CZ63098A3 - Antagonisti onkogenní aktivity proteinu Mdm2 a jejich použití v léčení rakovin - Google Patents

Antagonisti onkogenní aktivity proteinu Mdm2 a jejich použití v léčení rakovin Download PDF

Info

Publication number
CZ63098A3
CZ63098A3 CZ98630A CZ63098A CZ63098A3 CZ 63098 A3 CZ63098 A3 CZ 63098A3 CZ 98630 A CZ98630 A CZ 98630A CZ 63098 A CZ63098 A CZ 63098A CZ 63098 A3 CZ63098 A3 CZ 63098A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
mdm2
protein
ser
use according
nucleic acid
Prior art date
Application number
CZ98630A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ298806B6 (cs
Inventor
Bruno Tocque
Marie-Christine Dubs-Poterszman
Bohdan Wasylyk
Original Assignee
Rhone-Poulenc Rorer S. A.
Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rhone-Poulenc Rorer S. A., Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale filed Critical Rhone-Poulenc Rorer S. A.
Publication of CZ63098A3 publication Critical patent/CZ63098A3/cs
Publication of CZ298806B6 publication Critical patent/CZ298806B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4705—Regulators; Modulating activity stimulating, promoting or activating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4736—Retinoblastoma protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
    • C12N2799/022—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from an adenovirus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
    • C12N2799/027—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from a retrovirus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

Antagonisti onkogeďí aktivity proteinu a jejich použiti v léčeni rakovin
Oblast techniky
Předložený vynález se týká nových metod léčení hyperproliferativnich patologii (rakovin, restenóz, atd.) a odpovídajících farmaceutických kompozic.
Dosavadní stav techniky
Velký počet rakovin je způsoben úplně nebo zčásti genetickými anomáliemi, které se projevují bud’ silnou expresí jednoho nebo více genů nebo/a expresí jednoho mutovaného genu nebo mutovaných genů nebo genů nenormálních. Například exprese onkogenů generuje ve většině případů rakovinu. Jedná se o onkogen genu geneticky určeného, jehož produkt exprese narušuje biologickou funkci normálních buněk, iniciující tak nově vytvořený stav. V současné době byl identifikován a částečně charakterizován velký počet onkogenů, zejména geny ras, myc, fos, erb, neu, raf, src, fms, jun a abl, jejichž mutované formy odpovídají poruchám proliferačních buněk.
V souvislosti s normálními buňkami, proliferace těchto onkogenů je pravděpodobně potlačena alespoň zčásti vytvořením genu řečeného supresoru tumorů jako p53 a Rb. Nicméně určité jevy mohou porušit tento mechanizmus buněčné autoregulace a upřednostnit tak vývoj nově vytvořeného stavu. Jeden z těchto dějů spočívá v mutacích na úrovni genů supresorů tumorů. Tímto způsobem takto mutovaná forma delecí nebo/a mutací genu p53 je zahrnuta do vývoje většiny lidských rakovin (Baker et coll., Science 244 (1989) 217) a inaktivní formy genu Rb byly prokázány v případě různých nádorů zejména v retinoblastomech nebo v rakovinách mesenchimu jako např. osteosarkomy.
Protein p53 je nukleární fosfoprotein 53kD, který je exprimován ve většině normálních tkání. Je zahrnut do řízení buněčného cyklu (Mercer et al. Critic Rev. Eucar. Gene
Express, 2, 251, 1992), transkripční regulace (Fields et al., • · • · · ·
Sciences (1990) 249, 1046), replikace DNA (Wilcoq and Lané, (1991), Nátuře 349, 4290 a Bargonnetti et al., (1992) Cell 65 1083) a indukce apoptózy (Shaw et al., (1992) P.N.A.S.USA 89, 4495). Každá buněčná expozice k činitelům schopným například poškodit DNA iniciuje kaskádu buněčné signalizace, která vede k posttranskripční modifikaci proteinu p53 a k transkripční aktivaci proteinem p53 určitého počtu genů, jako jsou např. gadd45 (growth arrest and DNA damage) (Kaštan et coll. Cell, 71, 587-597, 1992), p21 WAF/CIP (ElDeiry et coll, Cancer Res., 54, 1169-1174, 1994) nebo také mdm2 (mouše double minuté) (Barak et coll., EMBO J., 12, 461-468, 1993).
Z toho jasně vyplývá, že vyjasnění různých biologických funkcí souboru implikovaných proteinů zejména ve způsobu buněčné signalizace, jejich způsobu fungování a jejich charakteristických znaků je hlavní zájem pro porozumění karcenogenese a upřesnění terapeutických účinných metod řízených proti rakovině.
Podstata vynálezu
Předložený vynález zapadá přesně do této souvislosti uváděje novou funkci proteinu Mdm2.
Protein Mdm2 je fosfoprotein o molekulové hmotnosti 90 kD, exprimovaný od genu mdm-2 (murine double minuté 2). Tento gen mdm2 byl klonován na počátku v živelné tumorální buňce BALB/c 3T3 a bylo konstatováno, že silná exprese zvyšuje silně tumorální schopnost (Cahilly-Snyder et coll. Sómat. Cell. Mol. Genet., 13, 235-244, 1987, Fakharzadeh et coll, EMBO J. 10, 1565-1569, 1991). Komplex Mdm2/p53 byl identifikován ve více buněčných linií obsahujících divoký protein p53 i mutované proteiny p53 (Martinez et coll., Genes Dev., 5, 151-159, 1991). Mimo jiné bylo ukázáno, že Mdm2 inhibuje transkripční aktivitu proteinu p53 na promotoru stejně jako aktivitu svalové kreatin-kinasy indikující, že Mdm2 může regulovat aktivitu proteinu p53 (Momand et coll., Cell, 69, 1237-1245, 1992, Oliner et coll. Nátuře, 362,
857-860, 1993).
Vzhledem k souboru výsledků protein Mdm2 je tedy v současné době zejména uznán jako modulátor aktivit proteinu p53. Když divoké proteiny p53 nebo mutované proteiny vyvolávají komplexy inhibuje jejich transkripčni aktivitu a přispívá tímto způsobem k deregulaci buněčné proliferace. Následkem toho využití těchto informací po stránce terapeutické spočívá hlavně v hledání prostředků pro zabránění této blokaci proteinu p53 proteinem Mdm2.
Předkladatel prokázal, že tento protein Mdm2 má charakter čistě onkogenní totiž úplně odlišný od onkogenního charakteru spojeného s jeho komplexní formou s proteinem p53. Protein Mdm2 rozvíjí onkogenní vlastnosti v souvislosti s proteinem p53 nul. Pro podpoření tohoto objevu a to, že onkogenní vlastnosti Mdm-2 jsou nezávislé na proteinu p53 a že zejména nevyplývají z inhibice transaktivační aktivity divokého proteinu p53, jsme pozorovali, že mutant proteinu p53 (p53 (14-19), Lin et al., Genes Dev., 1994, 8, 1235-1246), který má zachované své transaktivační vlastnosti, ale který již neinteraguje s Mdm-2, je neschopný blokovat onkogenní vlastnosti Mdm-2. Je zejména pozorováno, že Mdm-2 zejména oblast 1-134 Mdm-2, je schopný odblokovat zastavení buněčného cyklu v G1 indukovatelného silnou expresí pl07. Mdm-2 se jeví jako důležitý regulátor faktorů obsažených v řízení buněčného cyklu jiných než p53.
Předložený vynález vyplývá částečně z prokázání, že proteinová sekvence 1-134 identifikované sekvence SEQ ID N°1 proteinu Mdm-2 je dostatečná pro vyjádření onkogenního potenciálu výše uvedeného proteinu.
Předložený vynález yplývá také z prokázání, že je možné určit tento onkogenní charakter proteinu Mdm2 za použití sloučenin, které jsou schopné s ním interagovat. Předložený vynález popisuje také účinné systémy zejména dovolující • « odevzdáni in vivo, přímo do tumorů, takovýchto sloučenin a tedy boj proti vývoji rakovin. Předložený vynález předkládá také nové přístupy účinné zejména pro léčení tumorů zejména v souvislosti s p53 nul, například pro léčení adenokarcinomů tračníku, rakoviny štítné žlázy, karcinomy plic, rakoviny prsu, rakoviny plic, rakoviny žaludku, rakoviny jícnu, lymphomy B, rakoviny ovarií, rakoviny močového měchýře, glioblastomy atd.
První předmět vynálezu spočívá tak v použití sloučeniny schopné antagonizovat zejména onkogenní aktivitu proteinu Mdm2 pro přípravu farmaceutické kompozice určené k léčení rakovin v souvislosti s p53 nul.
Ve smyslu předloženého vynálezu se chápe rakovinou v souvislosti s p53 nul, rakovina, kde protein p53 bude neschopný vykonávat své funkce supresorového genu tumoru jakoukoliv modifikací nebo jakýmkoliv jiným mechanizmem než fixací Mdm-2 na P53, fixací zabraňující proteinu p53 hrát svou roli supresoru tumoru a umožňující buňkám zabránit růstu, který je řízený proteinem p53. Mezi těmito modifikacemi nebo mechanizmy blokujícími aktivitu supresoru tumoru p53 se mohou citovat například genetické poruchy genu p53 (bodové mutace, delece atd.), interakce s jinými proteiny než Mdm-2, velmi rychlá proteolytická degradace proteinu p53 spojená s přítomností proteinu E6 viru lidských papilomů vysoce nebezpečných jako jsou HPV-16 a HPV-18 atd.
Ve smyslu předloženého vynálezu onkogenní aktivita proteinu Mdm2 může být dosažena podle dvou metod.
Je přednostně uskutečněna, když zasahuje přímo na úrovni oblasti 1-134 proteinu. Každý protein schopný se vázat k této oblasti bude mít antagonistickou úlohu vůči onkogenním vlastnostem proteinu Mdm2.
Nicméně účinek inhibitoru může zejména být dosažen interakcí sloučeniny se sousední oblastí, jako například ··· ···· ·· • · ···· ·· ♦· ·· ·· oblast 135-491 proteinu mdm2, vyjádřené na sekvenci SEQ ID N°1 nebo sekvencí C-konce vyjádřené na sekvenci SEQ ID N°l. Podle toho předložený vynález se týká mimo jiné použití každé sloučeniny takové, která neintraguje s touto oblastí přímo a je nicméně schopná určit onkogenní vlastnost.
Podle zvláštního způsobu předložený vynález se týká použití sloučeniny schopné se vázat na úrovni oblasti 1-134 sekvence vyjádřené SEQ ID N°1 proteinu Mdm2 z pohledu přípravy farmaceutické kompozice určené k léčení rakovin v souvislosti s p53 nul.
Ze sloučenin schopných interagovat přímo na úrovni oblasti 1-134 proteinu Mdm2, se může citovat zejména scFV specificky řízený proti této oblasti.
ScFv jsou molekuly mající vazebné vlastnosti srovnatelné s molekulami protilátek a jsou intracelulárně aktivní. Jedná se zejména o molekuly tvořené peptidem odpovídajícímu vazebnému místu variabilní oblasti lehkého řetězce protilátek znovu spojených peptidovou spojkou k peptidu odpovídajícímu vazebnému místu variabilní oblasti těžkého řetězce protilátky. Předkladatelem je ukázáno, že ScFv mohou být produkovány in vivo přenosem genu (viz přihláška vynálezu WO 94/29446).
Může se zejména jednat o peptidy nebo proteiny již známé pro svou schopnost se specificky vázat s oblastí 1-134 proteinu Mdm2 jako například s celkem nebo částí vazebné domény proteinu p53 se sekvencí SEQ ID N°1 a zejména o celek nebo část jednoho z peptidů 1-52, 1-41 a 6-41 sekvence p53 vyjádřené SEQ ID N°2 (Oliner et al., Nátuře, 1993, 362, 857-860) nebo jednodušeji o celek nebo část peptidu 16-25 (Lané et al., Phil. Trans. R. Soc. London B., 1995, 347, 83-87) nebo o stejné peptidy 18-23 lidského proteinu p53 nebo myšího nebo také o blízké peptidy odvozené od peptidů již dříve citovaných, ve kterých kritická rezidua pro interakci s
Mdm-2 by byla zachována (Picksley et al., Oncogene, 1994, 9, 2523-2529) .
Může se zejména prokázat podle předloženého vynálezu sloučeniny se vážou k sousedním oblastem oblasti 1-134 Mdm2 vyjádřené SEQ ID N°1 a části tohoto spojení určující onkogenní aktivitu proteinu Mdm2. Z tohoto titulu se mohou uvést sloučeniny interagující na úrovni oblasti C-konce výše uvedeného proteinu jako například transkripční faktory TFII, TBP a TaF250 stejně jako proteiny interagující na úrovni oblasti 135-491 Mdm2 vyjádřené SEQ ID N°l, jako například proteiny L5 (ribosomální protein) a Rb (retinoblastomový protein) a transkripční faktor E2F (řízený Rb).
Jiný předmět předloženého vynálezu se týká zejména použití scFV specificky řízeného proti této oblasti 1-134 sekvence vyjádřené SEQ ID N°1 proteinu Mdm2 z pohledu přípravy farmaceutické kompozice určené k léčení rakovin.
Ve smyslu vynálezu se rozumí, že soubor interakcí citovaných výše určuje důsledně onkogenní charakter Mdm2. Mimoto tyto proteiny mohou být použity úplně nebo zčásti v případech, kde je prokázána jejich aktivní část oproti vazebným doménám s proteinem Mdm2, a že tato interakce vede k chorobě onkogenního charakteru.
V rámci předloženého vynálezu tyto sloučeniny mohou být použity takové jaké jsou nebo výhodně ve formě genetických konstrukcí, umožňujících jejich expresi in vivo.
Způsob provedení předloženého vynálezu zejména výhodný spočívá v prokázání nukleové sekvence kódující sloučeniny schopné antagonizovat alespoň částečně onkogenní aktivitu proteinu Mdm2 pro přípravu farmaceutické kompozice určené k léčení rakovin v souvislosti s p53 nul.
Z této perspektivy nukleové kyseliny použité v rámci vynálezu mohou být různých typů. Jedná se zejména:
- o antimediátorové nukleové kyseliny
- o oligoribonukleotidy schopné fixovat přímo jednu z oblastí proteinu Mdm2 a inhibovat jeho onkogenni aktivitu (oligonukleotidový ligand)
- o nukleové kyseliny kódující celek nebo část peptidů nebo proteinů schopných se oligomerizovat s jednou z oblasti Mdm2 a inhibovat jeho onkogenni aktivitu o nukleové kyseliny kódující intracelulární protilátky (například různé fragmenty jediného řetězce pocházejícího z protilátek) řízené proti oblasti 1-134 sekvence SEQ ID N°1 proteinu Mdm2.
Podle zvláštního způsobu předloženého vynálezu nukleová kyselina je antimediátorová nukleová kyselina. Tato antimediátorová kyselina je DNA kódující komplementární RNA nukleové kyseliny kódující protein Mdm2 a je schopná blokovat jeho transkripci nebo/a jeho translaci (antimediátorová RNA) nebo ribozym.
Později byl prokázán nový typ nukleových kyselin schopných regulovat expresi cílového genu. Tyto nukleové kyseliny se nehybridují s buněčnou mRNA, ale přímo s dvouvláknovou genomickou DNA. Tyto nové přístupy založeny na prokázání, že určité nukleové kyseliny jsou schopné specificky interagovat ve velkém pruhu dvoušroubovice DNA na úrovni oligopurin-oligopyrimidinové sekvence, totiž na úrovni oblastí majících oligopurinové sekvence na vláknu a oligopyrimidinové sekvence na komplementárním vláknu a tam tvoří trojšroubovici. Base třetího vlákna (oligonukleotid) tvoří vodíkové vazby (Hognessovy vazby nebo Hognessovy inverze) s puriny párů basí - párování basí Watsonovo-Crickovo. Nukleové kyseliny byly popsány zejména Pr. Hélene v Anti-Cancer drug design 6 (1991) 569.
Antimediátorové nukleové kyseliny podle předloženého • · • · « ·· · ·· · · e » · • » · ···· · « · • · ···· · · · · ·· ·· vynálezu mohou být sekvencí DNA kódující antimediátorovou RNA nebo ribozymy. Antimediátorové RNA takto vytvořené mohou interagovat s mRNA nebo cílovou genomickou DNA a tvořit s ní dvouvláknový nebo třívláknový helix. Může se zejména jednat o antimediátorové sekvence (oligonukleotidy), případně chemicky modifikované, schopné interagovat přímo s genem nebo cílovou RNA.
Vždy podle upřednostňovaného způsobu uvedení předloženého vynálezu nukleová kyselina je antimediátorový oligonukleotid takový, jaký byl již definován, případně chemicky modifikovaný. Může se jednat zejména o oligonukleotidy, jejichž fosfodiesterový skelet byl modifikován chemicky, například fosfonátové oligonukleotidy, fosfotriesterové, fosforamidátové a fosforthiolátové, které jsou popsány například v přihlášce vynálezu W094/08003. Může se jednat zejména o oligonukleotidy alfa nebo konjugované oligonukleotidy s činitely jako jsou akrylátové sloučeniny.
Ve smyslu předloženého vynálezu se jedná o oligonukleotidové ligandy, oligoribonukleotidy nebo oligodeoxyribonukleotidy schopné se specificky vázat k proteinu Mdm-2, aby inhiboval svou onkogenní funkci. Takovéto nukleotidy mohou být například prokázány technikami vývoj in vitro jako například technikou SELEX (Edgington, Bio/technology, 1992, 10, 137-140, Brevets US 5, 270, 163 a WO 91/198113) .
Všeobecně tyto nukleové kyseliny mohou být lidského původu, zvířecího, rostlinného, bakteriálního, virového, syntetického atd. Mohou být získány všemi odborníky známými technikami a zejména chemickou syntézou nebo také smíšenými metodami zahrnujícími modifikaci chemickou nebo enzymovou sekvencí získaných tříděním bank.
Jak je naznačeno dále, mohou být včleněny do vektorů, jako například plazmidových vektorů, virových nebo • · • · · ·· « ·*«· • · · »· · · · · · · · · • · · « · · « 9 • · · · · · ·· · · · · · · chemických. Mohou být zejména podávány jako takové ve formě DNA podle technik popsaných v přihlášce vynálezu WO 90/11092 nebo ve formě komplexu například ve formě komplexu s DEAE-dextranem (Pagano et al., J. Virol. 1 (1967) 891), s nukleárními proteiny (Kaneda et al., Science 234 (1989) 375) s lipidy nebo kationickými polymery (Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413) nebo ve formě lipozomů (Fraley et al., J. Biol. Chem. 255 (1980) 10431) atd.
Sekvence použitá v rámci předloženého vynálezu tvoří část vektoru. Použití takového vektoru umožňuje vskutku zlepšeni podávání nukleové kyseliny do buněk k ošetření a také umožňuje zvýšit jejich stabilitu v uvedených buňkách a tím umožňuje získat trvalý terapeutický účinek. Je možné vložit více sekvenci nukleové kyseliny do stejného vektoru tím se zvýší také účinnost léčeni.
Použitý vektor může být různého původu, tím okamžikem, co je schopný transformovat zvířecí buňky, zvláště rakovinové lidské buňky. V upřednostňovaném způsobu uvedení vynálezu se používá virový vektor, který může být vybrán mezi adenoviry, retroviry, viry AAV nebo viry Herpes.
Z tohoto pohledu předložený vynález má také pro předmět každého virového vektoru obsaženou, vloženou do svého genomu, nukleovou kyselinu kódující sloučeninu schopnou antagonizovat alespoň částečně onkogenní vlastnost proteinu Mdm2.
Předložený vynález se týká každého rekombinantního viru obsahujícího sekvenci nukleových kyselin kódujících sloučeninu schopnou se vázat k proteinu Mdm2 tak, aby vytvořil svůj onkogenní potenciál. V této souvislosti sekvence nukleových kyselin mohou kódovat jeden z peptidu, proteinů nebo transkripčních faktorů předem identifikovaných.
Tato sekvence nukleových kyselin kóduje scFv nebo peptid schopný interagovat na úrovni domény 1-134 (SEQ ID • ·
N°l) proteinu Mdm2.
Výhodně viry použité v rámci vynálezu jsou přednostně defektivni, tudíž jsou neschopné se replikovat autonomním způsobem v infikované buňce. Všeobecně, genom defektních virů použitých v rámci předloženého vanálezu je tedy zbaven alespoň sekvenci nezbytných k replikaci výše uvedeného viru v infikované buňce. Tyto oblasti mohou být bud’ vyloučeny (úplně nebo zčásti), nebo učiněny jinými sekvencemi, zejména které mají antagonistickou nefunkční, nebo substituované sekvenci kódující sloučeniny, roli na onkogenní vlastnosti proteinu Mdm2. Defektní virus nicméně zachovává sekvence svého genomu, které jsou nezbytné k enkapsidaci virových částic.
Jedná se zejména o adenoviry, různé serotypy, jejichž struktura a vlastnosti se tak trochu mění, a které byly charakterizovány. Mezi těmito serotypy se přednostně používají v rámci předloženého vynálezu lidské adenoviry typu 2 nebo 5 (Ad2 nebo Ad5) nebo adenoviry zvířecího původu. V rámci předloženého vynálezu se mohou uvést adenoviry původu psího, hovězího, myšího (například: Mávl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81) ovčího, prasečího, ptačího nebo také opičího (například: SAV). Adenovirus zvířecího původu je adenovirus psí zejména adenovirus CAV2 (souche manhattan nebo A26/61 (ATCC VR-800) například). V rámci předloženého vynálezu se přednostně používá adenovirus lidského původu nebo psího původu nebo jejich směs.
Defektní adenoviry podle předloženého vynálezu zahrnují ITR, sekvenci umožňující enkapsidaci a sekvenci kódující modulátor. V genomu adenoviru podle vynálezu gen El a alespoň jeden z genů E2, E4, L1-L5 jsou nefunkční. Uvažovaný virový gen může být zbaven nefunkčnosti všemi odborníky známými technikami a zejména totální supresí, substituci, částečnou delecí nebo adicí jedné nebo více basí v určitém nebo určitých genech. Takové modifikace mohou být dosaženy in • · • · • · · · • · · · · · ·· ···· ··· · · · · ·· ·· ···· ·· ·· · · · · vitro (na izolované DNA) nebo in šitu například prostřednictvím technik genetického oboru nebo zase léčením prostřednictvím mutagenních agentů.
Rekombinantní defektní adenoviry podle předloženého vynálezu mohou být připraveny všemi odborníky známými technikami (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573, Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). Zvláště mohou být připraveny obecnou rekombinancí mezi adenovirem a plasmidem nesoucím mezi jiným sekvenci DNA kódující inhibitor ETS. Obecná rekombinace nastává po kotransfekci řečeného adenoviru a plazmidu v linii přizpůsobených buněk. Použitá buněčná linie musí přednostně (i) být transformovatelná výše uvedenými elementy a (ii) obsahovat sekvence schopné doplnit část genomu defektního adenoviru zejména v integrované formě, aby se zabránilo nebezpečí rekombinace. Jako příklad linie se může zmínit lidská ledvinová embrionární linie 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59), která obsahuje zejména zahrnutou ve svém genomu levou část genomu adenoviru Ad5 (12%). Strategie konstrukce vektorů řízených adenoviry byly také popsány v přihláškách vynálezů n°FR 93 05954 a FR 93 08596.
Adenoviry, které jsou rozmnoženy, jsou získány a purifikovány podle klasických technik molekulární biologie, jak je naznačeno v příkladech.
Co se týče virů AAV, jedná se o viry DNA velikosti relativně malé, které se začleňují do genomu buněk, které jsou infikované, stabilně a regiospecificky. Jsou schopné infikovat široké spektrum buněk bez toho, aby měly vliv na indukci růstu, morfologii nebo diferenciaci buněk. Nezdá se, že jsou zahrnuty do patologií u lidí. Genom AAV byl klonován, sekvenován a charakterizován. Obsahuje okolo 47000 basí, a obsahuje na každém konci oblast obrácené repetice (ITR) se 145 basemi, sloužící jako původce replikace pro virus. Zbytek genomu je rozdělen na dvě hlavní části nesoucí enkapsidační « « funkce: na levou část genomu, která obsahuje gen rep implikovaný do virové replikace a exprese virových genů a pravou část genomu, která obsahuje gen cap kódující kapsidové proteiny viru.
Použiti vektorů odvozených od AAV pro přenos genů in vitro a in vivo bylo popsáno v literatuře (viz zejména WO 91/18088, WO 93/09239, US 4,797,368, US5,1397941, EP 488 528). Tyto přihlášky vynálezu popisují různé konstrukce odvozené od AAV, ve kterých geny rep nebo/a cap jsou deletovány a nahrazeny genem zájmu a popisuje jejich použiti pro přenos in vitro (na buňkách v kultuře) nebo in vivo (přímo do organizmu) výše uvedeného genu zájmu. Rekombinantní defektní AAV podle předloženého vynálezu mohou být připraveny kotransfekcí v buněčné linii infikované pomocným lidským virem (například adenovirem) plazmidu obsahujícího sekvenci kódující inhibitor ETS lemovaný dvěma oblastmi obrácené repetice (ITR) AAV a plazmidu nesoucího geny enkapsidace (geny rep a cap) AAV. Rekombinantní produkty AAV jsou pak purifikovány klasickými technikami.
Co se týče virů Herpes a retrovirů, konstrukce rekombinantních vektorů byla široce popsána v literatuře: viz zejména Breakfield et al., New Biologist 3 (1991) 203, EP
453242, EP 178220, Bernstein et al., Genet. Eng. 7 (1985)
235, McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689, atd. Zejména retroviry jsou integrované viry selektivně infikující buňky ve fázi dělení. Tvoří tak vektory zájmu pro rakovinové aplikace. Genom retrovirů zahrnuje zejména dvě LTR, sekvenci enkapsidace a tři kódované oblasti (gag, pol a env). V rekombinantních vektorech odvozených od retrovirů, geny gag, pol a env jsou všeobecně deletovány zčásti nebo úplně a nahrazeny heterologní sekvencí nukleové kyseliny zájmu. Tyto vektory mohou být vytvořeny od různých typů retrovirů takových, jako jsou zejména MoMuLv (murine moloney leukemia virus, ještě nazvané MoMLV) , MSV (murine moloney sarcoma • ·
virus), HaSV (harvey sarcoma virus), SNV (spleen necrosis virus) RSV (rouš sarcoma virus) nebo také Friendův virus.
Pro vytvořeni rekombinantních retrovirů obsahujících sekvenci zájmu je všeobecně konstruován plazmid obsahující zejména LTR, sekvenci enkapsidace a uvedenou sekvenci zájmu, potom použit pro transfekci buněčné linie enkapsidace schopné přenést retrovirální vadné funkce do plazmidu. Všeobecně linie enkapsidace jsou tak schopné exprimovat geny gag, pol a env. Takovéto linie enkapsidace byly popsány ve vedlejších oborech, zejména linie PA317 (US 4,861,719), linie PsiCRIP (WO 90/02806) a linie GP+envAm-12 (WO 89/07150). Jinak rekombinantni retroviry mohou zahrnovat modifikace na úrovni
LTR za účelem zrušení transkripční aktivity stejně jako rozsáhlou sekvenci enkapsidace obsahující část genu gag (Bender et al., J. Virol. retrovirální produkty jsou technikami.
(1987) 1639). Rekombinantni pak purifikovány klasickými
Ve vektorech vynálezu která má sekvence kódující vlastnosti vlastnostem antagonistické
Mdm.2 je umístěn pod svou expresi v tumorálních sloučeninu, onkogenním kontrolou signálů buňkách. Přednostně vůči umožňuj ících se jedná o signály heterologní exprese, tudíž o různé signály přirozeně odpovědné za expresi inhibitoru. Může se jednat zejména o sekvence odpovědné za expresi jiných proteinů nebo syntetické sekvence. Zejména se může jednat o sekvence promotoru eukaryontních genů nebo virových.genů. Například se jedná o sekvence promotoru pocházející z genomu buňky, která se požaduje infikovat. Stejně se může jednat o sekvence promotoru vzniklého z genomu viru, tam obsahuje použitý virus. V tomto ohledu se mohou citovat například promotory E1A, MLP, CMV, LTR-RSV atd. Mimoto tyto sekvence exprese mohou být modifikovány adicí aktivačních sekvencí, sekvencí regulačních nebo sekvencí umožňujících expresi tkáňově specifickou. Může být zajímavé použití zejména signálů «· · · ···· · · · · ··«« · · · · · · · • · · · · · · '· · ♦ ··· << · · · · * ·« ···· ·· ·· ·· ·· exprese specificky aktivních nebo většinově aktivních v tumorálnich buňkách tak, aby sekvence DNA byla nejen exprimovaná, ale i produkovala svým účinkem virus, který efektivně infikoval tumorální buňku.
Ve způsobu realizace se vynález týká rekombinantiho defektního viru obsahujícího sekvenci cDNA kódující sloučeninu mající antagonistické vlastnosti na onkogenni charakter Mdm2 pod řízením virového promotoru, vybraného s výhodou mezi LTR-RSV a promotorem CMV.
Vždy v upřednostňovaném způsobu vynález se týká defektního rekombinantniho viru obsahujícího sekvenci DNA kódující sloučeninu, která má antagonistické vlastnosti na onkogenni charakter Mdm2 pod řízením promotoru, který umožňje většinovou expresi v tumorálnich buňkách.
Exprese je považována jako většinová ve smyslu vynálezu i v tom případě, kdyby zbytková exprese byla pozorována v jiných buněčných typech, úrovně exprese jsou vyšší v tumorálnich buňkách.
Předložený vynález se týká zejména nukleové sekvence kódující intracelulární protilátky nebo také scFV řízené proti oblasti 1-134 sekvence proteinu Mdm2 vyjádřené sekvencí SEQ ID N°1 pro přípravu farmaceutické kompozice určené všeobecně k léčení rakoviny.
Týká se také každé farmaceutické kompozice obsahující sloučeninu schopnou inhibovat onkogenni aktivitu proteinu Mdm2 nebo sekvenci nukleových kyselin kódujících takovouto sloučeninu. Podle způsobu realizace vynálezu tato kompozice zahrnuje jeden nebo více rekombinantních defektních virů takových, jaké byly dříve popsány. Tyto farmaceutické kompozice mohou být sestaveny z pohledu způsobu podávání: topikálně, orálně, parenterálně, intranasálně, intravenózně, intramuskulárně, podkožně, intraokulárně, intradermálně atd. Farmaceutické kompozice vynálezu přednostně obsahují farmaceutické vehikulum vhodné pro injikovatelnou formulaci, především pro injikování přímo do tumoru pacienta. Může se jednat zejména o sterilní roztoky, izotonické roztoky nebo kompozice suché, zejména lyofilizované, které přidáním podle okolnosti sterilované vody nebo fyziologického séra umožňují konstituci injikovatelných roztoků. Injekce přímo do tumoru pacienta je výhodná, protože umožní soustředit terapeutický účinek přímo na úrovni postižené tkáně.
Dávky použitých rekombinatních defektních virů pro injikaci mohou být přizpůsobeny vzhledem k různým parametrům, zejména vzhledem k virovým vektorům, ke způsobu použitého podávání, k určité patologii nebo také délky zkoumaného ošetření. Všeobecně jsou rekombinantní adenoviry podle vynálezu formulovány a podávány ve formě dávek obsahující mezi 104 a 1014 pfu/ml, výhodněji 106 až 1O10 pfu/ml. Termín pfu (plaque forming unit) odpovídá infekční schopnosti roztoku virů a je určen infekcí vhodné buněčné kultury a počtem plaků infikovaných buněk po 48 hodinách. Techniky určení titru virového roztoku jsou dobře popsány v literatuře. Co se týče retrovirů, kompozice podle vynálezu mohou obsahovat přímo produkované buňky z pohledu jejich implantace.
Farmaceutické kompozice podle vynálezu jsou zejména výhodné pro neutralizaci onkogenní aktivity proteinů Mdm2 a proto pro modulování proliferace určitých buněčných typů.
Zejména tyto kompozice jsou přijatelné pro léčení rakovin souvisejících s p53 nul jako například následující rakoviny: adenokarcinomů tračníku, rakoviny štítné žlázy, karcinomy plic, rakoviny prsu, rakoviny plic, rakoviny žaludku, rakoviny jícnu, lymphomy B, rakoviny ovarií, rakoviny močového měchýře, glioblastomy atd.
Předložený vynález je výhodně použit in vivo pro destrukci hyperproliferativních buněk (v proliferaci ·· ·· · t ··«· · · · · · · · ·· · · * * · ·· · · · ♦ · * · • · · · · · ····** · • · « · · · · * · · «· ·· ·· ·» nenormální). Je tak aplikovatelný pro destrukci tumorálních buněk nebo buněk hladkého svalstva vaskulárni stěny (restenóza).
Následující obrázky a příklady blíže ilustruji vynález, aniž by však v jakémkoliv směru omezovaly jeho rozsah.
• · • ·
Seznam obrázků
Obrázek 1: Znázorněni proteinů Mdm2 A až F
Obrázek 2: Graf transfekce buněk Saos-2 s plazmidy exprimujícími různé proteiny Mdm-2
Obrázek 3: Schematické znázornění inhibice transformačních vlastností Mdm2 různými p53
Obrázek 4: Účinek silné exprese Mdm2 na buněčný cyklus
Obrázek 5: Účinek silné exprese Mdm2 na buněčný cyklus
Všeobecné techniky molekulární biologie
Metody klasicky používané v molekulární biologii jako je preparativní extrakce plazmidové DNA, odstřeďování plazmidové DNA v gradientu cloridu cesnatého, elektroforéza na agarosovém nebo akrylamidovém gelu, purifikace fragmentů DNA elektroelucí, extrakce proteinů fenolem nebo směsí fenolu a chloroformu, srážení DNA v prostředí šalinu ethanolem nebo isopropanolem, transformace v Escherichia coli atd. jsou odborníky dobře známé metody a jsou obsáhle popsané v odborné literatuře (Maniatis T. et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982, Ausubel F.M. et al. (eds.), Čurrent Protocols in Molecular Biology', John Wiley & Sons, New York, 1987) .
Za účelem vytvoření vazeb fragmenty DNA mohou být separovány podle jejich velikosti elektroforézou na agarosovém gelu nebo akrylamidovém gelu, extrahovány fenolem nebo směsí fenolu a chloroformu, sráženy ethanolem, potom inkubovány v přítomnosti DNA-ligasy fágu T4 (Biolabs) podle doporučení dodavatele.
Doplňováni vyčnívajících 5'konců může být provedeno • · · · • ·
Klenowovým fragmentem DNA Polymerasy I Escherichia coli (Biolabs) podle doporučení dodavatele. Destrukce vyčnívajících 3'konců se provádí v přítomnosti DNA Polymerasy I fágu T4 (Biolabs) použité podle doporučení výrobce. Destrukce vyčnívajícího 5'konce se provádí působením nukleasy S1.
Mutagenese in vitro usměrňovaná syntetickými oligonukleotidy může být provedena podle metody vyvinuté Taylorem a kol. (Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764) za použití soupravy distribuované Amersham.
Enzymová amplifikace fragmentů DNA technikou řečenou PCR (Polymerase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R. K. et al., Science 230 (1985) 1350-1354, Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350) může být provedena za použití DNA thermal cycler (Parkin Elmer Cetus) podle doporučení výrobce. Amplifikace genomické DNA se provádí zejména za následujících podmínek: 5 minut při teplotě 100°C, 30 jednominutových cyklů při teplotě 95°C, 2 minuty při teplotě 58°C, potom 3 minuty při teplotě 72°C prostřednictvím vhodných sond. Produkty amplifikace se analyzují elektroforézou na gelu.
Ověření nukleotidových sekvencí může být provedeno metodou podle Sangera a kol. (Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467) za použití soupravy distribuované Amersham.
Materiál a metody
1. Použité konstrukce plazmid pBKCMV je uvedený na trh Stratagenem a obsahuje gen rezistentní k neomycinu
- plazmidy pC53ClN3 a p53-4.2.N3 kódující divoký p53 a p53 R273H pocházejí od A. Levine (Hinds et al., Cell Growth • » · · • · · · · and Diff. (1990), 1, 571).
- plazmid pBKp53(R273H) obsahuje lidský minigen p53. Je získán od pD53-4.2.N3.
plazmid pBKMdm2 byl získán klonováním v pBKCMV kazety, kódování spočívající v nevyjádřené oblasti konce sekvence kódující souvislý β-globin sekvence kódující mdm2 .
plazmid pGKhygro exprimuje gen resistentní k hydromycinu (Nátuře (1990) 348, 649-651).
plazmid pCMVNeoBam umožňující expresi genu rezistentního k neomycinu (Hinds et al. (1990) Cell. Growth and Diff., 1, 571-580).
plazmidy pCMVplO7 a pCMVCD20 umožňující expresi proteinu pl07 a označení povrchu CD20 (Zhu et al. (1993) Genes and Development, 7, 1111-1125).
- plazmidy pCMVE2F-4 a pCMVE2F-5 umožňující expresi proteinů E2F-4 a E2F-5 (Sardet et al. (1995) Proč. Nati. Acad. Sc., 92, 2403-2407) .
- plazmidy pLexA, pLexA(6-41), pLexA(16-25) umožňující expresi DNA vazebné oblasti LexA (aa 1 až 87) volné nebo fixované s p53(6-41) nebo p53(16-25). pLexA(6-41) a pLexA(16-25) byly získány od plazmidu pLexApolylI vytvořeného LGME (Strasbourg).
- plazmidy eukariontní exprese pl07: (pl07(385-1068), pl07(l-781) a pl07(781-1068) (Zhu et al., EMBO J. 14 (1995) 1904) .
- plazmid pSGKlHAplO7 umožňuje expresi in vitro a in vivo pl07. pl07 je v souvislosti se sekvencí Kozák a epitop HA je exprimován ve fúzi k C-konci pl07.
- plazmidy pBC-MDM2 a pBC-MDM2(1-134) byly získány klonováním MDM2 a MDM2( 1-134) v pBC (Chatton et al., ·· ·· ·· ···· · * ·· • · · · · · · ···« • · · ·· · ·· ···>· « ··· · · · * · * · «ι · «··· ·· e* ·· ♦ ·
Biotechniques 18 (1995) 142).
- plazmidy pGex-MDM2 a pGex-MDM2(1-177) byly získány klonováním MDM2 a MDM2(1-177) v pGex.
2. Metoda:
Exprese p53 je určena Westernem Blottingem na buněčném extraktu pomocí monoklonálních protilátek D01.
Exprese mRNA kódující protein Mdm2 je určena semikvantitativní RT-PCR. Nepřítomnost kontaminace DNA je ověřena PCR.
Příklad 1: Prokázání transformovaných vlastností mdm2
Buňky Saos-2 jsou transfektovány bud’ plazmidem pBKMDM2, srovnávacím plazmidem pBKp53 (R273H) nebo srovnávacím plazmidem p53 negativním pBKCMV, potom vybrány na základě rezistence ke Geneticinu 418(G418).
V prvním pokuse, byly vybrány klony individuelně a rozmnoženy tak, že ve druhém pokuse neizolované klony byly umístěny do kultivační agarové půdy soft.
104 buněk bylo naočkováno dvojmo do 0,375% soft agaru.
Po 24 hodinách se určil celkový počet kolonií s více než 50 buňkami a stejně i počet buněk každé kolonie (velikost kolonií). Každá udaná hodnota odpovídá průměru čtyř dvojmo provedených pokusů. Získané výsledky jsou uvedeny v Tabulce
I. Klony v pokusu n°l odpovídající mdm2 jsou identifikovány jako Ml až M6, klony proteinu p53 (R273H) jako p53-l až p53-6 a klony kontrolní jako Col až Co5.
Jak bylo očekáváno Col a Co4 neexprimují transfektovaný mdm2 a Col-3 neexprimují protein p53.
• ·
Tabulka I:
růst na kultivačním médiu agar soft, kolonie (velikost) exprese
MDM2 P53
pokus 1 (izolované klony) MDM2 Ml 634 (100-600) + ND
M2 594 (100-600) ++ ND
M3 460 (100-600) + ND
M4 310 (50-500) ++ ND
M5 57 (50-200) + /- ND
M6 23 (50) + ND
kontrola Col 97 (50-200) - -
Co2 68 (50-200) ND -
Co3 35 (50-100) ND -
Co4 11 (50) - ND
Co5 4 (50) ND ND
p53R (273)H p53-l 190 (50-600) ND +++
p53-2 137 (50-300) ND +++ +
p53-3 88 (50-200) ND +++
p53-4 53 (50-200) ND +++
p53-5 47 (50-200) ND ++
p53-6 38 (50-100) ND +
pokus 2 MDM2 M-Pl 395 (100-1000) ++ ND
kontrola Co-Pl 21 (50-200) ND ND
Co-P2 18 (50-200) ND ND
< · • · · ·
Tabulka I-pokračování:
růst na kultivačním médiu agar soft, kolonie (velikost) exprese
MDM2 P53
pokus 3 MDM2 M-Pl 255 (50-300) ND ND
M-P2 220 (50-300) ND ND
kontrola Co-Pl 110 (50-200) ND ND
CO-P2 110 (50-200) ND ND
Co-P3 100 (50-100) ND ND
CO-P4 75 (50-100) ND ND
Příklad 2: Oblast N-konce Mdm2 (1-134) sekvence ID N°1 je nezbytná a dostatečná pro stimulaci růstu buněk Saos-2 na agaru soft.
Buňky Saos-2 jsou transfektovány bud’ s plazmidy pBKCV, které vyjadřují zároveň rezistenci neo a proteiny mdm-2 A až F popsané na Obrázku 1, anebo se srovnávacím plazmidem pBKCMV, potom vybrány na základě rezistence k G418. Zbylé buňky jsou shromážděny, amplifikovány a testovány pro tvorbu kolonii na agaru soft. Výsledky na Obrázku 2 jsou vyjádřeny počtem vytvořených kolonii na agaru soft vztažených k počtu mdm-2 (A). Tyto výsledky pocházejí ze dvou reprezentativních nezávislých pokusů transfekce, ve kterých mezi 3 a 7 jamkou byly testovány různé buňky, podle konstrukce. Jasně se ukázálo, že oblast N-konce mdm-2 má onkogenní vlastnosti. Nejúčinnější konstrukce odpovídá úplnému proteinu.
Pokus 3: Reverze onkogenních vlastností Mdm-2 divokým proteinem p53, mutantů proteinu p53 a fragmentů proteinu p53.
je
Část buněk
Saos-2 transformovaných
Mdm-2
I» · kotransfektována s plazmidem pGKhygro a nebo pC53ClN3 (p53) pC53-4.2N3 p53(R(273)H, p53 (1-52), pLexA(6-41), pLexA(16-25), pLexA, p53(L14Q,F19S), p53(L22Q,W23S), nebo pCMVNeoBam, potom vybrána na základě rezistence k hydromycinu v přítomnosti G418. 10 0000 buněk pocházejících z 3 až 5 jamek nezávislých rezistentních buněk jsou zaočkovány dvojmo na agar soft (0,375%). Po 25 dnech kultivace byly sečteny kolonie, které obsahují alespoň 50 buněk. Obrázek 3 ukazuje výsledky reprezentativního pokusu a schematicky vyjadřuje různé testované p53 pro inhibici transformačních vlastností Mdm-2. Z tohoto pokusu vyplývá, že samotné konstrukce umožňují expresi proteinů schopných se vázat s proteinem mdm-2 případně s p53, p53 R273H, p53(l-52), LexA(6-41), LexA(16-25) inhibují onkogenní vlastnosti Mdm-2. Naproti tomu dvojnásobní mutanti, kteří jsou uvedeni, kteří ztratili svou schopnost vázat mdm-2 (Lin et al., Gene Dev., 1994, 8, 1235-1246) nemají účinek inhibitoru. Skutečnost, že mutant p53(14-19), který má zachované transaktivační vlastnosti divokého proteinu p53 neinhibuje transformaci proteinem Mdm-2 potvrzuje, že onkogenní vlastnosti proteinu Mdm-2 jsou nezávislé na inhibici transaktivačních vlastností proteinu p53 proteinem Mdm-2.
Příklad 4: Mdm-2 inhibuje blokaci G1 buněčného cyklu indukovaného pl07 v buňkách Saos-2
Buňky Saos-2 jsou kotransfektovány se třemi typy plazmidů, (i) plazmidem pro expresi CD-20 (pCDVCD20, 2 gg, kódující značení povrchu buňky CD-20), (ii) plazmidrm (9 pg) exprese typu CMV (promotor cytomegaloviru) bez kódované sekvence nebo kódujícím Mdm-2 (PBKCMVMdm2) , oblast 1-134 Mdm-2 (PBKCMVdm2(1-134), E2F-4 nebo E2F-5 (pCMVE2F-4, pCMVE2F-5) a (iii) vektorem exprese pl07 (pCMVplO7, 9 gg) . Buňky jsou pak zpracovány pro analýzu FACScan, jak popsal Zhu et al., Gene Dev., 1993, 7, 1111-1125). Výsledky
reprezentativního pokusu jsou uvedeny na Obrázku 4. Je jasně ukázáno, že v nepřítomnosti silně exprimovaného pl07 exprese Mdm-2 nebo jeho oblasti 1-134 nemá vliv na buněčný cyklus. Naproti tomu exprese Mdm-2 a jeho oblasti 1-134 je schopná zrušit zastavení buněčného cyklu G1 indukovaného pl07. Tento příklad jasně ukazuje, že Mdm-2 není jen inhibitor transaktivační aktivitu proteinu p53, ale také pozitivní regulátor buněčného cyklu schopný inhibovat implikované faktory v řízení tohoto cyklu.
V podobném pokuse buňky Saos-2 byly kotransfektovány s 1 μg pl07(385-1068), 8 μg pCMVNéoBam, 1 μg pXJMDM2, 8 μg pXJ41 a 2 μg pCMVCD20. Výsledky reprezentativního pokusu jsou vyznačeny na Obrázku 5. Ukazují, že exprese MDM2 může ukončit blokaci G1 indukovanou pl07 a mutantem delece pl07(385-1068), který je schopný interagovat s MDM2.
Přiklad 5: MDM2 interaguje in vitro a in vivo s pl07
Tento příklad ukazuje fyzikální interakci mezi MDM2 a pl07 in vitro a in vivo. Tyto výsledky jsou korelovány s aktivitou MDM2 na úrovni buněčného cyklu (přiklad 4).
5.1. In vitro pl07 značený S35 in vitro je uveden v kontakt s proteinem GST-MDM2 (vektor pGex-MDM2) nebo GST-MDM2(1-177) (vektor pGex-MDM2(1-177)), které jsou imobilizovany na kuličkách glutathion sepharosy. P107 vázaný k MDM2 je potom detekován na polyakrylamidovém gelu autoradiograficky. Získané výsledky jsou uvedeny v Tabulce II.
5.2. In vivo
Buňky Cos jsou kotransfektovány s plazmidem pBC-MDM2 nebo pBC-MDM2(1-134), které exprimuji proteinovou fúzi
GTS-MDM2 nebo GST-MDM2(1-134) s plazmidem exprese pl07 nebo *
• · · 4» mutantem pl07. Komplexy proteinů GST-MDM2-plO7 pocházející z buněčných extraktů jsou izolovány na kuličkách glutathion sepharosy a proteiny pl07 jsou detekovány pomocí Western blot s polyklonální protilátkou anti-pl07 (santa Cruz plO7-C18). Získané výsledky jsou uvedeny v Tabulce II.
Tabulka II:
pl07 pl07 (385-1068) pl07(1-781) pl07 (385-1068)
In Vivo
GST-MDM2 + + + +
GST-MDM2(1-134) + nd nd nd
In Vitro
GST-MDM2 + nd nd nd
GST-MDM2(1-177) + nd nd nd
Výsledky ukazují přítomnost interakce protein-protein mezi MDM2 a pl07 in vitro, ale i v buňce. Oblast MDM2 nezbytná pro buněčnou transformaci (1-134) je oblast, která interaguje s pl07. Tato oblast byla lokalizována, jak bylo nalezeno, zejména v části kapsové oblasti, oblasti A a oblasti mezernik.
• · · · • · ♦
• ·
Seznam sekvenci (1) Všeobecné informace:
(i) podavatel:
(A) Jméno: RHONE-POULENC RORER S.A.
(B) Ulice: 20, Raymond ARON
(C) Město: ANTONY
(E) Země: Francie
(F) Směrovací číslo: 92165
(G) Telefon: 40.91.69.22
(H) Fax: ( 1) 40.91.72.96
(íí: ) podavatel:
(A) Jméno: : INSTITUT DE LA SANTE ET
RECHERCHE MEDICALE (INSERM) (B) Ulice: 101, Rue de Tolbiac (C) Město: Paříž Cedex 13 (E) Země: Francie (F) Směrovací číslo: 75654 (G) Telefon: 44.23.60.61.
(H) Fax: 45.85.68.56.
(ii) název vynálezu: Antagonisti onkogení aktivity proteinu MDM2 a jejich použití v léčení rakovin (iii) počet sekvencí: 2 (iv) způsob luštění počítačem:
(A) Typ nosiče: tápe (B) počítač: IBM PC kompatibilní • a • · · a ♦ a * · a a a a a · a » » a a a a aa aa·» a a a · a a a · · a ♦ • a · · · a · ♦ · · a a · · (C) systém využiti: PC-DOS/MS-DOS (D) logika: Patentln Relase #1.0, Version #1.30 (OEB) (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 1:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 1476 párů básí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetická: NE (iii) antimediátorová: NE (ix) charakteristika:
(A) jméno/CLE: CDS (B) umístění: 1...1476 (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 1:
ATG TGC AAT ACC AAC ATG TCT GTA CCT ACT GAT GGT GCT GTA 42
Met Cys Asn Thr Asn Met Ser Val Pro Thr Asp Gly Ala Val
1 5 10
ACC ACC TCA CAG ATT CCA GCT TCG GAA CAA GAG ACC CTG GTT 84
Thr Thr Ser Gin Ile Pro Al a Ser Glu Gin Glu Thr Leu Val
15 20 25
AGA CCA AAG CCA TTG CTT TTG AAG TTA TTA AAG TCT GTT GGT 126
Arg Pro Lys Pro Leu Leu Leu Lys Leu Leu Lys Ser Val Gly
30 35 40
GCA CAA AAA GAC ACT TAT ACT ATG AAA GAG GTT CTT TTT TAT 168
Ala Gin Lys Asp Thr Tyr Thr Met Lys Glu Val Leu Phe Tyr
45 50 55
CTT GGC TAG TAT ATT ATG ACT AAA CGA TTA TAT GAT GAG AAG 210
Leu Gly Gin Tyr Ile Met Thr Lys Arg Leu Tyr Asp Glu Lys
60 65 70
CAA CAA CAT ATT GTA TAT TGT TCA AAT GAT CTT CTA GGA GAT 252
Gin Gin His Ile Val Tyr Cys Ser Asn Asp Leu Leu Gly Asp
75 80
TTG TTT GGC GTG CCA AGC TTC TCT GTG AAA GAG CAC AGG AAA 294
Leu Phe Gly Val Pro Ser Phe Ser Val Lys Glu His Arg Lys
85 90 95
ATA TAT ACC ATG ATC TAC AGG AAC TTG GTA GTA GTC AAT CAG 336
Ile Tyr Thr Met Ile Tyr Arg Asn Leu Val Val Val Asn Gin
100 105 110
CAG GAA TCA TCG TAC TCA GGT ACA TCT GTG AGT GAG AAC AGG 378
Gin Glu Ser Ser Asp Ser Gly Thr Ser Val Ser Glu Asn Arg
115 120 125
TGT CAC CTT GAA GGT GGG AGT GAT CAA AAG GAC CTT CTA CAA 420
Cys His Leu Glu Gly Gly Ser Asp Gin Lys Asp Leu Val Gin
130 135 140
GAG CTT CAG GAA GAG AAA CCT TCA TCT TCA CAT TTG GTT TCT 462
Glu Leu Gin Glu Glu Lys Pro Ser Ser Ser His Leu Val Ser
145 150
AGA CCA TCT ACC TCA TCT AGA AGG AGA GCA ATT AGT GAT ACA 504
Arg Pro Ser Thr Ser Ser Arg Arg Arg Ala Ile Ser Glu Thr
155 160 165
GAA GAA AAT TCA GAT GAA TTA TCT GGT GAA CGA CAA AGA AAA 546
Glu Glu Asn Ser Asp Glu Leu Ser Gly Glu Arg Gin Arg Lys
170 175 180
CGC CAC AAA TCT GAT AGT ATT TCC CTT TCC TTT GAT GAA AGC 588
Arg His Lys Ser Asp Ser Ile Ser Leu Ser Phe Asp Glu Ser
185 190 195
CTG GCT CTG TGT GTA ATA AGG GAG ATA TGT TGT GAA AGA AGT 630
Leu Ala Leu Cys Val Ile Arg Glu Ile Cys Cys Glu Arg Ser
200 205 210
AGT AGC AGT GAA TCT ACA GGG ACG CCA TCG AAT CCG GAT CTT 672
Ser Ser Ser Glu Ser Thr Gly Thr Pro Ser Asn Pro Asp Leu
215 220
GAT GCT GGT GTA AGT GAA CAT TCA GGT GAT TGG TTG GAT CAG 714
Asp Ala Gly Val Ser Glu His Ser Gly Asp Trp Leu Asp Gin
225 230 235
GAT TCA GTT TCA GAT CAG TTT AGT GTA GAA CCC GAA GTT GAA 756
Asp Ser Val Ser Asp Gin Phe Ser Val Glu Phe Glu Val Glu
240 245 250
TCT CTC GAC TCA GAA GAT TAT AGC CTT AGT GAA GAA GGA CAA 798
Ser Leu Asp Ser G1U Asp Tyr Ser Leu Ser Glu Glu Gly Gin
255 260 265
GAA CTC CTA GAT GAA GAT GAT GAG GTA TAT CAA GTT ACT GTG 840
Glu Leu Ser Asp Glu Asp Asp Glu Val Tyr Gin Val Thr Val
270 275 280
TAT CAG GCA GGG GAG AGT GAT ACA GAT TCA TTT GAA GAA GAT 882
Tyr Gin Ala Gly Glu Ser Asp Thr Asp Ser Phe Glu Glu Asp
285 290
CCT GAA ATT TCC TTA GCT GAC TAT TGG AAA TGC ACT TCA TGC 924
Pro Glu Ile Ser Leu Ala Asp Tyr Trp Lys Cys Thr Ser Cys
295 300 305
AAT GAA ATG AAT CCC CCC CTT CCA TCA CAT TGC AAC AGA TGT 966
Asn Glu Met Asn Pro Pro Leu Pro Ser His Cys Asn Arg Cys
310 315 320
TGG GCC CTT CGT GAG AAT TGG CTT CCT GAA GAT AAA GGG AAA 1008
Trp Ala Leu Arg Glu Asn Trp Leu Pro Glu Asp Lys Gly Lys
325 330 335
GAT AAA GGG GAA ATC TCT GAG AAA GCC AAA CTG GAA AAC TCA 1050
Asp Lys Gly Glu Ile Ser Glu Lys Ala Lys Leu Glu Asn Ser
340 345 350
ACA CCA GCT GAA GAG GGC TTT GAT GTT CCT GAT TGT AAA AAA 1092
Thr Gin Ala Glu Glu Gly Phe Asp Val Pro Asp Cys Lys Lys
355 360
>
ACT ATA GTG AAT GAT TTC AGA GAG TCA TGT GTT GAG GAA AAT 1134
Thr Ile Val Asn Asp Ser Arg Glu Ser Cys Val Glu Glu Asn
365 370 375
GAT GAT AAA ATT ACA CAA GCT TCA CAA TCA CAA GAA AGT GAA 1176
Asp Asp Lys Ile Thr Gin Ala Ser Gin Ser Gin Glu Ser Glu
380 385 390
GAC TAT TCT CAG CCA TCA ACT TCT AGT AGC ATT ATT TAT AGC 1218
Asp Tyr Ser Gin Pro Ser Thr Ser Ser Ser Ile Ile Tyr Ser
395 400 405
AGC CAA GAA GAT GTG AAA GAG TTT GAA AGG GAA GAA ACC CAA 1260
Ser Gin Glu Asp Val Lys Glu Phe Glu Arg G1U G1U Thr Gin
410 415 420
GAC AAA GAA GAG AGT GTG GAA TCT AGT TTG CCC CTT AAT GTC 1302
Asp Lys Glu Glu Ser Val Glu Ser Ser Leu Pro Leu Asn Ala
425 430
ATT GAA CCT TGT GTG ATT TGT CAA GGT CGA CCT AAA AAT GGT 1344
Ile Glu Pro Cys Val Ile Cys Gin Gly Arg Pro Lys Asn Gly
435 440 445
TGC ATT GTC CAT GGC AAA ACA GGA CAT CTT ATG GCC TGC TGG 1386
Cys Ile Val His Gly Lys Thr Gly His Leu Met Ala Cys Phe
450 455 460
ACA TGT GCA AAG AAG CTA AAG AAA AGG AAT AAG CCC TGC CCA 1428
Thr Cys Ala Lys Lys Leu Lys Lys Arg Asn Lys Pro Cys Pro
465 470 475
GTA TGT AGA CAA CCA ATT CAA ATG ATT GTG CTA ACT TAT TTC 1470
Val Cys Arg Gin Pro Ile Gin Met Ile Val Leu Thr Tyr Phe
480 485 490
CCC TAG
Pro * (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 2:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 1182 párů bási
1476 • · • · · · • · ···· ·· typ: nukleotid počet vláken: jedno konfigurace: lineární typ molekuly: cDNA hypotetická: NE antimediátorová: NE charakteristika:
(A) jméno/CLE: CDS (B) umístění: 1...1182
(xi) popis sekvence: SEQ ID NO 2:
ATG GAG GAG CCG CAG TCA GAT CCT AGC GTC GAG CCC CCT CTG 42
Met Glu Glu Pro Gin Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu
1 5 10
AGT CAG GAA ACA TTT TCA GAC CTA TGG AAA CTA CTT CCT GAA 84
Ser Gin Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu
15 20 25
AAC AAC GTT CTG TCC CCC TTG CCG TCC CAA GCA ATG GAT GAT 126
Asn Asn Val Leu Ser Pro Leu Pro Ser Gin Ala Met Asp Asp
30 35 40
TTG ATG CTG TCC CCG GAC GAT ATT GAA CAA TGG TTC ACT GAA 168
Leu Met Leu Ser Pro Asp Asp Ile Glu Gin Trp Phe Thr Glu
45 50 55
GAC CCA GGT CCA GAT GAA GCT CCC AGA ATG CCA GAG GCT GCT 210
Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro Arg Met Pro Glu Ala Ala
60 65 70
CCC CCC GTG GCC CCT GCA CCA GCA GCT CCT ACA CCG GCG GCC 252
Pro Pro Val Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Thr Pro Ala Ala
• · • · * • ·
CCT GCA CCA GCC CCC TCC TGG CCC CTG CCA TCT TCT GTC CCT 294
Pro Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser Val Pro
85 90 95
TCC CAG AAA ACC TAC CAG GGC AGC TAC GGT TTC CGT CTG GGC 336
Ser Gin Lys Thr Tyr Gin Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly
100 105 110
TTC TTG CAT TCT GGG ACA GCC AAG TCT GTG ACT TGC ACG TAC 378
Phe Leu His Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys Thr Tyr
115 120 125
TCC CCT GCC CTC AAC AAG ATG TTT TGC CAA CTG GTC AAG ACC 420
Ser Pro Ala Leu Asn Lys Met Phe Cys Gin Leu Ala Lys Thr
130 135 140
TGC CCT GTG CAG CTG TGG GTT GAT TCC ACA CCC CCG CCC GGC 462
Cys Pro Val Gin Leu Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro Pro Gly
145 150
ACC CGC GTC CGC GCC ATG GCC ATG TAC AAG CAG TCA CAG CAC 504
Thr Arg Val Arg Ala Met Ala Ile Tyr Lys Gin Ser Gin His
155 160 165
ATG ACG GAG GTT GTG AGG CGC TGC CCC CAC CAT GAG CGC TGC 546
Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys Pro His His Glu Arg Cys
170 175 180
TCA GAT AGC GAT GGT CTG GCC CCT CCT CAG CAT CTT ATC CGA 588
Ser Asp Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gin His Leu Ile Arg
185 190 195
GTG GAA GGA AAT TTG CGT GTG GAG TAT TTG GAT GAC AGA AAC 630
Val Glu Gly Asn Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp Arg Asn
200 205 210
ACT TTT CGA CAT AGT GTG GTG GTG CCC TAT GAT CCG CCT GAG 672
Thr Phe Arg His Ser Val Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu
215 220
GTT GGC TCT GAC TGT ACC ACC ATC CAC TAC AAT TAC ATG TGT 714
Val Gly Ser Asp Cys Thr Thr Ile His Tyr Asn Tyr Met Cys
225 230 235
AAC AGT TCC TGC ATG GGC GGC ATG AAC CGG AGG CCC ATC CTC 756
Asn Ser Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu
240 245 250
ACC ATC ATC ACA CTG GAA GAC TCC AGT GGT AAT CTA CTG GGA 798
Thr Ile Ile Thr Leu Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Gly
255 260 265
CGG AAC AGC TTT GAG GTG CGT GTT TGT GCC TGT CCT GGG AGA 840
Arg Asn Ser Phe Glu Val Arg Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg
270 275 280
GAC CGG CGC ACA GAG GAA GAG AAT CTC CGC AAG AAA GGG GAG 882
Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn Leu Arg Lys Lys Gly Glu
285 290
CCT CAC CAC GAG CTG CCC CCA GGG AGC ACT AAG CGA GCA CTG 924
Pro His His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr Lys Arg Ala Leu
295 300 305
CCC AAC AAC ACC AGC TCC TCC CCC CAG CCA AAG AAG AAA CCA 966
Pro Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gin Pro Lys Lys Lys Pro
310 315 320
CTG GAT GGA GAA TAT TTC ACC CTT GAG ATC CGT GGG CGT GAG 1088
Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gin Ile Arg Gly Arg Glu
325 330 335
CGC TTC GAG ATG TTC CGA GAG CTG AAT GAG GCC TTG GAA CTC 1050
Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu
340 345 350
AAG GAT GCC CAG GCT GGG AAG GAG CCA GGG GGG AGC AGG GCT 1092
Lys Asp Ala Gin Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala
355 360
CAC TCC AGC CAC CTG AAG TCC AAA AAG GGT CAG TCT ACC TCC 1134
His Ser Ser His Leu Lys Ser Lys Lys Gly Gin Ser Thr Ser
365 370 375
CGC CAT AAA AAA CTC ATG TTC AAG ACA GAA GGG CCT GAC TCA 1176
Arg His Lys Lys Leu Met Phe Lys Thr Glu Gly Pro Asp Ser
380 385 390
GAC TGA

Claims (24)

1. Použití sloučeniny schopné antagonizovat alespoň částečně onkogenni aktivitu proteinu Mdm2 pro přípravu farmaceutické kompozice určené k léčeni rakovin v souvislosti s p53 nul.
2. Použití podle nároku 1 sloučeniny schopné se vázat na úroveni domény 1-134 sekvence proteinu Mdm2 vyjádřené SEQ ID N°l.
3. Použití podle jednoho z nároků 1 nebo 2 vyznačené t i m, že sloučenina je scFV řízená proti doméně
1-134 výše uvedeného proteinu Mdm2.
4. Použití podle jednoho z nároků 1 nebo 2 vyznačené t i m, že sloučenina je vyjádřena částečně nebo úplně peptidy 1-52, 1-41, 6-41, 16-25, 18-23 sekvence vyjádřené SEQ ID N°2 nebo jejich deriváty.
5. Použití podle nároku 1 sloučeniny schopné se vázat k doméně sousední doméně 1-134 vyjádřené SEQ ID N°1 proteinu Mdm2 a určující část tohoto spojení onkogenni aktivitu výše uvedeného proteinu.
6. Použiti podle nároku 1 nebo 5 vyznačené tím, že sloučenina interaguje s oblastí C-konce proteinu Mdm2.
7. Použití podle nároků 1,5 nebo 6 vyznačené tím, že se jedná o transkripční faktor vybraný mezi TFII, • · · ·
TBP a TAF250.
8. Použití podle nároku 1 nebo 5 vyznačené tím, že sloučenina interaguje s oblastí 135-491 proteinu Mdm2.
9. Použití podle nároku 1,5 nebo 8 vyznačené tím, že se jedná částečně nebo úplně o protein vybraný mezi proteiny Rb, L5 a transkripčním faktorem E2F.
10. Použití scFV řízeného proti oblasti 1-134 proteinu
Mdm2 pro přípravu farmaceutické kompozice určené k léčení rakovin.
11. Použití nukleové kyseliny kódující sloučeninu
schopnou antagonizovat onkogenní aktivitu proteinu Mdm2 pro přípravu farmaceutické kompozice určené k léčení rakovin v souvislosti s p53 nul. 12. Použití podle nároku 11 v y z n ačené tím, že se jedná o: - antimediátorové nukleové kyseliny
- oligonukleotidové ligandy schopné se fixovat přímo k oblasti proteinu Mdm2 a inhibovat jeho onkogenní aktivitu nukleové kyseliny kódující částečně nebo úplně peptidy nebo proteiny schopné oligomerizovat s jednou z oblastí Mdm2 a inhibovat jeho onkogenní aktivitu
- nukleové kyseliny kódující intracelulární protilátky řízené proti oblasti 1-134 sekvence proteinu Mdm2 vyjádřené • · • · · · • ·
SEQ ID N°l.
13. Použití podle nároku 12 vyznačené tím, že antimediátorová nukleová kyselina je DNA kódující komplementární RNA nukleové kyseliny kódující protein Mdm2 a je schopná blokovat jeho transkripci nebo/a jeho translaci (antimediátorová RNA) nebo ribozym.
14. Použití podle jednoho z nároků 11 až 13 vyznačené t i m, že nukleová kyselina je použita ve formě komplexu s DEAE-dextranem, s nukleárními proteiny nebo s lipidy nebo s kationickými polymery ve formě lipozomů nebo jako taková.
15. Použití podle jednoho z nároků 11 až 13 vyzna čené t i m, že nukleová kyselina tvoří část vektoru.
16. Použití podle nároku 15 vyznačené tím, že nukleová kyselina tvoří část virového vektoru vybraného mezi adenoviry, retroviry a viry AAV.
17. Virový vektor obsahující sekvenci nukleové kyseliny kódující sloučeninu schopnou inhibovat alespoň částečně onkogenní aktivitu proteinu Mdm2.
18. Virový vektor podle nároku 17 vyznačený tím, že sekvence nukleové kyseliny kóduje csFv nebo peptid schopný interagovat na úrovni domény 1-134 (SEQ ID N°l) proteinu Mdm2.
• · • · · · • ·
19. Virový vektor podle nároku 17 nebo 18 vyznačený t i m, že je vybrán mezi adenoviry, retroviry a viry AAV.
20. Virový vektor podle nároků 17 až 19 vyznače ný t i m, že se jedná o adenovirus nebo retrovirus.
21. Farmaceutická kompozice obsahující sloučeninu schopnou inhibovat onkogenni aktivitu proteinu Mdm2 takovou, jak je definováno v nárocích 1 až 11.
22. Farmaceutická kompozice obsahující sekvenci nukleových kyselin kódující sloučeninu schopnou inhibovat onkogenni aktivitu proteinu Mdm2 tak, jak je definováno v nároku 12 nebo 13.
23. Farmaceutická kompozice podle nároku 22 vyznačená t i m, že obsahuje alespoň virový vektor podle jednoho z nároků 14 až 20.
24. Kompozice podle nároku 23 vytvořená za účelem intratumorálního podávání.
25. Použití nukleové sekvence kódující intracelulární protilátky řízené proti doméně 1-134 (SEQ ID N°l) proteinu Mdm2 pro přípravu farmaceutické kompozice určené k léčení rakoviny.
CZ0063098A 1995-09-04 1996-09-02 Použití slouceniny schopné alespon cástecne inhibovat onkogenní aktivitu, virální vektor obsahujícísekvenci nukleové kyseliny kódující tuto slouceninu a farmaceutická kompozice obsahující tuto slouceninu CZ298806B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9510331A FR2738151B1 (fr) 1995-09-04 1995-09-04 Antagonistes de l'activite oncogenique de la proteine mdm2, et leur utilisation dans le traitement des cancers

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ63098A3 true CZ63098A3 (cs) 1998-06-17
CZ298806B6 CZ298806B6 (cs) 2008-02-06

Family

ID=9482234

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ0063098A CZ298806B6 (cs) 1995-09-04 1996-09-02 Použití slouceniny schopné alespon cástecne inhibovat onkogenní aktivitu, virální vektor obsahujícísekvenci nukleové kyseliny kódující tuto slouceninu a farmaceutická kompozice obsahující tuto slouceninu

Country Status (20)

Country Link
US (4) US20030060432A1 (cs)
EP (1) EP0848720B1 (cs)
JP (2) JPH11511980A (cs)
KR (1) KR100592916B1 (cs)
AT (1) ATE257711T1 (cs)
AU (1) AU722782B2 (cs)
BR (1) BR9610386A (cs)
CA (1) CA2228667C (cs)
CZ (1) CZ298806B6 (cs)
DE (1) DE69631335T2 (cs)
DK (1) DK0848720T3 (cs)
ES (1) ES2210386T3 (cs)
FR (1) FR2738151B1 (cs)
HU (1) HU223597B1 (cs)
IL (1) IL123514A (cs)
NO (1) NO319160B1 (cs)
PT (1) PT848720E (cs)
SK (1) SK287127B6 (cs)
WO (1) WO1997009343A2 (cs)
ZA (1) ZA967451B (cs)

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9620028D0 (en) * 1996-09-26 1996-11-13 Ludwig Inst Cancer Res Factors which interact with oncoproteins
US6013786A (en) * 1997-08-22 2000-01-11 Hybridon, Inc. MDM2-specific antisense oligonucleotides
US6238921B1 (en) * 1998-03-26 2001-05-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of human mdm2 expression
EP0947494A1 (en) * 1998-03-30 1999-10-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Derivatives of phenoxy acetic acid and phenoxymethyltetrazole having antitumor activity
GB9819860D0 (en) 1998-09-12 1998-11-04 Zeneca Ltd Chemical compounds
DE10109813A1 (de) * 2001-03-01 2002-09-12 Thomas Stanislawski Tumor-Peptidantigen aus humanem mdm2 Proto-Onkogen
PL2118123T3 (pl) * 2007-01-31 2016-06-30 Dana Farber Cancer Inst Inc Stabilizowane peptydy p53 i ich zastosowania
JP5631201B2 (ja) 2007-03-28 2014-11-26 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ ステッチングされたポリペプチド
US20090018078A1 (en) * 2007-07-09 2009-01-15 Vinod Labhasetwar Apoptosis-Modulating Protein Therapy for Proliferative Disorders and Nanoparticles Containing the Same
US20130149314A1 (en) 2010-02-09 2013-06-13 Jörn Bullerdiek p19Arf, HMGA2 and MDM2 For Use in the Diagnosis and Treatment of Aberrant Cell Growth
EP2550000A4 (en) 2010-03-24 2014-03-26 Advirna Inc RNAI COMPOUNDS OF REDUCED SIZE ADMINISTERING
KR102104762B1 (ko) 2010-08-13 2020-04-24 에일러론 테라퓨틱스 인코포레이티드 펩티도미메틱 거대고리
EP2768518A4 (en) 2011-10-18 2015-05-27 Aileron Therapeutics Inc PEPTIDOMIMETIC MACROCYCLES
CA2864120A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Aileron Therapeutics, Inc. Triazole-crosslinked and thioether-crosslinked peptidomimetic macrocycles
RU2642299C2 (ru) 2012-02-15 2018-01-24 Эйлерон Терапьютикс, Инк. P53 пептидомиметические макроциклы
BR112015009470A2 (pt) 2012-11-01 2019-12-17 Aileron Therapeutics Inc aminoácidos dissubstituídos e seus métodos de preparação e uso
CN106061488B (zh) 2013-12-02 2021-04-09 菲奥医药公司 癌症的免疫治疗
US11279934B2 (en) * 2014-04-28 2022-03-22 Phio Pharmaceuticals Corp. Methods for treating cancer using nucleic acids targeting MDM2 or MYCN
CN107106642B (zh) 2014-09-24 2021-02-26 艾瑞朗医疗公司 拟肽大环化合物及其制剂
EP3197478A4 (en) 2014-09-24 2018-05-30 Aileron Therapeutics, Inc. Peptidomimetic macrocycles and uses thereof
JP2018516844A (ja) 2015-03-20 2018-06-28 エルロン・セラピューティクス・インコーポレイテッドＡｉｌｅｒｏｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． ペプチド模倣大環状分子およびその使用
EP3347372A4 (en) 2015-09-10 2019-09-04 Aileron Therapeutics, Inc. PEPTIDOMIMETIC MACROCYCLES AS MODULATORS OF MCL-1
CN118436801A (zh) 2016-05-20 2024-08-06 豪夫迈·罗氏有限公司 Protac抗体缀合物及其使用方法
CN111491661B (zh) * 2017-07-27 2024-11-01 诺莫坎制药有限责任公司 M(h)dm2/4的抗体及其在诊断和治疗癌症中的用途
WO2020023502A1 (en) 2018-07-23 2020-01-30 Aileron Therapeutics, Inc. Peptidomimetic macrocycles and uses thereof
CA3127776A1 (en) * 2019-01-30 2020-08-06 Nomocan Pharmaceuticals Llc Antibodies to m(h)dm2/4 and their use in diagnosing and treating cancer
WO2023056069A1 (en) 2021-09-30 2023-04-06 Angiex, Inc. Degrader-antibody conjugates and methods of using same
WO2024240858A1 (en) 2023-05-23 2024-11-28 Valerio Therapeutics Protac molecules directed against dna damage repair system and uses thereof
CN120884603A (zh) * 2024-04-28 2025-11-04 上海雅义生物医药科技有限公司 一种抑制mdm2和mdm4基因扩增的三链形成寡核苷酸序列及其应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5411860A (en) * 1992-04-07 1995-05-02 The Johns Hopkins University Amplification of human MDM2 gene in human tumors
DE69333202T2 (de) * 1992-06-26 2004-03-18 The Trustees Of Princeton University Verfahren zur erkennung von krebszellen oder ihren vorstadien mittels p90 und p53-antikörper oder p90 und p53-sonden
FR2706486B1 (fr) * 1993-06-16 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Séquences nucléiques, vecteurs les contenant, compositions pharmaceutiques et utilisations thérapeutiques.
US5770377A (en) * 1994-07-20 1998-06-23 University Of Dundee Interruption of binding of MDM2 and P53 protein and therapeutic application thereof

Also Published As

Publication number Publication date
JP2011225571A (ja) 2011-11-10
WO1997009343A3 (fr) 1997-05-29
DE69631335D1 (de) 2004-02-19
FR2738151B1 (fr) 1997-09-26
AU722782B2 (en) 2000-08-10
EP0848720B1 (fr) 2004-01-14
CZ298806B6 (cs) 2008-02-06
HUP9900406A3 (en) 2002-04-29
IL123514A0 (en) 1998-10-30
HU223597B1 (hu) 2004-10-28
PT848720E (pt) 2004-05-31
WO1997009343A2 (fr) 1997-03-13
HUP9900406A2 (hu) 1999-05-28
SK287127B6 (sk) 2009-12-07
NO980905D0 (no) 1998-03-02
DE69631335T2 (de) 2004-12-02
AU6933496A (en) 1997-03-27
DK0848720T3 (da) 2004-04-19
ATE257711T1 (de) 2004-01-15
KR19990044356A (ko) 1999-06-25
US20040209834A1 (en) 2004-10-21
JPH11511980A (ja) 1999-10-19
SK28098A3 (en) 1998-08-05
MX9801407A (es) 1998-05-31
US20080311608A1 (en) 2008-12-18
NO980905L (no) 1998-03-02
BR9610386A (pt) 1999-10-13
FR2738151A1 (fr) 1997-03-07
US20030060432A1 (en) 2003-03-27
ES2210386T3 (es) 2004-07-01
ZA967451B (en) 1997-03-10
EP0848720A2 (fr) 1998-06-24
NO319160B1 (no) 2005-06-27
US20140030319A1 (en) 2014-01-30
CA2228667A1 (fr) 1997-03-13
KR100592916B1 (ko) 2006-11-07
IL123514A (en) 2006-10-31
CA2228667C (fr) 2013-06-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ298806B6 (cs) Použití slouceniny schopné alespon cástecne inhibovat onkogenní aktivitu, virální vektor obsahujícísekvenci nukleové kyseliny kódující tuto slouceninu a farmaceutická kompozice obsahující tuto slouceninu
CZ296185B6 (cs) Varianty proteinu p53 a jejich terapeutické pouzití
SK131197A3 (en) Conditional expression system
SK283989B6 (sk) Kombinovaný liekový prípravok na liečenie hyperproliferačných patologických stavov
HU226330B1 (en) Anti-p53 single-chain antibody fragments and their uses to produce pharmaceutical compositions
AU730324B2 (en) Use of protein gax for treating cancer
CZ291533B6 (cs) Deriváty proteinu p62, nukleové kyseliny kódující tyto deriváty a farmaceutické kompozice, které je obsahují
MXPA98001407A (en) Antagonists of the oncogenic activity of the mdm2 protein, and its use in the treatment of the cance
MXPA98002924A (en) Application of the gax protein for the treatment of the cance
MXPA97006928A (es) Sistema de expresion condicional
MXPA97008877A (en) P62, its variants, the nucleic acid sequences that code them, and its use in anti-cancer gene therapy

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20140902