro druhové varianty DC proteinu.

Tento vynález je konkrétně užitečný pro testování sloučenin pomocí rekombinantního DC proteinu v řadě technik na testování léků. Mezi výhody použití rekombinantního proteinu při testování specifických ligandů patří: (a) vylepšený obnovitelný zdroj proteinu ze specifického zdroje; (b) potenciálně vyšší počet antigenů, připadajících na jednu buňku, které poskytují lepší signál, aby byl zvýšen poměr ve stanoveních a (c) specifita druhové varianty (teoreticky poskytující lepší biologickou specifitu a specifitu vůči onemocnění).

Jeden způsob testování léku využívá eukaryotických nebo prokaryotických hostitelských buněk, které jsou stabilně transformovány rekombinantními molekulami DNA, exprimujícími DC protein. Buňky, které exprimují tento protein mohou být izolovány od jakýchkoliv jiných buněk. Tyto buňky, buď živé nebo ve fixované formě, mohou být použity pro standartní stanovení vazby povrchového proteinu. Viz také Parce a kol. (1989) Science 246:243 až 247 a Owicki a kol. (1990) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87:4007 až 4011, kde jsou popisovány citlivé způsoby detekce buněčných odezev. Kompetitivní stanovení je užitečné konkrétně v případě, kdy jsou buňky (zdroj DC proteinu) inkubovány s protilátkou, mající známou vazebnou afinitu k antigenu, jako je ¹²⁵I-protilátka a s testovaným vzorkem, jehož vazebná afinita k vazebnému prostředku je měřena. Navázané a volné značené vazebné prostředky jsou poté odděleny a je zjištěn stupeň navázání proteinu. Množství testované navázané sloučeniny je nepřímo úměrné množství značené protilátky, vážící se na známý zdroj. Pro separaci navázané a volné látky, aby byl stanoven stupeň navázání, může být použito mnoho technik. Tento separační krok většinou může zahrnovat postup jako je adheze na filtry, následovaná promytím, adheze na plasty, následovaná promytím nebo odstředění buněčných membrán. Pro testování účinků léku na funkce, zprostředkované tímto DC proteinem, např. prezentaci antigenu nebo na funkce pomocných látek, mohou být také použity živé buňky.

Jiný způsob využívá jako zdroj DC proteinu membrány z transformovaných eukaryotických nebo prokaryotických hostitelských buněk. Tyto buňky jsou stabilně transformovány DNA vektory, které řídí expresi příslušného proteinu např. upravené membránově vázané formy. Membrány by v podstatě měly být připraveny z buněk a použity při stanovení navázání jako je kompetitivní stanovení, které je zmíněno výše.

Ještě jiný přístup je použít rozpuštěný nepurifikovaný nebo rozpuštěný purifikovaný DC protein z transformovaných eukaryotických nebo prokaryotických hostitelských buněk. Tento přístup počítá při stanovení „molekulárního“ navázání s výhodami jako je zvýšená specifita, možnost automatizace, vysoká kapacita testování léků.

• · ·

Jiná technika testování léků zahrnuje přístup, který poskytuje vysokou kapacitu testování sloučenin, majících vhodnou vazebnou afinitu k příslušnému DC proteinu a je detailně popsán v patentové přihlášce Geysen, European patent Application 84/03564, publikované 13. září 1984. Nejprve je na pevném substrátu, např. plastikové jehličky nebo nějaké jiné vhodné povrchy, syntetizován velký počet odlišných malých peptidových testovaných sloučenin viz např. Fodor a kol. Poté všechny jehličky reagují s rozpuštěným nepurifikováným nebo rozpuštěným purifikovaným DC proteinem a jsou promyty. Následujícím krokem je detekce navázané látky např. protilátky.

Jednou z možností jak stanovit, která místa interagují s jinými specifickými proteiny, je stanovení fyzikální struktury např. rentgenovou krystalografií nebo dvourozměrným NMR. Tyto budou poskytovat návod, které aminokyselinové zbytky tvoří molekulové kontaktní oblasti. Podrobný popis stanovení proteinové struktury je uveden např. v Blundell a Johnson (1976) Protein Crystallography Academie Press, NY.

X. Soupravy

Tento vynález se rovněž zabývá použitím DC proteinů, jejich fragmentů, peptidů a jejich fuzních poduktů v různých diagnostických soupravách a při detekci přítomnosti DC proteinu nebo zprávy o něm. Většinou bude souprava obsahovat složku, obsahující buď definovaný DC peptid nebo úsek genu nebo látku, např. protilátku, která rozpozná jeden nebo druhý.

Souprava, pomocí které je stanovena vazebná afinita testované sloučeniny k příslušnému DC proteinu, by měla většinou obsahovat testovanou sloučeninu, značenou sloučeninu např. protilátku se známou vazebnou afinitou pro protein, zdroj DC proteinu (přirozeně se vyskytující nebo rekombinantní) a prostředky, sloužící k separaci navázané a volné značené sloučeniny jako je např. pevná fáze pro imobilizaci DC proteinu. Jakmile jsou sloučeniny otestovány, mohou být ty, které vykazují vhodnou vazebnou afinitu k proteinu, zhodnoceny ve vhodných biologických stanoveních, které jsou dobře známé v dané oblasti techniky. Toto se provádí proto, aby bylo určeno, zdali při regulaci funkce DC pracují jako agonisty nebo antagonisty. Dostupné rekombinantní DC polypeptidy také poskytují dobře definované standardy pro kalibrování těchto stanovení.

Upřednostňovaná souprava pro stanovení koncentrace např. DC proteinu ve vzorku, by měla většinou obsahovat značenou sloučeninu se známou vazebnou afinitou k DC proteinu např.

protilátku, zdroj DC proteinu (přirozeně se vyskytující nebo rekombinantní) a prostředek pro • * separaci navázané formy od volné značené sloučeniny např. pevnou fázi pro imobilizaci DC proteinu. Běžně jsou v soupravě poskytovány součásti, obsahující látky a návody.

Protilátky včetně fragmentů, které vážou antigen, specifické pro příslušný DC protein nebo jeho fragmenty jsou užitečné v diagnostických aplikacích a to pro detekci přítomnosti zvýšených hladin proteinu a/nebo jeho fragmentů. Tato diagnostická stanovení mohou používat lyzáty, živé buňky, fixované buňky, imunofluorescenci, buněčné kultury, tělní tekutiny a dále mohou zahrnovat detekci antigenů v séru apod. Diagnostická stanovení mohou být homogenní (bez separačního kroku, kdy jsou odděleny volná látka a komplex antigen:DC protein) nebo heterogenní (s tímto separačním krokem). Existují různá komerční stanovení jako je radioimunoanalýza (RIA), heterogenní kompetitivní EIA s použitím imunosorbentu (ELISA), enzymová imunoanalýza (EIA), homogenní enzymová imunoanalýza (EMIT), imunoanalýza s fluorescenčně značeným substrátem (SLFIA) apod.. Např. mohou být použity neznačené protilátky a to tehdy, když je použita sekundární protilátka, která je označena a která rozpoznává protilátku proti DC proteinu nebo proti jeho konkrétnímu fragmentu. Podobné analýzy byly podrobně diskutovány v literatuře. Viz např. Harlow a Lané (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, NY; Chán (1987) Immunoassay: A Practical Guide Academie Press, Orlando, FL; Price a Newman (1991) Principles and Practice of Immunoassay Stockton Press, NY a Ngo (1988) Nonisotopic Immunoassay Plenům Press, NY. Látky mohou být konkrétně užitečné pro diagnostikování populací DC v biologických vzorcích s cílem detekovat přebytek nebo nedostatek DC ve vzorku. Stanovení může být zaměřeno na histologickou analýzu biopsie nebo na stanovení DC v krvi nebo vzorku tkáně.

Antiidiotypické protilátky mohou být podobně využity při diagnostikování přítomnosti protilátek proti DC proteinu a tak mohou být používány jako diagnostické prostředky různých abnormálních stavů. Např. v důsledku nadměrné produkce DC proteinu může dojít k různým imunologickým reakcím, které mohou být diagnostickým prostředkem abnormálních fyziologických stavů, konkrétně stavů, souvisejících s rozmnožováním buněk, jako je maligní nádor nebo abnormální diferenciace.

Často jsou látky pro diagnostická stanovení dodávány v soupravách, Čímž lze optimalizovat citlivost stanovení. Pro předmětný vynález je v závislosti na povaze stanovení poskytován protokol a značka, značená nebo neznačená protilátka nebo receptor nebo značený DC protein. Tyto součásti jsou obvykle dodávány spolu s ostatními přídavnými látkami jako jsou pufry, stabilizátory, materiály, nezbytné pro vytvoření signálu jako jsou substráty pro enzymy apod. Výhodněji budou soupravy rovněž obsahovat návody pro použití a instrukce, týkající se likvidace použitého materiálu. Souprava většinou obsahuje složky pro každou užitečnou látku.

• ···· ···· ······· · · · · · · « * · ·

Látky jsou poskytovány jako suchý lyofilizovaný prášek, který může být rozpuštěn ve vodném médiu tak, aby byly získány koncentrace látek, vhodné pro stanovení.

Mnoho z výše zmíněných součástí testování léků a diagnostických stanovení mohou být použity bez modifikace nebo mohou být modifikovány v různých směrech. Například značení může být provedeno kovalentním nebo nekovalentním připojením skupiny, která přímo nebo nepřímo poskytuje detekovatelný signál. V řadě těchto stanovení mohou být značeny protein, testovaná sloučenina, DC protein nebo protilátka proti němu a to buď přímo nebo nepřímo. Mezi skupiny, které je možno použít pro přímé značení patří: radioznačky jako je ¹²⁵I, enzymy (U.S. Pat. č. 3645090) jako je peroxidáza a alkalická fosfatáza a fluorescenční značky (U.S. Pat. č. 3940475, které jsou schopné monitorovat změnu intenzity fluorescence, změnu vlnové délky nebo fluorescenční polarizaci. Mezi možnosti nepřímého značení patří biotinylace jedné složky, následovaná navázáním na avidin, který je vázán na jednu z výše uvedených skupin značek.

Existuje také řada způsobů separace navázaného a volného proteinu nebo také navázané a volné testované sloučeniny. DC protein může být imobilizován na různé matrice a po imobilizaci následuje promytí. Vhodné matrice zahrnují plasty jako jsou mikrotitrační destičky pro ELISA, filtry a kuličky. Způsoby imobilizace DC proteinu na matrici zahrnují, aniž by tím však byly omezeny, přímou adhezi na plast, použití zachycující protilátky, chemické spojování a systém biotin-avidin. Posledním krokem v tomto přístupu je srážení komplexu protein/protilátka jedním z několika způsobů včetně těch, které využívají např. organická rozpouštědla jako je polyetylenglykol nebo soli jako je síran amonný. Další vhodné separační techniky zahrnují, aniž by tím však byly limitovány, způsob, využívající magnetických částic s protilátkou, značenou fluoresceinem, v/zRattle a kol. (1984) Clin, Chem. 30:1457 až 1461 a separaci pomocí magnetických částic, která je popsána v U.S. Pat. č. 4659678.

Způsoby spojení proteinů nebo jejich fragmentů s různými značkami jsou podrobně popsány v literatuře a tudíž zde nevyžadují podrobnější diskusi. Mnoho technik používá pro spojení pro vznik peptidových vazeb aktivované karboxylové skupiny, buď prostřednictvím použití karbodiimidu nebo aktivních esterů, pro tvorbu thioesterů reakci merkapto skupiny s aktivovaným halogenem jako je chloroacetyl nebo aktivovaný olefin jako je maleimid apod.

V těchto aplikacích nalézají použití rovněž fuzní proteiny.

Jiným diagnostickým aspektem předmětného vynálezu je použití oligonukleotidových nebo polynukleotidových sekvencí, vybraných ze sekvence příslušného DC proteinu. Tyto sekvence mohou být použity jako próby pro detekování hladiny zprávy ve vzorku od pacientů, u nichž je podezření na výskyt abnormálních stavů např. maligní nádor nebo imunitní problémy.

V literatuře byly podrobně popsány a diskutovány příprava RNA i DNA nukleotidových sekvencí, značení sekvencí i upřednostňované velikosti sekvencí. Oligonukleotidová próba by měla běžně mít alespoň 14 nukleotidů, obvykle alespoň asi 18 nukleotidů a velikost polynukleotidové próby by měla být do několika kilobází. Mohou být použity různé značky, nejběžněji radionuklidy, konkrétně ³²P. Avšak mohou být použity rovněž jiné techniky jako je technika, používající pro začlenění do polynukleotidu biotinem modifikované nukleotidy. Biotin pak slouží jako místo pro navázání na avidin nebo protilátek, které mohou být značeny různými značkami jako jsou radionuklidy, fluorofory, enzymy apod. Také mohou být použity protilátky, které mohou rozeznat specifické duplexy včetně duplexů DNA, RNA, hybridů DNA-RNA nebo duplexů DNA-protein. Protilátky mohou být označeny a může být provedeno stanovení, kdy je duplex vázán na povrch, takže podle tvorby duplexu na povrchu může být detekována přítomnost protilátky, navázané na duplex. Próby k nové protisměrné („anti-sense“) RNA mohou být použity v jakékoliv odpovídající technice jako je hybridizace nukleových kyselin, testování plus a minus řetězců, rekombinační detekování a translace, ovlivňované hybridem (HRT a HART). Toto také zahrnuje amplifikační techniky jako je polymerázová řetězová reakce (PCR).

Diagnostické soupravy, pomocí nichž se kvalitativně nebo kvantitativně testuje přítomnost dalších značek, jsou rovněž obsaženy. Diagnóza nebo prognóza mohou záviset na kombinaci mnohočetných indikací, použitých jako ukazatelů. Proto soupravy mohou být použity pro testování kombinací těchto ukazatelů. Viz např. Viallet a kol. (1989) Progress in Growth Factor Res. 1:89 až 97.

XI. Izolace vazebného partnera

Jestliže je izolován jeden člen vazebného partnera specifické interakce, existují způsoby, jak izolovat druhého partnera. Viz Gearing a kol. (1989) EMBO J. 8:3667 až 3676. Například mohou být určeny způsoby značení povrchu DC proteinu, aniž by došlo k interferenci s navázáním na receptor. Například afinitní značka může být fúzována s amino nebo karboxykoncem ligandu. U expresní knihovny může být testováno specifické navázání na DC protein např. výběrem buněk nebo jinými testováními, jejichž cílem je detekovat subpopulace, které exprimují tuto vazebnou složku. Viz např. Ho a kol. (1993) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90:11267 až 11271. Také může být použit afinitní způsob. Viz např. Seed a Aruffo (1987) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84:3365 až 3369. Může být také aplikován dvou-hybridový selekční systém, který vytváří s dostupnýmmi sekvencemi DC proteinu odpovídající konstrukty. Viz např. Fields a Song (1989) Nátuře 340:245 až 246.

• « • · · · • ···· ···· ««···«· «· « · · · ·· · ·

Při izolaci vazebných partnerů DC proteinu mohou být aplikovány techniky prokřížení proteinů s použitím značky. Toto by mělo umožnit identifikaci proteinů, které specificky interagují s odpovídajícím DC proteinem.

Široký rozsah tohoto vynálezu bude nejlépe pochopen s pomocí následujících příkladů, které však vynález nijak neomezují pouze na specifická provedení.

Příklady provedení vynálezu

I. Obecné metody

Rada z níže uvedných standartních metod je popsána nebo je na ně odkazováno např. v Maniatis a kol. (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY; Sambrook a kol. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. vydání) Sv. 1 až 3, CSH Press, NY; Ausubel a kol., Biology Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY nebo Ausubel a kol. (1987 a doplňky) Current Protocols in Molecular Biology Wiley/Green, NY; Innis a kol. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications Academie Press, NY.

Mezi způsoby purifikace proteinů patří např. srážení síranem amonným, chromatografie na kolonách, elektroforéza, odstřeďování, krystalizace a jiné. Viz např. Ausubel a kol. (1987 a periodické doplňky); Deutscher (1990) „Guide to Protein Purification“, Methods in Enzymology sv. 182 a další svazky této série; Coligan a kol. (1996 a periodické doplňky) Current Protocols in Protein Science Wiley/Greene.NY a firemní literatura, týkající se použití produktů purifikace proteinů např. Pharmacia, Piscataway, NJ nebo Bio-Rad, Richmond, CA. Kombinace s rekombinantními technikami umožňuje fůzi s odpovídajícími úseky např. FLAG sekvencí nebo ekvivalenty, které mohou být fúzovány přes sekvenci, kterou lze odstranit proteázou. Viz např. Hochuli (1989) Chemische Industrie 12:69 až 70; Hochuli (1990) „Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent“ v Setlow Genetic Engineering. Principle and Methods 12:87 až 98, Plenům Press, NY a Crowe a kol. (1992) OIAexpress: The Iligh LeVel Expression & Protein Purification System QUIAGEN, lne., Chatsworth, CA.

Metody stanovení imunologické funkce jsou popsány např. v Coligan a kói. (1992 a periodické doplňky) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene, NY. Viz také např. Pául (1993) Fundamental Immunology (3. vydání) Raven Press, NY.

Analýzy pomocí průtokové cytometrie (FACS) jsou popsány vMelamed a kol. (1990) Flow Cytometry and Sorting Wiley-Liss, lne., New York, NY; Shapiro (1988) Practical Flow • · ·«»· ·· · · · · ·»· · · · » · · » ···· · * · ·· • · · · · ····· • ···· ··· ······· · · ···· · ·

Cvtometry Liss, New York, NY a Robinson a kol. (1993) Handbook of Flow Cvtometry Methods Wiley-Liss, New York, NY.

II. Vytvoření dendritických buněk

Lidské CD34+ buňky byly získány následujícím způsobem. Viz např. Caux a kol. (1995) str. 1 až 5 v Banchereau a Schmitt Dendritic Cells in Fundamental and Clinical Immunology Plenům Press, NY. Periferní nebo krevní buňky chordy, někdy vybrané CD34+, byly * kultivovány v přítomnosti kmenového buněčného faktoru (SCF), GM-SCF a TNF-a v médiu RPMI 1640 bez endotoxinu (GIBCO, Grand Island, NY), které bylo doplněno následujícími ^s látkami: 10 obj. % tepelně inaktivované zárodečné hovězí sérum (FBS; Flow Laboratories,

Irvine, CA), 10 mM HEPES, 2 mM L-glutamin, 5x10⁵ M 2-merkaptoetanol, penicilín (100 mg/ml). Toto médium je označováno jako kompletní médium.

CD34+ buňky byly namnoženy v baňkách o ploše 25 až 75 cm² (Corning, NY), kam byly dány v koncentracích 2 χ 10⁴ buněk/ml. Optimální podmínky byly udržovány tím, že tyto kultury byly v 5 a 10 dnu pasážovány do média, obsahujícího čerstvý GM-CSF a TNF-a (koncentrace buněk 1-3 χ 10⁵ buněk/ml). V určitých případech byly buňky asi v 6 dni rozděleny pomocí průtokové cytometrie (FACS) pro expresi CDla.

V určitých případech byly buňky běžně sklízeny po 12 dnech kultivace, přičemž případné přichycené buňky byly získány zpět pomocí roztoku 5 mM EDTA. V jiných případech byly CDla+ buňky aktivovány pomocí resuspendování v kompletním médiu na koncentraci 5 χ 10⁶buněk/ml. Aktivace roztokem phorbol 12-myristát 13-octanu o koncentraci 1 mg/ml (PMA, Sigma) a ionomycinem o koncentraci 100 ng/ml (Calbiochem, La Jolla, CA) probíhala odpovídající dobu (např. 1 nebo 6 h) Tyto buňky byly dále množeny po dobu 6 dní a poté byla * pro přípravu cDNA knihovny izolována RNA.

III. Izolace RNA a sestavování knihovny

Celková RNA je izolována např. postupem, který používá gradient guanidin thiokyanát/CsCl, který je popsán v Chirgwin a kol. (1978) Biochem. 18:5294 až 5299.

Poly(A)+ RNA je také možno izolovat pomocí soupravy pro izolaci mRNA OLIGOTEX (QIAGEN). Dvouvláknová cDNA je vytvořena pomocí např. plasmidového systému pro syntézu cDNA SUPERSCRIPT (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) a klonováním plasmidu. Vznikající • « dvouvláknová cDNA je jednosměrně klonována např. v pSportl a transfektována elektroporací do buněk ELECTROMAX DH10BTM (Gibco BRL, Gaithersburg, MD).

IV. Sekvenování

DNA, izolovaná z náhodně vybraných klonů nebo po subtraktivní hybridizaci pomocí neaktivovaných buněk, byly podrobeny standartní sekvenční analýze nukleotidů. Může být použita sekvenační souprava Taq Dideoxy Terminátor (Applied Biosystems, Foster City, CA). Značené DNA fragmenty jsou separovány v sekvenačním gelu odpovídajícího automatického sekvenátoru. Jinak může být izolovaný klon sekvenován postupem, popsaným např. v Maniatis a kol. (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press; Sambrook a kol. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. vydání) sv. 1 až 3, CSH Press, NY; Ausubel a kol., Biology Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY nebo Ausubel a kol. (1987 a dopňky) Current Protocols in Molecular Biology Greene/Wiley, New York. Dostupné jsou také chemické sekvenační metody např. sekvenování podle Maxama a Gilberta.

V. Rekombinantní gen DC

Poly(A)⁺ RNA je izolována z vhodné buněčné populace např. pomocí soupravy FastTrack mRNA (Invitrogen, San Diego, CA). Vzorky jsou podrobeny elektroforéze např. v 1 % agarózovém gelu, obsahujícím formaldehyd a jsou přeneseny na membránu GeneScreen (NEN Research Products, Boston, MA). Je provedena hybridizace např. při 65 °C v 0,5 M NaHPCL, pH 7,2, 7 % SDS, 1 mM EDTA a 1 % BSA (frakce V) s genovou cDNA DC, značenou ³²P-dCTP, o koncentraci 10⁷ cpm/ml. Po hybridizaci jsou filtry promyty 3 krát při 50 °C v roztoku 0,2 x SSC, 0,1 % SDS ajsou exponovány na film po dobu 24 h.

Rekombinantní gen může být použit pro vytvoření próby pro detekování zprávy. Inzert může být vyříznut a použit při detekcích, popsaných výše.

VI. Exprese proteinu, kódovaného genem DC, v E. coli

Pro přípravu konstruktu, obsahujícího otevřený čtecí rámec, výhodněji ve spojení s náležitým promotorem, selekcí a regulátorovými sekvencemi, je používána PCR. Vznikající expresní plasmid je transformován do odpovídajícího kmene E. coli, např. Topp5 (Stratagene, La • ·

Jolla, CA). Transformanty, rezistentní k ampicilinu (50 pg/ml), jsou pěstovány v médiu Luria Broth (Gibco) při 37 °C až do doby, kdy dosáhne absorbance při 550 nm hodnoty 0,7. Rekombinantní protein je indukován 0,4 mM isopropyl-bD-thiogalaktopyranosidem (Sigma, St. Louis, MO) a inkubace buněk pokračuje při 20 °C dalších 18 h.. Buňky z 1 1 kultury jsou odstředěny a resuspendovány např. ve 200 ml ledem chlazeného roztoku 30 % sacharózy, 50 mM Tris HCl pH 8,0, 1 mM etylediamintetraoctové kyseliny. Po 10 min v ledu je přidáno takové množství ledem chlazené vody, že konečný objem je 2 1. Po 20 min. v ledu jsou buňky odstředěny a supernatant je vyčeřen pomocí filtrace přes 5 μΜ Millipak 60 (Millipore Corp., Bedford, MA).

Rekombinantní protein je purifikován standartními purifikačními technikami např. různými iontově výměnnými chromatografiemi.

Rovněž mohou být použity imunoafmitní techniky s použitím protilátek, které jsou popsány níže. Afmitní metody mohou být použity tam, kde je epitop zapojen do expresního konstruktu.

VII. Mapování lidských genů DC

Izolace DNA, štěpení restrikčními enzymy, elektroforéza vagarózovém gelu, přenos Southern blotem a hybridizace jsou provedeny podle standartních technik. Viz Jenkins a kol. (1982) I Virol. 43:26 až 36. Bloty mohou být provedeny na nylonovou membránu Hybond-N (Amersham). Próba je označena ³²P-dCTP, promytí je provedeno až do dosažení konečných hodnot např. 0,lX SSC, 0,1 % SDS, 65 °C.

S PCR také může být kombinován panel hybridních myšších somatických buněk BIOS Laboratories (New Haven, CT). Viz Fan a kol. (1996) Immunogenetics 44:97 až 103.

Chromozomální lokalizace u Stanford G3 panelu dávala jako nejbližší značku SHGC12041 s hodnotou pro vazbu (lod) 7,7. Tato značka, což je gen, kódující antigen M130, je umístěna na chromozómu 12pl3. Toto místo je hostitelem řady genů, kódujících receptory rodiny lektinů C-typu, zejména CD69 a rodiny receptorů NK.

VIII. Analýza jednotlivých variací

Pro vzorkování od jednotlivců je podle údajů, týkajících se distribuce vybrán hojně se vyskytující, snadno dostupný typ buněk. Pomocí PCR technik je analyzován obsah tohoto genu u široké populace jednotlivců. cDNA nebo jiné způsoby PCR jsou používány pro sekvenování odpovídajícího genu v různých jednotlivcích a jejich sekvence jsou porovnány. To naznačuje míru rozdílnosti mezi rasově rozdílnými nebo jinými populacemi, i stanovení toho, které zbytky je možno modifikovat, aniž by došlo k významnějšímu ovlivnění jejich funkce.

IX. Příprava protilátek

Rekombinantní DC proteiny jsou vyráběny expresí v E. coli, což je ukázáno výše, a jsou testovány jejich biologické aktivity. Přirozené zdroje proteinů mohou být také použity u vhodných purifikačních postupů. Protilátky mohou být použity při imunopurifikaci nebo při sledování separačních postupů. Pro imunizaci vhodných savců mohou být použity aktivní nebo denaturované proteiny s cílem připravit polyklonální sérum nebo monoklonální protilátky.

X. Izolace protějšků genů DC z primáta nebo hlodavce

Klony lidské cDNA, kódující tyto geny, jsou použity jako próby nebo pro navržení PCR primerů proto, aby byly nalezeny protějšky v různých druzích primáta např. šimpanze.

Bioinformatika vybírá pomocí předpovězené polypeptidové sekvence DCMP1 (tblastn algoritmus) z EST databází (GenBank dbEST) odpovídající myšší klony, kódující protein, který je homologní sDCMPl primáta. Byly nalezeny 4 klony, odpovídající této sekvenci: AA387662 Ko myššího embrya 115dpc; AA170532 z myšší sleziny; AA475012 z myšší mléčné žlázy a AA423158 myšší mléčné žlázy. Jeden z nich, AA170532, který byl na základě sekvenční analýzy definován jako celý klon, byl vybrán a byla u něj sekvenována DNA. Tento klon obsahuje charakteristické znaky podobné jako má DCMP1. Celý klon má velikost 1418 bp, vyjma poly-A sekvence a obsahuje 5'UTR o velikosti 278 bp. Stejně jako pro hDCMPl není obsažen domnělý startovní kodón před konsenzuální Kozák oblastí, ale tento kodón se nachází za stop kodónem, který je vupstream oblasti. 5 'UTR obsahuje sekvence, podobné signálům pro rychlou degradaci včetně tří konsenzuálních míst ATTTA. Je pozorována významná polyadenylační sekvence. Předpovězený polypeptid je dlouhý asi 238 zbytků a kóduje membránový protein typu II s ΙΤΓΜ doménou a s lektinovou doménou C-typu. Byla zjištěna 3 silná N-glykosylační místa. Srovnání tohoto a lidského proteinu ukazuje asi 54 % identitu, 65 % homologii celé sekvence. Zejména ITIM domény jsou vysoce konzervativní (13 z 15 zbytků je identických). Předmětem zájmu je konzervativní glutaminový motiv v blízkosti membrány (FQKYSQLLE) a cysteinový zbytek, který může být příležitostně začleněn do tvorby disulfidového můstku. Stejně také lektinové domény C-typu ukazují konzervativní bloky včetně • ···· ···· ······· · · ···· · · ··

EPS motivu. Rozdíly, pozorované mezi hDCMPl a lidskými jatemími lektiny, jsou pozorovány i vmyšší sekvenci, zejména nahrazení tryptofanu v pozici 119 a 163; glutaminu v pozici 177 a šeřinu místo tryptofanu v pozici 228. Tento klon se tedy jeví jako myšší homolog hDCMPl.

XI. Použití činidel pro analýzu buněčných populací

Detekce hladiny dendritických buněk, přítomných ve vzorku, je důležitá pro diagnostikování neobvyklých stavů onemocnění. Např. zvýšení počtu dendritických buněk v tkáni nebo lymfatickém systému může naznačovat přítomnost hyperlazie DC nebo odhojení tkáně nebo štěpu. Populace s malým počtem DC může naznačovat abnormální reakci na např. bakteriální nebo virovou infekci, což může vyžadovat odpovídající léčbu, vedoucí k normalizaci odezvy DC.

Pro stanovení počtu DC, přítomných ve směsi buněk např. PBMC, adherentních buněk apod. je použita průtoková cytometrie pomocí značených vazebných činidel, specifických pro povrchové DC proteiny, viz např. Melamed a kol. (1990) Flow Cytometry and Sorting WileyLiss, lne., New York, NY; Shapiro (1988) Practical Flow Cytometry Liss, New York, NY a Robinson a kol. (1993) Handbook of Flow Cytometry Methods Wiley-Liss, New York, NY. Vazebné činidlo je také používáno pro histologickou analýzu tkáňových vzorků, čerstvých nebo fixovaných, s cílem analyzovat infiltraci DC. Mohou být stanoveny rovněž odlišné buněčné populace a to při stanovení, během kterého dochází ke zničení buňky nebo v určitých stanoveních, kdy si buňky zachovávají životaschopnost.

Analýza přítomnosti rozpustných intracelulárních molekul je provedena např. s fluorescenčním vazebným činidlem, specifickým pro DC jak popisuje Openshaw a kol. (1995) J. Exp. Med. 182: 1357 až 1367. Také mohou být použity způsoby, fixující tkáň nebo buňky.

Hladiny transkriptů jsou kvantifikovány např. pomocí semikvantitativní PCR, popsané vMurphy a kol. (1993) J. Immunol, Methods 162:211 až 223. Primery jsou navrženy tak, že genomová DNA není detekována.

XII. Rozložení exprese

Analýza celé sekvence cDNA DCMP1 v databázi sekvencí odhalila profil exprese, omezený na určitý počet knihoven. Nejvyšší počet sekvencí (deset) byl zjištěn v knihovnách dendritických buněk, čtyři sekvence v knihovně osteoklastomických buněk a po jediné sekvenci v knihovnách makrofágů, vytvořených in vitro z monocytů, neurofilů aktivovaných LPS, • » chondrosarkomu, maligního nádoru tlustého střeva, T-buněk lymfomy, kožního nádoru a chronické synovitidy. V GenBank dbEST byly zjištěny čtyři klony: AA418441, odečtený z knihovny; AA446401, celý plod; AA677149, slezina jater plodu; CO1555, povahy lidského genu; AA380065, kožní nádor.

Analýza exprese DCMP1 pomocí RT-PCR u řady různých buněčných linií a čerstvě izolovaných buněk ukazovala, že exprese DCMP1 není detekována v TF1 (myeloidní prekurzor), Jurkat (linie T buněk), CHA (maligní nádor ledvin), MRC5 (fibroblasty plic zárodku), JY (linie B buněk), U937 (linie buněk myelo-monocytického lymfomu), ale je omezena na krvetvorné buňky. U čerstvě izolovaných buněk byla exprese pozorována v aktivovaných i neaktivovaných DC; v aktivovaných granulocytech; aktivované i neaktivované PBL a v nízkých hladinách byla pozorována v aktivovaných monocytech a aktivovaných B buňkách. Všechny aktivované vzorky byly buňky, ošetřené PMA/ionomycinem po dobu 1 a 6 h.

Další analýza ukazovala, že exprese DCMP1 závisí na aktivačním stavu buňky. Pro detekci exprese DCMP1 v různých stádiích aktivace byla také použita RT-PCR. B buňky, izolované z tenzilární tkáně, byly ošetřovány PMA/ionomycinem po dobu 1 nebo 6 h nebo byly 3,12 a 24 h společně kultivovány sL buňkami, exprimujícími CD40L. mRNA byla detekována v neaktivovaných buňkách. Ke ztrátě této exprese může dojít po 1 h působení systému PMA/ionomycin a po 3 h působení CD40L. Naopak žádná exprese nebyla v T buňkách zjištěna ani po inkubaci s anti-CD3/anti-CD28.

V buňkách, odvozených od CD34+, byla v přítomnosti M-CSF zjištěna velmi silná exprese DCMP1 v makrofázích, pocházejících z CD34+ progenitorových buněk. Nezdálo se, že by tato exprese měla být v důsledku působení PMA/ionomycin změněna. V DC, odvozených z CD34+ progenitorových buněk v přítomnosti GM-CSF a TNFa, bylo pozorováno, že se hladina mRNA liší podle časového průběhu kultury, přičemž vyšší množství mRNA byla detekována 12 den kultury. Po 48 h společné kultivace sL buňkami, nesoucími CD40L, byla exprese DCMP1 ztracena. U DC, in vitro vybraných 6 den pomocí FACS pro přítomnost značek CDla/CD14 a kultivovaných dále po dobu 6 dní, bylo detekováno více mRNA v subpopulaci CD 14 než v CDla. Tato exprese byla snížena působením PMA/ionomycinu.

V monocytech, izolovaných z krve, nebyla v neaktivovaných buňkách detekována žádná mRNA. Avšak exprese DCMP1 byla detekována po 6 h působení PMA/ionomycinu. VDC, získaných z monocytů pomocí GM-CSF a IL-4, byla zvýšena exprese DCMP1. Tato exprese by neměla být působením PMA/ionomycin změněna, ale mohla by být snížena společnou kultivací sL buňkami, exprimujícími CD40L. V případě DCMP1 byla exprese mRNA zcela ztracena během 24 h. Exprese lidského proteinu byla potvrzena pomocí detekce protilátkou.

• ·

DCMP1 byl exprimován v podskupinách DC, izolovaných ex vivo. Podskupiny DC, izolované z krve nebo tonzilární tkáně, byly charakterizovány na základě přítomnosti nebo nepřítomnosti integrinu CD 11c. Larson a Springer (1990) Immunol. Rev. 114:181 až 217. CD1 lc+ podskupina DC, izolovaná z krve (také známé jako GCDC) exprimuje DCMP1. Avšak po aktivaci prostřednictvím protilátky anti-CD40L nebo působení PMA/ionomycin nebyla detekována žádná mRNA. Naopak stejná podskupina buněk, izolovaných z tonzilární tkáně déle neexprimuje DCMP1. V případě CDllc-DC podskupiny je v buňkách, izolovaných z krve, zjištěna nízká hladina exprese. Tato exprese je vyšší v buňkách, izolovaných z tonzilární tkáně, ale opět je při aktivaci prostřednictvím anti-CD40 protilátky nebo působením PMA/ionomycin snížena. Langerhansovy buňky, izolované z kůže, exprimují DCMP1, zatímco okolní bazální buňky nikoliv.

XIII. DCMP1 z primáta

Sekvenční analýza naznačuje, že DCMP jsou členy lektin/asialoglykoproteinové superrodiny receptorů. Konkrétně hepatické a makrofágové lektiny jsou spojeny s internalizací proteinů a peptidů, které, mohou být důležité např. při přijetí a prezentaci antigenu dentritickými buňkami. DCMP1 obsahuje intemalizační motiv (YxxV) nebo motiv podobný ITIM (IxYxxV; zbytky 5 až 10 v SEQ ID č:2 a prodlouženější motiv začínající od zbytku 1 do zbytku 24). Toto naznačuje, že protein může být verze dendritické buňky z rodiny inhibičních receptorů (KIR, LIR apod.), které vysílají negativní signál pro inhibici buněčné funkce.

Domnělý otevřený čtecí rámec začíná okolo nukleotidu 242. Tento eventuální startovní kodón není ve shodné Kozák sekvenci, ale protože není uveden alternativním ATG a protože stop kodón existuje v upstream pozici 200, předpokládá se, že toto je start kódovaného proteinu. Z této sekvence byl předpovězen polypeptid, skládající se z asi 237 aminokyselin. Nebyl detekován žádný peptidový signál, ale domnělá transmembránová sekvence sahá od pozicí asi 386 do pozice 443. Tento klon kóduje membránový protein typu II s lektinovou doménou Ctypu. 3TJTR obsahuje řadu potenciálních signálů pro rychlou degradaci včetně tří opakování shodné sekvence ATTTA. Nebyl detekován žádný peptidový signál, ale pravděpodobné transmembránové sekvence se nacházejí od pozicí 45 do 62 nebo také 386 až 443. Tento klon kóduje membránový protein typu II s lektinovou doménou C-typu.

Polypeptid, předpovězený na základě sekvenční analýzy, má 49 aminokyselinových intracelulárních domén, které zahrnují motiv na bázi tyrosinu, umístěný ve středu zbytku 7. YXX(L/V) motivy tohoto původu byly ukázány jako takové, které v případě hepatických lektinů a DC23 (Fce Rlla) pracují jako intemalizační motivy. Tento typ domény byl ukázán jako typ, který pracuje jako aktivační (ITAM) nebo inhibiční (ITIM) motiv v molekulách jako je Ly49, NKG2A a rodina molekul KIR, podobných imunoglobulinům. Inhibice je zprostředkována doplněním SHP2/SHIP fosfatáz do shodné domény (W)XYXX(L/V). Prvních 15 aminokyselin DCMP1 vykazuje neměnnost vůči prodloužené ITIM doméně a zdá se, že inhibice buněčné funkce je jedním z vlastností DCMP1. Jediné potenciální N-glykosylační místo je přítomno v pozici asi 185.

Porovnání aminokyselinové sekvence lektinové domény C-typu u DCMP1 a ostatních proteinů, obsahujících lektinové domény C-typu ukázalo, že DCMP1 vykazuje největší homologií shepatickými lektiny a makrofágovými lektiny (viz tab. 1). Neměnné cysteinové zbytky svinutého lektinu C-typu jsou neměnné mezi členy této rodiny avšak může být pozorována řada odlišných znaků. Stejně jako jaterní lektiny má DCMP1 na počátku lektinové domény dvojitý cysteinový motiv. Funkce tohoto doplňkového cysteinu je neznámá, ačkoliv v lektinové doméně očividně není žádný další cystein, který může s tímto zbytkem tvořit disulfidový můstek. Je možné, že tento zbytek může být zahrnut do tvorby intermolekulámích disulfidových můstků, ačkoliv v DCMP 1 je v pozici 91 další cystein, který pravděpodobně vykonává tuto funkci. N-koncová část lektinové domény DCMP1 ukazuje nejvyšší neměnnost u jatemích lektinů a makrofágových lektinů. Doména, která váže vápník, je vDCMPl konzervativní a vykazuje nejvyšší homologií s CD23 včetně EPS motivu (zbytky 195 až 197), glutamátu (E) v pozici 201 a asparaginaspartátu (ND) v pozici 218 až 219. Tyto motivy prokazatelně neexistují v NK receptorech (NKGE zde ukázané) a CD94.

DCMP1 je membránový protein typu II s předpovězeným transmembránovým úsekem, nacházejícím se asi od zbytku 45 do 62. To se týká rodiny proteinů, která zahrnuje asialoglykoproteinové receptory, jaterní lektiny, CD69, CD72, CD23 a NK receptory. Tento protein obsahuje na karboxylovém konci (od zbytků 104 do 237) extracelulární Ca-dependentní lektinovou doménu C-typu, která vykazuje motivy, charakteristické pro specifitu cukerných zbytků. Viz tab. 1. Tyto proteiny se většinou váží na sacharidové zbytky glykoproteinů a jsou zahrnuty v primární imunitní odezvě. U několika členů této rodiny, zejména CD69, u NK receptorů a CD72 byl prokázáno, že přenášejí signál během buněčné aktivace včetně rozmnožování a indukce specifických genů.

DCMP1, stejně jako myšší KIR receptor lektinů C-typu, Ly49, obsahuje intemalizační motiv se zvýšenou homologií se skupinou inhibičních receptorů (ITIM doména, viz současné souhrnné publikace Vivier a Daeron (1977) Immunology Today 18:286 až 291 a Katz a Austen (1997) J. Immunol. 158:5065 až 5070). Tyto receptory, buď patřící do superrodiny imunoglobulinů (IgSF) nebo lektiny C-typu), přenášejí negativní signál přes SH2-doménu, obsahující fosfatázy např. SHIP, SHP-1 a SHP-2. Důkazy svědčí o tom, že tyto receptory se spojují s dalšími aktivačními receptory s cílem blokovat aktivační signály. Důkazy rovněž svědčí o tom, že ligandem pro tento typ molekuly je molekula IgSF. Jako příklady mohou být uvedeny molekuly MHC třídy I (rozpoznávné CD94/NK receptory a Ly-49) a FcgR (CD23; který rozpoznává IgG).

Cysteinový zbytek 91 je pravděpodobně začleněn v disulfídovém spojení s dalším polypeptidem, asi homo nebo heterodimerem.

PCR naznačuje, že gen je exprimován v aktivovaných dendritických buňkách a neaktivovaných dendritických buňkách. Detekovatelné signály nebyly zjištěny v žádných TF1 (linie krvetvorných buněk), Jurkat (linie T buněk), MRC5 (linie fibroblastových buněk sarkomu plic), JY (linie B buněk), U937 (linie pre-monocytových buněk) nebo CHA (buněčná linie karcinomu) buňkách. Pozitivní signály byly detekovány v čerstvě izolovaných aktivovaných nebo neaktivovaných PBL a granulocytech a pouze slabé signály v čerstvě izolovaných T buňkách, B buňkách, NK buňkách nebo monocytech.

Sekvenční analýza naznačuje expresi genu ve vzorcích, charakterizovaných jako dendritické buňky, aktivované neutrofily, makrofágy (aktivované GM-CSF), osteoklastom, kožní nádor, lymfom T-buněk, maligní nádor tlustého střeva, chronická synovitida a chrondrosarkom.

XIV. Protějšek DCMP1 u hlodavce

Tab. 2 ukazuje sekvenci protějškových sekvencí u hlodavce.

Tab. 2: Sekvence ukazuje homologii se dvěma EST myši, W33446 (viz SEQ ID č: 11) a AA170532 (viz SEQ ID č: 8), které kódují protějšek DCMP1 u myši (viz SEQ ID č: 8).

hDCMPl MTSEITYAEVRFKNEFKSSGINTASSAASKERTAPI«KSNTGFPKIiLCASL·

W33446 ............................................-.....

170532 MASEITYAEVKFKNESNSLHTYSESPAAPREKPIRDLRKPGSPSliLLTSL mDCMPl MASEITYAEVKFKNESNSLHTYSESPAAPREKPXRDLRKPGSPSLLLTSL hDCMPl

W33446

170532 mDCMPl

LIFFDLIAISFFIAFVIFFQKYSQLLE - KKTTKELVHTTIiECVKKNMPVE

............-.............E-KMIIKEIJrrrELECTKWASLLE

MIJ^LIxLLAITFLVAFIXyFQKYSQLLEEKKAAKNIll • · • · hDCMPl ETAWSCCPKNWKSFSSNCYFISTE - - SASWQDSEKDCARMEAHLLVINTQ W33 4 4 6 DKVWSCCPKDWKPFGS YCYFTSTD - LVASWNESKENCFHMGAHLWTHSQ mDCMPl DKVWSCCPKDWRLFGSHCYLVPTVSSSASWNKSEENCSRMGAHLWIQSQ hDCMPl EEQDFIFQNLQEESAYFVGLSDPEGQRHWQWVDQTPYNESSTFWHPREPS W33446 EEQ mDCMPl EEQDFITGILDTHAAYFIGLWD -TGHRQWQWVDQTPYEES XTFWHNGEPS hDCMPl DPNERCWLNFR-KSPKRWGWNDVNCLGPQRSVCEMMKIHL mDCMPl SGNEKCATIIYRWKT--GWGWNDISCSLKQKSVCPMKK1NL

XV. DCMP2 z primáta

DCMP2, domnělý asialoglykoproteinový receptor, je transmebránový protein typu II. Ve své extracelulámi oblasti má DCMP2 jednu doménu, která rozpoznává sacharid (CRD), která je charakteristická pro rodinu lektinů C-typu (Ca++ dependentní) (viz Drickamer a Taylor (1993) Ann. Rev, Cell Biol. 9:237 až 264. DCMP2 vykazuje značnou homologii se dvěma geny (HI a H2), které kódují podjednotky lidského jatemího asialoglykoproteinového receptorů. Stockert (1995) Phvsiol. Revs. 75:591 až 609. Tyto jatemí receptory reprezentují prototyp II typu členů rodiny lektinů C-typu. Jatemí ASGPR má vazebnou specifitu pro desialylované glykoproteiny s koncovými galaktosylovými zbytky a zprostředkovává jejich endocytózu do hepatocytů přes jamky, potažené klathrinem. Zejména znaky, spojené s oběma těmito funkcemi, jsou mezi hepatickými ASGPR a DCMP2 nezaměnitelné. DCMP2 tedy obsahuje intracelulámí motiv včetně tyrosinového zbytku v pozici 5, který souvisí kapacitou ligandu pro endocytózu. Viz Furher a kol. (1991) J, Cell Biol, 114:423 až 431. Dále má DCMP2 ve své doméně pro rozpoznání sacharidů sekvenci QPD (Gln-Pro-Asp), rozpoznávající galaktózu (Drickamer (1992) Nátuře 360:183 až 186).

Bylo izolováno několik variant klonů cDNA, kódující DCMP2, nej pravděpodobněji jako následek alternativního sestřihu. Podle toho jsou popsány tři varianty: krátká forma, dlouhá forma a třetí forma, označená jako DCMP2v. Viz SEQ ID č: 4 a 10, Tab. 1. Krátká a dlouhá forma se liší přítomností zvláštního inzertu 27 aa v extracelulámi oblasti krátké formy klonu. Krátká forma DCMP2 vykazuje v extracelulámi oblasti, v porovnání s nedávno klonovaným ASGPR, který byl získán z lidských makrofágů (M-ASGPR), rozdíly ve 4 zbytcích. Suzuki a kol. (1996) J, Immunol. 156:128 až 135.

V případě DCMP21 neobsahuje ASGPRm úsek, který odpovídá GVSELQEHTTQKAHLGHCPHCPSVCVP (zbytky 118 až 144 v SEQ ID č. 4) a obsahuje • · · · · · · · · ····*·· · · · · · · · · ·· inzert GEE (mezi zbytky 173 a 174 v SEQ ID č: 4). DCMP2s je totožný SDCMP21, až na nepřítomnost GVSELQEHTTQKAHLGHCPHCPSVCVP (zbytky 118 až 144 v SEQ ID č: 4) a až na rozdíl v sekvenci a to v nukleotidu 1064, kde místo G je A, čímž je kódován spíše asn než asp. DCMPv je podobný DCMPs, ale postrádá sekvenci LLQRLRSGPCHLLLSLGLG (zbytky 30 až 48 v SEQ ID č: 4), která odpovídá významnému podílu transmembránového segmentu a obsahuje inzert GEE (mezi zbytky 173 a 174 v SEQ ID č: 4), který byl zjištěn i v ASGPRm. Předmětem zájmu jsou rovněž oblasti, které se nacházejí okolo těchto rozdílů např. v rámci části epitopu např. 12 až 17 aminokyselina.

Je dostupná rekombinantní dlouhá forma proteinu DCMP2 a byly připraveny mABs (monoklonální protilátky). Z důvodu stabilní exprese dlouhé i krátké formy byla dále transfektována linie myšších buněk.

Gen byl původně izolován z CDlaDC (čistota asi 70 %), odvozených od CD34+ krvetvorných progenitorových buněk, kultivovaných v GM-CSF a TNFa (Caux a kol. (1992) Nátuře 360:258 až 261). Klon byl inzertován do vektoru pSportl (Notl/Sall restrikční místa).

PCR analýza naznačuje expresi genů pro DCMP2 v dendritických buňkách a možná velmi malou expresi v TF1 buňkách (linie krvetvorných buněk). Žádný detekovatelný signál nebyl zjištěn v případě Jurkat (linie T buněk), CHA (linie karcinomových buněk), MRC5 (linie buněk fibroblastového sarkomu plic) nebo JY (linie B buněk). Signál byl detekovatelný v čerstvě izolovaných neaktivovaných nebo aktivovaných (PMA a ionomycin) dendritických buňkách, granulocytech a neaktivovaných nebo aktivovaných PBL. Signál nebyl zjištěn vmonocytech, neaktivovaných nebo aktivovaných T buňkách nebo v neaktivovaných nebo aktivovaných B buňkách.

DC-ASPGR vykazuje významnou homologii s myšším protějškem lidského monocytového ASGPR (M-ASGPR). Homologie je výrazná (~ 60 %) u domény, rozpoznávající sacharid, která uděluje specifitu myššímu monocytovému ASGPR pro galaktózu a Nacetylgalaktosamin (GalNAc). Sáto a kol. (1992) J, Biochem 111:331 až 336. Je zde zahrnut QPD motiv, rovněž nalezený vHl a H2 podjednotkách hepatického ASGPR. Dále myšší monocytový ASGPR má ve své cytosolické doméně internalizační signál YENL.

Myšší M-ASGPR funguje jako receptor pro endocytózu galaktosylovaných glykoproteinů (Ozaki a kol (1992) J, Biol. Chem. 267:9229 až 9235) a umožňuje rozpoznávání maligních buněk tumoricidními makrofágy (Kawakami a kol. (1994) Jpn, J, Cancer Res. 85:744 až 749). V této souvislosti bylo zjištěno, že myšší M-ASGPR je exprimován v plicních metastatických uzlících myši, nesoucích metastatické ovariální nádorové buňky OV2944-HM-1 (Imai a kol. (1995) Immunol. 86:591 až 598). Sledovaný lidský M-ASGPR vykazuje významnou specifitu • * »*»♦ · ♦ · * • · ♦ ···· ··« ···· ·· · · ♦ · · • · · · · ···«·« • · · · · · ♦ · · ····♦·· · · ···· ·« ·· pro Tn antigen (Suzuki a kol. (1996) J, Immunol. 156:128 až 135, který nese svazek serinem nebo threoninem připojených koncových GalNAc a je spojen s lidskými karcinomy (Springer (1989) Mol. Immunol. 26:1 až 5 a 0mtoft a kol. (1990) Int. J. Cancer 45:666 až 672).

Na základě homologie sekvencí může být předpovězeno, že DCMPs také hraje roli jako endocytický receptor pro galaktosylované glykoproteiny. Dále, intemalizace ligandu přes manózový receptor, další transmebránový endocytický lektin C-typu, způsobuje vysoce účinnou prezentaci antigenu DC prostřednictvím cesty, zahrnující MHC třídy II. Cella a kol. (1997) Current Opinion Immunol. 9.T0 až 16. Analogicky je možné, že DCMPs hraje podobnou roli při směrování intemalizovaných ligandů do prezentace antigenu.

DCMP2 tak může být potenciálním, vysoce účinným cílem pro zavádění antigenů do DC, aby byla v terapii, fungující na bázi imunity, zvýšena prezentace T buňkám. K tomuto je možno se přiblížit pulzací DC in vitro galaktosylovanou formou antigenu nebo monoklonálními protilátkami proti DCMP2, navázanými na antigen. Účinnost prezentace in vitro může být stanovena prostřednictvím aktivace T-buněk, specifických pro antigen. Toto by mělo být vzhledem k podstatným terapeutických perspektivám tohoto přístupu zaměřeno na prezentaci antigenů, souvisejících s nádorem (TAA). Předmětem zájmu jsou konkrétně TAA spojené s maligním melanomem.

Dále specifita lidského M-ASGPR pro Tn antigen činí tento karcinomový TAA kandidátem volby pro zacílení DCMP2.

Nedávno bylo ukázáno, že exogenní antigen může být zpracován a prezentován v průběhu cesty přes MHC třídy I. Viz Porgador a Gilboa (1995) J, Exp. Med. 182:255 až 260; Paglia a kol (1996) J, Exp, Med. 183:317 až 322. V DC pravděpodobně vykonávají tuto funkci specializované receptory

Tyto receptory vDC mohou být zacíleny na pomoc při produkci TAA-specifických cytotoxických T buněk (CTL), což má velký terapeutický význam, protože jak se zdá, jsou CTL začleněny v indukci rejekce tumoru.

XVI. Intemalizace DCMP

DC, získané z CD34+ progenitorů, kultivovaných v GM-CSF a TNFa, byly ponechány při 4 °C s monoklonální protilátkou proti DCMP2 mAb nebo s protilátkou proti CD 13 jako kontrolou. Po následné inkubaci při 37 °C po dobu až asi do 20 min., byly analyzovány povrchově vázané protilátky. Intemalizace byla pozorována jako pokles fluorescence buněčného povrchu.

»

99 9 9 9 9 9 99 9 9

9 9 9 9 9 9 ···«

DCMP21 je rychle internalizován při 37 °C, ale nikoliv při 4 °C. Přibližně 60 % povrchové značky zmizí během asi 15 min. To ukazuje, že DCMP2 může hrát roli jako endocytický receptor, což je v souladu s přítomností internalizačního motivu (YENF) v jeho intracytoplazmatické doméně.

XVII. Izolace vazebného protějšku

DC protein může být, vzhledem ke specifitě jeho vazby, používán jako specifické vazebné činidlo, téměř stejně jako by byla použita protilátka. Vazebné činidlo je buď značené, jak je popsáno výše, např. fluorescencí nebo jinak, nebo může být imobilizován na substrát pro afinitní způsoby.

DC protein je použit pro testování buněčné linie, která vykazuje zmíněnou vazbu. Pro detekci nebo vytřídění intracelulárního nebo povrchově exprimováného ligandu jsou použity standartní detekční techniky nebo jsou pomocí afinitních technik testovány povrchy, exprimující transformované buňky. Testování intracelulární exprese je uskutečňováno různými detekčními nebo imunofluorescenčními postupy. Viz také Mc. Mahan a kol. (1991) EMBO J. 10:2821 až 2832.

Například: 0. den nejdříve potáhnout 2-komorová permanoxová sklíčka 1 ml fibronektinu na komoru o koncentraci 10 ng/ml v PBS, proces probíhá po dobu 30 min. při teplotě místnosti. Jedenkrát propláchnout PBS. Poté dát COS buňky o koncentraci 2 až 3x10⁵ buněk na komoru do 1,5 ml růstového média. Inkubovat přes noc při 37 °C.

1. den každého vzorku připravit 0,5 ml roztoku, obsahujícího 66 mg/ml DEAE-dextranu, 66 mM chlorochinon a 4 mg DNA v séru bez DME. Pro každou sadu je připravena kontrola např. lidské receptor-FLAG cDNA v ředěních 1 a 1/200 a negativní imitace. Promýt buňky sérem bez DME. Přidat roztok DNA a inkubovat 5 h. při 37 °C. Odstranit médium a přidat na 2,5 min. 0,5 ml 10 % DMSO v DME. Odstranit a jednou promýt DME. Přidat 1,5 ml růstového média a inkubovat přes noc.

2. den vyměnit médium. 3. nebo 4. den jsou buňky fixovány a detekovány. Promýt buňky dvakrát Hankovým pufrovaným fyziologickým roztokem (HBSS) a fixovat 5 min. v 4 % roztoku paraformaldehyd (PFA)/glukóza. Promýt 3 x HBSS. Poté co byla všechna kapalina odstraněna mohou být sklíčka skladována při -80 °C. Pro každou komoru byly následujícím postupem provedeny inkubace v 0,5 ml. Přidat roztok HBSS/saponin (0,1 %) s 32 ml/ml 1 M NaN₃ na dobu 20 min. Poté jsou buňky lx promyty roztokem HBSS/saponin. Přidat protein nebo komplex • · «··· · · ·· ·« · · ··· ··*· · A · · • »··· ···· ··· ··· ·· ···« ·· «« protein/protilátka k buňkám a inkubovat 30 min. Promýt buňky 2 x roztokem HBSS/saponin. Jeli to vhodné, přidat na 30 min první protilátku. Přidat sekundární protilátku proti myšší protilátce např. Vector anti-mouse, v ředění 1/200 a inkubovat po dobu 30 min. Připravit roztok pro ELISA např. roztok křenové peroxidázy Vector Elitě ABC horsereadish peroxidase a preinkubovat 30 min. Použít např. 1 kapku roztoku A (avidin) a 1 kapku roztoku B (biotin) na 2,5 ml roztoku HBSS/saponin. Promýt buňky dvakrát roztokem HBSS/saponin. Přidat ABC HRP roztok a inkubovat 30 min. Promýt dvakrát buňky HBSS, druhé promytí po dobu 2 min., kdy dojde k uzavření buňky. Poté přidat diaminobenzoovou kyselinu (DAB) na dobu 5 až 10 min.. Použít 2 kapky pufru plus 4 kapky DAB plus 2 kapky H2O2 na 5 ml destilované vody. Opatrně odstranit komoru a promýt sklíčko ve vodě. Vysušit na vzduchu několik minut, poté přidat 1 kapku Crystal Mount. Péct 5 min. při 85 až 90 °C.

Pro afinitní purifikaci nebo oddělení buněk, exprimujících receptor, jsou používány také další monocytová proteinová vazebná činidla. Viz např. Sambrook a kol. nebo Ausubel a kol..

Jinou strategií je testování mebránově vázaných receptorů afinitní technikou. Receptorová cDNA je konstruována postupem, popsaným výše. Ligand může být imobilizován a použit pro imobilizaci buněk. Imobilizace může být provedena použitím odpovídajících protilátek, které rozpoznají např. FLAG sekvenci monocytového proteinového fuzního konstruktu nebo použitím protilátek, vytvořených proti prvním protilátkám. Opakovatelné cykly selekce a amplifikace vedou ke získání odpovídajících klonů a k eventuální izolaci klonů, exprimujících ligand.

Expresní fágové knihovny mohou být testovány monocytovým proteinem. Odpovídající techniky značení např. protilátky proti FLAG, umožňují specifické značení odpovídajících klonů.

Může být vytvořeno mnoho modifikací a variací předmětného vynálezu, aniž by došlo k odchýlení od jeho podstaty a rozsahu, což bude patrné odborníkům v dané oblasti techniky. Specifická provedení, popsaná zde, jsou nabízena pouze formou příkladů a vynález je limitován pouze termíny v přiložených nárocích spolu s celým rozsahem ekvivalentů, ke kterým se tyto nároky vztahuji.

• v I » 9 9 9 9 ·« · « · 9 · · 9 » 9 9 • · 9 · » 9 9 · · »«•••9 · 9 9 9 9 9 99 99

VÝKLAD SEKVENCÍ

SEQ ID č: 1 je nukleotidová sekvence genu pro DCMP1 z rodiny C-lektinů u primáta SEQ ID č:2 je polypeptidová sekvence genu pro DCMP1 z rodiny C-lektinů u primáta SEQ ID č: 3 je nukleotidová sekvence genu pro DCMP2 z rodiny C-lektinů u primáta SEQ ID č: 4 je polypeptidová sekvence genu pro DCMP2 z rodiny C-lektinů u primáta SEQ ID č: 5 je polypeptidová sekvence jatemího ASGPRhl u primáta

SEQ ID č:6 je polypeptidová sekvence jatemího ASGPRh2 u primáta

SEQ ID č: 7 je nukleotidová sekvence genu pro DCMP1 z rodiny C-lektinů u hlodavce SEQ ID č: 8 je polypeptidová sekvence genu pro DCMP1 z rodiny C-lektinů u hlodavce SEQ ID č: 9 je varianta nukleotidové sekvence DCMP2 u primáta

SEQ ID č: 10 je varianta polypeptidové sekvence DCMP2 u primáta

SEQ ID č: 11 je peptidová sekvence z W33446 EST hlodavce.

SEZNAM SEKVENCÍ

OBECNÉ INFORMACE:
(i) PŘIHLAŠOVATEL:
(A)	JMÉNO:	Schering Corporation
(B)	ULICE:	2000 Galloping Hill Road
(C)	MĚSTO:	Kenilworth
(D)	STÁT:	New Jersey
(E)	ZEMĚ:	USA
(F)	SMĚROVACÍ CISLO: 07033
(G)	TELEFON: (908)	298 - 5056
(H)	TELEFAX: (908)	298 - 5388

(ii) NÁZEV VYNÁLEZU: Téměř čistý nebo rekombinantní polypeptid DCMP1 a

DCMP2, fuzní protein, vazebná sloučenina, nukleová kyselina, kódující DCMP1 nebo DCMP2, expresní vektor, hostitelská buňka pro expresní vektor a způsob rekombinantní přípravy polypeptidů.

(iii) POČET SEKVENCÍ. 11 (iv) POČÍTAČOVÉ ÚDAJE:

(A) TYP MÉDIA. Floppy disk (B) POČÍTAČ. Power Macintosh (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: 8.1.0 (D) SOFTWARE: Microsoft Word 6.0.1 (v) SOUČASNÁ APLIKAČNÍ DATA:

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY:

(B) DATUM PODÁNÍ.

(vi) DŘÍVĚJŠÍ APLIKAČNÍ DATA:

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: US 60/053080 (B) DATUM PODÁNÍ: 9. července 1997 • « t ·«·· ···· ··«· ·» · · · * « • · · 0 · ···· ·»·· 00· ·· »»*· 0· ·· (2) INFORMACE O SEQ ID č: 1:

(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY.

(A) DÉLKA: 1104 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE, lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ. CDS (B) LOKALIZACE: 242 .952 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID č: 1:

TTCTCACTAT ACTGGTCCTG AGGAAAGGGC TTCTGTGAAC	TGCGGTTTTT	AGTTTTTATT	60
gtggttctta GTTCTCATGA gacccctctt gaggatatgt	GCCTATCTGG	TGCCTCTGCT	120
CTCCACTAGT TGAGTGAAAG GAAGGAGGTA ATTTACCACC	ATGTTTGGTT	CCTGTTTATA	180
AGATGTTTTA AGAAAGATTT GAAACAGATT TTCTGAAGAA	AGCAGAAGCT	CTCTTCCCAT	240
T ATG ACT TCG GAA ATC ACT TAT GCT GAA GTG AGG TTC AAA AAT GAA	286

Met Thr Ser Glu Ile Thr Tyr Ala Glu Val Arg Phe Lys Asn Glu 15 10 15

TTC Phe

AAG Lys

TCC Ser

TCA Ser

GGC Gly 20

ATC Ile

AAC Asn

ACA GCC Thr Ala

TCT TCT GCA GCT

TCC AAG GAG

334

Ser 25

Ser Ala

Ala

Ser

Lys 30

Glu

AGG

ACT

GCC

CCT

CTC

AAA

AGT

AAT

ACC

GGA

TTC

CCC

AAG

CTG

CTT

TGT

382

Arg

Thr

Ala

Pro

Leu

Lys

Ser

Asn

Thr

Gly

Phe

Pro

Lys

Leu

Cys

35

40

-

45

GCC

TCA

CTG

TTG

ATA

TTT

TTC

CTG

CTA

TTG

GCA

ATC

TCA

TTC

TTT

ATT

430

Ala

Ser

Leu

Ile

Phe

Leu

Ala

Ile

Ser

Phe

Ile

50

55

60

GCT

TTT

GTC

ATT

TTC

TTT

CAA

AAA

TAT

TCT

CAG

CTT

GAA

AAA

AAG

478

Ala

Phe

Val

Ile

Phe

Gin

Lys

Tyr

Ser

Gin

Leu

Glu

Lys

65

70

75

ACT

ACA

AAA

GAG

CTG

GTT

CAT

ACA

TTG

GAG

TGT

GTG

AAA

AAT

526

Thr

Lys

Glu

Leu

Val

His

Thr

Leu

Glu

Cys

Val

Lys

Asn

80

85

90

95

ATG

CCC

GTG

GAA

GAG

ACA

GCC

TGG

AGC

TGT

TGC

CCA

AAG

AAT

TGG

AAG

574

Met

Pro

Val

Glu

Thr

Ala

Trp

Ser

Cys

Pro

Lys

Asn

Trp

Lys

100

105

110

TCA

TTT

AGT

TCC

AAC

TGC

TAC

TTT

ATT

TCT

ACT

GAA

TCA

GCA

TCT

TGG

622

Ser

Phe

Ser

Asn

Cys

Tyr

Phe

Ile

Ser

Thr

Glu

Ser

Ala

Ser

Trp

115 120 125 «· ···· a ·, · · a · a * ' · «··· ♦ * · · ' · • · · · · 9 9 9 ‘ * 9

CAA GAC Gin Asp

AGT GAG AAG

GAC Asp

TGT Cys

GCT Ala 135

AGA Arg

ATG GAG GCT CAC

CTG Leu

CTG GTG Leu Val

670

Ser 130

Glu

Lys

Met Glu

Ala

His 140

ATA

AAC

ACT

CAA

GAA

GAG

CAG

GAT

TTC

ATC

TTC

CAG

AAT

CTG

CAA

GAA

718

Ile

Asn

Thr

Gin

Glu

Gin

Asp

Phe

Ile

Phe

Gin

Asn

Leu

Gin

Glu

145

150

155

GAA

TCT

GCT

TAT

TTT

GTG

GGG

CTC

TCA

GAT

CCA

GAA

GGT

CAG

CGA

CAT

766

Glu

Ser

Ala

Tyr

Phe

Val

Gly

Leu

Ser

Asp

Pro

Glu

Gly

Gin

Arg

His

160

165

170

175

TGG

CAA

TGG

GTT

GAT

CAG

ACA

CCA

TAC

AAT

GAA

AGT

TCC

ACA

TTC

TGG

814

Trp

Gin

Trp

Val

Asp

Gin

Thr

Pro

Tyr

Asn

Glu

Ser

Thr

Phe

Trp

180

185

190

CAT

CCA

CGT

GAG

CCC

AGT

GAT

CCC

AAT

GAG

CGC

TGC

GTT

GTG

CTA

AAT

862

His

Pro

Arg

Glu

Pro

Ser

Asp

Pro

Asn

Glu

Arg

Cys

Val

Leu

Asn

195

200

205

TTT

CGT

AAA

TCA

CCC

AAA

AGA

TGG

GGC

TGG

AAT

GAT

GTT

AAT

TGT

CTT

910

Phe

Arg

Lys

Ser

Pro

Lys

Arg

Trp

Gly

Trp

Asn

Asp

Val

Asn

Cys

Leu

210

215

220

GGT

CCT

CAA

AGG

TCA

GTT

TGT

GAG

ATG

AAG

ATC

CAC

TTA

952

Gly

Pro

Gin

Arg

Ser

Val

Cys

Glu

Met

Lys

Ile

His

Leu

225

230

235

TGAACTGAAC ATTCTCCATG AACAGGTGGT TGGATTGGTA TCTGTCATTG TAGGGATAGA 1012

TAATAAGCTC TTCTTATTCA TGTGTAAGGG AGGTCCATAG AATTTAGGTG GTCTGTCAAC 1072

TATTCTACTT ATGAGAGAAT TGGTCTGTAC AT 1104 (2) INFORMACE O SEQ ID č: 2:

(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:

(A) DÉLKA: 237 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID č: 2:

Met

Thr

Ser

Glu

Ile

Thr

Tyr

Ala

Glu

Val

Arg

Phe

Lys

Asn

Glu

Phe

1

5

10

15

Lys

Ser

Gly

Ile

Asn

Thr

Ala

Ser

Ala

Ser

Lys

Glu

Arg

20

25

30

Thr

Ala

Pro

Leu

Lys

Ser

Asn

Thr

Gly

Phe

Pro

Lys

Leu

Cys

Ala

40 45

Ser Leu Leu Ile Phe Phe Leu Leu Leu Ala Ile Ser Phe Phe Ile Ala 50 55 60 • · • · · ·

Phe 65

Val

Ile

Phe

Phe Gin 70

Lys

Tyr

Ser

Gin Leu Leu 75

Glu

Lys

Thr 80

Thr

Lys

Glu

Leu

Val

His

Thr

Leu

Glu

Cys

Val

Lys

Asn

Met

85

90

95

Pro

Val

Glu

Thr

Ala

Trp

Ser

Cys

Pro

Lys

Asn

Trp

Lys

Ser

100

105

110

Phe

Ser

Asn

Cys

Tyr

Phe

Ile

Ser

Thr

Glu

Ser

Ala

Ser

Trp

Gin

115

120

125

Asp

Ser

Glu

Lys

Asp

Cys

Ala

Arg

Met

Glu

Ala

His

Leu

Val

Ile

130

135

140

Asn

Thr

Gin

Glu

Gin

Asp

Phe

Ile

Phe

Gin

Asn

Leu

Gin

Glu

145

150

155

160

Ser

Ala

Tyr

Phe

Val

Gly

Leu

Ser

Asp

Pro

Glu

Gly

Gin

Arg

His

Trp

165

170

175

Gin

Trp

Val

Asp

Gin

Thr

Pro

Tyr

Asn

Glu

Ser

Thr

Phe

Trp

His

180

185

190

Pro

Arg

Glu

Pro

Ser

Asp

Pro

Asn

Glu

Arg

Cys

Val

Leu

Asn

Phe

195

200

205

Arg

Lys

Ser

Pro

Lys

Arg

Trp

Gly

Trp

Asn

Asp

Val

Asn

Cys

Leu

Gly

210

215

220

Pro

Gin

Arg

Ser

Val

Cys

Glu

Met

Lys

Ile

His

Leu

225

230

235

(2) INFORMACE O SEQ ID č: 3:

(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:

(A) DÉLKA: 1458 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) LOKALIZACE: 257.. 1204 (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: misc-znak (B) LOKALIZACE: 608 (D) OSTATNÍ INFORMACE: / pozn. = „krátká forma nemá nukleotidy 608 až 673“ • · • · • · (ix) CHARAKTERISTICKY ZNAK:

(A) JMENO/KLÍČ: misc-znak (B) LOKALIZACE: 775 (D) OSTATNÍ INFORMACE: / pozn. = „ASGPRm (tab. 2) má inzert sekvence, kódující GEE, mezi nukleotidy 775 až 776“ (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

(A) JMENO/KLÍČ: misc-znak (B) LOKALIZACE: 1064 (D) OSTATNÍ INFORMACE: / pozn. = ,/iukleotid 1064 DCMP2s může být A, který by měl ve zbytku č. 270 kódovat asn spíše než asp“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID č: 3:

GTTGAGGAGA TGGGATGTCC CAGATGATAG GGCTCCTGGG ATTTCAGACC CAAGACCAGC ' 60

AGGACTCCAG TCACCTCTAC CCCAGCTGTC CAGGACACAG CGCTCCCAAC TCTGAGTGAC 120

GTCCCACCTC TGGTCCTTGC AGCACAACCA ACGTGGGAAT CACACCCTCC AGACCTCCCA 180

CAGCTCCACC CCAGACTGGG CGCCGGCCCT GCCTCCATTT CAGCTGTGAC AACCTCAGAG 240

CCGTGTTGGC CCAAGC ATG ACA AGG ACG TAT GAA AAC TTC CAG TAC TTG 289

Met Thr Arg Thr Tyr Glu Asn Phe Gin Tyr Leu

10

GAG	AAT	AAG	GTG	AAA	GTC
Glu	Asn	Lys	Val 15	Lys	Val
CAG	TCC	CTC	CTG	CAG	CGT
Gin	Ser	Leu 30	Leu	Gin	Arg
TCC	CTG	GGC	CTC	GGC	CTG
Ser	Leu 45	Gly	Leu	Gly	Leu
TTC	CAA	AAT	TCC	AAA	TTT
Phe 60	Gin	Asn	Ser	Lys	Phe 65
TTT	AGC	AAC	TTC	ACC	TCA
Phe	Ser	Asn	Phe	Thr 80	Ser
TCC	CAG	GGC	AGC	AGC	TTG
Ser	Gin	Gly	Ser 95	Ser	Leu
GTG	GAG	GGT	TTC	AAG	CAG
Val	Glu	Gly 110	Phe	Lys	Gin
GAA	CAC	ACT	ACG	CAG	AAG
Glu	His	Thr	Thr	Gin	Lys

CAG	GGG	TTT	AAA	AAT	GGG
Gin	Gly	Phe 20	Lys	Asn	Gly
CTC	CGC	TCT	GGG	CCC	TGC
Leu	Arg 35	Ser	Gly	Pro	Cys
CTG	CTG	CTG	GTC	ATC	ATC
Leu 50	Leu	Leu	Val	Ile	Ile 55
CAG	AGG	GAC	CTG	GTG	ACC
Gin	Arg	Asp	Leu	Val 70	Thr
AAC	ACT	GTG	GCG	GAG	ATC
Asn	Thr	Val	Ala 85	Glu	Ile
GAA	GAA	ACG	ATA	GCA	TCT
Glu	Glu	Thr 100	Ile	Ala	Ser
GAA	CGG	CAG	GCA	GGG	GTA
Glu	Arg 115	Gin	Ala	Gly	Val
GCA	CAC	CTA	GGC	CAC	TGT
Ala 130	His	Leu	Gly	His	Cys 135

CCA CTT CCT CTC 337

Pro Leu Pro Leu

CAT CTC CTG CTG 385

His Leu Leu Leu

TGT GTG GTT GGA 433

Cys Val Val Gly

CTG AGA ACA GAT 481

Leu Arg Thr Asp

CAG GCA CTG ACT 529

Gin Ala Leu Thr

CTG AAA GCT GAG 577

Leu Lys Ala Glu

105

TCT GAG CTC CAG 625

Ser Glu Leu Gin 120

CCC CAC TGC CCA 673

Pro His Cys Pro

125 • · • · • ·

61

• · 1 • • • · · · ·

• · • • ·

• · • · • ·

• · • • · · ·

• · · · • · · · • · · ·

TCT

GTG

TGT

GTC

CCA

GTT

CAT

TCT

GAA

ATG

CTC

CTG

CGA

GTC

CAG

721

Ser

Val

Cys

Val

Pro

Val

His

Ser

Glu

Met

Leu

Arg

Val

Gin

140

-

145

150

155

CTG

GTG

CAA

GAC

CTG

AAG

AAA

CTG

ACC

TGC

CAG

GTG

GCT

ACT

CTC

AAC

769

Leu

Val

Gin

Asp

Leu

Lys

Leu

Thr

Cys

Gin

Val

Ala

Thr

Leu

Asn

160

165

170

AAC

AAT

GCC

TCC

ACT

GAA

GGG

ACC

TGC

CCC

GTC

AAC

TGG

GTG

GAG

817

Asn

Ala

Ser

Thr

Glu

Gly

Thr

Cys

Pro

Val

Asn

Trp

Val

Glu

175

180

185

CAC

CAA

GAC

AGC

TGC

TAC

TGG

TTC

TCT

CAC

TCT

GGG

ATG

TCC

TGG

GCC

865

His

Gin

Asp

Ser

Cys

Tyr

Trp

Phe

Ser

His

Ser

Gly

Met

Ser

Trp

Ala

190

195

200

GAG

GCT

GAG

AAG

TAC

TGC

CAG

CTG

AAG

AAC

GCC

CAC

CTG

GTG

GTC

ATC

913

Glu

Ala

Glu

Lys

Tyr

Cys

Gin

Leu

Lys

Asn

Ala

His

Leu

Val

Ile

205

210

215

AAC

TCC

AGG

GAG

CAG

AAT

TTT

GTC

CAG

AAA

TAT

CTA

GGC

TCC

GCA

961

Asn

Ser

Arg

Glu

Gin

Asn

Phe

Val

Gin

Lys

Tyr

Leu

Gly

Ser

Ala

220

225

230

235

TAC

ACC

TGG

ATG

GGC

CTC

AGT

GAC

CCT

GAA

GGA

GCC

TGG

AAG

TGG

GTG

1009

Tyr

Thr

Trp

Met

Gly

Leu

Ser

Asp

Pro

Glu

Gly

Ala

Trp

Lys

Trp

Val

240

245

250

GAT

GGA

ACA

GAC

TAT

GCG

ACC

GGC

TTC

CAG

AAC

TGG

AAG

CCA

GGC

CAG

1057

Asp

Gly

Thr

Asp

Tyr

Ala

Thr

Gly

Phe

Gin

Asn

Trp

Lys

Pro

Gly

Gin

255

260

265

CCA

GAC

TGG

CAG

GGG

CAC

GGG

CTG

GGT

GGA

GGC

GAG

GAC

TGT

GCT

1105

Pro

Asp

Trp

Gin

Gly

His

Gly

Leu

Gly

Glu

Asp

Cys

Ala

270

275

280

CAC

TTC

CAT

CCA

GAC

GGC

AGG

TGG

AAT

GAC

GTC

TGC

CAG

AGG

CCC

1153

His

Phe

His

Pro

Asp

Gly

Arg

Trp

Asn

Asp

Val

Cys

Gin

Arg

Pro

285

290

295

TAC

CAC

TGG

GTC

TGC

GAG

GCT

GGC

CTG

GGT

CAG

ACC

AGC

CAG

GAG

AGT

1201

Tyr

His

Trp

Val

Cys

Glu

Ala

Gly

Leu

Gly

Gin

Thr

Ser

Gin

Glu

Ser

300

305

310

315

1254

CAC TGAGCTGCCT TTGGTGGGAC CACCCGGCCA CAGAAATGGC GGTGGGAGGA His

GGACTCTTCT	CACGACCTCC	TCGCAAGACC	GCTCTGGGAG	AGAAATAAGC	ACTGGGAGAT	1314
TGGAAGCACT	GCTAACATTT	TGAATTTTTT	TCTCTTTAAT	TTTAAAAAGA	TGGTATAGTG	1374
TTCTTAAGCT	TTTATTTTTT	TTCCAACTTT	TGAAAGTCAA	CTTCATGAAG	GTATAATTTT	1434

TACATAATAA AAATGCACTC ATTT

1458 • · · • · · · · · (2) INFORMACE O SEQ ID č: 4:

(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:

(A) DÉLKA: 316 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID č: 4:

Met Thr Arg Thr Tyr Glu Asn Phe Gin Tyr Leu Glu Asn Lys Val Lys

1

5

10

15

-

Val

Gin

Gly

Phe

Lys

Asn

Gly

Pro

Leu

Pro

Leu

Gin

Ser

Leu

Gin

20

25

30

Arg

Leu

Arg

Ser

Gly

Pro

Cys

His

Leu

Ser

Leu

Gly

Leu

Gly

35

40

45

Leu

Val

Ile

Cys

Val

Gly

Phe

Gin

Asn

Ser

Lys

50

55

60

Phe

Gin

Arg

Asp

Leu

Val

Thr

Leu

Arg

Thr

Asp

Phe

Ser

Asn

Phe

Thr

65

70

75

80

Ser

Asn

Thr

Val

Ala

Glu

Ile

Gin

Ala

Leu

Thr

Ser

Gin

Gly

Ser

85

90

95

Leu

Glu

Thr

Ile

Ala

Ser

Leu

Lys

Ala

Glu

Val

Glu

Gly

Phe

Lys

100

105

110

Gin

Glu

Arg

Gin

Ala

Gly

Val

Ser

Glu

Leu

Gin

Glu

His

Thr

Gin

115

120

125

Lys

Ala

His

Leu

Gly

His

Cys

Pro

His

Cys

Pro

Ser

Val

Cys

Val

Pro

130

135

140

*

Val

His

Ser

Glu

Met

Leu

Arg

Val

Gin

Leu

Val

Gin

Asp

Leu

145

150

155

160

Lys

Leu

Thr

Cys

Gin

Val

Ala

Thr

Leu

Asn

Ala

Ser

Thr

-

165

170

175

Glu

Gly

Thr

Cys

Pro

Val

Asn

Trp

Val

Glu

His

Gin

Asp

Ser

Cys

t

180

185

190

Tyr

Trp

Phe

Ser

His

Ser

Gly

Met

Ser

Trp

Ala

Glu

Ala

Glu

Lys

Tyr

195

200

205

Cys

Gin

Leu

Lys

Asn

Ala

His

Leu

Val

Ile

Asn

Ser

Arg

Glu

210

215

220

Gin

Asn

Phe

Val

Gin

Lys

Tyr

Leu

Gly

Ser

Ala

Tyr

Thr

Trp

Met

Gly

225

230

235

240

Leu

Ser

Asp

Pro

Glu

Gly

Ala

Trp

Lys

Trp

Val

Asp

Gly

Thr

Asp

Tyr

245 250 255

Ala Thr Gly Phe Gin Asn Trp Lys Pro Gly Gin Pro Asp Asp Trp Gin 260 265 270 • · * • · · · · ·

Gly His Gly Leu Gly Gly Gly Glu
	275	280
Gly	Arg 290	Trp	Asn	Asp	Asp	Val 295	Cys
Glu	Ala	Gly	Leu	Gly	Gin	Thr	Ser

305 310

Asp	Cys	Ala	His	Phe 285	His	Pro	Asp
Gin	Arg	Pro	Tyr 300	His	Trp	Val	Cys
Gin	Glu	Ser	His

315 (2) INFORMACE O SEQ ID č: 5:

(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:

(A) DÉLKA: 291 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: nerelevantní (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID č: 5:

Met 1

Thr Lys

Glu

Tyr 5

Gin Asp

Leu

Gin His 10

Leu Asp

Asn

Glu

Glu 15

Ser

Asp

His

Gin

Leu

Arg

Lys

Gly

Pro

Gin

Pro

Leu

20

25

30

Gin

Arg

Leu

Cys

Ser

Gly

Pro

Arg

Leu

Ser

Leu

Gly

Leu

35

40

45

Ser

Leu

Val

Cys

Val

Ile

Gly

Ser

Gin

Asn

Ser

50

55

60

Gin

Leu

Gin

Glu

Leu

Arg

Gly

Leu

Arg

Glu

Thr

Phe

Ser

Asn

Phe

65

70

75

80

Thr

Ala

Ser

Thr

Glu

Ala

Gin

Val

Lys

Gly

Leu

Ser

Thr

Gin

Gly

85

90

95

Asn

Val

Gly

Arg

Lys

Met

Lys

Ser

Leu

Glu

Ser

Gin

Leu

Glu

Lys

Gin

100

105

110

Gin

Lys

Asp

Leu

Ser

Glu

Asp

His

Ser

Leu

His

Val

Lys

115

120

125

Gin

Phe

Val

Ser

Asp

Leu

Arg

Ser

Leu

Ser

Cys

Gin

Met

Ala

Leu

130

135

140

Gin

Gly

Asn

Gly

Ser

Glu

Arg

Thr

Cys

Pro

Val

Asn

Trp

Val

Glu

145

150

155

160

His

Glu

Arg

Ser

Cys

Tyr

Trp

Phe

Ser

Arg

Ser

Gly

Lys

Ala

Trp

Ala

165 170 175

Asp Ala Asp Asn Tyr Cys Arg Leu Glu Asp Ala His Leu Val Val Val 180 185 190

64

• •

• · · · • · • · · • • • · · · ·

• · • • · • •

• · • · • · • · • · • ·

• · • · • • • • · · ·

• · • • · • • ·

Thr

Ser

Trp

Glu

Gin

Lys

Phe

Val

Gin

His

Ile

Gly

Pro

Val

195

200

205

Asn

Thr

Trp

Met

Gly

Leu

His

Asp

Gin

Asn

Gly

Pro

Trp

Lys

Trp

Val

210

215

220

Asp

Gly

Thr

Asp

Tyr

Glu

Thr

Gly

Phe

Lys

Asn

Trp

Arg

Pro

Glu

Gin

225

230

235

240

Pro

Asp

Trp

Tyr

Gly

His

Gly

Leu

Gly

Glu

Asp

Cys

Ala

245

250

255

His

Phe

Thr

Asp

Gly

Arg

Trp

Asn

Asp

Val

Cys

Gin

Arg

Pro

260

265

270

Tyr

Arg

Trp

Val

Cys

Glu

Thr

Glu

Leu

Asp

Lys

Ala

Ser

Gin

Glu

Pro

275 280 285

Pro Leu Leu 290 (2) INFORMACE O SEQ ID č: 6:

(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:

(A) DÉLKA: 287 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: nerelevantní (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID č: 6:

Met Ala 1

Lys

Asp

Phe 5

Gin

Asp

Ile

Gin

Gin Leu 10

Ser

Glu

Glu 15

Asn

Asp

His

Pro

Phe

His

Gin

Gly

Pro

Ala

Gin

Pro

Leu

Ala

Gin

20

25

30

Arg

Leu

Cys

Ser

Met

Val

Cys

Phe

Ser

Leu

Ala

Leu

Ser

Phe

Asn

35

40

45

Ile

Leu

Val

Ile

Cys

Val

Thr

Gly

Ser

Gin

Ser

Ala

Gin

50

55

60

Leu

Gin

Ala

Glu

Leu

Arg

Ser

Leu

Lys

Glu

Ala

Phe

Ser

Asn

Phe

Ser

65

70

75

80

Ser

Thr

Leu

Thr

Glu

Val

Gin

Ala

Ile

Ser

Thr

His

Gly

Ser

85

90

95

Val

Gly

Asp

Lys

Ile

Thr

Ser

Leu

Gly

Ala

Lys

Leu

Glu

Lys

Gin

100

105

110

Gin

Asp

Leu

Lys

Ala

Asp

His

Asp

Ala

Leu

Phe

His

Leu

Lys

His

115

120

125

Phe

Pro

Val

Asp

Leu

Arg

Phe

Val

Ala

Cys

Gin

Met

Glu

Leu

His

130 135 140

Ser Asn Gly Ser Gin Arg Thr Cys Cys Pro Val Asn Trp Val Glu His • · • ·

145 150 155 160

Gin

Gly

Ser

Cys

Tyr 165

Trp

Phe

Ser

His

Ser 170

Gly

Lys

Ala

Trp

Ala 175

Glu

Ala

Glu

Lys

Tyr 180

Cys

Gin

Leu

Glu

Asn 185

Ala

His

Leu

Val

Val 190

Ile

Asn

Ser

Trp

Glu 195

Glu

Gin

Lys

Phe

Ile 200

Val

Gin

His

Thr

Asn 205

Pro

Phe

Asn

Thr

Trp 210

Ile

Gly

Leu

Thr

Asp 215

Ser

Asp

Gly

Ser

Trp 220

Lys

Trp

Val

Asp

Gly 225

Thr

Asp

Tyr

Arg

His 230

Asn

Tyr

Lys

Asn

Trp 235

Ala

Val

Thr

Gin

Pro 240

Asp

Asn

Trp

His

Gly 245

His

Glu

Leu

Gly Gly 250

Ser

Glu

Asp

Cys

Val 255

Glu

Val

Gin

Pro

Asp 260

Gly

Arg

Trp

Asn

Asp 265

Asp

Phe

Cys

Leu

Gin 270

Val

Tyr

Arg

Trp

Val 275

Cys

Glu

Lys

Arg

Arg 280

Asn

Ala

Thr

Gly

Glu 285

Val

Ala

(2) INFORMACE O SEQ ID Č: 7:

(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:

(A) DÉLKA: 1418 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) LOKALIZACE: 279..992 (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

(A) JMENO/KLÍČ: misc-znak (B) LOKALIZACE: 1348 (D) OSTATNÍ INFORMACE: / pozn. = „poly-A doplňkový motiv“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID č: 7:

CTATCCCCCA	CTTTGCAGTA	CTTGCATATC	TTGCTGAGTG	GGTTTGAGGG	CTACAATTCT	60
TATTTTCTTA	TGTTAAGAGG	TTGCATTTCC	CTTATCTCGC	CCTGGTGATT	CTATGCTGTG	120
GTTTCTTGTT	CTCATCTCGT	TTATCCTAGT	GAGACATGTC	TCTTCTTTCA	TACAACTGTG	180
CAATATGACA	ACTTATCACA	GTGATTGGTT	CTCATATACT	ATAGAGCCTT	AGAGAAGGAA	240

CAAGGCTCTC TTCTGACGGA GGAAGATTTT TTCTTGAT ATG GCT TCA GAA ATC

293

341 ··*·· : :· : 66 ·”. · · : .·

Met Ala Ser Glu Ile 1 5

ACT

TAT

GCA

GAA

GTG

AAG

TTC

AAG

AAT

GAA

TCC

AAC

TCC

TTG

CAC

ACC

Thr

Tyr

Ala

Glu

Val 10

Lys

Phe

Lys

Asn

Glu 15

Ser

Asn

Ser

Leu

His 20

Thr

TAC

TCA

GAA

TCT

CCT

GCA

GCT

CCČ

AGA

GAG

AAA

CCT

ATC

CGT

GAT

CTA

Tyr

Ser

Glu

Ser 25

Pro

Ala

Pro

Arg 30

Glu

Lys

Pro

Ile

Arg 35

Asp

Leu

AGA

AAG

CCT

GGT

TCC

CCC

TCA

CTG

CTT

ACA

TCC

CTG

ATG

CTA

CTT

Arg

Lys

Pro 40

Gly

Ser

Pro

Ser

Leu 45

Leu

Thr

Ser

Leu 50

Met

Leu

CTC

CTG

GCA

ATC

ACA

TTC

TTA

GTT

GCT

TTT

ATC

ATT

TAT

TTT

Leu

Leu 55

Leu

Ala

Ile

Thr 60

Phe

Leu

Val

Ala

Phe 65

Ile

Tyr

Phe

CAA

AAG

TAC

TCT

CAA

CTT

GAA

AAA

GCT

GCA

AAA

AAT

ATA

Gin 70

Lys

Tyr

Ser

Gin

Leu 75

Leu

Glu

Lys

Lys 80

Ala

Lys

Asn

Ile 85

ATG

CAC

AAT

GAA

TTG

AAC

TGC

ACA

AAA

AGT

GTT

TCA

CCC

ATG

GAA

GAC

Met

His

Asn

Glu

Leu 90

Asn

Cys

Thr

Lys

Ser 95

Val

Ser

Pro

Met

Glu 100

Asp

AAA

GTC

TGG

AGC

TGT

TGC

CCA

AAG

GAT

TGG

AGG

CTA

TTT

GGT

TCC

CAC

Lys

Val

Trp

Ser 105

Cys

Pro

Lys

Asp 110

Trp

Arg

Leu

Phe

Gly 115

Ser

His

TGC

TAC

TTG

GTT

CCC

ACA

GTT

TCT

TCA

GCA

TCT

TGG

AAC

AAG

AGT

Cys

Tyr

Leu 120

Val

Pro

Thr

Val

Ser 125

Ser

Ala

Ser

Trp 130

Asn

Lys

Ser

GAG

AAC

TGC

TCC

CGC

ATG

GGT

GCT

CAT

CTA

GTG

ATC

CAA

AGC

Glu

Glu 135

Asn

Cys

Ser

Arg

Met 140

Gly

Ala

His

Leu

Val 145

Val

Ile

Gin

Ser

CAG

GAA

GAG

CAG

GAT

TTC

ATC

ACT

GGG

ATC

TTG

GAC

ACT

CAT

GCT

Gin 150

Glu

Gin

Asp

Phe 155

Ile

Thr

Gly

Ile

Leu 160

Asp

Thr

His

Ala

Ala 165

TAT

TTT

ATA

GGG

TTG

TGG

GAT

ACA

GGC

CAT

CGG

CAA

TGG

CAA

TGG

GTT

Tyr

Phe

Ile

Gly

Leu 170

Trp

Asp

Thr

Gly

His 175

Arg

Gin

Trp

Gin

Trp 180

Val

GAT

CAG

ACA

CCA

TAT

GAA

AGT

ATC

ACA

TTC

TGG

CAC

AAT

GGT

GAG

Asp

Gin

Thr

Pro 185

Tyr

Glu

Ser

Ile 190

Thr

Phe

Trp

His

Asn 195

Gly

Glu

CCC

AGC

AGT

GGC

AAT

GAA

AAA

TGT

GCT

ACA

ATA

ATT

TAC

CGT

TGG

AAG

Pro

Ser

Ser 200

Gly

Asn

Glu

Lys

Cys 205

Ala

Thr

Ile

Tyr 210

Arg

Trp

Lys

ACT

GGA

TGG

GGC

TGG

AAC

GAT

ATC

TCT

TGC

AGT

CTT

AAA

CAG

AAG

TCA

Thr

Gly 215

Trp

Gly

Trp

Asn

Asp 220

Ile

Ser

Cys

Ser

Leu 225

Lys

Gin

Lys

Ser

389

437

485

533

581

629

677

725

773

821

869

917

965

GTT TGT CAG ATG AAG AAA ATA AAC TTA TGAATCACTC ATTCTTCATG 1012

Val Cys Gin Met Lys Lys Ile Asn Leu 230 235

GGCATTCGAT	TCATTGTTAT	CCAACCATTA	CACAGACACC	TGGGAAATTC	TACAGGTTCA	1072
CAGAATTTAA	GTGGGCAGCA	AATGGTTATG	CATACACTGG	CCCACATATA	TCCTTGTGCA	1132
TTTACCCACC	TACTCTGTCA	TAAAATGAAC	TTTCATTGAG	AATTTTCTAT	ATACCACAGA	1192
GTATACAGAG	TCCCTTATGG	ACACACATGG	AACTTTTTGC	CATCTTGTTT	ACTCATGCCA	1252
TTGTATGATA	GGTTCTCTTG	ACCTATCTGT	TTCTGTTTCT	CTGTTGTTTT	TTTAATGTCT	1312
TTGGATTTAT	TGACATTAAA	TTGAGAAGTA	AAATTATAAA	TATTTAAGTG	TCTGGATTGA	1372
TACACACAGA	TATGTACTAT	GAAATATAAT	TAAATATTTA	CTGTCC		1418

(2) INFORMACE O SEQ ID č: 8:

(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:

(A) DÉLKA: 238 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID č: 8:

Met Ala Ser Glu Ile Thr Tyr Ala Glu Val Lys Phe Lys Asn Glu Ser 15 10 15

Asn Ser Leu His Thr Tyr Ser Glu Ser Pro Ala Ala Pro Arg Glu Lys 20 25 30

Pro Ile Arg Asp Leu Arg Lys Pro Gly Ser Pro Ser Leu Leu Leu Thr 35 40 45

Ser Leu Met Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ile Thr Phe Leu Val Ala 50 55 60

Phe Ile Ile Tyr Phe Gin Lys Tyr Ser Gin Leu Leu Glu Glu Lys Lys 65 70 75 80

Ala Ala Lys Asn Ile Met His Asn Glu Leu Asn Cys Thr Lys Ser Val 85 90 95

Ser Pro Met Glu Asp Lys Val Trp Ser Cys Cys Pro Lys Asp Trp Arg 100 105 110

Leu Phe Gly Ser His Cys Tyr Leu Val Pro Thr Val Ser Ser Ser Ala 115 120 125

Ser Trp Asn Lys Ser Glu Glu Asn Cys Ser Arg Met Gly Ala His Leu 130 135 140

68

• · • • • • · ·

• · · • · • · · · • · · ·

• • • • · · • ·

»· · • · • • • · « · · ·

• • • • · • ·

Val

Ile

Gin

Ser

Gin

Glu

Gin

Asp

Phe

Ile

Thr

Gly

Ile

Leu

145

150

155

160

Asp

Thr

His

Ala

Tyr

Phe

Ile

Gly

Leu

Trp

Asp

Thr

Gly

His

Arg

165

170

175

Gin

Trp

Gin

Trp

Val

Asp

Gin

Thr

Pro

Tyr

Glu

Ser

Ile

Thr

Phe

180

185

190

Trp

His

Asn

Gly

Glu

Pro

Ser

Gly

Asn

Glu

Lys

Cys

Ala

Thr

Ile

195

200

205

Ile

Tyr

Arg

Trp

Lys

Thr

Gly

Trp

Gly

Trp

Asn

Asp

Ile

Ser

Cys

Ser

210

215

220

Leu

Lys

Gin

Lys

Ser

Val

Cys

Gin

Met

Lys

Ile

Asn

Leu

225 230 235 (2) INFORMACE O SEQ ID č: 9:

(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY.

(A) DÉLKA: 1370 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE.· lineární (ii) TYP MOLEKULY. cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) LOKALIZACE: 273 .1091 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID č: 9:

AAAGCATGGT CTCTGTGTGT TCTAATCCCT GTTCATTCTC ATTTACTGTC CCTGGGATTT 60

CAGATCCAAG ACCAGCAGGA CTCCAGTCAC CTCTACCCCA GCTCTCCAGG ACACAGCGCT 120

CCCAACTCTG AGTGACGTCC CACCTCTGGT CCTTGCAGCA CAACCAACGT GGGAATCACA 180

CCCTCCAGAC CTCCCACAGC TCCACCCCAG ACTGGGCGCC GGCCCTGCCT CCATTTCAGC 240

TGTGACAACC TCAGAGCCGT GTTGGCCCAA GC ATG ACA AGG ACG TAT GAA AAC	293
	Met 1	Thr	Arg Thr	Tyr 5	Glu Asn
TTC	CAG TAC TTG GAG AAT AAG GTG AAA GTC	CAG	GGG TTT	AAA	AAT GGG	341
Phe	Gin Tyr Leu Glu Asn Lys Val Lys Val 10 15	Gin	Gly Phe 20	Lys	Asn Gly
CCA	CTT CCT CTC CAG TCC CTC CTG CTG CTG	GTC	ATC ATC	TGT	GTG GTT	389
Pro	Leu Pro Leu Gin Ser Leu Leu Leu Leu 25 30	Val	Ile Ile 35	Cys	Val Val
GGA	TTC CAA AAT TCC AAA TTT CAG AGG GAC	CTG	GTG ACC	CTG	AGA ACA	437
Gly	Phe Gin Asn Ser Lys Phe Gin Arg Asp	Leu	Val Thr	Leu	Arg Thr

45

GAT Asp	TTT AGC AAC TTC ACC TCA AAC	ACT Thr
Phe	Ser	Asn	Phe 60	Thr	Ser Asn
ACT	TCC	CAG	GGC	AGC	AGC	TTG GAA	GAA
Thr	Ser	Gin	Gly	Ser	Ser	Leu Glu	Glu
			75				80
GAG	GTG	GAG	GGT	TTC	AAG	CAG GAA	CGG
Glu	Val	Glu	Gly	Phe	Lys	Gin Glu	Arg
		90				95
CTC	CTG	CGA	GTC	CAG	CAG	CTG GTG	CAA
Leu	Leu	Arg	Val	Gin	Gin	Leu Val	Gin
	105					110
CAG	GTG	GCT	ACT	CTC	AAC	AAC AAT	GGT
Gin	Val	Ala	Thr	Leu	Asn	Asn Asn	Gly
120					125
ACC	TGC	TGC	CCC	GTC	AAC	TGG GTG	GAG
Thr	Cys	Cys	Pro	Val	Asn	Trp Val	Glu
				140
TTC	TCT	CAC	TCT	GGG	ATG	TCC TGG	GCC
Phe	Ser	His	Ser	Gly	Met	Ser Trp	Ala
			155				160
CTG	AAG	AAC	GCC	CAC	CTG	GTG GTC	ATC
Leu	Lys	Asn	Ala	His	Leu	Val Val	Ile
		170				175
TTT	GTC	CAG	AAA	TAT	CTA	GGC TCC	GCA
Phe	Val	Gin	Lys	Tyr	Leu	Gly Ser	Ala
	185					190
GAC	CCT	GAA	GGA	GCC	TGG	AAG TGG	GTG
Asp	Pro	Glu	Gly	Ala	Trp	Lys Trp	Val
200					205
GGC	TTC	CAG	AAC	TGG	AAG	CCA GGC	CAG
Gly	Phe	Gin	Asn	Trp	Lys	Pro Gly	Gin
				220
GGG	CTG	GGT	GGA	GGC	GAG	GAC TGT	GCT
Gly	Leu	Gly	Gly	Gly	Glu	Asp Cys	Ala
			235				240
TGG	AAT	GAC	GAC	GTC	TGC	CAG AGG	CCC
Trp	Asn	Asp	Asp	Val	Cys	Gin Arg	Pro
		250				255
GGC	CTG	GGT	CAG	ACC	AGC	CAG GAG	AGT
Gly	Leu	Gly	Gin	Thr	Ser	Gin Glu	Ser
	265					270

• · · · • *

	50	• · • « • • ··	• · · • · « · · · • · · ·	• • • 9 · · • ·	• · · • · • • '· · • · · ·	, · * • • . · 1 · · 55	·· ·· • · · · • · · · • · · · • · · · ·· ··
GTG	GCG	GAG	ATC	CAG	GCA	CTG	485
Val 65	Ala	Glu	Ile	Gin	Ala 70	Leu
ACG	ATA	GCA	TCT	CTG	AAA	GCT	533
Thr	Ile	Ala	Ser	Leu 85	Lys	Ala
CAG	GCA	GTT	CAT	TCT	GAA	ATG	581
Gin	Ala	Val	His 100	Ser	Glu	Met
GAC	CTG	AAG	AAA	CTG	ACC	TGC	629
Asp	Leu	Lys 115	Lys	Leu	Thr	Cys
GAG	GAA	GCC	TCC	ACT	GAA	GGG	677
Glu	Glu 130	Ala	Ser	Thr	Glu	Gly 135
CAC	CAA	GAC	AGC	TGC	TAC	TGG	725
His 145	Gin	Asp	Ser	Cys	Tyr 150	Trp
GAG	GCT	GAG	AAG	TAC	TGC	CAG	773
Glu	Ala	Glu	Lys	Tyr 165	Cys	Gin
AAC	TCC	AGG	GAG	GAG	CAG	AAT	821
Asn	Ser	Arg	Glu 180	Glu	Gin	Asn
TAC	ACC	TGG	ATG	GGC	CTC	AGT	869
Tyr	Thr	Trp 195	Met	Gly	Leu	Ser
GAT	GGA	ACA	GAC	TAT	GCG	ACC	917
Asp	Gly 210	Thr	Asp	Tyr	Ala	Thr 215
CCA	GAC	GAC	TGG	CAG	GGG	CAC	965
Pro 225	Asp	Asp	Trp	Gin	Gly 230	His
CAC	TTC	CAT	CCA	GAC	GGC	AGG	1013
His	Phe	His	Pro	Asp 245	Gly	Arg
TAC	CAC	TGG	GTC	TGC	GAG	GCT	1061
Tyr	His	Trp	Val 260	Cys	Glu	Ala

CAC TGAGCTGCCT TTGGTGGGAC 1111

His • * · · • · · · * · * ·

CACCCGGCCA	CAGAAATGGC	GGTGGGAGGA	GGACTCTTCT	CACGACCTCC	TCGCAAGACC	1171
gctctgggag	AGAAATAAGC	ACTGGGAGAT	TGGAAGCACT	GCTAACATTT	TGAATTTTTT	1231
TCTCTTTAAT	TTTAAAAAGA	TGGTATAGTG	TTCTTAAGCT	TTTATTTTTT	TTCCAACTTT	1291
TGAAAGTCAA	CTTCATGAAG	GTATAATTTT	TACATAATAA	AAATGCACTC	ATTTAAAGAG	1351
TAAAAAAAAA	AAAAAAAAA					1370

(2) INFORMACE O SEQ ID č: 10:

(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:

(A) DÉLKA: 273 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID č: 10:

Met 1

Thr Arg

Thr

Tyr 5

Glu

Asn

Phe Gin Tyr 10

Leu Glu Asn

Lys

Val 15

Lys

Val

Gin

Gly

Phe

Lys

Asn

Gly

Pro

Leu

Pro

Leu

Gin

Ser

Leu

20

25

30

Leu

Val

Ile

Cys

Val

Gly

Phe

Gin

Asn

Ser

Lys

Phe

Gin

Arg

35

40

45

Asp

Leu

Val

Thr

Leu

Arg

Thr

Asp

Phe

Ser

Asn

Phe

Thr

Ser

Asn

Thr

50

55

60

Val

Ala

Glu

Ile

Gin

Ala

Leu

Thr

Ser

Gin

Gly

Ser

Leu

Glu

65

70

75

80

Thr

Ile

Ala

Ser

Leu

Lys

Ala

Glu

Val

Glu

Gly

Phe

Lys

Gin

Glu

Arg

85

90

95

Gin

Ala

Val

His

Ser

Glu

Met

Leu

Arg

Val

Gin

Leu

Val

Gin

100

105

110

Asp

Leu

Lys

Leu

Thr

Cys

Gin

Val

Ala

Thr

Leu

Asn

Gly

115

120

125

Glu

Ala

Ser

Thr

Glu

Gly

Thr

Cys

Pro

Val

Asn

Trp

Val

Glu

130

135

140

His

Gin

Asp

Ser

Cys

Tyr

Trp

Phe

Ser

His

Ser

Gly

Met

Ser

Trp

Ala

145

150

155

160

Glu

Ala

Glu

Lys

Tyr

Cys

Gin

Leu

Lys

Asn

Ala

His

Leu

Val

Ile

165 170 175

Asn Ser Arg Glu Glu Gin Asn Phe Val Gin Lys Tyr Leu Gly Ser Ala 180 185 190 <·» * · · • · · · · · ·

Tyr

Thr

Trp 195

Met

Gly

Leu

Ser

Asp 200

Pro

Glu

Gly

Ala

Trp 205

Lys

Trp

Val

Asp

Gly 210

Thr

Asp

Tyr

Ala

Thr 215

Gly

Phe

Gin

Asn

Trp 220

Lys

Pro

Gly

Gin

Pro 225

Asp

Trp

Gin

Gly 230

His

Gly

Leu

Gly

Gly 235

Gly

Glu

Asp

Cys

Ala 240

His

Phe

His

Pro

Asp 245

Gly

Arg

Trp

Asn

Asp 250

Asp

Val

Cys

Gin

Arg 255

Pro

Tyr

His

Trp

Val

Cys

Glu

Ala

Gly

Leu

Gly

Gin

Thr

Ser

Gin

Glu

Ser

260 265 270

His (2) INFORMACE O SEQ ID č: 11:

(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:

(A) DÉLKA: 75 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: nerelevantní (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID č: 11:

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:11:

Glu 1

Lys

Met

Ile

Ile 5

Lys

Glu Leu Asn Tyr Thr Glu Leu Glu Cys Thr

10

15

Lys

Trp

Ala

Ser

Leu

Glu

Asp

Lys

Val

Trp

Ser

Cys

Pro

Lys

20

25

30

-

Asp

Trp

Lys

Pro

Phe

Gly

Ser

Tyr

Cys

Tyr

Phe

Thr

Ser

Thr

Asp

Leu

35

40

45

r

Val

Ala

Ser

Trp

Asn

Glu

Ser

Lys

Glu

Asn

Cys

Phe

His

Met

Gly

Ala

50

55

60

His

Leu

Val

Ile

His

Ser

Gin

Glu

Gin

70 75 »9 * · 9 · · · * · · · **

9« · 9 · » · » · 9

9999 9 9 9 9 » · 9

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY ?i/

1) řetězec alespoň 17 aminokyselin z DCMP2v, jak je popsán v SEQ ID č: 10 a

1) Gly Val Ser Glu Leu Gin Glu His Thr Thr Gin Lys Ala His Leu Gly His Cys His Cys Pro Ser Val Cys Val Pro (zbytky 118 až 144 v SEQ ID č:4);

1. Téměř čistý nebo rekombinantní polypeptid DCMP1, vyznačující se tím, že vykazuje alespoň asi 85 % identitu se sekvencí SEQ ID č:2 nebo 8.

2) postrádá úsek alespoň 12 aminokyselin zFKNGPLPLQS LLQRLRWGPC HLLLWLGLGL LLLVIIC (zbytky 20 až 56 v SEQ ID č:4).

2) Gin Val Ala Thr Leu Asn Asn Asn Ala Ser Thr Glu Gly Thr Cys Cys (zbytky 166 až 181 v SEQ ID č:4) nebo

2. Téměř čistý nebo rekombinantní polypeptid DCMP2, vyznačující se tím, že obsahuje:

a) polypeptid, vybraný z:

3. Fúzní protein, vyznačující se tím, že obsahuje polypeptid podle nároku 1 nebo 2.

3) Trp Lys Pro Gly Gin Pro Asp Asn Trp Gin Gly His Gly Lu Gly (zbytky 263 až 277 v SEQ ID č:4) nebo

b) sekvenci, vykazující:

4. Vazebná sloučenina, vyznačující se tím, že se specificky váže na polypeptid podle nároku 1 nebo 2.

5. Vazebná sloučenina podle nároku 4, vyznačující se tím, že to je protilátka nebo fragment protilátky.

6. Nukleová kyselina, vyznačující se tím, že kóduje polypeptid podle nároku 1 nebo 2.

7. Expresní vektor, vyznačující se tím, že obsahuje nukleovou kyselinu podle nároku 6.

8. Hostitelská buňka, vyznačující se tím, že obsahuje vektor podle nároku 7.

• * • * • · ·· *«ι· • · « • · · · • « « ·

9. Způsob rekombinantní přípravy polypeptidu, vyznačující se tím, že zahrnuje kultivaci hostitelské buňky podle nároku 8 za takových podmínek, kdy je polypeptid exprimován.