CZ75798A3 - Promotor genu cdc25B, jeho příprava a použití - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález se týká promotoru genu cdc25B, způsobu nalezení promotorů cac25B a použití promotoru cdc25B pro přípravu léčiva.

Dosavadní stav techniky

Buněčné dělení probíhá v několika postupných fázích nazvaných G_o nebo Gi, S, G₂ a M. Fáze S (S fáze) je fáze syntézy DNA, je následována přechodnou fází G₂ (G₂ fáze), po které následuje mitotická fáze Μ (M fáze), ve které se mateřská buňka rozdělí na dvě dceřiné. Klidové fáze G_o (Go fáze) nebo přechodná fáze G₂ (G₂ fáze) leží mezi fázemi M a S.

Buněčné dělení je zprostředkováno skupinou proteinkináz, neboli komplexů cyklin/cdk. Komplexy obsahují katalytickou podjednotku, kinázu závislou na cyklinu (cdk, „cyclin dependent kinase, např. cdkl, cdk2, cdk3, cdk4, cdk5, cdk6, cdk7 nebo cdk8) a regulační podjednotku neboli cyklin (například cyklin A, cyklin B1-B3, cyklin D1-D3, cyklin E, cyklin H nebo cyklin C).

Různé komplexy cdk jsou zvláště aktivní v určité fázi buněčného cyklu, například komplexy cdk4/cyklin Dl-3 a cdk6/cyklin Dl-3 ve střední Gi fázi, komplex cdk2/cyklin E v pozdní Gi fázi, komplex cdk2/cyklin A v S fázi a komplex cdkl/cyklin Bl-3 a komplex cdkl/cyklin A v přechodné fázi G₂/M.

Aktivita komplexů cyklin/cdk zahrnuje fosforylaci a následnou aktivaci nebo inaktivaci proteinů, které se buď přímo nebo nepřímo účastní regulace syntézy DNA a mitózy.

V souladu se svou funkcí v buněčném cyklu jsou geny pro některé cykliny a cdk periodicky transkribovány a/nebo periodicky aktivovány či innibovány, například řízenou degradací cyklónů, a sice navázáním inhibitorů specifických pro určitou fázi buněčného cyklu (např. pl6^INK4A, pl5^INK4B, pel , p2 / , pl8 , pl9 a p57) nebo modifikaci aktivujícími (např. cdc25 fosfatázy nebo komplex cdk7/cyklin H) nebo inhibujícími (např. „wee 1 kináza) enzymy (přehled viz Zwicker a Muller, Progr. Cell Cycle

Res . , 1, 91, 1995, La

Thangue,

Curr.

443, 1994, MacLachlan et al.,

Crit. Rev. Eukaryotic Gene

Expr., 5, 127, 1995).

Vyšší eukaryotické organismy mají alespoň tři fosfatázy cdc25, jmenovitě cdc25A, cdc25B a cdc25C. cDNA genů pro fosfatázy již byla klonována a analyzována (Okazaki et al·.,

Gene, 178, 111, 1996, Galaktionow et al., Cell, 67, 1181,

1991). Všechny tři fosfatázy se v buněčném cyklu objevuji periodicky. Avšak aktivační funkce těchto fosfatáz cdc25 se zjevně liší (Jinno et al., EMBO J., 13, 1549, 1994, Honda et al. , FEBS Lett., 318, 331, 1993, Hoffmann et al. , EMBO J. ,

13, 4302, 1994) .

cdc25A je převážně exprimována v pozdní Gi fázi a konkrétně reguluje přechod z Gi fáze do S fáze (začátek buněčného cyklu) aktivací komplexů cdk/cyklin, sama je regulována Myc (transkripce) a Raf (aktivita). cdc25B defosforyluje tyrosiny (tyrosin 14 a tyrosin 15) v kapse cdkl vázající ATP, což vede k jejich aktivaci, nadto může být stimulována cyklinem B (1-3) nezávisle na cdkl a její exprese je deregulována a zesilována v buňkách infikovaných • · • ·

virem (SV40 nebo HPV) . cdc25C defosforyluje tyrosiny (tyrosin 14 a tyrosin 15) v kapse cdkl vázající ATP, což vede k jejich aktivaci, je exprimována zejména v G₂ fázi a reguluje vstup do M fáze.

Periodická exprese cdc25C v G₂ fázi buněčného cyklu je v podstatě regulována prvkem „CDE-CHR” v oblasti promotoru cdc25C, tento prvek je obsazen proteinovým represorem v Go/G₂ fázi a je volný v G₂ fázi. Zatímco nukleotidová sekvence tohoto promotorového prvku byla identifikována a podobně nalezena také v promotorech genů pro cyklin A a cdkl, v promotoru pro B-myb byla objevena nukleotidová sekvence „E2FBS-CHR, která se poněkud liší. Zkoumáni funkce závislé na buněčném cyklu těchto promotorových prvků ukázalo, že jejich zablokování v Gq/Gí fázi je následováno aktivaci transkripce příslušného genu, tato aktivace se uskutečňuje v případě genu B-myb obzvláště časně (ve střední G_x fázi), v případě cyklinu A v přechodné fázi Gi/S, v případě genu cdkl v S fázi a pouze v případě genu cdc25C v pozdní S fázi (Zwicker and Můller, Progress in Cell Cycle Res., 1, 91, 1995, Lucibello et al., EMBO J., 14, 132, 1995, Liu et al·., Nucl. Acids Res., 24, 2905, 1995, Zwicker et al., Nucl. Acids Res., 23, 3822, 1995, EMBO J., 14, 4514, 1995).

Kromě toho bylo zjištěno, že prvek CDE-CHR (z promotoru pro cyklin 25C, cyklin A a gen cdkl) a prvek E2FBS-CHR (z promotoru pro gen B-myb) nejsou schopné pouze inhibovat aktivaci a transkripci homologních genů v G₀/Gi fázi, ale jsou také schopné inhibovat aktivaci a transkripci dalších genů (viz například WO96/06943, DE19605274.2, DE19617851.7,

W096/06940, WO96/06938, WO96/06941 a WO96/06939).

Tyto patentové přihlášky vyjevují kombinaci promotoru závislého na buněčném cyklu s promotorem aktivovatelným nespecificky, buněčně specificky, virově specificky nebo metabolicky za účelem regulované aktivace transkripce efektorového genu, který kóduje protein pro profylaxi a/nebo léčbu nemoci. Takové nemoci mohou být například nádorové nemoci, záněty, leukemie, autoimunitni nemoci, artritidy, rejekce transplantovaných orgánů, nemoci oběhového systému nebo krevního koagulačního systému, nebo infekce či poškození centrálního nervového systému.

Takzvaný chimérický promotor je konkrétní příklad takové možnosti kombinace různých promotorů s promotorovým prvkem specifickým pro buněčný cyklus. V tomto chimérickém promotoru je aktivita aktivační (nebo promotorové) sekvence, která je aktivovatelná nespecificky, buněčně specificky, virově specificky nebo metabolicky, do velké míry omezena na S a G₂ fáze buněčného cyklu promotorovým prvkem CDE-CHR nebo E2FBS-CHR, který je k ní připojen bezprostředně po směru čtení („downstream).

Následný výzkum způsobu funkce promotorového prvku CDECHR konkrétně odhalil, že regulace závislá na buněčném cyklu prvkem CDE-CHR aktivátorové sekvence, lokalizované protisměrně („upstream), je do velké míry závislá na tom, zda aktivační sekvence je aktivována transkripčními faktory majícími aktivační domény bohaté na glutamin (Zwicker et al., Nucl. Acids Res., 23, 3822, 1995).

Příklady těchto transkripčních faktorů jsou Spi a NF-Y.

Toto následně omezuje použití promotorového prvku CDECHR pro chimérické promotory. Předpokládá se, že totéž platí pro promotorový prvek E2FBS-CHR genu B-myb (Zwicker et al., Nucl. Acids Res., 23, 3822, 1995).

• ·

• ·

Podstata vynálezu

Cílem předkládaného vynálezu je proto najít promotory a promotorové prvky specifické pro buněčný cyklus, jejichž represe specifická pro G_o a Gi je závislá na jiných okolnostech, než na těch, pro které je subjektem promotorový prvek CDE-CHR.

Když byla analyzována nukleotidová sekvence promotoru myšího genu cdc25B a nukleotidová sekvence 5' nekódující oblasti bezprostředně po směru čtení, včetně iniciační (nebo startovní) oblasti genu cdc25B (nukleotidová sekvence -950 až +167), bylo zjištěno, že funkční sekvence cdc25B obsahují dva boxy E, vazebná místa SP-1, jedno a box

TATA(specifická sekvence DNA obsahující motiv

TATA) .

Překvapivě nebylo možné nalézt žádné nukleotidová sekvence mající homologii s CDE-CHR

E2FBS-CHR. Proto tedy jsou funkční oblasti promotorové funkčních oblastí promotoru genu B-myb. Kromě toho je překvapujíc

1. _r ΖΘ až do současnosti nebyla žádná publikace o promotoru genu buněčného cyklu obsahujícím funkční box TATA.

Předkládaný vynález se proto týká promotoru genu cdc25B, jehož promotor obsahuje sekvenci, která za stringentních podmínek hybridizuje se sekvencí, je zobrazena v tabulce (sekvence s identifikačním číslem nebo její funkční částí, konkrétně s promotorem majícím sekvenci zobrazenou v tabulce 1 (sekvence s identifikačním

Celá klonovány nebo jeho sekvence funkční částí.

nebo fragmenty promotoru cdc25B byly do plazmidu v protisměru od luciferázového genu, a tyto plazmidy byly transfekovány do myších nebo lidských klidových a proliferujících fibroblastů a měřilo se množství exprimované luciferázy.

Bylo zjištěno, že (na rozdíl od situace v proliferujících buňkách) klonovaná sekvence cdc25B (promotorová a 5'-nekódujlei oblast, přibližně -950 až přibližně +167) vedla k silné supresi exprese luciferázového genu v klidových buňkách, a tato suprese byla postupně redukována tvořením delecí na 5' konci promotoru cdc25B (od přibližně -950 do přibližně +167 do přibližně -30 do přibližně +167).

Deleční fragmenty, které byly menší než přibližně -180 až přibližně +167 vedly k tomu, že promotorová aktivita byla redukována rovněž v proliferujícich buňkách.

Ve smyslu předkládaného vynálezu je proto nutné rozumět, že funkční části jsou zejména transkripčni faktory vázající místa uvedená detailně výše, obzvláště když zahrnují více než přibližně 50 % celého promotoru. Konkrétně se preferují funkční jedno vazebné místo části,

SP-1, a, případně, alespoň jeden které obsahují box TATA, alespoň jedno vazebné místo NFY, takže je možné dosáhnout alespoň box E, exprese efektorového genu závislé na buněčném cyklu. Tyto promotorové sekvence myšího genu cdc25B, zahrnují zejména ale zahrnují také promotorové sekvence lidského genu cdc25B.

Další výhodné části nového promotoru jsou podle tabulky

1 nukleotidy od	přibližně	-950	do	přibližně	+ 167,	od
přibližně -950	do	přibližně	+3,	od	přibližně	-930	do
přibližně +3,	od	přibližně	-720	do	přibližně	+3,	od
přibližně -340	do	přibližně	+3,	od	přibližně	-180	do
přibližně +3,	od	přibližně	-100	do	přibližně	+3,	od
přibližně -80 do	přibližně +3,	od přibli	žně -60 do	přibližně

• ·

+3, od přibližně -30 do přibližně +3, a také jejich části, které obsahují odpovídající funkční cis souladu s obr. 6, regulační prvky v

Předkládaný promotorů cdc25B zejména vynález tak, že delece 5' a/nebo se také týká označen, knihovny delece 3'.

způsobu nový promotor nebo jeho radioaktivně, a že se testují pomocí hybridizace je výhodně

DNA, výhodně ze savčích buněk, za stringentních podmínek.

Odborník nalezení část, je genomové s přípravou genomcvých knihoven DNA a hybridizací za stringentních podmínek obeznámený například z knihy Sambrook, J., et al.,

Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989. Podmínky hybridizace mohou být například optimalizovány, jak popsáno v Szostak, J.W., et al., Hybridization with synthetic oligonucleotides, Methods in Enzymol., 68, 419-482, 1979. Například, aby se izoloval myší promotor cdc25B, může být myší genomová fágová knihovna, která byla například získána z myšího kmene 129 FVL, Stratagene, testována se sondou, která obsahuje část sekvence zobrazené v tabulce 1 (sekvence s identifikačním číslem 7), která výhodně obsahuje sekvenci s identifikačním číslem 4.

Předkládaný vynález se kromě toho týká konstruktu nukleové kyseliny, který obsahuje alespoň jeden nový promotor. Výhodně je nová promotorové sekvence genu cdc25B kombinována se strukturním genem, tj . obecně s genem, který kóduje protein nebo RNA ve formě aktivní sloučeniny. V nej jednodušším případě může tato kombinace tvořit konstrukt nukleové kyseliny, který obsahuje nukleotidovou sekvenci nového promotoru pro gen cdc25B a strukturní gen, s promotorem aktivujícím transkripci strukturního genu, způsobem výhodně závislým na buněčném cyklu. Nový promotor je výhodně lokalizován v protisměru od strukturního genu.

V dalším výhodném provedení je 5'-nekódujici oblast genu cdc25B (nukleotidová sekvence od přibližně +1 do přibližně +167) vložena mezi nový promotor a strukturní gen.

V dalším výhodném provedeni je nový promotor kombinován j ednou aktivační sekvenci virově specifickou, metabolicky specifickou, buněčně specifickou, specifickou pro buněčný cyklus a/nebo závislou na buněčné za účelem regulace exprese strukturního genu.

promotory, které jsou aktivovány v endotelových buňkách, per buňkách, epitelových buňkách gastrointestinálnihc traktu, odvádějících moč, svalových tkání, hematopoetických buňkách, itoneálních buňkách, pleurálnich kůže, buňkách plic, buňkách buňkách ledvin a cestách buňkách, buňkách pojivových makrofázich, lymfocytech, leukemických buňkách, nádorových buňkách nebo gliových buňkách, promotorové sekvence virů jako je HBV, HSV, HPV, EBV, HTLV, CMV nebo HIV, promotorové nebo zesilovací sekvence, které jsou aktivovány hypoxií, aktivační sekvence specifické pro buněčný cyklus genů kódujících cdc25C, cyklin A, cdc2, E2F-1, B-myb a DHFR, a/nebo vazebné sekvence, jako jsou monomery nebo multimery boxu E Myc, pro transkripční faktory, které se objevují nebo jsou aktivovány způsobem závislým na buněčné proliferaci.

Pro kombinaci nového promotoru s alespoň jedním dalším promotorem mohou být použity různé techniky. Tyto techniky jsou popsány například v DE19617851.7, DE19639103.2 a DE19651443.6.

V dalším výhodném provedení tohoto vynálezu je pro kombinaci nového promotoru s alespoň jedním dalším promotorem nebo zesilovačem vybrán konstrukt nukleové kyseliny, který obsahuje nový promotor ve formě, ve které alespoň jedno vazebné místo pro transkripční faktor je mutováno. Tato strukturního genu.

jsou, případně, promotorově nebo aktivována • · · · · · • ·

mutace blokuje iniciaci transkripce

Další složky konstruktu nukleové kyseliny strukturní gen, alespoň jedna další zesilovací sekvence, která může být nespecificky, buněčně specificky nebo virově buněčný cyklus, a která aktivuje transkripci alespoň jednoho dalšího strukturního genu, který kóduje alespoň jeden transkripční faktor, který je mutován tak, že se váže k mutovanému vazebnému místu (či místům) nového promotoru a tento promotor aktivuje, a/nebo ke strukturnímu genu, který kóduje transkripční faktor.

Příklad uspořádání jednotlivých složek je zobrazen ve schématu na obrázku 1.

V typickém provedení tohoto vynálezu mutací může být mutace boxu TATA nového promotoru. Box TATA (sekvence TATAAA nebo TATATAA) je rozpoznáván jako vazebné místo pro iniciační komplex RNA polymerázami II a III, které se vyskytují v buněčném jádře. Iniciace transkripce, asi 30 baží po směru čtení od boxu TATA, je prováděna prostřednictvím proteinu vázajícího box TATA (TBP), který je zapojen do transkripční reakce všech RNA polymeráz (I, II a III), které jsou přítomné v buněčném jádře. Příklad promotoru závislého vyloženě na boxu TATA je promotor genu U6, který je transkribován RNA polymerázou III, a jehož genový produkt je zapojen do sestřižení RNA.

Příklad mutace sekvence boxu TATA může být TGTATAA. Výsledkem této mutace je, že není již déle rozpoznáváno místo vázající DNA v normálním TBP a kódující gen již není účinně transkribován. V případě takové mutace gen, který kóduje transkripční faktor, je sekvence nukleové kyseliny, která kóduje současně mutovaný TBP. Výsledkem této společné mutace je, že TBP se váže k mutovanému boxu TATA (např. k TGTATAA), a tím vede k účinné transkripci strukturního genu. Takové společné mutace genu TBP byly popsány například autory Strubin a Struhl (Cell, 68, 721, 1992) a Heard et al., (EMBO J., 12, 3519, 1993).

Zejména výhodné provedení je konstrukt nukleové kyseliny, který obsahuje:

1) nový promotor genu cdc25B včetně boxu TATA, se sekvencí boxu TATA, která byla změněna na TGTA,

2) sekvenci GCCACC,

3) cDNA pro imunoglobulinový signální peptid (nukleotidová sekvence < 63 až > 107),

4) cDNA pro β-glukuronidázu (nukleotidová sekvence < 93 až > 1982),

5) promotor genu vWF (nukleotidová sekvence -487 až +247), a

6) cDNA pro protein vázající box TATA (sekvence nukleové kyseliny od 1 do 1001, která je mutována v pozicích nukleové kyseliny 862 (A nahrazeno T) , 889 a 890 (GT nahrazeno AC) a 895 (C nahrazeno G).

V dalším výhodném provedení tohoto vynálezu je pro kombinaci nového promotoru s alespoň jedním dalším promotorem vybrán konstrukt nukleové kyseliny, který je nazýván složeným promotorem majícím jaderný retenční signál a exportní faktor a který obsahuje následující složky:

a) první nespecifickou, buněčně specifickou nebo virově specifickou promotorovou nebo zesilovací sekvenci (I), která může být aktivována metabolicky a/nebo specificky pro buněčný cyklus a která aktivuje bazální transkripci strukturního genu,

b) strukturní gen,

c) jaderný retenční signál („nuclear retention signál, NRS), jehož cDNA je spojena, přímo nebo nepřímo, na svém 5' a B · · · • ·

konci ke 3' konci strukturního genu, a transkripční produkt jaderného retenčního signálu má výhodně strukturu schopnou vázat jaderný exportní faktor,

d) další promotorovou nebo zesilovací sekvenci (II), která aktivuje bazální transkripci jaderného exportního faktoru („nuclear export factor, NEF), a

e) nukleovou kyselinu, která kóduje jaderný exportní faktor (NEF), který se váže na transkripční produkt jaderného retenčního signálu, a tím zprostředkovává transport transkripčního produktu strukturního genu ven z buněčného jádra.

Ve smyslu tohoto vynálezu alespoň jednu ze složek promotoru tvoří nový promotor.

První (I) promotorově nebo zesilovací sekvence (a) a druhá (II) promotorové nebo zesilovací sekvence (d) mohou být totožné nebo odlišné a, případně, aktivovatelné nespecificky, buněčně specificky, virově specificky nebo metabolicky, zejména hypoxií, nebo tvoří další promotor specifický pro buněčný cyklus.

Uspořádání jednotlivých složek je zobrazeno například na obrázku 2.

V nových konstruktech nukleové kyseliny mohou být složky d) a e) lokalizovány v protisměru nebo po směru čtení od složek a), b) a c) (viz rovněž obrázek 2).

Výhodně je gen, který kóduje jaderný retenční signál (NRS) vybrán z rev-responzivního prvku (RRE) z HIV-1 nebo HIV-2, RRE-ekvivalentniho retenčního signálu retrovirů nebo RRE-ekvivalentního retenčního signálu HBV.

Gen, který kóduje jaderný exportní faktor (NEF) je výhodně gen vybraný z rev genu virů HIV-1 nebo HIV-2, z viru visna-maedi, viru kozí artritidy a encefalitidy, viru koňské infekční anémie, viru imunodeficitu koček, retrovirů nebo • · · · · ·

HTLV, genu kódujícího protein hnRNP-Al nebo genu kódujícího transkripční faktor TFIII-A.

V dalším výhodném provedení je alespoň jedna promotorové nebo zesilovací sekvence (složka a) nebo d)) nových konstruktů nukleové kyseliny genový konstrukt, který se nazývá promotorové jednotka responzivní na aktivátor, a který výhodně obsahuje následující složky:

f) jednu nebo více totožných či odlišných promotorových nebo zesilovacích sekvencí, které mohou například být aktivovány specificky pro buněčný cyklus, v závislosti na buněčné proliferaci, metabolicky, buněčně specificky nebo virově specificky nebo současně specificky pro buněčný cyklus a metabolicky, buněčně specificky nebo virově specificky (takzvané chimérické promotory),

g) jednu nebo více totožných či odlišných aktivátorových podjednotek, které jsou v každém případě lokalizovány po směru čtení od promotorových nebo zesilovacích sekvencí a jejichž bazální transkripce je aktivována těmito sekvencemi,

h) promotor responzivní na aktivátor, který je aktivován expresními produkty jedné nebo více aktivátorových podjednotek.

Uspořádání jednotlivých složek preferované promotorové jednotky responzivní na aktivátor je zobrazeno na obrázku 3.

Inzerce preferované promotorové jednotky responzivní na aktivátor do nového konstruktu nukleové kyseliny je zobrazeno například na obrázku 4.

V těchto promotorových jednotkách responzivních na aktivátor, které jsou jako příklady zobrazeny na obrázcích 3 a 4, může být alespoň jeden promotor (I, II, III nebo IV) tvořen novým promotorem.

•v ····

9

Ve výhodném provedení vynálezu mohou tvořit promotorové jednotky responzivni na aktivátor vazebné sekvence pro chimérické transkripční faktory, které jsou složeny z domén vázajících DNA, z interakčních domén protein/protein a transaktivačnich domén. Všechna místa vázající transkripční faktory, která jsou zmíněna v předkládaném vynálezu, se mohou vyskytovat jednou (monomery) nebo v několika kopiích (multimery, například až do 10 kopií).

Operátor LexA v kombinaci s promotorem SV40 je příklad promotoru responzivního na aktivátor h) , který je aktivován dvěma aktivátorovými podjednotkami (g a g') .

Tento promotor obsahuje například následující aktivátorové podjednotky:

1) první aktivátorové podjednotka g) obsahuje cDNA kódující aminokyseliny 1-81 nebo 1-202 z proteinu vázajícího DNA pro LexA, jejíž 3' konec je spojen s 5' koncem cDNA kódující protein Gal80 (aminokyseliny 1-435), a

2) druhá aktivátorové podjednotka g') obsahuje cDNA kódující doménu vázající Gal80 proteinu Gal4 kódující aminokyseliny 851-881, jejíž 3' konec je spojen s 5' koncem cDNA kódující aminokyseliny 126-132 antigenu SV40 velké T, jejíž 3' konec je spojen s 5' koncem cDNA kódující aminokyseliny 406-488 transaktivační domény VP16 z HSV-i.

Dalším příkladem promotoru responzivního na aktivátor, který je aktivován dvěma aktivátorovými podjednotkami (g a g') , je vazebná sekvence pro protein Gal4 v kombinaci s promotorem SV40.

Tento promotor obsahuje například následující aktivátorové podjednotky:

1) první aktivátorové podjednotka g) obsahuje cDNA kódující doménu vázající DNA proteinu Gal4 (aminokyseliny • ·· ·· ···· ·· ···« * · 4 · · ·· • ·· · · ··· · · ♦· • 9 ··· 9 · 9 999 99

9 9 9 9 9 9 9· ·*4 ·· 99 999 ····

1-147), jejíž 3' konec je spojen s 5' koncem cDNA pro protein Gal80 (aminokyseliny 1-435), a

2) druhá aktivátorové podjednotka g') obsahuje cDNA kódující doménu vázající Gal80 z Gal4 (aminokyseliny 851881), jejíž 3' konec je spojen s 5' koncem cDNA kódující jaderný lokalizační signál SV40 (SV40 velké T, aminokyseliny 126-132), jejíž 3' konec je spojen s 5' koncem cDNA kódující aminokyseliny 406-488 transaktivační domény VP16 z HSV-1.

Dalším příkladem dvou aktivátorových podjednotek (g a g') , které aktivují promotor responzivní na aktivátor, který obsahuje sekvenci pro vazbu proteinu Gal4 a promotoru SV40, je:

1) aktivační jednotka g), která obsahuje cDNA kódující cytoplazmatickou doménu T buněčného antigenu CD4 (aminokyseliny 397-435), jejíž 5' konec je spojen s 3' koncem cDNA pro transaktivační doménu VP16 z HSV-1 (aminokyseliny 406-488), jejíž 5' konec je opět spojen s 3' koncem cDNA pro

jaderný	lokalizační	signál	SV4 0	(SV4 0	velké	T,	aminokyseliny
126-132)	, a
2)	aktivační jednotka	g'),	která	obsahuje	cDNA kódující
j aderný	lokalizační	signál	SV4 0	(SV40	velké	T,	aminokyseliny

126-132) a cDNA pro	doménu	vázaj ící	DNA proteinu Gal4
(aminokyseliny 1-147),	jejíž 3'	konec je	spojen s	5' koncem
cDNA pro sekvenci	vázaj ící	CD4 z	protein	p56 lek
(aminokyseliny 1-71).
Výhodné provedení	je tedy	konstrukt	nukleové	kyseliny,
který obsahuje:
1) jednu nebo	více	totožných	nebo	odlišných

aktivátorových podjednotek, jejichž bazální transkripce je aktivována promotorem nebo zesilovačem, a

2) promotor responzivni na aktivátor, který je aktivován expresním produktem uvedené aktivátorové podj ednotky, a zejména výhodné provedeni je konstrukt nukleové kyseliny, který obsahuje, jako aktivátorovou podjednotku A)

1) nový promotor,

2) jaderný lokalizační signál („nuclear localization signál, NLS) SV40 (SV40 velké T, aminokyseliny 126-132, PKKKRKV),

3) kyselou transaktivační doménu („acid transactivating domain, TAD) VP16 z HSV-1 (aminokyseliny 406-488), a

4) cDNA kódující cytoplazmatickou část glykoproteinu CD4 (aminokyseliny 397-435), a, jako další aktivátorovou podjednotku B),

1) promotor genu cdc25C (nukleové kyseliny -290 až +121),

2) jaderný lokalizační signál (NLS) SV40 (SV40 velké T, aminokyseliny 126-132, PKKKRKV),

3) cDNA pro doménu vázající DNA proteinu Gal4 (aminokyseliny 1-147), a

4) cDNA pro sekvenci vázající CD4 z proteinu p56 lek (aminokyseliny 1-71), a také promotor responzivni na aktivátor, obsahující až přibližně 10 kopií vazebné sekvence pro protein vázající Gal4, mající nukleotidovou sekvenci 5'-CGGACAATGTTGACCG-3', a bazální promotor SV40 (nukleotidová sekvence 48 až 5195), a, případně, strukturní gen, výhodně kompletní cDNA, která kóduje aktivní sloučeninu, enzym nebo fúzní protein, který je složen z ligandu a aktivní sloučeniny nebo ligandu a enzymu.

Zpravidla je strukturní gen ten, který kóduje farmakologicky aktivní sloučeninu, která je výhodně vybrána

• · z enzymů, fúznícn proteinů, cytokinů, chemokinů, růstových faktorů, receptorů pro cytokiny, receptorů pro chemokiny, receptorů pro růstové faktory, peptidů nebo proteinů majících antiproliferační nebo cytostatický nebo apoptotický účinek, protilátek nebo protilátkových fragmentů, inhibitorů angiogeneze, peptidových hormonů, koagulačních faktorů, inhibitorů koagulace, fibrinolytických peptidů nebo proteinů, peptidů nebo proteinů majících účinek na krevní oběh, proteinů krevní plazmy, antigenů infekčních agens, jako jsou bakteriální a parazitární antigeny, antigenů buněk nebo antigenů nádorů, s antigenem vyvolávajícím imunitní reakci, látek vyvolávajících trombózu, proteinů aktivujících komplement, obalových proteinů virů a/nebo ribozymů.

V případě ribozymů je strukturní gen výhodně gen, který kóduje ribozym, který inaktivuje mRNA, která kóduje protein, který je vybrán z proteinů řídících buněčný cyklus, zejména cyklin A, cyklin B, cyklin Dl, cyklin E, E2F1-5, cdc2, cdc25C nebo DPI, virových proteinů, cytokinů, růstových faktorů nebo jejich receptorů.

V dalším výhodném provedení může být strukturní gen ten, který kóduje enzym, který štěpí prekurzor léku na lék. V dalším výhodném provedení může strukturní gen kódovat fúzní protein ligand/efektor, přičemž ligand může být protilátka, protilátkový fragment, cytokin, růstový faktor, adhezivní molekula nebo peptidový hormon, a efektor může být farmakologicky aktivní sloučenina, jak popsáno výše, nebo enzym. Strukturní gen může například kódovat fúzní protein ligand/enzym, přičemž enzym štěpí prekurzor léku na lék a ligand se váže na buněčný povrch, výhodně na endotelové nebo nádorové buňky.

Konstrukty nukleové kyseliny jsou výhodně složeny z DNA. Pod termínem konstrukty nukleové kyseliny se obecně rozumí umělé struktury složené z nukleových kyselin, které mohou být transkribovány v cílových buňkách. Výhodně jsou vloženy do vektoru, přičemž jsou obzvláště preferovány plazmidové nebo virové vektory.

externě nebo interně, lokálně, perorálně, nazálně, intrabronchiálně, intrámuskalárně, subkutánně, do tělesné do urogenitálního traktu a používají se pro profylaxi nemoci nebo její léčbu.

Při použití nových konstruktů nukleové kyseliny může gen exprimován buněčně určených metabolických buněčný cyklus, přičemž být strukturní specificky, za specificky pro výhodně gen, který kóduje farmakologicky specificky, podmínek strukturní virově a/nebo gen j e aktivní sloučeninu nebo enzym, který štěpí inaktivní prekurzor léku na aktivní lék. Strukturní gen může být vybrán tak, že je farmakologicky aktivní sloučenina nebo enzym exprimován spolu s ligandem jako fúzní protein, a tento ligand se váže na povrch buněk, např. proliferujících endotelových nebo nádorových buněk.

Předkládaný vynález se dále týká způsobu přípravy nového konstruktu nukleové kyseliny, ve kterém jsou jednotlivé složky konstruktu nukleové kyseliny navzájem spojeny. Spojení jednotlivých složek může být provedeno za použití obecně známých metod, například enzymaticky použitím ligáz.

Předkládaný vynález se kromě toho také týká buněk, zejména kvasinek nebo savčích buněk, které obsahují nový konstrukt nukleové kyseliny. V obzvláště výhodném provedení jsou konstrukty nukleové kyseliny zavedeny do buněčných • · · · • · linii, které tedy mohou být po transfekci použity pro expresi transgenu. Tyto buňky mohou být následně použity pro poskytování léku pacientům. Výhodné použiti nového konstruktu nukleové kyseliny zahrnuje léčení nemoci, přičemž se poskytne lék obsahující zavedení konstruktu nukleové kyseliny do cílové buňky a expresi konstruktu způsobem, který je virově specifický nebo specifický pro cílovou buňku nebo metabolicky specifický nebo nespecifický a specifický pro buněčný cyklus. Obecně je podávání prováděno právě tak, jako v případě nových konstruktů nukleové kyseliny a podobně jsou použity pro profylaxi nebo léčbu nemocí.

Aby se připravil lék, mohou být například endotelové buňky izolovány z krve a transfekovány in vitro novým konstruktem nukleové kyseliny, a poté mohou být buňky znovu injikovány pacientovi, například intravenózně.

Tyto buňky, které byly transfekovány in vitro, mohou být pacientovi také podávány v kombinaci s novým vektorem. Tato kombinace má tu výhodu, že buňky a vektory mohou být v každém případě podávány nebo injikovány současně nebo v různém čase, na tomtéž nebo různých místech.

Předkládaný vynález se proto dále týká použití nového konstruktu nukleové kyseliny nebo nové buňky pro přípravu léku pro léčbu nemoci, která je vybrána z nádorových nemocí, leukémií, autoimunitních nemocí, alergií, artritid, zánětů, orgánových rejekcí, reakcí štěpu proti hostiteli, nemocí koagulačního systému, nemocí oběhového systému, anémie, infekcí, hormonálních poruch a/nebo poškození CNS. Obzvláště výhodné je použití endotelové buňky pro přípravu nového léku.

Nové konstrukty nukleové kyseliny se v této formě nevyskytuji v přírodě, tj. strukturní gen není přirozeně kombinován s novým promotorem.

• · • ·

Aplikace v každém případě strukturního genu. Následující souvislosti jako vodítko.

Detailní popis jednotlivých

WO96/06938, WO96/06941,

DE19617851.7, určuje výběr promotorů a příklady slouží v této složek vyjevuji W096/06940,

WO96/06939,

DE19639103.2 a DE19651443.6.

DE19605274.2

I) Promotorové sekvence

Ve smyslu předkládaného vynálezu jsou jako promotorové sekvence (složky a), c) , f) nebo f') ) použity nukleotidové sekvence, které obecně po vazbě transkripčních faktorů, aktivují transkripci strukturního genu, ke kterému přiléhají na 3' konci. Výběr promotorové sekvence(i), která je kombinována s promotorem cdc25B, závisí na nemoci, která má být léčena, a na cílové buňce, která má být transdukována. Je tedy možné, že další promotorové sekvence je aktivovatelná neomezeně, specificky pro cílovou buňku, za určených metabolických podmínek, specificky pro buněčný cyklus nebo virově specificky. Kromě toho ve složkách a) ,

c) , f) a/nebo f') mohou být použity totožné nebo odlišné promotorové sekvence. Příklady promotorových sekvencí k výběru jsou: promotorové a aktivátorové sekvence, které mohou být aktivovány neomezeně, jako je promotor RNA polymerázy III, promotor RNA polymerázy II, promotor CMV a zesilovač CMV, nebo promotor SV40, virové promotorové a aktivátorové sekvence, jako jsou sekvence z HBV, HCV, HSV, HPV, EBV, HTLV nebo HIV. Když je použit promotor z HIV, preferuje se použití jako virově specifického promotoru celé sekvence LTR včetně sekvence TAR (pozice -453 až -80, Rosen et al., Cell, 41, 813, 1985).

Promotorové sekvence dále zahrnují metabolicky aktivovatelné promotorové a zesilovací sekvence, jako je • · • · • ·· · ···· · ··· • « · · · · ·· ···· · ··· ·· · · · · ··· «· ·· ··· ·· ·· zesilovač indukovatelný hypoxií (Semenza et al., PNAS, 38, 5680, 1991, McBurney et al., Nucl. Acids Res., 19, 5755,

1991), promotory aktivovatelné specificky pro buněčný cyklus, jako promotor genu cdc25C, genu cyklinu A, genu cdc2, genu B-myb, genu DHFR nebo genu E2F-1, nebo vazebné sekvence pro transkripční faktory, které se objevují nebo jsou aktivovány během buněčné proliferace, jako jsou vazebné sekvence pro proteiny c-myc, přičemž tyto vazebné sekvence zahrnují monomery nebo multimery nukleotidové sekvence, která je označena jako box E Myc (5'GGAAGCAGACCACGTGGTCTGCTTCC-3', Blackwood a Eisenmann, Science, 251, 1211, 1991), promotory aktivovatelné tetracyklinem, jako je tetracyklinový operátor v kombinaci s příslušným represorem, chimérické promotory, které tvoří kombinace protisměrné aktivátorové sekvence, která může být aktivována buněčně specificky, metabolicky nebo virově specificky, s promotorovým modulem po směru čtení, který obsahuje například nukleotidovou sekvenci CDE-CHR nebo E2FBS-CHR, ke které se váží supresorové proteiny, a je tedy schopná inhibovat aktivaci protisměrné aktivátorové sekvence v Go fázi a Gi fázi buněčného cyklu (W096/06943, Lucibello et al., EMBO J., 14, 12, 1994), buněčně specificky aktivovatelné promotory, jako jsou promotory nebo aktivátorové sekvence z promotorů nebo zesilovačů těch genů, které kódují proteiny, které jsou přednostně tvořeny ve vybraných buňkách.

Příklady buněčně specificky aktivovatelných promotorů jsou promotorové a aktivátorové sekvence, které jsou aktivovány v endotelových buňkách, jako jsou promotorové a aktivátorové sekvence genů, které kódují endotelový přenašeč glukózy 1 specifický pro mozek, endoglin, receptor VEGF 1 (flt-1), receptor VEGF 2 (flk-1 nebo KDR), til-1 nebo til-2,

receptor B61 (receptor Eck), B61, endotelin, zejména endotelin B nebo endotelin 1, receptory endotelinu, zejména receptor endotelinu B, receptory manózo-6-fosfátu, von Willebrandův faktor, Il-la, IL-Ιβ, receptor IL-1, adhezivní molekula cévní buňky (VCAM-1) nebo syntetické aktivátorové sekvence, které obsahuji oligomerizovaná místa pro vazbu transkripčních faktorů, které jsou přednostně nebo selektivně aktivní například v endotelových buňkách. Příkladem je transkripční faktor GATA 2, jehož vazebné místo v genu endotelinu 1 je 5'-TTATCT-3' (Lee et al., Biol. Chem., 266, 16188, 1991, Dorman et al., J. Biol. Chem., 267, 1279, 1992, Wilson et al., Mol. Cell Biol., 10, 4854, 1990). Další buněčně specificky aktivovatelné promotory jsou promotorové nebo aktivátorové sekvence, které jsou aktivovány v buňkách v sousedství aktivovaných promotorové a aktivátorové přičemž genově regulační hraniční oblast, 3' hraniční oblast, endotelových buněk, jako jsou genů kódujících VEGF, sekvence sekvence pro gen VEGF jsou 5' gen

Src, nebo receptory steroidních hormonů a

14, promotor viru myšího nádoru mléčné žlázy.

Příklady promotorových nebo aktivátorových sekvencí, které jsou aktivovány ve svalových buňkách, zejména v buňkách hladkého svalstva, jsou promotorové nebo aktivátorové sekvence genů, které kódují tropomyozin, aaktin, α-myozin, receptor pro PDGF, receptor pro FGF, MRF-4, fosfofruktokinázu A, fosfoglycerátmutázu, troponin C, myogenin, receptory pro endotelin A, dezmin, VEGF, přičemž genové regulační sekvence pro gen VEGF již byly popsány výše nebo syntetické promotory. Příklady těchto syntetických promotorů jsou mnohonásobné kopie vazebného místa (DNA) pro svalově specifické proteiny rodiny HLH • · · ·

(„helix-loop-helix, šroubovice-smyčka-šroubovice), jako je box E (Myo D) (např. 4x AGCAGGTGTTGGGAGGC, sekvence s identifikačním číslem 1) nebo mnohonásobné kopie místa DNA pro vazebné místo proteinu „zinkového prstu GATA-4 genu těžkého řetězce a-myozinu (např. 5'-GGCCGATGGGCAGATAGAGGGGGCC GATGGGCAGATAGAGG-3', sekvence s identifikačním číslem 2). Příklady proteinů HLH jsou MyoD, Myf-5, myogen nebo MRF4. Proteiny HLH, a také GATA-4, projevují transkripci svalově specifickou nejenom s promotory genů specifických pro svaly, ale také v heterologním kontextu, tedy rovněž se syntetickými promotory.

Promotorové a aktivátorové sekvence, které jsou aktivovány v gliových buňkách, jsou zejména genově regulační sekvence nebo prvky genů, které například kódují následující proteiny: protein periaxin specifický pro Schwannovy buňky, glutaminsyntetázu, protein specifický pro gliové buňky, (gliový vláknitý kyselý protein, GFAP), protein SlOOb gliové buňky, IL-6 (CNTF), receptory 5-HT, TNFa, IL-10, receptor růstového faktoru podobného inzulínu I a II nebo VEGF, přičemž genově regulační sekvence pro gen VEGF již byly uvedeny výše. Promotorové a aktivátorové sekvence, které jsou aktivovány v hematopoetických buňkách, jsou promotorové sekvence pro geny cytokinu nebo jeho receptorů, které jsou exprimovány v hematopoetických buňkách nebo v sousedních buňkách, jako jsou buňky stromatu.

Tyto promotorové sekvence zahrnují například promotorové sekvence pro následující cytokiny a jejich receptory: receptor faktoru kmenové buňky, faktor kmenové buňky, IL-la, receptor

IL-1,

IL-3, receptor IL-3 (podjednotka a) , receptor

IL-3 (podjednotka β) ,

IL-6, receptor IL-6, receptor GMCSF (řetězec a), β · • ·

interferonový regulační faktor 1 (IRF-1), přičemž promotor IRF-1 je aktivován do stejné míry IL-6 a IFNy nebo IFNP, erytropoetin nebo receptor erytropoetinu.

Příklady promotorových a aktivátorových sekvencí, které jsou aktivovány v lymfocytech a/nebo makrofázích, jsou promotorové a aktivátorové sekvence genů cytokinů, cytokinových receptorů a adhezivních molekul a receptorů pro fragment Fc protilátek.

Příklady jsou promotorové sekvence pro následující proteiny: receptor IL-1, IL-la, IL-Ιβ, IL-2, receptor IL-2, IL-3, receptor IL-3 (podjednotka a), receptor IL-3 (podjednotka β) , IL-4, receptor IL-4, IL-5, IL-6, receptor IL-6, interferonový regulační faktor 1 (IRF-1), přičemž promotor IRF-1 je aktivován do stejné míry IL-6 jako ΙΓΝγ nebo ΙΡΝβ, promotor responzivní na IFNy, IL-7, IL-8, IL-10, IL-11, IFNy, GM-CSF, receptor GM-CSF (řetězec a), IL-13, LIF, receptor faktoru stimulujícího kolonii makrofágů (M-CSF) , receptory makrofága I a II, MAC-1 (leukocytární funkční antigen), LFA-Ια (leukocytární funkční antigen) nebo pl50,95 (leukocytární funkční antigen).

Promotorové a aktivátorové sekvence, které jsou aktivovány v synoviálních buňkách, jsou například promotorové sekvence pro metaloproteinázy mezibuněčné hmoty (MMP), například pro MMP1 (intersticiální kolagenáza) nebo MMP3 (stromelyzin/tranzin).

Dále zahrnují promotorové sekvence pro tkáňové inhibitory metaloproteináz (TIMP), například TIMP-1, TIMP-2 nebo TIMP-3.

Příklady promotorů a aktivátorových sekvencí, které jsou aktivovány v leukemických buňkách jsou promotory pro c-myc, HSP70, bcl-l/cyklin Dl, bcl-2, IL-6, IL-10, TNFa, ΤΝΡβ, H0X11, BCR-Abl, E2A-PBX1, PML-RARA (promyelocytární

leukemie - receptor kyseliny retinové) nebo c-myc, přičemž proteiny c-myc se váží na multimery nukleotidové sekvence, která se nazývá box E Myc (5'-GGAAGCAGACCAGCTGGTCTGCTTCC-3', sekvence s identifikačním číslem 3) a aktivují je.

Příklad promotorů nebo aktivátorových sekvencí, které jsou aktivovány v nádorových buňkách jsou genově regulační nukleotidové sekvence, se kterými interagují transkripční faktory, které se tvoří nebo jsou aktivní v nádorových buňkách.

Ve smyslu tohoto vynálezu výhodné promotory nebo aktivátorové sekvence zahrnují genově regulační sekvence nebo prvky z genů, které kódují zejména proteiny, které jsou v rakovinných buňkách nebo buňkách sarkomů, malobuněčných bronchiálních karcinomů promotoru proteinu N-CAM, použití promotoru nebo L-plastinu, tvořeny případě použití karcinomů hepatitidy karcinomů použití promotoru epitelového mucinu (PEM).

II) Jaderné exportní signály a

Ve výhodném provedení je nukleotidové sekvence, která RNA spojené s ní straně také tvoří Tento exportní messenger nebo jádra do cytoplazmy. obsahuje NRS, je tak, že je navázána Cell, 82, 475, 1995).

Tedy v j e výhodné v případě ovariálních receptorů růstového faktoru a v případě pankreatických L-plastinu nebo polymorfního faktory signál (NRS) pre-messenger ale která na druhé exportního proteinu.

transport preNRS ven z buněčného nebo messenger RNA, která ven z buněčného jádra proteinu (Fischer et al., jaderné exportní jaderný retenční bráni transportu přes buněčnou membránu, strukturu pro vazbu protein zprostředkovává messenger

RNA obsahující

Pre-messenger následně secernována k exportnímu

Jaderné exportní signály (NES) jsou výhodně sekvence retrovirového rev-responzivního prvku (RRE). V případě HIV1, tento RRE je sekvence v genu env obsahující 243 nukleotidů (nukleotidy 7362 až 7595). Avšak jaderný exportní signál (NES) může také být jakákoliv homologní a/nebo funkčně podobná (analogická) RRE-ekvivalentní prvek viru Biol., 13, 7476, 1993) .

V nových konstruktech nukleotidová sekvence, jako je

HBV (Huang et al., Mol. Cell nukleové kyseliny je jaderný exportní faktor (NEF) nukleotidová sekvence, která kóduje protein, který se váže na mRNA z NRS a zprostředkovává transport pre-messenger RNA nebo messenger RNA obsahující NRS z buněčného jádra a do cytoplazmy (nebo z cytoplazmy a do buněčného jádra). Zejména se používá gen rev retrovirů, především z virů HIV-1 nebo HIV-2. Protein rev retrovirového genu rev se váže svou doménou na N-koncové části k RRE v pre-mRNA. Vazba mezi RRE a proteinem rev umožňuje transport nesestřižené pre-messenger RNA, a také jakékoliv další RNA, která obsahuje RRE, ven z buněčného jádra a do cytoplazmy, a tím podstatně zesiluje translaci.

Ve smyslu předkládaného vynálezu mohou být také jako NEF použity nukleotidové sekvence, které kódují proteiny, které jsou homologní a funkčně podobné proteinu rev HIV-1 (Bogerd et al., Cell, 82, 485, 1995), jako je gen rev viru visna-maedi (VMV) nebo gen rev viru kozí artritidy a encefalitidy (CAEV) . Ale mohou být také použity ty geny, které kódují proteiny, které jsou funkčně podobné proteinu rev HIV-1, i když mají slabou nebo vůbec žádnou homologii s proteinem rev. Příklady jsou gen rev HTLV-1 a gen rev viru koňské infekční anémie (EIAV) a viru imunodeficitu koček (FIV).

• · • ·

V alternativním provedení mohou být NEF také nukleotidové sekvence proteinů, které uskutečňují sekreci RNA z jádra, aniž by tato RNA byla zadržena v jádru prostřednictvím NRS. Příklady těchto proteinů jsou transkripčni faktor TFIIIA nebo heterogenní jaderný ribonukleární protein Al (protein hnRNPAl). V širším smyslu jaderné transportní proteiny také zahrnují protein tepelného šoku 70 (hsp70) a inhibitor proteinkinázy CPKI.

Charakteristickou vlastností obecně sdílenou NEF a jeho homologními a analogickými proteiny je lokalizované blíže N-koncové části pro přítomnost domény vazbu monomerního proteinu k RNA NRS, a domény, která je obvykle bohatá na

ieucin (výjimkou je	hnRnPAl)	a	která	je nutná	pro
transportní funkci NEF.
Ve smyslu tohoto	vynálezu	je	exprese	genu NEF	pod
kontrolou promotorové	sekvence,		která je lokalizovaná
v protisměru čtení na	5' konci	genu NEF,	jak již	bylo

detailně popsáno výše.

III) Strukturní geny

Ve smyslu vynálezu strukturní geny (složka b)) kódují aktivní sloučeninu pro profylaxi a/nebo léčbu nemoci. Strukturní geny a promotorové sekvence jsou vybírány s ohledem na povahu léčby nemoci a berou se do úvahy cílové buňky, které mají být transdukovány.

Například následující kombinace promotorových sekvencí a strukturních genů se vybírají ve spojení s následujícími nemocemi. Detailní popis již byl podán v patentových přihláškách W096/06940, DE19605274.2, DE1967851.7, DE19639103.2 a DE19651443.6, které jsou zahrnuty v odkazech.

Příklady cílových buněk, které jsou vybírány pro léčbu nádorů, jsou: proliferující endotelové buňky, buňky stromatu a svalové buňky, které sousedí s endotelovými buňkami, nebo

nádorové nebo leukemické buňky. Promotory jsou specifické pro endotelové buňky a specifické pro buněčný cyklus nebo buněčně nespecifické nebo specifické pro svalové buňky a specifické pro buněčný cyklus nebo specifické pro nádorové buňky (solidní nádory a leukemie) a specifické pro buněčný cyklus.

Při výběru strukturních genů pro inhibitory buněčné proliferace, například pro protein retinoblastomu (pRb=pllO) nebo příbuzné proteiny pl07 a pl30, může být vybrána následující strategie:

Protein retinoblastomu (pRb/pllO) a příbuzné proteiny pl07 a pl30 jsou inaktivovány fosforylací. Dává se přednost použití takových genů těchto inhibitorů buněčného cyklu, které projevují mutace pro inaktivačni místa exprimovaných proteinů, aniž by se tím zhoršila funkce těchto proteinů. Příklady těchto mutací jsou popsány v případě pllO. Sekvence DNA proteinu pl07 nebo proteinu pl30 je mutována analogicky.

Protein p53 je další inhibitor buněčné proliferace. V buňce je protein p53 inaktivován buď vazbou na speciální proteiny, jako je MDM2, nebo oligomerizací p53 prostřednictvím defosforylovaného šeřinu v C-koncové části. Proto se dává přednost použití sekvence DNA pro protein p53, který byl na C-koncové části zkrácen odstraněním šeřinu 392. Další inhibitory jsou protein p21 (WAF-1), protein pl6, další inhibitory cdk, protein GADD45 nebo protein bak.

Strukturní geny pro faktory vyvolávající koagulaci a inhibitory angiogeneze kódují například inhibitor aktivátoru plazminogenu 1 (PAI-1), PAI-2, PAI-3, angiostatin, interferony (IFNa, ΊΤΝβ nebo IFNy) , destičkový faktor 4, IL12, TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3, leukemický inhibiční faktor (LIF) nebo tkáňový faktor (TF) a jeho fragmenty, které jsou aktivní při koagulaci.

Strukturní geny pro cytostatické a cytotoxické proteiny kódují například perforin, granzym, IL-2, IL-4, IL-12, interferony, jako je IFNa, ΙΓΝβ nebo IFNy, TNF, jako je TNFa nebo ΤΝΕβ, onkostatin M, sfingomyelinázu nebo magainin a deriváty magaininu.

Strukturní geny, které kódují cytostatické nebo cytotoxické protilátky a fúzní proteiny mezi protilátkovými fragmenty vázajícími antigen a cytostatickými, cytotoxickými nebo zánětlivými proteiny nebo enzymy, mohou být vybrány v souladu s následující strategií:

Cytostatické nebo cytotoxické protilátky zahrnují například ty, které jsou namířeny proti membránovým strukturám endotelových buněk, jak byly popsány například autory: Burrows et al., (Pharmac. Ther., 64, 155, 1994), Hughes et al., (Cancer Res., 49, 6214, 1989) a Maruyama et al., (PNAS USA, 87, 5744, 1990). Tyto protilátky zahrnují zejména protilátky proti receptorům VEGF. Dále zahrnují cytostatické nebo cytotoxické protilátky, které jsou namířeny proti membránovým strukturám na nádorových buňkách. Tyto protilátky byly uvedeny například v přehledech: Sedlaček et al., (Contrib. to Oncol., 32, Karger Verlag, Huních, 1988, and Contrib. to Oncol., 43, Karger Verlag, Municn, 1992). Dalšími příklady jsou protilátky proti sialyl Lewis, proti peptidům na nádorech, které jsou rozpoznávány T buňkami, proti proteinům, které jsou exprimovány onkogeny, proti gangliosidům, jako GD3, GD2, GM2, 9-O-acetyl GD3 a fukosyl GM1, proti antigenům krevních skupin a jejich prekurzorům, proti antigenům na polymorfním epitelovém mucinu a proti antigenům na proteinech tepelného šoku. Dále zahrnují protilátky, které jsou namířeny proti membránovým strukturám leukemických buněk. Velké množství těchto monoklonálních protilátek již bylo popsáno pro diagnostické ·· ·· ···· a léčebné způsoby (přehledy v: Kristensen, Danish Medical Bulletin, 47, 52, 1994, Schranz, Therapia Hungarica, 38, 3,

1990, Drexler et al., Leuk. Res., 10, 279, 1986, Naeim, Dis. Markers, 71, 1989, Stickney et al., Curr. Opin. Oncol., 4,

847, 1992, Drexler et al., Blut, 57, 327, 1988, Freedman et al., Cancer Invest., 9, 69, 1991). V závislosti na typu leukemie jsou například vhodné pro použití jako ligandy monoklonální protilátky nebo jejich protilátkové fragmenty vázající antigen, které jsou namířeny proti následujícím membránovým antigenům:

Buňky Membránový antigen

AML CD13

CD15

CD33

CAMAL sialosyl-Le

B-CLL CD5

CDlc

CD23 idiotypy a izotypy membránových imunoglobulinů

T-CLL CD33

M38 receptory IL-2 receptory T buněk

ALL CALLA

CD19 nehodgkinský lymfom

Humanizace myších protilátek a příprava a optimalizace genů pro Fab a rekombinantní fragmenty Fv se provádějí v souladu s technikami odborníkovi známými (Winter et al., Nátuře, 349, 293, 1991, Hoogenbooms et al., Rev. Tr.

Transfus. Hemobiol., 36, 19, 1993, Girol, Mol. Immunol., 28, 1379, 1991 nebo Huston et al., Intern. Rev. Immunol., 10,

195, 1993). Rekombinantní fragmenty Fv se podobně fúzuji ·· ··*· s geny pro cytostatické, cytotoxické nebo zánětlivé proteiny nebo enzymy v souladu se stavem techniky, který je odborníkovi znám.

Strukturní geny, které ligandy vázajícími cílovou buňku a cytostatickými a cytotoxickými proteiny následující strategií, látky, které se váží na mohou membránové struktury nebo membránové receptory na endotelových buňkách. Příklady těchto látek jsou cytokiny, jako je IL-i nebo růstové faktory nebo jejich fragmenty či částečné sekvence, které se váži na receptory, které jsou exprimovány endotelovými buňkami, například PDGF, bFGF, VEGF a TGF.

Dále zahrnují adhezivní molekuly, které se váží na aktivované a/nebo proliferujicí endotelové buňky. Příklady jsou Slex, LFA-1, MAC-1, LECAM-1, VLA-4 nebo vitronektin. Dále zahrnují látky, které se váží na membránové struktury nebo membránové receptory nádorových nebo leukemických buněk. Příklady jsou růstové faktory nebo jejich fragmenty či částečné sekvence, které se váží na receptory, které jsou exprimovány leukemickými nebo nádorovými buňkami. Takové růstové faktory již byly popsány (přehledy autorů: Cross et al., Cell, 64, 271, 1991, Aulitzky et al., Drugs, 48, 667, 1994, Moore, Clin. Cancer Res., 1, 3, 1995, Van Kooten et al., Leuk. Lymph., 27, 1993). Geny pro tyto ligandy, které se váži na cílovou buňku, jsou fúzovány s geny pro cytostatické, cytotoxické nebo zánětlivé proteiny nebo enzymy v souladu se stavem techniky za použití metod, které jsou odborníkovi známy.

Strukturní geny pro induktory zánětů kódují například IL-1, IL-2, RANTES (MCP-2), monocytární chemotaktický a aktivační faktor (MCAF), IL-8, makrofágový zánětlivý

9 999· protein 1 (ΜΙΡ-1α, ΜΙΡ-1β), neutrofilový aktivační protein 2 (NAP-2), IL-3, IL-5, lidský leukemický inhibiční faktor (LIF), IL-7, IL-11, IL-13, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, faktor kobřího jedu (CVF) nebo částečné sekvence CVF, které funkčně odpovídají lidskému komplementovému faktoru C3b, tj ., které jsou schopny se vázat ke komplementovému faktoru B a které tvoří konvertázu C3 po štěpení faktorem D, lidský komplementový faktor C3 nebo jeho částečná sekvence C3b, štěpné produkty lidského komplementového faktoru C3, které jsou funkčně a strukturně podobné CVF, nebo bakteriální proteiny, které aktivují komplement nebo vyvolávají záněty, například poriny ze Salmonella typhimurium, srážlivé faktory Staphylococcus aureus, moduliny, zejména z gramnegativních bakterií, hlavní vnější membránový protein legionel nebo z Haemophilus influenzae typu B nebo klebsiel, nebo M molekuly streptokoků skupiny G.

Strukturní geny, které kódují enzymy pro aktivaci prekurzorů cytostatických agens, například které kódují enzymy, které štěpí inaktivní prekurzorové látky (předléky) na aktivní cytostatické přípravky (léky), a příslušné předléky a léky pro každý případ již byly uvedeny v přehledech autorů: Deonarain et al., (British Journal Cancer, 70, 786, 1994), Mullen (Pharmac. Ther., 63, 199,

1994) a Harris et al., (Gene Ther., 1, 170, mohou být použity sekvence DNA pro jakýkoliv enzymů: thymidinkináza viru herpes simplex, bakteriální

1994). Například z následujících . thymidinkináza viru varicella zoster, bakteriální β-glukuronidáza, lidská

Secale cereale, nitroreduktáza, rostlinná β-glukuronidáza ze β-glukuronidáza, lidská karboxypeptidáza (CB), například CB-A mastocytů, CB-B, pankreatická nebo bakteriální karboxypeptidáza, bakteriální β-laktamáza, bakteriální cytosindeamináza, lidská kataláza •4 9··· ·· nebo peroxidáza, fosfatáza, zejména lidská alkalická fosfatáza, lidská kyselá prostatická fosfatáza nebe kyselá fosfatáza typu 5, oxidáza, zejména lidská lysyloxidáza nebo lidská kyselá D-aminooxidáza, peroxidáza, zejména lidská glutathionperoxidáza, lidská eosinofilni peroxidáza nebo lidská thyroidní peroxidáza nebo galaktosidáza.

Léčba autoimunitních nemocí a zánětů je nadto popsána ve WO/06941 a DE19651443.6, které jsou zahrnuty v odkazech.

Příklady vhodných cílových buněk jsou proliferující endotelové buňky, makrofágy a/nebo lymfocyty nebo synoviální buňky. Promotory jsou například specifické pro endotelové buňky a specifické pro buněčný cyklus nebo specifické pro makrofágy a/nebo specifické pro lymfocyty a/nebo specifické pro buněčný cyklus nebo specifické pro synoviální buňky a/nebo specifické pro buněčný cyklus.

Strukturní geny pro léčbu alergií kódují například IFNP, IFNy, IL-10, protilátky nebo protilátkové fragmenty proti IL-4, rozpustné receptory IL-4, IL-12 nebo ΤΰΡβ.

Strukturní geny pro prevenci rejekce transplantovaných orgánů kódují například IL-10, TGF3, rozpustné receptory IL1, rozpustné receptory IL-2, antagonisty receptoru IL-1, rozpustné receptory IL-6 nebo imunosupresivní protilátky nebo jejich fragmenty obsahující V_H a V_L nebo jejich fragmenty V_H a V_L, které jsou spojeny prostřednictvím spojky. Příklady imunosupresivních protilátek jsou protilátky, které jsou specifické pro T buněčný receptor nebo jeho komplex CD3 nebo které jsou namířeny proti CD4 nebo CD8, a dále proti receptoru IL-2, receptoru IL-1 nebo receptoru IL-4, nebo proti adhezivním molekulám CD2, LFA-1, CD28 nebo CD40.

Strukturní geny pro léčbu autoimunitních nemocí zprostředkovaných protilátkami kódují například TFGP, IFNa, IFNP, IFNy, IL-12, rozpustné receptory IL-4, rozpustné

	33	• ·· ·· ···· ·· · · 9 9 9 · • ·· · · ··· * <··«·· ·· • · · · · · ··· ·· ·· ··«	·· ·· • · · • ·· ··· · · • · · ·· ··
receptory	IL-6	nebo	imunosupresivni	protilátky nebo	j ej ich
fragmenty	obsahuj ící	VH a Vl-
Strukturní	geny pro léčbu	autoimunitnich	nemocí

zprostředkovaných buňkami kódují například IL-6, IL-9, IL10, IL-13, TNFa nebo TNFp, IL-13 nebo imunosupresivni protilátku nebo její fragmenty obsahující V_H a V_L.

Strukturní geny pro inhibitory buněčné proliferace, cytostatické nebo cytotoxické proteiny a enzymy pro aktivaci prekurzorů cytostatických přípravků již byly vyjmenovány výše ve vztahu k léčbě nádorů.

Ve smyslu předkládaného vynálezu mohou být použity, ve stejné formě jak již bylo v příslušném bodě popsáno, strukturní geny, které kódují fúzní proteiny, které obsahují protilátky nebo fragmenty Fab nebo rekombinantní fragmenty Fv těchto protilátek nebo jiných ligandů, které jsou specifické pro cílovou buňku, a výše zmíněné cytokiny, růstové faktory, receptory, cytostatické nebo cytotoxické proteiny a enzymy.

Ve smyslu vynálezu jsou pro léčbu artritidy vybrány strukturní geny, jejichž exprimovaný protein přímo nebo nepřímo inhibuje zánět, například v kloubu, a/nebo podporuje rekonstituci mezibuněčné hmoty (chrupavky a vazivové tkáně) v kloubu.

Příklady těchto proteinů jsou antagonista receptoru IL1 (IL-l-RA), protože IL-l-RA inhibuje vazbu IL-Ια a IL-Ιβ, rozpustný receptor IL-1, protože rozpustný receptor IL-1 váže a inaktivuje IL-1, IL-6, protože IL-6 zvyšuje sekreci TIMP a superoxidů a snižuje sekreci IL-1 a TNFa synoviálními buňkami a chondrocyty, rozpustný receptor TNF, protože rozpustný receptor TNF váže a inaktivuje TNF, IL-4, protože IL-4 inhibuje tvorbu a sekreci IL-1, TNFa a MMP, IL-10, protože IL-10 inhibuje tvorbu a sekreci IL-1, TNFa a MMP a zvyšuje sekreci TIMP, růstový faktor podobný inzulínu (IGF1), protože IGF-1 stimuluje syntézu mezibuněčné hmoty, TGF0, zejména TGFpi a TGF32, protože TGFP stimuluje syntézu mezibuněčné hmoty, a superoxiddismutáza nebo TIMP, zejména TIMP-1, TIMP-2 nebo TIMP-3.

Léčba nedostatečné tvorby krvinek již byla detailně popsána ve WO96/06941, což je zahrnuto v odkazech.

Příklady vhodných cílových buněk jsou proliferující nezralé buňky hematopoetického systému nebo buňky stromatu, které jsou lokalizovány v sousedství hematopoetických buněk. Promotory jsou například specifické pro hematopoetické buňky a/nebo specifické pro buněčný cyklus nebo buněčně nespecifické a specifické pro buněčný cyklus.

Strukturní gen pro léčbu anémie kóduje například erytropoetin. Strukturní geny pro léčbu leukopenie kódují například G-CSF, GM-CSF nebo M-CSF. Strukturní geny pro léčbu trombocytopenie kódují například IL-3, leukemický inhibiční faktor (LIF), IL-11 nebo trombopoetin.

Vhodné cílové buňky pro léčbu poškození nervového systému jsou gliové buňky nebo proliferující endotelové buňky. V tomto případě promotory jsou specifické pro gliové buňky a specifické pro buněčný cyklus nebo specifické pro endotelové buňky a specifické pro buněčný cyklus nebo nespecifické a specifické pro buněčný cyklus.

Strukturní geny pro neuronové růstové faktory kódují například FGF, nervový růstový faktor (NGF), neurotrofický faktor pocházející z mozku (BDNF) , neurotrofin 3 (NT-3), neurotrofin 4 (NT—4) nebo ciliární neurotrofický faktor (CNTF) nebo růstový faktor gliové buňky (GDNF). Strukturní geny pro enzymy kódují například tyrosinhydroxylázu nebo dopadekarboxylázu. Strukturní geny pro cytokiny a jejich inhibitory, které inhibují nebo neutralizují neurotoxický • ·

účinek TNFa, kóduji například TGF3, rozpustné receptory TNF, receptory TNF neutralizují TNFa, IL-10, protože IL-10 inhibuje tvorbu IFNy, TNFa, IL-2 a IL-4, rozpustné receptory IL-1, IL-1 receptor I, IL-1 receptor II, protože rozpustné receptory IL-1 neutralizují aktivitu IL-1, antagonistu receptoru IL-1 nebo rozpustné receptory IL-6.

Léčba poruch krevního koagulačního systému a krevního oběhového systému již byla detailně popsána v patentových žádostech WO96/06938, DE19617851.7 a DE19639103.2, zahrnuto v odkazech. Příklady vhodných cílových buněk jsou endotelové buňky, proliferující endotelové buňky, somatické buňky v sousedství endotelových buněk a buňky hladkého svalstva nebo makrofágy.

Promotory jsou například buněčně nespecifické a specifické pro buněčný cyklus nebo specifické pro endotelové buňky, buňky hladkého svalstva nebo makrofágy a specifické pro buněčný cyklus.

Strukturní geny pro inhibici koagulace nebo pro podporu fibrinolýzy kódují například tkáňový aktivátor plazminogenu (tPA) , aktivátor plazminogenu urokinázového typu (uPA), hybridy tPA a uFA, protein C, hirudin, inhibitory serinové proteázy (serpiny), jako je inhibitor C-1S, al-antitrypsin nebo antitrombin III nebo inhibitor dráhy tkáňového faktoru (TFPI). Strukturní geny pro podporu koagulace kódují například F VIII, F IX, von Willebrandův faktor, F XIII, PAI-1, PAI-2 nebo tkáňový faktor a jeho fragmenty. Strukturní geny pro angiogenní faktory kódují například VEGF nebo FGF. Strukturní geny pro snížení krevního tlaku kódují například kalikrein nebo syntázu oxidu dusnatého endotelových buněk. Strukturní geny pro inhibici proliferace buněk hladkého svalstva následující po poranění vrstvy endotelu kódují například antiproliferační, cytostatický «· ·· ···· ·· · · • · · · · · * • · · ···· · · · · ··· · ·· ···· • · • · · · nebo cytotoxický protein nebo enzym pro cytostatických přípravků na cytostatické bylo uvedeno výše při léčbě nádorů, nebo z těchto aktivních sloučenin s ligandem, štěpeni prekurzorů přípravky, jak již fúzní protein jedné například které jsou pro další inaktivátor s protilátkou nebo protilátkovými fragmenty, specifické pro svalové buňky. Strukturní geny proteiny krevní plazmy kódují například albumin,

Cl, sérovou cholinesterázu, transferin nebo al-antitrypsin.

Použití konstruktů nukleové kyseliny pro vakcinace již bylo detailně popsáno v patentových přihláškách W096/06941, DE19617851.7, DE19639103.2 a DE19651443.6, které jsou buněk jsou endotelové

DE19651443.6, zahrnuty v odkazech. Příklady vhodných cílových svalové buňky, makrofágy a/nebo lymfocyty nebo buňky. Promotory jsou například nespecifické a pro buněčný cyklus nebo specifické pro cílovou specifické pro buněčný cyklus.

Jako strukturní gen pro profylaxi infekčních použita například DNA pro protein, který je tvořen agens a který vede vyvoláním imunitní reakce, tj. pomocí vazby protilátky a/nebo prostřednictvím cytotoxických lymfocytů T, k neutralizaci a/nebo destrukci agens. takzvané neutralizační antigeny jsou již používány přehled v Ellis, Adv. Exp.

Avšak možnosti přípravy účinných omezeny. Mimoto DNA vakciny jejich účinnost (Fynan et 79, 1995, Donelly et al., předkládaného vynálezu je, vakcinační antigeny (viz Biol., 327, 263, 1992) .

vakcín obvyklým způsobem vyvoláváj í al. , Int.

Immunol., specifické buňku a nemoci je infekčním

Tyto jako

Med.

j sou otázky s ohledem na

J. Immunopharm., 17,

2, 20, 1994). Výhodou že je možné spoléhat na to, že účinnost je vyšší.

Ve smyslu předkládaného vynálezu se proto přednost dává DNA, která kóduje neutralizační antigeny pro následující patogenní agens: virus chřipky A, HIV, virus rabies, HSV • · ·· • · · · · • · · ·· ··

(virus herpes simplex), RSV (respirační syncyciální virus), virus parainfluenzy, rotavirus, VZV (virus varicella zoster), CMV (cytomegalovirus) , virus spalniček, HPV (lidský papilomavirus) , HBV (virus hepatitidy B) , HCV (virus hepatitidy C) , HOV (virus hepatitidy D) , HEV (virus hepatitidy E) ,

HAV (virus hepatitidy A) , antigen vibria cholery, Borrelia burgdorferi nebo Helicobacter pylori nebo antigen malárie.

Ale aktivní látky této povahy také zahrnují DNA pro antiidiotypovou protilátku nebo její fragmenty vázající antigen, jejichž struktury vázající antigen (oblasti určující komplementaritu) tvoří kopie proteinové struktury nebo sacharidové struktury neutralizačního antigenu infekčního agens. Antiidiotypové protilátky mohou nahradit zejména sacharidové antigeny v případě bakteriálních infekčních agens. Antiidiotypové protilátky a jejich štěpné produkty byly uvedeny v přehledech autorů: Hawkins et al., (J. Immunother., 14, 273, 1993) a Westerink a Apicella (Springer Seminars in Immunopathol., 15, 227, 1993).

Příklady strukturních genů pro „nádorové vakcíny jsou geny, které antigeny kódují antigeny na byly uvedeny například v nádorových buňkách. Tyto autorů:

přehledech

Sedlaček et al., Contrib.

to Oncol.,

Munich,

1988, a Contrib.

to Oncol.,

Verlag,

Verlag,

Munich, 1992.

Další příklady jsou antigeny nebo následující Lewis, peptidy buňkami, proteiny, geny, které krevních skupin a epitelovém mucinu kódují následující antiidiotypové protilátky: sialyl na nádorech, které jsou rozpoznávány T jsou exprimované onkogeny, antigeny prekurzory, antigeny na polymorfním antigeny na proteinech tepelného které j ej ich nebo šoku.

• ·

Léčba chronických infekčních nemocí již byla detailně popsána v patentových přihláškách WO96/06941, DE19617851.7, DE19639103.2 a DE1965443.6, které jsou zahrnuty v odkazech. Vhodná cílová buňka je jaterní buňka, lymfocyt a/nebo makrofág, epitelová buňka nebo endotelová buňka. Promotory jsou například virově specifické nebo buněčně specifické a specifické pro buněčný cyklus.

Strukturní geny kóduji například protein, který projevuje cytostatické, apoptotické nebo cytotoxické účinky nebo enzym, který štěpí prekurzor antivirové nebo cytotoxické látky na aktivní látku. Příklady strukturních genů, které kódují antivirové proteiny, jsou geny pro cytokíny a růstové faktory, které mají antivirový účinek, například IFNa, IFNp, ΙΕΝγ, TNFp, TNFa, IL-1 nebo TGFp nebo protilátky mající specifitu, která inaktivuje příslušný virus nebo jejich fragmenty obsahující V_H a V_L, nebo jejich fragmenty V_H a V_L, které jsou spojeny prostřednictvím spojky, jak již bylo popsáno. Příklady protilátek proti virovým antigenům jsou: anti-HBV, anti-HCV, anti-HSV, anti-HPV, anti-HIV, anti-EBV, anti-HTLV, anti-Coxsackie virus nebo anti-Hantaan virus.

Další příklad antivirového proteinu je protein vázající rev. Tento protein se váže k rev RNA a inhibuje kroky následující po transkripci závislé na rev v expresi retrovirálních genů. Příklady proteinů vázajících rev jsou RBP9-27, RBP1-8U, RBP1-8D nebo pseudogeny RBP1-8.

Jiné virové strukturní geny kódují ribozymy, které štěpí mRNA genů pro proteiny, které řídí buněčný cyklus, nebo mRNA virů. Ribozymy, které jsou katalytické pro HIV byly uvedeny v přehledech, například Christoffersen et al., J. Med. Chem., 38, 2033, 1995.

strukturních

Příklady antibakteriální proteiny neutralizují bakteriální baktérie. Příklady těchto meningokokům C nebo B,

Helicobacter pylori, nebo Staphylococcus aureus.

jsou geny pro protilátky, které toxiny nebo které opsonizují protilátek jsou protilátky proti

E. coli, Borreliím, Pseudomonas,

IV) Kombinace totožných nebo odlišných strukturních genů

Detailní popis již byl dán ve WO96/06941, WO96/06939, W096/06940, WO96/06938, DE19639103.2 a DE19651443.6, které jsou zahrnuty v odkazech. Příkladem kombinace strukturních genů je samozesilující, a případně i farmakologicky regulovatelný, expresní systém, ve kterém jsou spojeny sekvence DNA dvou totožných nebo dvou odlišných strukturních genů (složky c) a c') ) . Za účelem exprese dvou sekvencí DNA je jako regulační prvek mezi dva strukturní geny vložena další promotorové sekvence nebo nejlépe cDNA vnitřního ribozomálního vstupního místa (IRES). IRES umožní exprimovat dvě sekvence DNA, které jsou navzájem spojeny prostřednictvím IRES. Takové IRES byly popsány například autory Montford a Smith (TIG, 11, 179, 1995), Kaufman et al. (Nucl. Acids Res., 19, 4485, 1991), Morgan et al. (Nucl. Acids Res., 20, 1293, 1992), Dirks et al. (Gene, 128, 247, 1993), Pelletier a Sonenberg (Nátuře, 334, 320, 1988) a Sugitomo et al. (BioTechn., 12, 694, 1994). Tak například může být použita cDNA sekvence IRES polioviru (pozice < 140 až > 630 z 5' UTR) .

Dává se přednost strukturním genům, které projevují aditivní účinek a které jsou spojeny prostřednictvím dalších promotorových sekvencí nebo sekvencí IRES. Výhodné kombinace strukturních genů pro léčbu nádorů kódují například totožné nebo odlišné cytostatické, apoptotické, cytotoxické nebo • ·

zánětlivé proteiny a/nebo totožné nebo odlišné enzymy pro štěpení prekurzoru cytostatického přípravku, výhodné kombinace pro léčbu autoimunitních nemocí kódují odlišné cytokiny nebo receptory mající synergický účinek na inhibici buněčné a/nebo humorální imunitní reakce nebo odlišné nebo totožné TIMP, výhodné kombinace pro léčbu nedostatečné tvorby krvinek kódují odlišné, hierarchicky následující cytokiny, jako IL-1, IL-3, IL-6 nebo GM-CSF a erytropoetin, G-CSF nebo trombopoetin, výhodné kombinace pro léčbu poškození nervové buňky kódují neuronový růstový faktor a cytokin nebo inhibitor cytokinu, výhodné kombinace pro léčbu poruch krevního koagulačního systému a krevního oběhu kódují antitrombotické agens a fibrinolytické agens (např. tPA nebo uPA) nebo cytostatický, apoptotický nebo cytotoxický protein a antitrombotické agens nebo fibrinolytické agens nebo několik odlišných synergicky působících faktorů krevní koagulace, například F VIII a vWF nebo F VIII a F ix, výhodné kombinace pro vakcíny kódují antigen a cytokin stimulující imunitu, například IL-la, IL-Ιβ, IL-2, GMCSF, IL-3 nebo receptor IL-4, různé antigeny jednoho infekčního agens nebo odlišných infekčních agens, nebo různé antigeny jednoho nádorového typu nebo odlišných nádorových typů, výhodné kombinace pro léčbu virových infekčních nemocí kódují antivirový protein a cytostatický, apoptotický nebo cytotoxický protein, nebo protilátky proti odlišným povrchovým antigenům jednoho viru nebo několika virů, a výhodné kombinace pro léčbu bakteriálních infekčních nemocí kódují protilátky proti odlišným povrchovým antigenům a/nebo toxinům příčinného organismu.

• · · ·

V) Vloženi signálních sekvencí a transmembránových domén Detailní popis již byl podán v patentových přihláškách DE19639103.2 a DE19651443.6, které jsou zahrnuty v odkazech.

Aby se zesílila translace, může být vložena nukleotidová sekvence GCCACC nebo GCCGCC (Kozák, J. Cell

Biol., 108, 299, 1989) na 3' konec promotorové sekvence a přímo na 5' konec startovacího signálu (ATG) signální sekvence nebo transmembránové sekvence.

Aby se usnadnila sekrece expresního produktu strukturního genu, může být nahrazena homologní signální sekvence, která je přítomná v sekvenci DNA strukturního genu, heterologni signální sekvencí, která zlepšuje extracelulární sekreci. Tedy například může být vložena signální sekvence pro imunoglobulin (pozice DNA 63 až 107, Riechman et al., Nátuře, 332, 323, 1988) nebo signální sekvence pro CEA (pozice DNA 33 až 134, Schrewe et al., Mol. Cell Biol., 10, 2738, 1990, Berling et al., Cancer Res., 50, 6534, 1990) nebo signální sekvence glykoproteinu lidského respiračního syncyciálního viru (cDNA pro aminokyseliny 38

až	50 nebo 4 8 až 65,	Lichtenstein et al., J.	Gen.	Virol.,
77,	109, 1996).
	Jako alternativa	nebo	navíc k signální	sekvenci může
být	vložena sekvence	pro	transmembránovou doménu,	aby se

aktivní sloučenina ukotvila v buněčné membráně transdukované buňky, která tvoří aktivní sloučeninu. Například mezi promotorovou sekvenci a sekvenci strukturního genu může být vložena transmembránová sekvence lidského faktoru stimulujícího kolonie makrofágů (pozice DNA 1485 až 1554, Cosman et al., Behring Inst. Mitt., 77, 15, 1988) nebo sekvence DNA pro signální a transmembránové oblasti glykoproteinu G lidského respiračního syncyciálního viru (RSV) (aminokyseliny 1 až 63 nebo jejich částečná sekvence, • · aminokyseliny 38 až 63, Vijaya et al., Mol. Cell Biol., 8, 1709, 1988, Lichtenstein et al., J. Gen. Virol., 77, 109, 1996) nebo sekvence DNA pro signální a transmembránové oblasti neuraminidázy viru chřipky (aminokyseliny 7 až 35 nebo částečná sekvence aminokyseliny 7 až 27, Brown et al., J. Virol., 62, 3824, 1988).

Avšak nukleotidová sekvence pro glykofosfolipidovou kotvu může být také vložena za účelem ukotvení aktivní sloučeniny do buněčné membrány transdukovaných buněk, které tvoří aktivní sloučeninu. Glykofosfolipidová kotva je vložena na 3' konec nukleotidové sekvence pro strukturní gen tak, že toto vložení může být provedeno navíc kromě vložení signální sekvence. Glykofosfolipidové kotvy byly popsány například pro CEA, pro N-CAM a pro další membránové proteiny, například Thy-1 (viz přehled Ferguson et al., Ann. Rev. Biochem., 57, 285, 1988).

Další možností pro ukotveni aktivní sloučeniny v buněčné membráně v souladu s předkládaným vynálezem je použití sekvence DNA pro fúzní protein ligand/aktivní sloučenina. Specifita ligandu tohoto fúzního proteinu je namířena proti membránové struktuře na buněčné membráně vybrané cílové buňky.

Ligandy, které se váží na povrch buněk, zahrnují například protilátky nebo protilátkové fragmenty, které jsou namířeny proti povrchovým strukturám například endotelových buněk. Tyto protilátky nebo protilátkové fragmenty zahrnují zejména protilátky proti receptorům VEGF nebo proti kininovým receptorům. Mohou být také namířeny proti svalovým buňkám, jako jsou protilátky proti aktinu nebo protilátky proti receptorům angiotenzinu II nebo protilátky proti receptorům pro růstové faktory, jako proti receptorům EGF

nebo proti receptorům PDGF nebo proti receptorům FGF nebo protilátky proti receptorům endotelinu A.

Ligandy také zahrnují protilátky nebo jejich fragmenty, které jsou namířeny proti antigenům buněčné membrány nádorů, které jsou pro nádory specifické nebo k nim přidružené. Protilátky této povahy již byly popsány. Myší monoklonální protilátky se výhodně používají v humanizované formě. Fragmenty Fab a rekombinantní fragmenty Fv a jejich fúzní produkty se připravují za použití metod odborníkovi známých, jak již bylo popsáno.

Ligandy dále zahrnují všechny aktivní sloučeniny, jako jsou cytokiny nebo adhezivní molekuly, růstové faktory nebo jejich fragmenty či částečné sekvence, mediátory nebo peptidové hormony, které se vážou na membránové struktury nebo membránové receptory na vybraných konkrétních buňkách. Příklady jsou ligandy pro endotelové buňky, jako je IL-1, PDGF, bFGF, VEGF, TGG3 (Pusztain et al., J. Pathol., 169, 191, 1993) nebo kinin a deriváty nebo analogy kininu. Tyto ligandy také zahrnují adhezivní molekuly. Adhezivní molekuly této povahy, jako je Slex, LFA-1, MAC-1, LeCAM-1, VLA-4 nebo vitronektin a deriváty nebo analogy vitronektinu, již byly popsány pro endotelové buňky (přehledy Augustin-Voss et al., J. Cell Biol., 119, 483, 1992, Pauli et al., Cancer Metast. Rev., 9, 175, 1990, Honn et al., Cancer Metast. Rev., 11,

353, 1992, Varner et al., Cell Adh. Commun., 3, 367, 1995).

Vynález je objasněn pomocí následujících obrázků, tabulek a příkladů, aniž by byl jimi omezen.

Popis obrázků

Obrázek 1: schematické zobrazení nového konstruktu nukleové kyseliny obsahujícího složky a)-d).

·«

Obrázek 2: schematické zobrazení nového konstruktu nuklecvé kyseliny obsahujícího složky a)-e).

Obrázek 3: schematické zobrazení promotorové jednotky responzivní na aktivátor.

Obrázek 4: schematické zobrazení nového konstruktu

Obrázek genomová promotorovou struktura jednotku oblasti štěpením myšího cdc25B. Restrikčním promotoru/zesilovače různými enzymy byla připravena mapa genomového lokusu ze tří o zolovsnycn fága. Z fága VI byl vystřižen fragment o který přímo sousedí s 5' oblastí cDNA, a

b) = subklonovaný fragment

Obrázek 6: deleční mutanty myšího promotoru cdc25B. Obrázek zobrazuje různé 5' delece a 3' delece promotoru a předpokládaná místa vázající transkripční faktor, která jsou lokalizována v této oblasti promotoru. Označení jednotlivých delečních konstruktů je založeno na pozici na 5' konci v sekvenci.

Fragmenty byly purifikovány přes centrifugační kolony QIAquick™ (Qiagen) a klonovány do vektoru pGL3 (Promega).

Tabulka 1: sekvenovaná oblast myšího promotoru cdc25B. Byla sekvenována oblast, která přímo sousedí s 5' koncem publikované sekvence cDNA (Kakizuka et al., Genes Dev., 6, 587, 1992). Tabulka ukazuje uspořádání předpokládaných vazebných míst a začátek transkripce. Předpokládaná vazebná místa jsou na jedné straně aktivátory, jako jsou ty, které se objevují v mnoha promotorech specifických pro buněčný cyklus, které jsou regulovány represí. Nadto zde jsou předpokládaná vazebná místa pro E2F a v 5' oblasti dva • · · ·

boxy E, kterým se připisuje represorová aktivita. Box TATA, který je zobrazen, je prvek sekvence, který je neobvyklý pro geny, které jsou regulované specificky pro buněčný cyklus, a který je v tomto promotoru zjevně funkčně důležitý, protože určuje pozici začátku transkripce.

Tabulka 2: promotorové aktivita různých delečních konstruktů. Tabulka ukazuje relativní luciferázovou aktivitu konstruktů zobrazených na obrázku 6 v rostoucích a o sérum ochuzených buňkách NIH-3T3. Indukce promotoru buněčným cyklem, která je určena z podílu hodnot pro rostoucí versus hladovějící buňky, je uvedena v posledním sloupci. V tomto ohledu je hodnota pro nejdelší konstrukt v rostoucích buňkách stanovena jako 100 a ostatní hodnoty byly poté srovnány s touto referenční hodnotou.

Tabulka 2a: delece relativně značné velikosti pro určení funkčních oblastí v promotoru a bodová mutace boxu TATA.

Tabulka 2b: postupná delece proximálního vazebného místa Spi a vazebného místa NF-Y a bodová mutace vazebného místa NF-Y. V tomto případě je opět aktivita konstruktu, který obsahuje všechna tato místa vázající aktivátor, v rostoucích buňkách za účelem zjednodušení stanovena na 100 (aktuální aktivita neodpovídá aktivitě konstruktu B-950) .

a) testované deleční konstrukty (viz obr. 6)

b) promotorové aktivita v rostoucích buňkách

c) promotorové aktivita v klidových (sérem deprivovaných) buňkách

d) indukce buněčného cyklu (podíl promotorové aktivity v rostoucích buňkách ve srovnání s aktivitou v klidových buňkách) • · · · ·

Příklady provedeni vynálezu

1. Klonování a analýza myšího promotoru cdc25B

Aby se mohl klonovat myší promotor cdc25B, bylo testováno přibližně 10® fágových plaků v Λ-Fix (Stratagene) z myší genomové fágové knihovny (myší kmen 129 FVJ, Stratagene). Sondou použitou v tomto testování byl oligonukleotid o velikosti 80 bp, který byl namířen proti vnější 5' oblasti myší cDNA cdc25B (Kakizuka et al., Genes Dev., 6, 587, 1992). Sekvence je následující:

Sonda 1: 5'TCTAGCTAGCCTTTGCCCGCCCCGCCACGATGGAGGTACCCCTGCAGAAG TCTGCGCCGGGTTCAGCTCTCAGTCCTGCC-3' (sekvence s i. č. 4)

Tři z výsledných šesti fágových klonů byly izolovány, amplifikovány a mapovány prostřednictvím restrikčního štěpení (enzymy od firmy Gibco) a použitím dvou dalších sond, které byly namířeny proti jiným 3' lokalizovaným sekvencím myší cDNA cdc25B (obr. 5).

Sonda 2: 5'GGTCATTCAAAATGAGCAGTTACCATAAAACGCTTCCGATCCTTACCAGT GAGGCTTGCTGGAACACAGTCCGGTGCTG-3^, (sekvence s i. č. 5)

Sonda 3: 5'GTTAAAGAAGCATTGTTATTATGGC-GAGGGGGGAGCAACCTCTGGGTTCA

GAATCTACATATGCTGGAAGGCCCCAATGA-3' (sekvence s i. č. 6)

Nakonec byl z fága VI za použití enzymů EcoRI a SA1I (Gibco) vystřižen fragment o velikosti 4,6 kb z proximálni oblasti zesilovače hraničící s publikovanou cDNA (Kakizuka et al., viz výše) a purifikován elektroforézou v agarózovém gelu a za použití centrifugačních kolon QIAquick™ (Qiagen), a vložen do vektoru Bluescript SKII (Stratagene) (obr.5). Část o velikosti 1,5 kb z 3' oblasti klonovaného fragmentu

4,6 kb byla sekvenována a identifikována srovnáním sekvence se sekvencemi cDNA cdc25B různých druhů jako myší homolog genu cdc25B.

• · · · · ·

Z této sekvenované oblasti byly vystřiženy různé fragmenty, klonovány do luciferázového reportérového vektoru pGL3 (Promega) a testovány na promotorovou aktivitu v myších fibroblastech NIH-3T3 (ATCC). Transfekce (přechodná) byla prováděna za použiti DEAE/dextranové metody (modifikované podle Sompayrac et al·., PNAS, 78, 7575, 1981)). Kontrolami použitými v těchto pokusech byly bazálni promotor SV40 ve vektoru pGL3 (Promega), kterýžto promotor není subjektem žádné významné regulace buněčného cyklu, a jako pozitivní kontrola fragment lidského promotoru cdc25C (C290, Lucibello et al., EMBO J., 14, 132, 1995), který byl také klonován do vektoru pGL3. Luciferázová aktivita byla stanovována jak popsáno

Bylo shledáno, že nukleotidová sekvence promotor myšího genu identifikačním číslem

7, viz tabulka 1).

promotoru myšího genu cdc25B (obr.

byly vystřiženy různé delečni fragmenty, klonovány do luciferázového reportérového vektoru pGL3

Cl testovány na promotorovou aktivitu, jak výše, v myších fibroblastech

NIH-3T3.

Aby se analyzovala reakce buněčného cyklu na různé delečni konstrukty, transfekované buňky buňkami, které byly byly normálně rostoucí, v každém případě srovnány s přechodně podobnými po transfekci ochuzeny o sérum, jak popsáno (Lucibello et al., EMBO J., 14, 132, 1995). Výsledky jsou shrnuty v tabulce 2. V této souvislosti nejdelší konstrukt, tj . B-950 (nukleotidová sekvence -950 až +167), projevoval regulaci buněčného cyklu 10,1, což bylo srovnatelné s regulací konstruktem lidského cdc25C (neuvedeno v tabulce 2). Delece 3' oblasti až k +3 (viz obr.

6) neměla za následek žádnou ztrátu aktivity nebo regulace promotoru buněčným cyklem, proto bylo možné vymezit oblast zodpovědnou za regulaci promotoru ještě dále. Delece 5' oblasti promotoru vyvolaly dva odlišné účinky, na jedné straně delece nejdelšího konstruktu, tj . B-950, až k B-340 měly za následek zvýšeni aktivity v buňkách Go/Gi, což odpovídalo deregulaci. Další delece vyvolaly snížení promotorové aktivity až na poslední deleci, která poté vyvolala obnovenou deregulaci (tabulka 2a)

Startovací místo bylo určeno extenzí účelem byla izolována RNA z normálně primeru. Za rímto rostoucích myších fibroblastů

NIH-3T3 a reakce se prováděla

o.

primerů a (Gibco). Zmapované startovací místo je lokalizováno v prvku sekvence podobné iniciátoru, párů baží ve směru

3' od boxu TATA identifikačním

Jestliže je promotorová aktivita delečních konstruktů pozorována proti pozadí předpokládaných míst vázaj ících transkripční faktory, která

3, je pak zjevné, že jsou zprostředkovány deleci specifických vazebných míst:

delece boxů E umístěných v 5' oblasti, podobně jako delece předpokládaných míst vázajících

E2F umístěných v sousedství boxu TATA, vede k derepresi promotoru. Na druhé straně, delece předpokládaných míst vázajících aktivátor (přednostně míst vázajících SP-1) a místa vázajícího NF-Y, zmenšuje promotorovou aktivitu (viz tab. 2a) . V této souvislosti má bodová mutace předpokládaného místa NF-Y za následek ztrátu aktivity více než 74 % při srovnání s konstruktem divokého typu (viz tab. 2a) . Testy změny elektroforetické pohyblivosti („electrophoretic mobility shift assay, EMSA, jak je popsáno ve Zwicker et al., Nucl. Acids Res., 23, č.19, S. 3822 ff, 1995) za použití specifických protilátek proti

9» 99Λ9 »999 • · « · 9 9 9 9 9 99 • ·· 9 9999 9999

999 9 99 9 9 · 99

999 ·9 9999

999 99 99 9 9 9 9999

Spl/Sp3 a NF-Y (Santa Cruz) a křížové kompetitivní pokusy s „bona fide místy vázajícími Sp-1 nebo NF-Y dokázaly specifickou vazbu Spl/Sp3 a NF-Y k předpokládaným vazebným místům.

Ačkoliv je nejkratší konstrukt (B-30), který obsahuje box TATA a zmapované startovací místo, do značné míry deregulován, projevuje aktivitu, která je dvěstěkrát větší než aktivita pozadí vektoru pGL3. Kromě toho bodová mutace boxu TATA měla za následek ztrátu více než 25 % promotorové aktivity (viz tab. 2a), a tím potvrzovala jeho funkční úlohu v regulaci promotorové aktivity.

Místa vázající transkripční faktory (hlavně SPI a NF-Y) odpovídají těm z mnoha popsaných genů, které jsou regulovány specificky pro buněčný cyklus represí nebo aktivací (přehledy viz Zwicker a Muller, TiGS 14, 3, 1997), ale nebyl dosud popsán žádný gen promotoru buněčného cyklu obsahující funkční box TATA.

Promotor myšího genu cdc25B tedy obsahuje nukleotidy < -950 až > +167, nebo částečné sekvence těchto nukleotidových sekvencí, například < -950 až > +1, -930 až + 167, -720 až +167, -34 0 až +167, -180 až +167, -100 až + 167, -80 až +167, -60 až +167 nebo -30 až +167 a/nebo odpovídající částečné sekvence do až +3 nebo +1.

Postupem vycházejícím ze sekvencí myšího promotoru, které byly nalezeny, je nyní pro odborníka jednoduchou záležitostí nalézt promotory cdc25B jiné než myši, které jsou homologní k myšímu promotoru cdc25B, za použití značení myšího promotoru, nejlépe radioaktivního, a testováním genomových knihoven DNA získaných ze savčích buněk prostřednictvím hybridizace za stringentních podmínek.

*· ·« •9

999

9999 • · ·· •· ··

9 99

99

9999

2. Příprava genových konstruktů za použití technologie složeného promotoru

a) Příprava promotorové jednotky responzivní na aktivátor

Nová promotorové jednotka responzivní na aktivátor obsahuje následující odlišné nukleotidové sekvence, které následují jedna druhou po směru čtení:

Aktivátorova podjednotka A

- promotor genu cdc25B (nukleové kyseliny -950 až +167) jaderný lokalizační signál (NLS) SV40 (SV40 velké T, aminokyseliny 126-132, PKKKRKV, Dingwall et al., TIBS, 16, 478, 1991) kyselá transaktivační doména (TAD) VP16 z HSV-1 (aminokyseliny 406 až 488, Triezenberg et al., Genes

Developm.,	2,	718, 1988, Triezenberg,	Curr. Opin. Gen.
Developm.,	5,	190, 1995) .
cDNA	pro	cytoplazmatickou část	glykoproteinu CD4

(aminokyseliny 397-435, Simpson et al., Oncogene, 4, 1141,

1989, Maddon et al., Cell, 93, 1985)

Aktivátorové podjednotka B

- promotor genu cdc25C (nukleové kyseliny -290 až +121,

Zwicker et al., EMBO J., 14, 4514, 1995, Zwicker et al.,

Nucl. Acids Res., 23, 3822, 1995).

jaderný lokalizační signál (NLS) SV40 (SV40 velké T, aminokyseliny 126-132, PKKKRKV, Dingwall et al., TIBS, 16, 478, 1991)

- cDNA pro doménu vázající DNA proteinu Gal4 (aminokyseliny až 147, Chasman a Kornberg, Mol. Cell Biol., 10, 2916,

1990) • · · · 9 · ·· 99

cDNA pro sekvenci vázající CD4 z proteinu p56 lek (aminokyseliny 1-71, Shaw et al., Cell, 59, 627, 1989, Turner et al., Cell, 60, 755, 1990, Perlmutter et al., J. Cell. Biochem., 38, 117, 1988).

Promotory responzivní na aktivátor

- lOx vazebná sekvence pro protein vázající Gal4 mající nukleotidovou sekvenci 5'-CGGACAATGTTGACCG-3' (Chasman a Kornberg, Mol. Cell Biol., 10, 2916, 1989)

- efektorový gen bazálního promotoru SV40 (nukleové kyseliny 48 až 5191, Tooze (ed.), DNA Tumor Viruses (Cold Spring Harbor New York, New York, Cold Spring Harbor Laboratory)

- cDNA pro luciferázu (Nordeen BioTechniques, 6, 454, 1988)

Popsaná aktivátorové sekvence funguje, jak je popsáno dále:

Promotor cdc25B reguluje transkripci kombinovaných cDNA pro aktivační doménu VP16 a cytoplazmatickou část CD4 (aktivační podjednotka A) specificky pro buněčný cyklus. Promotor cdc25C reguluje transkripci kombinovaných cDNA pro protein vázající DNA z Gal4 a část vázající CD4 z proteinu p56 lek (aktivační podjednotka B) specificky pro buněčný cyklus. Expresní produkty aktivátorových podjednotek A a B dimerizují přes vazbu domény CD4 k doméně p56 lek. Dimerický protein tvoří chimérický transkripční faktor pro promotor responzivní na aktivátor (sekvence DNA pro domény vázající Gal4/promotor SV40) pro transkripci efektorového genu (= luciferázového genu).

Jednotlivé složky konstruktu jsou navzájem spojeny prostřednictvím vhodných restrikčnich míst, která jsou přidána na konce odlišných prvků během amplifikace metodou PCR. Spojení se provádí za použití enzymů, které jsou • · odborníkovi známy, a které jsou specifické pro restrikční místa, a DNA ligáz. Tyto enzymy lze získat komerčně.

Nukleotidový konstrukt, který byl připraven tímto způsobem, je klonován do plazmidového vektoru pXP2 (Nordeen, BioTechniques, 6, 454, 1988), který je poté použit pro aplikaci in vivo přímo nebo v koloidních disperzních systémech. Fibroblasty 3T3, které jsou udržovány v tkáňové kultuře, jsou transfekovány popsaným plazmidem za použití metody odborníkovi známé (Lucibello et al., EMBO J., 14, 132, 1995) a množství luciferázy tvořené fibroblasty se měří, jak popsali Herber et al·., (Oncogene, 9, 1295, 1994) a Lucibello et al. (EMBO J., 14, 132, 1995).

Aby se ověřila specifita pro buněčný cyklus, jsou fibroblasty synchronizovány v G₀/Gi odstraněním séra na 48 hodin. Obsah DNA buněk se určí na FACS po značení barvivém Hoechst 33258 (Hoechst Ag, Frankfurt) (Lucibello et al., EMBO J., 14, 132, 1995).

Získaly se následující výsledky:

V transfekovaných fibroblastech bylo zjištěno zřetelné zvýšení luciferázy ve srovnání s netransfekovanými fibroblasty. Proliferující fibroblasty (DNA > 2S) tvoří podstatně více luciferázy než fibroblasty, které jsou synchronizovány v G₀/Gi (DNA = 2S) . Proto tedy promotorové jednotka responzivní na aktivátor, která byla popsána, vede k expresi reportérového genu luciferázy, která je závislá na buněčném cyklu.

b) Příprava hybridního promotoru

Nový hybridní promotor obsahuje následující odlišné nukleotidové sekvence, které následují jedna druhou po směru čtení:

- promotor genu cdc25B (nukleové kyseliny -950 až +167. Box TATA (nukleové kyseliny TATATAA v pozicích -30 až -23 jsou mutovány na TGTATAA)).

- sekvence GCCACC (Kodak, J. Cell Biol., 108, 229, 1989)

- cDNA pro imunoglobulinový signální peptid (nukleotidová sekvence < 63 až > 107, Riechmann et al., Nátuře, 332, 323, 1988)

- cDNA pro β-glukuronidázu (nukleotidová sekvence < 93 až > 1982, Oshima et al., PNAS USA, 84, 685, 1987)

- promotor pro gen von Willebrandova faktoru (vWF) (nukleové kyseliny -487 až +247, Jahroudi a Lynch, Mol. Cell Biol., 14, 999, 1994)

- gen pro protein vázající box TATA (sekvence nukleových kyselin +1 až +1001, která je mutována v nukleových kyselinách 862 (A nahrazeno T), 889 a 890 (GT nahrazeno AC) a 895 (C nahrazeno G) (Strubin a Struhl, Cell, 68, 721, 1992, Heard et al., EMBO J., 12, 3519, 1993).

Jednotlivé složky konstruktu jsou spojeny prostřednictvím vhodných restrikčních míst, která jsou přidána na konce odlišných prvků během amplifikace metodou PCR. Spojení se provádí za použití enzymů, které jsou odborníkovi známy, a které jsou specifické pro restrikční místa, a DNA ligáz. Tyto enzymy lze získat komerčně.

Nukleotidový konstrukt, který byl připraven tímto způsobem, je klonován do plazmidového vektoru pUC18/19, který je použit pro aplikace in vivo přímo nebo v koloidních disperzních systémech. Endotelové buňky z lidského pupečníku a fibroblasty (Wi-38), které jsou udržovány v tkáňové kultuře, jsou transfekovány popsaným plazmidem za použití metody odborníkovi známé (Lucibello et al., EMBO J., 14, 132, 1995) a množství β-glukuronidázy, která je tvořena • · • · · · • · endotelovými buňkami, se měří za použití

4-metylumbelliferyl-p-glukuronidu jako substrátu.

Aby se ověřila specifita pro buněčný cyklus, jsou endotelové buňky synchronizovány v G₀/Gi odstraněním methioninu na 4 8 hodin. Obsah DNA buněk se určí na FACS po značení pomocí Hoechst 33258 (Hoechst Ag, Frankfurt) (Lucibello et al., EMBO J., 14, 132, 1995).

Získaly se následující výsledky:

Není možné zjistit žádné zvýšení β-glukuronidázy v transfekovaných fibroblastech při srovnání s netransfekovanými fibroblasty. Transfekované endotelové buňky exprimují podstatně více β-glukuronidázy než exprimuji netransfekované endotelové buňky. Proliferující endotelové buňky (DNA > 2S, S = jedna sada chromozomů) secernují podstatně více β-glukuronidázy než endotelové buňky, které jsou synchronizovány v Go/Gj. (DNA = 2S) . Proto tedy složená promotorové jednotka, která byla popsána, vede k expresi strukturního genu β-glukuronidázy, která je buněčně specifická a závislá na buněčném cyklu.

c) Příprava složeného promotoru majícího jaderný retenční signál (NRS) a jaderný exportní faktor (NEF)

Nový složený promotor obsahuje následující odlišné nukleotidové sekvence, které následují jedna druhou po směru čtení:

- promotor genu cdc25B (nukleové kyseliny -950 až +167).

sekvence GCCACC, sekvence s identifikačním číslem 1 (Kodak, J. Cell Biol., 108, 229, 1989)

- cDNA pro imunoglobulinový signální peptid (nukleotidové sekvence < 63 až > 107, Riechmann et al., Nátuře, 332, 323, 1988) • ·

- cDNA pro β-glukuronidázu (nukleotidová sekvence < 93 až >

1982, Oshima et al., PNAS USA, 84, 685, 1987)

- cDNA pro RER viru HIV-1 jako jaderný retenční signál (NRS) (nukleotidová sekvence 7357 až 7602, Ratner et al., Nátuře, 313, 277, 1985, Malim et al., Nátuře, 338, 254, 1989)

- promotor pro gen von Willebrandova faktoru (vWF) (nukleové kyseliny -487 až +247, Jahroudi a Lynch, Mol. Cell Biol., 14, 999, 1994)

- cDNA pro REV viru HIV-1 jako jaderný exportní faktor (NEF) (sekvence aminokyselin 1-117, Ratner et al., Nátuře, 313, 277, 1985).

Jednotlivé složky konstruktu jsou spojeny prostřednictvím vhodných restrikčních míst, která jsou přidána na konce odlišných prvků během amplifikace metodou PCR. Spojeni se provádí za použití enzymů, které jsou odborníkovi známy, a které jsou specifické pro restrikční místa, a DNA ligáz. Tyto enzymy lze získat komerčně.

Nukleotidový konstrukt, který byl připraven tímto způsobem, je klonován do plazmidového vektoru pUClS/19, který je použit pro aplikace in vivo přímo nebo v koloidních disperzních systémech. Endotelové buňky z lidského pupečníku a fibroblasty (Wi-38), které jsou udržovány v tkáňové kultuře, jsou transfekovány popsaným plazmidem za použití metody odborníkovi známé (Lucibello et al., EMBO J., 14, 132, 1995) a množství β-glukuronidázy, která je tvořena endotelovými buňkami, se měří za použití

4-metylumbelliferyl-fl-glukuronidu jako substrátu.

Aby se ověřila specifita pro buněčný cyklus, jsou endotelové buňky synchronizovány v G₀/Gi odstraněním methioninu na 4 8 hodin. Obsah DNA buněk se určí na FACS po značení pomocí Hoechst 33258 (Hoechst Ag, Frankfurt) (Lucibello et al., EMBO J., 14, 132, 1995).

• ·

Získaly se následující výsledky:

Není možné zjistit žádné zvýšení β-glukuronidázy v transfekovaných fibroblastech při srovnání s netransfekovanými fibroblasty. Transfekované endotelové buňky exprimují podstatně více β-glukuronidázy než exprimují netransfekované endotelové buňky. Proliferující endotelové buňky (DNA > 2S, S = jedna sada chromozomů) secernují podstatně více β-glukuronidázy než endotelové buňky, které jsou synchronizovány v Go/Gi (DNA = 2S) . Proto tedy složená promotorové jednotka, která byla popsána, vede k expresi strukturního genu β-glukuronidázy, která je buněčně specifická a závislá na buněčném cyklu.

3. Aplikace

Aktivní sloučenina podle příkladů, které byly popsány, zabezpečí, po lokálním podání, například v místě nádoru, nebo po intrakraniálním nebo subarachnoidálnim podávání, nebo systémovém, nejlépe intravenózním nebo intraarteriálním podávání, jako výsledek specifity složené promotorové jednotky pro buněčný cyklus buňku, že jsou proliferuj ící β-glukuronidázu.

doxorubicin^-glukuronid to hlavně, endotelové jestliže ne výlučně, pouze buňky,

Tato β-glukuronidáza které (Jacquesy secernuj i štěpí dobře snášený al., et

EPO 0 511 917 Al) , který je injikován, na doxorubicin, který má cytostatický účinek. Doxorubicin inhibuje proliferaci endotelových buněk a vykonává na tyto buňky cytostatický účinek, a také na sousední nádorové buňky. To má za následek, že je inhibován růst nádoru.

• ·

SEZNAM SEKVENCÍ (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 17 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...17 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:

AGCAGGTGTT GGGAGGC 17 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 41 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...41 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2;

GGCCGATGGG CAGATAGAGG GGGCCGATGG GCAGATAGAG G 41 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 26 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) • · • * · · (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENí: exon (B) POZICE: 1...26 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:

GGAAGCAGAC CAGCTGGTCT GCTTCC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 80 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...80 (xí) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:

TCTAGCTAGC CTTTGCCCGC CCCGCCACGA TGGAGGTACC CCTGCAGAAG 50 TCTGCGCCGG GTTCAGCTCT CAGTCCTGCC 80 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 79 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...79 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:

GGTCATTCAA AATGAGCAGT TACCATAAAA CGCTTCCGAT CCTTACCAGT 50 GAGGCTTGCT GGAACACAGT CCGGTGCTG 79 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 80 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...80 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:

GTTAAAGAAG CATTGTTATT ATGGGGAGGG GGGAGCAACC TCTGGGTTCA 50

GAATCTACAT ATGCTGGAAG GCCCCAATGA 8 0 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1122 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...1122 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:

AGTTCTCAAC	TGCCCACTAG	GTCCTTCCCA	gctcattcca	GGAAAACAGA	CTCAGCTGCA	60
AGGTGATTAG	GTCATTAGAA	AACGCTCATT	GTAAACTAAT	AGCAAATTCA	GCCTCTTTCA	120
CCTTCAAAGA	AACACTAAAT	ATGGTGCTAT	TAACCCCAAA	TTAGCCAAGT	GGGTGTGAGA	180

TTTTTTTCCC	CCTAGTTGGG	TTCTCTGGTG	GCATGTCCCA	ACTGTGTGTT	GCAGAAATCA	240
TTGCCTAAAT	CTAAGCGTCT	AATTCTCAGG	AGAATAGGCT	CAGTGGGGTC	ACATCTAAAC	300
TCTGGTGCCC	CAGAACCCAG	CAGTTCCACT	GTGCCTCGCA	AAGGGCTGCC	AGCAAACGAC	360
TGCAGCTGCT	CTGTGAGGTC	CAGGGGCGAT	GACAGGAGGC	TGCACCATCA	GCGGAGTCCC	420
TGAGGGAGCT	TCTATGTCTC	TGCCACTCAA	CCGAACCTGT	GACCTTAAAC	GAGTTAAAGA	430
gcttttcaac	GCTGGGGTCT	GTGAACTGGA	CAGGGAACGC	AGTGCTCACA	GCATACTTGG	540
CAAACGTCCT	GGGCTCAAGC	AGAGCGTCGC	ACCGTCCCTT	ACTGATGAAC	GTGCATGATG	600
GTAAACGTTG	AGGGCTCCTT	ATGAGGCCAC	CTTAGGGGAT	GACTACTCCC	TCTGAGGGTA	660
GAGGGCTGCT	CCCACCTCCA	AACCCTGTTC	CAGGAGGCAA	TATCCTGGAG	GCCCAGGATT	720
CTCGCGTCAA	TGGGAGCGGG	CGGGGCCGGG	GCGGTACGTG	TGGGGCAGGG	GGTTAACCCA	780
ACTCCCCGAG	TCACCCTAAG	AAGCCAGGCG	AGCAGAAGTA	GCTGGTCCAG	CCTCAGCCTC	840
AGCCCCGCCC	TTGGTCCCGC	CCTCCCGGAA	CCGGCGCCCC	CATTGGTGGC	GTCTGGCGGC	900
GCTGCCGCTG	TTATTTTTCG	AATATATAAG	GAGGTGGAGG	TGGCAGCTGC	CCAGCTCGGC	960
GTCCTCCCCT	CCCTTCCTCC	CCACATCCCT	CTCCTCACTC	CCAGGCCCAT	TGCTCTTCCT	1020
CCCTCCCTTC	CCTCCCTCCT	TCCCCTCACC	CCAGGCTCAC	TCTCGGAGCT	GAGCCAGCTG	1080

GGTCGGCGTC TGCTGGCCGC TGTACTGTGG CCCTCTAGCT AG

1122

Claims (1)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Promotor genu cdc25B obsahující sekvenci, která za stringentních podmínek hybridizuje se sekvencí, jak je zobrazena v tabulce 1 (sekvence s identifikačním číslem 7), nebo její funkční částí.

   2. Promotor podle nároku 1, kde promotor obsahuje sekvenci zobrazenou v tabulce 1 (sekvence s identifikačním číslem 7), nebo její funkční část.

   3. Promotor podle nároku 1 nebo 2, kde funkční část obsahuje box TATA, alespoň jedno vazebné místo Spi a alespoň jedno vazebné místo NFY a, případně, alespoň jedno vazebné místo E2F a také, případně, alespoň jeden box TATA.

   4. Promotor podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, který obsahuje sekvenci zahrnující nukleotidy od přibližně -950 do přibližně +167 z tabulky 1 nebo jejich fragmenty, které stále obsahuji všechny funkční cis regulační prvky promotorové sekvence nukleotidů od přibližně -950 do přibližně +167, jak zobrazeno na obrázku 6.

   5. Promotor podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, který obsahuje sekvenci zahrnující nukleotidy od přibližně -950 do přibližně +3 z tabulky 1 nebo jejich fragmenty, které stále obsahují všechny funkční cis regulační prvky promotorové sekvence nukleotidů od přibližně -950 do přibližně +3, jak zobrazeno na obrázku 6.

   6. Promotor podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, který obsahuje sekvenci zahrnující nukleotidy od přibližně -930 do • · · · přibližně +3 z tabulky 1 nebo jejich fragmenty, které stále obsahuji všechny funkční cis regulační prvky promotorové sekvence nukleotidů od přibližně -930 do přibližně +3, jak zobrazeno na obrázku 6.

   7. Promotor podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, který obsahuje sekvenci zahrnující nukleotidy od přibližně -720 do přibližně +3 z tabulky 1 nebo jejich fragmenty, které stále obsahují všechny funkční cis regulační prvky promotorové sekvence nukleotidů od přibližně -720 do přibližně +3, jak zobrazeno na obrázku 6.

   8. Promotor podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, který obsahuje sekvenci zahrnující nukleotidy od přibližně -340 do přibližně +3 z tabulky 1 nebo jejich fragmenty, které stále obsahují všechny funkční cis regulační prvky promotorové sekvence nukleotidů od přibližně -340 do přibližně +3, jak zobrazeno na obrázku 6.

   9. Promotor podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, který obsahuje sekvenci zahrnující nukleotidy od přibližně -180 do přibližně +3 z tabulky 1 nebo jejich fragmenty, které stále obsahují všechny funkční cis regulační prvky promotorové sekvence nukleotidů od přibližně -180 do přibližně +3, jak zobrazeno na obrázku 6.

   10. Promotor podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, který obsahuje sekvenci zahrnující nukleotidy od přibližně -100 do přibližně +3 z tabulky 1 nebo jejich fragmenty, které stále obsahují všechny funkční cis regulační prvky promotorové sekvence nukleotidů od přibližně -100 do přibližně +3, jak zobrazeno na obrázku 6.

   11. Promotor podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, který obsahuje sekvenci zahrnující nukleotidy od přibližně -80 do přibližně +3 z tabulky 1 nebo jejich fragmenty, které stále obsahují všechny funkční cis regulační prvky promotorové sekvence nukleotidů od přibližně -80 do přibližně +3, jak zobrazeno na obrázku 6.

   12. Promotor podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, který obsahuje sekvenci zahrnující nukleotidy od přibližně -60 do přibližně +3 z tabulky 1 nebo jejich fragmenty, které stále obsahují všechny funkční cis regulační prvky promotorové sekvence nukleotidů od přibližně -60 do přibližně +3, jak zobrazeno na obrázku 6.

   13. Promotor podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, který obsahuje sekvenci zahrnující nukleotidy od přibližně -30 do přibližně +3 z tabulky 1 nebo jejich fragmenty, které stále obsahují všechny funkční cis regulační prvky promotorové sekvence nukleotidů od přibližně -30 do přibližně +3, jak zobrazeno na obrázku 6.

   14. Způsob pro nalezení promotorů cdc25B vyznačující se tím, že obsahuje značení, výhodně radioaktivní značení, promotoru podle jednoho nebo více nároků 1 až 13, a testování (screening) genomových knihoven DNA, výhodně ze savčích buněk, prostřednictvím hybridizace za stringentních podmínek.

   15. Způsob izolace myšího promotoru cdc25B vyznačující se tím, že zahrnuje testování myší genomové fágové knihovny, získané z myšího kmene 129FVJ, se sondou, která obsahuje část sekvence zobrazené • · v tabulce 1 (sekvence s identitikačním číslem 7), výhodně která obsahuje sekvenci s identifikačním číslem 4.

   16. Konstrukt nukleové kyseliny obsahující alespoň jeden promotor podle kteréhokoliv z nároků 1 až 13.

   17. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 16, který navíc obsahuje strukturní gen.

   18. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 16, kde je promotor zařazen v protisměru trankripce (upstream) od strukturního genu.

   19. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 17 nebo 18, kde je mezi promotor a strukturní gen vložena 5' nekódující oblast genu cdc25B mající nukleotidovou sekvenci od +1 do přibližně +167.

   20. Konstrukt nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 16 až 19, kde je promotor podle kteréhokoliv z nároků 1 až 13 kombinován s alespoň jednou další aktivační sekvencí, přičemž tato další aktivační sekvence je vybrána z aktivační sekvence, která je nespecifická, virově specifická, metabolicky specifická, buněčně specifická, specifická pro buněčný cyklus a/nebo závislá na buněčné proliferaci.

   21. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 20, kde další aktivační sekvence je vybrána z promotorů, které jsou aktivovány v endotelových buňkách, peritoneálních buňkách, pleurálních buňkách, epitelových buňkách kůže, buňkách plic, buňkách gastrointestinálního traktu, buňkách ledvin a cest odvádějících moč, svalových buňkách, buňkách pojivových • · ···· ··· ··· • ·· · ···· · · ·· ·· · · · · ·· ···· ····· · ·· ··· ·· ·· ··· ·· ·· tkání, hematopoetických buňkách, makrofázích, lymfocytech, leukemických buňkách, nádorových buňkách nebo gliových buňkách, promotorových sekvencí virů jako je HBV, HCV, HSV, HPV, EBV, HTLV, CMV nebo HIV, promotorových nebo zesilovacích sekvencí, které jsou aktivovány hypoxií, aktivačních sekvencí specifických pro buněčný cyklus genů kódujících cdc25C, cyklin A, cdc2, E2F-1, B-myb a DHFR, a/nebo vazebných sekvencí, jako jsou monomery nebo multimery boxu E Myc, pro transkripční faktory, které se objevují nebo jsou aktivovány způsobem závislým na buněčné proliferaci.

   22. Konstrukt nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 16 až 21, kde je promotor podle kteréhokoliv z nároků 1 až 13 přítomen ve formě, ve které je alespoň jedno vazebné místo pro transkripční faktor mutováno.

   23. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 22, kde je mutován box TATA.

   24. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 22 nebo 23, kde je přítomna kromě strukturního genu další promotorové nebo zesilovací sekvence, která může být aktivována nespecificky, buněčně specificky nebo virově specificky, tetracyklinem a/nebo specificky pro buněčný cyklus, a která aktivuje transkripci alespoň jednoho dalšího strukturního genu, který kóduje alespoň jeden transkripční faktor, který je mutován tak, že se váže k mutovanému vazebnému místu(ům) promotoru podle nároku 22 nebo 23 a aktivuje tento promotor, a/nebo strukturní gen kódující transkripční faktor.

   • ·· ·« ···· ·· *· *··· · · · · · · • ·· · · · · · · ··· ·· ··· · · · · · · · ····· · ·· ··· ·· ·· ··· ·* ··

   25. Konstrukt nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 22 až 24, kde transkripčni faktor je protein (TBP), který se váže na mutovaný box TATA.

   26. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 25 obsahující

   1) promotor podle kteréhokoliv z nároků 1 až 13, včetně boxu TATA, se sekvenci boxu TATA mutovanou na TGTA,

   2) sekvenci GCCACC,

   3) cDNA pro imunoglobulinový signální peptid (nukleotidová sekvence < 63 až > 107),

   4) cDNA pro β-glukuronidázu (nukleotidová sekvence < 93 až > 1982),

   5) promotor genu vWF (nukleotidová sekvence -487 až +247), a

   6) cDNA pro protein vázající se na box TATA (sekvence nukleové kyseliny od 1 do 1001, která je mutována v pozicích nukleové kyseliny 862 (A nahrazeno T), 889 a 890 (GT nahrazeno AC) a 895 (C nahrazeno G).

   27. Konstrukt nukleové kyseliny, který obsahuje promotor a strukturní gen, k jehož 3' konci je přidán jaderný retenční signál (NRS), a další promotor, který aktivuje transkripci genu, který kóduje jaderný exportní faktor (NEF), přičemž tento NEF se váže k mRNA pro NRS, a kde alespoň jeden z promotorů je promotor podle kteréhokoliv z nároků 1 až 13.

   28. Konstrukt nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 20 až 27, kde alespoň jeden promotor nebo zesilovač je nahrazen promotorovou jednotkou responzivni na aktivátor.

   29. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 28, kde promotorová jednotka responzivni na aktivátor obsahuje alespoň následující složky:

   1) jednu nebo více, totožných nebo odlišných, aktivátorových podjednotek, jejichž bazální transkripce je aktivována promotorem nebo zesilovačem, a

   2) promotor responzivni na aktivátor, který je aktivován produktem exprese aktivátorové podjednotky.

   30. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 28 nebo 29 obsahující jako aktivátorovou podjednotku (A)

   1) promotor podle kteréhokoliv z nároků 1 až 13,

   2) jaderný lokalizační signál (NLS) SV40 (SV40 velké T, aminokyseliny 126-132, PKKKRKV),

   3) kyselou transaktivační doménu (TAD) VP16 z PISV-l (aminokyseliny 406 až 488), a

   4) cDNA kódující cytoplazmatickou část glykoproteinu CD4 (aminokyseliny 397-435), a, jako druhou aktivátorovou podjednotku (B),

   1) promotor genu cdc25C (nukleové kyseliny -290 až +121),

   2) jaderný lokalizační signál (NLS) SV40 (SV40 velké T, aminokyseliny 126-132, PKKKRKV),

   3) cDNA pro doménu vázající DNA proteinu Gal4 (aminokyseliny až 147) , a

   4) cDNA pro sekvenci vázající CD4 z proteinu p56 lek (aminokyseliny 1 až 71) a také promotor responzivni na aktivátor obsahující až přibližně 10 kopií vazebné sekvence pro protein vázající Gal4 mající nukleot idovou sekvenci 5'-CGGACAATGTTGACCG-3' a bazální promotor SV40 (nukleotidové sekvence 48 až 5191), a, případně, strukturní gen, výhodně kompletní cDNA, která kóduje aktivní sloučeninu, enzym nebo fúzní protein, který • · · je složen z ligandu a aktivní sloučeniny nebo ligandu enzymu.

   31. Konstrukt nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 17 až 30, kde strukturní gen je gen, který kóduje aktivní sloučeninu, která je vybrána z enzymů, fúzních proteinů, cytokinů, chemokinů, růstových faktorů, receptorů pro cytokiny, receptorů pro chemokiny, receptorů pro růstové faktory, peptidů nebo proteinů majících antiproliferační nebo cytostatický nebo apoptotický účinek, protilátek, protilátkových fragmentů, inhibitorů angiogeneze, peptidových hormonů, koagulačních faktorů, inhibitorů koagulace, fibrinolytických proteinů, peptidů nebo proteinů majících účinek na krevní oběh, proteinů krevní plazmy, antigenů infekčních agens, antigenů buněk, antigenů nádorů, látek vyvolávajících trombózu, proteinů aktivujících komplement, obalových proteinů virů a/nebo ribozymů.

   32. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 31, kde strukturní gen je gen, který kóduje enzym, který štěpí prekurzor léku na lék.

   33. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 31 nebo 32, kde strukturní gen je gen, který kóduje fúzní protein ligand/aktivní sloučenina nebo fúzní protein ligand/enzym, přičemž ligand je vybrán z cytokinů, růstových faktorů, protilátek, protilátkových fragmentů, peptidových hormonů, mediátorů a/nebo buněčných adhezivních proteinů.

   34. Konstrukt nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 16 až 33, kde nukleová kyselina je DNA.

   • ·* ·· ···· ·· ·· «· · • • • • <1 • • • • ·· • • • · · • • • · • · • • · • • • · * 9 • • • · • • • • • • 9 • · · ·· • · • · · « · • ·

   35. Konstrukt nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 16 až 34, kde konstrukt nukleové kyseliny je vložen do vektoru, výhodně plazmidového nebo virového vektoru.

   36. Způsob přípravy konstruktu nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 16 až 35 vyznačující se tím, že obsahuje spojení jednotlivých složek k sobě navzájem.

   37. Buňka, která obsahuje konstrukt nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 16 až 35.

   38. Použití konstruktu nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 16 až 35 nebo buňky podle nároku 37 pro přípravu léčivého přípravku pro léčení nemoci, která je vybrána z nádorových nemocí, leukémií, autoimunitních nemocí, alergií, artritid, zánětů, orgánových rejekcí, reakcí štěpu proti hostiteli, poruch krevní koagulace, nemocí oběhového systému, anémie, infekcí, hormonálních poruch a/nebo poškození CNS.

   39. Použití buňky podle nároku 38, kde buňka je endotelová buňka.

   1/8

   Složka a')

   Promotorova sekvence I promotor cdc25B, ve kterém je alespoň jedno vazebné místo pro transkripčni faktor mutováno

   Složka c)

   Promotorova sekvence II nebo zesilovací sekvence II