CZ9904607A3

CZ9904607A3 - Způsoby a kompozice pro identifikaci prasat geneticky resistentních na onemocnění způsobená F18 E. coli

Info

Publication number: CZ9904607A3
Application number: CZ19994607A
Authority: CZ
Inventors: Brad T. Bosworth; Peter Vogeli
Original assignee: Biotechnology Research And Development Corporation; U. S. Department Of Agriculture; Swiss Federal Institute Of Technology Zurich
Priority date: 1997-05-20
Filing date: 1998-05-20
Publication date: 2000-10-11
Also published as: JP3637420B2; PL364701A1; NO996373L; JP3941956B2; US6965022B2; HUP0103587A1; WO1998053102A1; AU7583298A; JP2005058240A; CA2290768A1; HUP0103587A3; DK1310570T3; CN1314953A; US7193072B2; PT985052E; US20020133836A1; NZ501886A; DE69816987T2; US20020129395A1; DE985052T1

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká prostředků a neinvazivních způsobů pro identifikaci prasat geneticky resistentních na onemocněni E. coli, konkrétně resistentních na střevní onemocnění způsobená kmenem E. coli vybaveným fimbriemi F18. Byly identifikovány, polymorfismy v genu pro prasečí α(1,2)fukosyltransferasu (FUT1), které odlišují resistentní prasata od prasat citlivých na onemocnění a které poskytují diagnostický test užitečný pro chovatele prasat.

Dosavadní stav techniky

Hlavním problémem chovu prasat jsou onemocnění prasat. Významným problémem jsou střevní onemocnění prasat po odstavení. Ometený počet serotypů toxigenních kmenů Escherichia (E.) coli je příčinou edematosního onemocnění a průjmu po odstavení u prasat, kde tato onemocnění způsobují značné ekonomické ztráty prasečích farem v celém světě, zejména mezi selaty stáří 4 až 12 týdnů. Typickými klinickými příznaky edematosního onemocnění jsou neurologické příznaky jako je ataxie, křeče a paralýza. Při pitvě je edem obvykle přítomen na charakteristických místech, jako jsou oční víčka a čelo, stěna žaludku a mesokolon. Onemocnění je způsobeno variantou Shiga-like toxinu II a enterotoxiny LT, STa, STb, v příslušném pořadí, které jsou produkovány E. coli, která kolonizuje povrch tenkého střeva bez toho, |e by způsobovala morfologické změny enterocytů (střevních buněk). Některé typy bakteriálních kmenů E. coli, F18, F4 a K88, jsou hlavními příčinami takových onemocnění. Edematosní choroba prasat je enterotoxemie charakterizovaná generalizováným poškozením cév. Toto poškození cév je způsobeno toxinem, variantou Shiga-like toxinu II, který je produkován některými kmeny E. coli (Bertschinger et al., 1993). E. coli se dělí podle typů řasinek, skupiny adhesivních fimbrií, a fimbrie kmenů související s tímto onemocněním jsou označeny například K88 nebo F18 (Vogeli et al., 1997) .

Ne všechna prasata podléhají infekcím E. coli. Kolonizace závisí na adherenci bakterií na enterocyty, která je zprostředkována bakteriálními fimbriemi označenými například F18 nebo K88. Bylo prokázáno, že citlivost k adhesi, t.j. exprese receptorů u prasete vhodných pro vazbu fimbrií, je geneticky kontrolována hostitelem a je děděna jako dominantní rys, kdy v případě F18 je B alela způsobující citlivost na adhesi a b j-e alela způsobující resistenci (Vogeli et al., 1996; Meijerink et al., 1996). Genetický lokus pro tento receptor pro F18 E. coli (ECF18R) byl mapován na prasečí chromosom 6 (SSC6), na základě jeho těšné genetické vazby na S lokus a na další lokusy halothanové (HAL) vazebné skupiny na chromosomu 6. Receptor pro K88 E. coli je na chromosomu 13.

Zdá se, že mechanismus resistence spočívá v tom, že střevo resistentních zvířat není kolonizováno E. coli, t.j. bakterie neadhferují na stěnu střeva resistentních prasat. Bylo prokázáno, že glykoproteinové receptory kartáčového lemu střeva jsou odpovědné za rozdíly mezi adhesivními a neadhesivními fenotypy pro určité E. coli a proto že genotyp prasat určuje resistenci. Také byly studovány bakterie nesoucí fimbrie (WO 9413811) .

Současné způsoby pro identifikaci prasat, která jsou resistentní na onemocnění způsobená F18 E. coli jsou: (1) odběr vzorků střeva od prasat při porážce a provedení mikroskopického * · testu adhese; (2) infekce zvířat virulentní E. coli (kolonizační test); nebo (3) provedení typizace A-O(S) systému krevních skupin. První dvě metody nejsou praktické pro identifikaci chovných resistentních zvířat. Ačkoliv stanovení krevní skupiny identifikuje resistentní zvířata, není možno tímto testem určit, zda jsou zvířata citlivá na onemocnění homozygotní nebo heterozygotní pro citlivost. Znalost genotypu zvířat s ohledem na tyto alely (stav genu) je zásadní pro vývoj úspěšného chovného programu. Účelem tohoto chovného programu je produkce prasat, která jsou resistentní na onemocnění způsobená F18 E coli, která decimuje chov po odstavení.

V jedné publikaci autoři uvádějí, s ohledem na edematosní onemocnění prasat, že probíhá výzkum vhodných genetických markérů... (Bertschinger et al., 1993, str. 87) a citují Walterse a Sellwooda, 1982:

Křížení resistentních prasat je atraktivní metodou pro prevenci onemocnění, pro která neexistuje účinná profylaxe. Proveditelnost tohoto přístupu závisí na prevalenci genu kódujícího resistenci v populaci prasat, lepších metodách pro detekci resistentních prasat a na absenci negativních genetických rysů selektovaných současně s touto resistenci.

Genetický markerový lokus je kódující nebo nekódující lokus, který je v blízkosti vybraného lokusu, ale nemusí to nutně být lokus sám. Detekovatelné fenotypy zahrnují kontinuální nebo diskontinuální rysy, například polymorfismus délky restrikčních fragmentů, produkci, bakteriální adhesi, kolorimetrické a enzymatické reakce a resistenci na antibiotika. S lokus kontroluje expresi antigenů A a 0 krevních skupin. Prasata homozygotně recesivní v S lokusu neexprimují A ani 0 antigeny krevních skupin. Podobná situace existuje u lidí a je způsobena • · • · · · • · • · mutacemi genu pro a(1,2)fukosyltransferasu, která kóduje lidskou krevní skupinu H (Kelly et al., 1994; viz také WO 9628967) . Nedávno byl sekvencován gen pro prasečí α(1,2)fukosyltransferasu (Cohney et al., 1996) . Tento gen je s velkou pravděpodobností přítomen v S lokusu u prasat.

Krevní skupiny H a Se byly mapovány geneticky a fyzikálně na lidský chromosom 19ql3.3. Tento region je evolučně konzervován a obsahuje geny homologní k HAL skupině genů u prasat. Gen kódující krevní skupinu H se také nazývá FUT1, zatímco Se gen se také nazývá FUT2 gen. FUT1 určuje expresi H antigenu v erytroidní buněčné linii, zatímco FUT2 reguluje expresi H antigenu v sekrečním epitelu a slinách. Konzervace FUTl genu byla prokázána u nižších savců, jako jsou krysy a králíci a exprese mRNA byla prokázána v králičí mozkové tkáni a krysím tlustém střevu. U všech těchto druhů byly popsány dva druhy genů pro a(l,2)fukosyltransferasu, které jsou strukturálně velmi podobné lidským FUTl a FUT2 genům, ale zejména u genů homologních s FUTl byla prokázán velmi specifický charakter exprese. U lidí je FUTl gen odpovědný za syntézu H antigenů v prekursorech erytrocytů. Nicméně, u prasat se erytrocyty pasivně adsorbují na H-podobné antigeny ze séra, podobně jako tomu je u lidských Lewis antigenů. U prasat všechny H antigeny souvisejí s exokrině sekreční tkání a exprese FUT2 (sekrečního) genu je pozorována v sekrečních tkáních jiných živočišných druhů. Proto může být exprese determinant A-0 krevních skupin prasat, které zkříženě reagují s protilátkami proti lidským krevním skupinám H a A, ovlivněna FUT2 genem.

Další informace o krevních skupinách a onemocnění prasat způsobených E. coli zahrnují to, že uhlovodanová struktura antigenů krevních skupin zprostředkuje adhesi některých patogenních mikroorganismů na tkáně hostitele, například Helicobacter pylori adheruje na antigeny Lewis® krevní skupiny a • · ► I • · ·· ·· • · · · • · · · • · · · · • · · · «· e·

E. coli způsobující infekce močových cest adheruje na substance krevní skupiny P. Geny kódující glykosyltransferasy, které jsou odpovědné za tvorbu specifických uhlovodanových struktur krevních skupin, proto představují kandidáty pro kontrolu bakteriální kolonizace hostitelem. Lokalizace těchto genů je ve stejném chromosomálním regionu jako lokus odpovědný za adhesi/non-adhesi F18 pozitivních E. coli v tenkém střevu prasat. Prasata neexprimují antigeny krevních skupin A a 0 do odstavení, což je stejná doba, kdy se stanou citlivými na onemocnění způsobená F18 E. coli.

Existuje potřeba nových diagnostických testů a terapie pro onemocnění prasat způsobená E. coli. Pro některá onemocnění prasat byla navržena detekce genetických mutací jako diagnostický test (maligní hypotermie) (Fujii et al., 1991; U.S. patent č. 5358649), ale pro diagnostiku nebyly popsány polymorfní markéry. Byly popsány vakciny pro vývoj resistence na kolonizaci E. coli (U.S. patent č. 5552144; WO 8604604), ale není pravděpodobné, že by byly výhodným způsobem pro prevenci onemocnění způsobených E. coli, vzhledem k obtížnosti podávání orální živé vakciny novorozeným selatům a z důvodu regulačních omezení. Existují účinná antibiotika pro léčbu, ale nejsou úspěšnou profylaxí.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález obsahuje prostředky a neinvazivní způsoby pro detekci a eliminaci prasat, která jsou citlivá na onemocnění způsobená E. coli. Neinvazivní způsob pro identifikaci prasat resistentních na střevní kolonizaci E. coli F18 obsahuje následující kroky: určení toho,zda je v biologickém vzorku od prasete přítomen genetický polymorfismus spojený s resistencí na kolonizaci; a vyvození toho, že prase je resistentní, pokud je prase homozygotní pro polymorfismus. (Polymorfismus je změna v • ·

I »19 nukleotidové sekvenci způsobená mutací, která existuje v populaci).

Přesněji, způsob je určení toho, zda je v biologickém vzorku získaném od prasete v genu pro a(1,2)fukosyltransferasu baze v pozici 307 adenin nebo guanin; a identifikace prasete jako resistentního, pokud je baží v pozici 307 adenin.

Pro stanovení toho, zda je v biologickém vzorku přítomen polymorfismus, je analyzována délka restrikčních fragmentů na gelu, který je separuje podle jejich molekulové hmotnosti. Restrikční enzymy jsou endonukleasy, které reprodukovatelně štěpí molekuly nukleové kyseliny ve specifických místech, což vede ke vzniku fragmentů nukleové kyseliny rozdílných molekulových hmotností, podle lokalizace míst štěpení.

Vynález se také týká křížení prasat tak, aby byly resistentní na onemocnění způsobená E. coli, za použití selekce takových prasat pro chov, která mají genetický polymorfismus v genu pro α(1,2)fukosyltransferasu 1, který určuje, že jsou resistentní na onemocnění způsobená E. coli, a potom křížením takových prasat.

Jedním aspektem vynálezu je molekula DNA, která je polymorfní pro gen pro α(l,2)fukosyltransferasu 1 u prasat, která má sekvenci uvedenou na obr. 1. Dalšími aspekty vynálezu jsou molekuly se sekvencí nukleotidů komplementární k sekvenci podle obr. 1.

Jiným aspektem vynálezu je izolovaná molekula DNA se substitucí adeninu za guanin v pozici 307. Tato molekula může také obsahovat substituci adeninu za guanin v pozici 857. Jiné izolováné molekuly DNA podle předkládaného vynálezu jsou ty molekuly, které obsahují mutaci v nukleotidu 229 sekvence podle • · · · » · • ·· · ···· obr. 1, kde je kodon CTT změněn na TTT, takže místo aminokyseliny leucinu kóduje fenylalanin. Mutace v nukleotidu 714 je z GAT na

GAC, ale při této změně nedochází ke změně kódované aminokys e1iny.

Polypeptidy kódované DNA molekulami podle předkládaného vynálezu a mající a(1,2)fukosyltransferasovou aktivitu jsou také aspektem předkládaného vynálezu.

Molekulární test pro detekci receptorů pro F18 E. coli u prasat spočívá v: (a) izolaci DNA z jaderných buněk prasete; (b) amplifikaci DNA v polymerasové řetězové reakci (PCR) za použití oligonukleotidových primerů, které jsou komplementární k DNA sekvenci genu pro prasečí a(1,2)fúkosyltransferasu; (c) provedení trávení restrikčními enzymy za použití alespoň jednoho restrikčního enzymu, například Cfol; (d) separaci výsledných fragmentů gelovou elektroforesou; a (e) určení příslušného počtu a délky fragmentů na gelu; a (f) stanovení toho, které receptory jsou přítomné na prasečích buňkách, podle počtu a délky fragmentů F18. Použití zde popsaných větších amplifikovaných fragmentů pro analýzu polymorfismu délky restrikčních fragmentů (RFLP) - oproti použití menších fragmentů - je méně nákladné, protože DNA proužky mohou být analyzovány na agarosových gelech v relativně menších koncentracích. Také je pro produkci některých fragmentů potřebný pouze jeden restrikční enzym pro konstantní restrikční místo sousedící s variabilním diagnostickým místem.

Dalším předmětem vynálezu je kit pro detekci polymorfismu spojeného s F18 receptory E. coli obsahující oligonúkleotidy v oddělených kontainerech, které jsou komplementární k ĎNa sekvenci genu pro prasečí a(l,2)fukosyltransferasu 1 a které odlišují resistentní prasata od citlivých prasat. Test může být proveden na prasatech jakéhokoliv věku.

Polymorfismy jsou také užitečné pro vývoj léků pro léčbu prasat trpících onemocněním způsobeným E. coli. Mutovaná forma prasečí a(1,2)fukosyltransferasy může interferovat s normálním enzymem, což může bránit produkci střevního receptorů pro F18.

Popis obrázků na připojených výkresech

Obr. 1 ukazuje nukleotidovou sekvenci (FUT1) (níže) a předpokládanou aminokyselinovou sekvenci (výše) polymorfismu prasečí a(1,2)fukosyltransferasy podle předkládaného vynálezu, za použití jednopísmenného kódu aminokyselin. Nepřerušovaná dvojitá čára po aminokyselinovými sekvencemi (=) označuje domnělý transmembránový region; tečkovaná linie pod aminokyselinovou sekvencí označuje potenciální N-vázaná glykosylační místa (...).

označuje substituci adeninu (A) za guanin (G) u resistentních prasat.

* označuje terminační kodon.

Zkratky pro aminokyselinové zbytky jsou následující: A, Ala;

C, Cys; D, Asp; E, Glu; F, Phe; G, Gly; H, His; I, Ile; K, Lys;

L, Leu; M, Met; N, Asn; P, Pro; Q, Gin; R, Arg; S, Ser; T, Thr;

V, Val; W, Trp; a Y, Tyr.

Molekulární analýza DNA polymorfismů spojených s resistencí prasat na onemocnění způsobené E. coli usnadňuje diagnostické testy pro selekci resistentních prasat pro křížení. Resistentní prasata se liší od sensitivních prasat v E. coli F18 receptorovém lokusu, jak bylo zjištěno markéry polymorfismu podle předkládaného vynálezu.

Předkládaný vynález poskytuje neivazivní metody a prostředky pro vysoce sensitivní a specifické odlišení prasat geneticky *

··«· ·» ·» * · * · »· sensitivních na onemocnění spojená s infekcí F18 E. coli a prasat resistentních na tyto infekce. Bylo zjištěno, že DNA polymorfismus v prasečím genu pro a(l,2)fukosyltransferasu (FUT1) odlišuje resistentní prasata od sensitivních prasat.

Polymorfismus vzniká mutací (změnou) nukleotidové sekvence, která vede ke vzniku nové alely. Alela je stav genu. V populaci může existovat mnoho alel genu lišících se substitucemi dusíkatých baží, která pravděpodobně vznikly v důsledku mutací původní DNA molekuly. Současná existence více než jedné alely (které jsou též někdy označovány jako varianty) v populaci se nazývá genetický polymorfismus. Lokus, ve kterém může existovat více než jedna alela jako stabilní složka populace, je polymorfní lokus. Obvykle má jeden polymorfní lokus v populaci nízkou frekvenci.

Jak je určeno z biologického vzorku, výhodně z krve, mají resistentní prasata v genomech polymorfismus, ve kterém je baží v pozici 307 (obr. 1) nukleotidové sekvence adenin, zatímco baží ve stejné pozici u homozygotních sensitivních prasat je guanin. Heterozygotní prasata budou mít oba typy DNA a budou sensitivní. Polymorfismus je variací sekvence prasečího genu (Cohney et al., 1996).

Na prasečích rodinách byla provedena analýza genetické vazby a byly stanoveny genetické asociace mezi polymorfismem ve FUT1 a resistencí na onemocnění u křížených prasat. Podle předkládaného vynálezu byl zjištěn polymorfismus v genu pro a(l,2)fukosyltransferasu 1. Polymorfismus, který má substituci jedné nukleotidové baze v pozici 307, byl použit pro stanování těsné vazby mezi genem pro fukosylttansferasu a S-systémem,

ECF18R lokusem a jinými lokusy HAL skupiny.

Detekce těsné vazby mutace ve FUT1 a ECF18R umožnila vývoj molekulárního testu pro identifikaci prasat resistentních na « · · · 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 adhesi E. coli F18, heterozygotů (nosičů) a prasat citlivých na tuto adhesi. Tento diagnostický test identifikuje, s vysokou sensitivitou a specificitou, prasata, která jsou citlivá na edematosní onemocnění a průjmová onemocnění po odstavení. Incidence polymorfismu podle předkládaného vynálezu se liší v chovech prasat. Vogeli et al. (1997) uvádí frekvence M307 alely u 5 prasečích chovů, které nebyly navzájem příbuzné. Dostupnost diagnostického testu pro polymorfismus podle předkládaného vynálezu dává chovatelům možnost účinně eliminovat alelu citlivou na ECF18R z chovů prasat, což umožní eliminaci predispozice pro E. coli F18 bakteriální adhesi způsobující edematosní onemocnění a průjem po odstavení prasat.

Předkládaný vynález dále obsahuje nukleotidové sekvence, které jsou variantami sekvence genu pro a(1,2)fukosyltransferasu 1 představující různé polymorfismy v bázi 307 a diagnostické molekulární kity pro identifikaci polymorfismů v genu pro a(1,2)fukosyltransferasu.

Pro získání kandidátových genů pro lokus receptorů pro F18 E. coli (ECF18R) bylo izolováno 5 kosmidů a jeden genomový klon obsahující geny pro a(1,2)fukosyltransferasy, FUT14 a FUT2 (Meijerink et al?, 1997), z prasečí genomové knihovny. Mapování fluorescence in šitu hybridizace umístilo tyto klony v proužku qll prasečího chromosomu 6 (SSC6qll) . Analýza sekvence kosrnidů vedla k charakterizaci (a) otevřeného čtecího rámce (ORF), délky 1098 párů baží, který je z 82,3% identický k.lidské FUT1 sekvenci, a (b) druhého ORF, délky 1023 párů baží, který je z 85% identický k lidské FUT2 sekvenci. FUT1 a FUT2 lokusy se proto zdají být prasečími ekvivalenty lokusů lidské krevní skupiny H a Secretor lokusu. Přímé sekvencování dvou ORF u prasat citlivých nebo resistentních na adhesi a kolonizaci F18 E. coli (ECF18R) odhalilo dva polymopfismy v páru baží 307 (M307) a páru baží 857 (M857) FUT1 ORF. Nukleotidové pozice jsou počítány od ATG (kódujícího methionin). Analýza těchto mutací u 34 párů Landrace rodin s 221 potomky ukázala těsnou vazbu mezi lokusem kontrolujícím resistenti a sensitivitu na E. coli F18 adhesi a kolonizaci v tenkém střevu (ECF18R) a lokusem inhibitoru krevních skupin S. Proto je M307 mutace dobrým markérem pro selekci zvířat resistentních na E. coli F18 založenou na markéru. Bylo zjištěno, že jiná mutace v nukleotidové pozici 229 vede k polymorfismu, ve kterém je kodon kódující leucin (CTT) změněn na TTT (kódující fenylalanin). Mutace v pozici 714 (GAT -> GAC) (kódující kyselinu asparagovou) nevyvolá aminokyselinovou substituci. Žádný polymorfismus, který by odlišil sensitivní od resistentních prasat, nebyl identifikován ve FUT2.

Příklady, pr.<2ysdsaí.._yysiál,azu

Následující příklady ilustrují provedení vynálezu.

Příklad 1: Test na resistentní prasata

Polymorfismus podle předkládaného vynálezu může být snadno identifikován za použití PCR-RFLP testu. V jednom provedení test využívá 160 bp fragment prasečí a(l,2)fukosyltransferasy 1 amplifikovaný pomocí PCR za použití následujících primerů:

' - CCAACGCCTCCGATTCCTGT- 3 ’ a 5 ' -GTGCATGGCAGGCTGGATGA- 3 . Výhodnými podmínkami PCR pro toto provedení je 25 cyklů při následujících dobách a teplotách: 94 °C, 30 s; 60 °C, 45 s; 72 °C, 90 s. Amplifikovaná DNA od resistentních prasat byla trávena restrikčním enzymem Hgal, ale nebyla trávena restrikčním enzymem HinPI. Amplifikovaná DNA od homozygotních sensitivních prasat byla trávena restrikčním enzymem HinPI. Amplifikovaná DNA od heterozygotních sensitivních prasat byla částečně trávena oběma enzymy.

• ·

V alternativním přístupu byla DNA izolována z prasečích jaderných buněk za použití standardních postupů. Přímé sekvencování prasečích FUT1 a FUT2 sekvencí a jejich sousedních regionů u zvířat různých ECF18R genotypů (BB, bb) vedlo k identifikaci dvou G --> A změn v pozicích 307 a 857 (označených M307 a M857, v příslušném pořadí) FUT1 ORF. M307 substituce eliminuje restrikční místo pro Cfol. Amplifikace DNA izolované z prasečích jaderných buněk byla provedena pomocí standardních postupů s primery P6 a Pil (3 minuty při 95 °C, 30 cyklů o 30 s při 95 °C, 30 s při 56 °C a 30 sec při 72 °C, po kterých následovala 7 minutová konečná extense při 72 °C), a po ní následovalo trávení Cfol a separace na 3% agarosovém gelu, která vedla k polymorfismu délky restrikčních fragmentů (RFLP). Homozygotní Μ307^ΛΑ zvířata měla 2 proužky. Homozygotní M307°° zvířata měla 93-, 241- a 87 bp fragmenty. Heterozygotní zvířata měla všechny čtyři fragmenty.

Příklad 2: Sensitivita a specificita testu využívajícího a(l,2)fukosyltransferasu v detekci prasat resistentních na F18

E.coli

Byla provedena studie pro stanovení asociace mezi resistencí na onemocnění a polymorfismem v pozici 307 FUT1 genu. 183 odstavených prasat (věku 2-6 měsíců) bylo získáno ze šesti různých chovů. Pouze o jednom chovu bylo před zahájením studie známo, že obsahuje resistentních zvířata a o těchto zvířatech bylo známo, že mají vysokou incidenci prasečího stresového syndromu. U dalších 5 chovů nebyly známky prasečího stresového syndromu a incidence resistentence na onemocnění nebyla známá. Prasata z každého chovu byla náhodně vybrána, humáně usmrcena a byly odebrány sleziny a vzorky tenkého střeva. Ze sleziny byla extrahována DNA a byla použita v PCR-RFLP testu popsaném v příkladu 1. Střevní buňky byly přečištěny seškrábnutím i / > .

- ·. ):, ,!>Á bs

- T slizničního povrchu střeva, lýzou buněk v hypotonickém EDTA roztoku a promytím centrifugací. Přečištěné buňky kartáčového lemu střeva byly inkubovány s F18 E. coli. Tato směs byla vyšetřována mikroskopií s fázovým kontrastem. Tento test určil, zda jsou prasata sensitivní (vzorky střeva obsahovaly adherované bakterie) nebo resistentní (vzorky střeva neobsahovaly adherované bakterie). PCR-RFLP test na polymorfismus koreloval s testem vazby bakterií na buňky střeva u 53 z 53 resistentních prasat a u 128 ze 130 sensitivních prasat. Dvě prasata, která byla pomocí testu vazby bakterie na střevní buňky určena jako sensitivní byla chybně určena jako resistentní při použití PCR-RFLP testu. Dva ze šesti vyšetřovaných chovů obsahovaly resistentní prasata, zatímco pouze jeden chov měl prasečí stresový syndrom, což dokazuje, že PCR-RFLP test může identifikovat prasata resistentní na onemocnění u zvířat, která nemají prasečí stresový syndrom.

Příklad 3: Lokalizace FUT1 na chromosomu 6 (SSC6)

Kosmidy ETHsl, -s2, -s3, -s4 a -s6 byly identifikovány po skríningu kosmidové knihovny FUT1 nukleotidovou sondou získanou z prasečí genomové DNA s primery P7 a P10 a byly mapovány pomocí FISH a DISC-PCR do proužku qll chromosomu 6.

Příklad 4: Identifikace ORF prasečí FUT1

Hybridizace kosmidů trávených KspI, EcoRI a KspI/EcoRI s radioaktivně značenými FUT1 fragmenty P6-P11 a P7-P10 pro Souther blot analýzu ukázaly identické autoradiografické signály pro ETHs2, -s4 a -s6, zatímco odlišné signály byly získány pro kosmidy ETHsl a -s3. Z kosmidu ETHs2 KspI byly izolovány subklony délky 940 bp.a 6,2 kb, které odpovídají předpokládané délce hybridizujících KspI fragmentu na Souther blot analýze. Sekvence obou subklonů byly kombinovány za zisku 1501 bp sekvence, která byla v souladu s výsledky přímého sekvencování genomových PCR produktů. 1501 bp sekvence obsahuje otevřený čtecí rámec (ORF) o 1098 bp odpovídající lidskému FUTl ORF, s 82,3% nukleotidovou a

80,8% aminokyselinovou identitou. ORF kóduje polypeptid.

Příklad 5: Identifikace prasečí FUT2 a pseudogenu FUTP

ETHsl má jeden DNA fragment (2,7 kb), který hybridizuje s FUTl sekvencí, zatímco ETHs3 má dva (2,7 kb a 8,2 kb). Subklonování a částečné sekvencování 2,7 kb EcoRI fragmentu ETHsl a -s3 potvrdilo, že tyto dva fragmenty jsou identické. Sekvence má vysokou podobnost s lidským FUT2, ale má několik změn k NH₂- a -COOH terminálních regionech. Tyto změny vedou k posunu čtecích rámců, které nejsou slučitelné s konzervovaným ORF, proto se předpokládá, že sekvence získaná z 2,7 kb fragmentu představuje pseudogen (FUT2P). Po subklonování produktu trávení ETHs3 BamHI byly identifikovány hybridizující sekvence obsažené v 8,2 kb EcoRI fragmentu. Získané subklonované sekvence představují 1023 bp ORF a jsou z 85% identické na nukleotidové úrovni a z 83% identické na aminokyselinové úrovni se sekvencí lidského FUT2. Mezi prasečí FUT2 sekvencí a FUT2P sekvencí získanou z 2,7 kb fragmentu bylo pozorováno mnoho rozdílů v NH₂- a -COOH terminálních regionech. Předpokládaná aminokyselinová sekvence odpovídá částečně určené aminokyselinové sekvenci prasečího Secretor enzymu (Thurin and Blaszczyk-Thurin, 1995). Prasečí FUTl, FUT2 a FUTP sekvence byly uloženy v GenBank pod přírůstkovým číslem U70883, U70881 a U70882, v příslušném pořadí. FUTl a FUT2 geny mají vysoce homologické sekvence. Toto bylo bráno v úvahu například při přípravě primerů. Kromě toho, enzymová aktivita FUTl a FUT2 musí být v dalších studiích odlišena.

• « • · « · * » • «

Příklad 6: Identifikace M307 a M857 mutací a charakterizace 14307 •··· · » ··

DNA byla izolována z prasečích jaderných buněk za použití standardních postupů. Přímé sekvencování prasečích FUT1 a FUT2 sekvencí a jejich sousedních regionů u zvířat různých ECF18R genotypů (BB, bb) vedlo k identifikaci dvou G --> A substitucí v pozicích 307 a 857 (označených 14307 a 14857, v příslušném pořadí) FUT1 ORF. 14307 substituce eliminuje restrikční místo pro Cfol. Amplifikace DNA izolované z prasečích jaderných buněk byla provedena pomocí standardních postupů s primery P6 a Pil (3 minuty při 95 °C, 30 cyklů o 30 s při 95 °C, 30 s při 56 °C a 30 sec při 72 °C, po kterých následovala 7 minutová konečná extense při 72 °C), a po ní následovalo trávení Cfol a separace na 3% agarosovém gelu, která vedla k polymorfismu délky restrikčních fragmentů (RFLP) . Homozygotní 14307^ zvířata měla 2 proužky (93a 328-bp fragmenty). Homozygotní 14307°° zvířata měla 87-, 93a 241- bp fragmenty. Heterozygotní zvířata měla všechny čtyři fragmenty.

Příklad 7: Charakterizace mutace 14857

14857 mutace je substituce, která eliminuje Acil místo. Primer PBEST byl navržen tak, aby eliminoval dvě další místa pro Acil v pozicích 866 a 872. PCR s primery P7 a PBEST (3 minuty při 95 °C, 30 cyklů o 30 s při 95 °C, 30 s při 56 °C a 30 sec při 72 °C, po kterých následovala 7 minutová konečná extense při 72 °C), po které následovalo trávení Acil, umožnily PCR-RFLP analýzu na 3% agarosovém gelu. Homozygotní 14857·^ zvířata vykazovala 174 bp fragment, zatímco amplifikační produkty 14857°° vykazovaly 136- a 38- bp fragmenty.

«••to * · · ···· ··· · · · · · « ·· ·

Příklad 8: Genetické mapování FUT1 genu

V Landrace prasečích rodinách ukázaly rekombinace mezi M307 a lokusem HAL vazebné skupiny (S, ECF18R, RYR1, GPI, PGD) rekombinační frakce Θ < 0,04 (tabulka 2). Lod skoré Z pro celkové rekombinační frakce byly mezi 24,5 a 50,6, což je silným důkazem vazby mezi těmito lokusy. Tato data umožňují genetické mapování FUT1 genu do HAL vazebné skupiny v těsné blízkosti S a ECF18R, které jsou oba ovlivněny FUT1. V pokusných Landrace rodinách byla zjištěna alelická asociace mezi ECF18R a RYR1. Větší počet genotypů RYR1^TT v pozici 1834 v RYR1 (genotyp citlivý na halotan) byl pozorován mezi prasaty resistentními na edematosní onemocnění prasat a průjmová onemocnění po odstavení (genotyp ECF18R^to/to) (tabulka 3). Tato asociace alel je důsledkem vazebné nerovnováhy, to znamená odchylky pozorovaných haplotypových frekvencí od očekávaných haplotypových frekvencí při nezávislém dělení alel. Vazebná nerovnováha označuje nenáhodnou asociaci alel náležících do vázaných lokusů. Nicméně, vzhledem k nízké rychlosti rekombinace nemůže být žádný lokus určen jako signifikantně lepší než druhý.

Příklad 9: Asociace M307^A s ECF18R^b a M307^G s ECF18R®

V Landrace (SL) a Large White (LW) prasatech je ECF18R¹³ (alela resistence na edematosní onemocnění prasat a na průjmová onemocnění po odstavení) 100% asociována s M307^A a ECF18R^B (alela sensitivity na edematosní onemocnění prasat a na průjmová onemocnění po odstavení) 100% asociována s M307^G (kde A je adenin a G je guanin) . U SL prasat odpovídá 88% (30/34) S^s všem ECF18R¹³a M307^A haplotypům, v příslušném pořadí. Odpovídající hodnoty pro oba S^s-ECFl8R^b a S^s-M307^A haplotypy byly 82% (9/11) u Large White prasat. V pokusných SL rodinách byl výskyt M857^A alely v FUT1 lokusu nízků, dokonce nepřítomný, u LW prasat. Proto nebyla pozorována signifikantní gametická asociace mezi alelami

M857 a alelami sousedních genů. G->A substituce v pozicích FUT1

307 a FLFT1857 byly zjišťovány s variabilními frekvencemi také u

Duroc, Hampshire a Pietrain prasat, což naznačuje, že se tyto substituce mohou vyskytovat také u j iných prasat.

Příklad 10: Distribuce FUT1 genotypů

Tabulka 4 ukazuje, že distribuce FUT1 genotypů v nukleotidové pozici 307 mezi ECF18R typy se statisticky významně odlišuje od očekávaného poměru při hypotéze, že se jedná o dva nezávislé genotypy. Z 119 zvířat ECF18R^to/to resistentních na edematosní onemocnění prasat a na průjmová onemocnění po odstavení mělo 118 genotyp 1^307“**^ v DNA testu. Jedno resistentní zvíře mělo genotyp M307^A/<3. Ze 131 sensitivních prasat mělo 130 genotyp Μ307^Λ/ο nebo M307^G/<3. Jedno zvíře, sensitivní na adhesi E. coli, bylo podle DNA testu homozygotní pro M307^A/A. Data z tohoto příkladu a z příkladu 2, spolu s daty předchozích studií, naznačují, že FUT1 gen je přítomen v S lokusu prasat a ECF18 lokusu. Ačkoliv 4 zvířata v tomto příkladu a v příkladu 2 neodpovídala hypotese, je pravděpodobné, že tato zvířata byla nesprávně fenotypizována s ohledem na sensitivitu/resistenci k onemocnění.

Příklad 11: Aminokyselinové změny v α(1,2)fukosyltransferase

G -> změny v bp +307 a bp +857 genu pro α(1,2)fukosyltransferasu 1 vedou k substituci aminokyseliny threoninu (neutrální polární) za alanin (neutrální nepolární) a glutaminu (neutrální polární) za arginin (bazická), v příslušném pořadí, kde tyto substituce mohou mít funkční důsledky v kódovaném produktu. C -> T substituce v bp 229 vede k aminokyselinové substituci leucinu (neutrální nepolární) za fenylalanin (neutrální nepolární).

Tabulka 1: Sekvence kódujících (F) a reversních (R) primerů a jejich relativní pozice vzhl^densl· k start kodonům prasečí FUT1 a FUT2²

Jméno primeru	Sekvence primeru	Pozice
FUTl P6 (R)	5'-CTTCAGCCAGGGCTCCTTTAAG-3'	+489
FUTl P7 (F)	5'-TTACCTCCAGCAGGCTATGGAC-3'	+720
FUTl P10 (R)	5'-TCCAGAGTGGAGACAAGTCTGC-3'	+1082
FUTI PII (F)	5'-CTGCCTGAACGTCTATCAAGATC-3	1' +69
FUTl PÍ6 (F)	5'-AGAGTTTCCTCATGCCCACAGG-3'	-90
FUTl PÍ8 (R)	5'-CTGCTACAGGACCACCAGCATC-3'	+1203
FUTl PBEST (R)	5'-ACCAGCAGCGCAAAGTCCCTGAC GGGCACGGCCTC-3¹	+893
FUT2P16 (R)	5'-CTCCCTGTGCCTTGGAAGTGAT-3'	+ 1094
FUT2P17 (F)	5'-AACTGCACTGCCAGCTTCATGC-3'	-83
² Primery FUTl P10	a FUTl Pil jsou získány	z lidského FUTl genu.
Tabulka 2: Celkové	rekombinační frakce (θ) ,	Lod skoré (Z) a počet
informativních zvířat (N) pro M307 a lokus	HAL vazebné skupiny v

Landrace pokusné populaci

Pár lokusů	N	Θ	Z
S-ECF18R	183	0,01	50,6
M307-S	183	0, 01	50, 6
M307-ECF18R	216	0,01	57,1
M307-RYR1	198	0,02	47,2
M307-GPI	147	0,03	34,2
M3Ó7-PGD	147	0,04	24,5

• · • · · ·

Tabulka 3: Frekvence haplotypů ve čtyřech lokusech (S-FUT1 (M307,

M857)-ECF18R-RYR1) v Landrace (SL) pokusné populaci a u náhodně vybraných Large White (LW) prasat

9 9 · · · · · 9 9 9 9 9 9

Odrůda	Haplotyp³ v S-FUT1 (M307, M857)-ECF18R-RYR1)	Frekvence⁴ (počet)
SL	sAGbT	70 (28)
	sAGbC	5 (2)
	SGGBC	15 (6)
	SGABC	10 (4)
LW	SAGbC	56 (9)
	SGGBC	31 (5)
	SGGBC	13 (2)

³ S: supresorový lokus pro A a 0 krevní typy (S a s) .

FUT1 (M307): alterace adeninu (A) na guanin (G) v nukleotidu 307 genu pro a(l,2)fukosyltransferasu (FUTi). FUTl (M857): alterace adeninu (A) na guanin (G) v nukleotidu 857 genu pro α(1,2)fukosyltransferasu (FUTl). ECF18R: E.coli F18 receptor. Dominantní alela citlivosti je označena B a resistentní alela je označena b. RYR1: ryanodinový receptor kosterního svalu. C (cytosin) je dominantně resistentní a T (thymin) je sensitivní alela pro maligní hypertermii.

⁴ Frekvence haplotypů jsou uvedeny v procentech a absolutní počet je uveden v závorkách.

• · ·

Tabulka 4: Distribuce genotypů, tetrachorické korelace (R) a statistická významnost asociace (x² a V x x²) asociovaných polymorfních FUT1 (M307) a ECF18R lokusů u Landrace (SL) pokusné populace a u náhodně vybraných Large White (LW) prasat.

···· · · ·· ·· ·· ··

	FUT1/M307
Odrůda	Lokus genotyp	A/G	A/A	r	X²	X² X w⁵
SL	ECF18R⁶ b/b	1	113	0,98	213,1	42,6***
	B/b	106	1
		A/G
	genotyp (A/G)	G/G	A/A
LW	ECF18R⁶ b/b	0	5	1,0	29,0	11,6***
	B/b, B/B	24	0
³ hmotnostní faktor w = 0,2	(SL)	a 0,4	(LW) byl	použit	pro

korekci chybění přesných výsledků vzniklých v důsledku zahrnutí příbuzných zvířat do dat, podle Cotterman (1947. *** p < 0,001.

⁶ Zvířata genotypu b/b v ECF18R lokusu jsou resistentní a zvířata genotypů B/b a B/B jsou sensitivní na adhesi F18 ab E. coli.

Způsoby

1. Primery

Primery odvozené z lidského FUT1 genu byly použity pro amplifikaci prasečího protějšku z genomové DNA. Z výsledných prasečích sekvencí byly navrženy specifické primery, které byly použity v další amplifikaci a sekvencování (tabulka 1).

• ftftft ftftft ····

2. Vyhledávání v prasečí genomové knihovně

Prasečí genomové knihovny byly vyšetřovány buď prasečí FUT1 sondou získanou za použití primerů P7 a P10, nebo prasečí FUT1 cDNA. Prasečí genomová knihovna, vytvořená v SuperCOsl (STratagene, La Jolla, CA, USA) byla vyšetřována s a³²P dATP značenou (Prime It II, Stratagene) FUT1 sondou získanou z prasečí genomové DNA pomocí primerů P7 a P10. Po hybridizaci dvoj itých filtrů při 42 °C po dobu 15 hodin (50% formamid, 6 x SSC, 5 x Denhartův roztok, 0,5% SDS, 0,1 mg/ml lososího spermatu) a dvojím promytí při 65 °C po dobu 30 minut (1 x SSC, 0,1% SDS) byly identifikovány pozitivní kolonie po expozici na rentgenovém filmu (15 h, -80 °C).

3. In šitu hybridizace prasečích chromosomů v metafázi

Kosmidové klony ETHsl, ETHs2, ETHs3, ETHs4 a ETHs6 byly předmětem fluorescentní in šitu hybridizace (FISH) (Solinas Toldo, et al., 1993) nebo přímé in šitu chromosomální PCT (DISC PCR) na prasečích chromosomech v metafázi. Chromosomy v metafázy byly barveny na Q-proužky a byly vyfotografovány před hybridizaci. Sondy byly značeny náhodným primingem za použití biotin-16-dUTP. Detekce signálu a amplifikace byly provedeny za použití avidin-FITC a biotynylovaného anti-avidinu. Chromosomy byly kontrastně barveny 4,6-diamidino-2-fenylindolem a relativní pozice kosmidů byly určeny způsobem, který popsal Solinas Toldo, 1993 .

4. Subklonování

Produkty enzymatického trávení genomových kolonií pozitivní na sondu byly separovány na agarosovém gelu, byly přeneseny na nylonovou membránu a proužky obsahující sondu byly subklonovány

4··· · · · ···· ··· · ···· « ·· · do plasmidů pro sekvencování FUT1. Sekvence FUT1 získaná tímto způsobem j e uvedena na obr. 1.

Všechny kosmidy byly tráveny KspI, EcoRI a KspI/EcoRI a produkty trávení byly separovány na 0,8% agarosovém gelu a byly přeneseny na Hybond N nylonovou membránu (Meijerink et al.,

1997). Tento blot byl hybridizován s a³²P dATP značenými produkty PCR prasečí FUT1 (primery P6-P11 a P7-P10). Na základě autoradiografických signálů byly ETHsl, -s2 a -s3 podrobeny dalšímu subklonování do pBluescript SK- a (Stratagene) a FUT sekvence byly určeny z těchto subklonů. Sekvence dvou

FUT-podobných otevřených čtecích rámců (ORF) (FUT1 a FUT2K získané z kosmidů ETHs2 a -s3 byly srovnávány s ECF18R pozitivními (BB/Bb) a negativními (b/b) zvířaty pomocí přímého sekvencování PCR produktů.

5. Polymerasová řetězová reakce a přímé sekvencování

Za použití Perkin Elmer Ready Reaction Dye Terminátor kitu (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT, USA) a 10 pmol primeru bylo provedeno cyklické sekvencování s teplotním programem stávajícím z počáteční denaturace při 95 °C po dobu 5 minut, po které následovalo 25 cyklů při 95 °C po dobu 5 s, 50 °C po dobu 15 s a 60 °C po dobu 4 minut. Primery použité pro amplifikaci a sekvencování prasečích genů pro α(1,2)fukosyltransferasu jsou uvedeny v tabulce 1. Další primery byly navrženy tak, že braly v úvahu křížové tepelné reakce primerů způsobené značnou podobností FUT1, FUT2 a FUT2 pseudogenu. Vzorky byly analyzovány na 373A ABI sekvenátoru (Applied Biosystems lne.) a analýza sekvence byla provedena s GCG výbavou (Devereux, 1984).

• · • ·

6. Produkce informativního potomstva

Polymorfisrny v jednom nukleotidu byly analyzovány na 221 Landrace prasatech, která byla potomky 4 vepřů a 16 prasnic a na 29 Large White prasatech, která byla potomky 9 páření mezi nepříbuznými prasaty. Pro produkci většího počtu informativního potomstva pro vyšetřování vazby mezi prasečími geny kódujícími ECF18 receptory a vybranými lokusy polymorfismu byly provedeny pouze informativní Landrace křížení B/b x b/b.

7. Test kolonizace

Ve studii provedené Bertschingerem et al., 193, byla výše uvedená Landrace prasata také testována na sensitivitu pro ECF18 v testu kolonizace. Pro tento test byla prasata inokulována těsně po odstavení E. coli kmenu 124/76 serotypů 0139:K12(B):H1:F18 (Rippinger et al., 1995) . Bakterie ve stolici byly sledovány každý den. Rozsah kolonizace byl vypočítán jako průměr dvou nejvyšších fekálních skoré. Prasata s fekálním skoré 3,5, které odpovídá 6,7 log kolony tvořících jednotek (CFU)/g nebo více, byla považována za sensitivní pro kolonizaci. Tento limit byl stanoven na základě chybění mortality pod touto hodnotou a na skoré získaných od plně resistentních selat.

8. Vazebná analýza nukleotidových polymorfismů J.

Výsledky jednonukleotidových polymorfismů byly.srovnávány s typizačními daty pro ECR18R, která byla získána v in vitro adhesním testu, jak jej popsal Vogeli et al., (1996), a s typizačními daty pro GPI-, PGD-, cc-l-B-glykoprotein (A1BG) , ryanodinový receptor (RYR1), EAH- a S- lokusy, jak je popsal Vogeli et al., (1996). Analýza párové vazby a výpočet rekombinačních frakcí byly provedeny za použití CRI-MAP verze 2.4 • · e · programu (Green et al., 1990). Analýza vícebodové vazby byla provedena sekvenční insercí výše uvedených lokusů do mapy. Haplotypové frakvence byly vypočítány z původních zvířat, pro Landrace rodiny a pro 8 rodičovských Large White zvířat, které byly haplotypovány na ECF18R z informací o potomstvu. Tetrachorické korelace ECF18R a mutací v FUTl (FUT1/M307) (polymorfismy) byly vypočítány na všem Landrace potomstvu a Large White potomstvu.

10. Souther blot analýza

Byla provedena Souther blot analýza kosmidů ETHs(l-3), ETHs2 (4-6) a ETHs3 (7-9) po trávení enzymy KspI (1, 4, 7), EcoRI (2,

5, 8) a KspI/EcoRI (3, 6, 9) a po separaci na 0,8% agarose. Hybridizace s a³²P dATP značeným 5'-FUTl fragmentem (primery P6-P11) vedla k vzniku stejného hybridizujícího 940 bp proužku pro produkty trávení KspI (dráha 4) a KspI/EcoRI (dráha 6). Nicméně, hybridizace s 3'-FUTl fragmentem (primery P7-P10) (tabulka 1) ukázala 6,2 kb KspI proužek ve dráze 4 a 1,1 kb KspI/EcoRI proužek ve dráze 6. Jak 5', tak 3' FUTl fragmenty hybridizují na stejný 4,6 kb EcoRI fragment ve dráze 5. Tato skutečnost ukazuje na přítomnost KspI místa ve FUTl genu obsaženém v kosmidu ETHs2. Křížová hybridizace 3' FUTl fragmentu detekuje 2,7 kb (dráhy 2, 3, 8a9) a 8,2 kb (dráhy 8 a 9) proužky, což vede k identifikaci sekvence FUT2 pseudogenu (nekompletní ORF) a FUT2 genu, v příslušném pořadí.

10. Polymorfismus délky restrikčních fragmentů

Detekce (A) M307 G na A a /Β) M857 G na A mutace v prasečím FUTl genu může být provedena analýzou polymorfismu délky restrikčních fragmentů, vzniklých trávením různými restrikčními enzymy. Trávení amplifikovaného FUTl fragmentu Cfol (A) a Acil • a • · · · «»«· · Μ * « a a a a a a ·· «a ·· aa (B) vede k polymorfismu restrikčních fragmentů. V první dráze je 100 bp markér. Délky fragmentů jsou uvedeny v párech baží. (A) Μ307^Λ/Α genotyp (dráha 2) vytváří restrikční fragmenty délky 328 bp a 93 bp, zatímco M307^G/<3 genotyp (dráha 4) vytváří restrikční fragmenty délky 93, 241 a 87 bp a heterozygotní M307^A/<3 genotyp (dráhy 3) vytváří všechny čtyři fragmenty.

(B) Trávení M857^A/A genotypu (dráha 2) vytváří restrikční fragmenty délky 174 bp, zatímco trávení M857^G/O genotypu (dráha 4) vytváří restrikční fragmenty délky 136 a 38 bp a trávení heterozygotního Μ857^Λ·^/® genotypu (dráhy 3) vytváří všechny tři fragmenty.

11. Zdroj prasat

Data pro Swiss Landrace pokusnou populaci jsou získána z rodokmenů, které byly zjištěny v Institute of Veterinary Bacteriology, University of Zurich. Všechna ostatní prasata Large White, Swiss Landrace, Duroc, Hampshire a Pietran plemen pocházela z různých chovných stád ve Švýcarsku. Ostatní prasata byla náhodně získána z farem na středozápadě USA.

• ·

Odkazy:

• · e · í ·»·

4 44« »4 4 • 4 4 4 4 4 4

444 · « * 44 <4

Bertschinger etal. (1993) Veterinary Microbiology 35:79-89.

Cohney et al. (1996) Immunogenetics 44:16-19.

Devereux et al., (1984) Nucleic Acids Res. J: 387-395.

Fujii et al. (1991) Science 253:448-451.

Green, et al., (1990) Documentation for CRI-MAP, Version 2.4, St. Louis: Washington University School of Medicine.

Kelly et al. (1994), Proč. Nati. Acad. Sci., U.S.A. 97:5843-5847 Meijerink, E. et al. (1997), 25th Int. Conf. on Animal Genetics, p. 44. Rippinger, et al. (1995) Vet. Microbial. 45:281-295.

Solinas Toldo et al. (1993) Mamm. Genome 4:720-727.

Thurin and Blaszczyk-Thurin, (1995) J. Biol. Chem. 270 (44):26511-26580.

Vogeli etal. (1996) Animal Genetics 27:321-328 Vógeli et al. (1997) Schweiz. Arch. Tierheilk. 139:479-484.

U.S. Pat. No. 5,358,649, Maclennon et al.

U.S. Pat. No. 5,552,144, Valery et al.

WO 8604604 987P, Inventor: Peterson.

WO 9628967, Inventor: Koike, C.

WO 9413811, Inventors: Imberechts and Lintermans.

TW 266264, Inventors: Jeng and Liou.

Claims

1. Způsob pro identifikaci prasat resistentních na kolonizaci střeva E. coli vyznačující se tím, že obsahuje:

a) určení přítomnosti genetického polymorfismů asociovaného s resistenci na kolonizaci v biologickém vzorku od prasete; a

b) pokud je prase homozygotní pro polymorfismus, tak určení prasete jako resistentního prasete.

2. Způsob pro identifikaci prasat resistentních na střevní onemocnění způsobená E. coli vyznačující se tím, že obsahuje:

a) určení toho, zda je v biologickém vzorku od prasete dusíkatá baze v pozici 307 genu pro α(1,2)fukosyltransferasu 1 adenin; a

b) identifikaci prasete jako resistentního tehdy, je-li baze v pozici 307 adenin.

3. Způsob křížení prasat resistentních na onemocnění způsobená E. coli vyznačující se tím, že

a) selekci takových prasat pro křížení, která mají genetický polymorfismus v genu pro α(1,2)fukosyltransferasu 1, který je identifikuje jako prasata resistentní na střevní onemocnění způsobéhá E. coli; a

b) křížení uvedených prasat.

4. Způsob podle nároků 1, 2 nebo 3vyznačující se tím, že E. coli je kmene F18.

5. Izolovaná molekula DNA, která je polymorfní pro gen pro α(1,2)fukosyltransferasu l u prasat.

6. Izolovaná molekula DNA mající sekvenci nukleotidů uvedenou na • · • · · · • · » ·· · · * « ··· · · · • «· ® « · · ···* ···· ·· »4 «4 «· obr. i.

7. Izolovaná molekula DNA podle nároku 6 ve které je místo guaninu v nukleotidové pozici 307 adenin.

8. Izolovaná molekula DNA, která je komplementární k nukleotidové sekvenci podle nároku 6.

9.Izolovaná molekula DNA podle nároku 6 se substitucí adeninu za guanin v nukleotidové pozici 857.

10. Izolovaná molekula DNA podle nároku 6 s threoninem v nukleotidové pozici 229.

11. Polypeptid kódovaný molekulou DNA podle nároků 5 nebo 6, kde uvedená molekula má α(1,2)fukosyltransferasovou aktivitu.

12. Část izolovaná molekuly DNA podle nároku 5 nebo 6, kde uvedená část obsahuje nukleotidovou sekvenci, která odlišuje prasata resistentní na kolonizaci E. coli od prasat sensitivních na takovou kolonizaci.

13. Molekulární test pro detekci receptorů pro F18 E. coli vyznačující se tím, že obsahuje izolaci DNA z jaderných buněk prasete; amplifikaci uvedené DNA v polymerasové řetězové reakci za použití oligonukleotidových primerů, které jsou komplementární k DNA sekvenci genu pro prasečí α(1,2)fukosyltransferasu; provedení trávení restrikčními enzymy za použití alespoň jednoho restrikčního enzymu; separaci výsledných fragmentů gelovou elektroforesou; určení příslušného počtu a délky fragmentů na gelu; a stanovení toho, které receptory jsou přítomné na prasečích buňkách, podle počtu a délky fragmentů.

• ·

J

J • · · ·

14. Molekulární test podle nároku 14 vyznačuj ící se tím, že restrikčním enzymem je Cfol.

15. Kit pro detekci receptorů pro F18 E. coli vyznačující se tím, že obsahuje oligonukleotidy v oddělehých kontainerech, které jsou komplementární k DNA sekvenci polymorfismu genu pro prasečí α(1,2)fukosyltransferasu 1.

16. Prasečí polypeptid mající α(1,2)fukosyltransferasovou aktivitu a aminokyselinovou substituci v pozici 103.

17. Polypeptid podle nároku 17, který má aminokyselinovou substituci v pozici 286.

18. Použití polymorfismu prasečí a(1,2)fukosyltransferasy pro vývoj léků pro léčbu prasat postižených onemocněním způsobeným E.