DD145060A5 - Verfahren zur herstellung eines neuen glucosetoleranzfaktors - Google Patents

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DD145060A5 DD79214605A DD21460579A DD145060A5 DD 145060 A5 DD145060 A5 DD 145060A5 DD 79214605 A DD79214605 A DD 79214605A DD 21460579 A DD21460579 A DD 21460579A DD 145060 A5 DD145060 A5 DD 145060A5
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Description

Berlin,de1?.12,1979
W AO 5 -A- AP G0W214 6O5 8^ . 55 876 12
Verfahren zur Herstellung eines neuen Glucosetoleranzfaktors Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft einen neuen Glucosetoleranzfaktor und ein Verfahren zu. dessen Herstellung.
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen
Bei Ratten, die mit einer Mangeldiät, enthaltend Torulahefe, ernährt wurden, beobachtete Schroeder (1957)» daß eine solche Diät einen Mangel an Vitamin E, Selen und einer Substanz, die erforderlich ist, um Glucose zu metabolisieren (Glucosetoleransfaktor), und die deshalb ein Cofaktor für Insulin sein, würde, aber einen exogenen Ursprung hat (Nahrung), aufweist e
Schroeder selbst fand in Schweinenieren eine Substanz mit ' biologischer Glucosetoleranzfaktor-Aktivität* In Zusammenarbeit mit W, Mertz untersuchte er das Vorliegen des Glucosetoleranzfaktors (GTF) in verschiedenen Nahrungsmitteln und · stellte fest, daß viele Nahrungsmittel (sehr reine Kohlehydrate) eine Art von Fett-Diabetes, unabhängig von Insulin, hervorrufen, wahrend andere (Proteine) einen Schutz gegen solchen Diabetes zu verleihen schienen.
W. Mertz schloß daraus, daß eine der Komponenten von GTF ein Metall, nämlich Chrom, war und führte eine Reihe von Versuchen durch einschließlich unter Verwendung von 3-wertigem Chrom, wodurch eine deutliche Erhöhung der Atmung (nahezu 50 %) bei In-vitro-Versucheri festgestellt viurde, bei denen man GTF-Extrakte oder auch relativ hohe Konzentrationen an dreiwertigem Chrom, verwendete» Bei den Versuchstieren und auch bei Menschen verursachte die Verabreichung von Substan-
Γ; < -* O i? ·1 Α
2- Berlin,a.17.12.1979 55 876 12
zen, die reich an G-T? oder Cr4"1"4* waren, in einigen Fällen eine Korrektor der "Glucoseintoleranz", die Insulin allein nicht bewerkstelligen konnteβ Is wurde festgestellt, daß diese Art ües Diabetes aufgrund des Mangels an GTF ein Fett- oder Insulin-resistenterDiabetes war, bei welchem der begrenzende Faktor der genannte GTF ist.
gewann W. Mertz aus Brauereiliefe eine gelbliche Substanz mit piner GTF-Aktivität, die beträchtlicht höher war als die von metallischem Chrom und die, wie festgestellt wurde, dreiwertiges Chrom, Nikotinsäure und die Aminosäuren' Glycin* Glutaminsäure und Cystein enthielt. Der Erfinder nimmt an, daß das Chrom nicht physiologisch ist und daß dessen Vorkommen in Hefe GTF aus dem rostfreien Stahl (18/8) del Fermentationstank^ in denen die Kultivierung stattfindet, stammt, und daß ira allgemeinen die Wirkung des Chroms ergänzend oder vertretend für ein anderes biologisch aktives Metall ist, wie dies bei vielen enzymatischen Systemen festgestellt wurde, bei denen eine Aktivierung durch Magnesium zum Teil auch durch Mangan bewirkt werden kann. Somit erhob sich die Frage, welches das biologisch aktive Metall in GTF istc Der Erfinder nimmt an, daß es Kobalt"1"4" ist* Diese Annahme begründet sich wie folgt? " Trotz der Tatsache, daß Mertz 1969 feststellte, daß Kobalt, keine biologische Aktivität aufweists lagen doch Daten vor, die genau das Gegenteil zu bestätigen schienen^ wie die biologische Aktivität von Vitamin B 12 und die antidiabe-tische Aktivität in dem kobaltenthaltenden medizinischen Wasser von Caldas de Malaveila«, In sehr alten Literaturs tollen wird Kobalt als eine "hipoglucemisierende" oder antidiabetische Substanz angesehen und die sehr wichtigen Beobachtungen von Bertrand (1926, 1927» 1934) auf diesem Gebiet und die
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Feststellung, daß Kobalt in den Nieren vorkommt (nämlich bis zu 320 Mikrogramm pro Kilo frischer Niere) führt zu. der Annahme, daß Kobalt eine natürliche Komponente des von Schröder aus Schweinenieren gewonnenen GTF ist.
Einsichtlich der weiteren Komponenten von Mertz GTP schloß der Erfinder, daß Nikotinamid, eine.physiologische Substanz und Komponente von Coenzyme^viel eher zu erwarten war als Nikotinsäure,
Hinsichtlieh der dritten Komponente (Glycin^ Glutarsäure und Cystein)j gibt es in der Natur ein Peptid, welches diese Zusammensetzung-hat (Glutathion), nämlich ein Tripeptid mit einer gewissen biologischen Aktivität, durch welche eine bessere Glucosetoleranz bei ketotischen Patienten auf Kosten einer sehr großen Menge von Glutathion bewirkt wird«
In Wirklichkeit sind jedoch sowohl Kobalt und Nikotinamid oder Glutathion bei alleiniger Verabreichung nur als Vorläufer aktiv, und sie sind weder unmittelbar wirksam noch wirken sie als Antideabetika in solchen Dosen, bei denen GTF schon aktiv sein kann.
Im Falle von GTF ist die biologische Wirkung dieser Vorläufer ähnlich der der Komponenten von allen anderen Coenzymen, wobei die Unterschiede zu dem Endprodukt oder dem biologisch aktiven Molekül, wie einem Coenzym, die folgenden sinds
1) Die Vorläufer müssen in sehr großen Mengen verabreicht werden und ausreichend frühzeitigs damit das gesamte Molekül gebildet werden'kann;
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2) sie sind gewöhnlich nicht in in-vitro-biologischen Versuchen (einschließlich enzymatischen Versuchen) aktiv;
3) die biologische Langzeitaktivität (eine unmittelbare Aktivität liegt, wie gesagt, nicht vor) ist im Verhältnis zu den verabreichten Mengen sehr klein;
4) werden mehrere Vorläufer des gleichen Moleküls zusammen verabreicht^ so ist deren Wirkung im äußersten Falle additiv 8 wogegen im Falle des Endproduktes eine sehr große Wirkungssteigerung vorliegt;
5) in einigen Fällen (gewöhnlich mit Kobalt) wird einer der Vorläufer allein verhältnismäßig schlecht absorbiert*
In therapeutischen Substanzen werden tatsächlich viele Oligoelemente gewöhnlich in Form von organischen Komplexen verabreicht.
Im Gegensatz zu diesen biologischen Eigenschaften der Vorlaufer wurde nun gefunden, daß die Eigenschaften eines Coenzyms oder eines anderen organischen Biokatalysators (Endprodukt) wie folgt spezifiziert v/erden können^ Ein Endprodukt oder ein Gesamtmolekül eines Goenzyms oder eines organischen Biokatalysators ist dadurch gekennzeichnet, daß es
1) in sehr niedrigen Konzentrationen aktiv istj
2) daß auch bei Ia-vitro-Versuchen und enzymatischen Versuchen Aktivität vorliegtι
3) daß die Wirkung direkt einsetzt und dia Aktivität sehr hoch ist im Verhältnis sa den verwendeten geringen Mengen?
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4) zusätzlich zu der Wirkungssteigerung bei dem Endmolekül liegt in vielen Fällen eine außerordentlich spezifische Wirkung vorj
5) das Endprodukt kann im. allgemeinen parenteral verabreicht werden^und in vielen Fällen wird die Absorption einer Komponente ermöglicht, die als freies Element nicht zu beobachten ist j wobei bei einer oralen Verabreichung häufig einige Biokatalysatoren in ihre Ursprungskomponen« ten oder!in Zwischenverbindungen aufgespalten werden.
Ein sehr deutliches Beispiel in dieser Hinsicht ist die biologische Wirkung eines Coenzyme, wie Nikotinamidadenindinucleotid (NAD, DPN oder Coenzym 1); zusammen sind diese Komponenten (Adenylsäure, Nikotinamid und Phosphat) in enzymatischen Versuchen oder anderen In-vitro-Versuchen nicht aktiv, während !"±n vivo" eine erhebliche Menge in Milligramm erforderlich ist.(die im Falle von Nikotinamid zu einem erheblichen Maße als methyliertes Derivat ausgeschieden wird)^während, andererseits das Endprodukt, nämlich Coenzym 1 oder DPN (bzw* NAD) schon in Mengen von Bruchteilen eines Milligramms, die injiziert werden, eine therapeutische Wirkung aufweisen,. Noch deutlicher ist dieses Phänomen bei DPN und TPN (NAD und NADP), die sich nur in einem Molekül Phosphat unterscheiden, aber selektive Aktivatoren in unterschiedlichen enzymatischen Systemen darstellen.
Das gleiche trifft auch für Flavineoenzymj FMN und FAD und noch deutlicher mit Adenösinphosphaten zui ADP inhibiert Pyruvatcarboxylase?während ATP diese aktiviert, während umgekehrt ATP Pyruvatdehydrogenase inhibiert und ADP aktivierte Dieser Unterschied wird nur durch das in dem Molekül eingebrachte Phosphat bewirkt.
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Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines neuen Glucosetoleranzfaktors mit hoher Aktivität, auch in niedrigen Konzentrationen und spezifischer Wirkung, der oral verabreicht werden kann*
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, geeignete Komponenten aufzufinden und diese in geeigneter Weise zu einem hoch~ wirksamen Glucosetoleranzfaktor zu kombinieren*
Erfindungsgemäß wird ein Glucosetoleranzfaktor hergestellt, der aus einem stöchiometrischen Komplex aus einem Teil Kobalt, zwei Teilen Nikotinamid und einem Teil Glutathion mit einem Molekulargewicht oberhalb 5OO besteht.
Der neue Glue usetoleranzfaktor wird in der V/eise hergestellt, daß man ein Kobalt(II)Salz mit Nikotinamid unter Bildung eines Kobalt-Nikotinamid-Komplexes im stöchiometrischen Verhältnis von 1 s 2 umsetzt und in einer zweiten Stufe diesen Komplex mit reduziertem Glutathion unter Ausbildung des Glucosetoleranzfaktors umsetzte
Diese Synthese wird erfindungsgemäß mit den drei Komponenten des erfindungsgemäßen GTF bewirkt, welches
a) Kobalt 2*
b) Glutathion
c) Nikotinamid
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sind. Die Synthese findet nicht statt, wenn man nicht ein Zwischenprodukt bildet, das hier als AC bezeichnet wird, weil es einen Kobalt-Nikotinamid-Komplex darstellt. Dieser Komplex wurde mit großer Reinheit isoliert, er kristallisierte sehr gut und ist völlig verschieden von seinen Bestandteilen A + C. Zum Unterschied von den Kobaltsalzen (organisch oder anorganisch),' die als Ausgangsprodukte dientenf und die immer eine mehr oder weniger purpurrosa Farbe haben, hat der Kobalt-Nikotinamid-Komplex eine Lachsfarbe, die mehr oder weniger orange ist und ist deutlich unterscheidbar von den Kobaltsalzen« Das stöchiometrische Verhältnis ist ein Teil Kobalt auf zwei Teile Nikotinamid. Wird dieser Komplex (die Zwischenverbindung AC) hydrolysiert, so entstehen wieder die Ausgangskomponenten,und die rosa Färbung des Kobaltsalzes tritt wieder auf.
Es ist bemerkenswert, daß man das Endprodukt (GTF), nämlich die stabile braunfarbene Verbindung aus der Kobalt-Nikotinamid-Glutathion-Zusammensetzung nicht ohne die vorhergehende Stufe der Bildung der Kobalt-Nikotinamid-Verbindung (AC) in" Form eines lachsfarbenen Komplexes als Zwischenprodukt bilden kann, und daß es nicht möglich ist, das aktive Endprodukt bzw. Kobalt GTF (braun) aus den AB (Kobalt-Glutathion) oder den BC (Nikotinamid-Glutathion)-Komponenten zu erhalten und auch nicht.durch eine gemeinsame Umsetzung der drei Komponenten A + B + C (Kobalt + Glutathion + Nikotinamid). Das Verfahren zur Herstellung des Glucosetoleranzfaktors,(GTF) aus Kobalt entsprechend einer Zusammensetzung Kobalt 1, Nikotinamid 2, Glutathion 1, setzt die vorhergehende Stufe der Bildung des Zwischenproduktes, nämlich der lachsfarbenen Verbindung, die als AC bezeichnet wird, und die Zusammen« . setsung 1 Kobalt auf 2 Nikotinamid hat, als Komplex voraus·
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Es bleibt somit festzustellen, daß kein aktives Produkt erhalten wird aus Kobalt4"*"5", Nikotinsäure oder aus oxydiertem Glutathion« .
Der Komplex oder dessen Salze wird erhalten durch eine aligemeine Neutralisierungsreaktion eines Kobalt++-Salzes? das dann durch Nikotinamid ersetzt wird, Es ist möglich, von verschiedenen Kobaltsalzen (organischen, wie Acetaten, oder anorganischenj wie Sulfaten, Chloriden, Nitraten und dgl.) auszugehen^ und dies wird in der Praxis auch durchgeführt, $& nach dem Preis, der Zugängigkeit u. dgl* Die Bedingungen sind nicht identisch,aber sehr ähnlich und als allgemeine Regel gilt? daß ein Gewichtsteil Kobaltsalz in einer kleinen Menge Wasser gelöst wird, daß diese Lösung mit Alkali. ze3e in Form von konzentriertem Natriumhydroxid zu Beginn und mit verdünntem Ammoniak zum Schluß neutralisiert wird. Das Nikotinamid wird beim Neutralisieren des Kobaltsalses zugegeben,, wodurch das Kobalt mit Nikotinamid abgesättigt wird. Das optimale.Verhältnis ist zwei Äquivalente Nikotinamid auf 1 Äquivalent Kobalt, um das stöchiometrische Verhältnis von 1 : 2 zu erzielen» Der pH liegt dabei zwischen 5,5 und 7*5 » vorzugsweise bei 6?
Die unterschiedlichen Salze des Komplexes werden aus dem so gebildeten Komplex erhalten, was man durch die Farbänderung von dunkelrosa des Kobaltsalses zum lachsfarbenen Rosa des Komplexes feststellen kann* Die Salze werden durch sorgfältiges Ansäuern (Je nach dem gewünschten Anion) bis zu einem pE zwischen 495 und 6?5 'gebildet«
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Man erhält so orangefarbene Kristalle, die in ihrer Farbe sehr unterschiedlich sind von der Originalfarbe des ionischen Kobaltsalzes, entsprechend dem Salz des 1 ϊ 2 Kobalt-Nikotinamid-Komplexes. Diese Verbindung kann jetzt mit einer Lösung von reduziertem Glutathion im Verhältnis 1 : 1 umgesetzt werden, wobei man darauf achten muß, daß die Umsetzung langsam stattfindet, um dadurch die Stabilität des Komplexes zu erhöhen» Je nach der Art des Komplexes wird durch die Umsetzung der pH erheblich verändert. In dem Maße, wia die Umsetzung stattfindet, bildet sich die braune Farbe des Endproduktesj die sich deutlich von der Orangefarbe des Zwischenproduktes unterscheidet» Die Umsetzung wird fortgesetzt, bis die braune Farbe überwiegt, und man kann dann daraus schließen, daß die Umsetzung vollständig verlaufen ist. Aus der braunen Lösung kann man das Endprodukt in fester Form entweder durch Gefriertrocknung oder durch Ausfällen mit verschiedenen Volumina (wenigstens 2) Äthylalkohol gewinnen*
Das braunfarbene Endprodukt ist verhältnismäßig stabil,und zwar sowohl in Lösung als auch in fester Form im Bereich von physiologischen pH-Werten. Das Produkt ist vollständig in Wasser löslich.
Das Produkt ist biologisch aktiv, sowohl in "in vitro'1- " Systemen, wobei die Aktivität durch die Freigabe von radio-
1Zl
aktivem (X^'bestimmt wird, welches aus C-Glucose, die mit Fettzellen von Hatten Epiäidymis inkubiert wurde., bestimmt wird j sowie auch in Gegenwart von Insulin» Das neue Produkt ist auch im menschlichen Körper (in vivo) aktiv.
- 10 - Berlin,d.17.12.1979 55 876 12
Die Aktivität des neuen GTP ist proportional der Konzentration am Insulin bei einer optimalen Konsentration und ist nicht aktiv in Abwesenheit von Insulin.
In der nachfolgenden tabelle wird die Zusammensetzung des erfindungsgemäß durch chemische Synthese erhaltenen neuen GTF-Produktes mit dem Produkts daß von Vi. Mertz aus Brauerei· hefe erhalten wurde, verglichen«
Kobalt2* G.T.Fe, Chrom3* G.T.F.
(gemäß der Erfindung) * (W· Mertz)
1) Kobalt2* 1«) Chrom3*
2). Glutathion 2') Glycin
Cystein Glutaminsäure 3) Nikotinamid 3') Nikotinsäure
Das Chrom GTF gemäß Mertz scheint ein Kunstgriff zu sein, denn seine Wirkung ist bei s^hr hohen Konzentrationen verhältnismäßig schwachj und seine biologische Wirkung ist immer pro~ portional der Konzentration«Seine Wirkung erinnert an.die hixjögl uc emier ende Wirkung, die man mit sehr hohen Konzentrationen von Chrom, Kobalt, Nickel oder auch anorganischem Kupfer erzielt»und sein Mechanismus ist indirekt (enzymatisch^ Inhibierung) möglicherweise durch eine Übertragungswirkung des biologisch aktiven Produktes (Kobalt)*
11- Berlin,d.17.12.1979 55 876 12
Das erfindungsgemäße GTF (Kobalt) ist aktiv in vitro bei derartig niedrigen Konzentrationen, wie 4m χ 10°" , wobei das Optimum (bei sehr hohen Insulinkonzentrationen) etwas höher liegt; bei etwas höheren Konzentrationen inhibiert es;und seine Wirkung ist proportional der Insulinkonzentration^ wobei das GTF in Abwesenheit dieses Hormons inaktiv ist.
Das Molekulargewicht der aktiven Verbindung, bestimmt durch Gel-Teilung
(Polyacrylamid) entspricht einem Molekulargewicht
oberhalb 15Ö0, woraus man schließen kann, daß es nicht eine einfache Verbindung aus einem Teil Kobalt, zwei TeileiiHikotinamid und einem Teil Glutathion ist, sondern aus wenigstens zwei Molekülen besteht, oder sogar ein Tetrameres darstellt. Es hat daher eine sehr komplizierte Struktur?aber es ist eine genau definierte Verbindung mit einer sehr spezifischen biologischen Aktivität.
Trotz der Tatsache, daß die Nikotinamid-Kobalt-Komplexe einiger sowjetischer Autoren erhebliche Unterschiede zu dem· als Zwischenprodukt auftretenden Nikotinamid-Kobalt-Komplez der Erfindung zeigen, weil die Herstellung, die Farbe, die Stabilität und die Löslichkeit verschieden sind, liegt, keine ausreichende Sicherheit vor, daß der als Zwischenprodukt gebildete Mkotinamid-Kobalt-Komplex neu ist. Dagegen kann mit Bestimmtheit gesagt werden, daß der Endkoraplex aus Glutathion, Kobalt und Nikotinamid original und neu ist.
S1 -12- Berlin,d.17.12,1979
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Die Erfindung wird nachstehend an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert«
300 g Kobaltacetat wurden in 200 ml destilliertem Wasser bei 35 0C! gelöst jund mit dieser Lösung wurden bei 35 0C 250 g Nikotinamid umgesetzt* Der pH der Lösung wurde durch Zugabe von 2 ia einer KOH~Lösung bis zur Einstellung eines pH von nahe 6S5 reguliert? wobei die dunkelrosa Färbung in eine helle lachsrosa Färbung überginge Die Umsetzung wurde durch Erhitzen auf 80 0C weitergeführte Die hellrosa Suspension wurde mit 1 η HOl angesäuert bis zu. einem pH von 4j4-?und die entstehenden Kristalle mit einer hellorangenen Farbe wurden langsam abgetrennt. Diese Kristalle wurden langsam mit 300 reduzierten Glutathion bei einem pH von 497 umgesetzt, wobei die Mischung allmählich eine braune Farbe annahm, die. an Intensität zunahm, bis zu einer sehr intensiven Bratxnfärbung6 Eine Überwachung der Beendigung der Umsetzung war möglich einerseits durch die Stabilität der erwähnten intensiven braunen Färbung und andererseits durch das Fortfallen des charakteristischen unangenehmen Geruches von~ Glutathion (ein Geruch $ der an Küken erinnert)« Hach dem Ausfrieren wurde das Endprodukt durch Lyophyllisierung gewonnene
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Biologischer Test
Die trockene GTF-Verbindung wurde nach der Robdell-Methode getestet; Fettzellen der Bpididymides von Sprague-Ratten
14
wurden in Gegenwart von Insulin mit C-Glukose bei einer Konzentration in der Nähe von 5 m χ 10 GTF inokulierte Die Entwicklung von COp wurde mit einem ß-Zähler gemessen« Es wurde festgestellt, daß die durch GTF gebildete Stimulierung eine Erhöhung von nahezu 450 % der Insulinwirkung ergäbe Weiterhin wurde festgestellt daß GTF nicht aktiv war, wenn Insulin nicht vorhanden ist»

Claims (6)

Berlin,d,17.12.i979 35 8?6 12
1, Verfahren zur Herstellung eines neuen Glucosetoleranzfaktorsj. bestehend aus einem stöchiometrischen Komplex aus einem Teil Kobalt, zwei Teilen Nikotinamid und einem Teil Glutathion mit einem Molekulargewicht oberhalb 1500s gekennzeichnet dadurch? daß man/ ein Kobait(II)sals mit Nikotinamid unter Eildung eines Kobalt-Hikotinamid-Kom-» plexes im stöchiometrischen Verhältnis von 1 % 2 umsetzt und in einer z-weiten Stufe diesen Komplex mit reduziertem Glutathion unter Ausbildung des Glucosetoleranzfaktors umsetzte
2«, Verfahren gemäß Punkt 1* gekennzeichnet dadurch, daß man als Kobaltsalz ein anorganisches oder organisches Salz verwendete ·
3* Verfahren gemäß Punkt 1 oder 2, gekennzeichnet dadurchs daß der als Zwischenprodukt gebildete Kobalt-Nikotinamid-Komplex durch Neutralisieren des Kobaltsalzes mit Alkali und anschließender Sättigung mit Nikotinamid gebildet wird9 wobei das Verhältnis wenigstens zwei Äquivalente Nikotinamid pro einem Äquivalent Kobalt beträgt und der pH 5$5 bis 7j5 (ift Abhängigkeit.von dem verwendeten Kobaltsalz)s vorzugsweise 6?5 beträgt» '
4* Verfahren nach Punkt 1 bis 3$ gekennzeichnet dadurch f daß der Komplex in Form von verschiedenen Salzen durch Ansäuern mit den entsprechenden Säuren auf einen pH zwischen 6S5? vorzugsweise 6$ gebildet, wird».
§ - 15 - Berlin,d. 17· 1-2.1979
55 8?6 12
5. Verfahren gemäß Punkt 1 bis 4, gekennzeichnet dadurch, daß der als Zvaschenprodiikt gebildete Komplex bei Raumtemperatur (20 0C) bis 80 0Cj vorzugsweise bei 50 0G gebildet wird, und daß die Umsetzung des gebildeten Komplexes mit Glutathion auf einen pH zwischen 4 und 6, in Abhängigkeit von dem als Zwischenprodukt verwendeten Komplexsalz durchgeführt wird.
6. Verfahren nach den vorhergehenden Punkten, gekennzeichnet dadurch, daß die Umsetzung mit Glutathion mit dem Kobalt-Kfikotinamid-Komplex, der in.einer beliebigen Form vorliegen kann, durchgeführt wird.
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