CZ9903186A3 - Způsob konstrukce transgenní drůbeže - Google Patents

Způsob konstrukce transgenní drůbeže Download PDF

Info

Publication number
CZ9903186A3
CZ9903186A3 CZ19993186A CZ318699A CZ9903186A3 CZ 9903186 A3 CZ9903186 A3 CZ 9903186A3 CZ 19993186 A CZ19993186 A CZ 19993186A CZ 318699 A CZ318699 A CZ 318699A CZ 9903186 A3 CZ9903186 A3 CZ 9903186A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
cock
acceptor
cells
testicles
donor
Prior art date
Application number
CZ19993186A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ289464B6 (cs
Inventor
Pavel Ing. Csc. Trefil
Original Assignee
Biopharm Výzkumný Ústav Biofarmacie A Veterinárních Léčiv, A.S.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biopharm Výzkumný Ústav Biofarmacie A Veterinárních Léčiv, A.S. filed Critical Biopharm Výzkumný Ústav Biofarmacie A Veterinárních Léčiv, A.S.
Priority to CZ19993186A priority Critical patent/CZ289464B6/cs
Priority to JP2001521147A priority patent/JP2003508068A/ja
Priority to PCT/CZ2000/000064 priority patent/WO2001017344A2/en
Priority to AU69784/00A priority patent/AU6978400A/en
Priority to EP00958098A priority patent/EP1211932B1/en
Priority to DE60041771T priority patent/DE60041771D1/de
Priority to AT00958098T priority patent/ATE424721T1/de
Publication of CZ9903186A3 publication Critical patent/CZ9903186A3/cs
Publication of CZ289464B6 publication Critical patent/CZ289464B6/cs

Links

Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A01AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01KANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A01AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01KANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00Genetically modified animals
    • A01K2217/05Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Conveying And Assembling Of Building Elements In Situ (AREA)

Description

Způsob konstrukce transgenní drůbeže Oblast techniky
Vynález se týká způsobu konstrukce transgenní drůbeže využitím prapohlavních spermatogoniálních buněk pro přenos genetické informace u drůbeže.
Dosavadní stav techniky
Biotechnologický výzkum v oblasti transgenní drůbeže není zdaleka tak úspěšný jako tomu je u savců. Hlavní příčinou tohoto stavuje unikátní rozmnožovací ústrojí ptáků.
Ptačí zygota na rozdíl od savců není přístupná a je spojena s mimořádně velkým žloutkovým vakem. Hmota žloutků brání identifikaci pronukleů, v procesu oplodnění dochází k polyspermii a není možné určit které prvojádro se účastní tvorby embrya. Proto například přímá mikroinjekce do prvojádra používaná u myší je u drůbeže téměř nemožná. Práce v uvedené oblasti se u drůbeže proto zaměřily na manipulace s ještě nediferenciovánými drůbežími buňkami, ať již se jedná o blastodermální buňky, primordiální gonocyty či prapohlavní, spermatogoniální buňky.
Využití prapohlavních, spermatogoniálních buněk při konstrukci transgenních jedinců jako první popsal u myší Brinster,L.R. Avarbock, M.R. (1994) Germline transmission ofdonor haplotype following spermatogonial transplantation. Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 91, 11303 -11307.
Jedná se v podstatě o novou oblast možné produkce zárodečných chimér a to částečnou nebo úplnou destrukcí pohlavních buněk ve varlatech jedince a jejich opětovnou rekolonizací pohlavními buňkami jiného jedince. U drůbeže tato metoda nebyla popsána.
Prvním krokem zvládnutí výše uvedené techniky je sterilizace varlat akceptora, neboť destrukce právě těchto prapohlavních spermatogoniálních buněk (progeňitorů spermií) není snadná a použití např. busulphanu není zcela odpovídající a dochází po jeho použití buď pouze k částečné sterilizaci donora Vick, L. Luke, G. Simkiss,K. (1993) Germline chimaeras canproduce both strains of fowl with high efficiency after partial sterilization. J.Reprod.Fertil., 98,637 - 641., nebo při použití vyšších dávek naopak k jeho celkové retardaci Smýkalová, Š. Kotrbová, A. Trefil, P. (1998) Effect of busulphan on growth and development ofthe chicken embryos, Vet.Med.-Czech,43,105 - 109., což v žádném případě není žádoucí.
·· · • ·
Druhým nezbytným krokem úspěšného využití popsaného postupu je nutné zvládnutí přenosu spermatogoniálních prapohlavních buněk akceptora , tedy těch spermatogoniálních buněk, které umožní po přenosu funkční zabudování a rekolonizaci varlat akceptora a následnou produkci oplození schopných spermií. To zatím přináší řadu potíží a nejednoznačných výsledků.
Podstata vynálezu :
Výše uvedené nedostatky odstraňuje způsob konstrukce transgenní drůbeže, zejména přenosem prapohlavních spermatogoniálních buněk podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se pouze varlata kohouta akceptora opakovaně ozáří gamrna paprsky, načež se do jeho neporušených sterilních varlat v intervalu 60 dní až dvou let od posledního ozáření implantují cizí prapohlavní spermatogoniální buňky kohouta donora, z nichž se dále produkují oplození schopné spermie s celou genetickou informací od kohouta donora. Po inseminaci slepic těmito nově vzniklými spermiemi se vylíhne transgenní drůbež s 1/2 genetické informace od donora.
Způsob podle vynálezu se dále provádí tak, že se varlata kohouta akceptora 3x až 9x ozáří gamrna paprsky o síle alespoň 8 Gy vždy v intervalu 3 až 9 dnů.
Výhodně se způsob podle vynálezu provádí tak, že se varlata kohouta akceptora 5x ozáří gamrna paprsky o síle 8 Gy, vždy v týdenním intervalu.
Při tomto ozáření dojde na rozdíl od jiných současných technik k úplnému zlikvidování původních prapohlavních spermatogoniálních buněk ve varlatech akceptora, který již pak nadále nemůže produkovat spermie, přičemž struktura varlat včetně Sertoliho buněk zůstane zachována pro následnou implantaci cizích prapohlavních spermatogoniálních buněk kohouta donora.. V těchto nově implantovaných prapohlavních spermatogoniálních buňkách jsou dále produkovány spermie, které jsou oplození schopné a nesou genetickou informaci prapohlavních spermatogoniálních buněk kohouta donora, viz schéma č. 1 v příloze.
Příprava transgenní drůbeže způsobem podle vynálezu je snadná a se stoprocentním výsledkem, protože spermatogoniální buňky kohouta donora mohou být transfekovány potřebnou žádanou genetickou informací a tak po jejich úspěšné implantaci do varlat kohouta akceptora dojde takto k tvorbě transgenního kohouta, který po inseminaci, či při přirozené plemenitbě bude z 1/2 předávat genetickou informaci na svoje potomstvo.
Pouze fakt, že uvedený způsob přenosu prapohlavních spermatogoniálních buněk z jednoho jedince do druhého je funkční, je nesmírně cenný a kromě této vlastní skutečnosti nesmírně zajímavý právě při tvorbě transgenní drůbeže. Prapohlavní, spermatogoniální buňky lze snadno před vlastní implantací do kohouta akceptora in vitro transfekovat cizorodou genetickou informací, která bude dál z 1/2 přenášena na potomstvo v F1 generaci. Takto pravděpodobně bude otevřena reálná cesta pro využití drůbeže (drůbežího vejcovodu) jako bioreaktoru pro produkci specifických např. pro farmaceutický průmysl cenných proteinů.
Původci vynálezu bylo provedeno velké množství pokusů na ověření způsobu podle vynálezu, z nichž některé byly vybrány do následující příkladové části, která je dále podložena přílohou grafů, stránkou obrázků.
Příklady provedení
Příklad 1
- úplná sterilizace kohouta akceptora
Dospělý kohout inbrední linie plemene Leghomka bílá (bílá barva peří způsobena dominantní alelou II v lokusu I) produkující ejakulát byl fixován v boxu tak, aby bylo možné zevně z boční strany těla provést ozáření přesně na plochu velikosti varlat pomocí gama paprsků. Jako vhodný se ukázal přístroj Theratron TI000 a isotop 0 Co. Varlata kohouta byla pomocí ozařovacího přístroje 5x za sebou v týdenním intervalu ozářena minimálně dávkou 8 Gy.
Aniž by se ozáření jakkoliv projevilo na zdravotním stavu a chovné kondici kohouta zhruba po 90 dnech po posledním ozáření ztratí kohout trvale schopnost produkce spermií a je připraven po uvedené době ke kolonizaci varlat prapohlavními spermatogoniálními buňkami kohouta donora, viz graf č. 1 a graf č. 2. a obrázek č. 1 v příloze.
- příprava a aplikace prapohlavních, spermatogoniálních buněk kohouta donora
Dospělému kohoutu inbrední linie plemene Minorka černá (černá barva peří způsobena recesivní alelou ii) produkujícím ejakulát byl pomocí biopsie odebrán vzorek tkáně z varlat obsahující jeho prapohlavní spermatogoniální buňky. Tyto buňky byly umístěny po dobu 4 hodin do média M 199 Sigma (obsahující 10 % hmotn.Fetal bovine sérum, 2 % hmotn. chicken sérum, 1 % hmotn. pyruvate sodium, 1 % hmotn. gentamycin) při poměru ředění 1 : 1 s uvedeným médiem. Inkubace buněk probíhala při standardních podmínkách: při 5 % hmotn. obsahu oxidu uličitého a při teplotě 40 °C. Poté byly prapohlavní spermatogoniální buňky v celkovém objemu suspenze 200 mikrolitrů aplikovány pomocí injekční sříkačky do každého ozářeného varlate kohouta akceptora, v době ozářený kohout ztratí po ozáření jakoukoliv produkci ejakulátu, tedy 85 až 100 dní od posledního ozáření.
9 « 9 • 9 · ·
9 9
9*
9
9* ♦« • 9 9 9 • 9 9 ·
9 999 ♦ · » ♦·
9 *
999 999 ·
« · 9 9
-funkční produkce ejakulátu po přenesení prapohlavních spermatogoniálních buněk kohouta donora
Ozářený kohout inbrední linie plemene Leghomka bílá - akceptor s neexistujícími funkčními varlaty po provedeném ozáření začal do 2 měsíců po provedené aplikaci cizích prapohlavních spermatogoniálních buněk kohouta inbrední linie plemene Minorka černá opět produkovat ejakulát s životaschopnými spermiemi.
- biologická testace přenesených prapohlavních spermatogoniálních buněk kohouta donora
Po provedené inseminace slepice inbrední linie plemena Leghomka žíhaná (šedivá žíhaná barva způsobená recesivní alelou ii genem žíhanosti vázaným na pohlaví B/-) ejakulátem odebraným od ozářeného kohouta inbrední linie plemene Leghomka bílá - akceptora cizích prapohlavních spermatogoniálních buněk kohouta inbrední linie plemene Minorka černá byla inseminovaná vejce dána do inkubátoru a po 21 dnech inkubace se vylíhla pouze černá kuřata.
Tato černá kuřata jsou jasným důkazem, že implantace a kolonizace prapohlavních, spermatogoniálních buňek kohouta donora byla úspěšná, protože vylíhnou-li se pouze černá nebo žíhaná kuřata, to ve své podstatě znamená nepřítomnost dominantní alely II, ale pouze přítomnost recesivní alely ii, tedy pouze přítomnost funkčních spermií kohouta s recesivním založením barvy peří ii, tedy v tomto případě s černou barvou peří, viz schéma č. 1 v příloze.
Příklad 2
-neúplná sterilizace kohouta akceptora
Dospělý kohout inbrední linie plemene Leghomka bílá (bílá barva peří způsobena dominantní alelou 11 v lokusu I) produkující ejakulát byl fixován po ozáření stejně jako v příkladu 1. Varlata kohouta byla pomocí ozařovacího přístroje ozářena jednorázovou dávkou 18 Gy. Kohout, aniž by se ozáření jakkoliv projevilo na jeho zdravotním stavu a chovné kondici, neztratil ani po 200 dnech sledování trvale schopnost produkce spermií (oproti kontrole, graf č.9 a č. 10), naopak po 150 dnech se koncentrace (viz.graf č.3) a motilita (graf č.4) vrátila do původních hodnot před ozářením a kohout nebyl připraven ke kolonizaci varlat prapohlavními, spermatogoniálními buňkami kohouta donora.
Příklad 3
-neúplná sterilizace kohouta akceptora
Dospělý kohout inbrední linie plemene Leghomka bílá (bílá barva peří způsobena dominantní alelou 11 v lokusu I) produkující ejakulát byl fixován při ozáření stejně jako vpříkladu 1. Varlata kohouta byla pomocí ozařovacího přístroje ozářena jednorázovou dávkou 22 Gy. Kohout, aniž by se ozáření jakkoliv projevilo na jeho zdravotním stavu a chovné kondici, neztratil ani po 200 dnech sledování trvale schopnost produkce spermií, naopak po 160 dnech se koncentrace (viz.graf č.5) a motilita (graf č.6) sice o něco nižší vrátila do původních hodnot před ozářením a kohout nebyl připraven ke kolonizaci varlat prapohlavními, spermatogoniálními buňkami kohouta donora.
Příklad 4
-neúplná sterilizace kohouta akceptora
Dospělý kohout inbrední linie plemene Leghomka bílá (bílá barva peří způsobena dominantní alelou II v lokusu I) produkující ejakulát byl fixován pro ozáření stejně jako v příkladu 1. Varlata kohouta byla pomocí ozařovacího přístroje ozářena jednorázovou dávkou 26 Gy. Tato dávka se projevila negativně na zdravotním stavu kohouta, místo ozáření bylo na kůži lehce zduřelé a načervenalé kohout jevil známky únavy ještě několik dnů po ozáření. Kohout ztratil téměř po 160 dnech schopnost produkce spermií, viz graf č.7, ale produkce ejakulátu v nepatrné míře pokračovala a spermie vykazovaly i určitou motilitu, viz graf. č. 8. Bylo možné konstatovat, že tato dávka byla poměrně vysoká, zatížila zdravotní stav kohouta, ale nebyla z pohledltještě pokračující produkce ejakulátu dostatečná a kohout nebyl připraven ke kolonizaci varlat prapohlavními spermatogoniálními buňkami kohouta donora. Průmyslová využitelnost
Opakovaným ozářením gamma paprsky varlat kohouta akceptora a implantací cizích prapohlavních spermatogoniálních buněk kohouta donora do neporušených sterilních varlat kohouta akceptora dojde u něj k opětovné produkci oplození schopných spermií s celou genetickou informací od kohouta donora. Po inseminaci slepic těmito produkovanými spermiemi vznikne transgenní drůbež s 1/2 genetické informace od donora. Uvedený postup bude využíván průmyslovým způsobem drůbežářskými šlechtitelskými a biotechnologickými společnostmi.

Claims (3)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Způsob konstrukce transgenní drůbeže, zejména přenosem prapohlavních spermatogoniálních buněk, vyznačující se tím, že se pouze varlata kohouta akceptora zevně opakovaně ozáří gama paprsky, načež se do jeho neporušených sterilních varlat v intervalu 60 dní až 2 let od posledního ozáření implantují cizí prapohlavní spermatogoniální buňky kohouta donora, z nichž se dále produkují oplození schopné spermie s celou genetickou informací od kohouta donora, z kterých po inseminaci slepic vznikne transgenní drůbež s 1/2 genetické informace od donora.
  2. 2. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že se varlata kohouta akceptora ozáří 3x až 9x gama paprsky o síle alespoň 8 Gy vždy v intervalu 3 až 9 dní.
  3. 3. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že se varlata kohouta akceptora ozáří 5x gama paprsky o síle 8 Gy vždy v týdenních intervalech.
    fotografie semenotvomých kanálků po opakovaném (5x8 Gy) ozáření varlat kohouta akceptora. V semenotvomých kanálkách jsou patrné pouze Sertoliho buňky, prapohlavní, spermatogoniální buňky nejsou patrné, (barveno Pas, x 400)
CZ19993186A 1999-09-08 1999-09-08 Způsob konstrukce transgenní drůbeľe CZ289464B6 (cs)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ19993186A CZ289464B6 (cs) 1999-09-08 1999-09-08 Způsob konstrukce transgenní drůbeľe
JP2001521147A JP2003508068A (ja) 1999-09-08 2000-09-08 トランスジェニック家禽を構築する方法
PCT/CZ2000/000064 WO2001017344A2 (en) 1999-09-08 2000-09-08 A method of transgenic fowl construction
AU69784/00A AU6978400A (en) 1999-09-08 2000-09-08 A method of transgenic fowl construction
EP00958098A EP1211932B1 (en) 1999-09-08 2000-09-08 A method of transferring spermatogonial germline cells in cocks
DE60041771T DE60041771D1 (de) 1999-09-08 2000-09-08 Verfahren zum transferieren von spermatonialen keimzellen bei hähnen
AT00958098T ATE424721T1 (de) 1999-09-08 2000-09-08 Verfahren zum transferieren von spermatonialen keimzellen bei hähnen

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ19993186A CZ289464B6 (cs) 1999-09-08 1999-09-08 Způsob konstrukce transgenní drůbeľe

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ9903186A3 true CZ9903186A3 (cs) 2001-04-11
CZ289464B6 CZ289464B6 (cs) 2002-01-16

Family

ID=5466297

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ19993186A CZ289464B6 (cs) 1999-09-08 1999-09-08 Způsob konstrukce transgenní drůbeľe

Country Status (7)

Country Link
EP (1) EP1211932B1 (cs)
JP (1) JP2003508068A (cs)
AT (1) ATE424721T1 (cs)
AU (1) AU6978400A (cs)
CZ (1) CZ289464B6 (cs)
DE (1) DE60041771D1 (cs)
WO (1) WO2001017344A2 (cs)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7527966B2 (en) 2002-06-26 2009-05-05 Transgenrx, Inc. Gene regulation in transgenic animals using a transposon-based vector
KR100569168B1 (ko) * 2003-08-08 2006-04-07 (주)아비코아생명공학연구소 조류 정원줄기세포의 배양방법 및 이에 의해 수득한 조류정원줄기세포
KR100569163B1 (ko) * 2003-08-11 2006-04-07 (주)아비코아생명공학연구소 정원세포를 이용한 조류 카이메라의 생산방법 및 조류 카이메라
WO2010036978A2 (en) 2008-09-25 2010-04-01 Transgenrx, Inc. Novel vectors for production of growth hormone
WO2010036976A2 (en) 2008-09-25 2010-04-01 Transgenrx, Inc. Novel vectors for production of antibodies
WO2010118360A1 (en) 2009-04-09 2010-10-14 The Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Production of proteins using transposon-based vectors
CZ2016348A3 (cs) * 2016-06-10 2018-01-10 Biopharm, Výzkumný Ústav Biofarmacie A Veterinárních Léčiv, A.S. Způsob produkce spermií a transgenních ptáků
CN115589993A (zh) * 2022-12-15 2023-01-13 内蒙古大学(Cn) 通过x射线照射和原始生殖细胞移植使鸡精子再生的方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP1211932B1 (en) 2009-03-11
AU6978400A (en) 2001-04-10
CZ289464B6 (cs) 2002-01-16
WO2001017344A2 (en) 2001-03-15
JP2003508068A (ja) 2003-03-04
ATE424721T1 (de) 2009-03-15
EP1211932A2 (en) 2002-06-12
WO2001017344A3 (en) 2002-01-10
DE60041771D1 (de) 2009-04-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Tajima et al. Production of germ line chimera by transfer of primordial germ cells in the domestic chicken (Gallusdomesticus)
Omoto et al. Sex ratios of triploids and gynogenetic diploids induced in the hybrid sturgeon, the bester (Huso huso female× Acipenser ruthenus male)
CA2402977C (en) Methods for gamete production in birds
Liptoi et al. Preliminary results of the application of gonadal tissue transfer in various chicken breeds in the poultry gene conservation
Amen et al. Effect of dietary supplementation with different level of zinc on sperm egg penetration and fertility traits of broiler breeder chicken
Song et al. Offspring produced from orthotopic transplantation of chicken ovaries
CZ289464B6 (cs) Způsob konstrukce transgenní drůbeľe
Yahav et al. Chick embryogenesis: a unique platform to study the effects of environmental factors on embryo development
Nakamura Avian biotechnology
Pandey et al. Genetic transformation in chicken by the use of irradiated male gametes
Bozkurt et al. Biotechnologies in Terrestrial and Aquatic Animals
CN116210647B (zh) 一种使用原始生殖细胞干细胞系扩繁白羽肉鸡的方法
Dzoma et al. A retrospective study of egg production, fertility and hatchability of farmed ostriches in Botswana
JPH07501705A (ja) 外来細胞による精巣精細管の再集団化,対応する結果としての生殖細胞並びに対応する結果としての動物および子孫
Liu et al. Chimeric plumage coloration produced by ovarian transplantation in chickens
Yosef et al. Engineering mice for female-biased progeny without impacting genetic integrity and litter size
Cassar et al. Observations on ploidy of cells and on reproductive performance in parthenogenetic turkeys
Furuta et al. Restoration of genetic resources from Ehime native chicken via transferred primordial germ cells (PGCs)
CZ307102B6 (cs) Způsob produkce spermií a transgenních ptáků
Rikimaru et al. Production of pure hinai-dori with normal reproductive capability from transferred primordial germ cells
KR101074448B1 (ko) 효율적인 이종간 조류의 생식선 카이메라 및 형질전환체의 제조방법
Ballantyne et al. Single generation allele introgression into pure chicken breeds using Sire Dam Surrogate (SDS) mating
YAMAMOTO et al. Genetic transformation of egg shell color in chicken by the use of irradiated sperm
Doroshenko et al. Productivity of germinative duck chimaeras and their descendants
RU2263318C2 (ru) Способ сравнительной оценки силы реакции гистонесовместимости у птиц

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MK4A Patent expired

Effective date: 20190908