CZ92499A3

CZ92499A3 - Kompozice maziva a způsob jejího použití

Info

Publication number: CZ92499A3
Application number: CZ99924A
Authority: CZ
Inventors: Kelvin Spencer Chiddick
Original assignee: Kelsan Technologies Corp.
Priority date: 1996-09-25
Filing date: 1997-09-11
Publication date: 1999-10-13
Also published as: DE69734671D1; JP2008144183A; AU736427B2; TR199900682T2; WO1998013445A1; AU4196097A; CA2186419C; KR100494878B1; EP0946693B1; EP0946693A1; ES2253783T3; BR9711553A; CA2186419A1; DE69734671T2; ATE310070T1; US6136757A; KR20000048631A; JP4642944B2; CZ297890B6; JP2001501994A

Description

Mikročástice ve vodě rozpustného materiálu pro použití při t rapi i nebo diagnose, inhalační zařízení obsahující tyto část ce a použití terapeutického činidla

ObJast___techni ky

Tento vynález se týká m,kročásl1 c ve vodě rozpustného materiálu pro použil! při terapii nebo diagnose. inhalačního zařízeni obsahujícího tyto částice a použil! terapeutického činidla ve forms mikročástic pro výrobu léčivého přípravku Tento vynález se zvláště týká Prostředku pro dodáváni diagnostických a terapeutických činidel a biotechnologických produktů „čelně léčiv na bázi rDNA technologie.

vadniI stay_techn_i ky

Nejobvykleji používané cesty podávání terapeutických činidel, orální nebo gastrointestinální , jsou většinou nepoužitelné Po peptidy a proteiny pocházející z rDNA průmyslu. Citlivost normálních peptidů a proteinů získaných z krve na kyše 1é/proteo lytické prostředí střeva většinou znemožňuje podávání touto cestou. Logickým způsobem podávání je intravenózní, ale to je problematické u pacientů se špatnou snášenlivostí při chronickém Podávání a kvůli velmi často rychlému vyčištění při prvním projití játry, což vede k krátké životnosti.

Nedávno byl zkoumán potenciál dodávání mukózním transfer rem. Zatímco nazálni dodávání bylo intenzivně zkoumáno, potenciální dodávání peptidů pulmonárními dýchacími cestami je vět šinou neprobádáno

Alveolární buňky ve své podstatě zajišťují efektivní bariéru. Avšak i projití materiálu do alveolární oblasti předsta vuje významnou překážku tohoto způsobu podávání. Existuje opt i mální velikost částic, které dosáhnou nejnižších oblastí pulmonárních dýchacích cest, tj. aerodynamický průměr <5 jim. Částice nad tuto velikost budou zachyceny v horních cestách dýchacích.

takže ve standardních komerčních suspenzních přípravcích pouze 10 až 30 % Částic z těch, které jsou normálně polydispergovány v suspenzích, dosáhne dolních cest dýchacích.

Běžné přípravu erosolů léčiv pro inhalaci zahrnují rozprašování, inhalátory s měřeným dávkováním a systémy se suchým práškem. Rozprašování vodných roztoků vyžaduje velké objemy léčiv a zahrnuje použití objemných a nepřenosných zařízení.

Nejobvyklejším způsobem podávání do plic je zařízení na bázi těkavého hnacího činidla, obvykle inhalátorů s měřeným dávkováním. Základem je roztok hnacího činidla, obvykle CFC 11, 12 nebo 114, obsahující buů rozpuštěnou léčivou látku nebo suspenzi látky v tlakové nádobce. Dávkování se dosáhne stlačením poháněcího zařízení, které uvolňuje aerosol hnací látky suspenze léčivé látky nebo roztoku, který je nesen do dýchacích cest. Během průchodu do plic se hnací látka odpaří. Získají se tak mikroskopické sraženiny z roztoku nebo volné částice ze suspenze. Dávkování je reprodukovatelné a levné, ale existuje ekologický tlak na snížení používání CFC. Použití CFC rozpouštědel zůstává většinou neslučitelné s mnoho moderními biotechnologickými léčivými látkami, protože jsou citlivé na denaturaci a mají nízkou stabilitu.

Současně existuje tendence směřovat k zařízením se suchými prášky, která obsahují suché prášky léčivých látek obvykle smíchané s excipientem, jako je laktosa nebo glukosa, což usnadňuje aerosolování a dispergování částic léčivé látky. Energie pro disagregaci je často dodávána dechem nebo vdechnutím vzduchu zařízením.

Léčivé látky jsou běžně mikromleté, aby se snížila velikost Částic. Tento přístup není aplikovatelný na biotechnologické produkty. Biotechnologické produkty jsou obecně dostupné v nízkém množství a navíc jsou citlivé na způsoby běžně používané pro sušení a mikromletí před smícháním s excipientem. Dále pak je zvláště obtížné získat směsi léčivé látky a excipentu, které jsou dostatečně sypké a pohybují se a dávkují reprodukovatelně v moderních inhalátorech pro více dávek, jako je zařízení Turbohaler (Astra) a Diskhaler (Glaxo). Studie odhalily, že na rozdíl od očekávání rozprašováním vysušené (kulovité) salbutamolové mikročástice vykazovaly větší pevnost koheze a adheze než Částice mikromleté léčivé látky o podobné velikosti Částic. Elektronové mikrografy materiálu vysušeného rozprášením ukázaly, že částice mají důlkované, hrubé povrchy.

Haghpanah a spol. popsali v roce 1994 na Britské farmaceutické konferenci, že albuminové mikročástice obsahující salbutamol se vyrábějí sušením rozprašováním a že mají vhdonou velikost pro respirační zařízení dodávající léčivou látku, tj. 1 až 5 jím. Cílem bylo připravit salbutamol v tobolce pro pomalé uvolňování. Nezdá se, že produktem jsou v podstatě stejnoměrně kulovité nebo hladké mikročástice, které mají uspokojivé sypké vlastnosti pro inhalátory suchého prášku určené pro více dávek.

Diagnostická činidla, která obsahují duté mikrotobolky, se používají pro zesílení ultrazvukového zobrazení. Například evropská patentová přihláška A 458745 (Sintetica) popisuje způsob výroby vzduchem nebo plynem naplněných mikrobalonků mez if ázovou polymerací syntetických polymerů, jako jsou polylaktidy a polyglykolidy. Spis Světového úřadu WO A 9112823 (Delta) popisuje podobný způsob používající albumin. Wheatley a spol. [Biomaterials H, 713 (1990).] popisují ionotropní gelaci alginátu za vzniku mikrobublinek o průměru nad 30 jim. Spis WO A-9109629 popisuje liposomy pro použití jako ultrazvuková kontrastní činidla.

Przyborowski a spol. [Eur. J. Nucl. Med. 7, 71 (1982).] popisuje výrobu mikrokuliček lidského sérového albuminu (HSA) sušením rozprašováním pro radioaktivní označení a jejich následující použití při scintigrafickém zobrazení plic. Nebylo uvedeno, že mikrokuličky obsahují otvor. Při našem opakování této práce byly vyrobeny převážně špatně vytvořené pevné mikrokuličky. Pokud nejsou tyto částice duté, nejsou vhodné pro echokar diografii. Mikrokuličky byly vyráběny také jednostupňovým postupem, o kterém bylo zjištěno, že není vhodný pro výrobu mikrokuliček vhodných pro echokardiografii. V předchozím postupu bylo nutné odstranit z mikrokuliček nedenaturovaný albumin. Byly získány mikrokuličky s širokým rozmezím velikostí, takže byl dále nutný stupeň prosévání.

Przyborowski a spol. popisují dva dřívější objevy způsobů získání albuminových částic pro scintigrafii plic. Aldrich a Johnston [Int. J. Appl. Rad. Isot. 25. 15 (1974).] popisují použití odstředivého disku pro generaci částic o průměru 3 až 70 μιη, které jsou pak denaturovány v horkém oleji. Tento olej se odstraní a částice jsou označeny radioisotopy. Raju a spol. [Isotopenpraxis 14(2), 57 (1978).] používá stejnou techniku rotujícího disku, ale denaturoval albumin jednoduchým zahřátím částic. V žádném případě nebyly zmíněny duté mikrotobolky a takto vyrobené Částice nebyly vhodné pro echokardiografii.

Evropská patentová přihláška A 0606486 (Teijin) popisuje výrobu prášků, v níž je účinné činidlo zahrnuto do malých částic s nosičem sestávajícím z celulosy nebo derivátů celulosy. Záměrem je zabránit částicím léčivé látky, aby přilnuly na želatinové tobolky používané v inhalátoru suchého prášku pro jednu dávku. Strana 12 tohoto spisu se týká sušení rozprašováním léčiva a základu tak, aby se získaly částice, z nichž 80 nebo více % má velikost 0,5 až 10 pra. Žádné pokyny nejsou uvedeny o tom, jaké podmínky by se měly používat, aby se získal takový produkt.

Evropská patentová přihláška A 0611567 (Teijin) se podrobněji týká výroby prášků pro inhalaci vysušením rozprašováním. Nosičem je celulosa, zvolená pro svoji odolnost vůči vlhkosti. Podmínky jsou takové, jak je uvedeno v příkladu 1 (ethanol jako rozpouštědlo, 2 až 5 % (hmotn. k obj.) rozpuštěné látky). Tyto podmínky znamenají, že neexistuje žádná kontrola morfologie povrchu. Příklad 4 popisuje slabou frakci pro vdechnutí dolními dýchacími cestami (12 %), což ukazuje na špatnou disperzi čás tic. Kulovité částice se zřejmě získávají s vysokým obsahem léčivé látky, což ukazuje na to, že morfologie částice je řízena obsahem příslušné léčivé látky a obsahem nosiče.

Conte a spol. [Eur. J. Pharm. Biopharm. 40(41, 203 (1994).] popisují sušení rozprašováním z vodného roztoku s maximální koncentrací rozpuštěné látky 1,5 % hmotn.. Je vyžadován vysoký obsah léčivé látky, aby se získaly téměř kulovité částice. To způsobuje zakrnění a svraštění částic. Dále pak po suspendování v butanolu, pro usnadnění Coulter analýzy, je zřetelně nutné působení ultrazvuku (sonikace), což ukazuje na to, že částice nejsou plně vysušeny.

Předmětem předloženého vynálezu je získat terapeutické dodávací ředidlo a prostředek, které jsou lépe uzpůsobeny, zvláště pro podávání do alveol, než výrobky podle oblasti techniky.

Podstata vynálezu

Podle předloženého vynálezu bylo překvapivě zjištěno, Že v mikročásticích (a také mikrotobolkách a mikrokulíčkách), které jsou vhodné jako meziprodukty, tj. před fixováním, při výrobě mikrotobolek obsahujících vzduch pro diagnostické zobrazení, např. jak je to popsáno ve spisu WO A 9218164, jako meziproduktové mikrotobolky, není materiál tvořící stěny v podstatě ovlivněn sušením rozprašováním. Lze tedy vyrobit velmi jednotné mikročástice, mikrokuličky nebo mikrotobolky materiálu citlivého na teplo, jako jsou enzymy, peptidy a proteiny, např. HSA a další polymery. Mohou se připravit jako suché prášky pro terapeutické a diagnostické použití.

Na rozdíl od oblasti techniky bylo nyní zjištěno, že lze vyrobit účinné, rozpustné nosiče pro terapeutická a diagnostická činidla sušením rozprašováním, kterými jsou volně sypké, hladké, kulovité mikročástice ve vodě rozpustného materiálu, např. lidského sérového albuminu (HSA), které mají střední velikost částic 1 až 10 μη. Obecněji - způsob výroby mikrotobolek podle vynálezu zahrnuje rozprašování roztoku (nebo disperze) materiálu tvořícího stěny. Současně může být rozprašováno nebo vneseno do takto vyrobených mikrotobolek terapeutické nebo diagnostické činidlo. Tímto materiálem může být také účinné činidlo samotné. Bylo zjištěno, že za zde uvedených podmínek a obecněji popsaných Suttonem a spol. (1992), např. použitím příslušné kombinace vyšší koncentrace rozpuštěných látek, vyššího poměru tok vzduch:kapalina než podle Haghpanaha a spol. a pomocí zesilovačů tvořících slupku, se mohou vyrábět pozoruhodně hladké kulovité mikročástice z různých materiálů. Kulovitá povaha mikročástic se může dosáhnout jinými prostředky než je pouhá analýza maximální velikosti, tj. technikou rozptylu laserového světla podle Haghpanaha a spol. Navíc lze velikost a distribuci Částic produktu regulovat v užším rozmezí a s větší reprodukovatelností. Například podle Coulterovy analýzy může být 98 % částic menších než 6 pm s rozmezím velikostí 2 pm a s menší variací střední velikosti mezi dávkami než 0,5 pm. Dále pak, jestliže se testuje v inhalátoru suchého prášku, kterým je vyvíjen, lze dosáhnout reprodukovatelného dávkování a následné tvorbě aerosolu za normálních průtokových podmínek (30 1/min), což vede k vynikajícímu oddělení mikročástic od ředidla.

Nefixované tobolky podle tohoto vynálezu, složené z nedenaturovaného HSA nebo jiného rozprašováním vysušitelného materiálu, mají velice hladké povrchy a mohou být zpracovány s relativně nízkými dávkami excipientů. Vyrobí se tak sypké prášky, které jsou ideální pro inhalátory pro suché prášky. Podle tohoto přístupu je možné vyrobit heterogenní mikrotobolky, které obsahují suspendované excipienty a účinnou složku. To má výhodu v tom, Že se získají sypké prášky účinné složky, které mohou být dále zpracovány tak, aby se získaly prášky, které se dávkují a vytvářejí aerosoly s vynikající reprodukovatelností a přesností.

Navíc pak způsob sušení rozprašováním v jeho běžné formě vede k relativně nízké denaturaci a konverzi na polymery při výrobě sypkých prášků. Ve všech případech může být velikost suspenze mikrotobolek taková, že 90 % hmotnosti leží v žádaném rozmezí velikostí, např. v oblasti 1 až 5 Mm.

V podstatě jsme proto definovali, jak vyrobit mikrotobolky, které jsou: převážně o velikosti 1 až 5 gm, hladké a kulovité, obsahují plyn a obsahují nepoškozené molekuly proteinu a které mohou být před dalšími stupni zpracování skladovány a zasílány. Pro výrobu meziproduktových mikrotobolek pro zobrazení ultrazvukem jsme definovali ty vlastnosti způsobu a výsledného prásku, které jsou podstatné pro výrobu lepších prášků pro inhalátory suchého prášku (DPI), zjistili jsme, že mnoho testů, které byly vyvinuty pro echokontrastní činidla, je vhodných pro definování takových parametrů částic, které jsou výhodné pro DPI prášky, jmenovitě: schopnost odrazu a rezistence vůči tlaku zesilovaných částic definujících přesně vytvořené mikročástice, mikroskopické vyhodnocení v DPX nebo v rozpouštědlech, definování kulovitosti a vlastnosti rozpustných meziproduktových tobolek obsahujících plyn, velikost a analýza distribuce velikostí a také test monomerních proteinů pro definování konečné úrovně fixace produktu.

Zvláště pro použití v terapii je nutno věnovat značnou péči regulaci velikosti částic a distribuce Částic. Zvolili jsme biokompatibilní polymer, který, jestliže je zesítován, zůstává neškodný. Také jsme se naučili, jak reprodukovatelně zesilovat tuto molekulu. Abychom dosáhli regulovaého zesí€ování, oddělili jsme způsob tvorby mikročástic a zesítování, při kterých se netvoří emulze a rozpouštědlo se neodpařuje. To znamená, že původní stupeň procesu nepoškozuje materiál vytvářející stěny. Definovali jsme příslušné parametry, které jsou důležité pro tvorbu úplné částice a dále jsme definovali výhodnější podmínky, které poskytují neporušenější částice. Při zvolení HSA jako zvláště výhodný polymer jsme zvolili také molekulu potenciálního nosiče, která může: ochránit labilní molekuly, zvýšit příjem peptidů plícemi, navázat léčivou látku s nízkou molekulovou hmotností přírodními vazebnými afinitami a být kovalentně modifikována tak, aby nesla léčivé složky buněčnými barierami do systémového oběhu a dále.

Když výzkumníci používali sušení rozprašováním pro výrobu mikročástic malých rozměrů, měli tendenci použít těkavá rozpouštědla, která podporují rychlé smršťování kapiček. Výzkumníci také používali výchozí materiály s nízkém obsahem rozpuštěné látky, aby se udržela nízká viskozita roztoku a aby se zvýšila tvorba menších kapiček. V obou případech, jestliže se vyrábějí mikročástice, má tento způsob malý dopad na konečnou morfologii. Ta je dána spíše složkami použitými při tvorbě částic. Intenzivně jsme studovali, jak vyrábět částice s regulovanou velikostí z HSA a jak aplikovat tento způsob na mnoho dalších materiálů včetně aktivních léčivých složek. Jsme schopni používat relativně vysoké obsahy rozpuštěných látek, např. 10 až 30 % (hmotn. k obj.), proti 0,5 až 2 %, při výrobě mikročástic obsahujících aktivní složku o nízké molekulové hmotnosti s laktosou, aktivní složkou samotnou, peptidy s HSA a modifikovanými polymerními nosiči s aktivní složkou. Nyní jsme zjistili, že to je způsob, který diktuje morfologii konečných Částic spíše než složení rozpuštěných složek. Jsme dále schopni použít kombinace vodných a s vodou mísitelných rozpouštědel pro zvýšení morfologie částic. Máme tedy způsob řízené metodologie, která umožňuje výhodnou výrobu hladkých, kulovitých částic s regulovanou velikostí, které jsou vhodné pro pulmonární podávání.

Bylo zjištěno, že postup podle vynálezu může být regulován tak, aby se získaly mikrokuličky s žádoucími vlastnostmi. Tlak, při kterém je proteinový roztok dodáván do rozprašovací trysky, může být různý, například od 1,0 do 10,0.10^s Pa, s výhodou 2 až 8.10⁵ Pa, nejvýhodněji 7,5.10^s Pa. Další parametry se mohou měnit tak, jak je popsáno níže. Tímto způsobem se mohou získat nové mikrokuličky.

Další aspekt podle vynálezu poskytuje duté mikrokuličky, v nichž více než 30 %, s výhodou více než 40, 50 nebo 60 % mikrokuliček má průměr v rozmezí 2 gm a alespoň 90, s výhodou a9 lespoň 95 nebo 99 % mikrokuliček má průměr v rozmezí l,o až 8,0 pm.

Rozmezí velikostí může být 2 pm se středním průměrem 3,5,

4,5, 5,0, 5,5, 6,0 nebo 6,5 pm.

Alespoň 30, 40, 50 nebo 60 % mikrokuliček má tedy průměry v rozmezí 1,5 až 3,5 μη, 2,0 až 4,0 pm, 3,0 až 5,0 μη, 4,0 až 6,0 μη, 5,0 až 7,0 μη nebo 6,0 až 8,0 μη. S výhodou má shora uvedené procento mikrokuliček průměr v rozmezí 1,0 μη, jako je 1,5 až 2,5 pm, 2,0 až 3,0 μη, 3,0 až 4,0 mm, 4,0 až 5,0 pm, 5,0 až 6,0 μη, 6,0 až 7,0 μη nebo 7,0 až 8,0 μη.

Další aspekt tohoto vynálezu poskytuje duté mikrokuličky s proteinovými stěnami, při čemž alespoň 90, s výhodou alespoň 95 nebo 99 % mikrokuliček má průměr v rozmezí 1,0 až 8,0 pm, alespoň 90, s výhodou alespoň 95 nebo 99 % mikrokuliček má tloušťku stěny 40 až 500 nm, s výhodou 100 až 500 nm.

Materiál tvořící stěny a podmínky způsobu výroby by měly být zvoleny tak, aby produkt byl dostatečně netoxický a neimunogenní za podmínek, za kterých se používá, což jasně závisí na podávané dávce a na době trvání léčení. Materiálem, který tvoří stěny, může být škrobový derivát, syntetický polymer, jako je terc.butyloxykarbonylmethylpolyglutamát (USA patent A 4888398) nebo polysacharid, jako je polydextrosa.

Materiál, který tvoří stěny, může být vybrán z nejhydroflínějších, biodegradovatelných fysiologicky slučitelných polymerů, jak je podrobněji popsáno ve spisu WO A-9218164.

Materiál, který tvoří stěny, je s výhodou proteinový. Například muže znamenat kolagen, želatinu nebo (sérový) albumin. V každém případě je s výhodou lidského původu (tj. odvozený od lidí nebo odpovídající strukturou lidskému proteinu). Nejvýhodněji znamená lidský sérový albumin (HSA) pocházející od donorů krve nebo ideálně z fermentace mikroorganismů (včetně buněčných linií), které byly transformovány nebo transfektovány tak, aby exprimovaly HSA. Další podrobnosti jsou uvedeny ve spisu WO A 9218164 .

Proteinový roztok nebo disperze obsahuje s výhodou 50 % (hmotn. k obj.), výhodněji 5,0 až 25,0 % proteinu, zvláště tehdy, jestliže protein znamená albumin. Optimální koncentrace je kolem 20 %. Mohou se používat směsi materiálů tvořících stěny. V tom případě se procenta v posledních dvou větách týkají celkového obsahu materiálu, který tvoří stěny.

Přípravek, který se má rozprašovat, může obsahovat jiné látky, než jsou ty, které tvoří stěny, a rozpouštědlo nebo nosnou kapalinu. Opět lze odkázat na spis WO A 9218164.

Proteinový roztok nebo disperze (s výhodou roztok), na který se zde odkazuje jako na ’’proteinový přípravek, je rozprašován a sušen rozprašováním jakýmkoliv vhodným způsobem, který vede k diskrétním mikrokuličkám nebo mikrotobolkám o průměru 1 až 10 μπι. Tato Čísla se týkají alespoň 90 % populace mikrokuliček. Průměr se měří zařízením Coulter Master Sizer II. Pojem ”mikrokuličky’’ znamená duté částice obklopující prostor, který je naplněn plynem nebo parou, ale nikoliv pevnými materiály. Netvoří se částice voštin připomínající cukrovinky prodávané ve Spojeném království jako Maltesers^(F’.

Rozprašování zahrnuje tvorbu aerosolu proteinové přípravku například tak, že se přípravek vhání pod tlakem do alespoň jednoho otvoru nebo použitím odstředivého rozprašovače v komoře horkého vzduchu nebo jiného inertního plynu. Komora by měla být dostatečně velká, aby i největší injektované kapičky nenarazily do stěn dříve než se vysuší. Plyn nebo pára v komoře je Čistá (tj. s výhodou sterilní nebo apyrogenní) a netoxická, jestliže se podává do krevního oběhu v takových množstvích, která souvisejí s podáváním mikrotobolek při použití. Rychlost odpaření kapaliny z proteinového přípravku by měla být dostatečně vysoká na to, aby se vytvořily duté mikrotobolky, ale ne tak vysoká, aby mikrotobolky praskaly. Rychlost odpaření lze regulovat měněním průtoku plynu, koncentrací proteinu v proteinovém přípravku, povahou kapalného nosiče, rychlostí přiváděného roztoku a, co je důležitější, teplotou plynu, který se střetává s aerosolem. Při koncentraci albuminu 15 až 25 % hmotn. ve vodě je pro zajištění dutosti obvykle postačující, aby teplota přiváděného plynu byla alespoň 100, s výhodou alespoň 110 °C, teplota může být až 250 C, aniž by tobolky praskaly. Teplota kolem 180 až 240, s výhodou 210 až 230 a nejvýhodněji kolem 220 °C je optimální, alespoň pro albumin. Jelikož teplota plynu, který se setkává s aerosolem, bude záviset také na rychlosti, kterou je aerosol dodáván, a na obsahu kapaliny v proteinovém přípravku, lze sledovat teplotu na vývodu tak, aby se v komoře zajistila příslušná teplota. Je vhodné, jestliže teplota na vývodu je 40 až 150 °c. Bylo zjištěno, že pro regulaci dalších parametrů, jako je počet neporušených dutých částic, je užitečné regulovat rychlost průtoku.

Mikrotobolky obsahují typicky 96 až 98 % hmotn. monomerního HSA.

Podrobněji - mikročástice podle vynálezu mají s výhodou rozmezí velikostí 3 pm, výhodněji 2 Mm a nejvýhodněji 1,5 mm vzhledem ke střední velikosti částic. Střední průměr částice se stanoví zařízením Coulter counter s konverzí na distribuci velikost-objem. Toho se dosáhne rozprašováním, kdy dochází ke kombinaci nízkého průtoku výchozí suroviny s vysokými úrovněmi rozprašování a sušení vzduchem. Výsledkem je výroba mikrotobolek velmi definovaného tvaru a úzké distribuce velikostí.

Několik pracovníků navrhlo rovnice pro definování střední velikosti kapiček pneumatických trysek. Jednoduchá verze různých parametrů, které ovlivňují střední velikost kapiček je následující :

D - A/(V²d)‘ + B.(M_VIdueh/M_kap)-^b kde D znamená velikost kapiček,

A znamená konstantu týkající se trysky,

B znamená konstantu týkající se viskozity kapaliny,

V znamená relativní rychlost vzduchu mezi kapalinou a tryskou, d znamená hustotu vzduchu, a M_kac znamenají hmotnost vzduchu a kapaliny a víQUvím -J a a b znamenají konstanty týkající se typu trysky.

Je zřejmé, že pro jakýkoliv typ trysky je velikost kapiček nejvíce ovlivněna relativní rychlostí na trysce a současně poměrem hmotnosti vzduchu ke kapalině. Pro většinu obvyklých použitých sušení je poměr vzduchu ke kapalině v rozmezí od 0,1 do 10 a při těchto poměrech je průměrná velikost kapiček 15 až 20 μια. Pro výrobu mikročástic ve zde popsaném rozmezí velikosti používáme poměr vzduchu ke kapalině v rozmezí od 20 až 1000:1. Výsledkem je výroba částic při vysokých poměrech, které jsou převážně malé při srovnání se standardy a při tom s velmi úzkými distribucemi velikostí. U mikročástic vyráběných při nižších poměrech vzduchu ke kapalině se vyrábějí nepatrně větší částice, ale ještě s úzkou distribucí velikostí, které jsou lepší než mikročástice vyrobené emulzními způsoby.

Množství přidané účinné složky není rozhodující. Mikročástice mohou obsahovat alespoň 50, výhodněji 70 nebo 80 a nejvýhodněji 90 % hmotn. HSA nebo jiného materiálu nosiče. Pro použití v inhalátoru mohou být mikročástice vyrobeny s konvenčním excipientem, jako je laktosa nebo glukosa.

Mikročástice mohou obsahovat terapeutické činidlo a nosič nebo sloučeninu, která sama je terapeuticky aktivní. Množství účinné složky lze vybrat podle povahy a aktivity, podle způsobu podávání a dalších faktorů známých odborníkům z oblasti techniky. Pouze jako příklad uvádíme, že počet podávaných částic může být takový, aby se podávalo 100 mg/den ot-1 antitrypsinu nebo 0,1 mg/den účinného materiálu, jako je beklomethason.

Aktivní částicí může být například diagnostická látka nebo klasická farmaceutická část, která může nebo nemusí být navázána, kovalentně nebo jinak, na materiál nosiče. Terapeutickým činidlem může být proteinový materiál, jako je insulin, parathyroidní hormon, kalcitonin nebo podobný bioaktivní peptid, albuterol, salicylát, naproxen, augmentin nebo cytotoxické činidlo. Pro pokusné účely může být zahrnut marker, jako je lysin-fluorescein.

Mikročástice podle vynálezu mohou vedle terapeutického nebo diagnostického Činidla obsahovat antagonistu nebo složku vázající receptor. Do molekulárního ředidla může být zahrnut například cukr nebo jiná molekula, z pohledu řízení podávání léčivé složky navázané na ředidlo do daného receptoru nebo do alveol.

Jako ilustrativní příklad materiálů nosičů rozpustných ve vodě pro použití podle vynálezu se zde používá HSA. Mezi další materiály, které se mohou používat, patří jednoduché a složité sacharidy, jednoduché nebo složité amino- a polyamino-kyseliny, mastné kyseliny a estery mastných kyselin, přírodní nebo rekombinantní lidské proteiny, jejich fragmenty nebo jejich krátké formy.

Tento vynález umožňuje, aby suché mikrotobolky byly díky své povaze manipulovány tak, aby se optimalizovala sypkost nebo vlastnosti ředidla měněním a snížením sil koheze a adheze v mikrotobolkovém přípravku. Například, jestliže je to žádoucí, mikrotobolky se mohou vyrobit tak, aby byly převážně positivní nebo negativní použitím vysoce nabitých monomerních nebo polymerních materiálů, např. lysinu nebo poly-lysinu a glutamátu nebo polyglutamátu v systémech bez HSA nebo heterogenních systémech obsahujících HSA a aktivní složky.

Dalším provedením vynálezu je současné sušení rozprašováním účinné složky a HSA, aby se usnadnila stabilizace účinné složky při tvorbě přípravku, balení a, co je nejdůležitější, při pobytu v alveolární výstelce. V tomto provedení může existovat intenzivní proteolytická aktivita. Zatímco inhibitory proteasy se mohou použít pro chránění peptidových účinných látek, mohou pro tento přístup existovat kontraindikace. Použitím HSA, jako jak excipientu tak ředidla, lze poskytnout velký nadbytek alternativního substrátu, na který mohou lokálně působit aktivní proteasy. Další výhodou je to, že i když bylo ukázáno, že HSA překračuje alveolární barieru, transcytotickými mechanismy zprostředkovanými receptorem nebo bez receptoru, může být použit jako ředidlo pro usnadnění projití účinné složky epitelovou výstelkou.

V dalším provedení může být účinná složka kovalentně navázána na HSA odštěpitelnými vazbami před vysušením rozprášením. Toto provedení představuje způsob nesení účinných složek celou cestou od zařízení do krevního oběhu a možná do cílů v těle. Tvorba částic optimální aerodynamické velikosti znamená, že fyzikální ředidlo dodává účinnou složku do místa adsorpce. Jakmile je jednou uloženo v alveolách, molekulární ředidlo ochraňuje a usnadňuje projití do krevního oběhu, a jakmile je jednou v krevním oběhu, může dále zvyšovat Životnost v oběhu nebo dokonce směřuje účinnou složku do jistých míst v těle na bázi událostí zprostředkovaných receptorem.

Vhodná technologie linkeru je popsána ve spisu Světového úřadu WO A 9317713 (Rijksuniversiteit Groningen). Jsou popsány linkery na bázi polyhydroxykyselin citlivé na esterasu. Tato technologie, používaná při derivatizaci HSA před sušením rozprašováním umožňuje výrobu systému kovalentního nosiče pro dodávání léčivých látek do systémového cévního systému. To využívá potenciál HSA procházet alveloami a nést léčivé látky po prodlouženou dobu, při čemž se chrání potenciálně nestálé částice.

I když účinná složka používaná v tomto vynálezu může být vnesena nebo jinak asociována s mikročásticemi po jejich vytvoření, je výhodné připravovat je s HSA. Mikročástice mohou být alespoň částečně potaženy hydrofóbním nebo ve vodě nerozpustným materiálem, jako je mastná kyselina, aby se zpozdila jejich rychlost rozpouštění a aby se ochránily proti hydroskopickému růstu.

Následující příklady ilustrují tento vynález. Rozprašovací sušárna použitá v příkladech, dostupná od A/S Niro Atomizer, Soeborg, Dánsko, pod obchodním označením “Mobile Minor, je podrobně popsána ve spisu WO A 9218164.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

20% (hmotn.) roztok sterilního, apyrogenního HSA v apyrogenní vodě (vhodné pro injekce) se pumpuje tryskou rozprašovače s dvěma tryskami namontovaného v komerční shora popsané jednotce rozprašovací sušárny. Rychlost peristaltické pumpy se udržuje na přibližně 10 ml/minutu tak, aby teplota přiváděného vzduchu byla 220 °C a teplota odváděného vzduchu 95 °C.

Stlačený vzduch se dodává dvěma fluidními rozprašovacími tryskami při 2,0 až 6,0.10^s Pa. Při tomto rozmezí se získají mikrotobolky se střední velikostí 4,25 až 6,2 μη.

Zvýšení střední velikosti částic (snížením rozprašovacího tlaku) typicky vede ke zvýšení množství mikrotobolek o velikosti nad 10 μη (viz tabulka 1).

Tabulka 1

Vliv rozprašovacího tlaku na množství mikrotobolek o průměru nad 10 μιπ rozprašovací tlak (.10^s Pa) výskyt částic nad 10 μη (%)

6,0	0,8
5,0	3,3
3,5	6,6
2,5	8,6
2,0	13,1

Za shora popsaných podmínek, tj. první stupeň z příkladu 1 podle spisu WO A 9218164, s tlakem na trysce 7,5.10^s Pa byly vyrobeny mikročástice o velikosti 4,7 μη. Tyto rozpustné mikročástice byly hladké a kulovité s menším než 1% množstvím částic o velikosti nad 6 μιπ. Mikročástice byly rozpuštěny ve vodném prostředí. Molekulární hmotnost HSA byla stanovena gelovou filtrační chromatografií. Výsledné chromatogramy pro HSA před a po sušení HSA rozprašováním byly v podstatě stejné. Další analýza HSA před a po sušení rozprašováním mapováním tryptických peptidů s HPLC odhalila, že v uvolněných peptidech nebyly pozorovatelné rozdíly. Obě analýzy ukazují, že za popsaných podmínek sušení rozprašováním, při nichž se vyrábějí mikročástice o velikosti 4,7 μη, došlo k malému nebo vůbec nedošlo ke strukturnímu poškození proteinu.

Příklad 2

Antitrypsin ct-l z lidského sera byl sušen rozprašováním za podmínek podobných příkladu 1 s teplotou přívodu 150 °C a teplotou vývodu 80 °C. Všechny další podmínky sušení byly stejné jako v příkladu 1. Vyrobené rozpustné mikročástice měly střední velikost 4,5 μη. Tyto mikročástice byly rozpuštěny ve vodném prostředí a analyzovány na zachování proteinové struktury a normální trypsinové inhibiční aktivity, potom byly srov nány s původním výchozím materiálem vysušeným vymrazením. Analýza chromatografií na gelu a obrácené fázi a kapilární elektroforesou ukázala, že po sušení rozprašováním nedošlo k žádným významným strukturním změnám. Analýza inhibiění aktivity (tabulka 2) ukázala, Že v rámci experimentální chyby bylo dosaženo plné zachování inhibiění aktivity.

Tabulka 2 pokus číslo procenta zachované aktivity

222

148

Příklad 3

Použitím obecného způsobu podle příkladu 1 byly vyrobeny mikrotobolky obsahující alkoholdehydrogenasu (ADH) a laktosu (0,1 % hmotn. ADH, 99,9 % hmotn. laktosy). Zjistili jsme, že pro maximální zachování enzymové aktivity je potřeba optimalizace stupně sušení rozprašováním. Byly použity obecné podmínky podle příkladu 1, ale vstupní a výstupní teploty byly měněny tak, aby se získaly podmínky, které nám umožnily vyrobit mikročástice žádané velikosti (4 až 5 gm), které si zachovaly plnou aktivitu po vysušení a po rekonstituci ve vodném prostředí. Procenta zachované aktivity při srovnání s výchozím materiál jsou uvedena v tabulce 3 pro všechny podmínky sušení rozprašováním. Mikrotobolky byly hladké a kulovité a obsahovaly vzduch, jak je vidět z jejich vzhledu v difenylxylenu (DPX) ve světelném mikroskopu.

Tabulka 3

pokus č.	tepl. vstupu	(°C)	tepl. výstupu	(°C)	zbývající aktivita (%)
1	220		73		57
2	175		71		98

Příklad 4

Byla provedena řada pokusů podle podmínek popsaných v příkladu 1, aby se zjistil vliv rychlosti přívodu kapaliny na výtěžek neporušených kulovitých částic. Zjistili jsme, že využitím schopnosti mikročástic obsahujících plyn odrážet ultrazvuk jsme schopni stanovit optimální podmínky pro maximalizování výtěžku neporušných hladkých kulovitých mikrotobolek. Mikročástice vytvořené po vysušení rozprašováním se fixují teplem, aby se staly nerozpustné, a potom se suspendují ve vodě, aby se provedla odrazová měření. Zjistili jsme, že zvýšení rychlosti přívodu kapaliny snižuje počet neporušených mikročástic vytvořených během počátečního sušení rozprašováním (tabulka 4). Střední velikost částic a celková tlaková stabilita, tj. tlouštka slupky, se nemění, ale celková odrazivost se mění, když se rychlost toku kapaliny zvýší ze 4 na 16 ml/minutu. Zjistili jsme, že pomalejší rychlosti odpařování (při vyšších rychlostech toku kapaliny) vedou k méně neporušeným kulovitým částicím, které se vytvořily.

Tabulka 4

rychlost toku (ml/min)	4	8	12	16
střední velikost (/im)	3,08	3,04	3,13	3,07
odrazivost (VDH)	22	21	14	10
odrazivost po tlaku (VDU)	20	18	10	8

Test byl prováděn resuspendováním teplem fixovaných mikročástic při koncentraci 1.10⁶ ml ve 350 ml vody. Tento roztok se pomalu míchá v 500ml kádince, nad kterou se namontuje 3,5MHz ultrazvuková sonda spojená s lékařským zobrazovacím přístrojem Sonus 1000. Šedá stupnice získaných odrazů se zachytí analyzátorem zobrazení a srovná se s kontrolním pokusem (jen voda). Tím se získají VDU odrazu ozvěny. Tento test se může přizpůsobit také zkoumání rezistence na tlak vyhodnocením odrazu ozvěny před a po vystavení vzorku cyklickým prudkým změnám tlaku (výbuchům) aplikovaným na zásobní roztok částic. Tato analýza rozlišuje neúplné částice, které unášejí vzduch při rekonstituci od plně kulovitých částic, které uvnitř slupky mají v tobolkách uzavřený vzduch. Neúplné částice nevykazují rezistenci na tlak a bezprostředně ztrácejí schopnost odrážet ultrazvuk. Odpověá na fixované albuminové částice z příkladu 1 je 5, 9, 13, 20, 22 a 24 VDU (intenzita) při příslušných koncentracích mikrotobolek 0,25, 0,5, 1, 2, 3 a 4.10⁶ na ml.

Příklad 5

Byly provedeny významné pokusy, které by vedly ke snížení velikosti částic a k úzké distribuci velikostí. Byly prováděny proto, aby se efektivně zvýšil obsah plynu echokontrastního činidla a aby se snížilo množství Částic s nadměrnou velikostí. Tento pokus je výhodný také pro výrobu respiračních přípravků v tom, že maximalizuje potenciální číslo dýchatelných částic v rozmezí 1 až 5 Mm a produkuje přirozeně hladší částice, které budou méně kohezivní než ne-kulovité Částice podobné velikosti.

Zjistili jsme, že je možné zmenšit velikost částice snížením obsahu rozpuštěných látek ve výchozím materiálu. Tento efekt je zprostředkován zčásti vlivy viskozity na tvorbu kapiček. My jsme však také zjistili, že snížení obsahu rozpuštěných látek za podmínek, které používáme, vede k významnému snížení počtu neporušených částic. V dalších pokusech jsme zjistili, že zavedení s vodou mísitelných těkavých rozpouštědel do výchozího materiálu významně zvýší rychlost tvorby slupky během su šení s průvodním zvýšením počtu neporušených částic nebo dutých částic (tabulka 5). Vyhodnocení dutosti se provede mikroskopickým vyhodnocením částic na povrchu krycího sklíčka hemocytometru při srovnání s počtem Částic podle Coulter counting.

Tabulka 5

pokus č.	obsah HSA suroviny (¾)	obsah ethanolu v surovině (%)	střední velikost částic (Mm)	procenta dutých částic (%)
1	10	0	0	12,5
2	10	25	3,52	64,3

Příklad 6

Pro výrobu hladkých kulovitých rozpustných mikročástic byly použity různé materiály. Mezi vyrobené mikročástice patřily inertní materiály, jako je HSA, laktosa, manitol, alginát sodný, aktivní materiály, jako je αΐ-antitrypsin, a směsi aktivního a inertního nosiče, jako laktosa/alkoholdehydrogenasa, laktosa/budesonid, HSA/salbutamol. Ve všech případech byly vyrobeny hladké, kulovité částice, které obsahují plyn.

Vyhodnotili jsme úspěch procesu zachování kontroly morfologie Částic. Tyto částice byly suspendovány v propanolu a potom zviditelněny mikroskopem. Tyto částice, které obsahují plyn, vypadají jako intenzivní bílé jádro obklopené neporušeným černým okrajem, zatímco rozbité nebo špatně vyrobené částice vypadají jako stíny. Mikroskopické vyhodnocení následujících mikročástic ukazuje příklady rozsahu materiálů a účinných složek, které mohou být vysušeny tak, aby se vyrobily hladké kulovité částice:

HSA kasein hemoglobin laktosa

ADH/laktosa

HSA/peroxidasa laktosa/salbutamol laktosa/budesonid

Příklad 7

Laktosa a budesonid se vysuší rozprašováním za podmínek, které jsou popsány v tabulce níže (tabulka 6).

Tabulka 6

parametr	nastavení
vstupní teplota výstupní teplota rozprašovací tlak nastavení tlumiče	220 °C 85 °C 7,5.10⁵ Pa 0,5
napájecí rychlost zásobní roztok	3,88 g/min 9,3 % (hmotn. k obj.) budesonidu, 85 % (hmton. k obj.) ethanolu, 19 % (hmotn. k obj.) laktosy

Výsledný suchý prášek byl smíchán s excipientem (laktosa) v mísiči typu V v poměrech uvedených v tabulce 7. Tyto směsi byly pak naplněny do želatinových tobolek a přeneseny z Rotahaleru*™' do dvoustupňového přístroje na sbírání vzorků částeček suspendovaných ve vzduchu nebo jiném plynu při 60 1/min. Dýchátelná frakce byla vypočtena jako procento uložené v dolní komoře.

Tabulka 7

přípravek č.	% butesonidu v částicích vysušených j rozprašováním	% produktu vysušeného rozprašováním ve směsi	% rychle tekoucí laktosy ve směsi	dýchatelná frakce
1	9,3	10	90	42
2	9,3	15	85	29
3	9,3	20	80	34
4	5,7	30	70	36

Získané dýchatelné frakce jsou značně lepší než mikrorozemletý produkt běžně používaný v tomto zařízení, které jsou obvykle v rozmezí 10 až 20 % maxima.

Přípravky budesonid/laktosa podrobně uvedené v příkladu 7 byly testovány v pokusném gravitačním napájení vícedávkového DPI. Zkoumané parametry byly variací emitované dávky při 30 dávkách a dýchatelné frakce ve čtyřstupňovém přístroji na sbírání vzorků částeček suspendovaných ve vzduchu nebo jiném plynu. Výsledky jsou uvedeny níže (tabulka 8).

Tabulka 8

-	přípravek č.	dávka (mg)	frakce jemných částic (dýchatelná) (%)	CofV emitované dávky (%)
	1	4	52	2,0
	2	4,2	42	2,8
	3	3,7	58	8,1

Pro běžná DPI zařízení předběžné doporučení podle US Pharmacopoeia je pravděpodobně menší než 25% variace v emitované dávce. Ve všech až dosud testovaných přípravcích jsme zřetelně v běžném limitu a v případě přípravků 1 a 2 jsme významně pod běžnými limity.

Příklad 8

Jak je popsáno v předcházejících příkladech, pro snížení rychlosti rozpouštění rozpustných mikrotobolek mohou být mikrotobolky potaženy mastnými kyselinami, jako je kyselina palmitová nebo behenová. Rozpustné mikrotobolky z příkladu 1 byly potaženy suspendováním směsi rozpustných HSA mikrotobolek a glukosy (50 % hmotn.) v ethanolickém roztoku, který obsahuje 10 % hmotn. kyseliny palmitové a behenové. Tento roztok byl odpařen a výsledný koláč byl rozemlet projitím Fritschovým mlýnem.

Účinnost potažení byla vyhodnocena nepřímým způsobem odvozeným od našich předcházejících ultrazvukových studií. Ultrazvukové odrazy z kádinky s vodou obsahující 1.10® mikrotobolek/ /ml byly shromažďovány ultravukovým přístrojem HP Sonus 1000 spojeným s analyzátorem zobrazení. Byla měřena časová závislost VDU proti prázdné kontrole (tabulka 9).

Nepokažené mikrotobolky velmi rychle ztratily všechen vzduch a tedy schopnost odrážet ultrazvuk. Potažené mikrotobolky si však zachovaly svoji strukturu po prodlouženou dobu a vykazovaly tedy prodloužený signál po několik minut.

Tabulka 9

Schopnost odrazu potažených HSA mikrotobolek schopnost odrazu (VDU)

doba (min)	pouze HSA	potaženo HS/ /palmitová kys.	potaženo HS/ /behenová kys.
0	1,75	1,91	0,88
5	0,043	0,482	0,524
10	0	0	0,004

Příklad 9

Rozpustné mannitolové mikrotobolky byly vyrobeny tak, jak je shora uvedeno v příkladu 1 (vysušením rozprášením výchozího materiálu s 15% (hmotn.) vodným mannitolem) a potaženy kyselinou palmitovou a kyselinou behenovou, jak shora uvedeno v příkladu 8. Vzorek každého přípravku byl suspendován ve vodě a byla změřena schopnost odrazu. Měření odrazu suspendovaného vzorku bylo zopakováno 10 minut po počáteční analýze (tabulka 10).

Tabulka 10

Schopnost odrazu potažených mannitolových mikrotobolek

doba (min)	mannitol	schopnost odrazu (VDU)
+ kys. palmitová + kys. behenová
0	1,6	1,7 0,92
10	0,33	0,5 0,24
17	0	0,84 0

Příklad 10

Pro umožnění výroby sypkého suchého prášku účinné sloučeniny byly vyrobeny rozpustné mikrotobolky s modelovou aktivní složkou (lysin-fluorescein) obsaženou v matrici. Při rozpuštění mikrotobolek se účinná sloučenina uvolní v přírodní formě.

S použitím lysinu jako modelové sloučeniny byla molekula označena fluoresceinisothioakyanátem (FITC), který umožnil, že sloučenina byla monitorována během přípravy rozpustných mikrotobolek a při následném uvolňování během rozpouštění.

K FITC (celkem 0,5 g) v uhličitanovém pufru byly přidány 3 g lysinu. Po jednohodinové inkubaci při 30 °C byl výsledný roztok testován TLC na tvorbu FITC-lysinového aduktu. Ten uká25 zal přítomnost stabilního FITC-lysinového aduktu.

FITC-lysinový adukt byl smíchán se 143 ml 25% (obj.) ethanolu obsahujícího 100 mg/ml HSA. Získá se tak výchozí materiál vysušený rozprašováním. Podmínky sušení rozprašováním použité pro výrobu mikrotobolek jsou podrobně uvedeny níže v tabulce 11. V nepřítomnosti ethanolu jsme zjistili, Že pouze malé procento částic je hladkých a kulovitých.

Postup sušení rozprašováním poskytl 17,21 g mikrotobolek, které se nerozpustily, když byl vzorek suspendován v ethanolu. Navíc nebylo pozorováno žádné uvolňování FITC-lysinového aduktu. Jestliže se však k mikrotobolkám suspendovaným v ethanolu přidá 10 ml vody, mikrotobolky se rozpustí a FITC-lysin se uvolní. TLC analýza aduktu před zahrnutím do mikrotobolek a po uvolnění z mikrotobolek při rozpuštění ukázala, že modelová sloučenina nebyla změněna.

Tabulka 11

Podmínky sušení rozprašováním

parametr	nastavení
vstupní teplota	220 °C
výstupní teplota	85 °C
rozprašovací tlak	7,5.10^s Pa
nastavení tlumiče	0,5
napájecí rychlost	3,88 g/min
zásobní roztok	25 % (obj.) ethanolu,
	10 % (hmotn. k obj.) HSA

Rozpustné mikrotobolky byly rozděleny podle velikosti v nevodném systému thiokyanátu amonného a propan-2-olu použitím zařízení Multisizer II (Coulter Electronics). Mikrotobolky měly střední velikost 3,28 ± 0,6 μπι s 90 % mikrotobolek v rozmezí 2 až 5 Mm.

Mikrotobolky byly smíchány s glukosou (50 % hmotn. mikrotobolek : 50 % hmotn. glukosy) a rozemlety projitím směsi třikrát Fritschovým mlýnem. Když se vzorek prášku přidá k vodě, uvolní se neporušený FITC-lysin, jestliže se srovnává s původní formou podle TLC analýzy. Tento příklad ukazuje snadnost výroby aminokyselinového nebo peptidového přípravku, který by se mohl používat pro respirační přípravky, které v přípravku obsahují HSA.

Příklad 11

500 mg beklomethasonu se rozpustí v ethanolu, přidá se k 50 ml výchozího HSA výchozího materiálu (10 % hmotn. k obj.) a vysuší se rozprašováním za podmínek uvedených shora v příkladu 10. Takto vyrobené mikrotobolky se rozdělí podle velikosti v nevodném systému, jak je podrobně uvedeno shora v příkladu 10. Tyto mikrotobolky mají střední velikost 3,13 ± 0,71 /xm, 90 % z nich má velikost mezi 2 a 5 gm.

Beklomethason byl extrahován z mikrotobolek srážením HSA v 10% TCA. Supernatant byl extrahován ethanolem. Ethanolový extrakt byl analyzován HPLC při vlnové délce 242 nm. Beklomethason detegovaný v tomto extraktu existuje ve volném stavu, ale jestliže byla extrahována albuminová peleta, byla pozorována přítomnost beklamethasonu navázaného na přírodní HSA. Bylo zjištěno, že i když většina účinné sloučeniny byla ve volném stavu, část byla přítomna ve stavu vázaného albuminu. Jelikož albumin přechází jenom pomalu do krevního oběhu, umožňuje to regulovat uvolňování účinné sloučeniny po prodlouženou dobu, při srovnání s volnou léčivou látkou.

Příklad 12

Zatímco alespoň v příkladech 10 a 11 nějaké navázání účinných sloučenin bylo účinkem vnitřní povahy albuminu, tento příklad poskytuje produkt po počátečním zesilováni účinné sloučeniny, před vysušením rozprašováním.

K 10 mg/ml roztoku methotrexátu se přidá 25 mg karbodiimidu (ECCI). Tento roztok se míchá 4 h, aby začala a proběhla úplná aktivace methotrexátu. K aktivované léčivé látce se přidá 50 mg HSA a směs se míchá 3 h za teploty místnosti. Methotrexát se chemicky naváže na HSA aminovými skupinami na albumin. Tento konjugát se pak použije jako výchozí materiál pro sušení rozprašováním, jak je podrobně uvedeno v příkladu 10.

Takto vyrobené rozpustné mikrotobolky byly rozděleny na vzorky, byly charakterizovány a byly analyzován obsah léčivé látky. Mikrotobolky měly střední velikost 3,2 ± 0,6 μια s tím, že 90 % hmotnosti mělo střední velikost mezi 2 a 5 μιη. Analýza obsahu léčivé látky mikrotobolek ukázala, Že mikrotobolky neuvolňují léčivou látku. Dokonce i po rozpuštění byla léčivá látka ještě navázána na HSA. Štěpení albuminu proteinasou K uvolnilo navázanou léčivou látku, o které bylo ukázáno, že je navázána na jenom omezený počet aminokyselin a malé peptidy. Již dříve bylo uvedeno, že aktivita doxorubicinu navázaného na polymerní nosiče má příznivý účinek na nádory, což ukazuje na fenotyp rezistentní vůči více léčivým látkám.

Příklad 13

Naproxenové mikrotobolky byly vyrobeny tak, jak je podrobně uvedeno v příkladech 10 a 12 s poměrem léčivé látky k HSA 1 až 5. Rozpustné mikrotobolky zadržely účinnou sloučeninu z nevodného rozpouštědla. Navíc, při rozpuštění mikrotobolek ve vodném roztoku byla účinná sloučenina stále ještě vázána na albumin, jak ukazuje HPLC analýza při 262 nm, jak shora uvedeno. Naproxen byl uvolněn z albuminu štěpením proteinasou K a esterasami.

Příklad 14

Použitím vzorků mikrotobolek vyrobených v příkladech 8 až 13 se provede vyhodnocení jejich chování v inhalátoru pro suchý prášek. Reprodukovatelnost takového dávkování každého přípravku se vyhodnotí v souvislosti s aerosolováním vzorku mirkoskopickým vyhodnocením.

Vzorek každého přípravku se přidá ke skladovací nádobě experimentálního inhalátorou pro suchý prásek (DPI). Inhalátor pro suchý prásek používá pro hnaní prásku do dávkovači Části stlačený vzduch. Dávkovači část byla kalibrována laktosou vysušenou rozprašováním.

I když množství, která jsou uložena v dávkovači části, se mění podle vzorků jako funkce jejich složení, reprodukovatelnost dávkování každého vzorku byla velmi stálá. Pro tři pokusy dávkování byl získán střed 5,0 ± 0,25 mg.

Aerosolové chování vzorků bylo testováno spojením inhalátoru s vakuovou komorou. K simulovanému dávkování došlo uvolněním vakua k DPI. Dávky byly shromážděny na mikroskopických sklíčkách potažených pryskyřicí. Tato sklíčka byla vyhodnocena na disperzi Částic. Sklíčka ukázala, že DPI měl deaglomerované vzorky tvořící na mikroskopických sklíčkách dokonce disperzi mikročástic.

Příklad 15

Provedení přípravků suchého prášku z příkladů 10 až 13 bylo analyzováno způsobem dvou přístrojů na sbírání vzorků částeček suspendovaných ve vzduchu nebo v jiném plynu (přístroj A pro tlakové inhalce, British Pharmacopeia 1988) a následujícím odebráním z Rotahaleru (Glaxo, Spojené království) 7 ml ve stupni 1 a 30 rol ve stupni 2 destilované vody. Přípravky byly dodávány v želatinových tobolkách velikosti 3 použitím Rotahaleru připojeného gumovým adapterem ke dvojici přístrojů na sbírání vzorků částeček suspendovaných ve vzduchu nebo v jiném plynu. Vakuová pumpa pracovala při 60 1/min se dvěma třísekundovými nárazy. Množství každého vzorku, které dosáhlo stupně 1 a stupně 2, bylo analyzováno. Všechny vzorky vykazovaly, že k největšímu procentu uložení dochází ve stupni 2 přístroje na sbírání vzorků částeček suspendovaných ve vzduchu nebo v jiném plynu, což ukazuje na optimální velikost částic pro podávání do alveol.

Příklad 16

Srovnání dávkování a ukládání fixovaných nerozpustných mikrotobolek a rozpustných mikrotobolek, vyrobených v příkladu 10, se provádí v plicích králíků.

Anestetizovaným bílým králíkům z Nového Zélandu se podá dávka buď rozpustných mikrotobolek nebo fixovaných mikrotobolek. Dávkování se provádí rozprašovačem řízeným počítačem (Mumed Ltd. , Spojené království). Rozpustné mikrotobolky byly suspendovány v CFC 11 a fixované částice byly suspendovány ve vodě. Po dávkování byly plíce králíků odebrány a vyrobené tobolky byly vyhodnoceny vyrobené tobolky.

Bylo zjištěno, Že fixované tobolky byly v tkáni alveol plic neporušeny. To ukazuje, že mikrotobolky měly příslušnou velikost pro dispergování v plicích. Při srovnání nebyl nalezen žádný důkaz přítomnosti neporušených rozpustných mikrotobolek, tobolky byly rozpuštěny v kapalinách plic. V některých tkáních alveol byla však při studiu fluorescenčním mikroskopem pozorována přítomnost aduktu FITC-lysin. Přítomnost aduktu byla zjištěna také v krvi a moči zvířat, na rozdíl od fixovaných tobolek, které nebyly nikde přítomny.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Mikročástice ve vodě rozpustného materiálu pro použití při terapii nebo diagnose, vyznačující se tím, že jsou hladké a sférické a že alespoň 90 % hmotnosti z nich má střední velikost částic 1 až 10 μη.

2. Mikročástice ve vodě rozpustného materiálu, vyznačující se tím, že jsou hladké a sférické a že alespoň 90 % hmotnosti z nich má střední velikost částic 1 až 10 Mm a že nesou terapeutické nebo diagnostické činidlo.

3. Mikročástice ve vodě rozpustného materiálu podle nároku 2, vyznačující se tí m, Že jsou získá— telné sušením rozprašováním vodného roztoku ve vodě rozpustného materiálu a terapeutického nebo dignostického činidla.

4. Mikročástice ve vodě rozpustného materiálu podle kteréhokoliv z nároků iaž3, vyznačující se tím, že velikost částic je 1 až 5 μη.

5. Mikročástice ve vodě rozpustného materiálu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že mají maximální rozmezí velikosti částic 3 μη.

6. Mikročástice ve vodě rozpustného materiálu podle nároku 5, vyznačující se tím, že mají maximální rozmezí velikosti 2 μη.

7. Mikročástice ve vodě rozpustného materiálu podle kteréhokoliv z nároků laž6, vyznačující se tím, že jsou sterilní.

8. Mikročástice ve vodě rozpustného materiálu podle kteréhokoliv z nároků laž7, vyznačující se tím, že jsou alespoň částečně potaženy materiálem nerozpustným ve vodě.

9. Mikročástice ve vodě rozpustného materiálu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že dále nesou složku vázající receptor.

10. Mikročástice ve vodě rozpustného materiálu podle kteréhokoliv z nároků laŽ9, vyznačující se tím, že se jako ve vodě rozpustný materiál používá sacharid.

11. Mikročástice ve vodě rozpustného materiálu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9, vyznačující se tím, že se jako ve vodě rozpustný materiál používá amino- nebo polyamino-kyselina.

12. Mikročástice ve vodě rozpustného materiálu podle kteréhokoliv z nároků laž9, vyznačující se tím, že se jako ve vodě rozpustný materiál používá mastná kyselina nebo její ester.

13. Mikročástice ve vodě rozpustného materiálu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9, vyznačující se tím, že se jako ve vodě rozpustný materiál používá protein, peptid nebo enzym.

14. Mikročástice ve vodě rozpustného materiálu podle nároku 13, vyznačující se tím, že se jako ve vodě rozpustný materiál používá lidský protein nebo fragment v přírodní nebo rekombinantní formě.

15. Mikročástice ve vodě rozpustného materiálu podle nároku 14, vyznačující se tím, že se jako ve vodě rozpustný materiál používá lidský sérový albumin.

16. Mikročástice ve vodě rozpustného materiálu podle kterého- koliv 2 nároků I aš 15, vyznačující sc t í m, že ve vodě rozpustný materiál je chemicky nebo enzymaticky modifikován před tím, než se vytvoří mikročástice .

17.Inhalační zařízení přizpůsobené pro dodávání terapeutické ho činidla pulmonárními cestami, vyznačuj ící se t í m, že obsahuje terapeutické činidlo ve formě mikročástic podle kteréhokoli v z nároků 1 až 16.

18.Použití terapeutického činidla pro výrobu léčivého pří pravku pro léčení potíží, na které terapeutické činidlo působí při podávání pulmonárními cestami, vyznačující se tím, že terapeutické činidlo je ve formě mikročástic podle kteréhokoliv z nároku 1 až 16.

Zastupuje: