DD143379A3 - Indikatorroehrchen zur glukosebestimmung - Google Patents

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DD143379A3 DD78206900A DD20690078A DD143379A3 DD 143379 A3 DD143379 A3 DD 143379A3 DD 78206900 A DD78206900 A DD 78206900A DD 20690078 A DD20690078 A DD 20690078A DD 143379 A3 DD143379 A3 DD 143379A3
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Description

206 900 -ι-
Titel der Erfindung
Indikator-Röhrchen zur Glukosebestimraung
Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Indikator-Röhrchen zum Glukosenachweis und zur Glukosebestimmung«
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen
Die enzymatisch^ Umsetzung von Glukose mit dem Enzym Glükoseoxydase und der Nachweis mit geeigneten Indikatoren in Gegenwart des Hilfsenzyms Peroxydase oder gleichartig wirkenden Stoffen ist bekannt, ebenso die Anwendung dieses Prinzips für Streifenteste.
Es treten dabei immer Farbreaktionen auf, die visuell oder photometrisch ausgewertet werden· Bei niedrigen Glukosekonzentrationen sind die Farbreaktionen differenzierbar, mit steigenden Glukosemengen im pathologisch wichtigen Bereich wird die Einstufung schwieriger und läßt bei den bisher beschriebenen Teststreifen keine eindeutige Aussage mehr zu· Das ist darauf zurückzuführen, daß die bisher verwendeten Teste die zur Reak-
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m, 2 —
tion benötigten Komponenten in einer Zone anwenden und die dabei erfolgenden Reaktionen parallel zueinander ablaufen· Mit steigender Substratmenge nimmt deshalb die Bedeutung des Mikromilieus und einer Diffusion zu.
In der DD-PS 40 667 ist ein Teststreifen beschrieben, der aus zwei bzw. drei Zonen besteht: einer Auftrags-, einer Reaktions- und einer Nachweiszone. Der Teststreifen kann Markierungsmittel zur farbigen Kennzeichnung, aber auch Puffersubstanzen enthalten·
Das in der DD-PS 40 667 beschriebene Mittel zum Glukosenachweis mit getrennt aufgetragenen Glukoseoxydase- und Peroxydase-Indikator-Zonen ist für einen qualitativen Nachweis geeignet, besitzt jedoch die gleichen, zuvor beschriebenen Nachteile, da das Enzym Glukoseoxydase mit der Untersuchungsflüssigkeit und dem Substrat bzw. dessen ümsetzungsprodukt in die Peroxydase-Zone diffundiert. Das .pH-Optimum für beide Enzyme ist unterschiedlich, so daß für die gemeinsam aufgetragenen Komponenten keine optimalen Bedingungen bestehen.
Ein weiterer Nachteil ergibt sich auch daraus, daß die gebildeten Farbstoffe mit zunehmender Reaktionszeit weiter oxydieren und dann Mischfarben entstehen, so daß eine Verlängerung der Reaktionszeit keine Besserung der Beatimmungsmethode bringt. Diese Nachteile sind in den bisher beschriebenen Verfahren durch Zusätze von'Gelatine, von Polymeren und durch, die Auswahl geeigneter Puffer verbessert worden. Ebenso ist die visuelle Auswertung durch den Zusatz von gelben oder roten Farbstoffen erleichtert worden.
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Die Auswertung aller beschriebenen Teste erfolgt mittels einer Farbtafel oder mit Hilfe spezieller Meßgeräte, wobei dann eine Standardmessung durchgeführt werden muß· Aus den aufgeführten Gründen sind die Auswertungen mit vorgeschriebener Reaktionszeit und Ablesezeit erforderlich, die eingehalten werden müssen, um die Farbtafel oder das Meßgerät anwenden zu können·
Diese Nachteile einer schlechten Differenzierbarkeit, der schwierigen Zμordnung zur Farbtafel, der Einhaltung der Reaktionszeit und der Ablesezeit werden noch durch den Abfall der Enzyraaktivität und durch Störfaktoren aus dem Untersuchungsmaterial beeinflußt.
So.ist die gleichzeitige Anwendung der Teststreifen oder Folien sowohl für die Glukosebestimmung im Harn wie auch im Serum oder Blut nicht möglich, da bei dem bekannten Reaktionsprinzip der Eiweißgehalt und der Färbstoffgehalt eine besondere Präparation der Teste erfordern· Zu diesem Zweck wird die Reaktionszone hydrophobiert oder mit einer semipermeablen Schicht überzogen oder auch der Teststreifen insgesamt imprägniert, wie es in der DD-PS 74 369 dargestellt ist·
Eine besondere Form der Bestimmung ist für den Nachweis der Restglukose im Harn entwickelt worden, um einen absolut glukosefreien Harn von Harnen mit physiologischen Glukosemengen bis 30 mg/100 ml unterscheiden zu können (Journal of the American Medical Association, April 15, 1968, Vol. 204, pp. 205 bis 208). Dazu wird das Trägermaterial Papier mit 2-Diäthylaminoäthanol vorbehandelt.
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Das Problem, im Serum oder Blut .Glukosemengen unter 40 mg/100 ml zu bestimmen, wie es als diagnostisches Problem in der Kinderheilkunde besteht, ist mit den bisher beschriebenen Teststreifen nicht möglich, da in diesem Bereich noch keine Anzeige erfolgt·
Serienbestimmungen sind bei gleichzeitiger Einhaltung der Reaktions- und Ablesezeit von einer einzelnen Laborkraft nicht möglich bzw. die Zahl der Prüfungen ist begrenzt. Ungeübten Personen, wie Altersdiabetikern, macht die visuelle Auswertung unter den vorgeschriebenen Bedingungen und den beigegebenen Farbtafeln Mühe, was auch die breite Anwendung der Teste in der Selbstkontrolle begrenzt.
Zur Abwendung dieser Mangel ist es möglich, einen Indikator zum Glukosenachweis gemäß der DD-PS 137 384 zu gestalten. Danach kann der Teststreifen in ein markiertes Kapillar-Röhrchen aus Glas oder Kunststoff mit geeigneten Abmessungen eingebracht werden· Die Hachweiszone des Teststreifens kann aus einer oder mehreren streifenförmigen Indikator-Signalzonen im Wechsel.mit unbehandelten Zwischenräumen aufgebaut sein.
Ziel der Erfindung
Es ist das Ziel der Erfindung, einen Testϊzu entwickeln, der eine quantitative Bestimmung auch höherer Glukosekonzentrationen und die Erfassung der Restglukose bzw. die Bestimmung von Glukosemengen unter 40 mg/100 ml Harn, Serum oder Blut ermöglicht.
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Darlegung des Wesens der Erfindung
Die Aufgabe der Erfindung besteht "darin, einen Test zur GlukosebeStimmung zu schaffen, der die Diffusion der Untersuchungsflüssigkeit durch eine fixierte Glukoseoxydasezbne ermöglicht und für die Reaktions- und Hachwei8zone optimale pH-Bedingungen schafft.
Die genannte Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die auf einem Teststreifen befindliche Reaktionszone aus fixierter Glukoseoxydase besteht.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß die Glukoseoxydase ohne wesentliche Einschränkung ihrer Aktivität in ausreichendem Maße immobilisiert wird, wenn man sie in einer sauren Lösung unterhalb des isoelektrischen Punktes aufträgt. Die Saugfähigkeit des Teststreifens, eine Voraussetzung für das Reaktionsprinzip, bleibt dabei voll erhalten. Das ist auf Aufwand gemessen eine ökonomisch vorteilhafte Methode, da auf diese Weise keine Umarbeitungsverluste eintreten,
Natürlich kann auch eine vorher nach einer bekannten Methode immobilisierte Glukoseoxydase als Suspension aufgetragen werden.
Dieser Teststreifen gestattet einerseits die Bestimmung niedrigster Glukosemengen, Andererseits wird durch die Diffusion der Untersuchungsflüssigkeit durch die Glukoseoxyd ase-Reaktionszone eine Substrathemmung verhindert. Damit werden auch höhere Konzentrationen differenzierbar·
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Dieser erfindungsgemäßen Reaktionszone iat eine Bemessungezone vorgelagert, die dem Aufnehmen und Abmessen einer bestimmten Menge der zu untersuchenden Flüssigkeit dient»
Dieae Zone kann zusätzlich Markierungsmittel enthalten und damit farbig gekennzeichnet sein. Sie kann weiterhin Oxydations-, Puffer- oder Fällungsmittel enthalten, so daß beispielsweise Eiweiß, Blutfarbstoff oder Vitamin C gebunden werden.
An die Reaktionazone schließt sich eine Hachweiszone an. Darauf ist das Hilfsenzym Peroxydase und ein Indikator in einer Zone oder aber in mehreren Streifen in Form von Signal-Zonen, die durch Zwischenräume getrennt sind, aufgetragen. Werden mehrere Peroxydase-Indikator-Zonen in Form von Signalzonen aufgetragen, ao können die Zwischenräume ein farbstoffbindendes Fixiermittel enthalten·
Zur Aufnahme des Teststreifens dient ein Kapillar-Röhrchen aus Glas oder Kunststoff. Am unteren Ende ist das Kapillar-Röhrchen mit einer farbigen Markierung versehen, bis zu der eine bestimmte Menge eines Laufmittels aufgenommen wird. Das Kapillar-Röhrchen weist eine länge von 40 bis 120 mm auf. Es ist mit einem gleichbleibenden Innendurchmesser von 1 bis 3 mm ausgeführt. Im oberen Teil kann das Kapillar-Röhrchen eine farbige Graduierung erhalten. Diese Graduierung kann der Anzeige der Glukosemenge in der Untersuchungaflüaaigkeit dienen. Da die Glukoaekonzentration äquivalent ist der Länge der gefärbten Nachweisζone, kann durch das Ablesen an den Teilstrichen der Graduierung eine quantitative Glukoseangabe erfolgen. «
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Wird der Teststreifen mit Kapillar-Röhrchen·verwendet, ist das Einhalten einer bestimmten Reaktionszeit nicht erforderlich. Zur Vornahme eines Glukosenachweises erfolgt ein Eintauchen der aus dem Kapillar-Röhrchen herausragenden Bemessungszone des TestStreifens. Der Teststreifen kann sofort oder nach Aufsaugen der Unterauchungsfliissigkeit auf der Bemessungszone in das Kapillar-Röhrchen zurückgeschoben werden· Durch Aufnehmen eines Laufmittels bis zur unteren Markierung des Kapillar-Röhrchens und Benetzen der Bemessungszone wird die Nachweisreaktion eingeleitet.
Probenahme und Reaktion laufen unabhängig voneinander ab. Der Reaktionsablauf auf dem Teststreifen kann in Verbindung mit dem Kapillar-Röhrchen durch die Aufnahme eines laufmittels zu jedem beliebigen Zeitpunkt und in Serie eingeleitet werden· Durch die Verwendung eines Kapillar-
Röhrchens ist eine genaue und ausreichende Dosierung des laufmittels auch durch ungeübte Kräfte oder Laien möglich.
Y/ird der Teststreifen ohne Kapillar-Röhrchen verwendet, so sind die Bemessungs-, Reaktions- und Nachweiszone zweckmäßig ohne Zwischenzonen oder Sicherheitsabstände auf dem Streifen anzuordnen» Die Vornahme eines Glukosenachweises erfolgt in diesem Falle durch Eintauchen des Teststreifens in voller Höhe der Bemessungszone und Auswerten der Länge des anzeigenden Indikators auf der Nachweiszone, Dieser Nachweis ermöglicht zumindest einen halbquantitativen Nachweis von Glukose.
Bei Anwendung eines derartigen Teststreifens entfällt die Benutzung einer Farbtafel, . . \ «
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Ausfuhrungsbeispiel
Die Erfindung soll in mehreren Ausführungsbeispielen näher erläutert v/erden·
In der dazugehörigen Zeichnung zeigen:
Figur 1: einen Teststreifen, ohne Kapillar-Röhrchen verwendbar,
Figur 2: einen Teststreifen mit Indikator-Signalzonen, mit Kapillar-Röhrchen verwendbar,
Figur 3: Kapillar-Röhrchen mit Teststreifen zur Aufnahme der Unterauchungsflüssigkeit,
Figur 4: Kapillar-Röhrchen mit Teststreifen zur Aufnahme des Laufmittels·
Beispiel 1
Das Beispiel erläutert den halbquantitativen Nachweis von Glukose im Harn ohne Farbtafel und ohne Reaktionszeit- und Ablesezeitbegrenzung für Einzel- oder Serienbestimmungen und wird in Figur 1 dargestellt.
Als Trägermaterial wird ein Filterpapier mit einem Ge-
2 wicht von 100 g/m verwendet. Es wird eine 0,1 %ige Lösung von Sudanrot in Äthanol hergestellt und an einem Ende eines Teststreifens 1 eine 5· bis 15 mm breite Bemessungszone 2 damit markiert. Die Breite dieser Zone ist entsprechend der nachfolgenden Zonenbreiten genau einzustellen und festzulegen. Im Beispiel wird eine Breite von 10 mm eingestellt.
Für die Reaktionszone 3 werden
a) 0,1 g Benzoesäure in 10 ml Äthanol und
b) 3000 U Glukoseoxydase in 10 ml destilliertem Wasser getrennt gelöst, rait-einander gemischt und sofort oberhalb der 10 mm breiten Sudanrotzone mit einer Breite von 3 bis 10 mm, in diesem Fall 5 mm breit, aufgetragen»
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Für die Uachweiszone 4 werden
a)· 300 U Peroxydase in 10 ml Puffer 0,2 mol, pH .7,0
b) 100 mg o-Tolidin und .
10 mg Auraraingelb gelöst in 10 ml Äthanol miteinander gemischt und auf das Papier oberhalb der Reaktionazone 3 aufgetragen. Die gemischte Lösung kann in Streifen von 1 bis 2 mm Breite, z. B. in 4 Streifen nebeneinander mit Zwischenräumen oder wie dargestellt in Form eines breiten Streifens von 10 mm Breite aufgetragen werden.
Das Auftragen der drei Lösungen für die verschiedenen Zonen geschieht zweckmäßigerweise mit bekannten Liniermaschinen gleichzeitig. Die Papierbogen oder -bahnen werden danach in bekannter V/eise getrocknet und in Streifen geschnitten. Zur Anwendung wird das für die Bemessung markierte Stück des Teststreifens 1 kurz in die zu untereuchende Flüssigkeit, z. B. in Harn eingetaucht. Die aufgenommene Flüssigkeitsmenge reicht aus, um durch die Kapillarwirkung durch die Glukoseoxydasezone in die Peroxydase-Indikatorzone bzw. -zonen zu diffundieren. Dabei wird eine bestimmte Menge der Glukose umgesetzt und in der Peroxydase-Indikatorzone angezeigt. Die Länge oder die Zahl der gefärbten Peroxydase-Indikatorzone bzw. -zonen zeigt die Glukosemenge an. Da die Reaktion mit dem Abschluß der Diffusion endet, bleibt die Färbung, die abhängig vom Glukosegehalt eintritt, konstant, auch wenn die Flüssigkeit verdunstet ist. Der Streifen kann also zu jedem beliebigem Zeitpunkt ausgewertet werden.
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Beispiel 2
Das Beispiel erläutert die Herstellung eines Teststreifens mit Indikator-Signalzonen mit einem Kapillar-Röhrchen für die Glukosebestimmung im Harn, zur Selbstkontrolle oder auch für SerienbeStimmungen, ohne Farbtafel und ohne Ablesezeitfestlegung und wird in Figur 2 bis 4 dargestellt·
Es wird ein geeignetes Trägermaterial mit einer guten Saugfähigkeit, z· B. Filterpapier mit einem Flächengewicht
von 135 g/m gleichzeitig mit folgenden Lösungen nebeneinander wie jeweils beschrieben präpariert·
Bemessunge zone 2, 10 mm breit.
Es wird eine Lösung von 0,1 g Kaliumpermanganat und 100 mg Kongorot in 100 ml destilliertem V/asser bereitet und die untere Kante 10 mm breit damit präpariert. In dieser Zone werden eventuell im Harn vorhandene reduzierende Stoffe, wie Askorbinsäure, die die Reaktion stören können, umgesetzt.
Zwischenzone 5, 5 mm breit im Anschluß an die Bemessungszone 2.
Es wird eine Lösung von 1 g Nitrilotriessigsäure in 100 ml destilliertem Wasser bereitet und in 5 mm Breite aufgetragen· Diese Zone dient als Maskierungszone.
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Reaktionszone 3, 10 mm breit.
Es wird eine Lösung von 0,5 g Bernsteinsäure.in 50 ml destilliertem Vfesser und eine Lösung von 0,5 g Glukoseoxydase, entsprechend 15 000 ü, in 50 ml destilliertem V/asser hergestellt. Die beiden Lösungen werden gemischt und damit sofort ein 10 ram breiter Streifen über der Zwischenzone 5 präpariert.
Zwischenzone 5f 5 mm breit im Anschluß an die Reaktionszone 3.
Es wird eine Lösung von 1 g Natriumazetat in 100 ml destilliertem Wasser bereitet und mit dieser Lösung eine 5 mm breite Zone präpariert. Sie dient als Pufferzone.
nachweiszone 4·
Im Anschluß an die Zwischenzone 5 werden mit Zwischenräumen von 2 bis 3 mm 5 Peroxydase-Indikatorzonen mit einer Breite von jeweils 2 bis 3 mm nebeneinander aufgetragen. Dazu wird eine Lösung folgender Zusammensetzung verwendete
a) 100 mg Peroxydase, entsprechend 6000 U, gelöst in 50 ml 0,2 mol Pufferlösung, pH 7,2,
b) 400 mg o-Tolidin und
75 mg Orasolgelb gelöst in 50 ml Äthanol· Beide Lösungen werden miteinander gemischt und sofort, wie beschrieben, in Streifen oberhalb der Zwischenzone 5 aufgetragen.
Das Auftragen der verschiedenen Lösungen kann gleichzeitig oder nacheinander erfolgen. Das präparierte und getrocknete Trägermaterial wird in schmale, etwa 2 mm breite Bänder geschnitten und in Kapillar-Röhrchen 6 aus Glas oder Kunststoff gesteckt. Die Kapillar-Röhrchen 6 besitzen
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eine Markierung 7 für die Bemessung der Laufflüssigkeit« Die Kapillar-Röhrchen 6 sind 60 mm' lang bei einem Innendurchmesser von 2,5 bis 3 mm.
Zur Durchführung der Prüfung wird die Bemessungszone 2, die rot gefärbt ist, aus dem Kapillar-Röhrchen 6 geschoben und kurz in die zu untersuchende Flüssigkeit getaucht. Dadurch erfolgt eine quantifizierte Flüssigkeitsaufnahme· Eventuell vorhandene, reduzierende Stoffe, insbesondere Askorbinsäure, werden oxydiert. Es kommt aber noch nicht zur Reaktion der Glukose,
Danach wird der Streifen soweit in das Kapillar-Röhrchen gezogen, daß die untere Kante etwa 5 mm über der Markierung 7 des Kapillar-Röhrchens 6 liegt.
Je nachdem, ob eine Einzelbestimmung oder SerienbeStimmungen durchgeführt werden, erfolgt die GlukosebeStimmung sofort oder nach Belieben. Dazu wird das Kapillar-Röhrchen bis zur Markierung 7 durch Eintauchen mit destilliertem Wasser gefüllt. Anschließend wird der Teststreifen 1 in das Wasser geschoben und aufrecht gestellt· Durch die Kapillarwirkung diffundiert die zu untersuchende Flüssigkeit mit dem V/asser durch die verschiedenen Zonen und die Glukose wird zur Reaktion gebracht. Je nach dem Glukosegehalt färben sich eine oder mehrere Indikatorzonen und werden an der Graduierung 8 abgelesen.
Vorausgesetzt, der Diffusionsvorgang ist abgeschlossen, so kann zu jeder beliebigen Zeit abgelesen und ausgewertet werden, da die Färbung konstant bleibt. Der Bemessungszone 2. kann anstelle von Kaliumpermanganat auch jedes andere geeignete Oxydations- oder Fällungsmittel zugesetzt werden, wie auch das Markierungs- bzw. Maskierungsrait.tel in bekannter Weise variiert werden kann.
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Für die Nachweiszone 4 können gleichermaßen auch die in der Literatur beschriebenen Stoffe mit Peroxydasewirkung Verwendung finden· . '
Der Einsatz anderer, bekannter Indikatorsysterne für den Nachweis von Wasserstoffperoxid anstelle von o-Tolidin ist möglich·
Beispiel 3
Herstellung eines Testes mit Indikator-Signalzonen für den nachweis und die Bestimmung von Spuren Glukose im Harn bei Harnweginfekten und im Serum bzw· im Blut von Kindern, ohne Farbtafel und ohne Ablesezeitfestlegung, dargestellt in den Figuren 2 bis 4·
Es wird als Träger ein Filterpapier mit einem Flächen-
2 gewicht von 220 g/m verwendet«
Bemessungszone 2„
1. Zone, 10 mm breit ohne Präparation,
2# Zone, 10 mm breit mit einer Lösung von 0,05 g Kaliumpermanganat in 100 ml Wasser imprägniert·
Reaktionszone 3, 10 mm bi?eit
Imprägniert mit einem Lösungsgemisch von
a) 1 g Benzoesäure in 50 ml Äthanol,
b) 1 g Glukoseoxydase in 50 ml Wasser, entsprechend . 30 000 U.
Nachweiszone 4, 10 mm breit, im Anschluß an die Reaktions· zone 3.
Diese Zone wird mit einem Gemisch folgender Lösungen imprägniert: -
- η- 20 6 900
a) 200 mg Peroxydaae, entsprechend 6000 U, werden in 50 ml 0,2 mol Pufferlösung, pH 7,2 gelöst,
b) 1 g o-Tolidin
50 mg Orasolgelb werden in 50 ml Äthanol gelöst.
Die Lösungen der verschiedenen Zonen werden gleichzeitig oder nacheinander aufgetragen· Hach dem Trocknen werden etwa 2 mm breite Bänder von ca· 70 mm Länge geschnitten und diese in Kapillar-Röhrchen 6 eingeführt. Die Kapillar-Röhrchen 6 haben einen Innendurchmesser von 2,5 bis 3 mm· Sie sind so markiert, daß mit ihnen 40 (xl der zu untersuchenden Flüssigkeit aufgenommen werden können· Der Teststreifen 1 wird ein Stück über die Markierung 7 hochgezogen, die zu untersuchende Flüssigkeit aufgenommen und der Teststreifen 1 in diese eingeschoben. Wegen der Differenzierung sehr geringer Glukosemengen von physiologisch normalen Gehalten wird nur direkt mit der zu untersuchenden Flüssigkeit gearbeitet· Die Auswertung erfolgt mit Hilfe der Graduierung 8 auf dem Kapillar-Röhrchen 6.

Claims (2)

-is- 206 900 Erfindungsanspruch
1« Indikator-Röhrchen zur Glukosebestimmung, bestehend aus einem Teststreifen, der aus einer unbehandelten oder mit einem Farbstoff, Oxydations-, Fällungsoder Puffermittel imprägnierten Bemessungszone,* einer Reaktionszone und einer Hachweiszone aus einer oder mehreren streifenförmigen Indikator-Signalzonen von Peroxydase und Indikator im Wechsel mit unbehandelten Zwischenräumen aufgebaut ist und in einem markierten Kapillar-Röhrchen angeordnet ist, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionszone (3) aus einer in saurer Lösung unterhalb des isoelektrischen Punktes aufgetragenen fixierten Glukoseoxydase besteht,
2. Indikator-Röhrchen nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionszone (3) gegebenenfalls eine in an sich bekannter Weise immobilisierte Glukoseoxydase als Suspension enthält.
Hierzu 1 Seite Zeichnungen
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