CZ80499A3 - Způsob modifikace polypeptidů - Google Patents
Způsob modifikace polypeptidů Download PDFInfo
- Publication number
- CZ80499A3 CZ80499A3 CZ1999804A CZ80499A CZ80499A3 CZ 80499 A3 CZ80499 A3 CZ 80499A3 CZ 1999804 A CZ1999804 A CZ 1999804A CZ 80499 A CZ80499 A CZ 80499A CZ 80499 A3 CZ80499 A3 CZ 80499A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- polypeptide
- sequence
- methionine
- indicator sequence
- purification
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 85
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 59
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 54
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 53
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 10
- 230000004048 modification Effects 0.000 title description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 title description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 28
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 24
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims abstract description 19
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims abstract description 19
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 13
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 13
- 238000002715 modification method Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 18
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 claims description 13
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 10
- 235000006109 methionine Nutrition 0.000 claims description 9
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 8
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 6
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 4
- -1 zalin Chemical class 0.000 claims description 4
- 150000003462 sulfoxides Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 claims description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 2
- 150000002742 methionines Chemical class 0.000 claims 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims 1
- 125000003375 sulfoxide group Chemical group 0.000 claims 1
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000463 material Substances 0.000 description 10
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 9
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 8
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- QEFRNWWLZKMPFJ-ZXPFJRLXSA-N L-methionine (R)-S-oxide Chemical compound C[S@@](=O)CC[C@H]([NH3+])C([O-])=O QEFRNWWLZKMPFJ-ZXPFJRLXSA-N 0.000 description 6
- QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N L-methionine sulphoxide Natural products CS(=O)CCC(N)C(O)=O QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 6
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 4
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 4
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 4
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- AQRLNPVMDITEJU-UHFFFAOYSA-N triethylsilane Chemical compound CC[SiH](CC)CC AQRLNPVMDITEJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000224017 Plasmodium berghei Species 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- PCMORTLOPMLEFB-ONEGZZNKSA-N sinapic acid Chemical compound COC1=CC(\C=C\C(O)=O)=CC(OC)=C1O PCMORTLOPMLEFB-ONEGZZNKSA-N 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000010183 spectrum analysis Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-N thioglycolic acid Chemical compound OC(=O)CS CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000208199 Buxus sempervirens Species 0.000 description 1
- 101100067721 Caenorhabditis elegans gly-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100315624 Caenorhabditis elegans tyr-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- QEFRNWWLZKMPFJ-YGVKFDHGSA-N L-methionine (R)-S-oxide group Chemical group N[C@@H](CCS(=O)C)C(=O)O QEFRNWWLZKMPFJ-YGVKFDHGSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003875 Wang resin Substances 0.000 description 1
- NERFNHBZJXXFGY-UHFFFAOYSA-N [4-[(4-methylphenyl)methoxy]phenyl]methanol Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1COC1=CC=C(CO)C=C1 NERFNHBZJXXFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 150000003862 amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 108010063086 avidin-agarose Proteins 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000013058 crude material Substances 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 150000002411 histidines Chemical class 0.000 description 1
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 150000002730 mercury Chemical class 0.000 description 1
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 239000013014 purified material Substances 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- PCMORTLOPMLEFB-UHFFFAOYSA-N sinapinic acid Natural products COC1=CC(C=CC(O)=O)=CC(OC)=C1O PCMORTLOPMLEFB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Způsob modifikace polypeptidů pro usnadnění jejich čištění, který zahrnuje vložení alespoň jedné specificky štěpitelné aminokyseliny na konec polypeptidového řetězce během jeho syntézy a ochranu téže aminokyseliny /aminokyselin/ v polypeptidů, pokud se v něm vyskytuje /vyskytují/, vůči štěpení k umožnění specifického štěpení přesně v místě specificky štěpitelné aminokyseliny/aminokyselin/. Způsob výroby vyčištěných polypeptidů za použití uvedeného způsobu modifikace.
Description
Předkládaný vynález se týká způsobu modifikace pro usnadnění přípravy vyčištěných polypeptidů a způsobu čištění, využívajícího této modifikační metody.
Dosavadní stav techniky
Během uplynulých let byla široce zdokonalena syntéza peptidů v pevné fázi, využívající metodu t-Boc nebo F-moc. Důmyslné syntezní protokoly dovolily přípravu polypeptidů, majících přibližně 100 či více aminokyselinových zbytků (P. Chong, C. Sia, E. Tam, A. Kandil, M. Klein, International Journal of Peptide and Protein Research 41, 21-27, 1993; L.R. Haaheim, J.P. Maskell, P. Mascagni, A.R. Coates, Scandinavian Journal of Immunology 34, 341-350, 1991; M.A. Rogerro se spol., Molecular Immunology 32, 1301-1309, 1995; D.D. Smith se spol., International Journal of Peptide and Protein Research 44, 183-191, 1994. Avšak nekompletní navázání a ukončení řetězce, k čemuž může dojít ve kterémkoli cyklu prodlužování peptidu, vede k vytvoření neúplných a zkrácených sekvencí.
Tento jev a možný výskyt vedlejších reakcí, pozorovaných zejména během konečného odštěpování z pryskyřice, komplikuje přímé isolování požadovaného peptidu od ostatních nečistot. Čištění dlouhých syntetických polypeptidů je hlavním problémem při výrobě produktů vhodných pro biologická studia a pro použití u lidí a u zvířat, kde je závazná vysoká úroveň čistoty.
• · • · • · · · • 9 9 · ··· 9·· · · 9 9
9 99 99
Konkrétně, pokud jsou syntetizovány sekvence obsahující 30 či více aminokyselinových zbytků, mohou být rozdíly ve fyzikálních vlastnostech jako je velikost, náboj a hydrofobnost u požadovaného produktu a peptidových nečistot s vynechanou sekvencí, po zkrácení nebo modifikaci příliš malé, než aby umožnily postačující vyčištění. Navíc jsou moderní výkonné separační techniky, jako HPLC na reversní fázi, často omezeny nízkými výtěžky a malým vzorkovým injikovatelným objemem, takže jsou zdlouhavé a nákladné.
K obejití tohoto omezení již byly testovány různé přístupy. Provedena byla biotinylace zbytku 153 synetického proteinu IL-1 (T.J. Lobl, M.J. Deibel, A.W. Yem, Analytical Biochemistry 170, 502-511, 1988) a zbytku 99 proteázového syntetického proteinu SIV (A.G. Tomasselli se spol., Journal of Biological Chemistry 267, 10232-10237, 1992) a biotinylované řetězce byly isolovány na sloupci avidin-agarózy.
Balí se spoluautory (H.L. Balí, P. Mascagni, International Journal of Peptide and Protein Research 40, 370-379, 1992) nedávno navrhl postup čištění, založený na přidání reversíbilní chránící skupiny, poskytující lipofilní, kyselé nebo zásadité funkce poslednímu aminokyselinovému zbytku peptidového řetězce.
Specifičtější chromatografické metody byly optimalizovány využitím přítomnosti zvláštních zbytků v syntetizovaných sekvencích. Například peptidy obsahující cystein byly čištěny reakcí s imobilizovanými deriváty rtuti (D.E. Krieger, B.W. Erickson, R.B. Merrifield, Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A 73, 3160-3164,
1976) nebo aktivovanými thioly (G. Lindeberg, J. Tengborn, H. bennich, U.J. Ragnarsson, Chromatography 156, 366-369, 1978) a pro čištěni peptidů obsahujících histidin nebo tryptofan (G. Lindeberg, H. Bennich, A. Engstrom, International Journal of Peptide and Protein Research 38, 253-259, 1991) byla úspěšně použita afinitní chromatografie s imobilizovaným kovovým iontem (IMAC, immobilized metal ion affinity chromatography) (J. Porath, J. Carlsson, I. Olsson, G. Belfrage, Nátuře 258, 598-599, 1975).
U rekombinantních bílkovin byly záměrně přidány histidinové zakončení, B-buněčný epitop nebo GST částice. Tato zakončení by následně mohla být použita při afinitní chromatografii.
Obecně musí být protokol (podrobný postup) čištění, které je založeno na fyzikálně chemických vlastnostech syntetizovaného peptidu, optimalizován pro každý jednotlivý vzorek, což je časově náročný a drahý výkon. Z těchto důvodů bylo vyvinuto velké množství technik k umožnění obecné použitelnosti procedur čištění (G. Barany, R.B. Merrifield, Peptides, analysis, synthesis, biology 1-163-165, Academie Press, London 1980). Ovšem až dosud popsané metody nejsou zcela uspokojivé, neboť jsou stále časově náročné a/nebo zanechávají v konečně vyčištěných produktech kovalentně derivatizované peptidy, což může vyvolávat určité obavy vzhledem k jejich biologickým a fyzikálně chemickým vlastnostem a jejich konečnému použití u zvířat a u lidí.
Podstata vynálezu
Předmětem přítomného vynálezu je tedy umožnění zlepšení • · • «
• · · · · · • · • · · · známých metod poskytnutím způsobu modifikace polypeptidů pro usnadnění jejich čištění a postupu čištění polypeptidů, přičemž způsob i postup jsou universálně použitelné, jejich výsledkem je vysoký výnos a snadno se provádějí.
Tohoto předmětu bylo podle vynálezu dosaženo způsobem modifikace, který zahrnuje vložení alespoň jedné specificky štěpitelné aminokyseliny na konec polypeptidového řetězce během jeho syntézy a ochranu téže aminokyseliny (aminokyselin) v polypeptidů, pokud se v něm vyskytuje (vyskytují), vůči štěpení, k umožnění specifického štěpení přesně v místě specificky štěpitelné aminokyseliny (aminokyselin).
Postup čištění, používající tento způsob modifikace, zahrnuje kroky:
a) syntetizování požadovaného polypeptidů;
b) přidání alespoň jedné specificky štěpitelné aminokyseliny na konec polypeptidů za současného chránění téže aminokyseliny (aminokyselin) v polypeptidů, pokud se v něm vyskytuje (vyskytují), vůči štěpení;
c) prodloužení polypeptidů a k němu přidané aminokyseliny (aminokyselin) indikační (tag) sekvencí k získání prodlouženého polypeptidů;
d) vyčištění prodlouženého polypeptidů pomocí metod čištění specifických vůči indikační sekvenci; a
e) odstranění indikační sekvence a přídavné aminokyseliny (aminokyselin) z prodlouženého polypeptidů pomocí metody štěpení, specifické vzhledem k přidané aminokyselině (aminokyselinám), k získání vyčištěného polypeptidů.
• ·
- 5 Specifickou metodou čištění je s výhodou metoda chemického štěpení, jak zde bude dále objasněno.
Způsob a postup podle vynálezu jsou použitelné pro každý polypeptid, neboť nejsou závislé na jeho aminokyselinovém složeni. Nadto jsou v určitých upřednostňovaných ztělesněních způsob a postup dle vynálezu finančně nenáročné a vysoce účinné.
Takovým ztělesněním je použiti methioninového zbytku jako přídavné aminokyseliny před přidáním afinitní indikační sekvence (například sekvence šesti histidinových zbytků nebo jiných sloučenin usnadňujících čištění). Po krocích vhodného čištění, jako je afinitní chromatografie specifická vzhledem k indikační sekvenci, může být histidinová indikační sekvence odštěpena digescí CNBr, finančně nenáročným a velmi účinným postupem, který specificky odštěpuje v místě methioninového zbytku.
V upřednostňovaném ztělesnění tedy indikační sekvence zahrnuje alespoň sekvenci hstidinových zbytků, s výhodou šesti nebo více, a methioninový zbytek. Volitelně lze začlenit jednu či více jiných aminokyselin.
Pokud sekvence požadovaného polypeptidu obsahuje methioninové zbytky, mohly by se stát při odstraňování indikační sekvence předmětem štěpení CNBr. Ovšem podle předkládaného vynálezu tomu lze zabránit použitím modofikovaných methioninových zbytků při syntéze polypeptidu. Takovým modifikovaným methioninovým zbytkem je například methioninsulfoxid.
♦ · · · · • · ·
V alternativním ztělesněni způsobu a postupu podle vynálezu je indikační sekvencí objemná molekula, jako polyethylenglykol. V takovém případě je způsobem čištění, specifickým vůči indikační sekvenci, gelová filtrační chromatografie.
Způsob a postup podle vynálezu jsou stejně dobře použitelné i pro polypeptidy vyráběné postupy rekombinace DNA. V upřednostňovaném ztělesnění jsou methioninové zbytky, původně přítomné v požadovaném polypeptidu, ne však v indikační sekvenci, chráněny proti štěpení, například substitucí jinou aminokyselinou jako je valin či glycin, nebo jsou odstraněny.
V této přihlášce vynálezu je indikační sekvence používána k označení odstranitelné molekuly, přidané k požadovanému polypeptidu během jeho syntézy nebo po ní. Indikační sekvencí může být aminokyselinová sekvence přidaná během syntézy polypeptidu, ale může to být také jiná molekula, kterou lze snadno vyčistit ze směsi složek. Příkladem druhé z možností je polyethylenglykol (PEG).
V této přihlášce vynálezu jsou výrazy peptid, a polypeptid používány zaměnitelně.
Následující příklad je uveden k dokreslení vynálezu. Je jasné, že pro odborníka bude tento příklad poskytovat dostatečný návod k rozvinutí dalších způsobů, spadajících do rozsahu vynálezu. V příkladu je uveden obecně použitelný postup čištění, založený na kombinaci 1) protokolu ukončení (capping), 2) použití methioninsulfoxidu jako chráněného methioninového zbytku během syntézy nativní sekvence a 3) • · · · • · · · · · • · · · · • · · • · « · • · · ········ ·· • · · · • · · · · • · · · · ♦ · · · · · · » • · · • · · · · prodloužení požadovaného peptidu methioninem a dvěma glycinovými zbytky a konečnou sekvencí šesti histidinů, které budou použity pro afinitní chromatografii. Po postačujících krocích čištění bylo provedeno odštěpení histidinové indikační sekvence bromkyanem (CNBr) a následně konečná redukce methioninsulfoxidu na methionin. Tato jednoduchá, přímá strategie umožnila vyčištění polypeptidu o 69 aminokyselinových zbytcích PbCS 242-310 pokrývajícího C-koncovou oblast CS proteinu Plasmodia berghei, do homogenity, s vysokým výtěžkem a v krátké době za použití běžných chromatografických postupů.
Popis obrázků na výkresech
Obrázek 1 znázorňuje hmotnostní spektrum surového peptidu.
Obrázek 2 znázorňuje chromatografický profil čištění pomocí IMAC (afinitní chromatografii s immobilizovaným kovovým iontem).
Obrázek 3 znázorňuje hmotnostní spektrum vyčištěného peptidu.
Obrázek 4 znázorňuje chromatografické profily surového a vyčištěného peptidu.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
1. Materiál a metody
1.1. Reagencie a rozpouštědla
Chemikálie a rozpouštědla, použité pro syntézu peptidu, • 0 • 00 • · · 0 · · · 0 · · · · • · 0 0» · 0 0 0
0 0 0 0 0 · 00 0 000 • 0 · 0 · 0 0 byly získány od firem Calbiochem-Novabiochem AG (Láufelfingen, Švýcarsko) a Fluka (Buchs, Švýcarsko).
1.2. Syntéza a analýza peptidu
K dokreslení předkládaného vynálezu byl polypeptid, označený jako PbCS 242-310, pokrývající C-koncovou oblast CS proteinu Plasmodia berghei (D.E. Lanař, Mol. Biochem. Parasitol. 39, 151-154, 1990), chemicky syntetizován za použití metody F-Moc v pevné fázi na peptidovém syntetizátoru Applied Biosystems 431A. Polypeptid byl připraven na F-moc-Ser(t-butyl)-p-alkoxybenzylalkoholové pryskyřici (Wangově pryskyřici) se stupněm substituce 0,43 mmol/g v 0,1 mmolové škále. Syntéza byla prováděna za použití pětinásobného přebytku aminokyselinových derivátů F-moc, DDCI a HOBt jako aktivačních činidel, 60 minutového vazebného času pro prvních 34 aminokyselin a dvojnásobného vazebného času pro zbývající zbytky. Ukončení (capping) s acetanhydridem bylo prováděno na konci každého cyklu. Chránící skupiny vedlejších řetězců zahrnovaly: pentamethylchromansulfonylovou skupinu pro Arg; -S-t-butyl pro Cys; trifenylmethylovou skupinu pro Asn, Gin a His; t-butoxykarbonylovou skupinu pro Lys a Trp; t-butylovou skupinu pro Asp, Clu, Ser, Thr a Tyr. Met 306 byl vkládán jako Fmoc-Met-sulfoxid k ochraně proti pozdějšímu štěpení CNBr.
Poté byl peptid prodloužen N-koncově sekvencí His-His-His-His-His-His-Gly-Gly-Met za stejných podmínek jako byly popsány výše, ale po navázání druhého Gly bylo vynecháno ukončení (capping). Takto získaný polypeptid je označován jako His tag PbCS 242-310.
• · · · · · · · · · · • · · · ♦ · ♦ · · • 4 4 · · 4 « ······ • 4 · 4 4 4 4 ···· 4··· ·» 9 99 ··
Surový peptid byl získán působením 2,5% H20, 5% triethylsilanu v TFA (kyselině trifluoroctové) na soustavu peptid-pryskyřice po dobu 2 hodin při laboratorní teplotě. Syntetický peptid byl čištěn kapalinovou chromatogragií na sloupci Sephadexu G-50 o velikosti 70 x 2,5 cm za použití soustavy 50% kyselina octová/H20 jako mobilní fáze. Čistota peptidu byla analyzována pomoci HPLC na reversní fázi za použití sloupce C4 W-Porex 250 x 4, 6 mm a 10-90% CH3CN gradientu v 0,1% TFA/H2O během 60 minut a rychlosti toku 1,0 ml/min. Složení aminokyselin bylo stanovováno podle Knechta a Changa (R. Knecht, J.Y Chang, Analyt. Chem. 58, 2375-2379,
1986) .
1.3. Afinitní chromatografie s imobilizovaným kovovým iontem (IMAC) a štěpení CNBr
Polypeptid byl nejprve čištěn afinitní chromatografii na základě histidinové indikační skupiny. Později byla indikační skupina odstraněna CNBr.
Ni-sloupec (Quiagen lne., Chatsworth, USA) byl připraven s Ni-NTA agarosovou pryskyřicí a ekvilibrován pufrem A (8 mol. I-1 močovina, 0,1 mol. I'1 Na2HPO4, 0,01 mol.l 1 Tris, pH upraveno na 8,0 pomocí H3PO4) . Gelovou filtrací čištěný polypeptid His tag PbCS 242-310 byl rozpuštěn v pufru A a nanesen na sloupec rychlostí toku 15 ml/hodinu. Sloupec byl promyt pufrem A (rychlost toku 15 ml/hod.) a pufrem B (8 mol.l-1 močovina, 0,1 mol.l 1 Na2HPO4, 0,01 mol.l 1 Tris, pH upraveno na 6,3 pomocí H3PO4 ), obsahujícím 50 mmol.1 1 imidazol při rychlosti toku 30 ml/hodinu. Polypeptid His-tag PbCS 242-310 byl poté eluován (rychlost toku 30 ml/hod.) • » ··· · ·· ·* • ···· ···· • · ·· ·· « ·«···· • · · · · 9 9
9999999 ·· 9 99 99 pufrem B, obsahujícím 250 mmol.l_1 imidazol.
Eluovaný materiál byl odsolen na sloupci Sephadex G25 (50 x 2,5 cm, za použití soustavy 50% kys. octová/H20 jako mobilní fáze) a lyofilizován. Pro odstranění histidinové indikační sekvence byl takto získaný materiál ovlivňován po dobu 8 hodin na reversní fázi při koncentraci 20 mg/ml v 70% TFA za použití stonásobného molárního přebytku CNBr.
Takto naštěpený materiál byl lyofilizován, rozpuštěn v pufru A a opět nanesen na sloupec Ni-NTA agarosy. Histidinová indikační sekvence je zachycena na Ni-sloupci a eluent ze sloupce obsahuje polypeptid PbCS 242-310. Eluent ze sloupce byl odsolen na sloupci Sephadex G25(50 x 2,5 cm, za použití soustavy 50% kys. octová/H20 jako mobilní fáze) a lyofilizován.
1.4. Redukce Met-sulfoxidu
Materiál ovlivněný CNBr a vyčištěný IMAC byl při pH 8,0 vystaven působení 10% merkaptoethanolu k přeměně methioninsulfoxidu na methionin a Cys-S-t-butylu na Cys a poté byl čištěn gelovou filtrací (sloupec Sephadex G25, 250 x 4,4 mm) .
1.5. Hmotnostní spektrometrie
Hmotnostní spektrografická analýza byla prováděna za použití hmotnostního spektrometru s průletovým analyzátorem LDI 1700 Mass Monitor (Linear Scientific lne., Reno, NV, USA), vyhodnocujícího dobu letu. Pět mikrolitrů roztoku polypeptidů o koncentraci 1 mg/ml bylo smíseno s 5 μΐ φφ ·· Φ· • φφφ ♦ · · 9 • · Φ Φ φ Φ • Φ φφφ
ΦΦΦΦΦΦΦΦ ΦΦ Φ
Φ Φ Φ Φ ΦΦΦ Φ Φ
Φ Φ kyseliny trans-3,5-dimethoxy-4-hydroxy-skořicové (sinapinová kyselina) o koncentraci 20 mg/ml v acetonitrilu (Linear Scientific lne., Reno, NV, USA) a 1 μΐ této směsi byl nanesen na špičku sondy hmotnostního spektrometru a vysušen jemným vakuem. Vzorek byl ozářen 3-ns laserovými pulsy (vlnová délka 337 nm) z N2-laseru. Doba průletu byla měřena digitálním osciloskopem (serie 9304; Le Croy Research Systems, Corp., Spring Valley, NY, USA), což bylo převedeno na hmotnostní spektrum za použití kalibračního standardu Peptide MALDITOFMS CAlibration Standard (Linear Scientific lne., Reno, NV, USA).
2. Výsledky
Polypeptid PbCS 242-310 o 69 aminokyselinových zbytcích odpovídá C-koncové oblasti CS bílkoviny P. berghei (D.E. Lanař, Mol. Biochem. Parasitol. 39, 151-154, 1990).
Syntéza His-tagPbCS242-310 byla provedena za použití automatického protokolu postupu, v němž byl krok ukončení (capping) začleněn po každém navázání, jak je popsáno v oddílu Materiál a metody.
Působením soustavy H2O/triethylsilan/TFA na 600 mg odpovídající pryskyřice s peptidem bylo získáno více než 150 mg surového polypeptidu.
Hmotnostní spektrální analýza surového polypeptidu ukazovala na přítomnost požadované látky s molekulovou hmotností (MW) 9301 mezi jinými nízkomolekulárními složkami (obr.l).
mg surového polypeptidu bylo čištěno afinitní ·
Φ* 99 · · 9 · 9 · 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 « ·····«
9 9 9 9 9 9 chromatograf ií s imobilizovaným kovovým iontem (IMAC) na sloupci Ní-NTA agarosy o objemu 25 ml (obr. 2). Po odsolení kapalinovou chromatografií oddělující látky o určité velikosti molekul bylo získáno 35 mg His-tag PbCS242-310”. Měření absorbance eluovaného materiálu (35 mg) při 280 nm a veškerého průtoku (55 mg) ukázalo, že výtěžek čistícího postupu byl 100%.
Materiál vyčištěný na Ni-sloupci byl poté štěpen CNBr k odstranění indikační sekvence šesti zbytků His.
Materiál po štěpení byl pak znovu nanesen na Ni-sloupec k odstranění nerozštěpeného peptidu a vystaven působení 10% merkaptoethanolu při pH 8,0 k redukování methioninsuifoxidu zavedeného během syntézy a chránících skupin zbytků cysteinu. Úplná redukce methioninsuifoxidu byla potvrzena opětným vystavením materiálu působení CNBr a ověřením účinnosti štěpení hmotnostní spektrografií.
Výsledkem dalšího čištění chromatografií oddělující určitou velikost molekul bylo 19 mg vyčištěného PbCS 242-310.
Na obrázku 3 je znázorněno hmotnostní spektrum získaného srovnány analytické vyčištěného peptidu. běhů je způsoben materiálu a na obrázku 4 jsou chromatografické profily surového a Rozdíl v retenčních časech dvou nepřítomností vysoce nabité histidinové indikační skupiny ve vyčištěném materiálu. Bylo zjištěno, že vyčištěný PbCS 242-310 vykazuje asi 95% čistotu na základě integrace ploch maxim (plků) při analýze při- vlnové délce 214 nm. Aminokyselinové složení CS polypeptidu bylo souhlasné se • · »·Μ
·0 0 0 0 0 · · • 0 0 · • · 0 0 · 0 0 0 0 00000000 · · složením, předpokládaným u tohoto peptidu (tabulka 1.)
Tabulka 1: Analýza aminokyselin
| aminokyselina3 | zbytky na mol PbCS 242-310 | ||
| očekávané | pozorované b | S.D.C | |
| Asp + Asn | 10 | 9,4 | 1,0 |
| Glu + Gin | 9 | 9,1 | 0,9 |
| Ser | 7 | 8,4 | 2,1 |
| Thr | 4 | 2,2 | CO o |
| Gly | 3 | 3,1 | 1,0 |
| Ala | 2 | 3,4 | 1,1 |
| Arg | 4 | 4,8 | 0,9 |
| Pro | 1 | 1,1 | 0,2 |
| Val | 3 | 2,9 | 0, 3 |
| Met | 1 | 1,0 | 0,1 |
| Ile | 7 | 6, 3 | 0,7 |
| Leu | 3 | 3,3 | 0,2 |
| Phe | 1 | 1,1 | 0,1 |
| Lys | 8 | 6,7 | 1,0 |
| His | 0 | - | - |
| Tyr | 1 | 1,2 | 0,2 |
a Cys a Trp nebyly stanovovány b střední hodnota z pěti stanovení c standardní odchylka
3. Diskuse
Chemická syntéza bioaktivních peptidů se stala rozšířenou a rychle se rozrůstající technikou díky automatizaci a účinným postupům pro sestavování řetězce. Pro většinu aplikací musí být surový syntetický produkt čištěn k odstranění zbývajících reagencií, chybějících sekvencí a chemicky modifikovaných peptidových typů. To se obvykle provádí pomocí HPLC na reversní fázi za použití soustavy • · *· »·*·
- ±4 ~ ·**· ·· · · « · · • * · · · 9 9 9 9 • · ·· *· 9 999999 • · 9 9 9 9 9 ···· 9999 99 · ·« ·« vodná kyselina trifluorooctová/acetonitril jako mobilní fáze. Ačkoli se peptidová syntéza stala vysoce automatizovanou, čištění je stále převážně manuálním procesem a tedy postupem časově náročným, nákladným a ne příliš účinným.
Příklad 1 ukázal, že způsob podle vynálezu vede k vysoké čistotě jak vyplývá z obrázku 3 a je snadno proveditelný a univerzálně použitelný.
Problém specifického štěpeni, daný přítomnosti methioninovýchzbytkův požadované sekvenci, tak jako ve zde uváděném příkladu, lze podle vynálezu snadno obejít použitím methioninsulfoxidových zbytků, které jsou odolné vůči působení CNBr a jsou kvantitativně redukovatelné kyselinou merkaptooctovou (R.A. Houghten, C.H. Li, Methods in enzymology 91, 549-559, 1991).
Z výše uvedeného vyplývá, že postup podle vynálezu byl úspěšně použit k vyčištění polypeptidu PbCS 242-310”, řetězce o 69 aminokyselinových zbytcích odpovídajícího C-koncové oblasti CS bílkoviny P. berghei (cit. 12). Ačkoli v surovém materiálu bylo po odštěpení z pryskyřice přítomno mnoho peptidových nečistot, jak je ukázáno hmotnostní spektrální analýzou uváděnou na obrázku 1, autoři vynálezu byli schopni vyčistit cílový peptid do homogenity s vysokým výtěžkem a v poměrně krátké době. Úplný protokol čištění poskytl 19 mg vyčištěného PbCS 242-310, odpovídajícího přibližně 20 % surového materiálu.
Závěrem zde bylo ukázáno, že štěpení CNBR a ochrana příslušných methioninových zbytků jako sulfoxidy ve spojení s účinnou afínítní indikační sekvencí může představovat účinný
ΦΦ φφ φ φ · · φ φ φ ΦΦΦ φ φφφφ φ φ · · φφφφφφφφ φφ φφ φφφφ φ φ ♦ φφφφ • φφφφ φ φ φφφ φφφ φ φ φ * φ · φ φ a obecný prostředek k čištění chemicky syntetizovaných peptidů s dlouhým řetězcem.
Zastupuje:
φφ φφφφ φ φ φ « φ φ φφφ
Φ φ φφφφ φφφφ rv
Claims (7)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob modifikace polypeptidů k usnadfení jejich vyčištění, přičemž tento způsob modifikace zahrnuje vložení nejméně jednoho specificky odštěpitelného methioninu a identifikační sekvence na konec polypeptidového řetězce během jeho syntézy a ochranu methioninových zbytků v polypeptidu, pokud jsou přítomné, vůči odštěpení jejich chráněním sulfoxidovou skupinou, vyznačující se tím, že indikační sekvencí je histidinová identifikační sekvence nebo objemnější molekula jako je polyethylenglykol.
- 2. Způsob výroby vyčištěných polypeptidů za použití způsobu modifikace podle nároku 1, kdy způsob výroby zahrnuje kroky:a) syntetizování požadovaného polypeptidu;b) přidání alespoň jednoho specificky odštěpitelného methioninu na konec polypeptidu za současné ochrany methioninu (methioninů) v polypeptidu, pokud se v něm vyskytuje (vyskytují), vůči štěpení chráněním sulfoxidovou skupinou;c) prodloužení polypeptidu a k němu přidaného methioninu (methioninů) indikační sekvencí k získání prodlouženého polypeptidu;d) vyčištění prodlouženého polypeptidu pomocí metody čištění specifické vůči indikační sekvenci; ae) odstranění indikační sekvence a přídavného methioninu (methioninů) z prodlouženého polypeptidu pomocí metody štěpení, založené na použití bromkyanu k získání vyčištěného polypeptidu, vyznačující se tím, že indikační sekvencí je histidinová indikační sekvence nebo objemnější molekula, jako je polyethylenglykol.«· *· Φ· • φ · · φ φ • · · · • φ · φ · • · · φ φφφφφφφφ φφ φ
- 3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že se histidinová indikační sekvence skládá z His-His-His-His-His-His-Gly-Gly-.
- 4. Způsob podle nároků 2 nebo 3, vyznačující se tím, že metodou čištění, specifickou vůči indikační sekvenci, je chromatografie založená na afinitě vůči indikační sekvenci.
- 5. Způsob podle nároku 2, vyzná tím, že indikační sekvencí je objemná polyethylenglykol a metodou čištění, indikační sekvenci, je gelová filtrace.čující se molekula jako je specifickou vůči rekombinace polypeptidu
- 6. Způsob podle nároků 2 až 5, vyznačující se tím, že požadovaný polypeptid je vyráběn technikami DNA v živoucím hostiteli a methioniny v jsou namísto chránění sulfoxidovou skupinou odstraněny nebo nahraženy jinou aminokyselinou, jako je zalin, glycin nebo modifikovaný methionin.
- 7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že živoucím hostitelem je eukaryotický hostitel nebo prokaryotický hostitel, jako Escherichia coli.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ1999804A CZ80499A3 (cs) | 1997-09-09 | 1997-09-09 | Způsob modifikace polypeptidů |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ1999804A CZ80499A3 (cs) | 1997-09-09 | 1997-09-09 | Způsob modifikace polypeptidů |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ80499A3 true CZ80499A3 (cs) | 2000-01-12 |
Family
ID=5462285
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ1999804A CZ80499A3 (cs) | 1997-09-09 | 1997-09-09 | Způsob modifikace polypeptidů |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ80499A3 (cs) |
-
1997
- 1997-09-09 CZ CZ1999804A patent/CZ80499A3/cs unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR100371824B1 (ko) | 정확하게연결된시스틴브릿지를갖는인슐린의수득방법 | |
| AU2002229603B2 (en) | Process for folding chemically synthesized polypeptides | |
| JP7360397B2 (ja) | グルカゴンペプチドの製造 | |
| EP2057183A2 (en) | High purity peptides | |
| Roggero et al. | A simple and rapid procedure for the purification of synthetic polypeptides by a combination of affinity chromatography and methionine chemistry | |
| Decostaire et al. | Solid phase oxime ligations for the iterative synthesis of polypeptide conjugates | |
| RU2182155C2 (ru) | Получение очищенных (поли)пептидов | |
| CZ80499A3 (cs) | Způsob modifikace polypeptidů | |
| Pak et al. | Conformation analysis of Ile-Ala-Val-Pro peptide and its derivatives by circular dichroism | |
| MXPA99002208A (en) | Preparation of purified (poly)peptides | |
| DK2976325T3 (en) | SYNTHESIS OF PEPTIDE PRODUCTS CONTAINING CYCLIC IMID | |
| HUE034308T2 (en) | Preparation of hydantoin-containing peptide products | |
| Van de Vijver et al. | Application of an omonasteine ligation strategy for the total chemical synthesis of the BRD7 bromodomain | |
| Sabatier | Chemical synthesis and characterization of small proteins: example of scorpion toxins | |
| HK1022322B (en) | Preparation of purified (poly) peptides | |
| Scolaro et al. | Solid‐phase synthesis of bombesin by continuous flow procedure using Fmoc‐amino acids | |
| Moss et al. | Mapping tertiary interactions in protein folding reactions: a novel mass spectrometry-and chemical synthesis-based approach | |
| Aznar‐Derunes et al. | Study of the yeast Saccharomyces cerevisiae F1FO‐ATPase ε‐subunit | |
| Čeřovský et al. | Combined solid‐phase/solution synthesis of large ribonuclease AC‐terminal peptides containing a non‐natural proline analog |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic |