DD157025A5

DD157025A5 - Verfahren fuer die ermittlung von haemoglobin im exkrement

Info

Publication number: DD157025A5
Application number: DD81227059A
Authority: DD
Inventors: Osmo Suovaniemi; Herman Adlercreutz; Jukka Suni; Paul Partanen
Original assignee: Suovaniemi Finnpipette
Priority date: 1980-01-17
Filing date: 1981-01-16
Publication date: 1982-10-06
Also published as: SU1496643A3; FI61965C; EP0032782B1; FI800140A7; CS228136B2; JPH0121907B2; US4427769A; FI61965B; ATE15945T1; JPS56106154A; EP0032782A3; DE3172465D1; EP0032782A2

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren fuer die Ermittlung von Haemoglobin im Exkrement fuer die Anwendung in der medizinischen Diagnostik. Ziel der Erfindung ist die spezifische Bestimmung von menschlichem Haemoglobin neben tierischem Haemoglobin und Verbindungen aus dem Pflanzenreich, welche bei der Nachweisreaktion ebenfalls ein positives Ergebnis zeigen. Erfindungsgemaess wird derart verfahren, dass aus der Probe das menschliche Haemoglobin mittels einer immunologischen Reaktion, d.h. einer Reaktion zwischen einem Antikoerper und einem Antigen, getrennt wird, indem ein an eine feste Phase gebundener spezifischer Antikoerper des menschlichen Haemoglobins benutzt und danach das an den Antikoerper gebundene menschliche Haemoglobin ermittelt wird, beispielsweise mittels der Enzym-Immunobestimmung oder durch Hinzusetzen von Guajak und Wasserstoffsuperoxyd und Messen der Staerke der enstandenen Blaufaerbung.

Description

_ i/- Berlin, den 20. 5. 1981

AP G01N/227 059/4 58 633/11

Verfahren für die Ermittlung von Hämoglobin im Exkrement Anwendungsgebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren für die Ermittlung von Hämoglobin oder von Auflösungsprodukten des Hämoglobins im Exkrement.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Bisher kennt man mehrere Verfahren für die Ermittlung von im Exkrement vorkommendem okkultem Blut. Sin bekanntes Verfahren gründet sich auf den Nachweis des aus dem Hämoglobin befreiten Hämins im Exkrement. Die Probe wird auf ein Guajakharz enthaltendes Reagenzpapier gelegt. Wenn Y/asserstoffperoxydlösung zum Reagenzpapier hinzugesetzt wird, reagiert das Hämin des Exkrements in der Art von Peroxydasenenzymen, wobei das Guajakharz sich zu einer blauen Verbindung oxydiert. Die Stärke der gebildeten Farbe hängt vom Hämoglobingehalt der Probe ab. Eine für das Verfahren geeignete Anordnung, die sogenannte Fecatest-Verpackung, wird in der US-PS 4.092.120 beschrieben. Im genannten US-Patent wird eine Anordnung für die Aufbewahrung und Prüfung von Laborproben beschrieben. Die Anordnung umfaßt eine Rahmenplatte, die eine durchlaufende Öffnung und eine in ihre Bödenfläche reichende Vertiefung aufweist. Eine erste gehobene Wandung erstreckt sich nach außen von der oberen Fläche der Rahmenplatte, um einen Probenauflagerungsbereich oberhalb der Öffnung zu begrenzen. Ein oberer Deckel ist derartig ausgeformt, daß er über die obere Fläche der Rahmenplatte paßt und einen gehobenen Teil aufweist, der sich in die gehobene Y/andung auf der Grundplatte erstreckt und die Probe zusammen-

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drückt«, Ein Bodendeckel paßt genau innerhalb der Vertiefung in der Bodenfläche_e Eine Scheibe von Prüfmaterial, wie z, B. Filterpapier, kann innerhalb der Vertiefung unter dem Bodendeckel gelegt werden, wo sie durch die in der Grundplatte vorkommende Öffnung mit der Probe in Berührung gebracht wird ο

Die bekannten zur Verwendung kommenden für den Nachweis von okkultem Blut im Exkrement vorgesehenen diagnostischen Präparate können z» B. aus Fleisch- und Blutspeisen enthaltender .Ttfahrung erhaltenes, aus Tieren herrührendes Hämoglobin vom Hämoglobin des Menschen nicht unterscheiden Ebenso veranlassen aus dem Pflanzenreich, z_e B. aus Rübe un<ä Meerrettich, herrührende Peroxyaasenenzyme ein falsches positives Ergebnis im Test«

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines verbesserten Verfahrens zur Bestimmung von Hämoglobin im Exkrement, mit dem eine spezifische Bestimmung von menschlichem Hämoglobin erfolgen kann«

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, um Fehlerquellen auszuschließen, das Hämoglobin des menschlichen Bluts aus der Exkrementprobe spezifisch durch immunologisches Mittel "zu pflücken". · .. .

In einer immunologischen Reaktion reagiert das Antigen mit dem entsprechenden Antikörper und bildet einen immunologischen Komplex« Eine der Komponenten kann an eine feste Phase, vorzugsweise an irgend-ein Polymer, gebunden werden,

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und der zu untersuchende Stoff befindet sich in einer Löeung, die mit der an die feste Phase gebundenen Komponente zusammengebracht wird, wobei die Komplexbildung stattfindet. Die quantitative Bestimmung des zu untersuchenden Antigens bzw· Antikörpers kann dadurch stattfinden, daß zur Reaktionsmischung eine gewisse Menge einer mit einem Enzym gestempelten Komponente hinzugeführt wird, welche Komponente dieselben immunologischen Eigenschaften aufweist wie der zu untersuchende Stoff· Die Bindung der mit einem Enzym gestempelten Komponente hängt von der Menge des zu untersuchenden Stoffes ab« Es folgt hieraus, daß die Enzymaktivität entweder der als Schlußergebnis erhaltenen Reaktionslösung oder der festen Phase als Maß der Menge des zu untersuchenden Stoffes benutzt werden kann· Eine solche Enzym-Immunobestimmung (EIA - enzyme immunoassay) wird z· B. in den US-PS 3.654.090 und 4.016.043 beschrieben.

Ein immunologisches Verfahren, bei welchem die eine Komponente mit der festen Phase gebunden ist, jedoch bisher nicht bei der Ermittlung des Hämoglobins im Exkrement verwendet worden.

Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ist hauptsächlich dadurch gekennzeichnet, daß aus der Probe das menschliche Hämoglobin mittels einer immunologischen Reaktion, d. h. einer Reaktion zwischen einem Antikörper und einem Antigen, getrennt wird. Indem ein an eine feste Phase gebundener spezifischer Antikörper des menschlichen Hämoglobins benutzt und danach das an den Antikörper gebundene menschliche Hämoglobin ermittelt wird. Dieses auf Antigen-Detektion gegründete immunologische Verfahren ist ausreichend empfindlich zum Nachweis von sogar sehr kleinen Mengen von Hämoglobin oder von dessen Auflösungsprodukten.

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Mit dem Verfahren gemäß der Erfindung wird im menschlichen Exkrement vorkommendes okkultes Blut immunologisch ermittelt« Das Verfahren gründet sich auf die Benutzung eines spezifischen Antikörpers«, Mit dessen Hilfe wird nur aus dem Menschen herrührendes Hämoglobin ermittelt.

Das Wesentliche im Verfahren ist die Verwendung des Anti-HumanHämoglobins zum "Fangen" des vom menschlichen Blut herrührenden Hämoglobins aus der Probe*

In der Reaktion wird ein geeigneter Puffer verwendet zur Eluierung der Proben aus dem im 'Test verwendeten Absorbens» Die immunologische ,Reaktion selbst wird durch die Verwendung eines geeigneten Markierstoffes "sichtbar" gemacht, wie z. B. eines anderen Antikörpers derselben Spezifität als mit einem geeigneten Enzym gestempelt, oder dadurch, daß eine Guajakharz enthaltende Lösung verwendet wird, wobei das Guajak sich in der Anwesenheit des. Häms aus dem Hämoglobin zu einer blauen Verbindung oxydiert (Pseudoperoxydasenreaktion)»

Erfindungsgemäß wird insbesondere derart verfahren, daß das im Exkrement vorhandene Hämoglobin und dessen Auflösungsprodukte vor dar. immunologischen Reaktion aus dein Exkrement ins Absorbens getränkt werden, wonach das Hämoglobin und dessen Auflösungsprodukte in eine Lösung eluiert werden, welche Lösung darauf einer immunologischen Reaktion unterworfen wird zum Trennen des menschlichen Hämoglobins aus der Lösung.

Au sführung sbe is pi el

Die Erfindung wird nachstehend an einigen Beispielen näher erläuterte

In der beiliegenden Zeichnung zeigen:

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Fig* 1: eine Fecatest-Anordnung dargestellt, bei welcher das im Exkrement enthaltene Blut ins Absorbens getränkt werden kann;

Pig« 2: das Absorbens bei der Eluierstufe, mit der als . Eluiergefäß verwendeten Küvettenreihe teilweise ,' geschnitten;

Pig. 3: eine in der immunologischen Reaktion verwendete Küvettenreihe, wobei die an die Küvettenv/andungen gebundenen Antikörpermoleküle zur Veranschaulichung als beträchtlich vergrößert dargestellt worden sind, indem die Küvettenreihe teilweise geschnitten ist·

Die für das Verfahren erforderliche Apparatur umfaßt eine Pecatest-Verpackung 1 (Pig· 1), worin die Probe leicht und hygienisch gelegt werden kann. Die Pecatest-Verpackung 1 hat auf der "Laborseite" 2 z. B. Filterpapier (entweder ein bzw· mehrere kleinere Papiere oder ein größeres Papier),

Zur Fecatest-Schachtel, die besonders für hygienische Beförderung und Prüfung der Exkrementprobe geplant worden ist, wird zur Laborseite ein absorbierendes Material 3 (z. B. Filterpapier) hinzugesetzt, worin das im Exkrement eventuell enthaltene Hämoglobin des Bluts und/oder dessen Auflösungsprodukte absorbiert werden·

Das Absorbens 3 wird an die Pecatest-Schachtel 1 so befestigt, daß es zwischen dem mit Guajak imprägnierten Papier des Pecatest und dem Kunststoffdeckel (Laborseite) liegt. Bei vorgenommenen Versuchen ist festgestellt worden, daß aus der Exkrementprobe ausreichend viel Hämoglobin oder dessen Auf-

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lösungsprodukt durch das Guajakharz enthaltende Papier ins nächste Filterpapier übergeht. Selbstverständlich ist auch eine Verlegung des Absorbens 3 von verschiedener Art möglich» Das Absorbens 3 ist in der Schachtel so gelegt worden, daß es leicht entfernt und für die Eluation des Hämoglobins bzw* dessen Auflösungsprodukte in einem geeigneten Gefäß, z* B. einer Küvettenreihe 4 (Pig· 2), gelegt werden kann«

Das ins Papier oder in ein sonstiges absorbierendes Material 3 absorbierte, aus der Probe stammende Hämoglobin oder dessen Auflösungsprodukte können aus diesem Material eluiert werden» Aus dem Eluat 5 kann das Hämoglobin mit dem Enzym-Immunverfahren oder mit irgendeinem anderen Immunverfahren ermittelt werden. Das Absorbens 3 kann auch als solches in den Immuntesten verwendet werden·

Bei Eluierung des Hämoglobins aus dem Absorbens 3 erhält man eine Lösung, die Hämoglobin (Hb) und sonstige lösliche Moleküle aus dem Exkrement enthält. Wenn diese Lösung z_o B«, in eine Küvette einer Polystyrenküvettenreihe 7 (Fig» 3) pipettiert wird, wobei an die Wandungen und an den Boden der Küvette eine gewisse.Menge eines spezifischen Anti« Human-Hämoglobins 6 (Anti-Hb) befestigt worden ist, findet zwischen dem Antikörper 6, d. h_e Anti-Hb, und dem Antigen, d« tu dem in der Probe vorkommenden Hämoglobin, eine immunologische Reaktion, Ab-Ag-Reaktion, statt. Somit wird das Hb der Probe an diese feste Phase (IgG- d_e Iu Immunoglobulin G-Fraktion) gebunden*

Nach einer gewissen Inkubationszeit ( = der von der immunologischen Reaktion in Anspruch genommenen Zeit) wird die Küvette 7 (feste Phase) zur Entfernung von allem nicht-gebundenen Material sehr sorgfältig gewaschen. Die feste Phra.se kann selbstverständlich im Vergleich zur im Beispiel

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beschriebenen Ausführung sogar sehr unterschiedlich sein. Sie kann ein völlig anderes Polymer als Polystyren sein, und ebenso von völlig anderer Form als Küvette oder Gefäß, z. B. Kugel, Ring, Platte usw.

Danach wird festgestellt, ob eine immunologische Reaktion stattgefunden hat, d. h. ob aus der Probe an das in der festen Phase vorhandene spezifische Anti-Human-Hänioglobin etwas gebunden worden ist oder nicht.

Das Peststellen des Reaktionsvorganges nachher ist z· B. durch folgende Mittel möglich:

Nachdem die Probe an den an die feste Phase der Küvette befestigten Antikörper gebunden und die Küvette gewaschen worden ist, wird zur festen Phase, d. h. zur Küvette, eine gewisse Menge vom spezifischen IgG des Anti-Human-Hb:s hinzugesetzt, mit welchem IgG irgendein Enzym als Markierstoff konjugiert worden ist« Die Bindung des mit dem Enzym markierten IgG:s an den in der "festen Phase vorhandenen Antikörper hängt davon ab, wie viel Antikörper es in der festen Phase nach der Behandlung der Probe als "frei" gibt· Mittels des Enzymstempels kann man also die Reaktion zwischen dem Antikörper (Anti-Human-Hb) und dem Antigen (Human-Hb) feststellen, indem man ein dem betreffenden Enzym spezifisches Substrat hinzusetzt, wobei das Enzym aus dem Substrat eine gefärbte, visuell oder photometrisch lesbare Verbindung spaltet· Eine Technik von entsprechendem Typ, sogenannte '!Sandwichs-Technik, im Zusammenhang mit einem EIA-Verfahren ist u. a. in der oben genannten US-PS 4.016.043 beschrieben worden. Die Menge des Enzyms kann dadurch festgestellt werden, daß entweder die an die feste Phase, gebundene Menge oder die in der Lösung frei gebliebene Menge^gemessen wird.

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2_β Eine andere Alternative für die Ausführung der Enzymreaktion ist gleichzeitig mit der Probe eine bekannte Menge von Konjugat, d_e h« vom mit Enzym gestempelten Human-Hb, hinzuzusetzen, wobei sowohl das in der Probe vorhandene Hb als auch das hinzugesetzte Hb mit dem in der festen Phase vorhandenen Antikörper, d. h. Anti-Hb,. konkurrieren« Die immunologische Reaktion (Ab-Ag-Reaktion) kann dadurch sichtbar gemacht werden, daß ein für das Enzym des Konjugats spezifisches Substrat hinzugesetzt wird, aus welchem Substrat eine gefärbte Verbindung sich spaltet« Bin sogenannter konkurrierender EIA-Test von entsprechender Art ist u. a. in der oben genannten US-PS 3e654»O9O beschrieben worden.

3ο Als Alternative einer Enzymreaktion kann eine Guajakreaktion verwendet werden_e Nachdem die Probe mit dem in der festen Phase vorhandenen Anti-Hb reagiert hat und die Küvette gewaschen worden ist, wird zur Küvette eine bekannte Menge von Guajak hinzugesetzt. Wenn die Probe menschliches Hämoglobin enthalten hat, welches an seinen spezifischen Antikörper an den Wandungen der Küvette gebunden worden ist, findet eine Pseudoperoxydasenreaktion statt, d. h«, in Anwesenheit von Wasserstoffperoxyd oxydiert sich das Guajak in eine blaue Verbindung, die photometrisch gemessen werden kann« Die Stärke der blauen Farbe steht in Proportion zur Menge des in der Probe vorhandenen menschlichen Hämoglobins* In dieser Alternative wird also die bei der EIA erforderliche Enzymreaktion nicht benutzt. Dank der Verwendung des spezifischen Antikörpers kann man trotzdem nur das Human-Hämoglobin·messen« .

Eine Ausführungsform der Erfindung wird im folgenden Beispiel beschrieben, auf welches Beispiel die Erfindung aber

nicht beschränkt wird«,

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1· Das die Probe enthaltende Absorbens wird aus dein Deckelteil der Laborseite der Fecatest-Schachtel genommen und z. B. in einer FP-9-Küvette gelegt.

2. Die FP-9-Küvette ist schon vorher mit der Anti-Human-H ämoglobin-IgG-Fraktion sensitiviert worden·

3. Zur Küvette wird 200/ul mit Phosphat gepufferter Salinenlösung (0,1 M PBS, pH 7,4) hinzugesetzte

4. Wird z. B. 2 Stunden lang bei + 37 ⁰C inkubiert.

5· Die Küvette wird mi-t 400 yul von destilliertem V/asser · gewaschen.

6. Zur Küvette wird 200/j.1 von mit einem geeigneten Enzym gestempelter (z. B. alkalische Phosphatase) Anti-Human-Hb-IgG-Fraktion (PBS als Verdünnungsflüssigkeit) hinzugesetzt (Hinzusetzung des Konjugats).

7. Wird Zc Bo -2 Stunden lang bei + 37 ⁰C inkubiert„

8. Wird wie in Abs. 5 gewaschen.

9· Das für das im Konjugat verwendete Enzym spezifische Substrat (im beschriebenen Beispiel Paranitrophenylphosphat) wird hinzugesetzt,

10. Nach einer Inkubation von 30 Minuten (= die Enzymreaktion) (bei + 37 ⁰C) wird zur Mischung zur Beendigung der Reaktion 200 /il einer geeigneten Lösung (in diesem Beispiel 0,1 M/NaOH) hinzugesetzt.

11. Das Schlußergebnis wird entweder photometrisch gemessen oder visuell gelesen.

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Die Reaktion kann auch in manchen anderen V/eisen geführt werden. Das angegebene Beispiel ist nur eines unter manchen Enzym-Immunverfahren,, die sich "bewährt haben. Die Inkubationszeiten, die Volumina der Reaktionsmischungen, die "Enzymstempel" und die Verhältnisse der festen Phase können Variation aufweisen.

Das in der Fecatest-Schachtel vorhandene Absorbens kann den mit einer chemischen Bindung gebundenen spezifischen Antikörper. (Anti-Human-Hämoglobin) enthalten, wobei das Antigen (do h. das menschliche Hämoglobin oder dessen Auflösungsprodukte) schon in dieser Stufe spezifisch gebunden werden« Dabei wird schon das betreffende Absorbens als die feste" Phase, verwendet. Das Verfahren wird weitergeführt, indem nach den Waschvorgängen das Konjugat hinzugesetzt wird, und nach einer gewissen Inkubation und Waschvorgängen wird das Substrat hinzugesetzt, und das Ergebnis wird visuell oder eventuell mit dem Densitometer gelesen«

Claims

58 633/11 - 11 - Erfindungs an sυruch

1« Verfahren für die Ermittlung von Hämoglobin oder von Auflösungsprodukten des Hämoglobins im Exkrement, gekennzeichnet dadurch, daß aus der Probe das menschliche Hämoglobin mittels einer immunologischen Reaktion, d. h. einer Reaktion zwischen einem Antikörper und einem Antigen, getrennt wird, indem ein an eine feste Phase gebundener spezifischer Antikörper des menschlichen Hämoglobins benutzt und danach das an den Antikörper gebundene menschlische Hämoglobin ermittelt wird.

2· Verfahren gemäß Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das an-den Antikörper gebundene menschliche Hämoglobin mittels der Enzym-Immunobestimmung, d. h* der EIA-BeStimmung, ermittelt wird.

3* Verfahren gemäß Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das an den Antikörper gebundene menschliche Hämoglobin durch Hinzusetzen von Guajak und Wasserstoffperoxyd ermittelt wird und daß die Stärke der blauen Farbe der vom oxydierten Guajak gebildeten Verbindung festgestellt wird»

4* \^rerfahren gemäß irgendeinem der obigen Punkte, gekennzeichnet dadurch, daß das im Exkrement vorhandene Hämoglobin und dessen Auflösungsprodukte vor der immunologischen Reaktion aus dem Exkrement ins Absorbens getränkt werden, wonach das Hämoglobin und dessen Auflösungsprodukte in eine Lösung eluiertwerden, -welche Lösung darauf einer immunologischen Reale ti on unterworfen wird zum Trennen des menschlichen Hämoglobins aus der Lösung.