DD156667A1 - Herstellungsverfahren von immunpraeparaten aus fetalen proteinen - Google Patents
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Abstract
Das Herstellungsverfahren von Immunpraeparaten, die embryonale/fetale Proteine enthalten, ist anwendbar auf dem Gebiet der Human- und Veterinaermedizin und ist dadurch gekennzeichnet, dass man Embryonen/Feten von Wirbeltieren, insbesondere von Voegeln d. h. die aus denselben hergestellten Zellkulturen gemeinsam oder nicht gemeinsam mit Retroviren oder ihren Bestandteilen mit Hilfe biophysikalischer und biochemischer Methoden isoliert und reinigt und dass die so gewonnenen Immunpraeparate fuer phylogenetisch im Verhaeltnis zum Ausgangsgewebe differenten Spezies als Diagnostikum und Medikament einsetzbar sind.
Description
Herstellungsverfahren von Immunpräparaten aus fetalen Proteinen
Anwendun£sgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur hochgereinigten Gewinnung fetaler Proteine aus Embryonen/Feten bzw. aus den von diesen hergestellten begrenzt oder unbegrenzt wachsenden Zellkulturen. Die Herkunft der Embryonen/Feten sind Wirbeltiere insbesondere Vögel. Hochgereinigte Fetoproteine stellen Immunpräparate dar, die in der Human- und Veterinärmedizin zur Diagnostik, Prophylaxe und Therapie eingesetzt werden können. Die Fetoproteine können mit gleichzeitig isolierten Partikeln von Retrovirusmorphologie assoziiert sein oder gemeinsame Antigendeterminanten aufweisen.
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen
Die im Wirtschaftspatent 3/51 Аб1 K 35/76 bzw. der Patentanmeldung V/P C 12K/215 302 dargelegten Erfindungen zur Herstellung von Immunpräparaten lassen die Existenz der hochwirksamen Fetoproteine außer acht, indem nur die Isolierung von Partikeln mit Retrovirusmorphologie oder deren Bestandteile angestrebt wird.
Das Wirtschaftspatent WP 0 O7G/199 351 gibt ein Verfahren zur Isolierung von Fetoproteinen aus fetalen Organen humaner Herkunft an, die innerhalb der gleichen Spezies zur Anwendung kommen.
2b Ziel der Erfindung
Der nützliche Effekt der Erfindung, der im Vergleich zu den bereits bekannten Lösungen erreicht wird, besteht in Polgendem:
Petoproteine werden aus Embryonen oder Feten bzw. von Wirbeltieren, insbesondere von Vögeln aus den aus ihnen hergestellten begrenzt oder unbegrenzt wachsenden Zellkulturen gewonnen, gereinigt und zu einem Immunpräparat aufgearbeitet, wobei unter anderem das elektronenmikroskopische Bild im Negatiykontrastverfahren, in dem sich Proteinaggregationen darstellen, Berücksichtigung findt . Me Immunpräparate werden auf Reinheit geprüft.
Dem Herstellungsverfahren liegt die Absicht zugrunden, Petoproteine mit oder ohne sich von Retroviren ableitenden Proteinen als Immunpräparat für eine phylogenetisch differente Spezies im Vergleich zur Herkunft der Petoproteine diagnostisch, prophylaktisch und therapeutisch einzusetzen,
Wesen der Erfindung
Embryonen/Feten beinhalten Substanzen (fetale Proteine), die dem Entwicklungsstadium der Embryonen/Feten entsprechend der Zeil- und Organdifferenzierung, der neuralen Reizausschaltung und dem Infektionsschutz dienen. Fetale Proteine können an Partikeln von Retrovirusmorphologie assoziiert oder mit Bestandteilen derselben immunologisch verwandt sein. Dementsprechend sollen die so gewonnenen Fetoproteine zum direkten Infektionsschutz, zur Schmerzbekämpfung und zur Immunisierung gegen verwandte Proteine, die in erkrankten Menschen oder Tieren auftreten, eingesetzt werden. Die letztgenannte Einsatzmöglichkeit beruht auf folgenden Erkenntnissen: Einige Erkrankungen, insbesondere Geschwulst- und destruktive Hirnerkrankungen des Menschen sind vom Wiederauftreten bestimmter fetaler Proteine begleitet. Die wiederauftretenden fetalen Proteine werden innerhalb der
gleichen Spezies nicht genügend als "fremd" erkannt und lösen deshalb keine oder eine ungenügende Immunantwort aus. Fetale Proteine phylogenetisch differenter Spezies besitzen einerseits artspezifische d.h. voneinander unterscheidbare andererseits interspezifische, d.h. einander ähnliche oder gleiche Antigendeterminanten. Diese Erkenntnis führte zu folgender Schlußfolgerung: Petale Proteine einer bestimmten Spezies lösen in einer phylogenetisch differenten Spezies eine Immunantwort aus, die nicht nur gegen die fremden, sondern auch gegen die im Organismus bereits: vorhandenen wiederauftretenden fetalen Proteine wirksam wird. Diese Schlußfolgerung bildet die Basis zur Herstellung und zum Einsatz von Immunpräparaten bestehend aus phylogenetisch differenten fetalen Proteinen. Ss wurde gefunden, daß mit Hilfe von biochemischen und biophysikalischen Reinigungs- und Anreicherungsverfahren (Fällungen, Detergenzbehandlung, Ultrazentrifugation, Chromatographie u.a.) aus Embryonen/Feten bzw. den aus ihnen hergestellten begrenzt und unbegrenzt wachsenden Zellkulturen Fetoproteine gewonnen und zu Immunpräparaten aufbereitet werden können. Weiter wurde gefunden, daß diese Immunpräparate in von der Ursprungsspezies differenten Spezies medikamentös und diagnostisch einsetzbar sind.
- 4 Anwendungsbeispiele
Entenembryozellkulturen werden in bekannter Weise aus 11 (10-12) Tage alten Vollembryonen hergestellt und bei 380C in einer Rollereinrichtung bebrütet. Die Zelldichte wird auf 3x10 Zellen eingestellt, so daß innerhalb 24 Std. eine konfluierende Zellschicht resultiert. Nach weiteren 2 Bebrütungstagen werden die Zellen durch ein Chelaplex (0,1%) - Trypsingemisch (0,2%) aus den Kulturgefäßen abgelöst, durch Zentrifugation (500g für 5 min) sedimentiert und in mindestens 10 fächer Konzentration im Verhältnis zum ZeIl-Züchtungsmedium mit serumfreier Hanks-Lösung aufgenommen. Das sich anschließende Aufarbeitungsverfahren dient zum einen der Gewinnung des Retrovirus der Ente und zum anderen der Präparation von embryonalen und fetalen Proteinen.
1. Virusgewinnung
Zur Freisetzung des intrazellulären Virus werden die Zellen durch klimatische Beugung in CO^-Trockeneis-Alkohol-Gemisch oder mit anderen geeigneten Verfahren aufgeschlossen. Der Zelldetritus wird durch Zentrifugation bei 2000g für 30 minaus der virushaltigen Flüssigkeit entfernt. Die Virusflüssigkeit wird von den Sedimenten abgetrennt, mit 50% Chloroform und 5 min lang gründlich geschüttelt. Nach erneuter Zentrifugation bei 2000g für 30 min setzt sich die das Virus enthaltende wäßrige Phase vom Chloroform ab. Die Virusflüssigkeit wird abgesaugt und anschließend durch Ultrazentrifugation be i 25000 U/min und O0C in einer VAC 602 2 Std. lang zentrifugiert. Die Sedimente werden in Trispufferlösung aufgenommen. Nach Zentrifugation bei 5000g für 20 min bei 40C wird das im Verhältnis zum Ausgangsmaterial 100 fach angereicherte Virus mit Formalin in einer Endkonzentration von 1:4000 inaktiviert.
2. Präparation embryonaler/fetaler Proteine
Die Präparation der fetalen Proteine erfolgt durch Zugabe der 10 fachen Menge an eisgekühlter 3 M KCL-Lösung (Gewicht/ Volumen) im Vergleich zur Ausgangszellmenge in phosphatgepufferter Salinelösung unter Zusatz von 0,1% Triton X-100.
Durch anschließende Ruption der Zellen durch Ultraschall bzw. mechanische Behandlung und Extraktion für 15-20 Std. im Kühlschrank erfolgt die Elution der gewünschten Proteine aus dem Zellverband. Der Zelldetritus wird durch Zentrifugation bei 5000g und 40G sedimentiert. Der klare Überstand wird gegen 0,15 M NaCL-Lösung dialysiert, klarzentrifugiert, durch Ultrafiltration 1:5 aufkonzentriert und durch Zusatz von 50% (NH. ^SO, gefällt. Das durch Zentrifugation bei 5000g und 4 C erhaltene Sediment wird in 1/10 des Aus-
gangsvolumens mit PBS gelöst und klarzentrifugiert und einer Chloroformbehandlung unterzogen. Wach erneuter Zentrifugation bei 2000g für 30 min wird die proteinhaltige Flüssigkeit vom Chloroform abgehebert. Die so erhaltenen fetalen Proteine werden über Ultrogel AcA34 chromatographiert. Die im Molekulargewichtbereich von 15OO00-2OOO00 Dalton vorliegenden Fraktionen werden durch Ultrafiltration 1:10 aufkonzentriert. Das nun vorliegende Präparat wird im Verhältnis 1:2 mit dem nach Pkt. 1 enthaltenen Substrat vermischt.
Zur Verwendung als Impfstoff wird die Präparation in Me ngen von 5 ml in Ampullen abgefüllt, eingeschmolzen und bei 4 C aufbewahrt. In der Regel werden 5 Injektionen im Abstand von 3 Tagen i.m. verabreicht, an die sich in 4-wöchigen Abständen weitere Injektionsserien anschließen können. Die Unschädlichkeit des Medikaments wird im Tierversuch an Säuglingsmäusen, Meerschweinchen und Kaninchen bei verschiedenen Applikationsverfahren geprüft. Mit Antilymphozytenseren behandelte Mäuse dienen zum Ausschluß einer onkogenen Aktivität.
2. Zur Verwendung als Diagnostikum wird das Zellmaterial wie unter Pkt. 1 beschrieben aufgearbeitet und nach erfolgter Ultrazentrifugation im Verhältnis 1:100 in Bezug zum Ausgangsvolumen der Zellsuspension in TN-Puffer aufgenommen. Die wie unter Pkt. 2 gewonnenen fetalen Proteine werden im Verhältnis 1:2 mit dem virushaltigen Substrat vermischt und für die immunologische Diagnostik von Tumoren z.B. im LAI-Test eingesetzt.
Claims (1)
- ErfindungsanspruchHerstellungsverfahren von in der Humanmedizin anwendbaren Immunpräparaten, die embryonale/fetale Proteine enthalten, dadurch gekennzeichnet, daß aus Teilen oder der Ganzheit von Embryonen/Feten der Wirbeltiere, insbesondere der Vögel begrenzt oder unbegrenzt wachsende Zellkulturen erzeugt, daß aus diesen mittels bekannter 16O biochemischer und biophysikalischer Methoden gemeinsam oder nicht gemeinsam mit Bestandteilen von Retroviren embryonale/fetale Proteine gewonnen bzw. isoliert und gereinigt werden.
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Cited By (1)
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| EP0889053A3 (de) * | 1997-06-27 | 1999-03-31 | Solisch, Peter, dr.med.habil. | Verwendungen von BK-RiV-Präparaten, Verfahren zu deren Herstellung sowie darin enthaltene Proteine |
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1981
- 1981-03-03 DD DD22802081A patent/DD156667A1/de unknown
Cited By (1)
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