CZ5198A3

CZ5198A3 - Cyklosporinové deriváty s anti-HIV účinkem

Info

Publication number: CZ5198A3
Application number: CZ9851A
Authority: CZ
Inventors: Jean M. Lüchinger
Original assignee: C-Chem Ag
Priority date: 1995-07-17
Filing date: 1996-07-17
Publication date: 1998-04-15
Also published as: EP0842191A2; CA2226880A1; WO1997004005A2; JP3920919B2; KR100441220B1; NO980195D0; NO980195L; CN1192750A; MX9800477A; HUP9900405A3; JP2000502320A; DE59608274D1; CZ290754B6; PL324531A1; BR9609795A; IL122754A0; IL122754A; US5948884A; ATE209216T1; CN1141317C

Description

(57) Anotace:

Cyklické peptidy obecného vzorce I, kde A až K znamenají zbytky následujících aminokyselin: A je substituovaný homothreonln obecného vzorce II R1-CH2CH/CH3/-CH/OH/CH/NHCH3/-COOH, ve kterém je Rj n-propyl nebo propenyl a dvojná vazba je preferovaně ve trans-konfiguraci, B je kyselina alfa aminomáselná, valin, norvalln nebo threonln, C je /D/-aminokyselina obecného vzorce III CHNH3-CH/R/-COOH. ve kterém R je C2-C6 alkyl, alkenyl, alkinyl, s přímým řetězcem nebo rozvětvený, kde tyto skupiny mohou být substituovány, D je N-methyl-gamma-hydroxyleucin nebo N-methyl-gamma-acetyloxuleucín, E je valin, F, I a J jsou v každém případě N-methylleucin, Gjealanln, Hje /D/-alanln nebo /D/-serin, aK je N-methylvalin. Vynález se také týká přípravků takových peptidů a jejich použití v prevenci infekce virem lidské imunodeflcience /HIV/.

V.

K.I.J.H.G.

Cyklosporinové deriváty's anti-HIV účinkem

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká nových cyklických peptidů se serie cyklosporinu, které mají silný inhibiční účinek na-virus lidské imunodefíclence (HIV), bez jakýchkoli imunosupresivních aktivit.

Dosavadní stav techniky

Takové cyklické peptidy jsou chráněny, inter alia. v EP 484 281. Jednou substancí, která je specificky chráněna v této patentové přihlášce, je (gamma-hydroxy-N-methy1leucin)cyklosporin. Ačkoliv, může být tato substance velmi snadno připravena z cyklosporinu A pomocí mikrobiální hydroxylace, EP 484 281 ukazuje, že tato substance má aktivitu proti HIV, která je asi 5 - 6 slabší než je aktivita nejaktivnějších substancí, jmenovitě MeIle-4-cyklosporinu a

MeVal-4-cyklosporinu. Všechny tři substance nemají prakticky <

žádnou imunosupresivní aktivitu. Neočekávaně bylo zjištěno, že anti-HÍV účinek (gamma-hydroxy-MeLeu-4)cyklosporinu muže být významně vylepšen, bez nárůstu jakýchkoliv imunosupresivních aktivit, zavedením vhodných substituentů do methylenové skupiny' aminokyseliny sarkosinu v pozici 3 uvedeného cyklosporinu. Protože terapeutické dávky cyklosporinu A, které jsou používány po orgánových transplantacích pro prevenci rejekce transplantovaných orgánů jsou velmi vysoké, a podobně vysoké dávky jsou očekávány pro anti-HIV terapii, která využívá cyklosporinových derivátů, je hodnota předkládaného vynálezu v tom, že poskytuje nový cykl ospor i nový derivát, který tná vysokou • * • « ··«< φ ·« «

* • · ft ·* ·· • · · • ·· ·· · · « '·· ’

anti-HIV aktivitu a že tento cyklosporinový derivát může být připraven simultáně, v několika málo krocích, z cyklospo-r inu A, což je produkt, který je již připraven v tunách.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se v důsledku toho týká nových cyklických peptidů obecného vzorce

B.C.D

J.I

E.P

H.G.

(I) kde A až

K znamenají zbytky následujících aminokyselin:

A je substituovaný homothreonin obecného vzorce

Ri-CH ₂CH(CHj)-CH(OH)-CH(NHCH3)-COOH (II) ve kterém je Rj n-propyl nebo propenyl a dvojná vazba je preferovaně v trans-konfiguraci;

B je kyselina alfa-aminomáselná, valin, norvalin nebo threonin, ,

C je (D)-aminokyselina obecného vzorce

CHNH3“CH(R)-COOH (ΠΙ) ve kterém

I

·. • 4 «4 4 · * 4» 4

4 4 4

4 4 4 4

4 W 4

R je C2-C0 alkyl, alkenyl, alkinyl, s přímým řetězcem nebo rozvětvený, kde tyto skupiny mohou dále být substituovány hydroxy, amino, C1-C4 alkylamino, Ci—C4 dialkylamino, alkoxy nebo acyloxy, ’

COOR2·, CONHR2, kde R2-může být Ci- C4 alkyl, s přímým řetězcem nebo rozvětvený, _; - X-Rs,. kde X je O nebo S a R3 je Ci - C4 alkyl, alkenyl nebo alkinyl, s přímým řetězcem nebo rozvětvený, a kde, pokud X 'je S, muže být Rs také aryl nebo heteroaryl, halogen, preferovaně fluor, kyano, . .

nebo CHR4R5ΐ kde R4 je vodík, methy1.ethyl nebo fenyl, a R5 je vodík, hydroxyl nebo halogen, preferovaně fluor, a dále amino, Ct- C/₍ alkylamino, Ci - C4 dialkyl amino,, 'acyloxy, preferovaně acetyloxy, a dále terč·.butoxykarbonyl-aminoethoxy-ethoxy-acety loxy , nebo alkoxykarbony1, preferovaně butoxykarbony1,

D je N-methy1-gamma-hydroxy1eucin nebo N-methyl-gamma-acetyloxuleucin, ....

í

E je valin,

F, I a J jsou v každém případě N-methy11euci η,

- G je alanin,

- H je (D)-alanin nebo (D)-serin, a

K je N-methy1 val in.

«« «·»· * · » • ♦ • · · ·

• · j • ·

«« • ** » ·· · · » » • * · · · « » «»· · Λ ··· “ ·· ' »»’

Významným prvkem v předkládaném vynálezu je variace radikálu R ve vzorci III aminokyseliny C.

Příklady radikálu R ve vzorci ΙΊΙ jsou Ci - C6 alkyl, alkenyl nebo alkinyl, s přímým řetězcem nebo rozvětvený, kde mohou být tyto skupiny dále substituovány hydroxylem, alkyloxy, acyloxy,

Ci - C/ι alkylamino nebo Ci - C4 dialkylamino. Příklady j sou methyL, ethyl, propyl, i sopropy 1 ,. n-buty 1., isobutyl, terc.butyl, pentyl, isopentyl, neopentyl, terc.pentyl, hexyl, cyklopropylmethyl, allyl, butenyl, pentenyl, isopentenyl, propargyl a butinyl. Příklady alkyloxy a acyloxy substituentů v radikálu R jsou methoxy, ethoxy, propyloxy, beta-methoxy a také acetoxy nebo pivaloyloxy. Příklady Ci - C4 alkylamino a Ci - C4 dialkylamino substituentů v radikálu R jsou methylamino, dimethylamino, ethylamino, diethylamino, propylamino, isopropylamino, dipropylamino, diisopropy1ami no a tertbutylamino. Radikál R2 v R může znamenat methyl, ethyl, propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl nebo terc.butyl. Kromě toho, R také může znamenat halogen nebo kyano. Radikál R3 v X-R3 může být Ci - C/₍ alkyl, alkenyl nebo alkinyl, s přímým řetězcem nebo rozvětvený, a, pokud X je S, pak to může být také aryl nebo heteroaryl. Příklady arylů jsou fenyl, 1-naftyl a 2-naftyl, a příklady heteroarylů jsou 2-pyridyl, 3-pyridyl, 4-pyridyl,

2-pyrimidiny1, 4-pyrimidinyl, pyrazínyl a benzothiazol-2-yl.

Preferované sloučeniny jsou ty, ve kterých je radikál Rj v A propenyl, B je kyselina alfa-máselná, D je

N-methy1-gamma-hydroxyleucin, E je valin, F, I a J jsou v každém případě N-methyl1eucin, G je alanin, H je (D)-alanin a K je N-methylva 1 iň.

9 999 ·· 9 «· *·

9999 9996

99 9 9999 * * 9 9 9 9 9 9999 9

9999 9 9· 999 99 »·'

V této konfiguraci je radikál E ve vzorci III methyl, ethyl, propyl, allyl, propargyl, hydroxymethyl, hydroxyethy1, hydroxybenzy1, aminomethyl, methylaminomethyl, dimethylaminomethýl, ethylaminomethy 1., diethylaminomethy 1, propy1ami nome thy1 , i sopropy lamí nome, thy 1, cl i propy 1 ami nome thy 1, di i sopropylaminomethy1, terč.butylaminomethy1, fluoromethyl, methoxymethy1 , ethoxymethy 1, methoxykarhony1, ethoxykarbony 1, propoxykarbony1, i sobuty'1 oxykarbony 1, methylaminokarbonyl, ethylaminokarbonyl, propylaminokarbonyl, isopropy lam i nokarbony 1, fenylaminokarbonyl, methoxykarbonylmethyl, ethoxykarbonylmethy 1',.. propoxykarbony lmet hyl . terč. butoxykarbonylmethy 1 , methoxy , ethoxy, propoxy, isopropoxy, n-butoxy, isobutoxy, terč.butoxy, ' hydroxyethoxy, methylthio, ethylthio, hydroxyethy1thio, propylthio, isopropy1thio,n-butylthio, isobuty1thio, t erc . but y 11 hi o , fenylthio, 2-pyr iclyl thi o , benzothiazo 1 -2-y 1 thio , kyano nebo fluor.

Nové sloučeniny mohou být připraveny za použití vhodných hází pro přípravu polyaniontů z cyklických peptidu podle obecného, vzorce I, kde D znamená N-methylleucin, reagováním*tohoto polyaniontů s vhodnými elektrofily a, pokud to je vhodné, podrobení nově zavedeného radikálu další transformaci tak, aby byla získána požadovaná substituce v aminokyselině C. Vzniklé produkty jsou potom hydroxy1 ovány prostředky mikrobiální transformace. Jiná možnost pro přípravu nových sloučenin spočívá, jak je popsáno výše, v použití vhodné báze pro přípravu polyaniontů z cyklických peptidu podle obecného vzorce I, kde D znamená N-methyl-gamma-hydroxyleucin, reagováním tohoto polyaniontů s vhodnými elektrofily a, pokud to je vhodné, podrobení nově zavedeného radikálu další transformaci tak, aby byla získána požadovaná substituce v aminokyselině C.

0000 0 0 0

0 • 0 «

0 0000 » * > 0 0 0 0# • 000 0 00 0 • 0 0 ·000 • 0 0 0 0000 0 • 0 000 »· 00

Polyanionty jsou připraveny reagováním počáteční sloučeniny ve vhodném nevodném rozpouštědle, jako je tetrahydrofuran, při nízkých teplotách, preferovaně při teplotách nižších než je minus čtyřicet stupňů, s přebytkem vhodné báze, preferovaně 1 ithiumdiisopropylamid, rozpuštěném ve bezvodém tetrahydrofuranu a.vychytáním vzniklého polyaniontu vhodným e1ektrofi 1em. Tato metoda v podstatě koresponduje metodě, kterou popsal Seebach (D. Seebach et al., Helv. Chim. Acta, svazek 76, 1564 - 1590. 1993). Další báze, které jsou vhodné, jsou jiné amidy alkalických kovů, jako je 1 ithumdiethylamid nebo ithiumhexamethyldisilazid, a také alkoholáty alkalických kovů, jako je methoxid draselný, terc.butoxid draselný, tert.amoxid draselný a methoxid sodný. Příklady vhodných elektrofilů jsou alkylhaiogenidy, jako je methyljodid, ethyljodid, allylbromid a benzyIbromid, alkoxymethylhalogenidy , jako je methoxymethy1 chlorid, methoxyethoxymethy1 chlorid a benzyloxymethylchlorid, nebo dále karbonylové sloučeniny, jako jsou aldehydy nebo některé ketony, například formaldehyd, acetaldehyd, benzaldehyd, aceton nebo cyklické ketony jako jle cyk1opropanon a jeho vyšší homologa, a také reaktivní derivátykyseliny uhličité, jako jsou isokyanáty a organických karboxylových kyselin, jako jsou estery, např. ethy1formi at, diethyloxalat, ethylbenzoaty a ethylnikotinaty. Jinými vhodnými elektrofily jsou halogeny a také- jiné zdroje pozitivních halogenů jako je N-chlorsukcinimid,

N-bromsukci n i mi d, N-f1uoro-N-neopentýl-p-to 1uensu1fonam id , perchlorylfluorid, N-halogenkyany, jako je chlorkyan a také disulfidy a jejich sulfoniové sole, jako je dimethyl sulfid, dimethyl thiomethylsul foniutn jodid, di f eny ld i sul f id , dipyridyldísulfid a 2,2'-benzothiazo1yldisulfid. Reakce těchto elektrofilů vedou ke tvorbě nových center chirality. Směsi, ve fafa fa V fa fa * fa fa • fa é fa t • fafa· fa • fa • fa • fa ··« fa· ·« fafa · • fafa • fafafa fa •fa ’*·’ kterých převládá jeden ze dvou možných diastereomeru, jsou získány v závislosti na reákčníeh podmínkách. Tyto nově tvořené diastereomery se jeden od druhého- liší v tom, že aminokyselina C podle obecného vzorce I má (D) konfiguraci v jednom případě, a (I.) konfiguraci ve druhém případě. V předkládaném, vynálezu jsou preferovány ty diastereomery, ve kterých je aminokyselina C podle obecného vzorce I v (D) konfiguraci. Faktory, které vedou k preferované tvorbě (D) diastéreomerú nebo (L) diastereomeru, a také vliv použité báze, a mnoho elektrófilů, byly zkoumány podrobně Seebachem pro případ, kdy je cyklosporin A počáteční sloučeninou, jak je popsáno v Literatuře (D. Seebach et al., Helv. Chim. Acta, svazek 76, 1564 - 1590, 1993), a jak bylo kriticky komentováno jinými autory (S. David, Chemtracts Organic Chemistry, svazek 6, 303 - 306, 1993). Pokusné podmínky, které jsou posány v předkládaném vynálezu, vedou k predoininantní tvorbě těch diastereomeru, ve kterých má nově vytvořené centrum chirality aminokyseliny C (D) konfiguraci. Bylo demonstrováno v předkládaném vynálezu, že tak je tomu také v případě 4-(gamma-hydroxy)-N-methy1-teucincyklosporinu, když je použit jako počáteční-sloučenina místo cyklosporinu A. Použití '

4-(gamma-hydroxy)-N-me thy1-1euci ncyklospor i nu jako počáteční sloučeniny pro takové transformace je nové a je předmětem předkl ádaného. vynál ezu. ...

Obecně, produkty, které jsou získány v těchto případech mají také predominantně konfiguraci (D) aminokyselin.

Mikrobiální hydroxylace gamma polohy aminokyseliny v poloze D může být provedena za použití různých mikroorganismů rodu Actinomyces, například za použití Sebekia benihana, jak je popsáno v Rur. J. Immunol,, 1987, 17, 1359. Význam této

9999

9 · 9999 999*

9 9« 9 9999 * · 9· 9 9 9 9999 9 . ? iiř ϊ · v -«

9999 9 99 «99 «9 9« transformace je zásadní v tom, že imunosupresivni účinek cyklosporinu je téměř kompletně eliminován v jednom kroku.

Protože jsou málo toxické, mají sloučeniny podle vzorce I výhodné biologické vlastnosti, zejména v to, že vykazují inhibiční účinek na virus lidské imunodeficience (HIV), a mohou proto být použity jako léky u HIV infekce. Tento inhibiční účinek byl pozorován-ve vhodných in vitro pokusech při koncentracích od 0,05 do 50 ing/1. Sloučeniny podle vzorce I, a pokud je to vhodné, tak její soli, mohou být použity jako léčiva bud samostatně, nebo ve vhodných medicinálních formách spolu s anorganickými nebo organickými farmakologicky indiferentními přídavnými substancemi.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příprava 3-N-methy1-(D)-serin-4-(gamma-hydroxy)N-methyl1eucincyklosporinu

Eur. J. Immunol., 1987, svazek 17, 1359, popisuje použití Sebekia benihana pro zavedení hydroxylové skupiny do gamma polohy N-methyl1euci nu v poloze 4 cyklosporinu Λ prostředky mikrobiální transformace. Tato bio transformace může být použita pro přípravu 3-N-methy1-(D)-ser in-4-gamma-hydroxy-N-methyl1euc incyk1 o spor i nu z 3-N-me thy1-(D)-serincyk1 ospor i nu. Kmen, který je použit, má označení NELL lilii a patří do rodiny Act i noplanaceae.

4 •

4494 • 944 • 94 *9 * *

44 •44 4 4 9 4 '♦»*

Počáteční kultura:

Agarové'ku 1 tury NRLL 11111 byly kultivovány při 27 °C po 10 dní've sterilizovaném mediu, které bylo upraveno na pH 7 a skládalo se z, 20 g glukosy, 10 g kvasinkového extraktu (Gistex), 10 g peptonu, 40 g škrobu, 2 g uhličitanu vápenatého, 40 g agaru a 1 1 vody.

Předběžná kultura

Předběžné kultivační medium se skládalo z 35 g glukosy, 50 g škrobu, 12,5 g peptonu, 50 g sladového extraktu, 22,5 g kvasinkového extraktu a 5 g uhličitanu vápenatého ve 5 1 vody. Kromě toho toto medium obsahovalo 5 ml roztoku stopových prvku (1 ml koncentrované kyseliny sírové, 5 g heptahydrátu síranu železnatého, 50 mg ΚΙ, 100 mg kyseliny borité, 4 g heptahydrátu síranu zinečnatého, 200 mg pentahydrátu síranu mécínatého a 2 g hexahydrátu chloridu hexahydrátu chloridu kobaltu v .1 1 destilované vody). Spory a mycelium počáteční kultury byly suspendovány v 10 ml 0,9% salinickébo roztoku a suspenze byla přidána ke 100 ml sterilizovaného předběžného kultivačního media. Tato kultura byla třepána při 27 °C po 4 dny na orbitální, třepačce při 200 otřesech/minutu. Po 4 dnech byla předběžná kultura ředěna (1:10) sterilizovaným předběžným kultivačním mediem a třepána po další 3 dny.

Hlavní kultura

Fermentační medium pro hlavní kulturu (t 1 destilované vody, 1 ml výše popsaného roztoku stopových prvků, 200 mg molybdátu amonného, 255 mg hydrogenfosforečnanu draselného, 120 mg iu «« ···· • 9 9

9 «

• á

MM · • · « · · ··

9 9· 9 9 9 9 • · * « · β a • ♦ 9 9 949 9 4

994 94 *94 dihydrogenfosforečnanu draselného, 100 mg heptahydrátu síranu hořečnatého, 50 mg hexahydrátu chloridu vápenatého, 12,5 g sojové moučky, 2,5 g kvasinkového extraktu, 10 g škrobu, 10 g dextrinu a 10 g cerelosy) bylo upraveno na pH 7,3 a sterilizováno při 120 °C po 20 minut. 10 ml předběžné kultury získané výše bylo potom přidáno a směs byla třepána při 27 °C po 24 hodin na orbitální třepačce a, po přidání 100 mg 3-N~methyl--(D)-serincyklosporinu, byla třepána po další 3 dny.

Izolace 3-N-methy1-(D)-serin~4-(gamma-hydroxy)N-methylleucincyklosporinu

Hlavni kultura je zbavena mycelia filtrací a filtrát je extrahován 5x dichlormethanem. Kombinované extrakty jsou koncentrovány na rotační odparce a zbytek je chromatografován na 250 g silikagelu (Merck silikagel, velikost částic 0,4 - 0,063 mesh). Další chromatografie cyklosporinových frakcí na 70 g silikagelu dávala 15 mg

3-N-me thy1-(D)-ser in-4-(gamma-hydroxy)N-methylleucincyklosporinu jako amorfního prášku. Optická otáčivost této substance' je (alfa)o = -166° (c = 0,5, dichlormethan). Tento produkt může být krystalizován z methanolu, se vzniklými krystaly tajícími při 150 - 152 ,°C. V IH NMR spektru, v deuterizovaném DMSO, se dvě methylové skupiny N-methy1-gamma-hydroxy1euci nu jeví jako singlety při 1,05 ppm.

Příklad 2

Příprava 3-N-methy1 — (D)-serincyklosporinu

Příprava této substance je popsána v literatuře, D. Seebach

I i

9« «99« «999 'i * 99 ·· • · 9· «99« • · 9 9 9 99 • 9 9 9 999« · tί « r-- . . * 9 · « «« 999 ·9 «· et al., Helv. Chim. Acta, svazek 76, 1564

1590, 1993.

Tato substance může být získána následujícím způsobem:

2a) 3-alfa-methoxykarbony1cyklosporin ml 1,6 tnolárního roztoku n-butyllithia v hexanu je přidáno po kapkách, při 0 °C a za atmosféry inertního plynu (argonu), do roztoku 8,7 ml di isopropylamidu v 800 ml sušeného THF. Po 20 minutách při 0 °C je roztok ochlazen na -78 °C a roztok 10,0 g cyklosporínu A ve 150 ml sušeného tetrahydrofuranu, který byl předem ochlazen na -78 °C, je k němu po částech přidán. Vzniklá směs je míchána při -78 °C po l hodinu a potom jí. prochází proud suchého CO2 plynu. 6,4 ml methyl chloroformiátu je potom přidáno po kapkách a směs je míšena při -78 °C po 2 hodiny. Poté, co byl přidán 1,1-diisopropylamin, je teplota zvýšena na 20 °C a směs je míchána při této teplotě po 14 hodin; potom je zahřívána pod refluxem po 45 minut. Poté, co byla směs ochlazena na 20 °C je přidáno 100 ml fosforečné kyseliny a vodná fáze je extrahována 600 ml *ethylacetátu. Vodná fáze je opakovaně extrahována několikrát ethylacetátem. Organické extrakty jsou kombinovány, sušeny síranem hořečnatým a vysušeny ve vakuu. Vzniklý olej je chromatografován na 500 g silikagelu (0,02 - 0,05 mesh) za použití směsi 4:1 ethylacetatu a cyklohexanu. Frakce, které obsahují produkt, jsou kombinovány a rozpouštědlo je odstraněno ve vakuu. 1,9 g 3-a1fa-methoxykarbony 1cyk1ospori nu je takto získáno jako bezbarvý prášek mající teplotu tání 138 °C.

2b) 3-N-methy1-D-s er incyklospor i n

2,4 ml 2,0 molárního roztoku borohydriclu lithného v THF je ·· *000

00 • * 0 * * 0* • 00 0 0 ·*·· · ·*

0 '0 0 přidáno po kapkách, při 0 °C, k roztoku 1,0 g 3-alfa-methoxykarbonycyklosporinu ve 30 ml suchého tetrahydrofuranu. Tato směs je míchána při 0 °C po 22 hodin.

' Potom jsou přidány 2 ml destilované vody, potom 10% kyselina chlorovodíková, která je přidána po kapkách, a potom dalších 10 .ml destilované vody. Tato směs je třepána s 25 ml ethylacetátu, potom jsou separovány fáze a vodná fáze je následné extrahována 3x 50 ml ethylacetátu pokaždé. Kombinované extrakty jsou sušeny síranem hořečnatým a vysoušeny ve vakuu. Zbytek je chromatografován na 300 g silikagelu za použiti ethylacetátu jako elučního činidla. Frakce, které obsahují produkt, jsou kombinovány a koncentrovány ve vakuu, a je získáno 401 mg

3- N-methy1-(D)-serincyklospori nu jako bezbarvého prášku majícího .teplotu tání 128- 130 °C.

Příklad 3:

Příprava 3-N-me thy1-(D)-s e r in-4-(gamma-hydroxy)-N, methylleucincyklosporinu ze 4-(gamma-hydroxy)-Nmethy1leucincyklosporinu ml 1,6 molárního roztoku n-butyl1ithía v hexanu je přidáno po kapkách, při 0 °C za atmosféry inertního plynu, do roztoku 1,12 ml dl isopropylaminu v 50 ml suchého THF. Po 20 minutách při 0 °C je roztok ochlazen na--78 °C. a roztok

4- (gamma-hydroxy)-N-methylleucincyklosporinu v 50 ml suchého tetrahydrofuranu, který byl předem ochlazen na -78 °C, je do něj přidán po částech. Vzniklá směs je míšena při -78 °C po l hodinu, potom je monomerní formaldehyd zaveden do reakční směsi za použití mírného proudu argonu. Směs je míšena při -78 °C po další 2 hodiny. Teplota je potom zvýšena na 20 °C, potom s

3

0« * * 0 ·

0 0 0

00·0 * • 00 v« *000 *

00 0 0

0 ««I

0« 0· je přidáno 10 ml kyseliny fosforečné a vodná fáze je extrahována 100 ml ethylacetátu. Vodná fáze je opakovaně extrahována několikrát ethylacetatem. Organické extrakty jsou kombinovány, sušeny síranem hořečnatým a vysušeny ve vakuu. Vzniklý olej je chromatografován·na 100 g silikagelu (0,02 - 0,05 mesh) za použití ethyl acetatu jako elučního činidla. Frakce, které obsahují produkt, jsou kombinovány a rozpouštědlo je odstraněno ve vakuu. Tímto způsobem je získáno 5 mg

3-N-me thy 1-(D)-ser i n-4- (gammahydroxy )-N-methy11eucincyk1osporinu. Podle všech fyzikálně + chemických kriterii je substance připravená tímto způsobem identická se substancí, která byla připravena podle příkladu b.

Test protivirové aktivity

T-buňky linie MT4, které popsali I.'Myoshi et al., (Nátuře 294, str 770 - 771, 1981) byly použity pro tento test. HIV—1 (kmen IIIB) byl adsorbován na buňky po dobu dvou hodin při 37 °C. Inokulum bylo potom odstraněno a infikované buňky byly přneseny do tkáňových kultivačních ploten, které obsahovaly testovanou sloučeninu v různých koncentracích. V tomto kontextu bylo virové inokulum vybráno tak, aby se koncentrace virového p24 antigenu zvyšovala exponenciálně v buněčném supernatantu do čtvrtého dne infekce. Třetí a čtvrtý den po infekci byly buněčné supernatanty analyzovány ELISA na antigen p24. Byly určeny ICso hodnoty srovnáním koncentrací p24 v supernatantech infikovaných, substancí ošetřených buněk a v supernatantech neošetřených infikovaných kontrolních buněk. V tomto testu byla hodnota IC50 pro 3-N-methy1-(D)-ser in-4-(gamma-hydroxy)-Nmethy11eucincyk1 o spor i nu 0,1 mg/ml. Pro srovnání, korespondující hodnota pro cyklosporin A je 0,5 mg/ml.

Claims

1. Nový cyklický peptid obecného vzorce I

B.C.D.E.F (I)

K.J.I.H.G.

kde A až. K znamenají zbytky následujících aminokyselin:

A je substituovaný homothreonin obecného vzorce II

Ri-CH ₂ CH(CH 3)-CH(OH)-CH(NHCH 3)-COOH (II), ve kterém je Ri n-propyl nebo propenyl a dvojná vazba je preferovaně ve trans-konfiguraci,

B je kyselina alfa aminomáselná, valin, norvalin nebo threonin,

- C je (D)-aminokyse1ina obecného vzorce III

CHNH3-CH(R)-COOH (ΙΠ) , ve kterém

X v •4 4444

2. Cyklický peptid obecného vzorce I podle nároku 1, kde radikál Ri v A je propeny!, B je kyselina alfa-máselná, D je N-rnethyl-gamma-hydroxy l eucin, E je valin, F, í a J jsou v každém případě N-methylleucin, G je alanin, H je (D)-alanin a K je N-methylvalin.

3. Cyklický peptid obecného vzorce I podle nároku 2. kde radikál R ve vzorci III je methyl, ethyl, propyl, allyl, propargyl, hydroxymethyl, hydroxyethyl, hydroxybenzy1, aminoinethyl, inethylaminomethyl, d i methyl am i notné thyl, ethylaminomethyl, diethylaminomethyl, propylaminamethy1, isopropy lam i notné thyl, dipropylaminomethyl, diísopropylaminomethy1, terč.butylaminomethyl, fluoromethyl, methoxymethyl, ethoxymethyl, methoxykarbony1, ethoxykarbonyl, propoxykarbonyl, isobutyloxykarbonyl, methylaminokarbony1, ethylaminokarbony 1 , propylaminokarbonyl, i sopropy 1 aminokarbony l·, r

fenylaminokarbonyl, methoxykarbonylmethyl, ethoxykarbonylmethy1, pr opoxykar bony lme thyl, terč. but oxy karbony lrne thy 1 , methoxy, ethoxy, propoxy, isopropoxy, n-butoxy, isobutoxy, terč.butoxy, hydroxyethoxy, methylthio, ethylthio, hydroxyethylthio, propylthio, isopropylthio, n-butylthio, isobutylthio, terč.butylthio, fenylthio, 2-pyridy1thio nebo benzothiazol-2-vl“thio.

4, 3^N-methyl-(D)-serin-4-(gamma-hydroxy)-N-methy11eucincyklo spor in.

•0 0000

0 0 0 0 0 0 ·

0 0 _ ‘0000 ·

4 44 44 • - 4 • 444 '4

- Η je (D)-alanin nebo (D)-serin, a

K j e N-m e t hylva 1 i n.

5. Způsob přípravy sloučenin obecného vzorce I, ve kterých má C výše uvedený význam a D znamená

N-methyl-gamma-hyclroxyl eucin, vyznačující se tím, že zahrnuje hydroxylaci cyklického peptidu obecného vzorce I, ve kterém D znamená N-methylleucin, za použití mikroorganisrnu.

6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tí-in, že mikroorganismus je Sebekia beriihana.

7. Způsob přípravy sloučenin obecného vzorce I, ve kterých D znamená N-methyl-gainma-hydroxyl eucin, vyznačuj í c í s e t í m, že zahrnuje konvertování cyklického peptidu obecného vzorce I, kde C je sarkosin a D je N-methyl-gamma-hydroxyleucin na polyanion za použití vhodných bází a transformování tohoto polyanionu na produkt podle nároku 1 jeho regováním s vhodnými elektrofily. ’*

SPOLEC všetečk/

Česká republika

A PARTNEŘI

120 00 Praha 2, Hálkova 2

I • ’ 0 0 _ · · · ··

δ.

Farmaceutická kompozice, která obsahuje jeden nebo více cyklických peptidů podle nároku 1 spolu s farmaceuticky pi'i jatelným ředidlem nebo přísadou.

9. Použití sloučeniny podle nároku. I pro.přípravu farmaceutik pro léčbu nebo prevenci infekcí virem lidské imunodeficience (HIV).

10. Polyanion obecného vzorce I, kde v tomto vzorci je C sarkosin a D je N-methy1-gamma-hydroxyleucin.

11. Polyanion 4-(gamma-hydroxy)-N-methylleucin-cyklosporinu.