DD155082A1 - Verfahren zur durchfuehrung von enzym-immuno-assays - Google Patents
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Abstract
Das Ziel der Erfindung besteht darin, den Enzym-Immuno-Assay oekonomischer zu gestalten. Erfindungsgemaess benutzt man anstelle von Antikoerper/Enzym-Konjugaten Antikoerper/Lektin-Konjugate und setzt anschliessend in einem weiteren Schritt mit einem kohlenhydrathaltigen Enzym um. Der Vorteil dieser Verfahrensweise besteht darin, dass auch Enzympraeparate geringeren Reinheitsgrades eingesetzt werden koennen. Die Erfindung ist in der medizinischen Diagnostik anwendbar.
Description
2 5 3 05
Dr. Mohr. .
Prof. Dr, Dr. Franz
"Verfahren zur Durchführung von Enzym-Immuno-Assays"
Anwendungsgebiet der Erfindung . . , ..
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Durchführung von Enzym-Immuno-Assays. Das Verfahren ist in der medizinischen Diagnostik anwendbar.
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen Der in den letzten Jahren entwickelte Enzym-Immuno-Assay (EIA) stellt eine Methode zum Nachweis von Antigenen oder Antikörpern dar, die in Empfindlichkeit und Spezifität dem Radio-Immuno-Assay vergleichbar ist (A. Voller, D. E. Bidwell, AnnBartlett, Bull. World Health Organ. 53, 1979, S. 55 -
Die Bestimmung eines Antigens wird im EIA in folgenden Schritten durchgeführt:
1) Der dem Antigen entsprechende Antikörper wird an einem Träger (z. B. PVC, Polystyrol) fixiert·
2) Die zu untersuchende antigenhaltige Lösung wird aufgebracht, bei der Inkubation reagiert das Antigen mit dem fixierten Antikörper.
3)- Each Entfernen der Lösung und Waschen wird ein Antikörper/ Enzym-Konjugat aufgebracht und'erneut inkubiert« Dabeireagieren freie Antigen-Determinanten mit dem Konjugat. 4) Uach Entfernen des Konjugats und Waschen wird das Enzym in an sich bekannter Weise bestimmt. Der erhaltene Wert entspricht der Antigenmenge in der untersuchten Lösung. Zur Herstellung des Antikörper/Enzym-Konjugats werden Enzyme hoher Reinheit benötigt, z. B. Meerrettichperoxidase mit ca. 250 E/mg. Die Hochreinigung von Enzymen ist aufwendig und bedingt deren hohen Preis. ·
Ziel der Erfindung
Die.Erfindung hat das Ziel, den EXA. ökonomischer zu gestalten.
Je£Le,.n'3 der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, den EIA ohne den Einsatz hochgereinigter Enzyme durchzuführen. Erfindungsgemäß werden anstelle von Antikörper/Enzym-Konjuga- ten Antikörper/Lektin-Konjugate eingesetzt, die im Anschluß an die Inkubation in einem weiteren Schritt mit kohlenhydrathaltigen Enzymen umgesetzt werden.
Als Lektine kommen alle gut zugänglichen Lektine in Betracht* Besonders günstig ist der Einsatz des aus Canavalia ensiformis gewinnbaren Concanavalin A. Das Eon^ugat wird durch Umsetzung mit dem Antikörper in einer Pufferlösung unter Zusatz von Glutaraldehydlösung in an sich bekannter Weise gewonnen« Haoh der Inkubation mit dem Konjugat wird gewaschen und mit der Lösung eines kohlenhydrathaltigen Enzyms (z. B. Meerret~ tichperoxidase) inkubiert und gewaschen. Anstelle eines kohlenhydrathaltigen Enzyms können auch Enzyme eingesetzt werden, die vor der Umsetzung kohlenhydrathaltig gemacht oder an Kohlenhydrat angereichert werden. Anschließend erfolgt in üblicher Weise die Bestimmung des Enzyms« Die erfindungsgemäße Verfahrensweise hat den Vorteil, daß auch Enzympräparate geringen Reinheitsgrades eingesetzt werden können. Im Fall von Meerrettichperoxidase können Präparate mit 25 - 32 E/mg verwendet werden. Demgegenüber fällt der zusätzliche Verfahrensschritt (Inkubation mit der Enzymlösung) praktisch nicht ins Gewicht. Das Verfahren ist in der medizinischen Diagnostik auch für Routineuntersuchungen anwendbar, z. B. zur Untersuchung von Blutkonserven auf die Anwesenheit von HBs-Antigen.
2253ns
Ausf ühriingsbeispiel Herstellung des
Eine Immunglobulinfraktion des Antiserums und eine Concanavalin Α-Lösung werden 16 h gegen 0,1 M Phosphat-Puffer (ph 6,8) dialysiert. Zu einer Lösung mit 4 mg Concanavalin. A und 2 mg Immunglobulin pro ml 0,1 M Phosphat-Puffer (pH 6,8) werden nach Zusatz von 0,2 M Methyl-alpha-D-mannosid oder p-Nitrophenyl-alpha-D-rmannosid 0,03 ml einer 1 %igen Glutaraldehydlösung gegeben. Die Mischung wird 3 h bei Zimmertemperatur gerührt. Danach werden pro ml Reaktionsmischung 0,05 ml einer 2 M Glycin-Lösung zugegeben und nochmals 2 h gerührt. Im Gegensatz zu der.von J. L. Guesdon und Se Avrameas (Ann. Immunol. (Inst. Pasteur) 1980, Ißi C, 389 - 396) beschriebenen Methode erfolgt keine Dialyse gegen PBS.
yersuohsanordnung:
PVC~Platten (Tablettenblister) mit halbkugelförmigen Vertiefungen werden mit Proteinantigenen wie folgt beladen: 0,1 ml einer Proteinlösung in Karbonat/Bikarbonat-Puffer (pH 9,6) (A. Toller, I. E. Bidwell, Ae%Bartlett: Bull. WId. Hlth. Org. J5J3, 1976» 55 - 65) werden pro Vertiefung aufgetragen und die Platten 16 - 20.h bei 40O aufbewahrt. Anschließend wird nach A. Voller u. a, mit PBS/Tween 20 gewaschen. Dann bringt man 0,1 ml verschiedener Verdünnungen des !Conjugates in einer 0,2 M Lösung von Methyl-alpha-D-mannosid oder von p-Hitrophenyl-alpha-D-mannosid in PBS/Tween 20 in die Vertiefungen. Nach einer Inkubationszeit von 2 h bei 370C wird wie o. a. in PBS/Tween 20 gewaschen. Danach werden je 0,1 ml Peröxidase-Lösung (kW) in PBS/Tween 20 zugefügt und nochmals 1 h bei 37°C inkubiert. Nach nochmaligem Waschen in PBS/Tween 20 erfolgt der lachweis der gebundenen Peroxidase mittels der Farbreaktion mit HgO2.und ο-Phenylendiamin (G. Wolters, L. Knijpers, S. Kacaki, A. Schmurs: J. clino Path. 2£, 1976, 873 - 879)
Anwendungsbei spiel;_
PVC-Platten wurden mit Human-, Kaninchen- oder Schaf-Immunglobulin-G (je 5 /Ug/ml) beladen. Zur Immunreaktion wurde das Konjugat in geometrischer Reihe 1 : 30 bis 1 : 7680 verdünnt»
- 4 —
Meerrettichperoxidase (RohprodLikt) (mindestens 32 E/mg) wurde zu 20 mg/ml in 0s9 %iger ITaOl-Lo sung gelöst und für den Test in einer Verdünnung von 1 : 400 bis 1 : 800 benutzt. Kontroll-Untersuchungen wurden mit hochgereinigter Meerrettichperoxidase (cao 250 E/mg) in einer Verdünnung7von 10 bis 5 /Ug/ml durchgeführt.
Resultate:
Mit Kaninchen-IgG wurde eine Farbreaktion bis zur Verdünnung 1 : 96O des Konjugates erhalten. Mit Schaf-IgG war die Farbreaktion negativ. Mit Human-IgG wurde bis zur Verdünnung des !Conjugates 1 : 120 eine schwache Farbreaktion erhalten, die auf eine Kreuzreaktion zwischen Human- und Kaninchen-IgG hinweist. Die Anwendung einer nur geringgradig gereihigten Peroxidase ergibt bei den beschriebenen Versuchsanordnungen . gleiche Empfindlichkeit und ebenso geringe Nebenreaktionen der Einsatz eines hochgereinigten Präparates.
Claims (3)
1. Verfahren zur Durchführung von Enzym-Immuno-Assays, dadurch gekennzeichnet, daß man anstelle von Antikörper/Enzym-Kon;] uga ten Antikörper/Lektin-Konjugate benutzt und anschließend in einem weiteren Schritt mit einem kohlenhy-. drathaltigen Enzym umsetzt·
2· Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die
Enzyme vor der Umsetzung kohlenhydrathaltig gemacht oder . . an Kohlenhydrat angereichert werden.
3. Verfahren nach Punkt 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Lektin Concanavalin A und als kohlenhydrathaltiges Enzym Meerrettichperoxidase verwendet.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4954433A (en) * | 1987-09-04 | 1990-09-04 | Sclavo S.P.A. | Method for the immunolocalization of antigens with the use of antibodies directed against epitopes of non-glucidic nature |
-
1980
- 1980-11-19 DD DD22530580A patent/DD155082A1/de not_active IP Right Cessation
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