DD153829A1 - Verfahren zur herstellung neuartiger hybridinsuline mit insulinaehnlicher wirkung - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Hybridinsulinen, in denen die Sequenz des B-Kettenanteils gezielt in beliebigen Positionen abgewandelt bzw. verkuerzt werden kann. Das Verfahren stellt die Weiterfuehrung und Verallgemeinerung des im Wirtschaftspatent DD-PS 132 861 niedergelegten Prinzips fuer die Chemosynthese von Insulin-B-Ketten-S-Sulfonat dar. Erfindungsgemaess wird nachgewiesen, dass dieses Konzept besonders geeignet und vorteilhaft ist, um ueber die native Form hinaus auch B-Ketten-S-Sulfonate in sequenzvariierter oder sequenzverkuerzter Form mit hohen Reinheitsgraden darzustellen. Diese dienen als Ausgangsstoffe fuer die Gewinnung der entsprechenden sequenzvariierten Hybridinsuline mit exakt definierten Strukturmerkmalen. Einige der so erhaeltlichen neuartigen Hybridinsuline besitzen interessante pharmakologische und biochemische Eigenschaften.
Description
Titel der Erfindung .
Verfahren zur Herst ellung von Peptiden mit insulinähnlicher Wirkung . '
Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur ehemosynthetischen Herstellung von Insnlinen mit abgewandeltem B~Eet« tenanteil
Charakteristik der bekannten teahnischart Lösungem
In der Do^-132 861 \7urde ein neues Verfahren zur Totalsyntliese der Insulin-B~Kette in S-SuIfonat-Form, ©it den ö.8raus gegenüber anderen Arbeitsweisen resultierenden besonderen verfahrenscheciischen. Vorzügen beschrieben.. Durch die vorliegende Erfindung; wird gezeigt,s daß diese Synthesekonseption über das beschriebene Beispiel hinaus in hobaia Maße verallgemeinarungs^ähig ist imd sich insbesondere Kum Aufbau saguensifs.riiex-ter Ins-ali23.~B~Kv3tten eignet«. Auf diese Welse lassen sich nach dem Baukastenprinzip in beliebige«. Positrtonen durch ano.ere Aminosäuren substituierte oder sequeiisverkörbte ΪΤ-Ee-feten—Analoge geyd.zmen», Nach Kombination sn;c Α-Kette· warden so Hybrid-Insuline iait systematisch, abv/andelbaz^ia B-Eetten-Anteil zugänglich· Die Endprod'akte fallen hierbei als definierte Verbindungen in hohei» .Reinheit baw.'gut relxii.gxingsfähigex» Form an· Das Konzept eignet sich somit vorzugsweise für die Uhtersucxiimg von Struktur—V/irkungsfragen am Insulin "und für die Gewinnung von bishex UTibekannten Insttlinen mit differen-=
zierten oder modifizierten biologischen Wirkungen»
Ziel der Erfindung
Die Erfindung "bezweckt; die totalsyntheti sehe Geisinnung von Hybridinsuliaen definierter Struktur, in welchen die Amiiiosäuref olge der B-Kette in beliebigen Positionen abgewandelt werden kann· Auf diese Weise sollen Insuline mit neuen verbesserten biochemischen:, pharmakologischen und klinischen Eigenschaften erschlossen werden·
Aufgabe der Erfindung
Aufgabe der Erfindung ist es? Hybridinsuline mit variierter Sequenz im B-Kettenanteil und definierter Struktur in hohen Reinheitsgraden zu.erhaltens die präzise Informationen über veränderte biochemische und pharmakologische Eigenschaften zulassen* Hierdurch wird die Erschließung und Gewinnung neuer, wirkungsmodifizierter Insuline ermöglicht«,
Merkmale der Erfindung
Die Erfindung beschreibt die Wolter führung des in def.
Φ3»~Β132 861 ausführlich beschriebenen
Verfahrens zur chemosynthet'ischen Gewinnung von Insulin™ B~Ketten-»S-Sulfonatβ Wie in den Beispielen näher dargelegt, wurde gefunden, daß die dort angewandte Strategie mid Taktik der Peptidsynthese einschließlieh der beschriebe-'neu'!Teuerungen über das untersuchte Objekt hinaus weiterführende wissenschaftlich-technische Entwicklungen, sul&ßt und besonders geeignet ist, um Analoge der Insulin-B«»Ket« te mit beliebigen Sequensabwanalungen aufzubauen.» Durch Kombination dieser derart zugänglich gewordenen Sequenz— varisBten mit Α-Kette bzw» deren AbwsJ3,d3„migsprodiücten werden Dai'stellungsmoglichkeiten fifc bisher nicht bekaruite Hybridins'alins eröffnet* So lassen sich beispielsweise die sequenzvariierten B-Ketteo. I - Y -unter An^andsang der
14 9 0
in oben zitiertem Patent angeführten Schutzgruppen, E*on~ densationstechniken und Aufbauprinzipien aus den Teilstücken B 1-8, B 9-14, B 15-2o und B 21-3o, weiche in entsprechend derivatisierter Form durch die DDR-Patente
123 315, 119 218, > 123 456 und 12o o14 beschrieben sind, sowie unter Einbeziehung ebenfalls zweckentsprechend derivatisierter Formen der variierten Sequenzabschnitte
B 4- 8 Z-Ala-His(Trt)-Leu~Cys(SEt)-Gly-OH Z-Ala-His(Trt)-Tal-Gys(SEt)-GIy-OH
B 9-14 BoC-AIa-AIa-LeU-TaI-GIu(OBzI)-AIa-OH ·
B 21-2? Boc-Glu(OBzI)-Arg(HCl)-Gly-Phe=-Phe-O}yr(BzI)-AIa-OH
komplikationslos als geschützte GesamtSequenzen aufbauen und nach Deblockierung und oxidativer Sulfitolyse in die entsprechenden S-SuIfonate überführen* Die Kombination der so zugänglich gewordenen sequenzveränderten B-Ketten-S^Sulfonate mit überschüssigem nativen A-Ketten-S-Sulfonat nach einem der in der Literatur gegebenen Verfahren, z.B. der Arbeitsweise nach TJ0T0, Ruegg und. E.G. Gattner (Hoppe-Seyler's Z.physiol·Clienu 356, 1527 (1975))» führt mit den für diese Methoden charakteristischen Ausbeuten zu den entsprechenden chromatografisch einheitlichen sequen zrra.ru er ten Hybridinsu:linene Erfindungsgemäß zeigte es sich liierbei» daß die mit der* Sequenzabwandliing verbundesien Anderuü-gen der ehe mischen νωα physikalischen MoXeküXeigerischaften der Tor-, Zvii-•ßcheni- und Endprodukte wie Reaktivität;, Löslicshkeit» Eyclxophobio bzw» Fljdr-ophilie keixis eiiischrajakeEden Fakto— reu für die übeiitrag^mgsfähiglieat des Verfahrens auf neuartige Syntheseoö^ekte darstellen und dieses'allgemein zur Eerstellimg belieba-geür HjbridinsuXine mit; .abgeändertem. B-JIettenanteil herangezogen, werden· ke.rsi* Einige der aus den vaiäleiten B-Ketten I — T gewonnenen neuartigen
Bybriöinsiiline besitzest "bei guter liypoglylEäiai seller Wi deutlich verändertes tiocliemisclies Terhalten«
4- 5 6? 8 · 9 1o 11 12 .13 1* 15 16 17 Ala-His-Leu-Cy s-Gly-Ser-His-Iieu-Yal~Glu-Ala-Le u-Tyr-Leu-
18 19 2o 21 22 23 24-25 26 27 28 29 3o
(Ala 4))
4 5 S 7 8 9 1o 11 12 13 14- 15 16 17
18 19 2o 21 22 23 24- 25 26 2?
(II s B 4 - 27 (Ala 4, Ala 27))
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1o 11 12 13 14
15 16 17 18 19 2o 21 22 23 24 25 26 27
Leu-O!^~Leu~¥al-Cys^ly~Glu-Ars--Gly--Hie--Phe=»a:yr~Ala
(III = B 1 - 27 (Ala 9, Ala 1o, Ala 27)) 4 5'67 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
18 19 2o 21 22 23 24 25 26 27
(IT - B 4-'27, (Ala 4,' Ala 9? A3.a 1o, Ala 27))
149 Q 1 -5-
Ausführungsbeispiele ;
1. Hybridinsulin B 4 - 27 (Ala 4, Ala. 27)/Anativ • Die sequenzvariierte B-Kette B 4 - 27 (AIa 4, AIa 27) (II) wurde in der entsprechend geschützten Form durch Kondensation der Fragmente ' . ' ··
Boc-Glu(OBzl)-Arg(H+)-Gly-Phe-Phe-Tyr(Bzl)-Ala-OBzl (B 21-27, Ala2'i
Schmp.: 160-162°, /oC/^° =-12,3° (c =.0,5, Ex·= 0,58 (n-Butanol/eisessig/Wasser 4:1:1, auf Kieselgel)
Boc-Leu-Tyr(BzI)-Leu-Val-Cys(SSt)-GIy-OH (B 15-20) 2 (beschrieben in der Patentschrift 123456 vom 20.12.1976)
Boc-Ser(Bzl)-His(Trt)-Leu-Val-Glu(OBzl)-Ala-OH (B 9-14) 2 , (beschrieben in der Patentschrift II92I8 vom 12.4.1976)
Z-Ala-rHis(Trt)-Leu-Cys(SSt)-GIy-OH (B 4-8, AIa 4) 4 : Schmp.: 130-132°, /Ί/ψ =-13,5° (c = 1,0, IMF) Rp=-O,37 (Aceton/Benzol 5·3) auf Kieselgel)
nach den Angaben des Bezugspatentes 132861 vom 15.11.1978 gewonnen. Hierzu wurde Fragment 1 mit 4n HCl/Dioxan- in Gegenwart von 20 Äquivalenten Ethylmercaptan von der Boc- Gruppe befreit und in BMF oder DM80 mit der äquivalenten-klenge 2 unter Anwendung der DicyclohexyIcarboäiimid/1-Hydroxybenzotriazole (DCC/HOBt)- Methode kondensiert. Nach üblicher Aufarbeitung und Reinigung resultierte das geschützte Teilfragment B 15-27, das-wiederum von seiner Boc- Gruppe befreit und unter Verwendung von 2 als Kupplungskomponente analog weiter zum geschützten Teilfragment B 9-27 und schließlich unter Einsatz von 4 zur geschützten B-Kette (4-27) niit den Alanin- Substitutionen in Position 4 und 27 verlängert wurde0 Die geschützte B-Kette wies korrekte Elementar- und Aminosäureanalysen auf, Zers.Punkt: 232-235°, Μ/ψ =-13,9° (c = 0,2, DiBO) R^= 0,62 (n-Butanol/Lisessig/Wasser 4:1:1, auf Kieselgel).
Wie ebenfalls im Be?ugspatent Seite 8 näher beschrieben, wurde die Kette dann mit HBr/irifluorssGigsäure/Ethylmercaptan oder durch katalytisch^= Hydrierung von ihren Benzyltyp-Schutz.-gruppen befreit, durch oxidative Sulfitolyse in das S-SuIfonat
1 Α ι',ιηΐί -;.· ! ,ι
2149 01
übergeführt und säulenchromatographisch gereinigt. B 4-27 (AIa 4, AIa 27)-S-SuIfonat (S-SuIfonat von Verbindung II) Rf = 0,91 (sek. Butanol/Eisessig/8m Harnstoff 12,5:0,9:1,5S auf FU4- Papier (VEB Spezialpapiere Niederschlag)). Elektrophoretisch einheitlich. Relative Laufstrecke gegen.. . natives B- Ketten-S-Sulfonat: 0,60 (45V/cm, Puffer: Arneisensäur.e/Sisessig/4m Harnstoff 3:2:15, pH 1,9, FN4- Papier). Die. wie bekannt ausgeführte Kombination des S-SuIfonates der abgewandelten B-Kette mit 3- his 4-fach molarem Überschuß an nativem A-Ketten-S-Sulfonat führte in ca. 20-prozo Ausbeute zu rohem Hybridinsulin B 4-27 (AIa 4, AIa 27)//L·,.. - das als
' XlcL C> J-ν
Pikrat gefällt und in üblicher Weise gereinigt wurde. Das elektrophoretisch einheitliche Insulinanaloge zeigt bei 45 V/cm im Puffer Ameisensäure/Eisessig/4m Harnstoff 3:2:15> pH 1,9» auf FH4-.Papier gegen Nativinsulin die relative Laufstrecke von 0,70 und weist bei deutlicher hyr^ogl^/kämischer Aktivität.
biocneiaiBcne veränderte Ziigenschaften auf.
2. Hybridinsulin B 4 - 27 (Ala 4, VaI 6, Ala 9, Ala 10. Ala 27)/ Anativ
Die sequenzvariierte B-Kette B 4 - 27 (Ala 4, VaI 6, Ala 9>
Ala 10, Ala 27) (V) wurde entsprechend Beispiel 1 aufgebaut, indem Fragment 1 von seiner Boc- Gruppe befreit und durch Fragment 2 prolongiert wurde. Das so erhaltene geschützte Zwischenprodukt der B-Kette mit dem Sequenzabschnitt 15-27 ließ sich dann analog weiter unter Verwendung von Fragment ^ zum geschützten Teilstück B 9-27 und. schließlich unter Heranziehung des Fragmentes 6 zur geschützten B-Kette (B 4~27) mit den Alanin- Substitutionen in Position 4, 9? 10 und 27 sowie der Valin- Substitution in Position 6 komplettieren«, Boc-Glu(OBzl)-Arg(H+)-Gly-Phe-?he-Tyr(Bzl)-Ala-OBzi; 1 Boc~Leu~Tyr(Bzl)"Leu-Val-Cys(.SLt)-Gly-OH 2
Boc-Ala-Ala-Leu-Val-Glu(OBzI)-AIa-OH (B 9-14, AIa 9,10) 5 Zers.Punkt? 255-269°,. /Jj^ = -28,6° (c = I5O3 Eisessig) E+. = 0,75 (n~Butanol/Eisessig/\7asser 4:1:1, auf Kieselgel)
1 -1 hinw -;n .-; r-.
2 1 4
Z-Ala-His(Tft)-Val-Cys(SEt)-GIy-OH (B 4-8, Ala 4, Val6) 6
.. Schm.: 100-103°, W^ = "35,6° (c = 1,0, Eisessig)
Rf = 0.,64 (n-Butanol/Eisessig/Wasser 4:1:1, auf Kieselgel)
Das so .gewonnene korrekte Elementar- und Amiriosäureanalysen aufweisende B-Ketten-Derivat mit den physikalischen Konstanten Zers.Punkt: 234 - 233°, Z0L/2^ = -16,3°'(c = 0,2, DMSO) Rf = 0,44 (n-Butanol/Sisessig/Wasser 4:1:1, auf Kieselgel) wurde entsprechend vorstehendem Beispiel und dem Bezugspatent deblockiert, in das S-SuIfonat übergeführt und säulenchromatographisch gereinigt. .
B 4-27 (AIa 4, VaI 6, AIa 9, AIa 10, AIa 27)-S-SuIfonat (S-SuIfonat von Verbindung V)
Ef = 0,90 (sek. Butanol/Eisessig/8m Harnstoff 12,5:0,5:1,5) auf FN4- Papier (VICB Spezialpapier Niederschlag) Elektrophoretisch einheitlich. Relative Laufstrecke gegen natives B-Ketten-S-Sulforiat: -0,20 (45V/öm, Puffer: Ameisen-· säure/Eisessig/4m Harnstoff 3*2:15, pH 1,9, 3?£T4~ Papier.
Seine Kombination mit überschüssigem S-Sulfonat von nativer A—Kette lieferte in 25 proz. Ausbeute das entsprechende Hybridinsulin mit dem wie aufgeführt abgewandelten B-Kettenanteil, das wie in Beispiel 1 gereinigt v/urde. Das· so gewonnene elektrophoretisch einheitliche Insulinanaloge zeigt gegenüber Insulin ele phoretisch die relative Laufstrecke von 0,55 (45V/cm,_ Ameisensäure/Eisessig/4m Harnstoff 3:2:15, pH: 1,5» FN4- Papier) und weist gegenüber Nativinsulin veränderte pharmakologische Eigenschaften auf.
Claims (1)
- Erfindungsanspruch:Verfahren zur Herstellung neuartiger Hybridinsuline mit insulinähnlicher Wirkung» in denen der B-Kettenanteil sequenzväriiert und um die terminalen Positionen 1-3 und 28-30 verkürzt sowie wahlweise in den Positionen 4,6,9,10 und 27 durch Alanin bzw. Valin ersetzt ist,gekennzeichnet dadurch, daß der B-Kettenanteil aus den sequentiell entsprechend variierten Untereinheiten B 4-8, 9—14» 15-20 und 21-27 unter Anwendung üblicher peptidchemischer Kondensat ionsinethoden, vorzugsweise jedoch der Bicyclohexyl« carbodiimid/1-%droxybenzotriazol - Methode in geschützter Form aufgebaut und hierbei für den Imidazolschutz Tritylgruppen, für den hydroxyl- und Carboxy1-Schutζ Benzylguppen sowie für den SH- Schutz die S- Ethylmercapto- . Gruppe eingesetzt werden, daß die derart derivatisierte B-Kette durch HBr/TPA Acidolyse oder katalytische Hydrierung von den Schutsgruppen befreit und dann auf bekanntem Wege in ihr S-Sulfonat übergeführt und mit nativer Insul'in-A-Kette kombiniert wird* ·ferzu..j?2i_$eiten Zeichnungen
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD21490179A DD153829A1 (de) | 1979-08-09 | 1979-08-09 | Verfahren zur herstellung neuartiger hybridinsuline mit insulinaehnlicher wirkung |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| DD21490179A DD153829A1 (de) | 1979-08-09 | 1979-08-09 | Verfahren zur herstellung neuartiger hybridinsuline mit insulinaehnlicher wirkung |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DD153829A1 true DD153829A1 (de) | 1982-02-03 |
Family
ID=5519618
Family Applications (1)
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| DD21490179A DD153829A1 (de) | 1979-08-09 | 1979-08-09 | Verfahren zur herstellung neuartiger hybridinsuline mit insulinaehnlicher wirkung |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DD (1) | DD153829A1 (de) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4992418A (en) * | 1987-07-17 | 1991-02-12 | Mount Sinai School Of Medicine | Superactive human insulin analogue-[10-Aspartic Acid-B]Human Insulin |
-
1979
- 1979-08-09 DD DD21490179A patent/DD153829A1/de unknown
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4992418A (en) * | 1987-07-17 | 1991-02-12 | Mount Sinai School Of Medicine | Superactive human insulin analogue-[10-Aspartic Acid-B]Human Insulin |
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