CZ92799A3

CZ92799A3 - Nádobka pro ukládání návnady proti lezoucímu hmyzu

Info

Publication number: CZ92799A3
Application number: CZ99927A
Authority: CZ
Inventors: Charles Austen Angell; Scott W. Demarest; Paul E. Furner
Original assignee: S. C. Johnson & Son, Inc.
Priority date: 1996-09-18
Filing date: 1997-09-18
Publication date: 1999-12-15
Also published as: RU2183060C2; PE106098A1; AU4489697A; MY130942A; CN1230873A; AR008840A1; PL332309A1; ATE228758T1; JP3805793B2; EP0933988A1; KR100332017B1; AP9901484A0; TR199901376T2; JP2001500739A; UA48250C2; WO1998011775A1; AU708465B2; HRP970496A2; EP0933988B1; NZ334603A

Description

Sterolové kompozice z dřeňového mýdla

Oblast techniky

Tento vynález se týká způsobu přípravy a čištění sterolových kompozic z dřeňových mýdel (pulping soaps), skutečných kompozic jako takových a použití těchto kompozic a od nich odvozených směsí jako přípravků pro prevenci nebo ošetřování primární nebo sekundární dyslipidémie.

Dosavadní stav techniky

Přímý důvod postižení srdce a angíny spočívá v degenerativních procesech známých jako ateroskleróza. Ateroskleróza vyplývá z řady spojených vrozených (genetických) okolností a okolností vyvolaných životním prostředím. Vzájemným působením těchto okolností, z nichž potrava u naší civilizace dostává nejdůležitější význam, vede k vývoji atherosklerózy. Růst cholesterolu vyplňujícího ateroskerotic— ké pláty v konečné fázi zabrání dodávce krve do srdečního svalu nebo střídavě do mozku nebo nohou, v závislosti na místě plátu ve stromkovitém rozvětvení tepen.

Jeden z hlavních rizikových faktorů pro aterosklerózu, který je potenciálně modifikovatelný, spočívá v hladině krevního cholesterolu. Řada dobře dokumentovaných studií ukazuje, že hladina krevního cholesterolu je vskutku důležitá pro předpověď rizika postižení srdce a také pro mrtvici.

Vztah mezi koncentrací cholesterolu v krvi a rizikem těchto poruch se kontinuálně (rozpětí napříč všemi hladinami cholesterolu) stupňuje (čím je vyšší hladina, tím větší je pravděpodobnost choroby) s nezřejmým prahem (rovněž snížením

- 2 tak zvaných nízkých hladin může nastat další pokles rizika choroby). Například u lidí starších 40 let hladina cholesterolu 7,0 mmol/1 představuje riziko choroby koronární artérie, které je trojnásobné až čtyřnásobné, než jaké se pojí s hladinami pod 5,0 mmol/1. Vztah nastává zejména při stupni, kdy hladiny jsou nad 5,2 mmol/1. Například úmrtnost mezi muži s hladinami cholesterolu v úrovni 8,0 mmol/1 je takřka šestinásobná než mezi muži s hladinami 4,0 mmol/1. Tato nejčerstvější stanovení jsou v souladu s dřívějšími studiemi.

Jiné velké klinické testy jasně ukazují, že snížením vysokých hladin cholesterolu se může snížit riziko fatálního a nefatálního infarktu myokardu, angíny, změn elektrokardiogramů a při chirurgickém přemostění (bypassu) koronární artérie. Nejlépe známý a první z těchto testů provedly Lipid Research Clinics, přičemž testy koronární primární prevence ukázaly, že s každým snížením celkové hladiny cholesterolu v krvi o 1 % se snižuje o 2 % riziko choroby koronární artérie.

Pro jakoukoli dlouhodobou preventivní terapii hypercholesterolémie je úspěšné, pokud se s ní začne v relativně časném věku a trvá bez časového omezení. Třebaže potrava s nízkým obsahem tuku je základním kamenem takové dlouhodobé terapie, až 60 % pacientů začne být nepoctíjnými po šesti měsících. Obtíže u nepot^ajných pacientů jsou zřetelné v řadě západních zemí s běžnou potravou, která má vysoký obsah tuků. Průřez malého obsahu cholesterolu u mnoha pacientů je zhoršován výskytem dodatečných rizikových faktorů pro kardiovaskulární chorobu, jako je vysoký krevní tlak, diabetes, obezita a kouření.

- 3 Úprava potravy jako terapeutické opatření pro aterosklerózu a jiné kardiovaskulární choroby je znovu zjišťována jako významná během posledních 10 až 15 let. Obzvláště bylo při výzkumu nalezeno, že rostlinné steroly (fytosteroly) jsou účinné při snižování hladin cholesterolu v plasmě, viz Lees a kol., Atherosclerosis, 28 , 325-338 (1977), Kudehodkar a kol., Atherosclerosis, 23., 239 (1976), Day. Artery, 18(3) , 125-132 (1991).

Fytosteroly jsou sloučeniny podobné sterolu, které se syntetizují v rostlinách, s nulovou nutriční hodnotou pro lidi. V rostlinách jsou tyto sloučeniny vyžadovány pro funkci buněk způsobem podobným způsobu, při kterém se cholesterol vyžaduje u lidí. Průměrná potrava na západě obsahuje až 360 mg fytosterolů za den. Nedávno se těmto dietetickým rostlinným sterolům dostalo velmi vysoké péče v důsledku jejich možných protirakovinných vlastností a jejich schopnosti snižovat hladiny cholesterolu, pokud se dodávají jako potrava řadě druhů savců včetně člověka.

Chemicky jsou fytosteroly blízce podobné cholesterolu ve své struktuře. Hlavními fytosteroly jsou β-sitosterol, kampesterol a stigmasterol. Mezi jiné fytosteroly se zahrnuje stigmastanol (β-sitostanol), sitostanol, desmosterol, chalinasterol, poriferasterol, clionasterol a brasikasterol. Chemické struktury β-sitosterolu, kampesterolu a stigmasterolu jsou vyjádřeny dále uvedenými vzorci.

- 4 β-sitosterol

kampesterol

stigmasterol

Mechnismus, kterým fytosteroly snižují cholesterol v krvi živočichů, není zřejmý, ale zdá se, že zahrnuje inhibici absorbce cholesterolu z proximálního lačníku (jejunum) kompeticí s cholesterolem na specifických místech absorbce. Výzkumné údaje také uvádějí, že některé fytosteroly se neabsorbují z proximálního jejuna vůbec (sitostanol) a pokud nastává absorbce (β-sitosterol), dochází k tomu ve velmi omezených množstvích.

Na základě těchto zjištění při výzkumu, použití fytosterolů jako dietetického doplňku ke snížení absorbce cholesterolu se široce zjišťuje, viz Lees a kol., citováno výše, Pollak, Pharmac. Ther., 31, 177-208 (1985) a Raicht a kol., Biochimica et Biophysica Acta, 388, 374-384 (1975).

- 5 V článku, který zveřejnil Lees a kol., citováno výše, se provádí porovnání mezi účinky siterosterolu připraveného ze dvou zdrojů, ze sojových sterolů a sterolů tálového oleje, na cholesterol v plazmě. Přípravky z rostlinných sterolů se zjištují jako účinné při ošetřování pacientů s hypercholesterolémií. Pollak, citováno výše, uvádí přehled fytosterolů a jejich účinku na lipidy v seru. Raicht, citováno výše, popisuje další účinek β-sitosterolu na sterolovou rovnováhu a enzymy omezující rychlost metabolismu sterolů.

Je obecně přijímáno, že fytosteroly nabízejí jedinečnou kombinaci dlouhodobé bezpečnosti, účinnosti a víceúčelovosti při ošetřování lidí. Pokrok se projevuje v souvislosti s izolací a čištěním fytosterolů z rostlinných zdrojů a určením dodatečných zdrojů, které jsou cenově efektivní, ovladatelné ve velkém měřítku a které projevují hypocholesterémické účinky.

Podle dosavadních způsobů se fytosteroly izolovaly ze zdrojů, jako je kukuřičný olej, olej z pšeničných klíčků, dřeň sojových bobů a dřeň z přípravy kukuřičného oleje. Podobně dřeň z přípravy tálového oleje, který se získává během způsobu přípravy papíru ze dřeva, obzvláště z borovicového dřeva, se používá jako zdroj fytosterolů. Obecně při tomto procesu se úlomky dřeva digerují hydroxidem sodným za vzniku buničiny neboli mýdla. Mýdlo se potom destiluje, aby se odstranily těkavé látky, které odcházejí ze dřeně jako zbytek. Z této dřeně výzkumníci izolovali fytosteroly.

Existují určité zřetelné nevýhody těchto tradičních zdrojů fytosterolů. Dřeň z přípravy tálového oleje tvoří mimořádně složitý materiál, který obsahuje pryskyřice, mastné kyseliny, produkty oxidace, esterifikované látky a fytostero

- 6 ly. Třebaže dřeň není drahá tím, že jako zbytek odchází z různých výrobních procesů, je velmi obtížné získávat steroly s vysokou molekulovou hmotností z této dřeně s dobrými výtěžky a o vysoké čistotě, která je vyžadována pro farmaceutické použití.

Julian v US patentu č. 3 840 570 uvádí způsob přípravy sterolů z dřeně z přípravy tálového oleje, který spočívá v extrakci směsí vody, alkoholu a uhlovodíku s následujícím zmýdelněním a poté čištěním. Výchozí látkou pro tento způsob je dřeň z přípravy tálového oleje, ze které se extrahují fytosteroly a různé nečistoty. Bylo zjištěno, že při libovolném způsobu čištění dřeně z přípravy tálového oleje, se zvláště obtížně oddělují alkoholy s dlouhým řetězcem a kyselé nečistoty od sterolů (které samy jsou tvořeny alkoholy s vysokou molekulovou hmotností).

Jiní vědečtí pracovníci z výzkumu uvádějí sporné problémy při čištění sterolů ze dřeně z přípravy tálového oleje v US patentu č. 2 835 682 Steinera a Fritze, US patentu č. 2 715 638 Albrechta a Herrlingera a US patentu č. 2 573 891 Christensona. Je důležité poznamenat, že při každém z těchto známých čisticích procesů je výchozí látkou dřeň z přípravy tálového oleje, kde se projevují problémy při získávání fytosterolů, rozebrané výše.

Předmětem tohoto vynálezu je vyhnout se výše uvedeným nevýhodám nebo zmírnit takové nevýhody.

Podstata vynálezu

Tento vynález poskytuje způsob čištění a přípravy fytosterolových kompozic z dřeňového mýdla, který spočívá

- 7 v tom, že se z dřeňového mýdla extrahuje krémová sraženina a tato sraženina se čistí za vzniku jedinečné fytosterolové kompozice. Uvedeno přesněji, krémová sraženina se extrahuje z dřeňového mýdla za použití rozpouštědlové extrakční procedury. Výsledná kompozice se potom čistí z krémové sraženiny krystalizací.

Tento vynález také poskytuje jedinečné kompozice, které jsou účinné při prevenci nebo ošetřování dyslipidémie a které obsahují β-sitosterol, kampesterol a stigmasterol. Fytosterolové kompozice zde získané se výrazně odlišují kompozic nacházejících se v rostlinách, potravinách a olejích. Zvláště se zdá, že přítomnost stigmasterolu zvyšuje účinnost. Tyto kompozice mohou dodatečně obsahovat různé společně se vyskytující sloučeniny, kterými mohou nebo nemusí být fytosteroly. Mezi tyto společně se vyskytující sloučeniny^. se mohou zahrnout zvláště triterpeny, alkoholy s dlouhým řetězcem a jiné organické sloučeniny, které jsou rozpustné v alkoholu.

Tento vynález dále poskytuje použití kompozic zde popsaných k prevenci nebo ošetřování primární a sekundární dyslipidémie a aterosklerózy včetně koronární srdeční choroby, periferní vaskulární choroby a mrtvice u lidí a zvířat.

Jedinečné kompozice podle tohoto vynálezu projevují vynikající výsledky ve snižování celkového cholesterolu (TC) a lipoproteinu o nízké měrné hmotnosti (LDL) v krvi. Kromě toho a naprosto překvapivě bylo u různých druhů zvířat shledáno, že kompozice podle tohoto vynálezu udržují nebo zvyšují hladiny lipoproteinu o vysoké měrné hmotnosti (HDL) u krevního cholesterolu v plazmě. Tento znak tohoto vynálezu

- 8 má kritickou důležitost, co je dáno skutečností prokázanou výzkumem, že bez ohledu na hladiny celkového cholesterolu, když hladina lipoproteinu o vysoké měrné hmotnosti v plazmě klesá, vzrůstá riziko aterosklerózy. Fytosteroly izolované z dřeně z přípravy tělového oleje, sojových bobů nebo jiných zdrojů, nemají tento jedinečný účinek na lipoproteiny o vysoké měrné hmotnosti, podle znalostí původců tohoto vynálezu.

I když je známo, jak se připravují určité typy fytosterolů z dřeně destilované z mýdla ze zpracovaných dřevěných úlomků, fytosterolové kompozice se dosud nepřipravovaly ze složek dřeňového mýdla při způsobu zpracování úlomků dřeva. Dřeň z přípravy tělového oleje je významně odlišně svým složením od dřeňového mýdla. Předpoklědě se, že překvapivý účinek kompozic podle tohoto vynělezu je důsledkem toho, že se alespoň čěstečně používě dřeňového mýdla jako výchozí lětky a že se také používě zvlěštního způsobu oddělovění.

Přehled obrázků na výkresech

Různé znaky vynělezu budou ilustrověny děle popsanými výkresy, které neomezují tento vynělez, kde obr. 1 je profilem plynové chromatografie pro jednu kompozici (zde děle označovanou jako Forbes-2), spadající do rozsahu tohoto vynělezu, obr. 2 představuje profil na obr. 1 z doby retence 35 až 45 minut, obr. 3 představuje profil na obr. 1 z doby retence 22

- 9 až 27 minut, obr. 4 je ukazatelem hodnot profilu plynové chromatografie z obr. 1, obr. 5 je profilem plynové chromatografie pro jinou kompozici (zde dále označovanou jako Forbes-3), spadající do rozsahu tohoto vynálezu, obr. 6 představuje profil na obr. 5 z doby retence 32 až 48 minut, obr. 7 je ukazatelem hodnot profilu plynové chromatografie z obr. 5, obr. 8 představuje sloupkový diagram ilustrující účinky Forbes-1 a Forbes-2 na koncentrace celkového cholesterolu v krys, obr. 9 představuje sloupkový diagram ilustrující účinky Forbes-1 a Forbes-2 na koncentrace LDL cholesterolu u krys, obr. 10 představuje sloupkový diagram ilustrující účinky Forbes-1 a Forbes-2 na koncentrace HDL cholesterolu u krys, obr. 11 představuje sloupkový diagram ilustrující účinky Forbes-3 na celkový cholesterol v seru u křečků, obr. 12 představuje sloupkový diagram ilustrující účinky Forbes-3 na LDL cholesterol v seru u křečků,

- 10 obr. 13 představuje sloupkový diagram ilustrující účinky Forbes-3 na HDL cholesterol v seru u křečků, obr. 14 představuje sloupkový diagram ilustrující účinky různých dietetických ošetření na hladiny cholesterolu u samců a samic křečka, obr. 15 představuje sloupkový diagram ilustrující účinky různých dietetických ošetřeni na hladiny cholesterolu v plazmě u samců křečka, obr. 16 představuje sloupkový diagram ilustrující účinky různých dietetických ošetření na hladiny cholesterolu v plazmě u samic křečka, obr. 17 představuje sloupkový diagram ilustrující účinky různých dietetických ošetření na hladiny triglyceridu v plazmě u samců a samic křečka, obr. 18 představuje sloupkový diagram ilustrující účinky různých dietetických ošetření na poměry HDL/apoB u samců a samic křečka, obr. 19 představuje sloupkový diagram ilustrující účinky dietetických ošetření na celkový cholesterol u křečka při studii v trvání 45 dnů, obr. 20 představuje sloupkový diagram ilustrující účinky dietetických ošetření na korelaci cholesterolu se sitostanolem, obr. 21 představuje sloupkový diagram ilustrující účinky dietetických ošetření na hladiny lipoproteinu o vysoké

- 11 měrné hmotnosti u křečků při studii v trvání 45 dnů, obr. 22 představuje sloupkový diagram ilustrující účinky dietetických ošetření na poměry ne-apoA/apoA u křečků při studii v trvání 45 dnů a obr. 23 představuje sloupkový diagram ilustrující účinky dietetických ošetření na ne-apoA steroly u křečků během 45 dnů.

Nyní se popisují výhodná provedení tohoto vynálezu.

Způsob podle tohoto vynálezu zahrnuje stupně, které spočívají v tom, že se

A) získá nebo připraví výchozí látka, dřeňové mýdlo rostlinného původu,

B) z mýdla extrahuje krémová sraženina za použití vhodného rozpouštědla a

C) z krémové sraženiny vyčistí fytosterolová kompozice.

Je řada možných zdrojů dřeňového mýdla rostlinného původu. Obecně při známém způsobu (Kraft proces) se úlomky dřeva zpracují s roztokem hydroxidu sodného za vzniku mýdla. Úlomky dřeva mohou být pocházet z libovolných druhů stromů s tvrdým dřevem nebo s měkkým dřevem, mezi které se zahrnuje jedle, cedr, borovice, smrk, ořech, tsuga kanadská a topol, na které však výčet není omezen. Nejvýhodněji úlomky pocházejí z některého druhu dřeva, které roste v lesích amerického pacifického severozápadu nebo v evropských lesích.

- 12 Při fázi extrakce se mýdlo smísí s vodným roztokem ketonu. K extrakci sterolů se používá uhlovodíkového rozpouštědla. Tento stupeň se může provádět při teplotách, které jsou obecně v rozmezí od přibližně 25 do zhruba 150 °C, ale nejvýhodněji jsou od přibližně 50 do zhruba 100 °C. Obzvláště výhodně tato fáze extrakce trvá po dobu 15 až 24 hodin. Je důležité poznamenat, že použití alkoholu není vyžadováno ani navrženo během fáze extrakce. Extrakční proces podle tohoto vynálezu se provádí za použití rozpouštědla tvořeného ketonem, vodou a uhlovodíkem.

Keton se voli ze souboru sloučenin obecného vzorce

RCOR¹, ve kterém

Ί R a R znamenají alkylové skupiny.

Výhodné alkylové skupiny obsahují od 1 do 6 atomů uhlíku. Zvláště výhodným ketonem je 2-propanon (aceton). Uhlovodík se může vybrat ze souboru zahrnujícího všechny uhlovodíky s 5 až 10 atomů uhlíku. Nejvýhodnějším uhlovodíkem je hexan.

Jak je popsáno na obr. 1, produkt z fáze extrakce je krémová sraženina nebo zbytek, z kterého se vyčistí fytosterolová kompozice. Tato fáze čištění se může provádět krystalizací, chromatografickým dělením nebo jinými vhodnými způsoby. Nejvýhodněji se krémová sraženina rozpustí v alkoholu, pomalu ochladí, potom filtruje a promyje studeným alkoholem. Zbytek se vysuší a výsledná látka je tvořena fytosterolovou kompozicí.

- 13 Při výhodné formě alkohol použitý ve fázi čištěni se vybírá ze souboru sloučenin struktury vyjádřené obecným vzorcem

R-CHOHR, R-CH₂OH a RCOH, ve kterém

R znamená alkylovou skupinu s 1 až 4 atomů uhlíku.

Nejvýhodnějším alkoholem je methanol. Fáze chlazení se může provádět při teplotách od 10 do 0 °C, nejvýhodněji od 3 do 4 °C, po dobu 24 hodin.

Fytosterolové kompozice, vznikající při způsobech zde popsaných, se mohou vpravit přímo do potravinového doplňku, vitamínových prostředků a do léčiv pro nepřerušované a preventivní ošetřování aterosklerózy a jejich následků, mrtvice, srdečních příhod a periferní vaskulární choroby. Kromě toho se při jednom provedení tohoto vynálezu pozoruje, že fytosterolové kompozice zde popsané se dostávají ve formě léčiv s vhodnými pomocnými látkami a nosiči. Například tyto kompozice se mohou inkorporovat nebo předepisovat současně s vybranými přípravky snižujícími lipidy, ke snížení nutné dávky, a proto toxicity, těchto posledně uvedených sloučenin.

Fytosterolové kompozice podle tohoto vynálezu projevují zřetelnou schopnost modifikovat lipoproteiny, rovněž při nižších koncentracích fytoproteinů než u známých prostředků. Avšak ještě překvapivější je účinek těchto kompozic na zvyšování hladin lipoproteinů o vysoké měrné hmotnosti (HDL) v plazmě, a proto účinek není spojován s nějakou jinou fytosterolovou kompozicí odvozenou od tálového oleje. Předpokládá se, že tento jedinečný účinek

- 14 může být důsledkem použití dřeňových mýdel jako výchozí látky nebo zajištěním stigmastanolu jako prvku kompozice.

Při výhodné formě, kompozice podle tohoto vynálezu sestávají z fytosterolů v dále uvedených poměrech: β-siterosterol (1), kampesterol (0,2 až 0,4) a stigmastanol (0,2 až 0,5). Výhodněji kampesterol a stigmastanol dohromady představují alespoň 50 % celkové koncentrace β-sitosterolu. Při nejvýhodnější formě kompozice podle tohoto vynálezu sestávají z dále uvedených poměrů fytosterolů, jako při srovnání k fytosterolům pocházejícím ze sojových bobů.

Poměr známých fytosterolů Přibližná β-Sitosterol Kampesterol Stigmastanol čistota (%)

Sojové boby		1	0,640	0,005
Forbes-1	91,0	1	0,354	0,414
Forbes-2	77,0	1	0,330	0,203
Forbes-3	90,0	1	0,268	0,299
Dále	se uvádí složení	a čistota	dvou jiných	extraktů

v rozsahu tohoto vynálezu:

- 15 Složení (%)

Přibližná β-Sitosterol Kampesterol Stigmastanol čistota (%)

Forbes-4 99,0 62,6 16,6

Forbes-5 98,3 64,7 16,4

V každé kompozici zde popsané mohou být přítomny další sloučeniny, kterými mohou nebo nemusí být fytosteroly. Například bylo nalezeno, že kampestanol, jiný fytosterol, může být přítomen v relativně malém množství. Kromě toho mohou být přítomny alifatické alkoholy s přímým řetězcem, jako je behenyl (obsahující 22 atomů uhlíku) a lignocerylalkohol (obsahující 24 atomů uhlíku). Za účelem stanovení povahy těchto společně se vyskytujících alkoholů se provádí analýza plynovou chromatografií s kapalnou stacionární fází každé z nejvýhodnějších kompozic podle tohoto vynálezu.

Podmínky k průběhu plynové chromatografie fytosterolů jsou: počáteční teplota 80 °C, která se udržuje po dobu 1 minuty, zvýšení na teplotu 120 °C, rychlostí 20 °C za minutu, která se udržuje po dobu 7 minut, snížení na teplotu 24 °C, rychlostí 20 °C za minutu, která se udržuje po dobu 15 minut, a zvýšení na teplotu 269 °C, rychlostí 20 °C za minutu, která se udržuje po dobu 25 minut. Na konci každého běhu se teplota zvýší na 320 °C a udržuje po dobu minimálně 5 minut. Injekční teplota činí 300 °C a teplota detektoru 320 °C. Rychlost průtoku kolonou činí 1 ml za minutu a rychlost průtoku dělicím vypouštěcím ventilem odpovídá 4 ml za minutu.

Rychlost průtoku proplachovacím ventilem činí 4,5 ml za minutu. Nosným plynem je helium.

- 16 Výsledky analýzy plynovou chromatografií s kapalnou stacionární fází na pro dvě z nejvýhodnějších kompozic podle tohoto vynálezu jsou znázorněny na obr. 1 až 7.

S ohledem na kompozici Forbes-2, známé steroly se dostavují v oblasti 35 až 45 minut, na obr. 1 a 2. β-Sitosterol je indikován jako pík 87, kampesterol je indikován jako pík 81 a stigmastanol je indikován jako pík 84. Píky 65, 66 a 77 na obr. 2 patří společně se vyskytujícím sloučeninám, které mohou projevovat hypocholesterolémické účinky. Je však možné, že tyto společně se vyskytující sloučeniny mohou mít synergický účinek na působení známých fytosterolů v kompozicích. Podobně na obr. 5 a 6 kampesterol, stigmastanol a β-sitosterol jsou reprezentovány píky 6, 7 a 8.

Jiná výhodná kompozice, spadající do rozsahu tohoto vynálezu, obsahuje dále uvedené složky:

kampesterol 14,1 % kampestanol 3,5 % β-sitosterol 62,8 % stigmastanol 16,9 % pro celkovou koncentraci fytosterolů 97,3 %.

Příklad 1

Extrakce a čištění

Násada 3 kg dřeňového mýdla se získá od B. C.

Chemicals lne. Připraví se směs 3 litrů acetonu a 1,5 litru

- 17 vody a k této směsi se přidá mýdlo. Směs se kontinuálně extrahuje 4,5 litrů hexanu za teploty 50 °C po dobu 24 hodin, za použití odparky o objemu 18 litrů. Výsledný extrahovaný produkt se potom vysuší síranem sodným a nechá odpařit. Tak se připraví 460 g odparku neboli krémové sraženiny.

Krémová sraženina se ohřeje a míchá za použití magnetické tyčinky a pomalu se k ní přidá 460 ml methanolu. Směs se vaří pod zpětným chladičem za míchání po dobu 15 minut a pomalu chladí po dobu 3 až 5 hodin. Směs se chladí na teplotu 3 až 4 °C přes noc a potom filtruje a dvakrát promyje vždy 150 ml studeného methanolu. Nakonec se směs ponechá za sníženého tlaku po dobu 2 dnů a tak se získá 100 g směsi o čistotě 82 % (to znamená 82 g fytosterolů).

Příklad 2

Hodnocení účinků fytosterolových kompozic na krysy

Devadesát samčích krys kmene Wistar (o hmotnosti 80 až 100 g) se rozdělí do 3 experimentálních skupin, pro hodnocení kompozice Forbes-1, kompozice Forbes-2 a sojových bobů.

Třicet krys v každé skupině se dále rozdělí na 5 dietetických režimů, jak je uvedeno v tabulce 2. Krysy se udržují v obráceném světelném cyklu a podává se jim potrava s bazálním semičištěným dietetickým doplňkem (tabulka 1), s rozdílným množstvím cholesterolu a fytosterolů (tabulka 2), po dobu 10 dnů. V každé z 5 dietetických skupin se 2 krysám podává kompozice Forbes-1, 2 krysám se podává kompozice Forbes-2 a 2 krysám se podává fytosterol pocházející ze sojových bobů (Sigma).

- 18 Tabulka 1

Složení experimentální dietetické potravy

Složky

kasein kukuřičný škrob sacharóza ztužený olej Dl-methionin minerální směs vitamínová směs	20 21,5 35 18 0,5 4,00 1,00
Saflorový olej Tabulka 2	a vepřové sádlo smíchané v poměru 1:3.
Dietetické režimy
Skupiny	Sterol přidaný k potravě	bazální dietetické (%)
	Cholesterol	Fytosterol
1	0	0
2	1	0
3	1	0,2
4	1	0,5
5	1	1

Na konci období podávání potravy se krysám zavede

- 19 intraperitoneální injekce oxidu deuteria (0,4 ml) a odpírá se jim potrava a voda alespoň po dobu 2 hodin. Krysy se potom anestetizují halothanem. Ze srdce se odebírají vzorky krve. Vzorky jater, tenkého střeva a svalu se rychle vyjmou, zjistí se jejich hmotnost, vloží se do kapalného dusíku a skladují za teploty -80 °C až do stanovení syntézy cholesterolu. Celkový cholesterol, LDL a HDL cholesterol se stanovují pomocí komerční soupravy (Biopacific Diagnostic Inc.).

Výsledky účinků fytosterolových kompozic na celkový cholesterol, LDL a HDL cholesterol jsou uvedeny na obr. 8, 9 a 10. Účinnost Forbes-1 a Forbes-2 je zřejmá ze snížení LDL cholesterolu, znázorněného na obr. 9, a ze zvýšení HDL cholesterolu, uvedeného na obr. 10, zvláště působením Forbes-1. Na obr. 8 přídavek cholesterolu (dietetická skupina 2) k základní dietetické potravě (skupina 1) má za výsledek zvýšení koncentrací cirkulujícího cholesterolu. Pokračující přidávání zvyšující hladiny fytosterolu (skupiny 3 až 5) má za výsledek normalizace hladin cholesterolu ve skupinách, kterým se podává Forbes-2 a Forbes-1, avšak nikoli fytosteroly sojového bobu, jak se stanoví regresní analýzou. Obr. 9 ukazuje, že fytosteroly Forbes-2 a Forbes-1 mají lepší cholesterol snižující účinek, než fytosteroly sojového bobu pro LDL. Obr. 10 demonstruje větší schopnost zvyšující HDL výhodných kompozic podle tohoto vynálezu, obzvláště Forbes-1, ve srovnání s fytosteroly sojového bobu.

Příklad 3

Ohodnocení účinků fytosterolových kompozic na křečka

Přítomná studie se provádí ke zjištění účinku dietetických fytosterolových kompozic podle tohoto vynálezu

- 20 na dietetickým cholesterolem vyvolané zvýšení z koncentrací sérového cholesterolu u křečků.

Celkem 40 samčím křečkům (o hmotnosti 80 až 100 g), umístěným jednotlivě do drátěných klecí z nerezavějící oceli, se podává žrádlo pro hlodavce a aklimatizují se po dobu 3 dnů za podmínek vzdušné místnosti (teplota 20 až 22 °C, světlo od 17.00 do 5.00 hodin). Křečci se potom rozdělí na 5 skupin o 8 zvířatech v každé skupině a podává se jim potrava po dobu 34 dnů, bazální semičištěný dietetický doplněk (tabulka 3) s rozdílnými množstvími cholesterolu a jedné z fytosterolových kompozic podle tohoto vynálezu (Forbes-3) (tabulka 4).

Tabulka 3

Složení experimentální dietetické potravy

Složky % hmotnostních

kasein	20
kukuřičný škrob	28
sacharóza	36,3
kukuřičný olej	5,0
celulóza	5,0
Dl-methionin	0,5
minerální směs	4,00
vitamínová směs	1,00
hydrogentartrát cholinu	0,2
cholesterol	0,025, 0,25

- 21 Tabulka 4

Dietetické režimy

Skupiny	Cholesterol přidaný ke kontrolní dietetické potravě (%)	Fytosterol přidaný ke kontrolní dietetické potravě (%)
1	0,025	žádný
2	0,25	žádný
3	0,25	0,25
4	0,25	0,5
5	0,25	1,0
Na konci	období podávání potravy se	zvířatům zavede

intraperitoneální injekce oxidu deuteria (0,4 ml) a odpírá se jim potrava a voda alespoň po dobu 2 hodin. Křečci se potom anestetizují halothanem. Ze srdce se odebírají vzorky krve. Jiné vzorky tkáně, včetně jater, tenkého střeva a svalu se rychle odeberou, stanoví se jejich hmotnost, vloží se do kapalného dusíku a skladují za teploty -80 °C až do určení syntézy cholesterolu. Celkový cholesterol, HDL a LDL se stanovují pomocí komerční soupravy. Výsledky jsou statisticky vyhodnocenou jednosměrnou analýzou (ONEWAY) variancí procedury (SYSTAT).

Křečci krmeni potravou s vysokým obsahem cholesterolu mají významně vyšší celkový cholesterol a LDL cholesterol v seru než mají křečci, kterým se podávala normální cholesterolová (0,025 %) dietetická potrava. Doplněk fytosterolů při

- 22 úrovni 0,5 a 1 % zřetelně snižuje toto zvýšení vyvolané vysokou spotřebou cholesterolu (obr. 11 a 12). Koncentrace LDL cholesterolu ve skupině 5 je nižší ve srovnání k hladinám u křečků, kterým se podávala normální strava obsahující cholesterol (obr. 12). Kromě toho se ukazuje negativní regrese, spojená s celkovým cholesterolem a LDL cholesterolem, k hladině fytosterolu přidaného do dietetické potravy (obr. 13).

Doplněk fytosterolu je příčinou slabého zvýšení HDL, aniž by se způsobil významný rozdíl (obr. 13).

Příklad 4

Hodnocení účinků fytosterolových kompozic u křečků při testu v trvání 90 dnů

Šest skupin o 20 křečcích (10 samců a 10 samic) je krmeno semičistou dietetickou potravou, která obsahuje 30 % tuku (poměr polynenasycených a nasycených tuků odpovídá 0,3) po dobu 90 dnů. Dietetická potrava 1 je zbavena cholesterolu. Dietetické potravy 2 až 6 obsahují 0,25 % (hmotnost/hmotnost) dietetického cholesterolu. Dietetické potravy 3 a 4 obsahují fytosteroly Forbes (o více než 90% čistotě) v množství 0,5 a 1 %. Dietetické potravy se připravují z prvotních složek každý týden. Hladiny tuku, fytosterolu a cholesterolu se stanovují plynovou chromatografií s kapalnou stacionární fází. Všechna zvířata mají volný přístup k vodě a dietetické potravě během experimentálního období. Týdně se stanovuje hmotnost zvířat. Příjem potravy se také stanovuje každý den, stejně jako průměr za týden, stanovením hmotnosti misek na potraviny před a po každém časovém období 24 hodin krmení. Po 90 dnech krmení se zvířata usmrtí za použití halothanu a krev

- 23 se zachytí k analýze profilu lipoproteinů. Stanoví se hladiny cirkulujícího celkového cholesterolu, částic obsahujících apoB, HDL cholesterolu a triglyceridu. Také těsně před usmrcením se určí absorpce cholesterolu a rychlost syntézy za použití metody na bázi cholesterolu a deuteria vpraveného do tkáňového cholesterolu. Rovněž tak se stanoví absorpce fytosterolu ve střevech a jiných tkáních. Kromě toho se vzorky střeva a jater uskladní, aby se předaly laboratořím Bio-Research v Senneville, Quebec (Kanada), pro histopatologickou analýzu, pro analýzu karcinogenity a pro analýzu funkce enzymů.

Výsledky

Výsledky jsou uvedeny na obr. 14 až 18. Skupiny na těchto obrázcích jsou často označovány čísly, které odpovídají číslům popsaným v experimentálním návrhu. Písmena nad proužky ve sloupkových diagramech označují významné rozdíly mezi skupinami. Pokud jsou uvedena písmena, proužky sdílející stejné písmeno nejsou významné rozdílné, zatímco proužky s rozdílnými písmeny se liší ve statistické úrovni p < 0,05.

Na obr. 14 až 16 jsou znázorněny hodnoty cirkulujícího cholesterolu pro samce a samice křečka konzumující testovanou dietetickou potravu po dobu 90 dnů. Pozorují se význačné účinky pohlaví na hladiny cirkulujícího cholesterolu pro zvířata, která dostávají dietetickou potravu 2, základní dietetickou potravu pouze s přidaným cholesterolem, a diete— tickou potravu 5, která obsahuje cholesterol a fytosteroly sojového bobu. Samice, třebaže nejsou žádné rozdíly od samců v hladinách cholesterolu u bazální dietetické potravy (skupina 1), projevují vyšší odezvu na samotný přidaný

- 24 cholesterol, v porovnání se samci. Přidání fytosterolů vylučují tento rozdíl, s výjimkou skupiny 5.

Hodnoty hladiny cholesterolu podle pohlaví jsou znázorněny na obr. 15 a 16. Pro samce (obr. 15) přídavek samotného cholesterolu k bazální dietetické potravě snižuje významně růst hladiny cirkulujícího celkového cholesterolu. Přídavek fytosterolů Forbes v množství 0,5 % má za výsledek sklon k poklesu hladiny cholesterolu, avšak přidání fytosterolů Forbes v množství 1 % vede ke zjištění statisticky významného snížení cholesterolu, na přibližně stejné hladiny jako má kontrolní skupina bez přidaného cholesterolu. Když se fytosteroly sojového bobu přidají k dietní potravě v množství 0,5 nebo 1 %, nezjistí se žádná významná ztráta hladiny cirkulujícího celkového cholesterolu u samců. Pro lipoprotein o vysoké měrné hmotnosti se pozoruje rozdílný účinek Forbes proti sojovému bobu, přičemž podávání Forbes nevytváří změny v hladinách lipoproteinu o vysoké měrné hmotnosti u skupiny, které se podává samotný cholesterol (skupina 2), avšak podávání fytosterolů sojového bobu má za výsledek významný pokles hodnot lipoproteinu o vysoké měrné hmotnosti při obou testovaných úrovních (skupiny 5 a 6). Přitom nejsou žádné významné rozdíly mezi částicemi cholesterolu obsahujícími apoB, avšak projevuje se sklon k nižším hladinám s podávaným cholesterolem Forbes v množství 1 %, v porovnání s jinými skupinami.

Údaje pro samice jsou uvedeny na obr. 16. Pro celkový a HDL cholesterol je výslovně patrný vliv přidávání samotného dietetického cholesterolu. Přídavek fytosterolů z libovolného typu zdroje v množství 1 % je ve svém výsledku významný a podobně klesá v koncentracích celkového a HDL cholesterolu.

- 25 Hladiny cirkulujícího triglyceridu u křečků konzumujících testovanou dietetickou potravu jsou uvedeny na obr. 17. Zjišťuje se zvýšení hladin cirkulujícího triglyceridu u samic zvířat, kterým se podává bazální dietetická potrava s cholesterolem a Forbes v množství 0,5 %, v porovnání se samotnou bazální dietetickou potravou, avšak žádné jiné rozdíly uvnitř skupiny se nepozorují u žádného pohlaví, u samců se nezjistí žádný účinek dietetické potravy na koncentraci triglyceridu nebo sklon k tomu.

V souhrnné formě hodnocení výsledků testování dietetické potravy na samcích je uvedeno dále:

Tabulka 5

	Celkový cholesterol LDL HDL
Forbes 0,	r 5 % 4 2 1
Forbes 1,	_r 0 % 1 J 2
Soja 0,5	% 2 3-44
Soja 1,0	^% 3 4-3 3

Výhody kompozic Forbes (podle přítomného vynálezu) mohou být jasně vidět. Kromě toho bylo nalezeno podobné hodnocení poměru HDL k apoB u samců (obr. 18):

Forbes 0,5%2

Forbes 0,1 %

Soja 0,5 %

Soja 1,0 %

Bylo také zjištěno, že poměr HDL k LDL pro kompozice

- 26 Forbes je takřka dvojnásobný ve srovnání se samotným β-sitosterolem.

Příklad 5

Účinky fytosterolové kompozice na králíky

Při této studii se testují dva králíci během 43 dnů s ohledem na účinky jedné kompozice podle tohoto vynálezu (Forbes 1 % v dietetické potravě) na profily celkového cholesterolu. Výsledky jsou uvedeny dále:

Tabulka 6

Profily celkového cholesterolu u králíků (mg/dl)

Datum	Králík A	Králík B
14.06.95	95	215
18.06.95	129	162
26.06.95	—	začíná krmení
		s Forbes 1 %
07.07.95	75	106
09.07.95	—	začíná krmení
		s Forbes 1 %
18.07.95	90	112
25.07.95	82	118
01.08.95	95	119
08.08.95	76	114

U obou králíků A a B může být zřejmý pokles celkového cholesterolu během podávání fytosterolové kompozice (Forbes

- 27 1 %) po dobu 2 týdnů. Tento účinek trvá po přerušení podávání Forbes v množství 1 %. Účinky kompozic podle tohoto vynálezu na snížení celkového cholesterolu pokračují po počáteční fázi podávání.

Příklad 6

Účinky fytosterolové kompozice na apoE deficiantní myši

Zvířata: Devatenáct samců apoE deficiantní myši starých 5 týdnů se zakoupí v laboratoři Jackson Laboratory, USA. Zvířata se nahodile rozdělí do 2 skupin a to 9 zvířat do kontrolní skupiny a 10 myší do experimentální Forbes skupiny. Po 5 dnech jako adaptivní periodě, se myším odebere krev z ocasu do kapiláry a plazma se odstředí z krve a stanoví se lipidy v plazmě myší.

Dietetická potrava: Žrádlo s nízkým obsahem cholesterolu a nízkým obsahem tuku se zakoupí od firmy Jamieson's Pet Food Distributors Ltd., Vancouver, B.C., Kanada. Fytosteroly pocházející z tělového oleje se extrahují z mýdla z přípravy tělového oleje, za použití způsobu popsaného v tomto vynělezu. Čistota a procentuělní obsah každého jednotlivého fytosterolu ve směsi konečného produktu se testuje plynovou chromatografií s kapalnou stacioněrní fězí. Konečně lětka ukazuje až na 95% čistotu a obsahuje 69 % sitosterolu, 15 % kampesterolu a 16 % stigmastanolu. Myší žrědlo se rozemele na jemný prěšek. K tomuto prěšku se přídě 0,15 % (hmotnost/ /hmotnost) cholesterolu (Sigma) a vše se dobře promíchě. Podíl tohoto dietetického doplňku s obsahem cholesterolu se znovu peletuje, vysuší a použije pro krmení kontrolní skupiny myší. Další čěst se doplní 2 % (hmotnost/hmotnost) fytosterolů extrahovaných z tělového oleje, znovu peletuje, vysuší

- 28 a použije pro podávání jako potrava experimentální skupiny myší.

Biochemické testy: Celkový cholesterol a triglyceridy v plazmě se měří za použití enzymatické soupravy (Boehringer Mannheim) a HDL cholesterol se stanoví dříve publikovanou metodou srážení za použití polyethylenglykolu 6000.

Tělesná hmotnost a spotřeba potravin: Tělesná hmotnost myší a spotřeba potravin se měří týdně.

Tabulka 7

Střední tělesná hmotnost (g) myší (jsou uvedena pouze měsíční měření)

Datum	Forbes skupina	Kontrolní skupina
20.06.95	21,42	21,02
24.07.95	29,82	28,00
22.08.95	32,12	29,73
12.09.95	34,16*	30,78

* p < 0,05

Tabulka 8

Střední týdenní spotřeba potravy (g) myší (jsou uvedena pouze měsíční měření)

- 29 Datum

Forbes skupina Kontrolní skupina

26.06.-03.07.95	19,61	21,21
1.08.-08.08.95	32,62*	29,20
15.08.-22.08.95	29,32	27,10
O5.09.-12.09.95	35,56	30,25

p < 0,05

Další zjištění: Nepozorují se žádné vedlejší účinky s ohledem na novou dietetickou potravu. Všechna zvířata z obou skupin vypadají normálně, s normálním vlastnostmi včetně stavu střev. Jedna myš v kontrolní skupině byla nalezena uhynulá dne 11. července 1995. Protože se nezachovalo tělo myši, nebylo možné provést pitvu. Jiná myš z Forbes skupiny se našla dehydratována se ztrátou tělesné hmotnosti. Zvíře bylo usmrceno a jako příčina jeho nemoci byla zjištěna malokluze (přerostlé zuby).

Statistická analýza: Výsledky se analyzovaly za použití T-testu dvou vzorků s předpokladem rovných rozptylů.

Výsledky

Výsledky jsou shrnuty v dále zařazených tabulkách.

Tabulka 9

Střední hladina celkového cholesterolu v plazmě myší (mg/dl)

Datum	Forbes skupina	Kontrolní skupina
20.06.95	606,28	599,61
18.07.95	1027,96*	1622,56
06.09.95	1168,57*	1508,63
* p < 0,0001

Tabulka 10

Střední hladina triglyceridu v plazmě myší (mg/dl)

Datum	Forbes skupina	Kontrolní skupina
20.06.95	110,97	120,31
18.07.95	210,17	143,71
06.09.95	224,48	152,25

Tabulka 11

Střední hladina HDL cholesterolu u myší (mg/dl) ^Datum Forbes skupina (9) Kontrolní skupina (7)

08.07.95 42,00* 18,29 * p < 0,001

Z výsledků může být zřejmé, že skupina dostávající kompozici Forbes vykazuje významný (33%) pokles celkového cholesterolu, významný vzrůst triglyceridů a významný vzrůst HDL cholesterolu (>100 %).

- 31 Příklad 7

Účinek fytosterolové kompozice na křečky, test v trvání 45 dnů

Padesát GS křečků se umístí na dobu 2 týdnů do klece pro zvířata, pro snadné zacházení s nimi před krmením semičistou dietetickou potravou po dobu 45 dnů. Křečci se rozdělí do 5 skupin a podává se jim 0,25 % cholesterolu, společně s jednou ze čtyř směsí rostlinných sterolů (steroly získané ze sojových bobů nebo tálového oleje, čistý sitostanol a syntetická směs, kterou představují fytosteroly tálového oleje). Kontrolní skupina obdrží toliko 0,25 % cholesterolu. Příjem potravy se sleduje během studijního období každý třetí den. Tělesná hmotnost křečků se měří každý týden a v době odebírání tkáně. Tři dny před usmrcením GS křečků se tito křečci lekce anestetizují diethyletherem a intravenózní injekcí do jugulární žíly se zavede 0,4 ml intralipidu, který obsahuje 0,18 mg ¹³C-cholesterolu. Přímo po injekci se zvířatům zavede žaludeční sondou 0,6 ml směsi (kokosového oleje, olivového oleje a saflorového oleje), která obsahuje 0,44 mg ¹⁸)-cholesterolu. Potom se GS křečci udržují ve svých drátěných klecích po dobu 72 hodin s tím, že se jim podle libosti podává voda a potrava.

V den usmrcení se každému křečkovi i.p. injekcí zavede 1 ml deuterované vody a křeček se ponechá jednu hodinu před usmrcením. Zvířata se anestetizují diethyletherem a vzorky krve se zachycují kardipunkcí. Játra, žlučník, tenké střevo, tlusté střevo a srdce se výjmou, ochladí v kapalném dusíku a uskladní v mrazničce za teploty -80 °C. Mrtvá těla a výkaly křečků se skladují za teploty -20 °C, pro další analýzu

- 32 celkového lipidu a sterolu.

Mereni přijmu potravy, tělesné hmotnosti a hmotnosti jater

Příjem potravy u GS křečků se měří každý třetí den. Statistická analýza neukazuje na významný rozdíl mezi pěti skupinami v jejich spotřebě potravy. Průměrný denní příjem v pěti skupinách se mění od 8,84 do 9,34 g za den, hodnota p = 0,4. Zvířata projevují významný vzrůst své tělesné hmotnosti přibližně o 25 až 40 g během časového období studie, hodnota p < o,05 (párový T-test). Konečné měření tělesné hmotnosti křečků odpovídá rozmezí od 112,5 do 154,3 g. Nezaznamená se žádná statistická významnost mezi různě ošetřovanými skupinami, hodnota p = 0,43.

Hmotnost jater se významně mění mezi různě rozdělenými zvířaty. Skupina ošetřovaná sitostanolem projevuje nejnižší hmotnosti jater, ve srovnání s kontrolní skupinou a jinými skupinami, které dostávaly 0,25 % cholesterolu a rozdílné fytosteroly. Kromě toho skupina ošetřovaná fytosteroly ze sojových bobů představuje podobně významný rozdíl ke skupině osetrene sitostanolem, když se hodnoty statisticky analyzují za použití Newman-Keulsova testu. Obecně všechny skupiny, ktere dostávaly v potravě rostlinné steroly, mají nižší hmotnost jater, v porovnání s kontrolní skupinou, které se podávalo 0,25 % cholesterolu, hodnota p = 0,01. GS křečci, kteří měli v potravě steroly tálového oleje a sitostanol/ mají průměrně hmotnost jater o 15 a 20 % nižší než kontrolní skupina. Přírodní tálový olej a synteticky připravený tálový olej dokládají podobné hodnoty hmotnosti jater, na základě čeho se předpokládá, že chybějící sloučenina v rostlinném oleji ze sojových bobů, sitostanol, hraje hlavní úlohu v poklesu obsahu sterolu v játrech.

- 33 Analýza lipidů

1. Celkový cholesterol

Hodnoty celkového cholesterolu se stanoví za použití komerčně dostupné soupravy enzymatických reakčních činidel na VP autoanalyzátoru. Vzorky krve se měří dvakrát a průměr ze dvou hodnot se použije pro konečnou statistickou analýzu. Pro různé analýzy lipidů se používá se jednosměrná ANOVA, s Newman-Keulsovou a Bonderroniho metodou. Sitostanol snižuje významně hladinu celkového cholesterolu v plazmě z jater GS křečků o 34 %, ve srovnání s kontrolním stanovením. Střední hodnota pro kontrolní skupinu činí 229,6 mg/dl a pro skupinu ošetřenou sitostanolem 151,2 mg/dl, hodnota p = 0,007. Fytosteroly tálového oleje a směsi syntetického tálového oleje projevují podobný pokles cholesterolu (17,5 %) v plazmě, 118,4 a 186,1 mg/dl. Avšak fytosteroly tálového oleje (Forbes) ukazují významný pokles hodnoty celkového cholesterolu (175,2 mg/dl), pokud se hodnota vzorku mimo rozsah vyloučí z analýzy, hodnota p < 0,02 ve skupině tálového oleje, v porovnání s kontrolní skupinou (pouze 0,25 % cholesterolu). Korelace mezi přítomností sitostanolu a nižší hladinou v plazmě je významná, hodnota p < 0,0001 a r = 0,46.

II. HDL cholesterol

ApoA podíl lipoproteinů přítomných v HDL cholesterolu neukazuje na jakékoli významné změny v jeho hodnotách mezi pěti rozdílnými skupinami, hodnota p = 0,18. Pozoruje se nevýznamný pokles o 15 % ve střední HDL hodnotě ve skupině ošetření sitostanolem. Nicméně tento prvek nezpůsobuje

- 34 významný pokles celkového cholesterolu, který činí 34 %. Poměr ne-apoA lipoproteinů k apoA (HDL) lipoproteinům se nemění významně mezi skupinami. Směšovací účinek nevýznamně nižších hodnot lipoproteinů o vysoké měrné hmotnosti ve skupinách ošetřených sitostanolem a tálovým olejem přispívá k vývoji nevýznamného výsledku v ne-apoA/apoA (HDL) hodnotách. Obecně rozdílné typy fytosterolů nemění hladinu HDL cholesterolu v plazmě GS křečků.

III. LDL a/nebo ne-apoA steroly

Sitostanol je účinný při poklesu ne-apoA sterolů v plazmě. Ukazuje se pokles v ne-apoA lipoproteinech o 55 %, hodnota p = 0,02. Podobně k účinku na celkový cholesterol, tálový olej a syntetická směs tálového oleje snižují ne-apoA steroly o 21 %, co opět vede k přesvědčení o silné korelaci existující mezi obsahem sitostanolu ve fytosterolech a jejich příznivými účinky na pokles hladin cholesterolu v plazmě GS křečků. Tento pokles však není statisticky významný v důsledku variability hodnot triglyceridu.

IV. Triglycerid

Pokud se aplikuje jednosměrná metoda ANOVA na hodnoty triglyceridu, test normality se nezavádí. GS křečci se usmrtí při stavu, kdy nehladoví (důležitý stav pro další syntézu cholesterolu, kinetiku a analýzu absorpce). V důsledku takové situace jsou různé hodnoty mimo stupnici. S hodnotami ANOVA hladiny triglyceridu neukazují žádný statistický rozdíl mezi skupinami. Rostlinné steroly nepůsobí na hladiny triglyceridu v plazmě u GS křečků.

- 35 Tabulka 12

Hodnota účinnosti

Celkový cholesterol

HDL LDL TG

kontrolní stanovení	C	C	C	C
β-sitostanol sojových	4	1	3-4	1-4
bobů
tálový olej (Forbes)	2-3	2-2	2-3	1-4
sigmastanol	1	4	1	1-4
syntetický tálový	3-2	3-2	4-3-2	1-4

olej

Na závěr se uvádí, že kompozice odvozené od mýdla z přípravy tálového oleje podle tohoto vynálezu projevují příznivější profil v důsledku zvýšení HDL cholesterolu a poklesu celkového cholesterolu. Tento účinek lipoproteinu o vysoké měrné hmotnosti se neukazuje u kompozice se syntetickým tálovým olejem. Podobně celkový účinek sitostanolu není příznivý v důsledku významného poklesu lipoproteinu o vysoké měrné hmotnosti.

Třebaže problém není zcela jasný, s ohledem na rostlinné steroly se zdá, že relativně hydrofóbní steroly inhibují více absorpci celkového cholesterolu, zatímco relativně hydrofilní steroly mají větší vliv na hladinu lipoproteinu o vysoké měrné hmotnosti. Fytosterolové kompozice podle tohoto vynálezu jsou jedinečné v tom, že zabezpečují oba tyto účinky.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1,0 β-sitosterolu k

0,268 kampesterolu k

0,299 stigmastanolu.

1. Způsob izolace fytosterolové kompozice z dřeňového mýdla rostlinného původu, vyznačující se tím, že se v první fázi smíchá dřeňové mýdlo s rozpouštědlovou směsí obsahující keton, zvolený ze souboru sloučenin struktury obecného vzorce

RCOR¹, ve kterém

Ί

R a R znamenají alkylové skupiny, alifatický uhlovodík, zvolený z uhlovodíků s 5 až 10 atomy uhlíku, a vodu, bez obsahu alkoholu, za teploty obecně od 25 do 150 °C, za vzniku krémové sraženiny, a v druhé fázi se z krémové sraženiny vyčistí fytosterolová kompozice.

2. Způsob podle nároku 1, vyzná tím, že se fytosterolová kompozice čistí ny krystalizací.

č u j í c í se z krémové sraženi-

3. Způsob podle nároku 1,vyznačující se t i m, že dřeňové mýdlo se připravuje z úlomků dřeva zvoleného ze souboru zahrnujícího cedr, jedli, borovici, smrk, ořech, tsugu kanadskou a topol.

4. Kompozice snižující cholesterol, v y z n a č u

-( náhradní strana)

- 37 Jící se tím, že obsahuje nejvýše 70 % hmotnostních β-sitosterolu, alespoň 10 % hmotnostních kampesterolu a dále obsahuje stigmastanol.

5. Kompozice podle nároku 4, vyznačuj ící se t i m, že kampesterol a stigmastanol dohromady tvoří alespoň 50 % koncentrace β-sitosterolu.

6. Kompozice podle nároku 4, vyznačuj ící se t í m, že poměr β-sitosterolu odpovídá 1,0, kampesterolu odpovídá 0,2 až 0,4 a stigmastanolu odpovídá 0,2 až 0,5.

7· Kompozice podle nároku 4, vyznačuj ící se t í m, že poměr β-sitosterolu odpovídá 1,0, kampesterolu odpovídá 0,354 a stigmastanolu odpovídá 0,414.

8. Kompozice podle nároku 4, vyznačuj ící se t í m, že poměr β-sitosterolu odpovídá 1,0, kampesterolu odpovídá 0,330 a stigmastanolu odpovídá 0,203.

9. Kompozice podle nároku 4, vyznačuj ící se t í m, že poměr fytosterolů odpovídá

10. Kompozice, vyznačující se tím, že je připravena způsobem popsaným v nároku 1.

11. Použití kompozice podle nároku 8, k přípravě léčiva pro snížení koncentrace LDL cholesterolu v plazmě.

Anáhraetnl sLianaj- 38 -

12. Látka terapeuticky účinná k prevenci nebo ošetřování primární nebo sekundární dyslipidémie a aterosklerózy, vyznačující se tím, že obsahuje kompozici podle nároku 8 a její farmaceuticky účinný nosič.

13. Kompozice podle nároku 10, vyznačuj íci se t í m, že dodatkově obsahuje společně se vyskytující sloučeniny.