CZ9902807A3 - Způsob výroby organických látek, zejména karba analogů peptidů - Google Patents

Abstract

Řešení se týká způsobu výroby organických látek, zejména karba analogů peptidů, při němž se používají nové deriváty cysteinu, které umožňují v připravovaných sloučeninách vytvoření "karba mostu". Zejména se řešení osvědčilo při výrobě 1-desamino-l-monokarba -2-O-metyl-tyrosinoxytocinu, jehož konečný čistý stav obsahoval méně než 2 % celkové plochy všech detekovatelných píků. Tato látka se používá ve veterinární medicíně a její nový jednodušší způsob výroby, ovšem mnohem efektivnější než současné způsoby její výroby, umožní její používání i v humánním lékařství.

Description

Způsob výroby organických látek, zejména karba analogů peptidů

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu výroby organických látek, zejména karba analogů peptidů. Při jejich výrobě se ke zjednodušení použijí jako meziprodukty nové sloučeniny, dále popsané původci vynálezu.

Dosavadní stav techniky

Klíčovým problémem při současných syntézách monokarbasloučenin je vytvoření tzv. „karba mostů“ v jejich molekule. Tento krok má obecně zásadní vliv na čistotu a výtěžek připravovaných sloučenin, jako je např. výroba farmaceuticky používaného 1 -desamino-1 -monokarba-2-O-metyl-tyrosinoxytocinu (karbetocinu). Jeho syntéza byla popsána v roce 1971 [1] a od té doby byl původní postup několikrát vylepšen [2], [3] a to jak syntézou v roztoku, tak v pevné fázi. Jeho syntézy byly patentovány. Uvedený peptid se používá ve veterinární medicině.

Původní syntézy jsou založeny na použití S-benzylcysteinových derivátů. Chráněný peptid, získaný amonolytickým odštěpením zpěvného nosiče, se podrobí redukci sodíkem v kapalném amoniaku, přičemž se odstraní chránící benzylové skupiny a nahradí etyl- nebo t-butylesterem kyseliny 4-brommáselné. Po alkalické hydrolýze etylesteru nebo kyselém odštěpení t-butylesteru a odštěpení benzyloxykarbonyl- nebo t-butyloxykarbonylové skupiny z Nkoncového metyleteru tyrosinu je prováděna cyklizace. Při dosavadních způsobech syntézy nastávají problémy s výtěžkem a kvalitou konečného produktu, neboť oba tyto parametry jsou negativně ovlivňovány přítomností řady nečistot různého složení a množství. Tyto vážné problémy jsou způsobeny především redukcí sodíkem v kapalném amoniaku, která je provázena řadou vedlejších nežádoucích reakcí a složení vedlejších produktů je nepředvídatelné a téměř nezvalidovatelné. Tato skutečnost vždy neblaze ovlivňuje čištění a v neposlední řadě i standardní kvalitu konečného produktu, což mimo jiné způsobilo opožděné používání např. již uvedeného 1 -desamino-l-monokarba-2O-metyl-tyrosin-oxytocinu i v humánní medicině.

Podstata vynálezu

Uvedené nedostatky zcela odstraňuje způsob výroby organických látek, zejména karba analogů peptidů, podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se při výstavbě lineárního řetězce v jejich molekule použije derivát cysteinu obecného vzorce A ··· ♦··· ···« • · ··· · · ·· · ·· ·

(A), kde

R¹ značí H, nasycený nebo mono-nenasycený alkyl s počtem atomů uhlíku Ci až Cé včetně rozvětvených derivátů a cykloalkylů, případně substituovaný benzyl se substituentem vybraným z H, 2- nebo 4-metoxy, 2- nebo 4-chloro a 2- nebo 4-nitro, nebo 9-fluorenylmetyl,

R² značí nasycený nebo mono-nenasycený alkyl s počtem atomů uhlíku Ci až Cg včetně rozvětvených derivátů a cykloalkylů, případně substituovaný benzyl se substituentem vybraným z H, 2- nebo 4-metoxy, 2- nebo 4-chloro a 2- nebo 4-nitro, nebo 9-fluorenylmetyl, přičemž R¹ a R² jsou různé, který se v průběhu výroby organických látek, zejména karba analogů peptidů, pozmění odstraněním chránící skupiny R¹ a následnou kondenzací se vytvoří amidická vazba, uzavírající karba můstkový cyklus v připravované molekule organické látky, zejména peptidů.

Způsob výroby podle vynálezu se dále provádí tak, že se pro výstavbu 1karba modifikovaných disulfidických vazeb používají deriváty cysteinu obecného vzorce I

X-NH-CH-CO-Y (I), ··· ····. ···« • · · · · · ·«· · · · · • ·· · · · ·· · · ··· ··· • · · · ···· · · kde

X značí H, Boc-, Fmoc-, Boc-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-, H-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-, ¥ značí skupinu -OH, -Pro-Leu-Gly-NH₂, -Pro-Leu-Gly-P,

Z značí allyloxykarbonylpropyl, karboxypropyl, p-nitrofenyloxykarbonylpropyl, přičemž značí-li substituent Z karboxypropyl nebo p-nitrofenyloxykarbonylpropyl, tvoří se případně amidická vazba s některým ze substituentů X.

Dále je způsob podle vynálezu vyznačen tím, že se odstranění chránící skupiny R¹ provádí odštěpením za přítomnosti homogenního palladiového katalyzátoru, který se použije v množství 0,01 až 0,1 ekvivalentu štěpené látky ve směsi rozpouštědel tvořené dimetylformamidem, kyselinou octovou a morfolínem v objemovém poměru 10:2: 1.

Podle vynálezu se vyrábějí především deriváty cysteinu obecného vzorce A, kde R značí allyl a R značí t-butyl nebo 9-fluorenylmetyl.

Způsob podle vynálezu dále spočívá v tom, že se deriváty cysteinu obecného vzorce A použijí při přípravě l-desamino-l-monokarba-2-O-metyltyrosin-oxytocinu, který obsahuje po vyčištění surové sloučeniny vždy stejné definovatelné množství biologicky neškodných vedlejších příměsí v množství menším než 2 % celkové plochy všech píků detekovatelných při jeho analýze.

Deriváty cysteinu podle vynálezu jsou nové látky použitelné k jednoduché a efektivní výrobě nejen analogů různých peptidů obsahujících ve své přirozené struktuře disulfidický můstek. Zmíněné deriváty umožňují izostemí záměnu atomu síry mety lenovou skupinou a jsou používány pro poměrně snadnou přípravu tzv. desamino-l-monokarba analogů peptidů, což bylo původci vynálezu ověřeno. Karba analogy jsou obvykle stabilnější vůči enzymatické degradaci a z tohoto důvodu mohou mít nové deriváty cysteinu podle vynálezu biologické vlastnosti umožňující jejich použití ve farmacii [1], Karba modifikace v molekule různých analogů přírodních peptidů může zajímavě ovlivnit profil jejich biologických aktivit.

Deriváty cysteinu obecného vzorce (I) podle vynálezu jsou nyní původci používány hlavně k výrobě l-desamino-l-monokarba-2-O-metyl-tyrosinoxytocinu. Tento analog oxytocinu je používán ve veterinární medicíně k léčbě agalactie a k ovlivnění průběhu porodu. Předpokládá se i jeho použití k léčbě podobných indikací v medicíně humánní a to zejména proto, že se ho způsobem výroby podle vynálezu podařilo připravit ve velmi vysoké a stabilní čistotě. Obecně lze deriváty cysteinu obecného vzorce (I) použít ve všech případech, kdy je třeba udělat desamino-1 -karba substituci v molekule.

• · · « · · · • · · · · · ·

Způsob výroby desamino-l-monokarba analogů podle vynálezu probíhá v několika stupních, jak je schematicky znázorněno v Příloze 1.

Nejdříve je nutné připravit N-chráněné S-(3-allyloxykarbonylpropyl) cysteiny. Reakce hydrochloridu monohydrátu L-cysteinu s allylesterem kyseliny 4-brommáselné (III) vede k CysC₃All (IV). Aminoskupina této sloučeniny je chráněna v dalším kroku buď t-butyloxy-karbonylovou nebo fluorenylmetyloxykarbonylovou skupinou. Boc-skupina je zavedena reakcí s di-t-butyldiuhličitanem za vzniku BocCysC₃All (V). Fmoc-skupina je zavedena reakcí s 9ťluorenylmetylsukcinimidyluhličitanem, kdy vzniká FmocCysC₃All (Va). Uvedené deriváty cysteinu podle vynálezu byly použity především k výrobě 1desamino-l-monokarba-2-O-metyl-tyrosin-oxytocinu, jak je schematicky znázorněno v Příloze 2 pro případ tvorby „karba mostu“ na pevném nosiči a v Příloze 3, kdy je „karba most“ vytvořen při reakci v roztoku.

Jak je uvedeno v Příloze 2, byl způsobem podle vynálezu imobilizovaný derivát s otevřeným řetězcem (VII) připraven syntézou na pevném nosiči [4], [5] s použitím buď derivátu cysteinu (V) nebo (Va). Oba způsoby vedly ke stejné sloučenině. Allylová chránící skupina byla z postranního řetězce odstraněna pomocí tetrakis(trifenylfosfin)palladia jako homogenního katalyzátoru. Výsledkem byl derivát (VIII). Boc-skupina byla odstraněna zN-koncové aminoskupiny 50%-ní trifluoroctovou kyselinou v dichlormetanu s 5 % anisolu. Z odchráněné peptidyl pryskyřice, na níž bylo působeno směsí diisopropylkarbodiimidu a N-hydroxybenzotriazolu v N-metylpyrrolidonu, vznikl imobilizovaný cyklický produkt (X). Požadovaný 1-desamino-l-monokarba-2-O-metyltyrosin-oxytocin (XI) byl z polymeru uvolněn amonolyticky plynným amoniakem [7] a čištěn pomocí IEC a HPLC.

Způsobem podle vynálezu, znázorněným v Příloze 3, byl amonolýzou sloučeniny (VIII) získán derivát s otevřeným řetězcem (XII). Z něj byl reakcí s p-nitrofenyltrifluoroacetátem připraven aktivní ester (XIII). Boc-skupina byla odstraněna z N-koncové aminoskupiny trifluoroctovou kyselinou s 5 % anisolu. Konečný l-desamino-l-monokarba-2-O-metyl-tyrosin-oxytocin (XI) byl připraven z odchráněného aktivního esteru (XIV) intramolekulámí reakcí v roztoku trietylaminu/DMF. Surová látka byla čištěna opět pomocí IEC a HPLC.

Získaný 1 -desamino-1 -monokarba-2-O-metyl-tyrosin-oxytocin, připravený výše popsanými způsoby podle vynálezu, obsahoval velmi málo nečistot, jejichž složení je ovšem validovatelné. Kvalita konečného výrobku plně odpovídá požadavkům farmakologie a článkům publikovaným vPhEu.

• · · 9 · · * · « 9 · • 9999 9 9 9 9 · >9 9 • · 9 999 99 99 · * · 999 · 9 · 9999 9 ·

Zmíněné množství a složení nečistot poskytuje žádaný profil biologických aktivit známý pro l-desamino-l-monokarba-2-O-metyl-tyrosin-oxytocin [6].

Způsob výroby podle vynálezu může být snadno použit pro výrobu průmyslových množství žádané látky s výtěžky překračujícími několikrát výtěžky u dosud známých a používaných syntetických způsobů přípravy. Všechny ekonomické parametry jsou lepší v porovnání se známými postupy.

Způsob výroby podle vynálezu může být použit též pro přípravu jiných organických sloučenin, zejména peptidů, majících v molekule stejnou strukturní modifikaci jako látky podle vynálezu. Tato skutečnost byla původci vynálezu ověřena přípravou desamino-1 -fragmentu u D-fenylalanyl-cysteinyl-fenylalanylD-tryptofyl-lysyl-threonyl-cysteinyl-threoninolu a analogů 1-desamino-1monokarba-2-O-metyl-tyrosin-oxytocinu jako např. 1-desamino-1-monokarba2-O-metyl-tyrosin-5-D-asparagin-oxytocinu a dalších. Podrobnosti jsou popsány dále v příkladech.

Následující příklady provedení způsob výroby organických látek, zejména karba analogů peptidů pomocí nových sloučenin, podle vynálezu pouze dokládají, ale neomezují.

Příklad 1

Výroba S-(3-allyloxykarbonylpropyl)cysteinu

1777,5 g allylesteru kyseliny 4-brommáselné bylo rozpuštěno v 42 litrech 50% (v/v) vodného /-butanolu. Roztok byl odvzdušněn heliem a argonem. Poté byl roztok až do ukončení reakce probubláván dusíkem. Do takto připraveného roztoku bylo přidáno 1005 g L-Cys.H₂O.HCl a 3500 ml N,Ndiisopropyletylaminu. Směs se míchá dalších 44 hodin. Pomocí N,Ndiisopropyletylaminu bylo pH reakční směsi udržováno v rozmezí 9,5 až 10. Reakce byla ukončena okyselením na pH 6 pomocí 2M vodné HCl. Přes noc se při +4 °C vysrážela očekávaná surová sloučenina, která byla odfiltrována. Z matečných louhů se opět přes noc při +4 °C vysrážel její druhý podíl. Stejným způsobem byl po filtraci získán z matečných louhů i třetí podíl.

Spojené pevné podíly byly po vysušení na vzduchu rozmíchány se 36 litry dietyleteru na homogenní suspensi a konečná látka byla získána po filtraci a sušení.

Výtěžek S-(3-allyloxykarbonylpropyl)cysteinu byl 1283 g ( 90,6 % ). Analytické vlastnosti byly potvrzeny H, C NMR a MS spektry. Optická otáčivost [ot]_D ²⁰ = 15,8 ± 0,8, c = 1 (AcOH), TLC, HPLC.

• · · · · · · · · « • · · · · · «· « · · · • · · · · · · · ·

Příklad 2

Výroba N-ř-butyloxykarbonyl-S-(3-allyloxykarbonylpropyl)cysteinu

900 g CysC₃All připraveného podle Příkladu 1 bylo suspendováno ve směsi obsahující 4000 ml dioxanu a 2400 ml vody. Do suspense vychlazené na +2 °C bylo za míchání přidáno 830 ml V,7V-diisopropyletylaminu a čerstvě připravený roztok 1191 g di-ř-butyldiuhličitanu ve 1470 ml dioxanu. Reakční směs byla rychle ohřátá na teplotu 18 až 22 °C, při níž reakce probíhala další 2 hodiny (kontrola pomocí TLC). Pomocí jVTV-diisopropyletylaminu bylo pH reakční směsi udržováno v rozmezí 8 až 10.

Rozpouštědla byla odpařena za sníženého tlaku při +45 °C ± 5 °C. Olej ovitý odparek byl rozpuštěn v 6500 ml 10% (m/v) vodného uhličitanu sodného. Vzniklý roztok byl třepán 3 krát 3700 ml dietyleteru a následně okyselen nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu draselného na pH = 3. Sloučenina byla extrahována 4 krát do 2800 ml etylacetátu. Spojené etylacetátové roztoky byly třepány s vodou (2 x 4600 ml), nasyceným vodným roztokem chloridu sodného (2 x 4600 ml), sušeny síranem hořečnatým a po filtraci zahuštěny odpařením za sníženého tlaku při +45 °C ± 5 °C na olej. Surová sloučenina byla rozpuštěna ve 3700 ml metanolu a roztok byl odpařen. Získaný olej byl rozpuštěn ve 3700 ml dichlormetanu. Konečná látka byla získána odpařením dichlormetanového roztoku.

Výtěžek N-z-butyloxykarbonyl-S-(3-allyloxykarbonylpropyl)cysteinu byl 1044 g (82,6 %). Analytické vlastnosti byly potvrzeny MS spektroskopií. Optická otáčivost [a]_D ²⁰ = 13,0 ± 0,4, c = 1 (metanol), TLC, HPLC.

Příklad 3

Příprava N-fluorenylmetyloxykarbonyl-S-(3-allyloxykarbonylpropyl)cysteinu

1,98 g CysC₃All připraveného podle Příkladu 1 bylo suspendováno v 80 ml 50% vodného acetonitrilu. Veškerý CysC₃All se rozpustil poté, co bylo pH suspense upraveno VV-diisopropyletylaminem na 10. Do roztoku bylo přidáno 2,97 g 9-fluorenylmetylsukcinimidyluhličitanu a reakce probíhala další 4 hodiny. Pomocí N, V-diisopropy lety laminu bylo pH reakční směsi udržováno v rozmezí 7,5 až 8. Reakce byla ukončena odpařením rozpouštědel za sníženého tlaku při +45 °C ± 5 °C. Olej ovitý zbytek byl rozpuštěn ve 30 ml vody obsahující N, V-diisopropy lety lamin (pH = 9). Vzniklý roztok byl třepán 3 krát 50 ml dietyleteru a následně okyselen IM vodným roztokem HC1 na pH = 3 a *·< · · · · ···· • · · · · · · φ · · φ · φ • · · 9 9 9 9 9 99 999 999

9 9 9 9 9 9 9 9 φ získaná látka byla extrahována 3 krát do 50 ml etylacetátu. Spojené etylacetátové roztoky byly třepány s vodou (2 x 50 ml), nasyceným vodným roztokem chloridu sodného (1 x 50 ml), sušeny síranem hořečnatým a po filtraci zahuštěny odpařením za sníženého tlaku při +45 °C ± 5 °C na olej.

Výtěžek N-fluorenylmetyloxykarbonyl-S-(3-allyloxykarbonylpropyl)cysteinu byl 3 g (79,8 %). Analytické vlastnosti byly potvrzeny MS spektroskopií, TLC, HPLC.

Příklad 4

Výroba N-t-butyloxykarbonyl-O-metyltyrosyl-isoleucyl-glutaminylasparaginyl-S-(3-allyloxy-karbonylpropyl)cysteinyl-prolyl-leucyl-glycyl-kopoly (1 %divinylbenzen-styren)

Boc-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys(S-(CH₂)₃COOAll)-Pro-Leu-Gly-O-P

Výroba byla uskutečněna na ručním syntetizátoru s 920 g chlormetylovaného polymerního nosiče esterifikováného Boc-Gly na substituci 1 mmol/g [4].

Každý aminokyselinový zbytek byl připojen v syntetickém cyklu složeného z deprotekce, promytí, neutralizace a vlastní kondenzační reakce, jak je znázorněno v Tabulce 1. Všechny cykly byly, s výjimkou kondenzačního kroku, stejné a byly při nich používány vždy 4,5 litry rozpouštědel nebo činidel. Deprotekce byla prováděna plynným chlorovodíkem bublaným suspensi nosiče v dichlormetanu [5].

Tabulka 1

Krok	Činidlo	Čas (min)	Počet operací
Deprotekce Boc skupiny	HC1/DCM	60	1
Promytí	DCM	2-4	3
Neutralizace	10% DIPEA/DCM	Po 4	2
Promytí	DCM (+DMF)*	2-4	1(+1)*
Kondenzace	aktivní komponenta	ifcsk 60-120	1-2
Promytí	DCM	2-4	3

* Před kondenzací Boc-Tyr(Me) -OH je nezbytné promýt nosič jednou dimetylformamidem.

**Kondenzační rekce trvá do negativního ninhy dřínového testu [4].

HOBt estery chráněných aminokyselin byly připraveny následujícím postupem:

• ·

0·

Množství použitých derivátů aminokyselin je uvedeno v Tabulce 2.

Dicyklohexylkarbodiimid a N-hydroxybenztriazol byly použity v ekvimolámích množstvích.

Tabulka 2 • · 0 0 · · · « · · *0 0· «· · · * · «♦

Cyklus v c.	Derivát aminokyseliny	Molární Hmotnost	Molární přebytek	DCM: DMF
1	B oc-Leu-OH.H2O	249,3	1,8	2 : 1
2	Boc-Pro-OH	215,3	1,8	2: 1
3	Boc-Cys(S-(CH2)3COO-allyl)- OH*	347,5	1,8	2: 1
4	Boc-Asn-OH	232,2	2,2	1 : 1
5	Boc-Gln-OH	246,3	2,2	1 : 1
6	Boc-Ile-OH.72H2O	240,3	2,0	1 : 1
7	Boc Tyr(Me)-OH	295,4	2,0	pouze DMF

připravený podle Příkladu 3.

Reakce byla ukončena promytím plně chráněné peptidylpryskyřice 3 krát

4,5 litry dichlormetanu a vysušením za sníženého tlaku při +40 °C do konstantní hmotnosti.

Výtěžek Boc-CB(C3A11)-P byl 1815 g (98,8 %). Sekvence byla potvrzena aminokyselinovou analýzou.

Vzorek plně chráněného peptidu byl amonolyticky odštěpen z 250 mg látky podle Příkladu 7A. Analytické vlastnosti uvedené sloučeniny byly potvrzeny aminokyselinovou analýzou a MS spektrometrií, HPLC.

Příklad 5

Odštěpení allylové skupiny. Výroba N-t-butyloxykarbonyl-O-metyltyrosylisoleucyl-glutaminyl-asparaginyl-S-(3-karboxypropyl)cysteinyl-prolyl-leucylglycyl-kopoly (1 %divinylbenzen-styren)

Boc-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys(S-C₃COOH)-Pro-Leu-Gly-O-P

2,4 1 kyseliny octové bylo pomalu přidáno do směsi 12 1 DMF a 1,2 1 morfolinu. 400 g Boc-CB(C₃A11)-P připraveného podle Příkladu 4 bylo v reaktoru pro reakci v pevné fázi promyto 3 krát 3,2 1 výše popsané směsi. Promytá peptidylpryskyřice byla poté suspendována do 4 1 téže směsi.

• * ·♦ · · ·« · · • · · ···· · • · <·· · · ·· · • · · · ♦ · · · · · ·« • · t · « · · · · ' · *· · · · · ·· ·· · »

Tetrakis(trifenylfosfin)palladium (10 g) byl přidán do suspense míchané bubláním argonu. Reakce probíhala pod argonem dalších 20 hodin. Ukončena odfiltrováním reakčního roztoku. Pryskyřice byla promyta dle následujícího schématu:

1. promytí, DCM, 3 x 1400 ml

2. neutralizace, 10% Λζ/V-diisopropyletylamin / DCM, 3 x 1400 ml

3. promytí, DCM, 3 x 1400 ml; MeOH, 3 x 1400 ml

Výtěžek Boc-CB(C3OH)-P byl 398 g (95,5 %). Sloučenina byla analyzována aminokyselinovou analýzou.

Vzorek částečně chráněného peptidu byl amonolyticky odštěpen z 250 mg látky podle Příkladu 7A. Složení konečné látky bylo potvrzeno aminokyselinovou analýzou a MS spektrometrií, HPLC.

Příklad 6

Výroba surového 1 -desamino-1 -monokarba-2-(O-metyl)-tyrosin-oxytocinu.

Cyklizace na polymemím nosiči.

A. Odštěpení /-butyloxykarbonylové skupiny. Příprava O-metyltyrosylisoleucyl-glutaminyl-asparaginyl-S-(3-karboxypropyl)cysteinyl-prolyl-leucylglycyl-kopoly (1 %divinylbenzen-styren)

H -Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys(S-(CH₂)₃COOH)-Pro-Leu-Gly-O-P

398 g Boc-CB(C3OH)-P připraveného podle Příkladu 5 byl umístěno do reaktoru pro reakci v pevné fázi a zpracováno podle následujícího schématu:

1. promytí, DCM, 3 x 2000 ml

2. deprotekce, 5% anisolu v 50% trifluoroctové kyselině /DCM, 3000 ml, 45 minut

3. promytí, DCM, 2 x 1800 ml; DMF, 2 x 1800 ml; DCM, 2 x 1800 ml

4. neutralizace, 6% V/V-diisopropyletylamin / DCM, 2 x 1800 ml

5. promytí, DCM, 3 x 1800 ml

B. Tvorba „karba mostu“. Cyklizace O-metyltyrosyl-isoleucyl-glutaminylasparaginyl-S-(3-karboxypropyl)cysteinyl-prolyl-leucyl-glycyl-kopoly (1 %divinylbenzen-styren)

398 g NH₂-CB(C₃OH)-P připraveného podle Příkladu 6A bylo umístěno do reaktoru pro reakci v pevné fázi a zpracováno podle následujícího schématu:

1. promytí, N-metylpyrrolidon, 3 x 2000 ml

99 9999 99

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9999 9 999 9 9 9 9 • · · · « 9 9 9 9 9 999 99 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

2. 1. cyklizace: Roztok 77,4 ml diisopropylkarbodiimidu a 75 g Nhydroxybenzotriazolu v 3200 ml N-metylpyrrolidonu, 20 hodin

3. promytí, N-metylpyrrolidon, 1 x 2000 ml

4. 2. cyklizace: Roztok 77,4 ml diisopropylkarbodiimidu a 75 g Nhydroxybenzotriazolu v 3200 ml N-metylpyrrolidonu, 20 hodin

3. promytí, DMF, 3 x 1200 ml; DCM, 2 x 1200 ml; MeOH, 2 x 1200 ml; DCM, 2x1200 ml

Konečná sloučenina byla vysušena za sníženého tlaku při +40 °C. Výtěžek CBP byl 368 g (99 %). Sekvence byla potvrzena aminokyselinovou analýzou.

C. Amonolytické odštěpení zpolymemího nosiče a isolace 1-desamino-1monokarba-2-(O-metyl)-tyrosin-oxytocinu pomocí IEC.

368 g CB-P připraveného podle Příkladu 6B bylo umístěno do plátěného pytlíku a vše bylo vloženo do tlakové nádoby vybavené přetlakovým ventilem, připojené k tlakové lahvi s amoniakem. Nádoba byla naplněna amoniakem (tlak 400 ± 50 kPa). Reakce probíhala 70 hodin při teplotě 18 až 22 °C.

Peptid byl získán extrakcí nosiče 5x21 metanolu. Spojené metanolické roztoky byly filtrovány přes 0,45 pm a 0,2 pm membrány a odpařeny za sníženého tlaku na objem 1 1.

Metanolický roztok byl prolit kolonou naplněnou 1 kg anexu, OH v metanolu. Kolona byla promyta 4x21 metanolu a vzniklý roztok odpařen za sníženého tlaku. Olej ovitý zbytek byl rozpuštěn v 1 1 vody a vzniklý roztok prolit kolonou naplněnou 1 kg katexu, H+ ve vodě. Kolona byla promyta 4x21 vody a získaný roztok zahuštěn odpařením za sníženého tlaku na 1,5 1. Z konečného roztoku byla, po přidání 80 ml kyseliny octové, látka izolována lyofilizací.

Výtěžek surového 1-desamino-l-monokarba-2-(O-metyl)-tyrosinoxytocinu byl 94,2 g (47,1 %). Sekvence byla potvrzena aminokyselinovou analýzou.

Příklad 7

Příprava surového 1 -desamino-1 -monokarba-2-(O-metyl)-tyrosin-oxytocinu

Cyklizace v roztoku.

A. Amonolytické odštěpení z polymemího nosiče.

Příprava N-t-butyloxykarbonyl-O-metyltyrosyl-isoleucyl-glutaminylasparaginyl-S-(3-karboxypropyl) cysteinyl-prolyl-leucyl-glycyl-amidu • 0 00 «0 90 00 90 • 00 0909 « « » ·

0 000 0 0 00 9 0 0 0 * · · 090 90 99 990 099 »»··«··» . .

Boc-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys(S-(CH2)3COOH)-Pro-Leu-Gly-NH₂

100 g Boc-CB(C3OH)-P připraveného podle Příkladu 5 bylo podrobeno reakci s amoniakem podle Příkladu 6C.

Peptid byl získán extrakcí nosiče po amonolýze 4 krát dimetylformamidem. Spojené DMF extrakty byly odpařeny za sníženého tlaku při +45 °C ± 5 °C na olej, ze kterého byla látka sražena pomocí 1,5 1 metanolu. Sraženina byla dvakrát promyta 1,5 1 metanolu, odfiltrována a vysušena na vzduchu při teplotě 18 až 22 °C.

Výtěžek Boc-CB(C3OH)-NH2 byl 40,5 g ( 76,4 % ). Analytické vlastnosti byly potvrzeny MS spektroskopií, TLC, HPLC.

B. Příprava N-t-butyloxykarbony 1-O-metyltyrosyl-isoleucyl-glutaminylasparaginyl-S-(3-[p-nitrofenyl]oxykarbonylpropyl)cysteinyl-prolyl-leucylglycyl-amidu

Boc-Tyr(Me)41e-Gbi-Asn-Cys(S-(CH₂)₃COONp)-Pro-Leu-Gly-NH2 g Boc-CB(C3OH)-NH2 připraveného podle Příkladu 7A bylo rozpuštěno ve 1280 ml dimetylformamidu. K roztoku bublanému dusíkem bylo postupně přidáno 1280 ml pyridinu a 51 g p-nitro fenyl trifluoroacetátu. Reakce probíhala pod dusíkem při teplotě 18 až 22 °C po 52 hodin. Rozpouštědla byla odpařena za sníženého tlaku při +45 °C ± 5 °C na olej. Látka byla sražena z oleje pomocí

2,5 1 etylacetátu. Sraženina byla promyta 500 ml etylacetátu a 500 ml dietyleteru. Po odfiltrování vysušena na vzduchu při teplotě místnosti 18 až 22 °C.

Výtěžek Boc-CB(C₃ONp)-NH₂ byl 40,2 g ( 90,5 % ). HPLC.

C. Odštěpení ř-butyloxykarbonylové skupiny.

Příprava O-metyltyrosyl-isoleucyl-glutaminyl-asparaginyl-S-(3-[/?nitrofenyl]oxykarbonylpropyl)cysteinyl-prolyl-leucyl-glycyl-amidu H-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys(S-(CH₂)3COONp)-Pro-Leu-Gly-NH₂ g Boc-CB(C₃ONp)-NH2 připraveného podle Příkladu 7B bylo rozpuštěno ve směsi 34 ml anisol a 640 ml trifluoroctové kyseliny. Reakce probíhala při teplotě 18 až 22 °C 1 hodinu. Rozpouštědla byla odpařena za sníženého tlaku při +40 °C ± 5 °C na olej, ze kterého byla sražena konečná látka pomocí 2 1 dietyleteru. Sraženina byla promyta 500 ml dietyleteru, odfiltrována a vysušena na vzduchu při teplotě 18 až 22 °C.

Výtěžek NH₂-CB(C₃ONp)-NH2 byl 42,8 g. HPLC.

• 4 9 9 · 4· • · · ·

9 4 4

4 9 • 4 4 44 • · · · • 4 4 4 ·· «4

9 4 · ·4 ·

· ·

D. Tvorba „karba mostu“. Cyklizace O-metyltyrosyl-isoleucyl-glutaminylasparaginyl-S-(3-|/>-nitrofenyl]oxykarbonylpropyl)cysteinyl-prolyl-leucylglycyl-amidu. Čištění pomocí IEC.

42,4 g NH₂-CB(C₃ONp)-NH₂ připraveného podle Příkladu 7B bylo rozpuštěno v 8 1 dimetylformamidu. Do roztoku bylo za míchání přidáno 24 ml trietylaminu. Reakce probíhala 21 hodin při teplotě 18 až 22 °C. Rozpouštědla byla odpařena za sníženého tlaku při +40 °C ± 5 °C na olej, který byl rozpuštěn v 11 metanolu. Roztok stál 1 hodinu při teplotě 18 až 22 °C a poté byl zfiltrován přes 0,45 pm a 0,2 pm membrány. Filtrát byl odpařen za sníženého tlaku při +40 °C ± 5 °C na olej a požadovaná látka byla sražena z oleje pomocí 2 1 etylacetátu. Sraženina byla promyta 500 ml etylacetátu, odfiltrována a vysušena na vzduchu při teplotě 18 až 22 °C.

Sraženina (34,5 g) byla rozpuštěna v 70 ml metanolu. Do roztoku bylo přidáno 630 ml vody tak, aby vznikl 10% (v/v) vodný roztok metanolu. Nerozpuštěné podíly byly odfiltrovány. Čirý roztok byl prolit kolonou naplněnou 1 kg katexu, FČ ve vodě, postupem podle Příkladu 6C. Vzniklý roztok byl odpařen za sníženého tlaku při +45 °C ± 5 °C na konečný objem 500 ml a zfiltrován přes 0,45 pm a 0,2 pm membrány. Z konečného roztoku byla, po přidání 25 ml kyseliny octové, izolována konečná sloučenina lyofilizací.

Výtěžek surového 1-desamino-l-monokarba-2-(O-metyl)-tyrosinoxytocinu byl 27 g (78,3 %). Sekvence byla potvrzena aminokyselinovou analýzou, HPLC.

Příklad 8

Čištění surového 1 -desamino-1 -monokarba-2-(0-metyl)-tyrosin-oxytocinu, pomocí HPLC.

A. Čištění uvedené sloučeniny získané cyklizací na polymemím nosiči

Kolona preparativního HPLC systému naplněná reverzní ODS stacionární fází na bázi silikagelu byla ekvilibrována mobilní fází složenou z 85 % (v) složky A = 2% kyselina octová ve vodě a 15 % (v) složky B = 2% kyselina octová v metanolu. Ekvilibrace byla prováděna 30 minut průtokem 50 litrů za hodinu.

g surového 1-desamino-l-monokarba-2-(O-metyl)-tyrosin-oxytocinu připraveného podle Příkladu 6C bylo rozpuštěno v 500 ml 6% kyseliny octové ve vodě a roztok byl nanesen na kolonu průtokem 3,5 litru za hodinu. Eluce byla provedena mobilní fází složenou z 54 % (v) složky A a 46 % (v) složky B průtokem 50 litrů za hodinu.

• 99 · · · · · · · ·

9999 9 999 · «9 9 • · 9 9*9 99 9» 999 999

9999 999· · ·

Složení látky v každé frakci bylo stanoveno použitím HPLC. Frakce obsahující l-desamino-l-monokarba-2-(O-metyl)-tyrosin-oxytocin o čistotě > 96 % byly spojeny, zakoncentrovány odpařením rozpouštědel za sníženého tlaku při +45 °C ± 5 °C a lyofilizovány.

Výtěžek vyčištěného 1 -desamino-1 -monokarba-2-(O-metyl)-tyrosin-oxytocinu byl 53 g (66 %). Analýzou byla získána následující analytická data:

Aminokyselinová analýza: Asx	0,95 - 1,05
Gly	0,95-1,05
Pro	0,95-1,05
Glx	0,95-1,05
Ile	0,95-1,05
Leu	0,95-1,05
Tyr(Me)	0,95-1,05
CysC3	0,95-1,05

2. Optická otáčivost, [ot], 598 nm, c = 5 mg/ml (1% kyselina octová ve vodě)

- 83° až - 73°

3. Obsah vody: Karl Fischer, coulometrická detekce < 6%

4. Peptidové nečistoty: HPLC, suma nečistot < 4%

5. Zbytková rozpouštědla: Isotachoforéza, kyselina octová < 5%

6. Obsah 1 -desamino- l-monokarba-2-(O-metyl)-tyrosin-oxytocinu (volná báze) v % celkové hmotnosti substance: HPLC, > 85%

7. Obsah 1 -desamino-l-monokarba-2-(O-metyl)-tyrosin-oxytocinu (volná báze): HPLC, 95 - 105 %

B. Čištění uvedené látky získané cyklizací v roztoku g surového 1 -desamino- l-monokarba-2-(O-metyl)-tyrosin-oxytocinu připraveného podle Příkladu 7D bylo čištěno podle Příkladu 8A.

Výtěžek vyčištěného 1 -desamino-1 -monokarba-2-(O-metyl)-tyrosin-oxytocinu byl 58 g (72,2 %). Analytická data vyčištěné látka byla shodná s daty uvedenými v Příkladu 8.

Příklad 9

Příprava 1 -desamino-1 -monokarba-2-(O-metyl)-tyrosin-5-D-asparagin oxytocinu • * · · φ · · φφφφ • · ·φφ φφφφ 1111

Φ 11 1 1 1 11 · φ 111 111

11111111 1 ·

A. Příprava N-t-butyloxykarbonyl-O-metyltyrosyl-isoleucyl-glutaminyl-Dasparaginyl-S-(3-allyloxykarbonylpropyl)cysteinyl-prolyl-leucyl-glycyl-kopoly (1 %divinylbenzen-styren)

Boc-Tyr(Me)-Ile-Gln-D-Asn-Cys(S-(CH₂)₃COOAll)-Pro-Leu-Gly-O-P

Reakce byla uskutečněna s 2,8 g chlormetylovaného polymerního nosiče esterifikovaného Boc-Gly na substituci 1 mmol/g [4] postupem podle Příkladu

4. V sekvenci byl použit Boc-D-Asn místo Boc-L-Asn.

Výtěžek Boc-[D-Asn⁵]CB(C₃All)-P byl 5.5 g (92,3 %). Sekvence byla potvrzena aminokyselinovou analýzou.

B. Odštěpení allylové skupiny. Příprava N-t-butyloxykarbonyl O-metyltyrosylisoleucyl-glutaminyl-D-asparaginyl-S-(3-karboxypropyl)cysteinyl-prolyl-leucylglycyl-kopoly (1 %divinylbenzen-styren)

Boc-Tyr(Me)-Ile-Gln-D-Asn-Cys(S-(CH₂)₃COOH)-Pro-Leu-Gly-O-P

4,6 g Boc-[D-Asn⁵]CB(C₃All)-P připraveného podle Příkladu 9A bylo zbaveno chránící skupiny podle Příkladu 5.

Výtěžek Boc-[D-Asn⁵]CB(C₃OH)-P byl 4,5 g (93,8 %). Sekvence byla potvrzena aminokyselinovou analýzou.

C. Odštěpení /-butyloxykarbonylové skupiny. Příprava O-metyltyrosylisoleucyl-glutaminyl-D-asparaginyl- S-(3-karboxypropyl)cysteinyl-prolylleucyl-glycyl-kopoly (1 %divinylbenzen-styren)

H -Tyr(Me)-Ile-Gln-D-Asn-Cys(S-(CH₂)₃COOH)-Pro-Leu-Gly-O-P

4,5 g Boc-[D-Asn⁵]CB(C₃OH)-P připraveného podle Příkladu 9B bylo zbaveno chránící skupiny podle Příkladu 6A.

Získaná látka byla použit bez izolace přímo v dalším kroku - Příklad 9D.

D. Tvorba „karba mostu“. Příprava l-desamino-l-monokarba-2-(O-metyl)tyrosin-5-D-asparagin-oxytocinyl-kopoly (1 %divinylbenzen-styren)

NH₂-[D-Asn⁵]CB(C₃OH)-P připraveného podle Příkladu 9C byl cyklizován podle Příkladu 6B.

Výtěžek [D-Asn⁵]CB-P byl 3,8 g (89,6 %). Sekvence byla potvrzena aminokyselinovou analýzou.

• * · «·«· ···· • · ··· · · ·· ··«· • · · · · « · · · · ··· ··· • · · · ' · · « « ·

E. Amonolytické odštěpení zpolymemího nosiče a isolace 1-desamino-1monokarba-2-(O-metyl)-tyrosin-5-D-asparagin-oxytocinu pomocí IEC.

[D-Asn⁵]-CB-P připravený podle Příkladu 9D byl amonolyzován podle Příkladu 6C.

Výtěžek surového [D-Asn⁵]CB byl 490 mg (23,7 %). Analytické vlastnosti byly potvrzeny HPLC.

v

F. Čištění surového 1-desamino-l-monokarba-2-(O-metyl)-tyrosin-5-Dasparagin-oxytocinu pomocí HPLC.

Kolona semipreparativního HPLC systému naplněná reverzní ODS stacionární fází na bázi silikagelu byla ekvilibrována 7 minut průtokem 20 ml/min mobilní fází složenou z 90 % (v) složky A = 0,04% kyselina trifluoroctová ve vodě a 10 % (v) složky B = acetonitril.

400 mg surového 1-desamino-l-monokarba-2-(O-metyl)-tyrosin-5-D-asparaginoxytocinu připraveného podle Příkladu 9E bylo rozpuštěno v 8 ml vody a roztok byl nanesen na kolonu průtokem 4 ml/min. Eluce byla provedena mobilní fází složenou ze složek A a B míchaných podle gradientního programu uvedeného v Tabulce 3 průtokem 20 ml/min.

Tabulka 3

Gradientní program:

V Cas (min)	% A	%B
0	90	10
7	90	10
25	80	20
110	60	40
130	50	50
140	15	85

Frakce obsahující požadovanou látku byly vyhodnoceny pomocí HPLC, spojeny, zahuštěny odpařením rozpouštědel za sníženého tlaku při +45 °C ± 5 °C a lyofilizovány.

Výtěžek vyčištěného 1 -desamino-1 -monokarba-2-(O-metyl)-tyrosin-5-Dasparagin-oxytocinu byl 45 mg (11,2 %). Analytické vlastnosti byly potvrzeny MS spektroskopií, chirální aminokyselinovou analýzou a HPLC.

Příklad 10

Příprava 1 -desamino-1 -monokarba-fenylalaninyl-D-tryptofyl-lysyl-threonyl-S(3 -karboxypropyl) cysteinyl-threonyl-amidu

CO-NH-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂ 1— CH₂-CH₂-CH₂— S—I

A. Příprava N-fluorenylmetyloxykarbonyl-fenylalaninyl-D-tryptofyl-N^£(řbutyloxykarbonyl)lysyl-O-ř-butylthreonyl-S-(3-allyloxykarbonylpropyl)cy steinyl-threonyl-kopoly (1 %di vinylbenzen-styren)

Fmoc-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(S-(CH₂)₃COOAll)-Thr-O-P

Reakce byla uskutečněna s 1,8 g chlormetylovaného polymerního nosiče esterifikovaného Boc-Thr na substituci 0,39 mmol/g [4].

Přehled derivátů aminokyselin použitých pro kondenzace je uveden v Tabulce 4. Promytí, deprotekce a kondenzace každého aminokyselinového zbytku byly prováděny v souladu s metodikou rutinně používanou pro Boc/Bzl nebo Fmoc/řBu taktiku syntézy peptidů v pevné fázi [4] na automatickém syntetizátoru peptidů. Kondenzační reakce byly prováděny DIC/HOBt metodou. V každém kroku byly použity 3 ekvivalenty aktivní komponenty v DMF.

Tabulka 4

Cyklus \z c.	Derivát aminokyseliny	Molární hmotnost
1	Boc-Cys(S-(CH2)3All)-OH*	347,5
2	Fmoc-Thr(/Bu)-OH	397,5
3	Fmoc-Lys(Boc)-OH	468,5
4	Fmoc-D-Trp-OH	426,5
5	Fmoc-Phe-OH	387,4

připraveného podle Příkladu 3

Výtěžek byl 2,35 g (89,4 %). Sekvence byla potvrzena aminokyselinovou analýzou.

B. Odštěpení allylové skupiny. Příprava N-fluorenylmetyloxykarbonylfenylalaninyl-D-tryptofýl-N^e(/-butyloxykarbonyl)lysyl-O-/-butylthreonyl-S-(3karboxypropyl)cysteinyl-threonyl-kopoly (1 %divinylbenzen-styren) • Φ · Φ · · ο ΦΦΦΦ • φ φφφ φ φ ·Φ φφφφ • φφ φφφ φφ φφ φφφ φφφ φφφφ φφφφ φ φ

Fmoc-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(S-(CH₂)₃COOH)-Thr-O-P

2,0 g plně chráněné peptidy 1 pryskyřice připravené podle Příkladu 10A bylo zbaveno chránící skupiny podle Příkladu 5.

Výtěžek byl 1,9 g (95,8%).

C. Odštěpení N-fluorenylmetyloxykarbonylové skupiny. Příprava fenylalaninylD-tryptofyl-N^E(ř-butyloxykarbonyl)lysyl-O-ř-butylthreonyl-S-(3karboxypropyl)cysteinyl-threonyl-kopoly (1 %divinylbenzen-styren) H-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(S-(CH₂)3COOH)-Thr-O-P

1,9 g N-fluorenylmetyloxykarbonyl-fenylalaninyl-D-tryptofyl-N^E(Zbutyloxykarbonyl)lysyl-O-Z-butylthreonyl-S-(3-karboxypropyl)cysteinylthreonyl-kopoly (l%divinylbenzen-styren) připraveného podle Příkladu 10B bylo zbaveno chránící skupiny v následujícím cyklu:

1. promytí, DMF, 3x20 ml

2. promytí, 20% piperidin (v/v) v DMF

3. deprotekce, 20% piperidin (v/v) v DMF, 20 minut

4. promytí, DMF, 3x20 ml

Získaná sloučenina byla použita bez izolace přímo v dalším kroku - Přikladl OD.

D. Tvorba „karba mostu“. Příprava 1-desamino-l-monokarba-fenylalaninyl-Dtryptofyl-N^e(/-butyloxykarbonyl)lysyl-O-ř-butylthreonyl-S-(3karboxypropyl)cysteinyl-threonyl-kopoly (1 %divinylbenzen-styren)

CO-NH-Phe-D-T rp-Lys(Boc)-Thr( řBu)-Cys-Thr-O-P I— ch₂—ch₂— ch₂-S—I

Fenylalaninyl-D-tryptofyl-N^s(/-butyloxykarbonyl)lysyl-O-/-butylthreonyl-S-(3karboxypropyl)cysteinyl-threonyl-kopoly( 1 %divinylbenzen-styren) připravený podle Příkladu 10C byl cyklizován podle Příkladu 6B.

Získaná látka byla použita bez izolace přímo v dalším kroku - Příklad 10E.

E. Odštěpení /-butyloxykarbonylové a ř-butylové skupiny. Příprava 1-desaminol-monokarba-fenylalaninyl-D-tryptofyl-lysyl-threonyl-S-(3karboxypropyl)cysteinyl-threonyl-kopoly (1 %divinylbenzen-styren)

CO-NH-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-O-P I— CH₂-CH₂-CH₂_ S—I • · » · · * · « * # 9 • · · ♦ · · ··· « · · · «· · · · · · · « ·«· 999 • · · · · · · · » ·

-desamino-1 -monokarba-fenylalaninyl-D-tryptofy 1-Ν^ε(ίbutyloxykarbonyl)lysyl-O-ř-butylthreonyl-S-(3-karboxypropyl)cysteinylthreonyl-kopoly (l%divinylbenzen-styren) připravený podle Příkladu 10D byl zbaven chránících skupin v následujícím cyklu:

1. promytí, DCM, 3x20 ml

2. promytí, směs TFA:fenol:voda:EDT:TIS, 80:5:5:2,5:1 (v/v), 20 ml

3. deprotekce, směs TFA:fenol:voda:EDT:TIS, 80:5:5:2,5:1 (v/v), 20 ml, 45 minut

4. promytí, DCM, 4x20 ml; DMF, 1x20 ml; DCM, 2x20 ml

5. neutralizace, 10% Αζ/V-diisopropyletylamin v DCM (v/v), 3 x 20 ml, 5 minut

3. promytí, DCM, 3 x 20 ml; MeOH, 3 x 20 ml; DCM, 3 x 20 ml

Získaná látka byla vysušena při teplotě 18 až 22 °C. Výtěžek byl 1,56 g. Sekvence byla potvrzena aminokyselinovou analýzou.

F. Amonolytické odštěpení z polymerního nosiče a isolace surového 1desamino-1-monokarba-fenylalaniny 1-D-tryptofyl-ly syl-threonyl-S-(3karboxypropyl)cysteinyl-threonyl-amidu

1,5 g 1 -desamino-1 -monokarba-fenylalaninyl-D-tryptofyl-lysyl-threonyl-S-(3karboxypropyl)cysteinyl-threonyl-kopoly(l%divinylbenzen-styren) připraveného podle Příkladu 10E bylo amonolyzováno podle Příkladu 7A. Sloučenina byla sražena z oleje získaného odpařením spojených DMF extraktů pomocí dietyleteru. Sraženina byla po odfiltrování vysušena na vzduchu při teplotě 18 až 22 °C.

Výtěžek surové látky byl 305 mg (75,2 %).

G. Čištění surového 1 -desamino-1 -monokarba-fenylalaninyl-D-tryptofyl-lysylthreonyl-S-(3-karboxypropyl)cysteinyl-threonyl-amidu pomocí HPLC.

Kolona semipreparativního HPLC systému naplněná reverzní ODS stacionární fází na bázi silikagelu byla ekvilibrována 7 minut průtokem 20 ml/min mobilní fází složenou z 90 % (v) složky A = 0,04% kyselina trifluoroctová ve vodě a 10 % (v) složky B = acetonitril.

300 mg surového 1 -desamino- 1-monokarba-fenylalaninyl-D-tryptofýllysyl-threonyl-S-(3 -karboxypropyl) cysteinyl-threonyl-amidu připraveného podle Příkladu 10F bylo rozpuštěno v 10 ml 10% vodného acetonitrilu a roztok byl nanesen na kolonu průtokem 5 ml/min. Eluce byla provedena mobilní fází složenou ze složek A a B smíchaných podle gradientního programu uvedeného v Tabulce 5 průtokem 20 ml/min.

··· ί · · · ···· • · ··· ♦ · ·· · · · · • ·· · ♦ · · · · · ··· «·· • · · · · · · · · ·

Tabulka 5

Gradientní program:

Čas (min)	% A	%B
0	90	10
30	80	20
200	60	40

Frakce obsahující požadovanou sloučeninu byly vyhodnoceny pomocí HPLC, spojeny, zahuštěny odpařením rozpouštědel za sníženého tlaku při +45 °C ± 5 °C a lyofilizovány.

Výtěžek vyčištěného 1 -desamino-1 -monokarba-fenylalaninyl-D-tryptofyl-lysylthreonyl-S-(3-karboxypropyl)cysteinyl-threonyl-amidu byl 55 mg (18,3 %). Analytické vlastnosti byly potvrzeny MS spektroskopií, chirální aminokyselinovou analýzou a HPLC.

Průmyslová využitelnost

Nové deriváty cysteinu podle vynálezu, připravené způsobem podle vynálezu, mohou být využity především pro přípravu a výrobu 1-desamino-1-monokarba2-(O-metyl)-tyrosin-oxytocinu, který je používán k léčbě různých gynekologických poruch ve veterinární medicíně a nyní i v humánním lékařství, neboť se způsobem podle vynálezu podstatně zjednodušila jeho výroba a zlepšila kvalita konečné sloučeniny. Zmíněné deriváty mohou být použity též pro přípravu dalších peptidů majících v molekule typický strukturní karba motiv.

• » · · • ♦ « • ··

Seznam zkratek

Asn

Asx

Cys

D-Asn

Gin

Glx

Gly

Ile

Leu

Lys

Phe

Pro

Thr

D-Trp

Tyr(Me)

CysC₃All

BocCysC₃All

FmocCysC₃All

P

Boc

Fmoc

All řBu

ACN

AcOH

Asparagin

Asparagová kyselina, asparagin - obecná zkratka

Cystein

D-asparagin

Glutamin

Glutamová kyselina, glutamin - obecná zkratka

Glycin

Isoleucin

Leucin

Lysin

Fenylalanin

Prolin

Threonin

D-tryptophan

O-metyltyrosin

S-(3-allyloxykarbonylpropyl)cystein

N-/-butyloxykarbonyl-S-(3-allyloxykarbonylpropyl)cystein N-fluorenylmetyloxykarbonyl-S-(3allyloxykarbonylpropyl)cystein Polymerní nosič

N-ř-butyloxykarbonyl

N-fluorenylmetyloxykarbonyl

Allyl /-butyl

Acetonitril

Kyselina octová

Boc₂O

DCM

DIC

DIPEA

DMF

EDT

FmocOSu

HOBt

MeOH

NMP

TEA

TFA

TFAONp

TIS

ODS

NH₃(g)

NMR

TLC

MS

HPLC

IEC

Boc-CB(C₃A11)-P

Boc-CB(C₃OH)-P

NH₂-CB(C₃OH)-P di-Z-butyl diuhličitan

Dichlormetan

N,N-diisopropylkarbodiimid

N,N-diisopropyletylamin

Dimetylformamid

Etandithiol

9-fluorenylmetylsuccinimidyluhličitan

N-hydroxybenztriazol

Metanol

N-metylpyrrolidon

Trietylamin

Kyselina trifluoroctová p-nitrofenyl trifluoracetát

Triisopropylsilan

Oktadecylsilan

Plynný amoniak

Nukleární magnetická resonance

Chromatografie v tenké vrstvě

Hmotnostní spektrometrie

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie

Ionexová chromatografie

N-t-butyloxykarbonyl-O-metyltyrosyl-isoleucyl-glutaminylasparaginyl-S-(3-allyloxykarbonylpropyl)cysteinyl-prolylleucyl-glycyl-kopoly( 1 %divinylbenzen-styren) N-t-butyloxykarbonyl-O-metyltyrosyl-isoleucyl-glutaminylasparaginyl-S-(3-karboxypropyl)cysteÍnyl-prolyl-leucylglycyl-kopoly( 1 %divinylbenzen-styren)

O-metyltyrosyl-isoleucyl-glutaminyl-asparaginyl-S-(322

Boc-CB(C₃OH)nh₂

Boc-CB(C₃ONp)NH₂

NH₂-CB(C₃ONp)NH₂

Boc-[DAsn⁵]CB(C₃All)-P

Boc-[DAsn⁵]CB(C₃OH)-P

NH₂-[DAsn⁵]CB(C₃OH)-P

CB-P [D-Asn⁵]CB-P [D-Asn⁵]-CB

PhEu karboxypropyl)cysteinyl-prolyl-leucyl-glycylkopoly( 1 %di viny lbenzen-styren)

N-t-butyloxykarbonyl-O-metyltyrosyl-isoleucyl-glutaminylasparaginyl-S-(3-karboxypropyl)cysteinyl-prolyl-leucylglycyl-amid

N-t-butyloxykarbonyl O-metyltyrosyl-isoleucyl-glutaminylasparaginy 1- S-(3 - [p-nitrofeny 1] oxykarbony lpropyl)cysteinylprolyl-leucyl-glycyl-amid

O-metyltyrosyl-isoleucyl-glutaminyl-asparaginyl-S-(3-[pnitrofenyl] oxykarbonylpropyl)cysteinyl-prolyl-leucyl-glycylamid

N-t-butyloxykarbonyl-O-metyltyrosyl-isoleucyl-glutaminylD-asparaginyl-S-(3-allyloxykarbonylpropyl)cysteinyl-prolylleucyl-glycyl-kopoly (1 %divinylbenzen-styren) N-t-butyloxykarbonyl-O-metyltyrosyl-isoleucyl-glutaminylD-asparaginyl-S-(3-karboxypropyl)cysteinyl-prolyl-leucylglycyl-kopoly (1 %divinylbenzen-styren)

O-metyltyrosyl-isoleucyl-glutaminyl-D-asparaginyl-S-(3karboxypropyl) cysteinyl-prolyl-leucyl-glycyl-kopoly (1 %divinylbenzen-styren)

-desamino-1 -monokarba-2-(O-metyl)-tyrosin-oxytocinkopoly (l%divinylbenzen-styren)

-desamino-1 -monokarba-2-(O-metyl)-tyrosin-5-Dasparagin-oxytocin-kopoly (1 %divinylbenzen-styren)

-desamino-1 -monokarba-2-(O-metyl)-tyrosin-5-Dasparagin-oxytocin

European Pharmacopoeia • · · · · * · ···· • *♦·♦ · » ·· ♦ · » · • · · « · · · · · « ··· ··· * · ♦ · ♦ · 9 » 4 9

Citovaná literatura [1] Handbook of neurohypophyseal hormone analogs vol. I, part 2, pp. 144, CRC Press,

Boča Raton, Florida [2] CZ patent 237944; Krchňák V., Flegel M., Krojidlo M., Lebl M., Kolínský J.

[3] CZ patent 230542; Krojidlo M., Flegel M., Lebl M., Kolínský J.

[4] Stewart J. M., Young J. D.: Solid phase peptide synthesis, Freeman, San Francisco,

Califomia, 1969 [5] CZ patent 255500; Krchňák V., Krojidlo M., Lepša L.

[6] Handbook of neurohypophyseal hormone analogs vol. II, part 2, pp. 91, CRC Press,

Boča Raton, Florida [7] Flegel M., Rinnová M., Pánek Z., Lepša L., Bláha I.: Proč 14^th Amer. Peptide Symp.

(Mayflower Scientific Ltd., Columbus, 1996)

Claims (5)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob výroby organických látek, zejména karba analogů peptidů, vyznačující se tím, že se při výstavbě lineárního řetězce v jejich molekule použije derivát cysteinu obecného vzorce A kde

   R¹ značí H, nasycený nebo mono-nenasycený alkyl s počtem atomů uhlíku Ci až C₆ včetně rozvětvených derivátů a cykloalkylů, případně substituovaný benzyl se substituentem vybraným z H, 2- nebo 4-metoxy, 2- nebo 4-chloro a 2- nebo 4-nitro, nebo 9-fluorenylmetyl,

   R² značí nasycený nebo mono-nenasycený alkyl s počtem atomů uhlíku Ci až Cfi včetně rozvětvených derivátů a cykloalkylů, případně substituovaný benzyl se substituentem vybraným z H, 2- nebo 4-metoxy, 2- nebo 4-chloro a 2- nebo 4-nitro, nebo 9-fluorenylmetyl, přičemž R a R jsou různé, který se v průběhu výroby organických látek, zejména karba analogů peptidů, pozmění odstraněním chránící skupiny R¹ a následnou kondenzací se vytvoří amidická vazba, uzavírající karba můstkový cyklus v připravované molekule organické látky.
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se při výstavbě lineárního řetězce použije derivát cysteinu obecného vzorce I

   X-NH-CH-CO-Y

   Óh₂ i

   i (I), ··· · · · · 9 9 9 9 • 9 999 9 · 99 »999

   9 99 999 99 · · · 9 9 9 · 9 • ••9 · · · · · 9 kde

   X značí Η, Boc-, Fmoc-, Boc-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn, H-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-,

   Y značí skupinu -OH, -Pro-Leu-Gly-NH₂, -Pro-Leu-Gly-P,

   Z značí allyloxykarbonylpropyl, karboxypropyl, p-nitrofenyloxykarbonylpropyl, přičemž značí-li substituent Z karboxypropyl nebo p- nitrofenyloxykarbonylpropyl, tvoří se případně amidická vazba s některým ze substituentů X.
3. 3. Způsob podle nároku 1., vyznačující se tím, že se odstranění chránící skupiny R¹ provede odštěpením za přítomnosti homogenního palladiového katalyzátoru, který se při reakci použije v množství 0,01 až 0,1 ekvivalentu štěpené látky ve směsi rozpouštědel tvořené dimetylformamidem, kyselinou octovou a morfolínem v objemovém poměru 10:2: 1.
4. 4. Deriváty cysteinu obecného vzorce A podle nároku 1., kde R¹ značí allyl a R² značí t-butyl nebo 9-fluorenylmetyl.
5. 5. Způsob výroby podle nároku 1., vyznačující se tím, že se deriváty cysteinu obecného vzorce A použijí při přípravě 1 -desamino-l-monokarba-2-O-metyltyrosin oxytocinu, který obsahuje po vyčištění surové sloučeniny vždy stejné, definované množství biologicky neškodných vedlejších příměsí v množství menším než 2 % celkové plochy všech píků detekovatelných při analýze.