CZ9802013A3

CZ9802013A3 - Deriváty OB proteinu, chimerní OB polypeptidy, prostředky pro léčbu obezity a dalších fyziologických stavů a způsob léčení těmito prostředky, kódující sekvence pro OB protein, expresní vektor nesoucí tuto sekvenci, buňky transformované tímto vektorem a způsob jejich kultivace, a způsob navození růstu buněk s pomocí OB proteinu

Info

Publication number: CZ9802013A3
Application number: CZ982013A
Authority: CZ
Inventors: Sauvage Frederic J. De; Nancy Levin; Richard L. Vandlen
Original assignee: Genentech, Inc.
Priority date: 1995-12-27
Filing date: 1996-12-19
Publication date: 1998-09-16
Also published as: BR9612359A; JP4037905B2; CN1154726C; MX9804687A; CA2238307A1; JP2000504210A; ATE267255T1; RU2178307C2; WO1997024440A1; DE69632546T2; NZ326592A; EP0870026B1; IL124831A0; AU1520097A; DE69632546D1; EP0870026A1; CN1205738A

Description

Vynález se týká derivátů OB proteinu s dlouhým poločasem. Konkrétně se vynález týká chiinérních proteinů složených z OB proteinu a imunoglobulinu a dalších derivátů OB proteinu s dlouhým poločasem, přípravků s obsahem těchto derivátů a způsobů podávání těchto derivátů. Vynález se dále týká způsobu léčení obezity podáváním derivátů OB proteinů s dlouhým poločasem, jako například chiinérních proteinů složených z OB proteinu a imunoglobulinu.

Dosavadní stav techniky

Obezita je nejčastější nutriční poruchou, která podle posledních epidemiologických studií postihuje asi jednu třetinu Američanů starších dvaceti let (Kuczmarski a kol., J. Am. Med. Assoc, 272, 205-211 (1994)). Obezita je příčinou množství vážných zdravotních poruch včetně kardiovaskulárních onemocnění, diabetů II. typu, inzulínové rezistence, hypertenze, hyperglyeeridemie, dislipoproteinemie a některých forem rakoviny (Pi-Sunyer, F.X., Anns. Int. Med, 1 19, 655-660, (1993); Colfitz, G.A., Am. J. Cli. Nutr. 55, 503S-507S (1992). Bylo zjištěno, že jednoduchá mutace v genu „ob“ („ob“ mutace) je příčinou obezity a diabetů II. typu u myši (Friedman, Genomics 11, 1054-1062, (1991). V poslední době byl osekvenován a publikován myší gen ob i jeho lidský homolog (Zhang a kol., Nátuře 372. 425-431 (1994)) a předpokládá se, že • · · · • · • · »

produkt genu ob může fungovat jako součást signální dráhy z adipózní tkáně, která reguluje velikost tělních tukových zásob. Parabiózní experimenty již před více než 20 lety prokázaly, že geneticky obézní myši nesoucí dvě mutantní kopie ob genu (ob/ob myši) nevytvářejí faktor sytosti, který reguluje příjem potravy, zatímco diabetické {db/db) myši tento faktor vytvářejí ale nedokáží na něj odpovídat (Coleman a Hummal, Am. J, Physiol. 217, 12981304 (1969); Coleman, Diabetol. 9, 294-298 (1973). Poslední výsledky tří nezávislých výzkumných týmů prokázaly, že každodenní injekce rekombinantní ho OB proteinu inhibují příjem potravy a regulují tělesnou hmotnost a množství tuku u makroskopicky obézních ob/ob myší, ale nikoliv u db/db myší (Pelleymounter a kol.. Science 269, 540-543 (1995); Halaas a kol., Science 269, 543-546 (1995); Campfield a kol., Science 269, 546549 (1995)), z čehož vyplývá, že ob protein je takovým faktorem sytosti, jak to předpokládaly dřívější studie. Výsledky těchto dřívějších studií ovšem ponechávají mnohé otázky nezodpovězené a vykazují množství dosud nevyřešených rozporů. Například zatímco byl prokázán mírný účinek každodenních injekcí ob proteinu na příjem potravy a tělesnou hmotnost u hubených myší, byla pitvou prokázána významná redukce tělesného tuku v jednom (Halaas a kol, viz výše), ale nikoliv v ostatních (Pelleymounter a kol., viz výše) případech, nezávisle na ekvivalentním snížení tělesné hmotnosti. Pelleymopunter a kol. navíc zjistili, že z neznámých důvodů u ob/ob myší, kterým byl aplikován OB protein v dávce 0,1 mg/kg/den, vzrostla tělesná hmotnost o 17,13 %, zatímco u obézních muší, které obdržely OB protein v dávce 1 mg/kg/den docházelo k poměrně mírné redukci hmotnosti. Receptor • ·

nebo receptory pro ob protein nebyly dosud identifikovány. Existence periferních receptorů nemůže být zatím vyloučena, ovšem poslední výsledky ukazují, že důsledkem zvýšeně exprese ob genu v aďipózní tkáni myší s hypothalamickou lézí není štíhlý fenotyp a tudíž že OB protein pravděpodobně neinteraguje přímo s tukovými buňkami (Maffei a kol.. Proč. Nati. Acad. Sci. 92, 69576960 (1995). Vědci předpokládají, že nejméně jeden OB receptor je lokalizován v mozku. Identifikace a exprese klonovaného leptinového receptorů (OB-R) byla popsána Tartaglia a kol., Cell 83., 1263-1271 (1996). Různé izoformy leptinového receptorů byly dále popsány Cioffi a kol., Nátuře Medicine 2, 585-89 (1996). Lidský hematopoetinový receptor, který by mohl být receptorem pro OB protein je popsán v PTC žádosti č. WO 96/08510, publikované 21. března 1996. Receptor OB proteinu byl popsán v Tartaglia a kol., Cell 83, 1263-1271 (1995).

Podstata vynálezu

Navrhovaný vynález je založen na poznatku, že OB protein má podstatně větší účinek na redukci tělesné hmotnosti a hmotnosti adipózní tkáně je-li podáván ve formě kontinuální podkožní infúze, než je-li stejná dávka podávána každý den podkožní injekcí. Vynález je dále založen na neočekávaném zjištění, že chimérní protein ve kterém je OB polypeptid fúzován s konstantní doménou imunoglobulinu je pozoruhodně potentnější při redukci tělesné hmotnosti a tukových zásob, než nativní lidský OB protein, jsou-li oba proteiny podávány podkožní injekci lx denně. Toto poslední zjištění je zvláště překvapivé proto, že OB-imunoglobulin chimérní protein má příliš velikou molekulovou hmotnost díky které pravděpodobně není schopen projít bariérou z krevního • · · · • · řečiště do mozku a tudíž ani nemůže reagovat s OB receptory o kterých se předpokládá, že jsou v mozku přítomny.

Jeden z aspektů vynálezu se týká derivátů OB proteinu s dlouhým poločasem, které umožňují u léčeného jedince redukovat tělesnou hmotnost a/nebo příjem potravy. Vynález se dále týká prostředků s obsahem takových derivátů a jejich podávání za účelem snížení tělesné hmotnosti a/nebo příjmu potravy.

Další z aspektů vynálezu se týká chimérního polypeptidu obsahující aminokyselinovou sekvenci OB proteinu schopnou vazby na nativní OB receptor, vázanou s imunoglobulinovou sekvencí (zkracováno jako OB-imunoglobulinové chiméry nebo imunoadheziny). V jednom konkrétním případě chimérní protein obsahuje aminokyselinovou sekvenci OB proteinu schopnou vazby na nativní OB receptor fúzovanou s aminokyselinovou sekvencí konstantní domény imunoglobulinu. OB část chimérního proteinu podle navrhovaného vynálezu přednostně obsahuje dostatečně dlouhou aminokyselinovou sekvenci nativního OB proteinu tak, aby proteinu zůstala zachována schopnost vazby a signalizace prostřednictvím nativního OB receptorů. Nejraději si OB protein zachovává schopnost redukovat tělesnou hmotnost je-li podán obéznímu lidskému nebo ne-lidskému subjektu. OB polypeptid je přednostně humánního původu a fúzován je přednostně s konstantní doménou těžkého imunoglobulinového řetězce. V jednom konkrétním případě jsou asociovány dva fúzní proteiny OB polypeptid-imunoglobulinové těžký řetězec (kovalentní vazbou přes disulfidické můstky) v homodimerní strukturu podobnou imunoglobulinu. Lehký řetězec imunoglobulinu může být dále asociován s jednou nebo oběma OB-imunoglobulinovými • · · · · • · · · · · • · · chimérami opět disulfidickou kovalentní vazbou za vzniku homotrimerní nebo homotetramerní struktury.

Vynález se dále týká nukleové kyseliny kódující chimérní polypeptidové řetězce podle navrhovaného vynálezu, expresních vektorů obsahujících DNA kódující takové molekuly, transformovaných hostitelských buněk a metod produkce takových molekul kultivací transformovaných hostitelských buněk.

Ačkoliv jsou deriváty s prodlouženým poločasem podle navrhovaného vynálezu vhodné především pro redukci tělesné hmotnosti a/nebo příjmu potravy, mohou být obecně použity pro léčbu stavů asociovaných s abnormální expresí nebo funkcí OB genu a/nebo k navození biologické odpovědi prostřednictvím OB receptorů. OB deriváty podle navrhovaného vynálezu mohou být tedy použity například pro léčbu bulimie, k redukci hladiny inzulínu, tj. u pacientů s diabetem I a II typu, a také jako mitogeny pro různé typy buněk exprimující OB receptor. Všechny zmíněné, a i další podobné způsoby použití jsou předmětem navrhovaného vynálezu

V dalším případě se vynález týká purifikace OB receptorů za použití OB-imuňoglohulinové chiméry.

Stručný popis obrázků

Obrázek 1 nahoře - štíhlým samičkám myší byl podáván myší OB protein buď ve formě kontinuální podkožní infúze nebo každý den podkožní injekcí. Zobrazená data představují průměrnou tělesnou hmotnost každé skupiny v gramech, n = 4 myši/bod.

Obrázek 1 dole - je zobrazena průměrná hmotnost retroperitoneálních tukových polštářů. Kontinuální podkožní infúze •· 999 9 · » · • · · · • · • · • ·

I • ·

OB proteinu byly opět efektivnější ve smyslu redukce tukové tkáně než každodenní podkožní injekce.

Obrázek 2 nahoře - obézním samiěkám ob/ob myší byl podáván lidský OB protein (hOB) nebo lidský OB-IgG-1 fúzní protein (hOB-IgG-1). Zobrazená data představují průměrnou změnu tělesné hmotnosti v každé skupině od prvního do posledního dne experimentu v gramech, n = 3 myši/úsečku kromě hOB 0,19 mg/kg/den ve skupině injekcí kde n - 4 a PBS ve skupině injekcí kde η = 1.

Obrázek 2 dole - zobrazená data představují průměrný příjem potravy pro každou testovanou skupinu za šest 24 hodinových period experimentu v g/myš/den, n = 1.

Obrázek 3 nahoře a dole - obézním {ob/ob) samiěkám myší byl podáván hOB nebo hOB-IgG-1 fúzní protein podkožní injekcí denně po dobu 7 dnů. Zobrazená data jsou uspořádána jako na obrázku 2, n = 4 pro všechny testované skupiny.

Obrázek 4 nahoře - obézním (ob/ob') samiěkám myší byl podáván hOB protein, nebo PEG-hOB. Zobrazená data představují průměrnou změnu tělesné hmotnosti pro každou pokusnou skupinu od prvního do posledního dne experimentu v gramech, n = 3-4 s výjimkou skupiny PBS injekcí, kde n = 1. Látka byla myším podávána každý den podkožní injekcí. „PEG IX“ a „PEG 2X“ označuje poměr PEG a proteinu v přípravku.

Obrázek 4 dole - zobrazená data představují průměrný příjem potravy pro každou testovanou skupinu za šest 24 hodinových period experimentu v g/myš/den, n = 3-4.

Obrázek 5 - obézním (ob/ob) samiěkám myší byl podáván hOBIgG fúzní protein, nativní hOB nebo hCD4-IgG formou ·· · · · · každodenních podkožních injekcí po dobu 7 dnů. n = 6 pro všechny testované skupiny s výjimkou hOB 3,8 mg/kg/den, kde n =

2. Znovu bylo potvrzeno, že fúzní protein byl účinnější než nativní hOB protein ve smyslu redukce tělesné hmotnosti (horní a prostřední graf) i příjmu potravy (dolní graf).

Obrázek 6 - nukleotidová sekvence (SEQ.ID.NO: 1) a aminokyselinová sekvence (SEQ. ID. NO: 2) lidského OB-IgG-1 chimérního proteinu podle příkladu 1.

Detailní popis vynálezu

A. DEFINICE

Termín „obezita“ je používán pro popis stavu jedince s nadváhou spojený s nadbytkem tělesného tuku. Správná hmotnost určitého individua závisí na množství faktorů včetně pohlaví, výšky, věku, celkové stavby atd. Stejné faktory určují, kdy bude jedinec považován za obézního. Určení optimální tělesné hmotnosti daného jedince je plně v kompetenci lékaře.

Termín „dlouhý poločas“ a jeho gramatické varianty použité ve spojení s OB deriváty popisují OB deriváty s delším poločasem existence v plazmě, tj. s pomalejším úbytkem, než jaký vykazuje odpovídající nativní OB protein. Deriváty s dlouhým poločasem mají poločas nejméně l,5x delší než nativní OB protein; ještě raději 2x delší a nejraději nejméně 3x delší než nativní OB protein. Nativní OB protein je přednostně OB protein jedince, který má být léčen.

Termíny „OB“, „OB protein“, „OB polypeptid“ a jejich gramatické varianty jsou navzájem zaměnitelné a jsou používány pro popis nativního OB proteinu nebo nativní sekvence OB proteinu • · 9999

9 999 9

99

9 9 « • · 9 9

999 9 1 • · I

99 (známého také jako „leptin“) a jejich funkčních derivátů. OB polypeptidy mají typické strukturní vlastnosti cytokinů, tj. polypeptidů uvolňovaných jednou buněčnou populací, které působí na jiné buňky jako mezi buněčné mediátory, jako jsou například růstové hormony, inzulínu podobné růstové faktory, interleukiny, inzulín, glykoproteinové hormony jako například folikuly stimulující hormon (FSH), thyroidní stimulující hormon (TSH), tumor nekrotizující faktory a a β (TNF-α a TNF-β), nervové růstové faktory jako například NGF-β, PDGF, transformující růstové faktory (TGF), jako například TGF-α a TGF-β, inzulínu podobný růstový faktor -1 a -2 (IGF-1 a IGF-2), erytropoetin, osteoinduktivní faktory, interferony (IFN) jako například IFN- a, IFN- β a IFN- γ, kolonie stimulující faktory (CSF) jako například M-CSF, GM-CSF a G-CSF, interleukiny (IL), jako například IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 a další polypeptidové faktory.

Termíny „nativní“ nebo „nativní sekvence“ OB polypeptidů jsou použity pro popis OB polypeptidů ze kteréhokoliv živočišného druhu (tj. lidský, myší, králičí, kočičí, ovčí, kuřecí, prasečí, koňský atd.) tak, jak se vyskytuje v přírodě, včetně přirozeně se vyskytujících alel s delecemi, substitucemi a nebo inzercemi tak, jak jsou v současnosti známé, nebo jak by mohly být v budoucnu identifikovány, za předpokladu že mají zachovanou schopnost vázat OB receptor a přenášet jeho prostřednictvím signál. Nativní lidský OB polypeptid tedy představuje aminokyselinovou sekvenci mezi N-koncem a cysteinem (Cys) v pozici 167 aminokyselinově sekvence na obrázku 6 (viz. také SEQ.ID.NO:2 a obrázek 6 ve Zhang a kol., viz výše) a přirozeně se vyskytující varianty tohoto ·· ··«·

9999

99

9 9 9 9 9

9 · 99

9 9 99· 9 9

9 9 9 9

99 99 proteinu tak, jak jsou v současnosti známé, nebo jak by mohly být v budoucnu identifikovány. Podobně termíny „nativní“ nebo „nativní sekvence“ myšího OB polypeptidu představují aminokyselinovou sekvenci zobrazenou na obr. 6 Zhang a kol., viz. výše a přirozeně se vyskytujíeí varianty tohoto polypeptidu tak, jak jsou v současnosti známé, nebo jak by mohly být v budoucnu identifikovány. Definice konkrétně zahrnuje varianty proteinu s i bez aminokyseliny glutaminu v pozici 49 při použití číslování podle Zhang a kol., viz, výše. Termíny „nativní“ nebo „nativní sekvence“ OB polypeptidu zahrnují nativní proteiny s i bez iniciačního N-terminálního methioninu (Met) asi bez nativní signální Sekvence, buď v monomerní, nebo v dimerní formě. Běžně známé nativní lidský a myší OB polypeptidy jsou 167 aminokyselin dlouhé proteiny obsahující dva konzervované eysteinové zbytky a vykazující vlastnosti sekretovaného proteinu. Polypeptid je převážně hydrofilní a předpokládané místo štěpení signální sekvence je v pozici 21 při použití číslování podle Zhang a kol., viz. výše. Celková sekvenční homologie lidského a myšího proteinu je okolo 84 %. Oba proteiny vykazují větší podobnost v N-termiriální oblasti maturovaného proteinu s pouze čtyřmi konzervativními a třemi nekonzervantivními substitucemi v oblasti mezi místem pro štěpení signální sekvence a konzervovaným cysteinem v pozici 117. Molekulová hmotnost OB proteinu v monomerní formě je okolo 16 kDa.

„Funkční derivát“ nativního polypeptidu je sloučenina mající kvalitativní biologické vlastnosti společné s nativním polypeptidem. Funkční derivát OB polypeptidu je sloučenina mající kvalitativní biologické vlastnosti společné s nativním ·· 9999

99 9

99 « · · · * · · 9 9 9

Λ 9 9 9 9 9 9 9 99 · · · · · ·♦···· 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

99 99 9 99 99 (lidským nebo jiným živočišným) OB polypeptidem. „Funkční deriváty“ představují např. fragmenty nativních polypeptidů kteréhokoliv živočišného druhu (včetně lidských) a deriváty nativních živočišných i lidských polypeptidů a jejich fragmenty za předpokladu, že si zachovávají biologickou aktivitu společnou s odpovídajícím nativním polypeptidem.

Termín „fragmenty“ zde označuje oblasti uvnitř sekvence maturovaného nativního OB polypeptidů. Preferované fragmenty OB polypeptidů obsahují C-konec maturovaného polypeptidů a mohou obsahovat relativně krátkou deleci (nebo delece) na N-konci i v dalších částech molekuly, které nejsou nezbytné pro vazbu receptorů a/nebo pro zachování strukturní integrity molekuly. Termín „derivát“ tak, jak je zde použit označuje varianty proteinu lišící se v aminokyselinové sekvenci nebo kovalentní modifikace nativního polypeptidů, zatímco termín „varianta“ odpovídá variabilitě v aminokyselinové sekvenci v mezích této definice. „Biologická vlastnost“ v kontextu definice „funkčních derivátů“ je definována jako 1) imunologická křížová reaktivita s nejméně jedním epitopem nativního polypeptidů (tj. nativního OB polypeptidů kteréhokoliv druhu), nebo 2) existence nejméně jedné adhezivní, regulační nebo efektorové funkce, společné s nativním polypeptidem.

Funkčními deriváty jsou přednostně polypeptidy shodující se v aminokyselinové sekvenci nejméně v 65 %, raději pak v 75 %, ještě raději nejméně v 85 % a nejraději nejméně v 95 % s nativními OB proteiny a pro člověka nejsou imunogenní.

Identita nebo homologie v aminokyselinové sekvenci je zde definována jako procento aminokyselinových zbytků studované

0000

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 00 00

00 0 0 0 0 0 • 0 0 00

0 0000 · « 0 0 0 0 00 00 sekvence, které jsou identické s aminokyselinovými zbytky odpovídající sekvence nativního póly peptidu při lineárním porovnání sekvencí a po případném vložení mezer nezbytných pro dosažení maximální homologie. Žádné konzervativní substituce nejsou při určování sekvenční identity uvažovány. Ani extenze, ani inzerce na C- či N- koncích proteinů nejsou brány v úvahu jako činitelé redukující stupeň identity nebo homologie proteinů.

Termín „imunologicky křížově reagující“ tak, jak je použit zde označuje schopnost odpovídajícího (poly)peptidu kompetitivně irthibovat reakci odpovídajícího nativního polypeptidu s polyklonálními protilátkami nebo s antisérem, připraveným proti známé aktivní molekule. Takové protilátky nebo antiséra jsou připraveny konvenčním způsobem, tj. imunizací živočicha, jako například kozy nebo králíka, například podkožní injekcí známého nativního OB proteinu v kompletním Freudovu adjuvans a následnou další intraperitoneální nebo podkožní injekcí proteinu opět v kompletním Freudovu adjuvans.

Termín „izolovaný OB polypeptid“ a jeho gramatické varianty se týkají OB polypeptidů (tak, jak byly definovány výše) oddělených od kontaminujících polypeptidů přítomných v lidském těle i v dalších živočišných druzích, nebo pocházejících z jiného zdroje, ze kterého je polypeptid izolován.

Obecně termín “varianta aminokyselinové sekvence” označuje molekulu s některými odlišnostmi v aminokyselinové sekvenci ve srovnaní s referenčním (nativním) polypeptidem. Rozdíly v aminokyselinové sekvenci mohou být způsobeny substitucemi, inzercemi nebo delecemi v původní sekvenci a nebo kteroukoliv vhodnou kombinací těchto změn.

···· ·· ·· • · · · · • · · ·· • · ··· · · • · · · • ·· ··

Substitučními variantami jsou takové, u kterých byl nejméně jeden aminokyselinový zbytek z původní sekvence odstraněn a jiný aminokyselinový zbytek byl vložen do stejné pozice. Substituce mohou být jednoduché, kdy dochází k záměně pouze jediné aminokyseliny, nebo mnohočetné, kdy jsou zaměněny dvě nebo více aminokyselin v jednom polypeptidovém řetězci.

Inzerěními variantami jsou polypeptidy s jedním nebo více aminokyselinovými zbytky vloženými do nativní aminokyselinové sekvence v pozici právě sousedící s aminokyselinou v odpovídající pozici nativní sekvence. Termín právě sousedící s aminokyselinou znamená vázaný buď k α-kaboxy nebo k α-amino funkční skupině aminokyseliny.

Deleění variantou je takový polypeptid, u něhož byla z původní aminokyselinové sekvence odstraněna jedna nebo více aminokyselin. Obvykle bývá u deleění ch variant odstraněna jedna, případně dvě aminokyseliny z jedné určité oblasti molekuly. Termínem “kovalentní deriváty” jsou označeny modifikace nativního polypeptidů nebo jeho fragmentu s organickým proteinovým nebo neproteinovým derivatizaěním agens a posttranslaění modifikace. Kovalentní modifikace vznikají tradičně reakcí cílového aminokyselinového zbytku s organickým derivatizaěním agens schopným reagovat s vybranou skupinou nebo s koncovou částí molekuly, nebo jsou výsledkem funkce posttranslačně modifikačního systému fungujícího ve vybrané rekombinantní hostitelské buňce. Určité posttranslační modifikace jsou výsledkem účinků rekombinantní hostitelské buňky na exprimovaný polypeptid. Glutaminylové a asparaginylové zbytky bývají často posttranslačně deamidovány na odpovídající glutamyl • ·· · a asparatyl resp. Alternativně mohou být tyto zbytky deamidovány za slabě kyselých podmínek. OB-imunoglobulinové chiméry podle vynálezu mohou obsahovat kteroukoliv ze zmiňovaných forem. Dalšími posttranslaěními modifikacemi mohou být například hydroxylace prolinu a lyzinu, fosforylace hydroxylových skupin šeřinu, tyroyinu a threoninu, či methylace α-amino skupin lyzinu a argininu a bočního řetězce histidinu [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, str. 75-86 (1983)].

Termíny “kódování pomocí DNA sekvence”, “DNA kódování” a “kódování nukleovou kyselinou” se týkají pořadí neboli sekvence deoxyrihonukleotidů podél řetězce deoxyribonukleové kyseliny. Pořadí těchto deoxyribonukleotidů určuje pořadí aminokyselin v polypeptidovém řetězci. DNA sekvence tedy kóduje aminokyselinovou sekvenci.

Termín “replikační expresní vektor” a “expresní vektor” označují DNA, obvykle dvouřetězcovou, do které může být vložena cizorodá DNA sekvence. Cizorodá DNA je definována jako heterologní DNA, tj. DNA která se v hostitelské buňce přirozeně nevyskytuje. Vektor se používá pro transport cizorodé neboli heterologní DNA do vhodné hostitelské buňky. Po vstupu do buňky je vektor schopen replikace nezávisle na hostitelské chromozomální DNA, čímž může být vytvořeno několik kopií vektoru včetně vložené cizorodé DNA. Navíc nese vektor geny nezbytné pro translaci cizorodého genu a tak může být rychle nesyntetizováno velké množství molekul polypeptidu kódovaného cizorodou DNA. Termínem „kontrolní sekvence“ je zde označována DNA sekvence nezbytná pro expresi nezbytná pro expresi s ní funkčně spojené • · · · * · • · · · · · kódující sekvence odpovídajícího hostitelského organizmu. Prokaryotické kontrolní sekvence obsahují například promotor, operátor, vazebné místo pro ribozóm a případně i další, zatím málo známé sekvence. Eukaryotické buňky využívají promotory, polyadenylační signály a zesilovače.

Nukleová kyselina je funkčně spojená s jinou sekvencí, pokud je mezi těmito sekvencemi funkční vztah. Například DNA pro presekvenci neboli vedoucí sekvenci sekretovaného proteinu je funkčně spojena s DNA pro polypeptid, je-li tento exprimován jako preprotein, ve kterém se vedoucí sekvence účastní sekrece polypeptidu; promotor nebo zesilovač je funkčně spojen s kódující sekvencí, pokud ovlivňuje transkripci této sekvence· vazebné místo pro ribozóm je funkčně spojeno s kódující sekvencí, pokud je umístěno tak, aby umožňovalo translaci. Obecně „funkčně spojené“ znamená, že DNA sekvence jsou blízko sebe a v případě vedoucí sekvence sekretovaného proteinu sousedí a jsou ve stejném čtecím rámci. Zesilovače ovsem se sekvencí, kterou ovlivňují nemusí vůbec sousedit. Spojení sekvencí je dosaženo ligací ve vhodných restrikčních místech. Pokud taková místa neexistují, používají se namísto nich syntetické oligonukleotidové adaptory nebo linkery. Výrazy „buňka“, „buněčná linie“ a „buněčná kultura“ tak, jak jsou použity v kontextu navrhovaného vynálezu jsou navzájem zaměnitelné a všechny se týkají dceřinných buněk. Výrazy „transformant“ a „transformovaná (hostitelská) buňka“ se tudíž týkají primárně odvozených buněk a buněčných kultur bez ohledu na počet transferů. Je také zřejmé, že všechny dceřinné buňky nemohou mít absolutně shodný obsah DNA, ať už díky úmyslným, nebo i náhodným mutacím. Mutantní dceřinné buňky, které mají • · · ··· ·> ···· ·· · ·· · ···· ··· ··· ···· ·· «···· · ··· · · ···· ··· ··· ·· ·· toto · ·· ·· stejnou funkci nebo biologickou aktivitu, která je testována u správně transformovaných buněk, jsou zahrnuty také. Pokud tomu bylo v některém případě jinak, je tato skutečnost zřetelně vyznačena v textu.

Nativní imunoglobuliny jsou obvykle heterotetramerní glykoproteiny s molekulovou hmotností přibližně 150 000 daltonů. Skládají se ze dvou identických lehkých řetězců (L) a dvou identických těžkých řetězců (H). Každý lehký řetězec je spojen s těžkým řetězcem jednou kovalentní disulfidickou vazbou, zatímco počet disulfidických vazeb mezi jednotlivými těžkými řetězci se u jednotlivých izotypů liší. V každém těžkém i lehkém řetězci jsou dále v pravidelných rozestupech další vnitrořetězeové disulfidické můstky. Každý těžký řetězec se skládá z jedné koncové variabilní domény (V_H) a několika konstantních domén. Každý lehký řetězec se skládá z jedné koncové variabilní domény (V_L) a konstantní domény na opačném konci řetězee, Konstantní doména lehkého řetězce prostorově sousedí s první konstantní doménou těžkého řetězce a variabilní doména lehkého řetězce prostorově sousedí s variabilní doménou těžkého řetězce. Soudí se, že kontakt mezi variabilními doménami lehkého a těžkého řetězce je zprostředkován specifickými aminokyselinovými zbytky (Clothia a kol., J. Mol. Biol. 186, 651-663 (1985); Novotný a Haber, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82, 4592-4596 (1985)).

V závislosti na aminokyselinové sekvenci konstantních oblastí těžkých řetězců jsou imunoglobuliny rozděleny do několika tříd. Existuje pět hlavních tříd imunoglobulinů: IgA, IgD, IgE, IgG a IgM, z nichž některé mohou být dále rozděleny do podtříd (izotypů), tj. Ig.G-1, IgG-2, lgG-3 a IgG-4, IgA-1 a IgA-2.

·· ···· ·· ···· ·· ····· · ··· · φφφφ φφφ · · • Φ ΦΦ φφφ φφ Γ·

Konstantní oblasti těžkých řetězců, které odpovídají odlišným třídám ímunoglobulinů, se nazývají α, δ, ε, γ a μ, resp.

V součastné době jsou dobře známy podjednotkové složení i trojrozměrná struktura jednotlivých tříd Ímunoglobulinů. IgA-1 a IgA-2 jsou monomerní podtřídy třídy IgA, které se obvykle vyskytují ve formě dimerů, nebo větších polymerů, lmunoeyty ve střevě produkují převážně polymerní IgA (známý jako poly-IgA, zahrnující dimery i vyšší polymery). Takové poly-IgA obsahují disulfidicky vázaný spojovací („joining“) neboli „J“ řetězec a mohou být transportovány přes žlázový epitel střevní stěny. Podobně je tomu v případě poly-IgM kde J-řetězec spojuje pět molekul IgM a opět v této podobě umožňuje transport přes žlázový epitel střevní stěny.

Hybridizace byla přednostně prováděna ve „stringentních podmínkách“, což znamená (1) nízká iontová síla a vysoká teplota při promývání, například 0,015 M NaCI / 0,0015 M citronan sodný / 0.1% SDS při 50 °C, nebo (2) aplikace denaturačního agens (například formamidu) během hybridizace, např. 50% (v/v) formamid s 0,1% hovězím sérovým albuminem / 0,1% Ficoll / 0,1% polyvinylpyrrolidon / 50 nM Na fosfátový pufr pH 6,5 se 750 mM NaCI a 75 mM citronanu sodného při 42 °C. Dalším příkladem může být použití 50% formamidu, 5 x SSC (0,75 M NaCI, 0,075 M citronan sodný), 50 mM fosforečnanu sodného (pH 6/8), 0,1% pyrofosforeěnanu sodného, 5 x Denhardtova roztoku, sonikované DNA z lososího spermatu (50 pg/ml), 0,1% SDS a 0,1% dextran sulfátu při 42 °C a při promývání při 42 °C v 0,2 x SSC a 0,1% SDS.

• · · • ·

B. Chiméry OB proteinu s imunoglobulinem (imunoadheziny) Imunoadheziny jsou chimérní molekuly podobné protilátkám v nichž je sloučena funkční doména (domény) vazebného proteinu (obvykle receptorů, adhezivní molekuly nebo ligandu) s imunoglobulinovou sekvencí. Nej obvyklejšími příklady tohoto typu fůzního proteinu jsou proteiny, ve kterých je spojena pantová a Fc oblast imunoglobulinu (lg) s doménami buněčných povrchových receptorů, jež rozeznávají specifické ligandy. Tento typ molekuly se nazývá „imunoadhezin“, neboť jsou v něm spojeny „imunitní“ a „adhezivní“ funkce; dalšími často používanými názvy jsou například „Ig-chiméra“, „lg-“ nebo „Fc-fúzní protein“, nebo „receptor-globulin“.

Dosud bylo odborníky popsáno více než padesát imunoadbezinů. Mezi imunoadheziny, popsané v literatuře patří například fúzní proteiny s T-receptorem (Gascoigne a kol., Pro. MNatl. Acad. Sci. USA 84, 2936-2940, (1987)), s CD4 (Capon a kol., Nátuře 337, 525-531 (1989); Traunecker a kol., Nátuře 339, 68-70, (1989), Zettmeissl a kol., DNA Cell Biol, USA 9, 347-353 (1990), Byron a kol., Nátuře 334, 667-670 (1990)); L-selektinem (homing receptor) (Watson a kol., J, Cell, Biol, 110, 2221-2229 (1990); Watson a kol., Nátuře 349, 164-167 (1991); E-selektinem (Mulligan a kol., J. Immunol. 151, 6410-6417 (1993), Jacob a kol,, Biochemistry 34, 1210-1217 (1995)); P-selektinem (Mulligan a kol., J, Immunol. 151, 6410-6417 (1993), Hollenbaugh a kol., Biochemistry 34, 5678-5684 (1995)); ICAM-1 (Stauton a kol., J. Exp, Med. 176, 1471-1476 (1992), Martin a kol., J. Virol. 67, 3561-3568 (1993), Roep a kol., Lancet 343, 1590-1593 (1994)); ICAM-2 (Damle a ··

kol., J, Immunol. 148, 2-23-29 (1992)); ICAM-3 (Holness a kol., J. Biol. Chem. 270 877-884 (1995)); LFA-3 (Kanner a kol., L Immunol. 148, 2-23-29 (1992)); LI glykoproteinem (Doherty a kol., Neuron 14, 57-66 (1995)); TNF-R1 (Ashkenazi a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88, 10535-10539 (1991); Lesslauer a kol., Eur. J, Immunol. 21, 2883-2886 (1991); Peppel a kol., J. Exp. Med. 174, 1483-1489 (1991)); TNF-R2 (Zack a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90, 2335-2339 (1993); Wooley a kol., J. Immunol. 151, 6602-6607 (1993)); CD44 (Aruffo a kol., Cell 61_, 1303-1313 (1990)); CD28 a B7 (Linsley a kol., J. Exp, Med. 173, 721-730 (1991)); CTLA-4 (Linsley a kol., J. Exp, Med. 174, 561-569 (1991)); CD22 (Stamenkovic a kol., Cell 66, 1133-1144 (1991)); NP receptorem (Bennett a kol., J. Biol. Chem. 266, 23060-23067 (1991)); IgE receptorem a (Ridgway a Gorrnan, J. Gell Biol. 115, abstr. 1448 (1991)); HGF receptorem (Mark M. R. a kol., J. Biol. Chem, (1992), přijato do tisku); IFNyR a- a β-řetězcem (Marsters a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 92, 5401-5405 (1995)); trk-A, B a -C (Shelton a kol., J. Neurosci. 15, 477-491 (1995)); IL-2 (Landolfi, J. Immunol. 146, 915-919 (1991)); IL-10 (Zheng a kol., J, Immunol· 154, 5590-5600 (1995)).

Nejjednodušší a nejobvyklejší imunoadhezin v sobě slučuje vazebnou oblast (oblasti) adhezivního proteinu s pantovou a Fc oblastmi těžkého řetězce imunoglobulinu. Obvykle je při přípravě OB-imunoglobulinových chiměrních proteinů podle vynálezu Cterminálně fúzována nukleová kyselina kódující požadovaný OB polypeptid s N-koncem sekvence pro konstantní doménu imunoglobulinu, ovšem i N-terminální fůze je přípustná. Typicky zůstávají u takových fůzí vytvořených chimérních polypeptidů ·· ···· ·· ···· zachovány aktivní pantová a CH2 a CH3 domény konstantní oblasti těžkého imunoglobulinového řetězce. K fůzi může docházet také na C-konci Fc části konstantní domény, nebo přímo na N-konci na CH1 konstantní doméně těžkého řetězce nebo odpovídající oblasti lehkého řetězce. Přesné místo, ve kterém k fůzi dochází není kritické. Jednotlivá vhodná místa jsou dobře známá a jejich výběrem je možné optimalizovat biologickou aktivitu, sekreční vlastnosti a vazebné charakteristiky OB-imunoglobulinových chimér.

V jednom z navrhovaných případů je sekvence nativního maturovaného OB polypeptidú fúzována s N- nebo C-koncovou částí molekuly protilátky (konkrétně s její Fc částí) při zachování efektorových funkcí imunoglobulinu, tj. v tomto případě IgG-1 . S OB sekvencí lze fúzovat celou konstantní oblast těžkého imunoglobulinového řetězce. Ovšem preferovanější je situace, kdy je pro fůzi použita sekvence začínající v pantové oblasti těsně nad místem pro štěpení papainem (čímž je IgG Fc chemicky definován; aminokyselina 216, přičemž první aminokyselina konstantní oblasti těžkého řetězce je 114, nebo mohou být použita analogická místa ostatních imunoglobulinů) (Kobet a kol., viz výše). Zvláště preferovaný je případ, kdy je OB polypeptidová sekvence fúzována s pantovou oblastí a CH2 a CH3, nebo CH1, pantovou oblastí a CH2 a GH3 doménami IgG-1, IgG-2 nebo IgG-3 těžkého řetězce. Přesné místo ve kterém k fůzi dochází není kritické, ale nej optimálněj ší místo může být určeno experimentálně.

V některých případech mohou být OB-imunoglobulinové chiméry připraveny ve formě multimerů, konkrétně homo-dimerů nebo homo-tetramerů (WO 91/08298). Obecně budou mít takto • ·

připravené imunoglobuliny známou podjednotkovou stavbu. Základní čtyřřetězeovou stavební jednotkou je forma, ve které existují IgG, IgE a IgD. Vyšší počet těchto čtyřřetězcových základních stavebních jednotek je základem imunoglobulinů s vyšší molekulovou hmotností; IgM se obvykle vyskytuje ve formě pentameru kde jsou základní čtyřřetězcové jednotky navzájem spojeny disulfidovými vazbami. IgA globulin a příležitostně i IgG mohou existovat v séru také v multimerní formě. V případě multimerů mohou být základní čtyřřetězcové jednotky shodné nebo odlišné.

Následují příklady různě sestavených OB-imunoglobulinových chimér podle popisu:

(a) AC_l-AC_l;

(b) AC_h-[ACh, ACl-ACh, AC_l-V_hC_h, nebo V_LC_L-AC_H];

(c) AC_l-ACh-[AC_l-AC_h, ACl-VhGh, V_lC_l-AC_h nebo V_LC_LV_HC_H];

(d) ACl-VhCh-[ACh, nebo ACl-VhCh, nebo VlCl-ACh];

(e) V_lC_l-AC_h-[AC_l-V_hCh, nebo V_LC_L-AC_H];

(f) [A-Y]_n-[ V_LC_L- VhCh], kde každé A představuje identickou nebo odlišnou OB polypeptidovou aminokyselinovou sekvenci;

V_L je variabilní doména lehkého imunoglobulinového řetězce;

Vh je variabilní doména těžkého imunoglobulinového řetězce;

C_L je konstantní doména lehkého imunoglobulinového řetězce;

Ch je konstantní doména těžkého imunoglobulinového řetězce; n je celé číslo větší než 1;

Y představuje zbytek kovalentně vázaného agens.

• 1

V zájmu stručnosti jsou u předcházejících struktur popsány pouze klíčové vlastnosti; nejsou vyznačeny vazebné (J) ani další domény imunoglobulinu, ani disulfidické můstky. Ovšem pokud jsou pro požadovanou vazebnou aktivitu takové domény nezbytné, měly by být přítomny v konstruktu ve stejném pořadí, v jakém jsou přítomny v originální imunoglobulinové molekule.

Alternativně může být OB aminokyselinová sekvence vložena mezi sekvence těžkého a lehkého řetězce imunoglobulinů tak, že výsledkem je imunoglobulin s chimérním těžkým řetězcem. V tomto případě je OB polypeptidová sekvence fúzována ke 3'-konci imunoglobulinového těžkého řetězce každého ramena imunoglobulinu a to buď mezi pantovou oblast a CH2 doménu, nebo mezi CH2 a CH3 domény. Podobné konstrukty již byly v literatuře popsány (Hoogenboom a kol., Mol. Immunol. 28, 10271037 (1991)).

Ačkoliv přítomnost lehkého řetězce imunoglobulinu není v imunoadhezinech podle navrhovaného vynálezu nezbytná, může být imunoglobulinový lehký řetězec přítomen, a to buď kovalentně asociovaný s fúzním polypeptidem skládajícím se z OB proteinu a těžkého řetězce imunoglobulinu, a nebo přímo fúzovaný s OB polypeptidem. V prvním případě je DNA kódující lehký imunoglobulinový řetězec koexprimována s DNA kódující luzní protein skládající se z OB proteinu a těžkého řetězce imunoglobulinu. Při sekreci jsou hybridní těžký řetězec a lehký řetězec kovalentně asociovány ve strukturu podobnou imunoglobulinu obsahující dva disulfidicky vázané páry imunoglobulinového lehkého a těžkého řetězce. Metoda, vhodná ···· • · 1 ·· * ·· ··

I · · <

» · ·· • · · · 4 • · « «· ·· pro přípravu takových struktur je popsána například v U.S. Patentu ě. 4,816,567, zveřejněném 28. března 1989.

V jednom z preferovaných případů jsou imunoglobulinové sekvence, použité pro konstrukci imunoadhezinů podle navrhovaného vynálezu převzaté z konstantní části těžkého řetězce imunoglobulinu IgG. Pro přípravu lidských imunoadhezinů je preferováno použití lidských IgG-1 a IgG-3 imunoglobulinových sekvencí. Hlavní výhodou použití IgG-1 je, že IgG-1 imunoadheziny mohou být účinně purifikovány na imobilizovaném proteinu A. Naproti tomu IgG~3 vyžaduje pro svou purifikaci protein G, což je podstatně méně univerzální médium. Ovšem i další strukturní a funkční vlastnosti imunoglobulinů bychom měli mít na mysli při výběru vhodného fúzního partnera pro konstrukci jednotlivých imunoadhezinů. Například IgG-3 pantová oblast je delší a flexibilnější a tudíž může nést větší „adhezinovou“ doménu, která by namohla správně fungovat asociovaná s IgG-1. Možné imunoadhezinové konstrukty založené na fůzi s IgG jsou zobrazeny na Obr. 3a-c. Zatímco IgG imunoadheziny jsou typicky mono- nebo bivalentní, s dalšími Ig subtypy jako např. IgA a IgM mohou vznikat dimerní nebo pentamerní struktury resp., odvozené od základní IG homodímerní jednotky. Typický IgM-podobný multimerní imunoadhezin je zobrazen na Obr. 3d. Multimerní imunoadheziny jsou výhodnější v tom smyslu, že mohou vázat své odpovídající cíle s vyšší aviditou, než jejich IgG-podobné protějšky. Publikovanými příklady takových struktur jsou CD4IgM (Traunecker a kol., viz výše), ICAM-IgM (Martin a kol., JL Virol. 67, 3561-3568 (1993)); a CD2-IgM (Arulanandam a kol., L Exp. Med. 177, 1439-1450 (1993)).

• · · ·

Pro OB-Ig imunoadheziny, které jsou navrhovány pro in vivo aplikaci jsou důležité také farmakokinetické vlastnosti a efektorové funkce specifikované Fc oblastí. Ačkoliv mají IgG-1, IgG-2 i IgG-4 in vivo poločasy přibližně 21 dní, jejich relativní potenciál při aktivaci systému komplementu je odlišný. IgG-4 komplement neaktivuje vůbec a IgG-2 je podstatně slabším aktivátorem komplementu, než IgG-1. Navíc IgG-1 ani IgG-2 i neváží Fc receptory na mononukleárních buňkách nebo neutrofilech. Zatímco IgG-3 vykazuje optimální vlastnosti ve smyslu aktivace komplementu, jeho in vivo poločas je přibližně třetinový ve srovnání s ostatními IgG izotypy. Dalším důležitým faktem, který musíme uvažovat při konstrukci imunoadhezinů určených pro lidskou terapii je počet alotypických variant jednotlivých izotypů. Obecně jsou preferovány IgG izotypy s menším počtem serologieky definovaných alotypů. například IgG-1 má pouze čtyři serologieky definovaná alotypická místa, z nichž dvě (Glm a 2)jsou lokalizována v Fc oblasti; a navíc jedno z těchto míst, Glml, není imunogenní. Naopak IgG-3 vykazuje 12 serologieky definovaných alotypů, všechny v Fc oblasti, z nichž pouze tři (G3m5, 11 a 21) nejsou imunogenní. Potenciál imunogenicity γ3 imunoadhezinů je tudíž větší než u yl imunoadhezinů.

Při přípravě OB-Ig imunoadhezinů podle navrhovaného vynálezu mohou být oblasti, které nejsou nezbytné pro vazbu na receptor, strukturní integritu (tj. například správné sbalení proteinu) a/nebo biologickou aktivitu molekuly deletovány. U takových struktur je důležité lokalizovat fúzní spojení do oblasti mezi doménami tak, aby nedošlo k chybě při skládání sekundární struktury proteinu. S • · · · * · •· ···· • · • · • · · · • · • · · · · • · ·· ohledem na rodičovský imunoglobulin je vhodným spojovacím místem oblast právě nad cysteiny pantové oblasti, jež tvoří disulfidický můstek mezi dvěma těžkými řetězci. V poměrně často používaném uspořádání bývá C-koncový zbytek adhezinové (OB) části molekuly umístěn právě nad (proti směru čtení) kodony pro sekvenci DKTHTCPPGP IgG-1 pantové oblasti.

Ob-Ig imunoadheziny j sou nej častěj i konstruovány fúzováním cDNA sekvence kódující OB část molekuly s Ig cDNA sekvencí při zachování čtecího rámce. Ovšem může být použita i fůze s genomovým Ig fragmentem (viz. např. Gascoigne a kol., Proč. Nati. Acad, Sci. USA 84, 2936-2940 (1987); Aruffo a kol., Cell 61, 1303-1313 (1990); Stamenkovic a kol., Cell 66, 1133-1144 (1991)). Druhý typ fůze vyžaduje pro expresi přítomnost Ig regulační sekvence. cDNA kódující konstantní oblasti těžkých řetězců IgG může být izolována na základě publikované sekvence z cDNA knihoven, odvozených od slezinných lymfocytů nebo lymfocytů z periferní krve, pomocí hybridizace nebo polymerázové řetězové reakce (PCR). Myší OB cDNA může být například izolována pomocí PCR z cDNA knihovny z myší adipózní tkáně (Clontech) za použití primerů navržených na základě sekvence Zhanga a kol. Lidská OB cDNA může být získána obdobně. Alternativně může být myší OB gen použit jako sonda pro izolaci z cDNA z lidské adipózní tkáně (Clontech), tj. z XgtII knihovny tak, jak bylo popsánu Zhangem a kol. cDNA kódující „adhezivni“ a Ig části imunoadhezinu jsou v tandemu vloženy do plazmidového vektoru, který zajistí účinnou expresi ve vybraných hostitelských buňkách. Pro expresi v savčích buňkách jsou preferovány vektory na bázi plazmidů pRK5 (Schall a kol., Cell 61, 361-370 (1990),

0 0 0 • 0 • 0 0

0

000 0 0 >

0 pRK7 a CDM8 (Seed, Nátuře 329, 840 (1989). pRK7 a pRK5 jsou identické plazmidy s jedinou výjimkou: pořadí restrikčních míst pro endonukleázy je mezi místy Clal a HindlII převrácené (viz. US Patent č. 5,108,901 zveřejněný 28. dubna 1992).Přesné spojení může být vytvořeno odstraněním nadbytečné sekvence mezi navrženými spojovacími kodony za pomoci oligonukleotidy řízené deleční mutageneze (Zoller a Smith, Nucleic Acids Res. 10, 6487 (1982); Capon a kol., Nátuře 337, 525-531 (1989)). Mohou být použity syntetické oligonukleotidy, u kterých je každá polovina komplementární k sekvencím na každé straně požadovaného místa spojení. V ideálním případě jsou tyto syntetické oligomery 36- až 48-mery. Alternativně může být použita pro spojení obou částí molekuly s odpovídajícím vektorem ve správném čtecím rámci PCR.

Imunoadheziny mohou být účinně exprimovány ve velkém množství hostitelských buněk včetně myelomových buněčných linií, vaječných buněk křečka (CHO), opičích COS buněk, lidských embryonálních ledvinných buněk 293 a baculovirem infikovaných hmyzích buněk. V těchto systémech jsou imunoadhezinové polypeptidy složeny a sekretovány do kultivačního média. Dále mohou být jako hostitelské buňky použity kvasinky Sacharomyces cerevisiae, Pichia pastoris atd., nebo bakteriální buňky, nejraději Escherichia coli. OBimunoglobulinové chiméry mhou být exprimovány například v kvasinkách způsobem podobným tomu, jaký pro expresi OB proteinů popsal Leiber a kol., Crit. Res. Food Sci. Nutr. 33, 351 (1993); Friedman a Leibel, Cell 69, 217 (1992); a Beavis a Chait, Proč. Nati. Acd. Sci. USA 87, 6873 (1990). Kódující sekvence tak ···· ·« 9··9 mohou být subklonovány i do kvasničných expresních vektorů, např. plazmidu pPIC.9 (Invitrogen). Tento vektor zajišťuje sekreci heterologních proteinů z kvasinky do kultivačního média. Podle Halaase a kol., viz výše, je při expresi myšího nebo lidského OB genu v Sacharomyces cerevisiae transformované tímto vektorem sekretován do média 16-kDa protein, kterým je neprocesovaný OB polypeptid postrádající signální sekvenci. Exprese myší nebo lidské OB-imunoglobulinové chiméry v E. coli může být dosaženo např. analogickým procesem, jaký popsal Halaas a kol., viz výše. Kódující sekvence myší a lidské OB-imunoglobulinovýeh chimér mohou být subklonovány do expresního vektoru pET15b (Novagen) a exprimovány v E. coli (BL21 (DE3)pIYsS) s použitím T7 E.coli RNA polymerázového systému. Alternativně může být fúzní protein exprimován v E. coli vložením kódující sekvence spolu se sekreční sekvencí z E. coli teplotně stabilního enterotoxinu II pod kontrolu promotoru pro E. coli alkalickou fosfatázu (Chang a kol.. Gene 55, 189-196 (1987)).

Výběr hostitelské buněčné linie pro expresi OB-Ig imunoadhezinů závisí především na expresním vektoru. Dalším hlediskem je požadované množství proteinu. Miligramová množství mohou být často produkována přechodnou transfekci. Například adenovirem EIA transformovaná linie lidských embryonálních ledvinných buněk 293 může být přechodně transfektována vektory na bázi pRK5 a pRK7 modifikovanou kalcium fosfátovou metodou, Výsledkem je velmi účinná exprese imunoadhezinů. Tato metoda je popsána v kapitole „Příklady provedení vynálezu“. Vektory na bázi CDM8 mohou být použity pro transfekci COS buněk DEAE dextranovou metodou (Aruffo a kol., Cell 61, 1303-1313 (1990);

· ·9 9 9

Zettmeissl a kol., DNA Cell Biol. (US) 9, 347-353 (1990)). Pokud chceme získat větší množství proteinu, může být imunoadhezin exprimován po stabilní transfekci hostitelské buněčné linie. Vektory na bázi pRK5 a pRK7 mohou být například vloženy do CHO buněk v přítomnosti dalšího doplňkového plazmidu kódujícího dihydrofolát reduktázu (DHFR) a nesoucího rezistenci k G418. G418 rezistentní kmeny mohou být v kultuře selektovány; tyto klony totiž rostou v přítomnosti vyšších hladin DHFR inhibitoru methotrexátu; vybrány jsou klony, ve kterých dochází ke koamplifikaci genů pro DHFR a imunoadhezin. Obsahuje-li imunoadhezin na svém N-konci hydrofobní vedoucí #sekvenci, je pravděpodobné, že bude transfektovanými buňkami procesován a sekretován do média. Exprese imunoadhezinů s komplexnější strukturou může vyžadovat unikátně připravené hostitelské buňky; komponenty jako například lehký řetězec nebo J řetězec mohou být produkovány vhodnými myelomovými nebo hybridomovými hostitelskými buňkami (Gascoigne a kol., 1987; Martin a kol., Virol. 67, 3561-3568 (1993)).

Imuňoadheziny mohou být snadno purifikovány afinitní chromatografií. Vhodnost proteinu A coby afinitního ligandu závisí na druhu a izotypu imunoglobulinové Fc domény, která je použita pro konstrukci chiméry. Protein A může být použít pro purifikaci imunoadhezinů obsahujících lidské γΐ, γ2, nebo γ4 těžké řetězce (Lindmark a kol., J. Immunol. Meth. 62, 1-13 (1983)). Protein G je doporučován pro purifikaci všech myších izotypů a lidského γ3 (Guss a kol., EMBO J, 5, 1567-1575 (1986)). Matricí, na kterou se váže afinitní ligand bývá nejčastěji agaróza, ovšem i další matrice jsou přípustné. Mechanicky stabilní matrice jako ·· · například sklo s kontrolovanou velikostí pórů nebo poly(styrendivinyl)benzen umožňují rychlejší průtok a tím i kratší dobu purifikace, než jaké je možné dosáhnout s v případě agarózy. Podmínky vazby imunoadhezinu na afinitní kolonu s proteinem A nebo G jsou určeny výhradně charakteristikami imunoadhezinové Fc domény; tj. druhem a izotypem imunoadhezinu. Obvykle, je-li vybrán správný ligand, dochází k účinné vazbě imunoadhezinu na kolonu přímo z nezpracované kultivační tekutiny. Jednou z významných vlastností imunoadhezinů je, že pro lidské yl molekuly je vazebná kapacita proteinu A snížena ve srovnání s protilátkami shodného Fc typu. Navázaný imunoadhezin může být z kolony účinně eluován buď kyselým pH (přibližně 3,0), nebo pufrem o neutrálním pH s obsahem slabě chaotropní soli. Výsledkem tohoto afinitně ehromatografického kroku je vzorek imunoadhezinu o čistotě větší než 95 %.

Namísto afinitní chromatografie s proteiny A nebo G, nebo spolu s ní, mohou být použity pro purifikaci imunoadhezinů i další známé purifikační metody. Při purifikaci chromatografií na thiofilních gelech se imunoadheziny se chovají podobně jako protilátky (Hutchens a Porath, Anal, Biochem. 159, 217-226 (1986)), a stejně je tomu i při chromatografií s použitím imobilizovaného ehelátu kovu (Al-Mashikhi a Makai, J. Dairy Sci. 71, 1756-1763 (1988)). Na rozdíl od protilátek je ovšem jejich chovaní na iontoměniěové koloně řízeno nejen jejich izoelektriekým bodem, ale také nábojem dipólu, který může existovat uvnitř molekuly díky její ehimérní struktuře. Mikroheterogenita náboje imunoadhezinové molekuly může být způsobena glykosylací adhezinové části molekuly a obsahem

•9 ·««·

000 «0

0 ·

00 0· 0

0 0

0· kyseliny sialové. Specifický purifikační protokol je popsán v kapitole „Příklady provedení vynálezu“.

Výsledky dosažené s množstvím dosud vyprodukovaných imunoadhezinů ukazují, že fůze adhezinovém části molekuly s Fe oblastí obvykle nebrání skládání jednotlivých domén. Jak adhezinová část molekuly, tak imunoglohulinové domény se skládají správně a Fc část molekuly si zachovává množství efektorových funkcí, charakteristických pro protilátky včetně vazby na Fc receptory.

Metody, obecně použitelné pro konstrukci, expresi a purifikaci imunoadhezinů jsou popsány například v U.S. Patentech č. 5,225,538 (6. července 1993) a 5,455,165 (30. října 1995). Konstrukce imunoadhezinů, jejich exprese, purifikace a různé druhy imunoadhezinů jsou dále popsány v souborných článcích Ashkenazi a Chamow, Methods in Enzymology 8, 104-115 (1995) a Peach a Linsley, Methods in Enzymology 8, 116-123 (1995).

C. Další OB deriváty s dlouhým poločasem

Další deriváty OB proteinů, které se vyznačují delším poločasem, než nativní molekuly, obsahují OB protein nebo OBímunoglobulinovou chiméru kovalentně vázanou k neproteinovému polymeru. Neproteinovým polymerem často bývá hydrofilní syntetický polymer, tj. polymer, který se jinak v přírodě nevyskytuje. Ovšem mohou být použity i polymery, které se v přírodě vyskytují a jsou produkovány jako rekombinantní nebo in vitro metodami, stejně jako polymery izolované z přirozených zdrojů. Předmětem tohoto vynálezu jsou hydrofilní polyvinylové polymery, jako polyvinylalkohol nebo polyvinylpyrrolidon. Zvláště ·* ···· vhodnými jsou polyalkylenové éthery jako například polyethylenglykol (PEG), polyalkyleny jako poyethylen, polyoxyethylen, polyoxypropylen (Pluronics); polymethakryláty; karbomery; větvené i nevětvené polysacharidy obsahující sacharidové monomery jako jsou D-manóza, D- a L-galaktóza, fukóza, fruktóza, D-xylóza, L-arabinóza, D-glukuronová kyselina, sialová kyselina, D-galakturonová kyselina, D-manuronová kyselina (tj. polymanuronová kyselina, nebo alginová kyselina), Dglukózamin, D-galaktózamin, D-glukóza a neuraminová kyselina, včetně homopolysacharidů a heteropolysacharidů jakými jsou například laktóza, amylopektin, Škrob, hydroxyethylovaný škrob, amylóza, dextransulfát, dextran, dextriny, glykogen nebo polysacharidové jednotky kyselých mukopolysacharidů, např. hyaluronová kyselina; polymery cukerných alkoholů jako polysorbitól a polymanitol; heparin nebo heparon. Polymer před zesíťováním nemusí být ve vodě rozpustný, ale je s výhodou, je-li, ale finální konjugát ve vodě rozpustný být musí. Navíc by polymer v konjugované formě neměl být vysoce imunogenní, ani by se neměl vyznačovat vysokou viskozitou, která je nekompatibilní s podáváním intravenózní infůzí nebo injekcí (to v případě, že zamýšlíme podávat výsledný konjugát tímto způsobem).

Přednostně obsahuje polymer pouze jednu reaktivní skupinu. To napomáhá zabránit zesíťování proteinových molekul. Ovšem předmětem vynálezu je i optimalizace reakčních podmínek tak, aby bylo redukováno nežádoucí zesíťování a dále čištění reakčního produktu gelovou filtrací, nebo chromatograficky za účelem získání vysoce homogenních derivátů.

9· ·»·· ····

Žádoucí molekulová hmotnost polymeru se pohybuje v rozmezí od 100 do 500 000, nejčastěji pak od 1000 do 20 000. Vybraná molekulová hmotnost bude záviset na vlastnostech polymeru a na požadovaném stupni substituce. Obecně čím větší je hydrofilieita polymeru a čím vyšší je stupeň substituce, tím nižší molekulová hmotnost polymeru může být použita. Optimální molekulová hmotnost musí být stanovena experimentálně.

Obecně je polymer kovalentně vázán k OB proteinu nebo k OB-Ig chiméře pomocí multifunkčního zesíťujícího agens, které reaguje s polymerem a jednou nebo více aminokyselinami nebo cukernými zbytky OB proteinu nebo OB-Ig Chiméry, jež mají být propojeny. Ovšem i přímé zesíťování polymeru reakcí derivatizovaného polymeru s hybridní molekulou je předmětem navrhovaného vynálezu.

Místem pro kovalentní zesíťování na OB proteinu nebo na OB-Ig chimérním proteinu mohou být N-koncová aminoskupina a epsilon aminoskupina přítomná na lyzinových zbytcích, stejně jako i další amino, imino, karboxylové, sulfhydrylové, hydroxylové i jiné hydrofilní skupiny. Polymer může být kovalentně vázán přímo k hybridnímu proteinu i bez použití multifunkčního (obvykle bifunkěního) zesíťujícího agens. Kovalentní vazby s aminoskupinou je dosaženo s pomocí známých chemikálií na bázi kyanurchloridu, karbonyldiimidazolu, reaktivních aldehydických skupin (PEG alkoxid s diethylacetalem bromoacetaldehydu; PEG s DMSO a kyselým anhydridem; nebo PEG chlorid s fenoxidem 4hydroxybenzaldehydu, sukcinimidyl aktivními estery, aktivovaným dithiokarbonátem PEG, 2,4,5-trichlorfenylchloroformiátem, nebo P-nitrofenylchloroformiátem aktivovaným PEG). Karboxylové ·· ·♦·· ·« ·«#· skupiny jsou derivatizovány párováním PEG aminu za použití karbodiimidu.

Polymery jsou oxidativně konjugovány s oligosacharidovými skupinami za použití chemických činidel jako např. metaperiodátu nebo enzymů jako jsou např. glukóza nebo galaktóza oxidáza (každý z nich produkuje aldehydický derivát uhlovodíku) a následně je provedena reakce s hydrazidem nebo s aminoderivatizovanými polymery tak, jak je to popsáno v Heitzmann a kol., P.N.A.S. 71, 3537-3541 (1974) nebo v Bayer a kol., Methods in Enzymology 62, 310 (1979), za účelem označení oligosacharidů biotinem nebo avidinem. Další chemické nebo enzymatické metody, které byly použity pro zesíťování oligosacharidů jsou zvláště výhodné, neboť obecně dochází k méně substitucím, než je míst na aminokyselinách, vhodných pro derivatizaci a oligosacharidové produkty jsou tak více homogenní. Oligosacharidové substituenty mohou být dále ještě před derivatizaci polymeru modifikovány enzymatickým odštěpením cukerných jednotek, např. neuraminidázovým štěpením.

Polymer ponese skupinu, která může reagovat přímo s aminokyselinovým bočním řetězcem, nebo s N- či C-koncem vázaného polypeptidů, nebo která je reaktivní s multifunkěním zesíťujícím agens. Obecně jsou polymery nesoucí takové reaktiví skupiny známé z metod pro přípravu i mobilizovaných proteinů. Aby bylo možné používat takové chemikálie zde, je nutné pracovat s polymerem rozpustným ve vodě, jinak derivatizovaným stejným způsobem, jako u nerozpustných polymerů, dosud používaných pro imobilizaci proteinů. Aktivace cyanogen bromidem je zvláště vhodnou metodou používanou pro zesíťování polysacharidů.

·· ···· ·· *··· „Ve vodě rozpustný“ v popisu výchozího polymeru znaěí, že polymer nebo jeho reakční meziprodukt, používaný pro konjugaci je dostatečně rozpustný ve vodě, aby se mohl účastnit derivatizaění reakce.

„Ve vodě rozpustný“ v popisu konjugátu polymeru značí, že konjugát je rozpustný ve fyziologických tekutinách, například v krvi.

Stupeň substituce takového polymeru se bude lišit v závislosti na počtu reaktivních skupin na proteinu, v závislosti na tom, je-li použit celý protein, nebo jen jeho fragment, je-li protein fúzován s heterologním proteinem (např. OB-Ig chiméra), v závislosti na molekulové hmotnosti, hydrofilicitě a dalších charakteristikách polymeru a na konkrétních místech zvolených pro derivatizaci proteinu. Obecně obsahují konjugáty přibližně 1-10 molekul polymeru, zatímco kterákoliv heterologní sekvence může být substituována v zásadě neomezeným počtem molekul polymeru, až dokud není výrazně nepříznivě ovlivněna požadovaná aktivita. Optimální stupeň zesíťování může být snadno určen s pomocí experimentální matrix, kde jsou čas, teplota a další reakční podmínky měněny, čímž je ovlivňován stupeň substituce, a poté jsou porovnány funkční vlastnosti výsledných konjugátů.

Polymer, tj. PEG může být zesíťován širokou škálou metod známých a používaných pro kovalentní modifikaci proteinů neproteinovými polymery, jakým je například PEG. Některé z těchto metod ovšem nejsou v našem případě preferovány. Použití kyanurchloridu vede k mnoha bočním reakcím včetně zesíťování proteinů. Navíc může velmi pravděpodobně vést k inaktivaci proteinů s obsahem sulfhydrylových skupin. Použití karbony 1 ·· ···· ·· ····

Anal. Biochem. 131. 25-33

8,5), které může inaktivovat diimidazolu (Beauchamp a kol., (1983)) vyžaduje vysoké pH (>

proteiny. Navíc, vzhledem k tomu, že „aktivovaný PEG“ meziprodukt reaguje s vodou, je nutné pracovat s velkým molárním nadbytkem „aktivovaného PEG“ ve srovnání s proteinem. Požadované vysoké koncentrace PEG pro zpracování s karbonyl diimidazolem vedou dále k problémům při purifikaci, neboť jak gelová filtrace, tak chromatografie na bázi hydrofilní interakce jsou touto vysokou koncentrací nepříznivě ovlivněny. Navíc vysoké koncentrace „aktivovaného PEG“ mohou způsobit precipitaci proteinu, problém, který sám o sobě byl zmíněn v literatuře již dříve (Davis U.S.Patent ě. 4,179,337). Naopak použití aldehydu (Royer, U.S. Patent ě. 4,002,531) je mnohem efektivnější, neboť v tomto případě je potřeba jen čtyřiceti násobný molární nadbytek PEG a 1-2 hodiny inkubace. Ovšem oxid manganičitý, doporučovaný Royerem pro přípravu aldehydu PEG je problematický díky „známé tendenci PEG tvořit komplexy s oxidačními činidly na bázi kovu“ (Harris a kol., J. Polym. Sci. Hem. Ed. 22, 341-352 (1984)). Použití Moffatovy oxidace, DMSO a kyselého anhydridů tento problém řeší. Navíc použití borohydridu sodného navrhované Royerem vyžaduje vysoké pH a byla prokázána významná tendence této sloučeniny redukovat disulfidické vazby. Naopak kyanoborohydrid sodný, který je účinný při neutrálním pH vykazuje jen velmi malou tendenci redukovat disulfidické vazby, a proto je preferován. Funkcionalizované PEG polymery pro modifikaci OB proteinů nebo OB-Ig chimér podle vynálezu jsou dostupné od firmy Shearwater Polymers, lne. (Huntsville, AL.). Mezi takové komerčně dostupné ·· ···· deriváty PEG patří například amino-PEG, PEG amino estery, PEGhydrazid, PEG-thiol, PEG-sukcinát, karboxymethylovaný PEG, PEG modifikovaný kyselinou propionovou, PEG modifikovaný aminokyselinami, PEG sukciimidylsukcinát, PEG sukciimidyl propionát, sukcinimidyl ester karboxymethylovaného PEG, sukcinimidylkarbonát PEG, sukciimidylestery aminokyselin PEG, PEG-oxykarbonylimidazol, PEG-nitrofenyl karbonát, PEG tresylát, PEG-glycidyl ether, PEG-aldehyd, PEG vinylsulfon, PEGmaleimid, PEG-orthopyridyl-disulfid, heterofunkční PEG, PEG vinylové deriváty, PEG silany a PEG fosfolidy. Reakční podmínky pro párování těchto derivátů PEG se mění v závislosti na proteinu, požadovaném stupni „PEGylace“ a použitém typu PEG derivátu. Mezi faktory, které ovlivňují výběr PEG derivátů patří: zamýšlené místo modifikace (lyzin nebo cystein), hydrolytická stabilita a reaktivita derivátů, stabilita, toxicita a antigenicita vazby, snadnost analýzy atd. Konkrétní návody pro použití jednotlivých derivátů jsou k dispozici od výrobce.

Konjugáty s dlouhým poločasem podle vynálezu jsou separovány od nezreagovaných výchozích materiálů metodou gelové filtrace. Eleterologní typy konjugátu jsou od sebe navzájem odděleny stejnou metodou. Polymer může být také ve vodě nerozpustný, stejně jako hydro fi lni gel.

Konjugáty mohou být purifikovány také iontoměniěovou chromatografií. Použitím mnoha elektrofilně aktivovaných PEG dochází k redukci náboje na aminoskupinách výsledného produktu. Z toho důvodu může být pro oddělení volných a konjugovaných proteinů a k rozlišení jednotlivých typů konjugátů s ohledem na stupeň modifikace PEG použita iontoměničová čhromatografie. V ·* ···· zásadě je rozlišení jednotlivých typů (tj. s obsahem jednoho nebo dvou PEG zbytků) možné i na základě odlišných iontových vlastností nezreagovaných aminokyselin.

D. Použití OB-imunoglobulinových chimér i dalších derivátů S DLOUHÝM POLOČASEM.

OB-imunoglobulinové chiméry i další deriváty OB proteinů s dlouhým poločasem podle navrhovaného vynálezu se používají pro redukci hmotnosti, konkrétně pro léčbu obezity a dalších poruch, asociovaných s abnormální expresí nebo funkcí OB genu. Naše studie prokázaly, že OB-imunoglobulinové chimérní proteiny stejně jako další OB deriváty s dlouhým poločasem, tj. OB proteiny konjugované s deriváty PEG, redukují příjem potravy a zlepšují využití energie léčených živočichů, a jsou tudíž velmi účinně při redukci hmotnosti jak obézních, tak normálních subjektů. Pro testovací účely mohou být molekuly podle vynálezu rozpuštěny ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku (PBS) (pH 7,4) a podávány intravenózní nebo podkožní injekcí nebo infuzi.

Dlouho působící OB deriváty podle navrhovaného vynálezu mohou být použity i k léčbě dalších metabolických poruch, jakými jsou např. diabetes nebo bulimie. Bylo prokázáno, že OB protein redukuje hladinu inzulínu u živočichů a mohl by být tudíž vhodný i pro redukci zvýšených hladin inzulínu u lidských pacientů. Redukce hladiny inzulínu jak u obézních, tak i u neobézních pacientů (tj. pacientů s diabetem I i II typu) by mohla obnovit nebo zlepšit citlivost takových pacientů k inzulínu.

• · 4 4 4 4

4« 4444 ·· 44 • 4 4 4

4 44

444 4 4

4 4

44

Navíc mohou být deriváty OB proteinů s dlouhým poločasem použity k léčbě některých ledvinových poruch, hypertenze a plicních dysfunkcí, jako např. rozedmy plic. OB proteiny mohou dále vyvolat mitogenní odpověď u tkání nesoucích vhodné receptory a tak mohou fungovat i jako růstové faktory.

terapeutické přípravky podle navrhovaného vynálezu jsou připraveny pro uskladnění smísením aktivní složky o požadovaném stupni čistoty s vhodným, fyziologicky přijatelným nosičem, excipientem nebo stabilizátorem .(Remington s Pharmaceutical Sciences 16^thedition, Osol, A. Ed. (1980)) ve formě lyofilizovaného prostředku nebo vodného roztoku. Vhodnými nosiči, excipienty či stabilizátory jsou takové, které jsou pro příjemce v používaných dávkách a koncentracích netoxické, a zahrnují pufry, např. fosfátové, citrátové či na bázi dalších organických kyselin; antioxidanty včetně kyseliny askorbové; nízkomolekulární polypeptidy (méně než 10 aminokyselinových zbytků); proteiny, například sérový albumin, želatin nebo imunoglobuliny; hydro filní polymery jako např. polyvinylpyrrolidon; aminokyseliny (glycin, glutamin, asparagin, arginin nebo lyzin); monosacharidy, disacharidy a další uhlovodíky včetně glukózy, manózy nebo dextrinů; chelatační činidla (EDTA); cukerné alkoholy (manitol, sorbitol); solotvorné obojetné ionty (např. sodík); a/nebo neiontové povrchově aktivní látky jako jsou Tween, Pluronics nebo PEG.

Aktivní složky mohou být také vloženy do mikrokapslí připravených například koacervačními technikami nebo mezipovrchovou polymerizací (například hydroxymethylcelulózové nebo želatinové mikrokapsle a poly-(methylmethacylátové) ·· ···· ·· ···· mikrokapsle) dále mohou být vloženy do koloidních systémů pro distribuci léčiv (například lipozómy, albuminové mikrogranule, mikroemulze, nanočástice a nanokapsle) nebo makroemulzí. Zmíněné techniky jsou popsány v Remingtonů Pharmaceutical Sciences 16^thedition, Osol, A. Ed. (1980).

Přípravky, určené pro podávání in vivo musí být sterilní. Sterility je snadno dosaženo filtrací přes sterilní filtrační membrány ještě před, nebo následně po lyofilizaci a rekonstituci.

Terapeutické prostředky jsou obvykle uloženy v nádobách umožňujících sterilní přístup, například sáčky pro intravenózně podávané roztoky, nebo lahvičky se zátkou, propíchnutelnou podtlakovou injekční jehlou.

Léčiva jsou podávána běžně známými způsoby, tj. injekcí nebo infúzí intravenózně, intraperitoneálně atp. Předpokládají se i přípravky, uvolňující se postupně z depotního ložiska. Vhodným příkladem takového přípravku je semipermeabilní polymemí matrice ve formě tvarovaných článků (tj. filmů nebo mikrokapslí). Matrice pro postupné uvolňování zahrnují polyestery, hydrogely, polyaktidy (U.S. Patent 3,773,919 EP 58,481), kopolymery kyseliny L-glutamové a γ ethyl L-glutamátu (U. Sidman a kol., 1983, „Biopolymers“ 22 (1), 547-556), póly (2-hydroxyethylmethakrylát) (R. Langer a kol., J. Biomed. mater. Res. 15, 167-277 (1981) a R. Langer, Chem. Tech. 12, 98-105 (1982)); ethylen vinyl acetát )R. Langer a kol., Id.); nebo poly-D-(-)-3-hydroxymáselná kyselina (EP 133,988A). Mezi prostředky umožňující pozvolné uvolňování aktivní substance patří také lipozómy. Lipozómy s obsahem molekul podle navrhovaného vynálezu mohou být připraveny některou z již známých a popsaných metod: DE ·· ···· «· ····

3,218,121A; Epstein a kol., 1985. „Proč. Nati. Acad. Sci. USA“ 82: 3688-3692; Hwang a kol., 1980 „Proč. Nati. Acad. Sci. USA“ rl·. 4030-4034; EP 52322A; EP 36676A; EP 88046A; EP 143949A; EP142641A; Japonská patentová přihláška 83-118008; U.S. patenty 4,485,045 a 4,544,545; a EP 102,324A. Běžně jsou používané malé (200-800 Á) lipozómy unilamelárního typu s obsahem lipidu větším než 30 mol. % cholesterolu; vybraný poměr je zvolen s ohledem na optimální terapii.

Účinné množství molekuly podle vynálezu pro terapeutické použití závisí například na terapeutickém záměru, způsobu podávání a stavu pacienta. V souladu s tím je nezbytné aby terapeut pečlivě stanovil dávku a upravil způsob podávání, aby bylo dosaženo maximálního terapeutického efektu. Typická denní dávka se pohybuje v rozmezí od 1 pg/kg až do 100 mg/kg, případně i více, závisle na mnoha výše zmíněných faktorech. Typicky je lékařem podávána látka podle vynálezu až dokud není dosaženo dávky, která zajišťuje požadovaný biologický efekt. Účinek této terapie je snadno monitorován konvenčními technikami. Je-li důvodem léčby snižování nadváhy, pokračuje normálně terapie až dokud není dosaženo požadované tělesné hmotnosti.

Neterapeutická použití OB-imunoglobulinových derivátů podle navrhovaného vynálezu zahrnují jejich použití pro identifikaci a purifikaci OB receptorů. Identifikace, klonování a exprese OB receptorů za použití OB-imunoadhezinů je popsána v následujících příkladech.

Vynález je dále ilustrován následujícími příklady, které však nejsou v žádném případě limitující.

·· ···· ·· ···· ·· ·· • · · · • · ·· ··· · · • · · ·· ··

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Exprese OB-imunoadhezinů

Za použití technik proteinového inženýrství byl exprimován lidský OB protein ve formě fúzního proteinu s pantovou, CH2 a CH3 doménami IgG-1. DNA konstrukty kódující chiméru lidského OB proteinu a IgG-1 Fc domén byly připraveny s použitím klonů Fc oblastí lidského IgG-1. Lidská OB cDNA byla získána pomocí PCR z dscDNA z lidských tukových buněk (Clontech Buiek-Clone cDNA product). Zdrojem IgG-1 cDNA byl plazmid pBSSK-CH2CH3. Chiméra obsahující kódující sekvence plné délky OB proteinu (aminokyseliny 1-167, Obr. 5) a lidské IgG-1 sekvence počínající kyselinou asparagovou 216 (počítáme-li aminokyselinu 114 jako první aminokyselinu konstantní oblasti těžkého řetězce (Kabat a kol., Sequences of Proteins of Immunological Interest 4^thed. (1987)), jež je první aminokyselinou IgG-Ι pantové oblasti následující hned za cysteinovým zbytkem zodpovědným za vazbu těžkého a lehkého řetězce, a končící aminokyselinou 441 (tj. zahrnující CH2 i CH3 Fc domény IgG-1). Mezi OB a IgG-1 kódující sekvence byly inzert©vány kodóny pro tři aminokyseliny (GlyValThr). V případě nutnosti může být tento krátký linker snadno odstraněn, například místně specifickou deleční mutagenezí, čímž je vytvořeno přímé spojení mezi kódujícími sekvencemi pro OB protein a IgG-1 pantovou oblast. Kódující sekvence pro OB-IgG-1 imunoadhezin byla subklonována do vektoru založeného na plazmidu pRK5 (pRK5tk-neo, který nese neomyeinový selekční markér) pro přechodnou expresi v buňkách 293 s použitím kalcium fosfátové metody (Sůva a kol., Science • · · · · · • · · · ·

237, 893-896 (1987)). Buňky 293 byly kultivovány v HAM's: DMEM médium (50:50) s nízkým obsahem glukózy, 10 % FBS a 2mM L-Gln. Pro účely purifikace OB-IgG-1 chimérních proteinů byly buňky jeden den po transfekci převedeny do bezsérového produkčního média PS24 a po tři dny bylo kultivační médium sbíráno. Poté bylo médium zfiltrováno.

Ze supernatantu po přefiltrování buněk 293 (400 ml), obsahujícího rekombinantní lidský OB-IgG-1, byl připraven 1 mM roztok ve fenylmethylsulfonyl fluoridu s přídavkem 2 pg/ml aprotininu. Takto připravený materiál byl nanesen na kolonu (1 x 4,5 cm, Protein A agaróza; katalog Pierce # 20 365) ekvilibrovanou ve 100 mM HEPES pH 8,0. Purifikace probíhala při 4 °C, průtok byl nastaven na 75 ml/h. Po nanesení vzorku byla kolona promývána ekvilibraěním pufrem dokud Aíko nedosáhla opět bazální hodnoty. OB-IgG-1 protein byl eluován 3,5 M MgCG + 2% glycerolem (nepufrováno)při průtoku 15 ml/h. Eluát byl shromažďován a příležitostně byl přidáván 100 mM HEPES pH 8, čímž byla redukována koncentrace MgCH přibližně na polovinu a bylo zvyšováno pH. Eluovaný protein byl poté dialyzován do PBS (fosfátem pufrovaného fyziologického roztoku), zakoncentrován, sterilizován filtrací a skladován buď při 4 °C nebo zamražen na -70 °C. Čistota OB-IgG-1 imunoadhezinu připraveného touto metodou byla pomocí SDS-PAGE stanovena jako >90%.

Příklad 2: Testování živočichů

A. Materiál a metody

Produkce OB proteinu: Myší OB cDNA byla získána pomocí PCR z cDNA knihovny z buněk tukové tkáně za použití primerů • · · · · · ·· ···· navržených podle sekvence Zhanga a kol., viz výše. Maturovaný OB protein (aminokyseliny 22-167) byl exprimován v E. coli vložením kódující sekvence spolu se sekreční sekvencí z E. coli teplotně stabilního enterotoxinu II pod kontrolu promotoru pro E. coli alkalickou fosfatázu (Chang a kol., Gene 55, 189-196 (1987)). Po lyži buněk byla nerozpustná frakce solubilizována v pufru s 8 M ureou pH 8,35 a v přítomnosti 25 mM DTT. Redukovaný OB protein byl purifikován rozměrovou vytěsňovací HPLC nebo HPLC na reverzní fázi a poté byl protein znovu renaturován v přítomnosti glutathionu. Renaturovaný OB protein byl purifikován HPLC na reverzní fázi a analyzován pomocí SDS-PAGE a aminokyselinové a hmotnostní spektrometrie.

Příprava PEG-hOB: PEG deriváty lidského OB proteinu byly připraveny reakcí hOB purifikovaného chromatografií na reverzní fázi se sukciimidyl derivátem PEG kyseliny propionové (SPA-PEG) s nominální molekulovou hmotností asi 10 kD, který byl získán od firmy Shearwater Polymers, lne.. (Huntsville, AL). Po purifikaci hOB proteinu chromatografií na reverzní fázi byly přibližně 1-2 mg/ml roztoku proteinu v 0,1% kyselině trifluoroctové a asi 40% acetonitrilu rozředěny 1/3 až 1/2 objemu 0,2 M borátového pufru pH 8,5 (upraveno NaOH). SPA-PEG byl přidán k reakční směsi v molárním poměru proteinu ku SPA-PEG 1:1 až 1:2 a směs byla inkubována při pokojové teplotě po dobu 1 hodiny. Po zreagovaání a purifikaci gelovou elektroforézou nebo iontoměničovou chromatografií byly vzorky pečlivě zdialyzovány proti PBS a sterilizovány filtrací přes filtr s velikostí pórů 0,22 mikronů. Vzorky byly skladovány při 4°C. Za předpokladu, že počáteční poměr SPA-PEG a proteinu byl 1:1, se výsledná frakce PEG-hOB • · · • · · skládá převážně z molekul s jedním navázaným 10 kDa PEG s minoritním zastoupením molekul se dvěma navázanými PEG.

Pomocí SDS-PAGE bylo stanoveno, že při počátečním molárním ©· poměru 1:2 se reakční směs skládá přibližně ze stejných množství hOB se dvěma navázanými PEG a se třemi navázanými molekulami PEG. V obou případech bylo detekováno i malé množství nezreagováného proteinu. Tento nezreagovaný protein byl účinně odstraněn gelovou filtrací nebo iontoměniěovou chromatografíí (podle potřeby). PEG deriváty lidského OB proteinu mohou být připraveny i za použití aldehydové reakce popsané v EP 372,752, publikovaném 13. června 1990.

Studie na zvířatech: Všechny studie prováděné na zvířatech byly posouzeny a schváleny Genetechs Institutional Animal Care and Use Comittee. Sedm až osm týdnů staré geneticky obézní C57BI/6J-oá/oů (ob/ob) samičky myší byly získány z Jackson Labs (Bar Harbor, ME). Štíhlé samičky myší se stejnou genetickou výbavou (C57BI/6) byly získány z Harlan Sprague Dawley (Hollister, CA). Myši byly chovány ve skupinách po 3 - 6 s přísunem vody a standardního myšího krmivá (Purina 5010; Purina Mills, Richmond, IN) ad libitum v prostředí s kontrolovanou teplotou, vlhkostí a světelným režimem (světlo od 06:00 h. do 18:00 h.)

Miniosmotické pumpy (Alzet model 2002; Alza Corp., Palo Ato. CA) byly naplněny purifikovaným rekombinantním OB proteinem (100 pg/kg/den) ve sterilním PBS, nebo samotným PBS. Vše probíhalo ve sterilních podmínkách podle návodu výrobce. Před implantací myším byly pumpy inkubovány přes noc ve sterilním fyziologickém roztoku při pokojové teplotě. Myším bylo podáno anestetikum ketamin/xylazin a do midskapsulární oblasti jim byly podkožně implantovány miniosmotické pumpy. Každý den byly myším podávány subkutální injekce purifikovaného rekombinantního OB proteinu, hOB-IgG-1 fúzního proteinu nebo PBS a to opět do midskapsulární oblasti a při plném vědomí. Zvířata byla injikována během jedné hodiny po zhasnutí světel. Tělesná hmotnost každé myši (s přesností na 0,1 g) a hmotnost potravy v krmítku každé klece (opět s přesností na 1 g) byly zaznamenávány každý den během první hodiny po zhasnutí světel. Data byla zaznamenána jako průměr ± SEM. Počty zvířat jsou uvedeny dále v textu a v legendách k obrázkům.

B: VÝSLEDKY DOSAŽENÉ PŘI KONTINUÁLNÍ SUBKUTÁLNÍ INFŮZI OB

PROTEINU

Štíhlým samičkám myší byl podáván myší OB protein buď ve formě kontinuální subkutální infůze nebo ve formě každodenních subkutálních injekcí. Výsledky experimentu jsou zobrazeny na Obr. 1. Z horního grafu je patrné, že OB protein je významně efektivnější při redukci tělesné hmotnosti, je-li podáván ve formě kontinuální infůze, než je-li stejná dávka podávána každý den injekčně. Ze spodního grafu je zřejmý stejný rozdíl ve schopnosti OB proteinu redukovat hmotnost tukové tkáně.

C: VÝSLEDKY DOSAŽENÉ S OB-IgG-1 CHIMÉRNÍM PROTEINEM

Obézním samičkám ob/ob myší byl podáván lidský OB protein lidský OB-IgG-1 chimérní protein. Data jsou zobrazena na Obr. 2. Data zobrazená v horním grafu ukazují, že hOB-IgG-1 fúzní protein je účinnější při redukci tělesné hmotnosti než nativní hOB • · · · · · • · • · · · • « · ·· · ··· • tt ··· ···· ft · · · · ·· · ··♦· ···· * · · · · «· «· ·» · ** ·· protein, jsou-li oba proteiny podávány shodně každý den podkožní infůzí. Je zřejmé, že účinnost fúzního proteinu b byla ještě zřetelnější, kdyby byla získaná data přepočtena na molární množství OB proteinu, neboť jen asi 1/3 molekulové hmotnosti

OB-IgG-1 chimérního proteinu připadá na OB protein.Data dále potvrdila předešlé zjištění, že kontinuální subkutální infůze (pumpa) hOB proteinu je při redukci tělesné hmotnosti efektivnější než každodenní podkožní injekce (inj.).

Data zobrazená na spodním grafu Obr. 2 ukazují, že hOB-IgG-1 fúzní protein znatelně redukoval příjem potravy. Takový výsledek byl neočekávaný neboť se předpokládalo, že fúzní protein je příliš veliký, než aby překonal bariéru mezi krevním řečištěm a mozkovou tkání, a tudíž nemůže způsobit takový efekt.

Obézním samičkám ob/ob myší byl podáván lidský OB protein, nebo lidský OB-IgG-1 chimérní protein formou každodenních podkožních injekcí po dobu 7 dnů. Data zobrazená na Obr. 3 znovu ukazují, že chimérní protein je při redukci tělesné hmotnosti (nahoře) i příjmu potravy (dole) účinnější než nativní hOB.

V dalších experimentech byly obézním samičkám ob/ob myší podávány formou každodenních podkožních injekcí po dobu 7 dnů nativní hOB, hOB-lgG-1 fúzní protein nebo hCD4-IgG-l (kontrola). Výsledky, zobrazené na Obr. 5 potvrdily, že hOB-IgG-1 fúzní protein je při redukci tělesné hmotnosti (horní a střední graf) i příjmu potravy (dole) účinnější než nativní hOB.

D. Výsledky dosažené s PEG-hOB

Obézním samičkám ob/ob myší byl podáván lidský OB protein nebo PEG derivát lidského OB proteinu. Data jsou zobrazena na • · · · · · • · · · · ·

·· *» ··

Obr. 4. Výsledky vynesené v horním grafu ukazují, že PEG-hOB protein je účinnější při redukci tělesné hmotnosti než nativní hOB protein, jsou-li oba proteiny podávány shodně každý den podkožní • r* o z íniuzi.

Data, zobrazená na spodním grafu Obr. 4 ukazují, že PEG-hOB proteiny byly významně účinnější při redukci příjmu potravy než nemodifikovaný nativní hOB.

Příklad 3: Referenční příklad

Identifikace a klonování OB receptorů

OB protein-imunoadhezin z příkladu 1 byl použit pro detekci, klonování a expresi OB reeeptoru.

Nejprve, aby byl zjištěn zdroj receptorů, bylo několik buněčných linií testováno průtokovou cytometrií s 1 pg/ml OB-IgG-1 fúzního proteinu. Detekční systém, který se skládá ze sekundární protilátky konjugované s biotinem následované streptavidin-fykoerytrinem dramaticky amplifikuje signál a umožňuje detekci buněk, exprimujících i malé množství receptorů. Byly nalezeny dvě buněčné linie, vážící OB-IgG-1, ale nikoliv kontrolní Flt-4 imunoadhezin: lidské embryonální ledvinné buňky 293 a buňky z lidské pliení tkáně A549. Specifická vazba OB-IgG-1 na buňky byla demonstrována i přidáním nadbytku bakteriálně exprimovaného hOB proteinu. Přidání 10 pg/ml hOB úplně blokuje vazbu OB-IgG-1 na receptory buněk 293.

Pro izolaci cDNA kódující OB receptor byly přechodně transfektovány buňky COSN soubory asi 10⁵ klonů z oligo dT značené 293 cDNA knihovny v plazmidu pRK5B. Transfektované buňky byly zahuštěny vysetím na misky pokryté anti-lidskou Fc

protilátkou po inkubaci s OB-IgGl. Po trojnásobném zahuštění dal asi jeden ze třiceti klonů vzniknout OB-IgG-1 zprostředkované adherenci COSN buněk na misky s protilátkou. Tato vazba může být vytěsněna lidským leptinem. cDNA klony, náhodně vybrané po tomto třetím zahuštění byly transfektovány ve skupinách po 10-20. Nakonec byly po vyloučení asi jednoho klonu z deseti, který se jevil být pozitivní, jednotlivé klony identifikovány.

Sekvenční analýzou byl určen klon s fragmentem velikosti asi 5300 bp s otevřeným čtecím rámcem kódujícím protein o velikosti 896 aminokyselin. Sekvence odpovídala transmembránovému proteinu typu I s 22 aminokyselin dlouhým signálním peptidem 819 aminokyselin velkou extracelulární doménou, 21 aminokyselin velkou transmembránovou doménou a krátkou, 34 aminokyselin velkou intracelulární doménou. Bylo zjištěno, že sekvence odpovídá lidskému OB receptorů identifikovanému a izolovanému Tartaglia a kol., viz výše, a je identická se sekvencí lidského receptorů popsanou v paralelně podané patentové přihlášce Č. 08/585,005 podané 11. ledna 1996.

Vynález byl ilustrován několika příklady, ty však zdaleka nejsou limitující. Je zřejmé, že existují další modifikace a varianty, které nevybočují z rámce navrhovaného vynálezu. Navrhovaný vynález se týká i všech takových· modifikací.

Všechny odkazy, citované v popisu vynálezu včetně příkladů a odkazů citovaných tamtéž, jsou zde začleněny výlučně jako reference.

• 0

SEZNAM SEKVENCÍ (1) Obecné informace:

(i) Žadatel: Genetech, lne.

De Sauvage, Frederic J.

Leviti, Nancy Vandlen, Richard L.

(ii) Název vynálezu: Deriváty OB proteinu (iii) Počet sekvencí: 2 (iv) Adresa pro korespondenci:

(A) Firma: Genetech, lne.

(B) Ulice: 460 Point San Bruno Blvd (C) Město: South San Francisco (D) Stát: California (E) Země: USA (F) Zip: 94080 (v) Počítačově zpracovatelná forma:

(A) Typ média: 3,5 inch, 1,44 Mb floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: WinPatin (Genetech) (vi) Data o součastné žádosti:

(A) Číslo žádosti:

(B) Datum podání: 19. prosince 1996 (G) Klasifikace:

(vii) Data o předchozí žádosti:

(A) Číslo žádosti: 08/667184 (B) Datum podání: 20. ledna 1996 (vii) Data o předchozí žádosti:

(A) ČÍSLO ŽÁDOSTI: 08/579494 (B) Datum PODÁNÍ: 27. prosince 1995 (viii) Údaje o právním zastoupení:

(A) JMÉNO: Dreger, Ginger R.

(B) ČÍSLO registrace: 33,055 (C) Reference/čislo spisu: 985P2PC4 (ix) Telekomunikační informace:

(A) Telefon: 415/225-32 16 (B) Telefax: 415/952-9881 (C) Telex: 910/371-7168 (2) Informace o SEQ ID NO: 1:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 7127 párů baží (B) TYP: Nukleová kyselina (C) počet řetězců: Dva (D) TOPOLOGIE: Lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID N():l:

TTCGAGCTCG	CCCGACATTG	ATTATTGACT	AGTTATTAAT	AGTAATCAAT	so
TACGGGGTGA	ŤTAGTTCATA	GCCCATATAT	GGAGTTCOGC	GTTACATAAC	100
TTACGGTAAA	TGGCCCGCCT	GGCTGAGCGC	CCAACGACCC	CCGGCCATTG	150
ACGTCAATAA	TGACGTATGT	TCCCATAGTA	ACGCCAATAG	GGACTTTCCA	200
TTGACGTCAA	TGGGTGGAGT	ATTTACGGTA	AACTGCCCAC	TTGGCAGTAC	2 50
ATCAAGTGTA	TCATATGCCA	AGTACGCCCC	CTATTGACGT	CAATGACGGT	3 00
AAATGGCCCG	CCTGGCATTA	TGCCCÁGTAC	ATGACCTTAT	GGGACTTTCC	350
TACTTGGCAG	TACATCTACG	TATTAGTCAT	CGCTATTÁCC	ATGGTGATGC	4 00
GGTTTTGGCA	GTACATCAAT	GGGCGTGGAT	AGCGGTTTGA	CTCACGGGGA	450
TTTCCAAGTC	TCCACCCCAT	TGACGTCAAT	GGGAGTTTGT	TTTGGCÁCCA	500

AAATCAACGG GACTTTCCAA AAYGTCGTAA CAACTCCGCC CCAT'1'GACGC 550

4 4 4

4444

AAATGGGCGG	TAGGCGTGTA	CGGTGGGAGG	50 TCTATATAAG	• • • • CAGAGCTCGT	4 4 · ♦ 4 4 4 · • · · · » • · · · · »» ·· ·· 600
TTAGTGAACC	GTCAGATCGC	CTGGAGACGC	CATCCACGCT	GTTTTGACCT	650
CCATAGAAGA	CACCGGGACC	GATCCAGCGT	CCGCGGCCGG	GAACGGTGCA	700
TTGGAACGCG	GATTCCCCGT	GCCAAGAGTG	ACGTAAGTAC	CGCCTATAGA	7 50
GTČTATAGGC	CCACCCCCTT	GGCTTCGTTA	GAACGCGGCT	ACAATTAAŤA	800
CATAACCTTA	TGTATCATAC	ACATAČGATT	TAGGTGACAC	TATAGAATAA	850
CATCCACTTT	GCCTTTCTCT	CCACAGGTGT	CCACTCCCAG	GTCCAACTGC	900
ACCTCGGTTC	TATCGATATG	CATTGGGGAA	CCCTGTGCGG	ATTCTTGTGG	950
CTTTGGCCCT	atcttttcta	TGTCCAAGCT	GTGCCCATCC	AAAAAGTCCA	1000
AGATGACACC	AAAACCCTCA	TCAAGACAAT	TGTCACCAGG	ATCAATGACA	1050
TTTCACACAC	GGAGTCAGTC	TCCTCCAAAC	AGAAAGTCAC	CGGTTTGGAC	1100
TTCATTCCTG	GGCTCCACCC	CATCCTGACC	TTATCCAAGA	TGGACCAGAC	1150
ACTGGCAGTC	TACCAACAGA	TCCTCACCAG	TATGCCTTČC	AGAAACGTGA	1200
TCCAAATATC	CAAGGACCTG	GAGAACCTCC	GGGATCTTCT	TCACGTGCTG	1250
GCCTTCTCTA	AGAGCTGCCA	CTTGCCCTGG	GCCAGTGGCC	TGGAGACCTT	1300
GGACAGCCTG	GGGGGTGTGC	TGGAAGCTTC	AGGCTACTCC	ACAGAGGTGG	13 50
TGGCCCTGAG	CAGGCTGCAG	GGGTCTCTGC	AGGACATGCT	GTGGGAGCTG	1400
GACCTCAGCC	CTGGGTGCGG	GGTCACCGAC	AAAACTCACA	CATGCCCACC	14 50
GTGCCCAGCA	CCTGAACTCC	TGGGGGGAGC	GTCAGTCTTČ	CTCTTCCCCC	1500
CAAAACCCAA	GGACACCCTC	ATGATCTCCC	GGACCCCTGA	GGTCACATGC	1550
GŤGGTGGTGG	ACGTGAGCCA	CGAAGACCCT	GAGGTCAAGT	TCAACTGGTA	1600
CGTGGACGGC	GTGGAGGTGC	ATAATGCCAA	GACAAAGCCG	CGGGAGGAGC	1650
AGTACAAGAG	CACGTACCGT	GTGGTGAGCG	TCCTCACCGT	CCTGCACCAG	1700
GACTGGCTGA	ATGGCAAGGA	GTACAAGTGC	AAGGTCTCCA	ACAAAGCCCT	1750
CCCAGCCCCC	ATCGAGAAAA	CČATCTCCAA	AGGCAAAGGG	CAGGCCCGAG	1800
AACCACAGGT	GTACACCCTG	CCCCCATCCC	GGGAAGAGAT	GACCAAGAAC	1850
CAGGTCAGCC	TGACCTGCCT	GGTCAAAGGC	TTCTATCCCA	GCGACATCGC	1900
CGTGGAGTGG	GAGAGCAATG	GGCAGCCGGA	GAAGAACTAC	AAGACCACGC	1950

CTCCCGTGCT GGACTCCGAC GGCTCCTTCT TCCTCTACAG CAAGCTCACC 2000

9 ·

ΦΦ ΦΦΦΦ

ΦΦ Φ· • Φ Φ · • * ·· • φ Φ Φ ·

Φ Φ « »Φ <·

GTGGACAAGA	gcaggtggca	GCAGGGGAAC	GTCTTCTCAT	GCTCCGTGAT	2050
GCATGAGGCT	CTGCACAACC	ACTACACGCA	GAAGAGCCTC	TCCCTGTCTC	2100
CGGGTAAATG	AGTGCGACGG	CCCTAGAGTC	GACCTGCAGA	AGCTTCTAGA	2150
GTCGACCTGC	AGAAGCTTGG	CCGCCATGGC	CCAACITGTT	TATTGCAGCT	2 2 00
TATAATGGTT	ACAAATAAAG	CAATAGCATC	ACAAATTTCA	CAAATAAAGG	22 50
atttttttca	CTGCATTCTA	GTTGTGGTTT	GŤCCAAACTC	AŤGAATGTAT	2300
CTTATCATGT	CTGGATCG7V)'	CGGGAATTAA	TTCGGCGCAG	CACCATGGCC	23 50
TGAAATAACC	TCTGAAAGAG	GAACTTGGTT	AGGTACCTTC	TGAGGCGGAA	2400
AGAACC/AGCT	GTGGAATGTG	TGTČAGTTAG	GGTGTGGAAA	GTCCCCAGGC	2450
TCCCCAGCAG	GCAGAAGTAT	GCAAAGCATG	CATCTCAATT	AGTCAGCAAC	2500
CAGGTGTGGA	AAGTCCCCAG	GCTCCCCAGC	AGGCAGAAGT	ATGCAAAGCA	2550
TGCATCTCAA	TTAGTCAGCA	ACCATAGTCC	CGCCCCTAAC	TCCGCCCATC	2600
CCGCCCCTAA	CTCCGCCCAG	TTCCGCCCAT	TCTCCGCGCC	ATGGCTGACT	2650
aatttttttt	atttatgcag	AGGCCGAGGC	CGCCTCGGCG	TCTGAGCTAT	2700
TCCAGAAGŤA	GTGAGGAGGC	TTTTTTGGAG	GCCTAGGCTT	TTGCAAAAÁG	2 7 50
CTGTTAATTC	GAACAGGCAG	ATGCAGTCGG	GGCGGCGCGG	TCCCAGGTCC	2800
ACTTCGCATA	TTAAGGTGAC	GCGTGTGGCC	TCGAACACCG	AGCGACCCTG	20 50
CAGCGACCCG	CTTAACAGCG	TCAACAGCGT	GCCGCAGATC	TGATGAAGAG	2 900
ACAGGATGAG	GATCGTTTCG	CATGATTGAA	CAAGATGGAT	TGCACGCAGG	2950
TTCTCCGGCC	GCTTGGGTGG	AGAGGCTATT	CGGCTATGAC	TGGGCACAAC	3000
agacaatcgg	CTGCTCTGAT	GCCGCCGTGT	TCCGGCTGTC	AGCGGAGGGG	3050
cgcccggttc	TTTTTGTCAA	GACCGACCTG	TCCGGTGCCC	TGAATGAACT	3100

GCAGGACGAG GCAGCGCGGC TATCGTGGCT GGCCACGACG GGCGTTCCTT 3150

GCGCAGCTGT GCTCGACGTT GTCACTGAAG CGGGAAGGGA CTGGCTGCTA 3200

TTGGGCGAAG TGCCGGGGCA GGATCTCCTG TCATCTCACC TTGCTCCTGC 32 50

CGAGAAAGTA TCCATCATGG CTGATGCAAT GCGGCGGCTG CATACGCTTG 3300

ATCCGGCTAC CTGCCCATTC GACCACCAAG CGAAACATCG CATČGAGCGA 3350

GCACGTACTC GGATGGAAGC CGGTCTTGTC GATCAGGATG ATCTGGACGA 3 4 00

AGAGCATCAG'GGGCTCGCGC CAGCCGAACT GTTCGCCAGG CTCAAGGCGC 3450 ♦ · 9999

99 9

99 ·· · · 9 9 9 9 9 ·

9 9 9 9 9 9 9 99

9 9 « 9 9 · · 999 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 ·· * · 9 99 99

GCATGCCCGA CGGCGAGGAT CTCGTCGTGA CCCATGGGGA TGCCTGCTTG 3500

CCGAATATCA TGGTGGAAAA TGGCCGCTTT TCTGGATTCA TCGACTGTGG 3550

CCGGCTGGGT GTGGCGGACC GCTATCAGGA CATAGCGTTG GCTACCCGTG 3600

ATATTGCTGA AGAGCTTGGC GGCGAATGGG CTGACCGCTT CCTCGTGCTT 3650

TACGGTATCG CCGCTCCCGA TTCGCAGCGC 'ATCGCCTTCT ATCGCCTTCT 3 7 00

TGACGAGTTC TTCTGAGCGG GACTCTGGGG TTCGAAATGA CCGACCAAGC 3750

GACGCCCAAC CTGCCATCAC GAGATTTCGA TTCCACCGCC GCCTTCTATG 3000

AAAGGTTGGG 'CTTCGGAATC GTTTTCCGGG ACGCCGGCTG GATGATCCTC 3850

CAGCGCGGGG ATCTCATGCT GGAGTTCTTC GCCCACCCCG GGAGATGGGG 3900

GAGGCTAACT GAAACACGGA AGGAGACAAT ACCGGAAGGA ACCCGCGCTA 3950

TGACGGCAAT AAAAAGACAG AATAAAACGC AGGGGTGTTG GGTCGTTTGT 4000

TCATAAACGC GGGGTTCGGT CCCAGGGCTG GCACTCTGTC GATACCCCAC 4 050

CGAGACCCCA TTGGGGCCAA TACGCCCGCG TTTCTTCCTT TTCCCCACCC 4100

CAACCCGCAA GTTCGGGTGA AGGCCCAGGG CTCGCAGCCA AGGTCGGGGC 4150

GGGAAGCGGG CCATAGCCAC GGGCCCCGTG GGTTAGGGAC GGGGTCGCCC 4200

ATGGGGAATG GTTTATGGTT CGTGGGGGTT ATTCTTTTGG GCGTTGCGTG 4250

GGGTCAGGTC CACGACTGGA CTGAGCAGAC AGACCGATGG TTTTTGGATG 4300

GCCTGGGCAT GGACCGCATG TACTGGCGCG ACACGAACAC CGGGCGTCTG 4350

TGGCTGCCAA ACACCCCCGA CCCCCAAAAA CCACCGCGCG GATTTCTGGC 4400

GCCGCCGGAC GAACTAAACC TGACTACGGC ATCTCTGCCC CTTCTTCGCT 4450

GGTACGAGGA GCGCTTTTGT TTTGTATTGG TCACCACGGC CGAGTTTCCG 4500

CGGGACCCCG GCCAGGGCAC CTGTCCTACG AGTTGťATGA TAAAGAAGAC 4550

AGTCATAAGT GCGGCGACGA TÁGTCATGCC CCGCGCCCAC GGGAAGGAGC 4600

TGACTGGGTT GAAGGCTCTG AAGGGCATCG GTCGAGGGGC CGCATCAAAG 4650

CAACCATAGT ACGCGCCCTG TAGCGGCGCA TTAAGCGCGG CGGGTGTGGT 4700

GGTTACGCGC AGCGTGACCG CTACAGTTGC CAGCGGCCTA GCGCCCGCTC 4750

GTTTCGCTTT CTTCCCTTCC TTTCTCGCCA CGTTCGCCGG CTTTCCCCGT 4 800

GAAGCTCTAA ATCGGGGGCT CCCTTTAGGG TTCCGATTTA GTGCTTTACG 4850

GCACCTCGAC CCCAAAAAAC TTGATTTGGG TGATGGTTCA CGTAGTGGGC 4900 •CATCGCCCTG ATAGACGGTT TTTCGCCCTT TGACGTTGGA GTCCACGTTC 4950 • · * * ·« • · • ♦ · · ·» ·· • · · « , » ·» · · · * • · « ·· ·♦

TTTAATAGTG	GACTCTTGTT	CCAAACTGGA	ACAACACTCA	ACCCTATCTC	5000
GGGCTATTCT	TTTGATTTAT	AAGGGATTTT	GCCGATTTCG	GCCTATTGGT	5050
TAAAAAATGA	GCTGATTTAA	CAAAAATTTA	ACGCGAATTT	TAACAAAATA	5100
TTAACGTTTA	CAATTTTATG	GTGCAGGCCT	CGTGATACGC	CTATTTTTAT	5150
AGGTTAATGT	CATGATAATA	ATGGTTTCTT	AGACGTCAGG	TGGCACTTTT	5200
CGGGGAAATG	TGCGCGGAAC	CGCTATTTGT	TTATTTTTCT	AAATACATTC	5250
AAATATGTAl’	CCGCTCATGA	GACAATAACC	CTGATAAATG	CTTCAATAAT	53 00
ATTGAAAAAG	GAAGAGTATG	AGTATTCAAC	ATTTCCGTGT	CGCCCTTATT	53 50
cccttttttg	CGGCATTTTG	CCTTCCTGTT	TTTGCTCACC	CAGAAACGCT	5400
GGTGAAAGTA	AAAGATGCTG	AAGATCAGTT	GGGTGCACGA	GTGGGTTACA	5450
TCGAACTGGA	TCTCAACAGC	GGTAAGATCC	TTGAGAGTTT	TCGCCCCGAA	5500
GAACGTTTTC	CAATGATGAG	ČACTTTTAAA	GTTCTGCTAT	GTGGCGCGGT	5 5 50
ATTATCCCGT	GATGACGCCG	GGCAAGAGCA	ACTCGGTCGC	CGCATACACT	5600
ATTCTCAGAA	TGACTTGGTT	GAGTACTCAČ	CAGTCACAGA	AAAGCATCTT	56 50
AGGGATGGCA	TGACAGTAAG	AGAATTATGC	AGTGCTGCCA	TAACCATGAG	5700
tgataacact	GCGGCCAACT	TACTTCTGAC	AACGATCGGA	GGACCGAAGG	5750
AGCTAACCGC	TTTTTTGCAC	AACATGGGGG	ATCATGTAAC	TCGCGTTGAT	58 00
CGTTGGGAAC	CGGAGCTGAA	TGAAGGCATA	CCAAACGACG	AGCGTGACAC	5850

CACGATGCCA GCAGCAATGG CAACAACGTT GCGCAAACTA TTAACTGGCG 5900

AACTACTTAC TCTAGCTTCC CGGCAACAAT TAATAGACTG GATGGAGGCG 5950

GATAAAGTTG CAGGACCACT TČTGCGCTCG GCCCTTCCGG CTGGCTGGTT 6000

TATTGCTGAT AAATCTGGAG CCGGTGAGCG TGGGTCTCGC GGTÁTCATTG 6050

CAGCAGTGGG GCCAGATGGT AAGCCCTCCC GTATCGTAGT TATGTACACG 6100

AGGGGGAGTC AGGCAACTAT GGATGAACGA AATAGACAGA TCGCTGAGAT 6150

AGGTGCCTCA CTGATTAAGC ATTGGTAACT GTCAGACCAA GTTTACTCAT 6200

ATATACTTTA GATTGATTTA AAACTTCATT ΤΤΤΑΑΤ'ΓΤΑΛ AAGGATCTAG 6250

GTGAAGATCC TTTTTGATAA 'TCTCATGACC AAAATCCCTT AAGGTGAGTT 6 300

TTCGTTCCAC TGAGCGTCAG ACCCCGTAGA AAAGATCAAA GGATCTTCTT 6 3 50

GAGATCCTTT TTTTCTGCGC GTAATCTGCT GCTTGCAAAC AAAAAAACCA 6400 ·· ·«·· ·· ···» • · · · · • · ♦ · • · · · ·« 99

9 9

99

9 9 9

9 99

999 9 9

9 9

9-9

CCGCTACCAG	CGGTGGTTTG	TTTGCCGGAT	CAAGAGCTAC	CAACTCTTTT 6450
TCCGAAGGTA	ÁCTGGCTTCA	GCAGAGCGCA	GATACCAAAT	ACTGTCCTTC 6500
TAGTGTAGCC	GTAGTTAGGC	CACCACTTCA	AGAACTCTGT	AGCACCGCCT 6550
ACATAGCTCG	CTCTGCTAAT	CCTGTTACCA	GTGGCTGCTG	CCAGTGGCGA 6600
TAAGTGGTGT	CTTACCGGGT	TGGACTCAAG	ACGATAGTTA	CCGGATAAGG 6650
CGCAGCGGTC	GGGGTGAACG	GGGGGTTCGT	GCACACAGCC	CAGCTTGGAG 6700
CGAACGACCT	ACACCGAACT	GAGATACCTA	CAGCGTGAGC	ATTGAGAAAG 6750
CGCCACGCTT	CCCGAAGGGA	GAAAGGCGGA	CAGGTATCCG	GTAAGCGGCA 6800
GGGTCGGAAC	AGGAGAGCGC	AGGAGGGAGC	TTCCAGGGGG	AAACGCCTGG 6850
TATCTTTATA	GTCCTGTCGG	GTTTCGCCAC	CTCTGAGTTG	AGCGTCGATT 6 9 0 0
TTTGTGATGC	TCGTCAGGGG	GGCGGAGCCT	ATGGAAAAAC	GCCAGCTGGC 6950
ACGACAGGTT	TCCCGACTGG	AAAGCGGGCA	GTGAGCGCAA	CGCAATTAAT 7000
GTGAGTTACC	TCACTCATTA	GGCACCCCAG	GCTTTACACT	TTATGCTTCC 7050
GGCTCGTATG	TTGTGTGGAA	TTGTGAGCGG	ATAACAATTT	CACACAGGAA 7]00

ACAGCTATGA CCATGATTAG GAATTAA 7327 •to ···· «· ···· to to • · • to • to • · • ·· to · ♦ ·· · <

« · 4 ♦ · ·· (2) Informace o SEQ ID NO:2:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) DÉLKA: 397 aminokyselin (B) TYP: Aminokyselinová (C) TOPOLOGIE: Lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:2:

Met 1

His

Trp

Gly

Thr 5

Leu

Cys Gly

Phe

Leu i o

Trp

Leu

Trp

Pro

Tyr 15

Leu

Phe

Tyr

Val

Gin 20

Ala

Val Pro

Ile

Gin 2 5

Lys

V a).

Gin

Asp

Asp 30

Thr

Lys

Thr

Leu

Ile 35

Lys

Thr Ile

Val

Thr 40

Arg

1 ) e

Asn

Asp

Ile 45

Ser

His

Thr

Gl n

Ser 50

Val

Ser Ser

Lys

G1 n 55

bys

Va)

T) íi-

G1 y

Leu 60

Asp

Phe

I le

Pro

Gly 65

Leu

His Pro

Ile

Leu 70

Thr

Leu

Se r

bys

Met 75

Asp

Gin

Thr

Leu

Ala 80

Val

Tyr Gin

Gin

I le 8 5

Leu

Thr

Ser

Met

Pro 90

Ser

Arg

Asn

Val

Ile 95

Gin

Ile Ser

Asn

Asp 100

Leu

Glu

Asn

Leu

Arg 105

Asp

Leu

His

Val 110

Leu

Ala Phe

Ser

bys 11 5

Ser

Cys

His

Leu

Pro 120

Trp

Ala

Ser

Gly

Leu 125

Glu

Thr Letí

Asp

Se r 13 0

Leu

G) y

Gly

Val

Leu 135

jGlu

Ala

Ser

Gly

Tyr 140

Ser

Thr Glu

Val

Val 145

Ala

Leu

Ser

Arg

Leu 150

Gin

Gly

Ser

Leu

Gin 155

Asp

Met Leu

Trp

Gin 160

Leu

Asp

Leu

Ser

Pro 165

Gly

Cys

Gly

Val

Thr 170

Asp

Lys Thr

His

Thr 17 5

Cys

Pro

Cys

Pro 180

Ala

Pro

Glu

Leu

Gly

Gly Pro

Ser

Va)

Phe

Len

Phe

Pro

185

1 90

195

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr 2 00

Leu

Met Jle

Ser

Arg 20 5

Thl

Pro

Glu

Val

Thr 210

Gys

Val

Asp 215

Va)

Ser His

Glu

Asp 2 2 0

Pro

G1 u

Va)

bys

Phe 225

φφ φφφφ • Φ φφφφ • φ · φ φ · φ φ φ φ φ φ «φφφ •ΦΦΦ φ · φφ φφ φ* φφ φφ φ φ φ φ φ φ φφ • φφφ φ φ • φ · φφ φφ

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp 230

Gly

Val

Glu

Val

His 2 35

Asn

Ala

Lys

Thr I.ys 240

Pro

Arg

Glu

Gin 24 5

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr 2 50

Arg

Val

Ser Val 255

Leu

Thr

Val

Leu

His 260

G1 n

Asp

Trp

Leu

Asn 26 5

Gly

Lys

Glu

Tyr Lys 270

Cys

Lys

Val

Ser

Asn 275

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala 280

Pro

Ile

Glu

Lys Thr 285

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys 290

Gly

Gin

Pro

Arg

Gl u 295

Pro

Gl n

Val

Tyr Thr 300

Leu

Pro

Ser

Arg 30 5

Glu

Met

Thr

Lys 3 10

Asn

Gin

Val

Ser Leu 315

Thr

Cys

Leu

Va 1

Lys 320

Gly

Phe

Tyr

P ro

Ser 325

Asp

3 le

Ala

Val Glu 330

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly 335

G1 n

Pro

Glu

Asn

Asn 340

Tyr

Lys

Thr

Thr Pro 34 5

Pro

Val

Leu

Asp

Ser 350

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe 3 55

Leu

Tyr

Ser

Lys Leu 360

Thr

Val

Asp

Lys

Ser 365

Arg

Trp

Gin

Gly 370

Asn

Val

Phe

Ser Cys 375

Ser

Val

Met

His

Glu 3 80

Ala

Leu

His

Asn

His 385

Tyr

TI 11

Gin

Lys Ser 390

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY J>(/

1. Kovalentní derivát OB proteinu s delším poločasem v plazmě, a/nebo s pomalejším rozpadem než jakým se vyznačuje odpovídající nativní OB protein, a který je schopný redukovat tělesnou hmotnost a/nebo příjem potravy u jedince, kterému je podáván.
2. Derivát podle nároku 1, který je derivátem nativního lidského OB proteinu.
3. Derivát podle nároku 1, který je OB-imunoglobulinovou chimérou.
4. Derivát podle nároku 1, kdy je nativní OB protein nebo OBimunoglobulinová chiméra modifikována neproteinovým polymerem.
5. Derivát podle nároku 4, kdy neproteinovým polymerem je polyethylenglykol (PEG).
6. Prostředek pro léčení stavu asociovaného s abnormální expresí nebo funkcí OB genu, nebo pro stanovení biologické odpovědi zprostředkované OB receptorem vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství OB derivátu podle nároku 1.
7. Prostředek podle nároku 6 vyznačující se tím, že je účinný pro redukci hmotnosti a/nebo chuti k jídlu.
8. Prostředek podle nároku 6 vyznačující se tím, že je účinný pro redukci zvýšených hladin inzulínu.
9. Způsob léčení stavu asociovaného s abnormální expresí a/nebo funkcí OB genu, nebo způsob stanovení biologické odpovědi zprostředkované OB receptorem vyznačující se tím, že zahrnuje podání derivátu podle nároku 1 léčenému jedinci.

·· ···· ·· ····
10. Způsob podle nároku 9 vyznačující se tím, že léčeným stavem je porucha, vybraná ze skupiny obsahující obezitu, bulimii a diabetes I nebo II typu.
11. Způsob navození ubývání hmotnosti nebo ztráty chuti k jídlu u subjektu vyznačující se tím, že zahrnuje podávání účinného množství derivátu podle nároku 1 řečenému subjektu.
12. Chimérní polypeptid skládající se z aminokyselinové sekvence OB proteinu schopné vazby na nativní OB receptor, vázané s imunoglobulinovou sekvencí.
13. Chimérní polypeptid podle nároku 12 vyznačující se tím, že zmíněnou imunoglobulinovou sekvencí je sekvence konstantní domény.
14. Chimérní polypeptid podle nároku 13 v y z n a č u j í c i se t ím , ž e zmíněný OB protein je lidský.
15. Chimérní polypeptid podle nároku 14 vyznačující s e tím, že dva fúzní proteiny obsahující OB polypeptid a IgG těžký řetězec jsou k sobě navzájem vázány nejméně jednou disulfidickou vazbou za vzniku homodimerní imunoglobulinu podobné struktury.
16. Chimérní polypeptid podle nároku 15 vyznačující se tím, že nejméně jeden z fúzních proteinů, skládajících se z OB polypeptidu a IgG těžkého řetězce, je asociován s imunoglobulinovým lehkým řetězcem.
17. Izolovaná nukleotidová sekvence kódující OBimunoglobulinový fúzní protein.
18. Replikovatelný expresní vektor v y zn a č u j í c i se tím, ž e obsahuje nukleovou kyselinu podle nároku 17.

ΦΦ φφφ· •Φ φφφφ
19. Hostitelská buňka vyznačující se tím, že je transformována replikovatelným expresním vektorem podle nároku 18.
20. Způsob kultivace hostitelských buněk podle nároku 19 vyznačující se tím, že vede k expresi nukleové kyseliny kódující fúzní OB-Ig protein.
21. Způsob podle nároku 20 vyznačující se tím, že hostitelské buňky jsou kotransformovány nukleovou kyselinou, kódující nejméně dva OB protein-imunoglobulinové fúzní polypeptidy.
22. Způsob podle nároku 21 vyznačující se tím, že zmíněné buňky jsou dále transformovány nukleovou kyselinou kódující nejméně jeden imunoglobulinový lehký řetězec.
23. Způsob léčení stavu asociovaného s abnormální expresí a/nebo funkcí OB genu, nebo způsob stanovení biologické odpovědi zprostředkované OB receptorem vyznačující se tím, že zahrnuje podání terapeuticky účinného množství chimérního polypeptidů podle nároku 12 pacientovi.
24. Způsob podle nároku 23 vyznačující se tím, že léčeným stavem je porucha, vybraná ze skupiny obsahující obezitu, bulimii a diabetes I nebo II typu.
25. Prostředek pro léčení obezity vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství chimérního polypeptidů podle nároku 12 asociované s farmaceuticky přijatelným nosičem.
26. Způsob navození růstu buněk exprimujících OB receptor vyznačující se tím, že zahrnuje kontakt zmíněných buněk s OB derivátem podle nároku 1.