DD143180A1

DD143180A1 - ENZYME ELECTRODE FOR NAD (P) DETERMINATION

Info

Publication number: DD143180A1
Application number: DD21292179A
Authority: DD
Inventors: Frieder Scheller; Dorothea Pfeiffer; Michael Jaenchen; Ingrid Seyer; Martina Siepe
Original assignee: Frieder Scheller; Dorothea Pfeiffer; Michael Jaenchen; Ingrid Seyer; Martina Siepe
Priority date: 1979-05-16
Filing date: 1979-05-16
Publication date: 1980-08-06

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf eine- Enzymelektrode zur NAD(P)«Bestimmung. Sie eignet sich besonders für den Einsatz in klinischen Labors und in der Mikrobiologie. Das Ziel der Erfindung besteht darin, mit einer Enzymelektrode bei kurzer Meßzeit und Wiederverwendbarkeit des Enzyms die NAD(P)-Konzentration und damit Substrate NAD(P)H-abhängiger Dehydrogenasen sowie die enzymatische Aktivität von Dehydrogenasen, z.B. LDH in physiologischen und mikrobiologischen Lösungen zu bestimmen. Die erfindungsgemäße Enzymelektrode ist eine O2- oder H2O2-anzeigende Elektrode, die mit einer Enzymschicht versehen ist, in der die Glukoseoxidase und Glukosedehydrogenase homogen oder in getrennten Schichten aufgebracht und mit einem Dialyseschlauch abgedeckt ist. In die Meßlösung wird eine definierte Glukosemenge zugegeben. Die NAD(P)-Bestimmung ist mit dieser Elektrode einfacher und billiger durchzuführen.The invention relates to an enzyme electrode for NAD(P) determination. It is particularly suitable for use in clinical laboratories and in microbiology. The aim of the invention is to use an enzyme electrode to determine the NAD(P) concentration and thus substrates of NAD(P)H-dependent dehydrogenases, as well as the enzymatic activity of dehydrogenases, e.g., LDH, in physiological and microbiological solutions with a short measurement time and reusability of the enzyme. The enzyme electrode according to the invention is an O2- or H2O2-indicating electrode provided with an enzyme layer in which the glucose oxidase and glucose dehydrogenase are applied homogeneously or in separate layers and covered with a dialysis tube. A defined amount of glucose is added to the measurement solution. The NAD(P) determination is easier and cheaper to perform with this electrode.

Description

-λ--λ-

212 921212 921

Erfinder DrInventor Dr • F. Scheller• F. Scheller ZIMZIM D.D. PfeifferPfeiffer ZIMZIM M.M. JänchenJänchen PMDPMD I.I. SeyerSeyer ZIMZIM M.M. Siepe "Siepe " ZIMZIM

Enzyme electrode for NAD (, P) determination Field of application of the invention

Die Erfindung betrifft eine Enzymelektrode zur Bestimmung der Konzentration von Nicotinsäureadenin-dinukleotid (NAD) und Kicotinsäureadenin-dinukleotidphosphat (NADP) ( zusammen als NAD(P) bezeichnet) und ermöglicht die Bestimmung der Konzentration von Substraten lTAD(P)H-abhängiger Dehydrogenasen sowie der Dehydrogenaseaktivität. Da in vivo etwa 200 verschiedene Dehydrogenasen (DH) vorkommen, ist die Enzymelektrode besonders für den Einsatz im klinischen Labor geeignet· Außerdem ist sie für die NAD(P)-Messungen in der Mikrobiologie und Nahrungsguterwirtschaft geeignet,The invention relates to an enzyme electrode for determining the concentration of Nicotinsäureadenin-dinucleotide (NAD) and Kicotinsäureadenin-dinucleotide phosphate (NADP) (collectively referred to as NAD (P)) and allows the determination of the concentration of substrates lTAD (P) H-dependent dehydrogenases and the dehydrogenase activity. Since there are approximately 200 different dehydrogenases (DH) in vivo, the enzyme electrode is particularly suitable for use in the clinical laboratory. It is also suitable for NAD (P) measurements in microbiology and food processing.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen Die verbreitete Methode zur Bestimmung der NAD(P)-Konzentration ist der optische Test. Er beruht auf der Messung der UV-Absorption des Reduktionsproduktes NAD(P)H bei 340 nm. Diese Methode wird auch zur Konzentrationsmessung der Substrate NAD(P)H-ahhängigen Dehydrogenasen angewandt.. Die elektrochemische Messung der NAD(P)-Konzentration ist nur in sauerstoffreier Lösung möglich, da sich die Characteristic of known technical solutions The common method for determining the NAD (P) concentration is the optical test. It is based on the measurement of the UV absorption of the reduction product NAD (P) H at 340 nm. This method is also used for the concentration measurement of the substrates NAD (P) H-dependent dehydrogenases. The electrochemical measurement of the NAD (P) concentration is only possible in oxygen-free solution, since the

und die 1. NAD(P)-Reduktionsstufe überlagern· Dabei führt das Entlüften zur Denaturierung der Proteinmoleküle.and superimpose the first NAD (P) reduction stage. In doing so, venting leads to denaturation of the protein molecules.

Object of the invention

Das. Ziel der Erfindung ist es,mit einer Enzymelektrode bei kurzer Meßzeit und Wiederverwendbarkeit der Enzyme die NAD(P)-Konzentration und damit die Substrate NAD(P)H-abhängigen Dehydrogenasen sowie die. enzymatisch^ Aktivität von Dehydrogenasen in physiologischen und mikrobiologischen Lösungen zu bestimmen·The. The aim of the invention is, with an enzyme electrode with a short measurement time and reusability of the enzymes, the NAD (P) concentration and thus the substrates NAD (P) H-dependent dehydrogenases and the. to enzymatically determine the activity of dehydrogenases in physiological and microbiological solutions

Explanation of the essence of the invention

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, durch Kombination der Enzyme Glukoseoxidase (GOD) und Glukosedehydrogenase (GDH) ein Signal zu erhalten, das von der NAD(P)-Konzentration abhängt. Die Aufgabe wird mit einer Enzymelektrode dadurch gelöst, daß die beiden Enzyme gemeinsam in einer Schicht vor einer üblichen Sauerstoffelektrode angeordnet sind und der Meßlösung eine definierte Menge Glukose zugesetzt ist. In Abwesenheit von NAD(P) tritt durch die Glukoseoxidation ein Ort-Verbrauch auf, der der zugesetzten Glukosemenge proportional ist (Prinzip der Glukoseelektrode (P. Scheller et al., Z.med.Lab.Diagn. J8, 312 (1977)). Bei Zugabe von NAD(P) zu dieser Lösung wird ein Teil der Glukose durch die GDH vor der Elektrode zu Glukonsäure umgesetzt, so daß eine Verkleinerung des Signals für Glukose auftritt, die von der NAD(P)-Menge abhängt.The object of the invention is to obtain by the combination of the enzymes glucose oxidase (GOD) and glucose dehydrogenase (GDH) a signal which depends on the NAD (P) concentration. The object is achieved with an enzyme electrode in that the two enzymes are arranged together in a layer in front of a conventional oxygen electrode and the measuring solution is added a defined amount of glucose. In the absence of NAD (P), the glucose oxidation causes a local consumption which is proportional to the amount of glucose added (Principle of the Glucose Electrode (Scheller P. et al., Z. Med.Lab.Diagn. J8, 312 (1977)). When NAD (P) is added to this solution, part of the glucose is converted by the GDH in front of the electrode to gluconic acid, so that a decrease in the signal for glucose occurs, which depends on the NAD (P) amount.

GOD Glukose * O₂ Glukonsäure + ^₂O₂ GOD glucose * O ₂ gluconic acid + ^ ₂ O ₂

GDH Glukose + NAD(P) Glukonsäure + NAD(P)HGDH glucose + NAD (P) gluconic acid + NAD (P) H

Die erfindungsgemäße Enzymelektrode arbeitet also ohne die Verwendung eines Kofaktors· Sie erlaubt sowohl die kontinuierliche als auch die punktweise Bestimmung der NAD(P)-Konzentration mit einfachen Geräten (pOg-Meter). Damit ist auch die Bestimmung des NAD(P)-Verbrauches, d.h_e der NAD(P)H-Bildung möglich.The enzyme electrode according to the invention thus operates without the use of a cofactor. It allows both the continuous and the pointwise determination of the NAD (P) concentration with simple devices (pOg-meters). Thus, the determination of NAD (P) consumption, ie _e of NAD (P) H formation is possible.

-3- 212 921-3- 212 921

Zur Bestimmung von Substraten von NAD(P)H-abhängigen DH ist es zweckmäßig, daß die Enzymschicht zur GOD und GDH zusätzlich mi der für das Substrat spezifischen DH versehen ist·In order to determine substrates of NAD (P) H-dependent DH, it is expedient that the enzyme layer for GOD and GDH is additionally provided with the specific DH for the substrate.

Auaführungabeispiele

Die Erfindung soll nachstehend an 2 Ausführungsbeispielen erläutert werden·The invention will be explained below with reference to two exemplary embodiments.

200 U GOD und 50 U GDH mit 3 U Mutarotase werden in 0,3 ml lösung von 5 mg Acrylamid aufgelöst und auf einer Fläche von200 U GOD and 50 U GDH with 3 U mutarotase are dissolved in 0.3 ml solution of 5 mg acrylamide and placed on an area of

ρ 2 cm zwischen 2 Glasplatten ausgestrichen und photopolymerisiert· Ein 3 x 3 mm großes Filmstück wird auf der Polyäthylenfolie der Clark-Elektrode unmittelbar vor der Indikatorelektrode (Pt) plaziert· Über die Enzymschicht wird ein Dialyseechlauch mit einem O-Ring über den Elektrodenmantel gespannt. Die so präparierte Enzymelektrode taucht in die gerührte Meßlösung von 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,6, und ist an ein pO«- Meter mit Schreiber angeschlossen·ρ 2 cm spread between 2 glass plates and photopolymerized · A 3 x 3 mm piece of film is placed on the polyethylene of the Clark electrode immediately before the indicator electrode (Pt) · About the enzyme layer is a dialysis tube with an O-ring stretched over the electrode jacket. The enzyme electrode prepared in this way is submerged in the stirred measuring solution of 0.1 M phosphate buffer, pH 7.6, and is connected to a pO «meter with recorder.

Nachdem sich der Grundstrom eingestellt hatjWird eine Menge an Glukose zugegeben, so daß die Konzentration in der Meßlösung 0,5 mM beträgt· Nach 2 Minuten ist der stationäre Stromwert erreicht und es erfolgt 8-mal die Zugabe von jeweils 0,25 mN NAD (Aufnahme der Eichkurve)· Dabei tritt jeweils eine Verkleinerung des Glukosesignals ein, wobei nach dem steilen Abfall unmittelbar nach NAD-Zugabe der Übergang zu einem konstanten Gebiet erfolgt· Der Meßwert ergibt sich als Schnittpunkt der linearen Extrapolation beider Gebiete. Zur Messung der IDH-Aktivität wird eine Lösung, die 0,5 mM Glukose und 1 mM NAD sowie 0,1 M Laktat enthält in die Meßzelle eingefüllt. Nachdem der Strom einen konstanten Wert besitz, werden 20/ul der LDH-haltigen Serumprobe zugegeben. Durch die Enzymreaktion erfolgt ein Anstieg der Strom-Zeit-Kurve, da die NAD-Konzentration verkleinert wird· Aus der Eichkurve kann damit die LDH-Aktivität errechnet werden·After the basal current has stopped, an amount of glucose is added so that the concentration in the measurement solution is 0.5 mM. After 2 minutes, the steady state current value is reached and 8 times the addition of 0.25 mM NAD each (uptake) the calibration curve). In each case, a reduction of the glucose signal occurs, whereby after the steep drop immediately after NAD addition, the transition to a constant region occurs. The measured value results as an intersection of the linear extrapolation of both regions. To measure the IDH activity, a solution containing 0.5 mM glucose and 1 mM NAD and 0.1 M lactate is introduced into the measuring cell. After the current has a constant value, 20 μl of the LDH-containing serum sample is added. The enzyme reaction leads to an increase in the current-time curve, since the NAD concentration is reduced. The LDH activity can thus be calculated from the calibration curve.

Eine photopolymerisierte Enzymschicht, die nur GOD enthält, wird wie in Beispiel 1 auf die O^-Elektrode aufgebracht· An-A photopolymerized enzyme layer containing only GOD is applied to the O 2 electrode as in Example 1.

212 9:212 9:

schliessend wird eine zweite Polyacrylamidschicht von 20/U Dicke, die 30 U GDH und 20 U Alkoholdehydrogenase je cm² enthält, über die GOD-Schicht gelegt und mit einem Dialyseschlauch auf der Stirnfläche des Elektrodenmantels fixiert. Diese Elektrode taucht in 5 ml temperierte Grundlösung, die 0,5 mM Glukose, 1 mM EiAD in 0,1 M Phosphat puff er pH 7,6 enthält. . Nachdem sich der Strom stabilisiert hat; werden 100 /Ul der G A'thanol-haltigen Meßprobe zugegeben. In der Enzymreaktion wird eine zur Konzentration an Äthanol äquimolare NAD-Menge verbraucht und deshalb der Strom erhöht. Diese Erhöhung ergibt die Ä'thanolkonzentration aus der Eichkurve, die unter identischen Bedingungen aufgenommen wurde.Finally, a second polyacrylamide layer of 20 / U thickness, containing 30 U GDH and 20 U alcohol dehydrogenase per cm ² , placed over the GOD layer and fixed with a dialysis tube on the end face of the electrode sheath. This electrode immersed in 5 ml tempered stock containing 0.5 mM glucose, 1 mM EiAD in 0.1 M phosphate buffer pH 7.6. , After the electricity has stabilized; are added 100 / Ul of G A'thanol-containing sample. In the enzyme reaction, an amount of NAD that is equimolar to the concentration of ethanol is consumed and therefore the current is increased. This increase gives the ethanol concentration from the calibration curve recorded under identical conditions.

Claims

invention claim

1. enzyme electrode for the determination of WAD (P) by means of an Op- or H-Op-indicating electrode, characterized in that the electrode with an enzyme layer, in the glucose and glucose dehydrogenase homogeneously applied or in separate layers and covered by a dialysis tube, wherein in the measurement solution, a defined amount of glucose is added.

2 × enzyme electrode according to item 1, characterized in that the enzyme layer for glucose oxidase and dehydrogenase additionally contains lactate or alcohol dehydrogenase ·