DD145755A1 - Isolierungsverfahren fuer spezifische hla-antikoerper - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Isolierungsverfahren für HLA-Antikörper durch Affinitätschromatographie mit HLA-Antigenen aus Urin. Erfindungsgemäß werden aus humanem Urin nach Präzipitation mit Ammoniumsulfat und Konzentrierung durch Ultrafiltrarion sowie nachfolgende Ionenaustausch- und Gelchromatographie HLA-Antigene gewonnen. Die isolierten HLA-Antigene werden mittels Glutardialdehyd an eine Polyacrylamid-Agarose-Copolymer gebunden, welches nachfolgend zur Affinitätschromatographie mit einem Antiserum beladen und mit PBS- und HCL-Glycin-Puffer eluiert wird. Die hergestellte Präparation kann sowohl für diagnostische Zwecke (HLA-Serologie) als auch für therapeutische Zwecke (Vermeidung der Transplantatabstoßung) verwendet werden.
Description
Dr0 W. Schößler
Isolierungsverfahren für spezifische HLA-Antikörper
Anwen d ungs g_e bi_et_ der Er f i η dang .
Die Erfindung betrifft ein Isolierungsverfahren für spezifische HLA-Antikörper aus humanem Antiserum0 Anwendung findet das Verfahren in der pharmazeutischen Industrie und in der Medizin. . . .
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen Für die Abstoßung von.Transplantaten, die xenogen oder allogen übertragen werden, sind die HLA-(Human Leukocyte Antigen) Antigene verantwortlich. Heben anderen diskutierten Llöglichkeiten der Vermeidung der Transplantatabstofiung, die bisher noch nicht praktisch angewendet wurden, kommt dem Einsatz von HLA-Antikörpern unter- Nutzung des immunologischen Enhancements (spezifische Immunsupression durch spezifische Antikörper) unter Umständen große Bedeutung zuo Alle bisherigen Versuche, HLA-Antikörper mit den gebräuchli-r chen physikochemischen Methoden zu separieren und isolieren, scheiterten, da die HLA-Antikörper vom IgG-Typ sind und sich deshalb bei Einsatz dieser Methoden wie alle im Serum vorhandenen IgG-IvIoIeküle verhalten.
Die Isolierung von spezifischen HLA-Antikörpern ist in der Literatur noch nicht beschrieben.
Ziel der Erfindung . .
Das Ziel der Erfindung besteht darin, eine Präparation- bereitzustellen, die sowohl für diagnostische Zwecke (HLA-Serologie) als auch therapeutische Zwecke (Vermeidung der Transplantatabstoßung) eingesetzt werden kann» Die Erfindung hat
91 5 I
die Aufgabe, ein Isolierungsverfahren für diese, die HLA-Antikörper-enthaltende Präparation zu entwickeln.
Darlegung des Wesens der Erfindung ;
Erfindungsgemäß werden aus humanem Urin nach Präzipitation "bei 80 /oiger Sättigung mit Ammoniumsulfat und nachfolgende Dialyse und Ultrafiltration mit einer SM 12136 Membran sowie Ionenaustauschchromatographie an DEAE-Cellulose mit Trisphosphat-Puffer.steigender Ionenstärke (pH= 8,4) und Gelchromatographie an Sephadex-G .1 00 mit Irisphosphat-Puffer (pH =8?4) HLA-Antigene gewonnen. Besonders vorteilhaft ist der Einsatz von Urin von Patienten mit einer tubularen Proteinurie, da darin die HLA-Antigene angereichert sindo Die isolierten HLA-Antigene werden im folgenden mit 10 %igem Glutardialdehyd in 0,1 m Phosphat-Puffer.(pH = 7,2) an ein Polyacrylamid-Agarose-Copolymer gebunden. Nach Prüfung der Binduhgsfestigkeit der Antigene und Bestimmung der an der Matrix gebundenen Proteinmenge wird das Gel in eine Säule gegeben und mit einem Antiserum beladen. Anschließend werden die nicht oder unspezifisch gebundenen Proteine des Antiserums mit PBS-Puffer (pH = 7,4, 40C) eluiert und schließlich., die Antigen-Antikörper-Komplexe mit HCl-Glycin-Puffer (pH=2,8 und 2,2 bei 40C) gespalten. Nach sofortiger Neutralisation und Dialyse gegen PBS-Puffer werden die Antikörper-haltigen Fraktionen durch Ultrafiltration konzentriert und serologisch getestet.
Die erfindungsgemäß hergestellte Präparation kann für diagnostische Zwecke (HLA-Serologie) in der Transplantationsimmunologie, Gerichtsmedizin und dergleichen-sowie für therapeutische Zwecke - der Vermeidung der Transplantatabstoßung - eingesetzt werden«
AuBführungsbeispiel ' · .
Aus 8,5 1 Urin eines iJierentransplantierten mit einer tubulären Proteinurie (Gesamteiweiß· 3,8 g/l) wurden die HLA-Antigene A 1, A 2, B 8, B 17 isoliert. Die antigenen Aktivitäten in den verschiedenen Reinigungsschritten werden mit dem Lymphocytotox-Inhibitions-Test bestimmt«, ' .-. .
Der Urin, der bis zur Verarbeitung. "bei 4 C in Anwesenheit von 0,02 % Natriurnazid aufbewahrt wird,· wird durch Zugabe von Ammoniumsulfat bis zur Sättigung von 30 % konzentriert. Das durch Zentrifugation bei 5 000 g in 20 min„ gewonnene Präzipitat wird in 0,01 m ..Phosphat-Puff er mit 0,15 m IaCl (PBS-Puffer) (pH = 7)2) suspendiert und.gegen diesen Puffer erschöpfend dialysierto Anschließend erfolgt eine etwa.10 fache Konzentrierung durch Ultrafiltration mit.einer SM 1213ο-Membran auf eine Proteinkonzentration von 31 g/l· Die weitere Reinigung erfolgt durch lonenaustauschchromatographie an DEAE-Cellulose mit 0,005 m Phosphat-Puffer mit 0,04 m Tris (pH = 8,4) [V" (Durchflußgeschwindigkeit 3 ml/
2 cm "h) bei Anwendung eines kontinuierlichen Ionenstärkegradienten bei gleichzeitiger on-line~Konzentrierung ririt einer Diaflo-pM 10-Hembrano Die die HLA-Antigene enthaltenden Fraktionen werden erst bei hohen lonenstärken eluiert und sind 'weitgehend frei von Begleitproteinen. Die Prüfung auf Reinheit, erfolgt mit der Immunelektrophorese und Disk-Slektrophorese».
Als nächster Schritt erfolgt eine Gelchromatographie an Sephadex G 100 in.0,5 m Tris-Phosphat-Puffer (pH.=.8,4) (Bettvolumen: 314 ml, Probevolumen: 5S5 ml, Durchflußgeschwindigkeit: 5 »5 ml /cm h, on-line Konzentrierung mit PM 10-Ivlembran Ca0 1 : 4)« Die niedermolekulare Fraktion enthält die.KLA-Antigene, die geringfügig mit Albumin kontaminiert sinde Die Ausbeute beträgt 200 - 300 /Ug HLA-Antigene. Nach Dialyse gegen 0,1 m Phosphat-Puffer (pH = .7,2) werden die HLA-Antigene an ein Polyacrylamid-Agarose-Oopolymer (Ultrogel AcA 34) gebunden. Hierzu wird das Gel (20 ml) ausreichend mit-Wasser gewaschen bis keine UY-Absorption bei-280 nm sichtbar ist und mit 10 % Glutaraldehyd in 80 ml 0,1 m Phosphat-Puffer (pH - 7,2) (0,02 % HaIT3) 24 h bei 370C aktiviert und anschließend erschöpfend gewaschen«, Die Bindung der HLA-Antigene an das aktivierte Gel erfolgt unter.vorsichtigem Rühren 16 Ii bei 4°0 und 4 h bei Raumtemperatur. Eine nachfolgende Proteinbestimmung im Überstand erlaubt eine Berechnung der gebundenen Antigenmenge« Nach einem
erneuten Waschen mit PBS-Puffer (pH =7,4) (UV-Absorption = 0).werden die freien Aldehydgruppen :des aktivierten Geles mit O5Vm Lysin-Lösung pH '= 7,4 blockiert* Nach einem weiteren Waschvorgang mit PBS-Puffer erfolgt eine Prüfung der Bindungsfestigkeit der gebundenen HLA-Antigene mit 0,2 m HCl-Glycin-Puffer pH = 2,8 mit nachfolgendern Itfeutralisations-(1m KgHPO^-Iösung) und Waschvorgang (PBS-Puffer). Eine Eiweißbestimmung in der Waschlösung gibt .Auskunft über die an der Matrix fest gebundene Antigenmengeo Nunmehr wird das Gel in eine Säule (Länge: 30.mm, Durchmesser: 9 mm) gegeben und mit PBS-Puffer (pH = 7,4) äquilibriert, Bei Raumtemperatur werden 5 ml Antiserum, das die Antikörper B 5 und B 8 enthält, aufgetragen« Nach Eindringen des Antiserums in das Gel wird der Ausgang der Säule für 2 Stunden geschlossen«
Die nachfolgende Elutionder nicht oder unspezifisch gebundenen Proteine des Antiserums erfolgt bei 4 G mit kaltem PBSt Puffer (pH = 7,4, Durchflußgeschwindigkeit: 3-5 ml/cm2h). Wenn das Eluat keine UV-Absorption bei 280 nm mehr zeigt, erfolgt die Spaltung der gebildeten Äntigen-Antikörper-Komplexe und Elution mit 0,2 m HCl-Glycin-Puffer pH = 2,8 und pH = 2,2 bei 4 C unter kontinuierlicher Konzentrierung mit einer . Diaflo-Hvl .10-Membran. Die Fraktionen werden sofort mit 0,2 m KpHPO, neutralisiert, gegen PBS-Puffer dialysiert und durch Ultrafiltration mit Kollodiumhülsen konzentriert»
• 51 Die serologische Testung erfolgt mit der Cr-release-Techniko.Wahrend der B 5-Antikörper durch den PBS-Puffer eluiert wird, da das Antigen B 5 nicht vorhanden ist, erfolgt die Elution des B 8-Antikörpers anschließend durch den HCl-GIycin-Puffero Die Protein-Konzentrationen von den B 8-Praktionen betrugen 170 mg/1 und 90 mg/lo Somit erfolgt durch das erfindungsgemäße Verfahren eine 400 - 80Ofache Anreicherung der HLA-Antikörper entsprechend humanem Serum (Gesamteiweiß etwa 70 g/l) ο ' .' . ·
Claims (2)
1.-Verfahren zur Isolierung von HLA-Antikörpern, dadurch gekennzeichnet, daß aus humanem Urin nach Präzipitation mit Ammoniumsulfat und Konzentrierung durch Ultrafiltration 'sowie, nachfolgende Ionenaustausch- und Gelchromatographie isolierte HLA-Antigene an eine Matrix gebunden und die
HLA-Antikörper durch nachfolgende Affinitätschrornatogrä-. phie aus humanem HLA-Antiserum isoliert'werden, Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnets daß die Isolierung der HLA-Antigene durch Präzipitation bei 80 /Siger Sättigung mit Ammoniumsulfat erfolgt und nach anschließender Dialyse durch Ultrafiltration mit einer SM 1213δ Membran, lorienaustauschchromatographie an DEAE-CeI-lulosernit Tris-Piiosphat-Puffer steigender Ionenstärke pH = 8,4 und Gelchromatographie an Sephadez G 100 mit . Tris-Phosphat-Puffer pH = 8S4 gereinigt wirdo .
3ο Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die
isolierten HLA-Antigene mittels Glutardialdehyd an ein Po-. lyacrylamid-Agarose-Copolyraer gebunden werden,,
4. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Affinitätschromatographie die mit HLA-Antigenen beladene Polyacrylamid-Agarose-Copolynier-Säule, äquilibriert mit PBS-Puffer, mit einem HLA-Antiserum beladen und anschließend mit PBS-Puffer und HCl-Glycin-Puffer eluiert und-das Eluat anschließend neutralisiert, dialysiert und konzentriert wird β
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0550482A4 (en) * | 1990-08-30 | 1994-05-18 | Gen Hospital Corp | Methods for inhibiting rejection of transplanted tissue |
| EP0763203A4 (de) * | 1994-05-24 | 1998-12-09 | Sangstat Medical Corp | Verbesserte bestimmung der transplantat-annahmebereitschaft |
-
1979
- 1979-08-27 DD DD21519979A patent/DD145755A1/de not_active IP Right Cessation
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