DD149861A3 - Verfahren zur trennung bzw.reinigung von proteinen - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Trennung bzw. Reinigung von Proteinen, vorzugsweise Haemoproteinen. Das Verfahren ist in der chemischen, pharmazeutischen und biochemischen Industrie sowie in der klinischen Chemie, der Analytik und der Diagnostik einsetzbar. Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein einfaches, praeparativ und analytisch einsetzbares Verfahren zur Trennung bzw. Reinigung von Proteinen zu finden. Ihr liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren auf der Basis der Affinitaetschromatographie zu entwickeln. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dasz eine proteinhaltige Loesung mit Imidazol oder einem Imidazolderivat, das an einen wasserunloeslichen makromolekularen Traeger gebunden ist, in Kontakt gebracht wird und die in der Loesung oder am Traeger befindlichen Proteine, gegebenenfalls nach Abtrennung des Traegers, isoliert werden. Traeger und proteinhaltige Loesung werden bei pH 7 bis 11, gegebenenfalls in Gegenwart von Detergentien u/o Glycerin, bei Temperaturen von 0 bis 30 Grad nach dem Batch-Verfahren oder nach dem Saeulenverfahren in Kontakt gebracht. Es werden gute Trenn- und Reinigungseffekte erzielt; Beispiele sind die Trennung Haemoglobin/Myoglobin und Cytochrom P450/Cytochrom P420.
Description
"Verfahren zur Trennung bzw. Reinigung von Hämoproteinen"
Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Trennung bzw» Reinigung von Hämoproteinen. Das Verfahren ist in der chemischen, pharmazeutischen und biochemischen Industrie, ze B« zur Abtrennung von Hämoglobin aus biologischem Material sowie in der klinischen Chemie, der Analytik und der Diagnostik einsetzbar0
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen Für die Trennung bzw« Reinigung von Proteinen werden verschiedene Methoden eingesetzt, die die Unterschiede in den physikalischen und biochemischen Eigenschaften der zu trennenden Proteine ausnutzen, wie löslichkeit, Stabilität, Molekülgröße, elektrische Ladung usw«/No REHFELD, D. REICHELT: Analytische und präparative Methoden der Klinischen Biochemie, Akad. Verlag Berlin 1972, S6 SCHWIMIiER und A. B, PARDEE: AdVe in Enzymology 1J;» 375./
Zum Beispiel kann die Entfernung von Hämoglobin aus Blutplasma durch Extraktion mit Chloroform (Tscheche Pat· 88563 / 1959/) oder durch Fällen mit Zn-Salzen (Vox sango 2^9 481 / 1972/) durchgeführt werden« Mehrmals wurde die Anwendung von Zelluloseionenaustauschern (z„ Be DEAE-, CM-Zellulose in Vox Sang« Hi 59 /1967/) und Polysaccharidderivaten (z. B. DEAE-, CM-Sephadex in Vox Sang« ,2J3, 18 /1972/) beschrieben« Die Verfahren sind Z0 T» sehr zeit- und materialaufwendig, und eine ausreichende Reinheit ist häufig nur unter hohen Ausbeuteverlusten zu erzielen,.
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Pur die Isolierung und Reinigung von Proteinen gewinnen in der letzten Zeit Verfahren der Affinitätschromatographie steigende Bedeutung, die auf der spezifischen tooaffinen Komplexbildung der Proteine beruhen,»
So ist Zo B. die Abtrennung von Hämoglobin (Hb) auf der Grundlage der Komplexbildung mit Haptoglobin AU KLEHT und C, MIHAESGO: Biochenu biophys» Res. Commun. ££, 774 (1973)/ beschrieben worden» Bei diesem Verfahren kann jedoch nur das Hb entfernt werden^ das nicht mehr vom Haptoglobin im Serum durch Komplexbildung gebunden worden ist.
Das Ziel der Erfindung besteht darins ein einfaches und allgemein anwendbares Verfahren zur Trennung bzw. Reinigung von Proteinen, vorzugsweise Hämoproteinen, zu finden. Es soll analytisch und präparativ einsetzbar sein und gute Ausbeuten erreichen«
Darlegung des Wesens der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde^ die spezifische bioaffine Komplexbildung der Proteine zu Imidazo! bzwe seinen Derivaten auszunutzen und ein geeignetes Trennverfahren auf der Basis der Affinitätschromatographie zu entwickeln» Erfindungsgemäß werden Hämoproteine getrennt bzw« gereinigt, indem eine hämoproteinhaltige lösung mit Imidazol oder einem Imidazolderivat t das an einen v/asserunlöslichen makromolekularen Träger gebunden ist, in Kontakt gebracht wird, die danach in der Lösung verbleibenden oder am Träger befindlichen Hämoproteine isoliert werden und danach ggf«. eine Regenerierung des Trägers erfolgt«. Als wasserunlösliche makromolekulare Träger dienen Biopolymere, vorzugsweise Polysaccharide oder synthetische Makromoleküle, vorzugsweise Kopolymer!sate auf der Basis der Methakrylsäureester, Das Imidazol oder sein Derivat ist direkt oder unter Zwischenschaltung von Spacern an den Träger gebunden« Anknüpfungsstellen sind der Ringstickstoff in 1-Stellung oder der
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Ringkohlenstoff in 2- oder 4 (5)-Stellung des Imidazolrings. Die Realisierbarkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens ist insofern überraschend, da das Iraidazol bzw« seine Derivate keine physiologische Komplexpartner für Hämoproteine sind0 Die aus der Literatur bekannten'Stabilitätskonstanten, z» B. des Hämoglobin-Imidazöl-Komplexes, liegen an der internen Grenze, die für eine Affinitätschromatographie gefordert werden. Die Bildung und Stabilität dieser Komplexe hängt also weitgehend von der Natur der dem Eisen-protoporphyrin IX umgebenden Proteintasche abo
Hierbei kam es darauf an, daß die Trägerfixierung des Imidazole bzw, seiner Derivate und die unspezifischen (hydrophoben) Wechselwirkungen des Trägermaterials mit dem Hämoprotein einen positiven Einfluß auf die Komplexbildung und Selektivität haben»
Die Herstellung dieser imidazölhaltigen Träger (IMD-Träger) erfolgt nach an sich bekannten Verfahren, Zur Realisierung der Erfindung sind die in WP 124 405 (M. Benes, Me Kühn, K. Pommerening) vorgeschlagenen IMD-Träger generell einsetzbar. Die hämoproteinhaltige Lösung wird bei pH 7 - 10, gegebenenfalls in Anwesenheit von Detergentien und/oder Glycerin, bei Temperaturen von 4 - 3O0C mit dem Träger in Kontakt gebrachte Im Falle der Abtrennung von Hämoglobin kann die Kontaktnahme auch bei geringfügig höherer Temperatur (bis 400C) erfolgen. Hierfür gibt es 2 Möglichkeiten: ;
a) Der Träger wird in die hämoproteinhaltige Lösung eingetragen und nach der für die Adsorption notwendigen Zeit, etwa 1 bis 24 Stunden durch Filtration wieder abgetrennt (Eintopfoder Batchverfahren)»
b) Der Träger befindet sich in einer Säule, auf die die proteinhalt ige Lösung aufgebracht wird (Säulenverfahren),
Das Batchverfahren wird besonders vorteilhaft für Reinigungsoperationen eingesetzt, d0 he bei der Abtrennung von Verunreinigungen«, Das Säulenverfahren wird besonders vorteilhaft für Trennoperationen eingesetzt, wenn die Proteine unterschiedlich stark
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aber nicht zu fest an den Träger gebunden werden. Die proteinhaltige Lösung wird bei einem pH von 7 bis 10, gegebenenfalls in Anwesenheit von Detergentien und/oder Glyzerin, bei Temperaturen von 4 - 300C, vorzugsweise bei Raumtemperatur, auf die Säule aufgebracht. Anschließend wird eluiert, wobei die Hämoproteine auf Grund der unterschiedlich festen Bindung zum Träger nacheinander in der Elutionsflüssigkeit erscheinen«, Die entsprechenden Fraktionen werden aufgefangen und die Isolierung des enthaltenen reinen Hämoproteins in an sich bekannter Weise durchgeführt«
Die IMD-Träger können nach ihrer Regenerierung .wiederholt eingesetzt werden«» Die Regenerierung erfolgt vorzugsweise durch Behandlung mit Harnstoff und einem Gemisch Pyridin/LTatronlaugej gegebenenfalls unter Zusatz von Dithionit oder durch pH-Änderung des Elutionspuffers· Das erfindungsgemäße Verfahren ist einfach durchzuführen und hat den Vorteil allgemeiner Anwendbarkeit« Die zu trennenden bzw* zu reinigenden Hämoproteine werden mit guten Ausbeuten und in hoher Reinheit erhalten. So wurde z« B. aus einem Hämoglobin AIyoglobin-Gemisch mit dem Säulenverfahren das Myoglobin chromatographisch rein in über 90 folger Ausbeute isoliert» Aus einem Zytochrom P-450/Zytochrom P-420-Gemisch wurde mit dem Batch-Verfahren Zytochrom P-420 bis 85 % des Ausgangswertes entfernte Vorteilhaft läßt sich das Verfahren auch für die Abtrennung von Hämoglobin aus biologischen Materialien (zo B0 hämolytischen Seren) anwenden. Je nach Verfahrensbedingungen werden dabei 40 - 100 % des vorhandenen Hämoglobins entfernt.
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Die Erfindung soll an einigen Beispielen erläutert werden, die jedoch die Erfindung nicht einschränken«
AusfUhrungsbeispiele · .
Beispiel 1111
1 g bzw«' 2 g des makroporösen IMD-Trägers mit Strulctureinheit
der allgemeinen Formel I (siehe Anlage)
(n = 1j2), hergestellt nach YvT 124 405, werden in Äthanol gequollenj mit Wasser und 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7, gewaschen
und in eine Säule gefüllt»
1 ml einer O?53 mVal/1 Met Hb (Mensch)-Lösung^, pH-7, wird auf die Säule gegeben und anschließend mit dem Phosphatpuffer eluierte Die Konzentrationsbestimmung im Eluat ergibt eine
Bindung des Hb an der Säule von 64 - 74 %o
(MetHb,= Methämoglobinj das Fe liegt im 3-wertigen Valenzzustand vor, Die Konzentrationsangaben beziehen sich immer auf das Fe (1 Mol = 4 Val/1),
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Die Bestimmung der Hb-Konzentration erfolgt über den CN-Komplex mit £' nm = 11 (bezogen auf Pe). Die Bindung des Hb und
der anderen Proteine an den Träger kann auch aus der Differenz der Absorption der Ausgangslösung und des Eluats bei 279 nm und/oder der Soretbande bestimmt werden. Innerhalb der Fehlergrenze ergeben die einzelnen Methoden übereinstimmende Werte. Beim Batch-Verfahreη (5 ml 0,1" mVal/1 MetHb-Lösung, 2 Stunden Inkubation bei .Raumtemperatur) werden bis zu 72% des angebotenen MetHb gebunden, ·
300 mg bzw, 750 mg I (η = 1,2) werden analog Beispiel 1 vorbehandelt und mit einem Puffer pH 9 (0,1 M NaHCO3-, 0,5 M NaCl) gewaschen. 5 ml einer 0,1 rnVal/l MetHb (Mensch)-Lösung im gleichen Puffer werden bei Raumtemperatur 3,5 Stunden im Kreislauf über die Säule gepumpt. Hierbei werden 77-80% des Hb gebunden.
Beispiel 3 ,
2 g NHg-gruppenhaltige Agarose (AH-Sepharöse) werden nach dem Quellen und Waschen mit einer 0,5 M NaCl-Lösung in 16 ml der NaClJ-Lösung suspendiert und 3,2 ml einer 25%igen Glutaraldehyd-Lösung zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird 3 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Nach dem Waschen mit der 0,5 M NaCl-Lösung und Umpuffern auf pH. 9 (0,1 M NaHCO35 0,5 M NaCl) wird der Träger mit 16 ml einer 0,05 M Histamin-Losung in dem Puffer pH 9 3 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt.
-R Π Γ 7 IQ 7 7 .· K Ί K\ O / '"
194 299
Nach dem Waschen und Umpuffern auf pH 8 werden die überschüssigen Aldehydgruppen durch Umsetzung mit 16 ml einer 1 M Athanolamin-Lösung, pH 8, blockiert.
5 ml einer 0,43 mVal/l MetHb'-Lösung im Puffer, pH S1 werden 2 Stunden bei Raumtemperatur mit dem IMD-Träger geschüttelt. Nach Abtrennen des Trägers sind 100% des angebotenen Hb adsorptiv am Träger gebunden,
Zu 1 g bzw«, 2 g analog Beispiel 1 ν or behände Item I (n = 2) werden 2,5 ml einer Lösung gegeben, die im Puffer pH 9
(HemcM (0,1 M NaHGO3, 0,5 M NaCl) 0,04 mVal/1 MetHt/und 0,0LmM
Humanserumalbumin (HSA) enthält. Unter ständiger Durchmischung (Rühren, Schütteln, Rotieren) wird die Lösung 2 Stunden bei Raumtemperatur mit dem IMD-Träger in Kontakt gebracht,, Nach Abtrennen des Trägers sind 80-90% des MetHb und nur 9-11% des HSA gebunden.
Die Konzentrationsbestimmung des HSA erfolgt^ mit einem Extinktionskoeffisienten £ ·\α = 7,15, das Molekulargewicht wird mit 66500 angenommen. Die Bindung des HSA an den Träger wird aus der UV-Absorption bei 279 nm unter Berücksichtigung der Hb-Absorption ermittelt»
Der makroporöse IMD-Träger der allgemeinen Formel I (n = 1, 300 mg; η = 2, 450 mg; η = 3, 550 mg) wird in einer Säule mit 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,3, der 0,3% Na-dodezylsulfat enthält, gewaschen. 1 ml eines Gemisches aus 1 Teil 0,53 mVal/l MetHb'- und 1 Teil 0,12 mM HSA-Lösung wird auf die Säule gegeben und mit dem Na-dodezylsulfat enthaltenden Puffer eluierte Über 90% des MetHb werden an den IMD-Träger gebunden»
--6.0lZ.137 7 M) 7 !)i) V;;
-β- 19A299
Vollserum (Mensch) wird durch Zugabe von MetHb hämolytisch gemacht (0,4-2,9 mVal/1 MetHb) und mit 0,1 M NaHCO3-Puffer, pH 9-9,5, der 0,5 M KaCl enthält, verdünnt (1:10 - 1:11). 2,5 ml dieses hämolytischen Serums werden mit 500 mg des analog Beispiel 1 vorbehandelten I (n = 1,2) entweder 24 Stunden bei 4 C oder 2 Stunden bei Raumtemperatur unter ständiger Durchmischung in Eontakt gebracht. Nach Abtrennen des IMD-Trägers sind 39-59% des MetHb gebunden» Das Serum wird sofort gegen 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7, dialysiert und durch Ultrafiltration konzentriert*
Vollserum (Mensch) wird durch Zugabe von MetHb hämolytisch gemacht (0,4-3 mVal/1 MetHb) und mit 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,3, der 0,3% Na-dodezylsulfat enthält, verdünnt (1:10-1:11).
2^5 ml dieses Serums werden mit 500 mg I (n = 1,2) 2 Stunden bei Raumtemperatur und ständiger Durchmischung in Kontakt gebrachte Nach Abtrennen des IMD-Trägers sind 90-100% des MetHb gebunden. Das Serum wird sofort analog Beispiel 6 dialysiert und konzentriert«
2 g makroporöses Poly-glykolmethakrylat (Spheron 1000) werden nach bekannten Verfahren mit 400 mg BrCN aktiviert» Der aktivierte Träger wird bei pH 9$5 mit ,y^Mol Histamin umgesetzt. Die Desaktivierung der nicht umgesetzten Gruppen des Trägers erfolgt mit 5 ml einer 1 M Äthanolamin-Lösung, pH 8« Hämolytisches Vollserum (0,5 mVal/1 MetHb) wird analog Beispiel 7 verdünnt« 5 ml des Serums werden analog Beispiel 7 mit dem IMD-Träger in Kontakt gebracht. 65-78% des MetHb werden an den Träger gebunden©
"ι 7 -v Ii 7<) l)V #x
ϊ 9 4 2 9 9-
3,0 g IMD-Träger mit der Struktureinheit der allgemeinen Formel I (n = 1,2) werden in einer Säule bei Raumtemperatur mit 0,1 M Puffer f?H 8 äquilibriert« 1 ml eines Gemisches aus Hämoglobin(Rind)/Myoglobin(Rind) (Hämoproteinkonzentration 0,4 - 0,5 m Val/l) wird auf die Säule gegeben und anschließend mit dem Puffer pH 8 über einen Fraktionssammler eluiert«, Die gelchromatographische Untersuchung der proteinhaltigeη Fraktionen zeigt, daß beim Einsatz des IMD-Trägers (n = 2) rdines Myoglöbin eluiert wird und im Falle η = 1 das Myo-. globin im Vergleich zum Hämoglobin stark angereichert ist»
Beispiel 10
10-11 ml gequollener IMD-Träger mit der Struktureinheit der allgemeinen Formel II (siehe Anlage) werden in einer Säule bei Raumtemperatur oder 40C mit 0,1 M Puffer pH 8 äquiiibriert. 1 ml eines Gemisches aus Hämoglobin/Myoglobin (Rind) (Konzentration je Hämoprotein) wird auf die Säule gegeben und 0,25 m Val/l anschließend mit dem pH 8 Puffer über einen Fraktionssammler eluiert.
Im Eluat werden über 90% des Myoglobins in gelchromatographisch reiner Form zurückgewonnen. Das Hämoglobin wird entweder vollständig an dem Träger adsorbiert (Raumtemperatur) oder erst bei sehr hohen Volumina teilweise eluiert.
100 mg bzw. 1 ml gequollener IMD-Träger' der allgemeinen Formel I und II werden mit 0,1 M Phosphat-Puffer pH 7,25, 20% Glyzerin, 1(2) mM EDTA äquilibriert..1 ml mikrosomales Zytochrom P-450 aus Kaninchenleber (Konz. 80-150 /UM) mit 13-36% Zytochrom P-420 in dem Puffer der §usammensetzung:
~5.utZ.1377 *
-· 10 -
1 S A 2 9 9
'.0,1 M Phosphat, pH 79 25, 1 mM Dithioerythrit, maximal 6% J Ua-cholat, gegebenenfalls 20% Glyzerin wird zugegeben und die Probe 18 Stunden bei 40C oder 2 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Im Eluat ist der Gehalt an Zytochrom P-420 bis zu 87% des Ausgangswertes erniedrigt.
11 ml (2 g) gequollener IMD-Träger der Formel I (η = 1) werden in einer Säule bei Raumtemperatur mit pH 9 Puffer (0,1 M Borat, 0,5 M WaCl) äquilibriert. 1 ml eines Gemisches aus Katalase (Rind)/Methämoglobin(Rind) mit einer Konzentration von 34 /U-M bzw, 50 M Val/1 wird auf die Säule gegeben und anschließend mit dem Puffer über einen Fraktionssammler eluiert.
Nach Konzentrierung der proteinhaltigen Fraktionen konnten über 70% gelchromatographisch reiner Katalase wiedergewonnen werden.
Regenerierung der IMD-Träger Beispiel 13
Die Regenerierung der hämoglobinbeladenen IMD-Träger erfolgt durch mehrstündige Inkubation mit 6 M Harnstoff, Waschen mit Wasser und einem Gemisch aus Pyridin und 0,1 M NaOH (1:4), gegebenenfalls unter Zugabe von Dithionit. Nach mehr als 10-facher Regenerierung ist kein sichtbarer Verlust der Hb-Bindungsfähigkei.t zu beobachten» Auf dem gleichen Wege kann eine generelle Regenerierung der proteinbeladenen Träger erfolgen
Bei Waschen der beladenen IMD-Träger mit einem Puffer, , wird Hb ebenfalls vom IMD-Träger teilweise eluierto
. des Trägers erfolgte
2, Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß in Gegenwart von Detergentien gearbeitet wird«
3# Verfahren nach Punkt 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Elution bei einem pH von 7 - 10 in Anwesenheit von Detergentien und gegebenenfalls Glycerin bei Temperaturen von 4 - 3O0C erfolgt.
4« Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Regenerierung der Imidazolgruppen enthaltenden Träger durch Abspaltung des Hämoproteins durch Behandlung mit Harnstoff und einem Gemisch PyridinATatronlauge, gegebenenfalls unter Zusatz von Dithionit oder durch pH-Änderung des EIutionspuffers erfolgt.
Hierzu tSeite Formeln
Formel I n = 1-3
Tr-0-σ-ΗΗ-( CH2) n-N=CH-( CH2 )m-CH=lT-CH2--CH2
Formel II: Tr = Polyglykolmethakrylat (Spheron),
Polysaccarid (Agarose) n. = 2 - 10 , . CD
m = 3 . 4N
fO CO CD
Claims (1)
194299 -^-
1, Verfahren-zur Trennung bzw. Reinigung yon Hämoproteinen, dadurch gekennzeichnet, daß eine hämoprοteinhaltige Lösung mit dem trägerfixierten Imidazol bzw, Imidazolderivat der Formeln I oder II bei einem pH von 7-10 bei Temperaturen von 4 - 3O0G im Säulen- oder Eintopfverfahren (Batch-Verfahren) in Kontakt gebracht wird, anschließend die in der Lösung verbleibenden oder am Träger befindlichen Hämoproteine isoliert werden und danach ggfo eine Regenerierung
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD19429976A DD149861A3 (de) | 1976-08-12 | 1976-08-12 | Verfahren zur trennung bzw.reinigung von proteinen |
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|---|---|---|---|
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Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DD149861A3 true DD149861A3 (de) | 1981-08-05 |
Family
ID=5505411
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DD19429976A DD149861A3 (de) | 1976-08-12 | 1976-08-12 | Verfahren zur trennung bzw.reinigung von proteinen |
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| Country | Link |
|---|---|
| DD (1) | DD149861A3 (de) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1987000177A1 (en) * | 1985-06-26 | 1987-01-15 | Hemosol Inc. | Purification of hemoglobin and modified hemoglobin by affinity chromatography |
-
1976
- 1976-08-12 DD DD19429976A patent/DD149861A3/de unknown
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1987000177A1 (en) * | 1985-06-26 | 1987-01-15 | Hemosol Inc. | Purification of hemoglobin and modified hemoglobin by affinity chromatography |
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