CZ606189A3 - Microrespirograph for evaluating biotechnological processes and metabolic alternation in cells, tissues and organisms - Google Patents

Description

Mikroreapirograf· pro vyhodnocování biotechnologických procesů a metabolických změn buněk, tkání a organismů

Vynález se týká zařízeni pro plynulou registraci spotřeby kyslíku a vylučováni oxidu uhličitého buňkami a tkáněmi, pracující na volumetrickém principu a obsahující elektronický převodník tlakových rozdílů mezi respirační a kompenzační nádobkou, přičemž řečený elektronický převodník je napojen na tensometrickou jednotku a respirační nádobka je opatřena generátorem kyslíku.

P?o měřeni spotřeby kyslíku organismů a tkáni byla vyvinuta celá řada respirometrických technik. Původní přístroje byly spirometry a spirografy používané v lékařství, jejichž citlivost se pohybovala řádově v ml spotřebovaného kyslíku. Druhou generaci těchto přístrojů představuji mikrorespirometry používané k výzkumu metabolických změn u různých živočichů a rostlin, pracující v oblasti yU l hodnot. Třetí generace je v současné době zastoupena elektronickými přístroji, jako jsou kyslíkové oxygrafy a ultramikrorespirometry, schopné zaznamenávat spotřeby kyslíku v nanolitrovém množství. V souborné práci věnované měřeni spotřeby kyslíku malých vzorů tkáni /viz T.J.3radley a T.A.Miller: Measurement of ion transoort and metabolic rate in insects, Springer Verlag, New York, Berlin, Heidelberg, Tokyo, 1984, str.101/ byly shrnuty základní mikrorespirometrické přístroje s velkou citlivosti. Tyto přístroje jsou založené na přímých volumetrických principech, dále jsou zde popsány, elektrolytické resoirometry, polarograf i cké respi rometry využívající kyslíkových elektrod, dále diaferometrické průtokové respirometry, analysátory vydechovaného oxidu uhličitého založené na absorpci oxidu uhličitého CO2 v infračervené oblasti, apod.

Nejvíce prakticky jsou rozšířeny v současné době oxygrafy, používající kyslíkové elektrody. Tyto přístroje jsou velmi citlivé, jejich nevýhodou však je nepřímé měřeni spotřeby kyslíku na základě změn koncentrace O2 v respiračni nádobce. Velký pokrok v elektronice, zvláště dostupnost polovodičových tenzometrú, schopných přenášet a měnit na změnu elektrického proudu nejjemnéjši mechanické deformace, umožnil konstrukci vysoce citlivého přístroje, registrujícího přímo nanolitrové změny ve spotřebě kyslíku. Tento přistroj se ukázal být vhodný pro měřeni metabolické činnosti malých vzorků explantovaných hmyzích tkáni. Pomoci tohoto skanovaciho mikrorespirografu /viz citaci výše/, bylo možné získat průběžné záznamy metabolických změn malých množství buněk a tkáni.

Nevýhodou výše uvedené metody je, že zvýšeni citlivosti v nl oblasti je dosaženo mimo jiné změnšenim objemu respiračni nádobky pod 1 ml. Následkem toho je množství kyslíku použitelného k dýcháni měřeného objektu značně omezené. Během delšího měřeni dochází velmi rychle k jeho spotřebě a k poklesu jeho parciálního tlaku uvnitř respiračni nádobky, a tím k postupnému zmenšováni metabolické aktivity, spojené připadne s uhynutím měřených buněk. Další nevýhody dosavadních metod měřeni metabolismu buněčných susoenzi spočívají v tom, že používají velké množství tkáně, řádově miligramy, nebo tkáňových suspenzi, řádově mililitry. Navic používají kapalných termoregulačních medii a vydatného mi cháni reakčni směsi k zajištěni rovnoměrného přisunu kyslíku k buňkám, nebot difúze 0^ v kapalném prostředí j.e asi 500 miliónkrát pomalejší než v plynné fázi.

Tyto nevýhody odstraňuje zařízeni podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že tensometrická jednotka 3 elektronickým převodníkern tlaku je propojena 3 generátorem kyslíku uvnitř respiračni nádobky přes regulační spínací obvod, elektronický převodník msže být tvořen polovodičovými tsnsometry umístěnými na membráně o průměru 6 až 20 mm, tloušťce 0,01 až 0,08 mm, dělúcí'’ prostor elektronického převodníku na dvě stejné části, přičemž vnitřní prostor elektronického převodníku na každé straně membrány je v rozmezí 1 až 300 nl a obě stejné části jsou spojeny věncem adjustačnich šroubů.

Výhoda zařízeni podle vynálezu spočívá v tom, že nahrazuje kyslík spotřebovaný tkáněmi kyslíkem elektrolyticky *

vyrobeným přímo uvnitř respirační nádobky. To umožňuje dlouhodobý průběžný záznam metabolických změn malých vzorků tkáni při zachováni veliké citlivosti měřeni a současném zachováni stálého parciálního tlaku 0₂ v respirační nádobce po celou dobu měřeni. V kombinaci s vysokou citlivosti elektronických převodníků tlaku umožňuje zařízeni plně autoregulačni, dlouhodobé monitorováni změn v látkové přeměně mikrogramových množství buněk a tkáni s přesnosti záznamu pikolitrových veličin spotřeby 0^ nebo vylučováni oxidu uhličitého CO^ za minutu.

Další výhodou tohoto vynálezu je, že diky veliké citlivosti měřeni se mohou používat extrémně malá množství buněk a tkáni, řádově mikrogramy, nebo tkáňových suspenzi, řádově mikrolitry. Tím je zaručen dostatečný přívod kyslíku až k mitochondriim buněk bez nutnosti mícháni, které je pro některé buněčné kultury přímo škodlivé. Použitím větších nádobek a zmenšením citlivosti je možno přistroj podle vynálezu použit jako univerzální mikrorespirograf pro záznam metabolických změn malých i velkých organizmů, jako jsou vajíčka a různá vývojová stadia hmyzu, klíčící embrya nebo části rostlin, nebo laboratorní zvířata.

Přiklad provedeni zařízeni podle vynálezu je znázorněn na připojeném výkresu, představujícím schematický náčrtek mechanické i elektronické části zařízeni.

Kompenzační nádobka 2 ³ fespiračni nádobka 2_ jsou vzájemně oddělené membránou 16 elektronického převodníku 3_. Kromě toho jsou také propojeny navzájem spojovacími trubičkami £ o vnitřním průměru menším než 0,7 mm, napojenými na ventil £ pro uzavíráni nebo otevíráni prostory kompenzační nádobky £ ³ respir3čni 'nádobky 2. do vnějšího prostoru. Ventil £ je připojen k servomotoru £, který je přes přepínač 14 napojen na regulační spínací obvod 12. Respirační nádobka £ je také spojena prostřednictvím spojovací trubičky 9 s mikrostři- 4 • kačkou 7_ pro přímou objemovou kalibraci přístroje. Elektronický převodník tlaku j5, spojovací trubičky 9_ a ventil 4. jsou umístěny ve vnitřním kovovém plášti 5_. Vnitřni kovový plást 5^, kompenzační nádobka 1_, respiračni nádobka 2_, mi kr ost ři kač ka 7_ a servomotor 6_ jsou uloženy v termoi zolační m plášti který je připojen k termoregulační jednotce 18.

Elektronický převodník _3 je tvořen polovodičovými tenzometry 15 umístěnými na membráně 16 o průměru 6 až 20 mm, tlouštce O_ZO1 až 0,08 mm, dělicí prostor elektronického převodníku 3_ na dvě stejné části_z přičemž vnitřni prostor elektronického převodníku 3. na každé straně membrány 16 je v rozmezí 1 až 300 yu l a obě stejné části jsou spojeny věncem adjustačnich šroubů 17. Tenžometry 15 elektronického převodníku .3 jsou připojeny ke vstupu tensometrické jednotky 11_z jejíž výstup je připojen jednak ke vstupu regulačního spínacího obvodu 12 a jednak k registračnímu a vyhodnocovacímu zařízeni 13 propojenému zpětně s regulačním spínacím obvodem 12, jehož výstup vede přes přepínač 14 bud do elektrod generátoru 10 kyslíku nebo do servomotoru 6_. V kompenzační nádobce 1_ je uložen rovněž generátor 10 kysliku_z jehož elektrody nejsou zapojeny.

Základní elektronickou součásti zařízení je tensometrická jednotka 11, určená pro přesné měřeni použitím odporových můstků_z zásobujících tenžometry 15 elektronického převodníku

3. napájecím napětim_z jehož změny závislé na mechanické deformaci membrány 16 jsou pak zesilovány, dekódovány a přeměněny na výstupní signál přicházející na vstup regulačního spínacího obvodu 12 a dále na registrační a vyhodnocovací zařízeni 15, představované lineárním zapisovačem, osciloskopem nebo parně•A tovým počítačem. Regulační spínací obvod 12 ovládá činnost servomotoru ó. spojeného s ventilem 4., nebo činnost generátoru 10 kyslíku nastavením pásmovcýh propusti na začátku a na konci měřeného rozsahu. Generátor 10 kyslíku pracuje na elektrolytickém principu a je tvořen platinovou /+/ a měděnou /-/ elektrodou, které jsou umístěny v nasyceném roztoku CuSCL s přídavkem 12 síranu železnatého FsSC, proti tvorbě ozonu.

<+

Na rozdíl od elektrolytických respirátorů /viz citaci uvedenou výše, str. 163/, zařízení podle vynálezu nepoužívá elektrolyt!c5 ký princip přímo k měřeni hodnot spotřeby kyslíku, ale k automatickému nastavováni tlakových hodnot a k průběžnému doplňováni množství kysli ku spotřebovaného měřenými organismy. Skutečné měřeni spotřeby kyslíku a automatické nastavováni nuly jsou v tomto zařízeni uskutečňovány prostřednictvím elektronického převodníku 3., tensometrické jednotce 11 a regulačního spínacího obvodu 12.

Při práci se zařízením podle vynálezu musí být na začástku měřeni ventil £ v poloze otevřeno, pásmové propusti regulačního spínacího obvodu 12 pro zapínáni a vypínáni generátoru 10 kyslíku se nastaví na příslušné hodnoty, dále se nastaví rozsah citlivosti měřeni na tensometrické jednotce 11 a odpovídající proud do elektrod generátoru 10 kyslíku se pak nastaví na regulačním spínacím obvodu 12. Měřený objekt se umísti spolu s absorbentem oxidu uhličitého C0₂ do respirační nádobky £, která se připojí k příslušnému vývodu z elektronického převodníku 3. V zařízeni je možno použit i několika samostatných respiračnich nádobek 2_, které jsou společně umístěny v termoizolačním plášti 8. a jsou postupně připojovány k elektronickému převodníku 3^ pomoci neznázorněného vicecestného miniaturního ventilu.

Po 10 až 15 minutách potřebných pro ustáleni teploty se začne měřeni uzavřením ventilu £ elektrickým povelem přes přepínač 14. Registrační a vyhodnocovací zařízeni 13 začne ihned ukazovat úbytek tlaku v respirační nádobce £, který je úměrný spotřebovanému kyslíku. Po dosaženi maxima nastaveného hodnotou horní pásmové propusti na regulačním a spínacím obvodu 12 dochází k vysláni elektrického signálu na přepínač £4, což má za následek bud krátkodobé otevřeni ventilu 4_, a tím vyrovnání t la ku^ompenza čni nádobce £ ³ respirační nádobce 2. na původní nulovou hodnotu, nebo, podle polohy přepínače 1 4 _z dojde k průtoku elektrického proudu generátorem 10 kyslíku, který bude vyrábět plynný 0-, rychlosti odpovídající nastavenému proudu na regulačním a spínacím obvodu 12 , až do okamžiku, kdy hodnoty na výstupu dosáhnou spodního limitu pásmové propusti pro vypnuti elektrolýzy. V této době je indikátor registračního a vyhodnocova6 čího zařízeni 13 zpět na původní hodnotě a celý cyklus měřeni se samočinné opakuje.

Zařízeni podle vynálezu je možno s výhodou využit pro měřeni nanolitrových a pikolitrových množství spotřeby kysli— ku_z zejména pro monitorováni průběhu biotechnologických postupů na základě záznamu spotřeby kysliku nebo vylučováni oxidu uhličitého miniaturních, submikrolitrových vzorků reakčních směsi, dále k měřeni metabolické aktivity mikroorganismů, tkáňových kultur buněk a buněčných suspenzi, k výzkumu buněčných vývojových cyklů, k měřeni metabolismu mikroskopických vzorků ži- * vočišných a rostlinných tkáni> např. pro srovnáni normální a nádorové tkáně, dále je možno zařízeni použit k měřeni metabolické aktivity malých organizmů, jako jsou vajíčka hmyzu a jiných živočichů, různá vývojová stadia členovců, klíčící semena a kličky rostlin v biotechnologických postupech a s menšími úpravami velikosti baniček je možno zařízeni použit jako vysoce citlivého, univerzálního respiroarafu s kontinuálním záznamem.

Claims (2)

1. Zařízení pro plynulou registraci sootřeby kyslíku a vylučovaní oxidu uhličitého buňkami a tkáněmi vytvořený na cápi přímého volumetrického principu, obsahující elektronický převodník tlakových rozdílu mezi respiračni a kompenzační nádobkou, přičemž elektronický převodník je napojen na tensometrickou jednotku a respiračni nádobka je ooatřena generátorem kyslíku, vyznačené tím, že tensometrická jednotka /11/ s elektronickým převodníkem /3/ je zpětnovazebně propojena s generátorem /10/ kyslíku přes regulační spínací obvod /12/.

2. Zařízeni podle bodu 1 vyznačené tím, že elektronický převodník /3/ je tvořen polovodičovými tenzometry /15/ umístěnými na membráně /16/ o průměru 6 až 20 mm, tlouštce 0,01 až 0,08 mm, rozdělující prostor elektronického převodníku /3/ na dvě stejné části, přičemž vnitřní prostor elektronického převodníku /3/ na každé straně membrány /16/ je v rozmezí 1 až 300 yj l a obě stejné části jsou spojeny věncem adjustačnich šroubů /17/.