CZ9902921A3 - Léčivo pro profylaxi nebo zpomalení rozvoje Alzheimerovy choroby a terapeuticky účinný produkt k prevenci Alzheimerovy choroby - Google Patents

Description

Oblast techniky

Předmětem vynálezu je použití fytosterolového prostředku pro výrobu léčiva pro profylaxi nebo zpomalení rozvoje Alzheimerovy choroby, jakož i terapeuticky účinný produkt k prevenci Alzheimerovy choroby, který obsahuje beta-sitosterol, kampesterol a stigmastanol, patřící mezi fytosterolové prostředky.

Dosavadní stav techniky

Alzheimerova choroba je nezvratně se vyvíjející mentální onemocnění. Jeho hlavním patologickým znakem je rozvoj cytoskeletálních změn v několika citlivých nervových buňkách. Tyto změny nenastávají nevyhnutelně s rostoucím věkem, ale jakmile onemocnění započne, spontánní uzdravení nebo remise se nepozorují.

Počáteční kortikální změny popsané dále se rozvíjejí v málo myelinizovaných buňkách spojující oblasti mediálního spánkového laloku. Jako předvídatelný děj následuje destruktivní proces, který se šíří i do okolních kortikálních oblastí. Umístění neuronů nesoucích uzlíčky (tangles) a potíže způsobené změnami umožňují rozlišit šest stadií vývoje onemocnění od stadií I-II, která jsou bez klinických projevů až po stadia V-VI, která ukazují plně rozvinutou Alzheimerovu chorobu. U relativně malého počtu pacientů se projevují změny, zejména na počátku, což ukazuje, že pokročilý věk není nezbytnou podmínkou pro rozvoj změn. Podle toho je tedy Alzheimerova choroba věkem • · · · · ·

- 2 ovlivněná, ale není na věku závislá.

94 » 9 9 · » 9 9 9 •94 4·9

4

4· ·9

Existuje několik současných teorií týkajících se příčin mechanismu vývoje Alzheimerovy choroby, mnoho z nich

Velmi malé procento má defekt na 21. ke genu pro tvorbu

Amyloidový je spojeno s genetickými defekty, pacientů s Alzheimerovou chorobou chromozomu, který se vztahuje amyloidového prekursorového proteinu (APP). prekursorový protein je velký protein účastnící se růstu a reparace buňky, který se může, po štěpení na malý neuspořádaný protein beta-amyloid (B-A), akumulovat v plácích v mozku.

Další zajímavé studie se zaměřují na vztah mezi pozdním rozvojem dědičné Alzheimerovy choroby a polymorfním genem na 19. chromozomu kódujícím apolipoprotein E (apo-E), protein o relativní molekulové hmotnosti 34 000 účastnící se transportu cholesterolu a jiných lipidů do buněk a z buněk v celém těle. Úloha apo-E v transportu a metabolismu lipidů je rozhodující a pojednává se o ní dále. Neurobiologická úloha apo-E byla odvozena z množství několikaletých výzkumů. Za prvé se apo-E hojně vyskytuje v mozku, kde ho syntetizují a produkují především astrocyty (Elshourbagy a kol., 1985). Za druhé se lipoproteiny obsahující apo-E nalézají v mozkomíšním moku a zdá se, že hrají hlavní roli při lipidovém transportu v centrálním nervovém systému (Pitas a kol., 1987). Za třetí apo-E navíc se zdrojem cholesterolu podporuje výraznou extenzi axonů v kultuře buněk zadních kořenů ganglií (Handelmann a kol., 1992). Za čtvrté se hladiny apo-E výrazně zvyšují po poškození periferního nervu (Muller a kol., 1985). Podle toho se apo-E zdá být účastníkem jak při vychytávání lipidů vytvořených po degeneraci axonu, tak i v redistribuci těchto lipidů na • ft ftftftft • · · · * ·9 « ft ft ft • · · · · ftftftft • ft ftft » ftft ftftft ftftft ft ftftft ft ft · · _ 2 ·· ·· ··· ··· ·· ·* obnovu axonů k regeneraci axonu a později i na obnovu Schwannových buněk k remyelinizaci nových axonů (Boyles a kol., 1989).

Důsledkem úlohy apo-E, který existuje ve třech různých izoformách kódovaných třemi oddělenými alelami (E-2, E-3 a

E-4), které jsou dědičné kodominantní formou v jediném genetickém místě, v patogenezi Alzheimerovy choroby vychází konkrétně ze spojitosti apo-E se dvěma charakteristickými neuropatologickými lézemi Alzheimerovy choroby extracelulárními plaky axonů (představujícími depozita betaamyloidu) a intracelulárními neurofibrilovými uzlíky (představující filamenta proteinu spojeného s mikrotubuly zvaného tau-protein). Pro posouzení, prosím, shlédněte publikaci Weisgraber a kol. (1994).

Především byla nalezena genetická spojitost mezi izoformou apo-E4 a Alzheimerovou chorobou. E4-homozygotní jedinci projevují větší riziko rozvoje Alzheimerovy choroby než E4-heterozygoti, kteří zase projevují větší riziko než jedinci s chybějící alelou E4. Přestože přesný mechanismus kterým existuje tato korelace, zůstává nevyjasněn, vědci nalezli některé možné odpovědi. Ty mohou zahrnovat biologický účinek proteinu produkovaného touto alelou, analogický ke způsobu, kterým u E2-homozygotů vede pokles avidity vazby apo-E2 k receptorům pro LDL ke zvýšení hladin plazmatického cholesterolu. Strittmatter a kol., 1993, ukázal, že apo-E4 se účinněji váže k peptidu beta-amyloidu, což vede ke zvýšené tvorbě senilních plaků ve srovnání se zbylými dvěmi izoformami, a proto navrhl, že to není přítomnost apo-E, ale nedostatek jiných izoforem apo-E, co vede ke zvýšené predispozici k Alzheimerově chorobě (Strittmatter a kol., 1994a).

·· ·· · ’ • · • · » · · « · • ···* • ·

Taktéž s ohledem na interakci specifickou pro danou izoformu apo-E s tau-proteinem, jehož fosforylované formy jsou hlavní složkou neurofibrilových uzlíků, se ukázalo, že ne apo-E4, ale apo-E3 má větší aviditu k vazbě s tauproteinem (Strittmatter a kol. 1994a). Tento odlišný efekt vedl k hypotéze, že apo-E normálně dovoluje tau-proteinu stabilizovat mikrotubuly, a že jeho pokles nebo chybění u pacientů s jednou nebo dvěma alelami apo-E4 vede k disociaci tau-proteinu od mikrotubulů a jeho zvýšené fosforylaci a polymerizaci v patologicky zdvojená helikální fílamenta (Strittmatter a kol., 1994b).

Navzdory enormnímu výzkumu v oblasti rozvoje Alzheímerovy choroby jsou možnosti léčby omezené a způsoby profylaxe a/nebo zpomalení rozvoje tohoto mentálního onemocnění vlastně neexistují.

Předmětem tohoto vynálezu je odstranit nebo zmírnit výše uvedené nevýhody.

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu je použití fytosterolového prostředku pro výrobu léčiva pro profylaxi nebo zpomalení rozvoje Alzheímerovy choroby u živočicha.

Předmětem tohoto vynálezu je také terapeuticky účinný produkt k prevenci Alzheímerovy choroby, který obsahuje beta-sitosterol, kampesterol a stigmastanol.

Přítomný vynález bude popsán podrobněji dále.

• · 0 · « 0 * 0 · 0· 0 0 · 0 0 · • · · · · 0000

00 0 00000000

0000 00 00

00 000 000 00 00

Stručný popis obrázků na výkresech

Tento vynález je dále znázorněn těmito neomezujícími obrázky, kde:

obrázek 1 představuje graf ukazující výsledky testu Morrisova vodního labyrintu, vyjádřené jako doba [%] v každém kvadrantu, a kde základna byla v kvadrantu 1, obrázek 2 představuje graf ukazující výsledky testu Morrisova vodního labyrintu, vyjádřené jako doba [%] v každém kvadrantu, a kde základna byla z kvadrantu 1 odstraněna, obrázek 3 představuje graf ukazující výsledky testu Morrisova vodního labyrintu vyjádřené jako doba [%] v každém kvadrantu, a kde základna byla v kvadrantu 3 a obrázek 4 představuje graf ukazující výsledky testu Morrisova vodního labyrintu, vyjádřené jako doba [%] v každém kvadrantu, a kde základna byla z kvadrantu 3 odstraněna.

Upřednostňovaná ztělesnění vynálezu

Fytosteroly jsou sloučeniny podobné sterolům syntetizované v rostlinách bez přímé nutriční hodnoty pro ·· φφφφ ·· φ » φ φ φ φφφφ φφφ φ φ φφφφ φ φ φφ φ φ φ φφ φ φ φ φ φφφφ φφ φφ φφ φφ φφφ φφφ φφ φφ

- 6 lidi. U rostlin jsou potřebné pro funkci buňky, podobně jako je cholesterol potřebný pro člověka. Průměrná západní strava obsahuje více než 360 mg fytosterolů denně. Poslední dobou tyto potravinové rostlinné steroly získaly velkou pozornost díky svým možným protirakovinným vlastnostem a své schopnosti snižovat hladiny cholesterolu, jsou-li podány několika druhům savců včetně lidí. Rostlinné steroly dosud nikdy nebyly doporučeny nebo studovány k profylaxi a zpomalení rozvoje (k léčbě) Alzheimerovy choroby.

Chemicky . se fytosteroly strukturně těsně podobají cholesterolu. Hlavními fytosteroly jsou beta-sitosterol, kampesterol a stigmasterol. Jako další se mezi ně zahrnují stigmastanol (beta-sitostanol), desmosterol, chalinasterol, poriferasterol, klionasterol a brasikasterol. Prostředek podle tohoto vynálezu zahrnuje všechny přirozené a syntetické formy fytosterolů, všechny hydrogenované analogy, tj. stanoly a všechny jejich deriváty včetně izomerů.

Přestože jsou fytosteroly dostupné z rostlinných olejů a z rostlin, jejich množství nejsou bezpodmínečně ve významně dostatečných koncentracích nebo ve správné formě ke splnění výhod tohoto vynálezu. V oblasti tohoto vynálezu je zahrnutý způsob profylaxe a/nebo zpomalení rozvoje Alzheimerovy choroby podáním prostředku s fytosteroly živočichům, přesněji lidem. Tento prostředek může být přímo inkorporován do potravinových doplňků, olejů, vitaminů a terapeutických prostředků, jak se požaduje a popisuje dále.

Předpokládá se, že prostředky s fytosteroly podle tohoto vynálezu se mohou bez ohledu na genetickou pred.isposici k Alzheimerově chorobě mísit s běžně dostupnými složkami potravy za účelem širokého rozšíření v populaci.

• · · • · · · ·· flfl jsou ohroženi choroby, tj váné formě

Alternativně se mohou tyto protředky selektivně podat v intenzivnějším programu se zaměřením na jedince, kteří rozvojem zvláštních forem Alzheimerovy dědičné Alzheimerovy choroby. V upřednostňose prostředky přimísí k rostlinným olejům, zvoleným ze skupiny zahrnující slunečnicový olej, olej ze sezamových semen, kukuřičný olej, olej z rýžových otrub, olivový olej a řepkový olej. Nejvíce se upřednostňuje olivového oleje, jakožto oleje široce a s nízkým obsahem fytosterolů a mastných kyselin. Alternativně se inkorporovat do výrobků založených na nasycených tucích (vepřové sádlo) nebo pokrmových tucích, jako například másle nebo margarínu.

suplementace používaného polynenasycených prostředek může

V dalším ztělesnění se prostředky mohou inkorporovat do přípravků s dalšími obvyklými nebo rostlinnými produkty k prevenci nebo terapii Alzheimerovy choroby. Tyto produkty zahrnují, ale nejsou omezeny pouze na inhibitory cholinesterázy, jako například Aricept™-risperidon (lék na schizofrenii, nyní shledán užitečným k omezení agresivity spojené s Alzheimerovou chorobou) a možná paměť posilující rostlinná léčiva, jako například ginkgo (jinan dvoulaločný).

Tento vynález se zakládá na použití fytosterolů obecně k profylaxi a/nebo zpomalení rozvoje Alzheimerovy choroby. Přestože jsou upřednostňované přípravky k dosažení tohoto cíle uvedeny níže, nejsou žádným způsobem předloženy jako vymezující hranice rámce tohoto vynálezu, neboť mnoho fytosterolů samotných nebo v různých kombinacích může dosáhnout stejných prospěšných výsledků.

Upřednostňované prostředky s fytosteroly podle tohoto φφ φφ*· ·· · ···· φφφφ φφφ · φ φφφφ φ * φ · φ φ * φφφ φφφ φφφφ φφ φφ vynálezu zahrnují beta-sitosterol, kampesterol, stigmastanol (sitostanol) a popřípadě kampestanol a jejich analogy/deriváty. V jednom ztělesnění obsahuje prostředek podle tohoto vynálezu nejméně 10 % kampesterolu a ne více než 75 % beta-sitosterolu. V další upřednostňované formě prostředek obsahuje 10 až 25 % kampesterolu, 10 až 40 % stigraastanolu a 45 až 75 % beta-sitosterolu. Popřípadě může být přítomno 1 až 10 %, výhodněji 3 % kampestanolu.

V další upřednostňované formě obsahují prostředky podle tohoto vynálezu následující poměr fytosterolů: betasitosterol (1), kampesterol (0,2 až 0,4) a stigmastanol (0,2 až 0,5). Výhodněji kampesterol a stigmastanol dohromady představují nejméně 50 % celkové koncentrace betasitosterolu. Prostředky podle tohoto vynálezu obsahují následující poměry tří klíčových rostlinných sterolů:

beta-sitosterol kampesterol stigmastanol

0, 354 0, 414

0, 330 0, 203

0,268 0,299

U jiných upřednostňovaných prostředků byly shledány následující distribuce rostlinných sterolů (v %):

·96· »» • 9 • 9

	- 9 -	9 9 * 9 9 9 99 ·· f··
beta-sitosterol	kampesterol	stigmastanol
62, 6	16, 6	23,2
64,7	16, 4	17,2
60, 0	13, 6	16, 3
32, 0	14	29
25, 5	7	42,5
51	14	19
61	17	23
Avšak rozumí se, že v některém z těchto
upřednostňovaných	prostředků mohou	být přítomny jiné
rostlinné steroly.	Taktéž mohou být	součástí prostředku
adjuvancia nebo	nosné látky,	jsou-li požadovány.

• 9 · 9 9 • · 9 ·

999 999 • · ·9

V závislosti na způsobu podávání prostředků podle tohoto vynálezu se může dávkování poněkud lišit. Nejvíce se upřednostňuje podávání 1,0 g až 3,0 g denně.

Ve způsobu podle tohoto vynálezu se podáním prostředků s fytosteroly blíže popsaných výše jedinci předchází vzniku a/nebo zpomaluje rozvoj Alzheimerovy choroby. Přestože přihlašovatelé mají několik teorií, které jsou podrobněji přiblíženy dále, přesný mechanismus, kterým se podáním fytosterolú v potravě zlepšuje schopnost učení a paměti, zmenšuje se na věku závislé poškození synapsí a zpomalují se neurodegenerativní procesy, není jasný. Tyto teorie nejsou zamýšleny k vymezení rámce tohoto vynálezu, ale naopak, slouží k ukázání komplexního působení fytosterolú v udržení homeostázy lipidů u živočichů.

Jak je popisováno výše v dosavadním stavu techniky tohoto vynálezu, ukázalo se, že fenotyp apo-E4 představuje

9

9· 9 9 9 • · • · · · • · • · · 9 při vzniku Alzheimerovy choroby u lidí důležitý rizikový faktor. Také existuje jistý důkaz ukazující vztah mezi Alzheimerovou chorobou a kardiovaskulárním onemocněním (Kalaria, 1997) . Přehled funkce apo-E se poskytuje níže spolu s informací o vazbě apo-E k tomuto vynálezu, s ohledem na vysvětlení navrhovaných mechanismů účinku fytosterolů.

APO-E

Apo-E je pouze jednou z molekul přenášejících lipidy patřící mezi apolipoproteiny. Tyto proteiny mají tři hlavní funkce. Za prvé, interakcí s fosfolipidy pomáhají solubilizovat silně hydrofobní cholesterol a triglyceridy (jádro komplexu tvoří lipidy, vnější obal je apolipoprotein) , aby byl umožněn transport těchto lipidů. Za druhé, apolipoproteiny regulují reakci lipidů s enzymy, jako například s lipoproteinovou lipázou a lecithincholesterol-acyltransferázou. Za třetí, apolipoproteiny se vážou k receptorům buněčného povrchu, a tím určují místa příjmu a podílu degradace jiných součástí lipoproteinů, jmenovitě cholesterolu.

Apo-E je mezi apolipoproteiny ojedinělý v tom, že má specifický význam pro nervovou tkáň. Během rozvoje nebo po poškození periferního nervového systému koordinuje apo-E mobilizaci a redistribuci cholesterolu při reparaci, růstu a podpoře myelinu a membrán neuronů (Boyles a kol., 1989, výše). O funkci apo-E v centrálním nervovém systému se ví mnohem méně, což činí poznatek, že apo-E4 je možným ukazatelem Alzheimerovy choroby (zmíněno v části dosavadní stav techniky), zcela záhadným.

• · · · · «

APO-E MYŠI publikováno 4 a Mogadasian

Některé studie s lidmi a zvířaty ukázaly u rostlinných sterolů účinky snižující hladinu cholesterolu, včetně antiaterogenních účinků prostředků s fytosteroly u apo-E deficientních myší (patentová přihláška PCT/CA95/00555, dubna 1996 a začleněna odkazem na tomto místě a kol., 1996). Později se ukázaly apo-E deficientní myši být vhodnými zvířecími modely ke studiu patofyziologie Alzheimerovy choroby. Protože u apo-E deficientních myší brání fytosteroly atypickému rozdělení cholesterolu (pokožka, šlachy, aorta a hlavní tepny), mohly by hrát důležitou roli při určení tkáňové distribuce cholesterolu, dokonce i v mozkových buňkách nezávislých na fenotypech apo-E (studie přihlašovatele ve vývoji).

ZBYTKY CHYLOMIKRONŮ (REMNANTY CHYLOMIKRONŮ)

Chylomikrony jsou největší lipoproteinové částice osahující velké množství triglyceridů s menším množstvím fosfolipidů, volného cholesterolu a esterů. Syntetizují se v tenkém střevě nebo enterocytech jako odpověď na tuk a cholesterol potravy, vstupují do mesenterických a hrudních lymfatických žláz, kde obdrží apo-E. Enzym lipoproteinová lipáza (LL) katalyzuje hydrolýzu triglyceridů chylomikronů, kdy uvolněné volné mastné kyseliny jsou přednostně vychytávány adipocyty a zbývající menší části lipoproteinů, které jsou obohaceny o cholesterol, se nazývají zbytky chylomikronů (CR). Zbytky chylomikronů jsou rychle vychytány z plazmy selektivním apo-E dependentním receptorovým jaterním mechanismem (receptor příbuzný LDL receporu, receptor LRP), kde se cholesterol buďto použije k biosyntéze • · · * · · · membrán nebo lipoproteinů, nebo se vylučuje jako volný cholesterol, nebo se metabolizuje na žlučové kyseliny. Přítomnost apo-E se považuje za rozhodující pro internalizaci částic. Jaterní a mozkové buňky jsou na receptor pro vazbu částic LDL obzvláště bohaté.

LIPOPROTEINY 0 VELMI NÍZKÉ HUSTOTĚ (ČÁSTICE VLDL)

Lipoproteiny o velmi nízké hustotě (částice VLDL) mají podobnou strukturu jako chylomikrony, ale jsou menší a obsahují méně triglyceridů, avšak relativně více cholesterolu, fosfolipidů a proteinů (směs apo-E, apo-C a apo-ΒΙΟΟ). Částice VLDL se syntetizují hlavně v játrech a jejich hlavní funkcí je transport triglyceridů. Částice VLDL se liší ve velikosti, ale následná lipolýza lipoproteinovou nebo jaterní lipázou vede ke stejnoměrně menším částicím, zbytkům VLDL, neboli remnantům VLDL (také známým jako lipoproteiny o střední hustotě, IDL) a lipoproteinům o nízké hustotě (částice LDL).

LIPOPROTEINOVÉ LIPÁZY

Existují nejméně dvě odlišné triglyceridové lipázy. Extrahepatální neboli lipoproteinová lipáza (LL) se náchází hlavně v tukové tkáni a kosterních svalech. Hepatální lipáza (HL) se vyskytuje v endotelu jaterních buněk. Jak lipoproteinová lipáza, tak i jaterní lipáza jsou zahrnuty v katabolismu zbytků chylomikronů i částic VLDL.

APO-E RECEPTORY

Existují čtyři známé receptory, které jsou zahrnuty v transportu lipoproteinů (chylomikrony, VLDL nebo LDL) • Φ • · • · • · • ·

- 13 s apo-E z plazmy do buněk, LDL receptor, receptor příbuzný LDL receptorů (výše popsaný receptor LRP), nově popsaný receptor VLDL a epiteliální glykoproteinový 330 receptor (receptor GP330). Všechny čtyři receptory se nacházejí v mozku. Objev, že receptor pro aktivovanou formu alfa2makroglobulinu je identický s receptorem příbuzným LDL receptorů (receptor LRP) je důkazem, že receptor příbuzný LDL receptorů (receptor LRP) je multifaktoriální receptorový protein zvaný receptor alfa2M/LRP. Tento receptor se exprimuje téměř na všech buňkách v těle, zvláště v játrech a mozku, zaměřuje se na enzymy, proteiny, chylomikrony a LDL cholesterol a zdá se, že hraje komplexní roli v proteolýze, imunitě, buněčné proliferaci a buněčné smrti.

S ohledem na transport apo-E do nitra nervových buněk bylo zjištěno, že nejen neurony jsou velmi bohaté na receptory LRP na svém povrchu a že v plácích u Alzheimerovy choroby se zvýšila imunoreaktivita receptorů LRP (Rebeek a kol., 1993), ale že komplexy apo-E/LRP se také vyskytují v plácích lidského mozku (Ikeda a kol., nepublikované údaje). Receptor LRP se nejen váže ke zbytkům obsahujícím apo-E, ale také vzájemně reaguje s důležitými enzymy metabolismu chylomikronů, jako například s lipoproteinovou lipázou. Tato pozdější vazba nezávisí na přítomnosti na apoE (Beisiegel a kol., 1991). Pozoruhodná je schopnost fytosterolů předcházet u apo-E deficientních myší rozvoji tvorby aterosklerotických plaků.

V játrech jsou chylomikrony katabolizovány lipoproteinovou lipázou nebo apo-E dependentním receptorovým mechanismem, a sice prostřednictvím receptorů LRP nebo alfa2M/LRP.

• 9 · · 9 • ·

9 9 9 9 »999 • · 9 9 · 9 9999999 • · · 9 · · · 9

99 999 999 9« 99

NÁVRHOVÁNÉ MECHANISMY ÚČINKU FYTOSTEROLŮ NA ALZHEIMEROVU CHOROBU

Existují tři vzájemně propojené primární mechanismy, kterými fytosteroly projevují prospěšný účinek při profylaxi a rozvoji Alzheimerovy choroby:

1) fytosteroly zvyšují apo-E independentní vychytání chylomikronů v játrech tvorbou komplexu s jaterním receptorem LRP (a ještě ne zcela objasněným) mechanismem zahrnujícím alosterickou aktivaci lipoproteinové lipázy a tvorbu komplexu lipoproteinové lipázy s chylomikrony, a/nebo

2) fytosteroly snižují cirkulaci a/nebo apo-E dependentní receptorově zprostředkovaný transport komplexů apo-E s lipoproteiny obecně do buněk, zejména však do mozkových buněk, a/nebo

3) fytosteroly snižují rozvolňování buněk endotelu a chrání funkci endotelu jako hematoencefalické bariéry.

Fytosteroly se vážou na cirkulující chylomikrony a lipoproteiny a mají modifikující účinek na tyto částice v plazmě a na fyzikálně-chemické vlastnosti enzymů, jako například lipoproteinové lipázy a jaterní lipázy. Jinými slovy, přihlašovatelé navrhují, že fytosteroly tak působí stejně jako apolipoproteiny změnu struktury, složení a funkce cirkulujících chylomikronů a lipoproteinů, a navíc nepřímo přes receptor LRP ovlivňují mnoho rozhodujících buněčných funkcí.

Jednoduše řečeno, s ohledem na první mechanismus se • · ' · · ' · · ··· • · ·· · ··« fytosteroly váží na lipoproteiny, tj. chylomikrony a brání vazbě těchto částic na receptory alfa2M/LRP a následné pasáži těchto částic přes buněčnou bariéru do mozku. Podle toho by se mělo snížit množství apo-E v nervových buňkách, což je obzvláště důležité pro jedince, kteří jsou apo-E4 homozygotní.

Navíc fytosteroly alosterickou modifikací zvyšují aktivitu lipoproteinové lipázy, takže chylomikrony obohacené fytosteroly se tímto enzymem rychle metabolizuji. Chylomikrony se potom rychle odstraní z cirkulace prostřednictvím apo-E independentních receptorů pro chylomikrony v hepatocytech, které jsou stejné jako receptory LRP. Jak se pojednává výše, lipoproteinová lipáza je hlavní enzym zapojený do metabolismu triglyceridů (chylomikronů a částic VLDL) , který má karboxylový konec (Ckonec) a dusíkový konec (N-konec). Regulace, strukturní a funkční vztah a doména C-konce lipoproteinové lipázy (při indukci katabolismu chylomikronů prostřednictvím receptoru LRP) jsou vědcům dobře známy, a to přivedlo přihlašovatele na možnost apo-E independentního katabolismu lipoproteinů.

Doufá se, že prostředky s fytosteroly podle tohoto vynálezu upravují alosterickou modifikací fyzikálně-chemické vlastnosti lipoproteinů. V důsledku toho by mohla aktivita lipoproteinové lipázy ovlivněná fytosteroly účinněji utilizovat množství enzymu ke katabolismu triglyceridů katalytickým místem na N-konci, zatímco doména na C-konci by měla sloužit jako liganda pro chylomikrony. Komplexy domény na C-konci lipoproteinové lipázy a chylomikronů s přísunem jaterních nižších mastných kyselin jsou pak internaiizovány receptorem shodným s vychytávajícími („scavenger,,) receptory (alfa2M/LRP), a poté katabolizovány jaterní lipázou s další • · 9 9 · · ♦ 9 · · 9 «9 9 · * 9

9 9 9 9 9999

9 · 9 99 999 999

9999 9 9 99 _ — ** ** ··· ··· ** ·* výraznou degradací esterů mastných kyselin zbytků chylomikronů.

Jinými slovy, je možné, že fytosteroly usnadňují vazbu C-koncového ligandu lipoiproteinové lipázy na zbytky chylomikronů, a tím zvyšují metabolismus zbytků chylomikronů. Protože tyto procesy jsou nezávislé na apo-E, neměly by vyústit v up-regulaci LDL-receptorů.

S ohledem na třetí, jen doplňkový mechanismus, kterým fytosteroly snižují rozvolňování buněk (endoteliální účinek), přihlašovatelé zjistili, že u normálních a hypercholesterolemických krys snížilo podání prostředků s fytosteroly potravou rozvolňování buněk endotelu o 50 až 70 %. To je rozhodující zjištění vzhledem k úloze endotelu v hematoencefalické bariéře a v průniku nežádoucích škodlivých částic do mozku, což může vést ke vzniku Alzheimerovy choroby. Kromě toho jsou do interakce extracelulární buněčné matrix zapojeny integriny, odlišná třída glykoproteinových receptorů. Porušení exprese integrinú v mozku může být spojena se zvýšeným subendoteliálni propustnosti apo-E. Extracelulární buněčná matrix řídí růst, diferenciaci a funkci překrývajícího endotelu (Getlenburg a kol., 1990).

Dále se přihlašovatelé domnívají, že rostlinné steroly modifikují membrány, včetně hematoencefalické bariéry. Podle toho se transport potenciálně toxických látek, jako například betaamyloidového prekursoru, může narušit, což vede ke zpomalení rozvoje Alzheimerovy choroby.

Navíc trpí apo-E deficientní kyši oxidativním stresenfv mozku (Mathews a kol., 1996). To by mohlo být spojeno s Alzheimerovou chorobou. Přihlašovatelé právě probíhajícím výzkumem ukázali, že rostlinné steroly mohou mít antioxidační účinek. Podle toho tyto steroly mohou chránit mozek před oxidativním stresem, což vede k zpomalení rozvoje, nebo dokonce k profylaxi Alzheimerovy choroby.

Následuje souhrn možných způsobů účinku fytosterolů:

2) enzymatický účinek alosterická modifikace lipoproteinové lipázy a změny molekulární konfigurace v lipoproteinových komplexech

3) chylomikrony a zbytky chylomikronů stimulace lipoproteinové lipázy - lipoproteinovou lipázou obohacené zbytky chylomikronů, inhibice jaterní lipázy, transport zbytků chylomikronů po vazbě na apo-E independentní receptor VLDL nebo LRP využívající C-konec monomeru lipoproteinové lipázy jako ligand pro vazbu a/nebo internalizaci receptoru, inhibice transportu zbytků chylomikronů vazbou na receptor LDL monomerem jaterní lipázy, vstup do hladkého endoplazmatického retikula jater, stimulace 7-alfa-hydroxylázy, což vede ke zvýšení syntézy žlučových kyselin, zvýšení odvodu cholesterolu žlučí, snížení obsahu cholesterolu v játrech, zvýšení aktivity HMG-CoA reduktázy způsobem nezávislým na metabolismu LDL, tj . receptor LDL nebo VLDL by měl být inhibován zbytky chylomikronů, snížené rozvolňování endoteliálních buněk a tvorba hydrofilnějšleh membrán.

	18 -	• 0 • 0 0 0 0 0 • 0 0 • 0 0 0 *0 0 0	00 00 00 00 >0 0 0 0» 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 000000 0· 0 0 • 00 000 00 00
Následující neomezující příklady	jsou určeny	k tomu,
aby ukázaly různé aspekty	tohoto vynálezu. Zejména	studie
ukazuje, že zrychlený	rozvoj	aterosklerózy	apo-E
deficientních myší se	zpomalí	podáním prostředku
s fytosteroly a dochází	ke zlepšení při	rozvoj i
aterosklerotických lézí.	„FCP-3P1,,	je uveden	jako
upřednostňovaný prostředek v	rámci tohoto vynálezu.
Příklady provedení vynálezu
PŘÍKLAD 1
Zlepšení schopnosti učení a	paměti apo	-E deficientních myší
podáním FCP-3P1
Úvod

Apo-E deficientní myši jsou známé jako model aterosklerózy, xantomatózy a Alzheimerovy choroby (16-18). Apo-E deficientní myši byly použity jako užitečný systém ke zjištění důležitosti apolipoproteinu E při funkci mozku. Některé z těchto studií se zaměřily na schopnost učení a práce a na ověření paměti u apo-E deficientních myší (19,20). Hustota synapsí v hippokampu a regenerační kapacita po poškození hippokampu byly u těchto myší sníženy (21,22). Přihlašovatelé suplementací potravy směsí fytosterolů FCP3P1 účinně zpomalili/zabránili prvním dvěma výše uvedeným poruchám (11,23) . Záměrem této studie je vyhodnotit účinky suplementace potravy FCP-3P1 v množství 2 % hmot. po dobu 33 týdnů na schopnost učení a paměti apo-E deficientní myší.

Hypotéza • φ

φ »

Φ φ φφφ

Suplementace potravy FCP-3P1 zlepšuje schopnost učení a paměti u apo-E deficientních myší.

Materiály a metodika samců apo-E deficientních myší 2 týdny starých a 24 obdobných protikladů se divokého typu (dále standartní fenotyp, Wild-type) se spolu se svými matkami zakoupilo v Jacksonově laboratoři. Ve 4. týdnu věku se myši odstavily a rozdělily na 4 skupiny s vyrovnanou tělesnou hmotností a celkovými hladinami plazmatického cholesterolu. Skupiny se po dobu 33 týdnů krmily následující potravou:

Skupina 1	(n = 10): apo-E deficientní myši	krmeny normální
myší potravou	s obsahem 4,5 % hmot.	tuku obohacenou
2 % hmot.	FCP-3P1
Skupina 2	(n =	10): myši se standardním	fenotypem krmeny

normální myší potravou s obsahem 4,5 % hmot. tuku obohacenou 2 % hmot. FCP-3P1

Skupina 3 (n = 10) : apo-E deficientní myši krmeny normální myší potravou s obsahem 4,5 % hmot. tuku

Skupina 4 (n = 10) : myši se standardním fenotypem krmeny normální myší potravou s obsahem 4,5 % hmot. tuku

Zvířata se chovala prázdnou láhev s velkým odděleně (každá myš obdržela otvorem na hraní), denně se pozorovala jejich fyzická aktivita a chování a týdně se zaznamenávaly jejich tělesné hmotnosti. V týdnech studie 0,4,17 a 29 se odebrala krev z ocasních vén a enzymaticky se ·· · • · ♦ · · · ·· »* *9 ··* 999 99 99 stanovily hladiny plazmatického cholesterolu. 33 týdnů po započetí podávání experimentální potravy se testovalo chování myší způsobem Morrisova vodního labyrintu, jak bylo popsáno dříve. Postup se zaznamenal videokamerou a výsledky se analyzovaly počítačovými systémy. Na konci studie se myši usmrtily a jejich mozek se fixoval v 10% formaldehydu a použil k histochemickému hodnocení. Řezy mozkem fixované v parafínu se obarvily a) hematoxylinem a eosinem (H&E), jakožto standardní barvící metodou pro histologické hodnocení, b) červení Kongo k hodnocení tvorby plaků amyloidu c) barvivém Bielchowsky k hodnocení axonů a d) pravou modří Luxol k testování myelinu. Navíc se ještě ve spolupráci s universitou v Miami mozky obarvily a immunohistochemicky hodnotily na potenciální markéry neurodegenerativních chorob, zahrnující gliový fibrilární kyselinový protein (GFA), prekursorový amyloidový protein (APP), neurofilamenta (NF) a ubiquitin. Jedna myš ze skupiny 1 a jedna myš ze skupiny 3 byly v časné fázi experimentu milosrdně usmrceny díky úbytku hmotnosti a snížení příjmu potravy. Jedna myš ze skupiny 2 a jedna myš ze skupiny 4 byly ze studie odstraněny, aby se skupiny vyrovnaly s jinými experimentálními skupinami. Během experimentu byla jedna myš ze skupiny 1 usmrcena v 17. týdnu z důvodu kožních lézí a jedna myš ze skupiny 3 náhle zemřela ve 14. týdnu pravděpodobně na srdeční onemocnění. Během testu Morrisova vodního labyrintu projevila jedna kontrolní apo-E deficientní myš (#15 ze skupiny 3) epileptický záchvat dvakrát během prvního testovacího dne.

Výsledky

A.Tělesná hmotnost • · * · · • · * · 99 99 · 9 * 9 9 ·

9 9 9 9 9 • 9 9 999 999

9 9 ·

999 999 «9 99

Tělesná hmotnost myši se zaznamenávala týdně. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 1. Jak je zřejmé, u všech zvířat v průběhu experimentu vzrostla hmotnost. To ukazuje, že růst a vývoj byl mezi všemi 4 skupinami podobný. Přídavek FCP-3PI do myší potravy neměl žádné účinky na tělesnou hmotnost.

B. Hladiny plazmatického cholesterolu

Celkové hladiny plazmatického cholesterolu se určovaly v počátku a v průběhu experimentu. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 2. Přídavek FCP-3PI do myší potravy byl spojen se značným poklesem celkových hladin cholesterolu apo-E deficientních myší> což je v souladu s našimi předchozími poznatky. Na druhé straně, suplementace myší potravy FCP-3PI měla malý vliv na celkové hladiny plazmatického cholesterolu u myší s normálním fenotypem.

C. Testovací analýza Morrisova vodního labyrintu

Všechny čtyři skupiny myší podstoupily test chování použitím zavedeného způsobu Morrisova vodního labyrintu. Počítačová analýza údajů neukázala mezi skupinami myší významné rozdíly vzhledem ke schopnosti učení a paměti. Obrázky 1 až 4 shrnují výsledky získané z každé skupiny myší. Obrázek 1 ukazuje procenta doby, kterou každá skupina myší strávila v každém kvadrantu bazénu nalezením základny. Obrázek 2 ukazuje procenta doby, kterou každá skupina myší po vycvičení strávila v každém kvadrantu bazénu hledáním základny. To ukazuje prostorovou paměť myší. V tomto ohledu ukázaly myši se standartním fenotypem krmené FCP-3P1 tendenci k lepší paměti, než jiné skupiny zvířat. Jak je patrné z obrázu 2, myši se standartním fenotypem krmené FCP3P1 strávily více času hledáním základny v kvadrantu 1 ftft ftft ftft · • · · ··· ftftft • · • ft ftft ft ft · • ft * ftftft (místo, kde základna byla umístěna ve fázích výcviku). To je také zřejmé z obrázku 3 ukazujícím mírně zlepšené učení myší se standartním fenotypem krmených FCP-3PI při nalezení místa základny (kvadrant 3). Obrázek 4 neukazuje žádný rozdíl mezi skupinami myší, jestliže se přednostně testovaly v kvadrantu 3 (test zpětného zjišťování), což je dáno slabou pamětí mezi všemi čtyřmi skupinami myší.

D. Histochemie

Mozky všech skupin myší se histologicky testovaly. Obarvení hematoxylinem a eozinem ukázalo v mozcích všech skupin zvířat mírné degenerativní změny. Obarvení červení Kongo u žádné ze všech 4 skupin zvířat neprokázalo v žádném mozku tvorbu amyloidních plaků. Obdobně, obarvení barvivém Bielchovsky a pravou modří Luxol neukázalo vzhledem k charakteristickým rysům mozkového myelinu a axonů žádné významné rozdíly mezi všemi 4 skupinami myší. Imunochemické stanovení se provádějí nezávislým neuropatologem v St. Paul's Hospital. Výsledky budou předloženy co nejdříve po dokončení testů.

Diskuse

Tato studie ukázala, že přídavek 2 % hmot. FCP-3P1 významně snižuje celkové hladiny plazmatického cholesterolu u apo-E deficientních myší. Tato dávka FCP-3P1 nemá zjevné vedlejší účinky a všemi skupinami zvířat je dobře tolerována. Přídavek FCP-3P1 k potravě myší se standartním fenotypem byl ve srovnání s jinými skupinami spojen se zlepšením jejich schopnosti učení a paměti.

• · ·· ·· φφ ·· φφφφ • · · · · · φ · · ··· φφφ • φ φ φ • ΦΦ φφφ φφ ·· •4 ···»

Tabulka 1:Tělesná hmotnost myší na počátku a v průběhu experimentu (průměrná hodnota ± směrodatná odchylka, g)

Φ φ φ φ • φ * φ φ·

Sk.	Týden
	0	4	8	12	16	20	24	33
A	18,211,9	21,811,1	23,611,0	2510,8	25,311,8	2710,9	2711,1	28,811,8
B	18,212,4	22,312,2	24,212,2	25,412,1	25,213,3	27,111,4	2811,3	29,511,4
C	17,911,4	2311,3	24,711,3	2611,3	27,211,5	27,411,3	27,911,5	29,411,8
D	18,211,4	23,511,2	24,510,9	26,410,9	37,710,9	27,810,9	28,411,1	30,511,1

Tabulka 2:Hladiny celkového cholesterolu v plazmě na počátku a v průběhu experimentu (průměrná hodnota ± směrodatná odchylka, mmol/1)

Sk.	Týden
	0	4	17	29
A	12,612,2	11,512,6’	14,612,2’	15,112,8’
B	13,212,5	16,412,4	19,713,5	20,312,2
C	210, 2	1,610,2	1,510,2	1,610,2
D	210, 1	1,610,1	1,610,2	1,510,2

P<0,002 ve srovnání s kontrolní skupinou

Skupina

A apo-E deficientní myši ošetřené FCP

B kontrolní apo-E deficientní myši ošetřené FCP C myši se standardním fenotypem ošetřené FCP D kontrolní myši se standardním fenotypem ošetřené FCP

9

4 • ·

9 9 ·· 4

9 9 9

99

9

9

99 9

9

Literatura

1. Elshourbagy a kol., Apolipoprotein E mRNA is abundant in the brain and adrenals, as well as in the liver, and is present in other peripheral tissues in rats and marmosets. Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 82, 203 - 207 (1985).

2. Pitas a kol., Lipoproteins and their receptors in the CNS: Characterization of lipoproteins in CSF and idetification of apolipoproteins B,E (LDL) in brain. J. Biol. Chem., 262, 14352 - 14360 (1987).

3. Handelmann a kol., Effects of apolipoprotein E, Betavery low density lipoproteins and cholesterol on the extension of neurites by rabbit dorsal root ganglion neurons in vivo. J. Lipid Res., 33, 1677 - 1688 (1992).

4. Muller a kol., A specific 37 000-dalton protein that accumulates in regenerating but not in non-regenerating mammalian nerveš. Science, 228, 499 - 501 (1985).

5. Boyles a kol., A role for apolipoprotein-E, apolipoprotein A-l and low density lipoprotein receptors in cholesterol transport during regeneration and remyelinization of the rat sciatic nerve. J. Clin. Invest., 83, 1015 - 1031 (1989) .

6. Weisgraber a kol., Lipoproteins, neurobiology, and Alzheimer's disease: Structure . and function of apolipoprotein-E. Curr. Opin. Struct. Biol., 4, 507 515 (1994).

φφ φφ » φ φ φ > φ φ φ φφφ φφφ * · φ · « φ • · · φφφ • φ φ φ φ φ · φφ φφ φφ

7. Strittmatter a kol., Binding of human apolipoprotein-E to synthetic amyloid beta-peptide, isoform specific effects and implications for latě onset Alzheimer's disease. Proč. Nati. Acad. Sci. USA , 90, 8098 - 8102 (1993).

8. Strittmatter a kol., Isoform specific interactions of apolipoprotein-E with microtubule associated protein tau, implications for Alzheimer's disease. Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 91, 11183 - 11186 (1994a).

9. Strittmatter a kol., Hypothesis: microtubule instability and paired helical filament formation in the Alzheimer's disease brain are related to apolipoprotein-E genotype. Exp. Neurol·., 125, 163 - 171 (1994b).

10. Kalaria a kol., Society Neurosci, 23, 2215 (1997).

11. Moghadasian a kol., Arteriosclero. Throm. Vasc. Biol., 17, 119 - 126 (1996)

12. Rebeek a kol., Apolipoprotein E in sporadic Alzheimer's disease: allelic variation and receptor interactions. In: Neuron, 11(4), 575 - 580 (1993).

13. Beisiegel a kol., Lipoprotein lipase enhances the binding of chylomikrons to low density lipoprotein receptor related protein. Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 88, 8342 8346 (1991) .

14. Getlenburg a kol., The tissue matrix: cell dynamic and hormone actlon. In: Endocrine Rewiew, 11, 399 (1990).

• · · · t · • * · ·· ······ • · · · · · · · · fr · frfr · frfr frfr· ··· • frfr · · · · · _ 2θ _ »♦ ·· ·♦· ··· ·· ··

15. Mathews a kol., Brain Res., 718, 181 - 184 (1996).

16. Nakashime a kol., Arteriosclerol. Thromb., 14, 133 140 (1994).

17. vanRee a kol., Atherosklerosis, 112, 237 - 243 (1995).

18. Oitzl a kol., Brain Research, 752, 189 - 196 (1997).

19. Gordon a kol., Neuroscience Letters, 199, 1-4 (1995).

20. Gordon a kol., Mol. Chem. Neuropathol., 97 103 (1996).

21. Masliah a kol., Neurobiol. Aging, 158, 46 (1994).

22. Poirier, J. Trends Neuroscience, 17, 525 - 530 (1994).

23. Moghadasian a kol., Can. J. Cardiol., 13, 81B (1997) .

24. Morris R., Neurosci Methods, 11, 47 - 60 (1984).

Claims (10)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použití fytosterolového prostředku pro výrobu léčiva pro profylaxi nebo zpomalení rozvoje Alzheimerovy choroby u živočicha.
2. 2. Použití fytosterolového prostředku podle nároku 1, pro výrobu léčiva pro profylaxi nebo zpomalení rozvoje Alzheimerovy choroby u živočicha, kterým je člověk.
3. 3. Použití fytosterolového prostředku podle nároku 1, pro výrobu léčiva pro profylaxi nebo zpomalení rozvoje Alzheimerovy choroby, přičemž prostředek obsahuje betasitosterol, kampesterol a stigmastanol.
4. 4. Použití fytosterolového prostředku podle nároku 1, pro výrobu léčiva pro profylaxi nebo zpomalení rozvoje Alzheimerovy choroby, kde prostředek obsahuje betasitosterol, kampesterol a stigmastanol, a kde kampesterol a stigmastanol dohromady tvoří obsah odpovídající nejméně 50 % koncentrace beta-sitosterolu.
5. 5. Použití fytosterolového prostředku podle nároku 1, pro výrobu léčiva pro profylaxi nebo zpomalení rozvoje Alzheimerovy choroby, kde prostředek obsahuje betasitosterol, kampesterol a stigmastanol, přičemž prostředek obsahuje 10 až 25 % kampesterolu, 10 až 40 % stigmastanolu a » · * • · * • · · «

   • » • · • · • * • 9 ···♦ ·· ·« • 9 · · • · · · • · · ·« • · · ··

   45 až 75 % beta-sitosterolu.
6. 6. Použití fytosterolového prostředku podle nároku 1, pro výrobu léčiva pro profylaxi nebo zpomalení rozvoje Alzheimerovy choroby, kde prostředek obsahuje betasitosterol, kampesterol a stigmastanol a kampestanol.
7. 7. Terapeuticky účinný produkt k prevenci Alzheimerovy choroby, vyznačující se tím, že obsahuje betasitosterol, kampesterol a stigmastanol.
8. 8. Produkt podle nároku 7, vyznačující se tím, že v něm kampesterol a stigmastanol dohromady tvoří obsah odpovídající nejméně 50 % koncentrace betasitosterolu .
9. 9. Produkt podle nároku 7, vyznačující se tím, že obsahuje 10 až 25 % kampesterolu, 10 až 25 % stigmastanolu a 45 až 75 % beta-sitosterolu.
10. 10. Produkt podle nároku 7, vyznačující se tím, že obsahuje navíc kampestanol.