CZ9735U1 - Zkrácené deriváty lidského insulinu - Google Patents
Zkrácené deriváty lidského insulinu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ9735U1 CZ9735U1 CZ200010361U CZ200010361U CZ9735U1 CZ 9735 U1 CZ9735 U1 CZ 9735U1 CZ 200010361 U CZ200010361 U CZ 200010361U CZ 200010361 U CZ200010361 U CZ 200010361U CZ 9735 U1 CZ9735 U1 CZ 9735U1
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- phe
- human insulin
- insulin
- peptide
- truncated derivatives
- Prior art date
Links
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical class C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 title claims description 9
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 8
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 8
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims description 8
- HTSGKJQDMSTCGS-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(4-chlorophenyl)-2-(4-methylphenyl)sulfonylbutane-1,4-dione Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1S(=O)(=O)C(C(=O)C=1C=CC(Cl)=CC=1)CC(=O)C1=CC=C(Cl)C=C1 HTSGKJQDMSTCGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 2
- NLFBCYMMUAKCPC-KQQUZDAGSA-N ethyl (e)-3-[3-amino-2-cyano-1-[(e)-3-ethoxy-3-oxoprop-1-enyl]sulfanyl-3-oxoprop-1-enyl]sulfanylprop-2-enoate Chemical compound CCOC(=O)\C=C\SC(=C(C#N)C(N)=O)S\C=C\C(=O)OCC NLFBCYMMUAKCPC-KQQUZDAGSA-N 0.000 claims 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 12
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 5
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 108700028250 desoctapeptide- insulin Proteins 0.000 description 5
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N dichloromethane Natural products ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 5
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N anisole Chemical compound COC1=CC=CC=C1 RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 4
- -1 Boc - t-Butoxycarbonyl Chemical group 0.000 description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N N-Methylmorpholine Chemical compound CN1CCOCC1 SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000005515 capillary zone electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 3
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- UHPQFNXOFFPHJW-UHFFFAOYSA-N (4-methylphenyl)-phenylmethanamine Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1C(N)C1=CC=CC=C1 UHPQFNXOFFPHJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MQUQNUAYKLCRME-INIZCTEOSA-N N-tosyl-L-phenylalanyl chloromethyl ketone Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1S(=O)(=O)N[C@H](C(=O)CCl)CC1=CC=CC=C1 MQUQNUAYKLCRME-INIZCTEOSA-N 0.000 description 2
- SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methylglycine Chemical compound OCC(CO)(CO)[NH2+]CC([O-])=O SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 2
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910000040 hydrogen fluoride Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N methoxybenzene Substances CCCCOC=C UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- TWADEBCIPVNACR-ZDUSSCGKSA-N (2s)-2-(n-(4-methylphenyl)sulfonylanilino)propanoic acid Chemical compound C=1C=C(C)C=CC=1S(=O)(=O)N([C@@H](C)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 TWADEBCIPVNACR-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 229960000549 4-dimethylaminophenol Drugs 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N D-cystine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CSSC[C@@H](N)C(O)=O LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- YGYAWVDWMABLBF-UHFFFAOYSA-N Phosgene Chemical compound ClC(Cl)=O YGYAWVDWMABLBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004642 Polyimide Substances 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N Syringetin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007997 Tricine buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 1
- DEZRYPDIMOWBDS-UHFFFAOYSA-N dcm dichloromethane Chemical compound ClCCl.ClCCl DEZRYPDIMOWBDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- MQYQOVYIJOLTNX-UHFFFAOYSA-N dichloromethane;n,n-dimethylformamide Chemical compound ClCCl.CN(C)C=O MQYQOVYIJOLTNX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXGNZZKBCMGWAZ-UHFFFAOYSA-N dimethylformamide dmf Chemical compound CN(C)C=O.CN(C)C=O UXGNZZKBCMGWAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 231100000508 hormonal effect Toxicity 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 description 1
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- LLYKPZOWCPVRPD-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylpyridin-2-amine;n,n-dimethylpyridin-4-amine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1.CN(C)C1=CC=CC=N1 LLYKPZOWCPVRPD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001721 polyimide Polymers 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N trifluoroacetic acid Substances OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N xenon atom Chemical group [Xe] FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
Zkrácené deriváty lidského insulinu
Oblast techniky
Technické řešení se týká nových semisyntheticky připravených zkrácených derivátů lidského insulinu.
Dosavadní stav techniky
Krácení karboxyterminální sekvence B-řetězce lidského insulinu je možné, ale má ve vztahu k biologickému účinku své limity. Kritická délka B řetězce insulinu je 25 aminokyselin a to ještě za předpokladu, že koncový karboxyl fenylalaninu 25 je amidován:
ío 22 23 24 25 26 27 28 29 30
-----Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr.
Jiné řešení je zachování sekvence B22-B26. U analogů lidského insulinu připravených semisyntheticky z desoktapeptidu insulinu a tetrapeptidů je viditelnější dopad následných záměn provedených v dané oblasti molekuly lepší než je tomu u despentapeptidů analogů lidského insulinu (CZ užitný vzor 6381). V CZ užitném vzoru č. 6381 byla pozornost soustředěna na destetrapeptidy insulinu, v jejichž karboxyterminální části B-řetězce B23- B26 byla modifikována peptidová vazba, tj. byl substituován vodík - NH - skupiny methylovou skupinou. Cílem bylo zajistit vyšší metabolickou stabilitu proti endopeptidasovému štěpení. Zavedením
N-methylované aminokyseliny (N(CH3)fenylalaninu) do jednotlivých posic bezpochybně zvýší odolnost vazeb vůči chymotrypsinu, ale odrazí se v prostorovém uspořádání té části řetězce, která je považována za rozhodující pro interakci insulinového analogu s receptorem. Zavedením N-methylované aminokyseliny ztrácí peptidová vazba schopnost tvořit vodíkový můstek. Se změnou konformace peptidové vazby je spojena změna lokální flexibility peptidového řetězce a vzroste hydrofobicita peptidu.
Postupem peptidové synthesy na pevné fázi byly připraveny tři analogy sekvence B23 - B26, které byly pomocí enzymově katalysované semisynthesy připojeny na karboxyl argininu B22. Produkty byly isolovány a charakterisovány.
Podstata technického řešení
Předmětem technického řešení jsou zkrácené deriváty lidského insulinu obecného vzorce I X-Gly-Y (I) kde X = desoktapeptidinsulin,
Y = Phe-Phe-PheNH2 (látka I) nebo
Phe-Phe-N(CH3)PheNH2 (látka II) nebo
Phe-N(CH3)-Phe-PheNH2 (látka ΠΙ).
Tetrapeptidy, které se připraví synthesou na pevné fázi se kondensují s desoktapeptid insulinem v přítomnosti tosylfenylalaninchlorketon trypsinu v 50 - 65% DMF při teplotě 4 - 25 °C po dobu 3-24 hodin. Vzniklé produkty se isolují RP-HPLC.
Příklady provedení
Vysvětlení zkratek
Boc - t-Butoxykarbonyl,
DIEA - Diisopropylethylamin,
-1 CZ 9735 Ul
DCM - Dichlormetan,
HOBt ester - Hydroxybenztriazolový ester,
DCC - Dicyklohexylkarbodiimid,
DMF - Dimethylformamid,
DMAP - Dimethylaminopyridin,
TFA - Kyselina trifluoroctová,
RP - HPLC - Vysokoúčinná kapalinová chromatografie na reversní fázi,
TPCK - Tosylfenylalaninchlorketon.
Příklad 1 ío Tetrapeptidy byly synthetisovány na pevné fázi dle Merrifielda. K synthese byla použita 4-methylbenzhydrylaminová (MBHA) pryskyřice (substituce 0,57 mmol/g). Jako semipermanentní N-koncové chránění byla použita t-butyloxykarbonylová skupina (Boc). Synthesa byla prováděna v 0,3 mmol měřítku. Byl použit následující protokol synthesy. Pryskyřice byla neutrálisována opakovaným promytím 10% DIPEA v DCM (2x5 min), potom byla promyta
DCM (3 x 1 min). Poté byl do reaktoru s pryskyřicí přidán trojnásobný molámí přebytek HOBt esteru chráněné aminokyseliny. Reakce probíhala 1 hodinu. (Ester byl připraven zBocaminokyseliny a HOBt působením DCC ve směsi DCM-DMF (9 : 1), reakční doba byla 30 minut při 0 °C. Od vzniklého esteru byla odfiltrována vysrážená dicklohexylmočovina, tato promyta DCM a filtrát zahuštěn za laboratorní teploty a poté přidán DMF do výsledné koncentrace přibližně 0,1 M. Výjimkou byly kondensace Boc-N(CH3)Phe, kdy kondensace byla prováděna buď činidlem ByBrop/DMAP nebo HBTU/DIEA. Průběh reakce byl sledován kvalitním Kaiserovým testem, pouze však při kondensaci nemethylovaných aminokyselin. Pokud byl test negativní, následoval další reakční krok. V případě positivního nálezu byla kondensační reakce opakována. Po ukončení výstavby peptidového řetězce byla odštěpena N-koncová Boc skupina působením 50% TFA v DCM, reakce probíhala 25 min. Poté se pryskyřice promyla DCM, 4 x 1 min, objem DCM byl vždy 50 ml. Pryskyřice byla vysušena do konstantní váhy. Odštěpení peptidů z nosiče spolu s odštěpením chránících skupin v postranních řetězcích bylo provedeno kapalným fluorovodíkem ve směsi s anisolem (9 : 1) při 0 °C. Flurovodík byl vyfoukán dusíkem při 0 °C a anisol extrahován vychlazeným diethyletherem (4 x 50 ml). Uvolněné peptidy byly extrahovány 20% kyselinou octovou (5 x 50 ml), pryskyřice odfiltrována a roztok peptidu lyofilisován. Čistota peptidu byla kontrolována stanovením aminokyselinového složení, RP-HPLC a hmotovou spektrometrií.
Příklad 2
Příprava [Gly23-Phe24-Phe25-Phe26-NH2]destetrapeptidB27‘B30insulinu: Pro přípravu tohoto kráce35 něho analogu byl použit následující protokol: 23 mg tetrapeptidu bylo smícháno s 195 μΐ DMF a 55 μΐ 0,05M a CaCl2. Bylo přidáno 22 mg desoktapeptid insulinu (DOI) a reakční směs jemně protřepána. 3 mg TPCK-trypsinu byly rozpuštěny v 50 μΐ 0,05 M CaCl2 a přidány do reakční směsi, pH reakční směsi bylo upraveno N-methylmorfolinem na hodnotu 7,0. Reakce probíhala za míchání po dobu 3 až 24 hodin, konverse byla monitorována. Reakce byla zastavena přidáním
1 ml acetonu. Sraženina byla odstředěna a supematant oddělen, sraženina byla opětovně promyta ml acetonu. Sediment byl rozpuštěn v 1,2 ml 10 % kyseliny octové a výsledný roztok byl jímán a lyofilizován. Výsledný produkt byl charakterizován RP-HPLC, hmotovou spektrometrií a kapilární elektroforesou.
Příklad 3
Příprava [Gly23-Phe24-Phe25-N(CH3)Phe26-NH2]destetrapeptidB27‘B30insulinu: 10 mg peptidu bylo rozpuštěno v 98 μΐ DMF a přidáno 27 μΐ 0,05M CaCl2. Poté bylo přidáno 9,1 mg DOI, šetrně zamícháno a přidáno 1,5 mg TPCK trypsinu rozpuštěného v 25 μΐ 0,05 M CaCl2. Poté bylo postupováno postupem uvedeným v příkladu 2. Reakční doba byla nejméně 3 hodiny, teplota byla mezi 5-25 °C.
-2CZ 9735 UI
Příklad 4
Příprava [Gly23-Phe24-N(CH3)Phe25-Phe26-NH2]destetrapeptidB27‘B30insulinu: 11 mg příslušného tetrapeptidu bylo rozpuštěno ve 110 μΐ DMF a přidáno 30 μΐ 0,05 M CaCl2. Do reakční směsi bylo přidáno 10 mg DOI a 1,5 mg TPCK-trypsinu rozpuštěného v 25 μΐ 0,05 CaCl2. Poté bylo postupováno dle příkladu 2. Reakční doba byla nejméně 3 hodiny při teplotě 5-25 °C.
Příklad 5
Kapilární zonová elektroforesa (CZE). Analysa čistoty připravených peptidů byla prováděna metodou CZE se zdrojem vysokého napětí 0-15 kV. Separačním prostorem byla křemenná kapilára s vnějším polyimidovým povlakem o vnitřním průměru 0,056 mm, vnějším průměrem ío 0,200 mm, celkové délce 315 mm a efektivní délce (od startu k detektoru) 200 mm. Peptidy byly analysovány v 0,5 M kyselině octové, nebo v roztoku o složení 0,04 M Tris a 0,04 M Tricinu, pH
8,1. Vzorek byl nanášen manuálně a měření bylo prováděno při laboratorní teplotě. Separace probíhala v režimu konstatního napětí 10,0 kV a proud dosahoval hodnot 9,5-10,8 μΑ. Detekce byla prováděna spektrofotometricky při 206 nm.
Příklad 6
Hmotová spektra jednotlivých peptidů. Měření bylo prováděno metodou FAB, která spočívá v ionisaci testovaných vzorků pomocí urychlených atomů xenonu. Vzorek byl umístěn na glycerinovou matrici. Snímání spekter bylo prováděno vícekanálovou analysou při nízké rozlišovací schopnosti. Byl použit třísektorový hmotový spektrometr YAB-EQ s geometrií
BEQQ vyrobený firmou VG Analytical Manchester. Iontový zdroj pracoval při urychlovacím napětí 8 kV.
Příklad 7
Aminokyselinové složení peptidů: Peptidy byly hydrolysovány v 6 M HCI při teplotě 110 °C po dobu 20 hodin ajednotlivé aminokyseliny separovány na přístroji D-500 (Durrum corp.)
Zastoupení prolinu a cystinu nebylo vyhodnocováno.
Průmyslová využitelnost
Zkrácené deriváty lidského insulinu podle technického řešení lze využít pro základní biochemický a farmakologický výzkum a jako látky s hormonálním účinek.
Claims (1)
- 30 1. Zkrácené deriváty lidského insulinu obecného vzorce IX-Gly-Y (I) kde X = desoktapeptidinsulin,Y = Phe-Phe-PheNH2 (látka I) neboPhe-Phe-N(CH3)PheNH2 (látka II) nebo 35 Phe-N(CH3)-Phe-PheNH2 (látka III).
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ200010361U CZ9735U1 (cs) | 2000-02-03 | 2000-02-03 | Zkrácené deriváty lidského insulinu |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ200010361U CZ9735U1 (cs) | 2000-02-03 | 2000-02-03 | Zkrácené deriváty lidského insulinu |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ9735U1 true CZ9735U1 (cs) | 2000-03-10 |
Family
ID=5473775
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ200010361U CZ9735U1 (cs) | 2000-02-03 | 2000-02-03 | Zkrácené deriváty lidského insulinu |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ9735U1 (cs) |
-
2000
- 2000-02-03 CZ CZ200010361U patent/CZ9735U1/cs unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5478810A (en) | Peptide amides, processes for the preparation thereof and agents containing these as fibrin/thrombin clotting inhibitors | |
| Beyermann et al. | Rapid continuous peptide synthesis via FMOC amino acid chloride coupling and 4-(aminomethyl) piperidine deblocking | |
| Hojo et al. | Development of a Linker with an Enhanced Stability for the Preparation of Peptide Thioesters and Its Application to the Synthesis of a Stable-Isotope-Labelled HU-Type DNA-Binding Protein. | |
| Kawakami et al. | The use of a cysteinyl prolyl ester (CPE) autoactivating unit in peptide ligation reactions | |
| AU2017286333B2 (en) | Metabolically stable spexin peptide analogs | |
| US8377891B2 (en) | Process for synthesis of cyclic octapeptide | |
| JP2013536822A (ja) | ｈ「Ｇｌｙ２」ＧＬＰ−２の固相合成 | |
| Marsh Jr et al. | Mechanism of action of thrombin on fibrinogen. Kinetic evidence for involvement of aspartic acid at position P10 | |
| Aimoto et al. | Development of a facile method for polypeptide synthesis. Synthesis of bovine pancreatic trypsin inhibitor (BPTI). | |
| Moroder et al. | Studies on cytochrome c. Part II. Synthesis of the protected heptapeptide (sequence 17–23) of Baker's yeast iso‐1‐cytochrome c | |
| Vita et al. | Synthesis of charybdotoxin and of two N‐terminal truncated analogues: Structural and functional characterisation | |
| EP1756141B1 (en) | Process for the preparation of peptides | |
| CN108047323B (zh) | 一种固相片段法合成GpTx-1及其类似物和合成方法 | |
| XUE et al. | Synthesis of S‐alkyl and C‐terminal analogs of the Saccharomyces cerevisiae a‐factor: Influence of temperature on the stability of Fmoc and OFm groups toward HF | |
| CZ9735U1 (cs) | Zkrácené deriváty lidského insulinu | |
| Nishiuchi et al. | Combined solid‐phase and solution approach for the synthesis of large peptides or proteins | |
| CZ2000401A3 (cs) | Zkrácené deriváty lidského insulinu | |
| Cordeau et al. | Selenazolidine: A selenium containing proline surrogate in peptide science | |
| Pawlak et al. | Synthesis of a novel side‐chain to side‐chain cyclized enkephalin analogue containing a carbonyl bridge | |
| Wong et al. | Synthesis of a fully active snake venom cardiotoxin by fragment condensation on solid polymer | |
| RU2096415C1 (ru) | Циклические пептиды или их фармацевтически приемлемые соли, фармацевтическая композиция | |
| Mezö et al. | Cyclohexyloxycarbonyl based orthogonal solid phase peptide synthesis in Boc chemistry | |
| CZ10670U1 (cs) | Zkrácené deriváty lidského insulinu | |
| Byrnes et al. | SYNTHESIS AND CHARACTERIZATION OF DENDROTOXIN: A POTENT POTASSIUM CHANNEL | |
| Hojo et al. | Chemical synthesis of palmitoylated histone H4. |