DD157264A1 - Verfahren zur kontinuierlichen herstellung genetisch homogener actinomyceten-kulturen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur kontinuierlichen Herstellung genetisch homogener Actinomyceten-Kulturen und verfolgt das Ziel, das Risiko der Degeneration dieser Mikroorganismen, das bei den bisher bekannten und genutzten Methoden zur Anzucht und Vermehrung auftritt, zu vermeiden. Die Aufgabe, ein dazu geeignetes Verfahren zu beschreiben, wird dadurch geloest, dass die Actinomyceten in einer kontinuierlichen Submerskultur unter geeigneten und reproduzierbaren Bedingungen kultiviert werden.

Description

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'Dipl.-Biol. Martin Roth

Dr· Dieter Noack

Biol«.-Labor«, Karin Gaube

Titel der Erfindung

Verfahren zur kontinuierlichen Herstellung genetisch homogener Actinomyceten-Kulturen

J Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur kontinuierlichen Herstellung von genetisch homogener Biomasse von Actinomyceten, das in der technischen Mikrobiologie sowie in der mikrobiologischen und mikrobengenetischen Forschung einsetzbar ist*

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es ist bekannt, daß Actinomyceten als Produzenten zahlreicher Metabolite und Enzyme in großem Umfang in der pharmazeutischen und mikrobiologischen Industrie eingesetzt werden» Für einen ungestörten und effektiven Produktionsablauf ist die Stabilität der Fähigkeit des betreffenden Produktionsstammes zur Bil*-> ) dung des erwünschten Produkts von entscheidender,Bedeutung·

Aus der Praxis der technischen Mikrobiologie und der genetischen. Grundlagenforschung ist bekannt, daß es bei Produktionsstämmen von Actinomyceten, die zur Herstellung von Metaboliten, wie z_e B₀ Antibiotika und Enzymen_genutzt werden, spontan zur Degeneration kommen kann, die durch den Verlust der Fähigkeit zur Bildung des betreffenden Produkts gekenn-* zeichnet ist·. Weiterhin ist bekannt, daß derartige Degenerationen häufig bei mehrmaligen aufeinanderfolgenden Überimpfungen der Bakterien auf Agarnährböden bzw» Passagierungen in Nährlösungen auftreten (Perlman et al·, Applo Microbiol. (1954·)* 199; Reusser et alo, Apple Microbiol _β $ (1961), 342j Reusser, Adv* Applo Microbiol» j5 (1963)» 189» Freeman und Hopwood, J. Gene Microbiol_e 106 (1978), 377)ο

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Die in der .technischen Mikrobiologie allgemein genutzten Meth®-* den zur Anzucht und Vermehrung von Actinomyceten sind gerade dadurch gekennzeichnet j daß die Biomasse für die Beimpfung der Produk'tionsfermentoren ausgehend von Agarkulturen oder Mycelkonserven durch mehrere aufeinanderfolgende Vorkulturen mit-zu-. nehmenden Kulturvolumina gewonnen wircU Nachteilig an dieser Verfahrensweise ist_? daß sie nur bedingt reproduzierbar ist und daß auf Grund der mehrmaligen "Überimpfungen und der langen Kultivierungszeit das Risiko für eine Degeneration des betreffenden Actinomyceten-Stammes besonders groß ist_e

Ein Kultivierungsverfahren, mit dem unter reproduzierbaren Bedingungen genetisch homogene Biomasse "^on Actinomyceten herge<~ stellt werden kann, ist bisher nicht bekannt_o

Ziel der Erfindung

Die Erfindung verfolgt das Ziel, unter reproduzierbaren Bedingungen genetisch homogene Biomasse von Actinomyceten herzustellen, um die Nachteile der bisher bekannten und genutzten Methoden zur Anzucht und Vermehrung dieser MikroOrganismen zu vermeidenο .

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein kontinuierliches Kultivierungsverfahren zu beschreiben, mit dem genetisch homogene Biomasse von Actinomyceten unter reproduzierbaren Bedingungen hergestellt werden kann« Das Verfahren soll die Nachteile der bisher bekannten Methoden zur Anzucht und Vermehrung dieser Bakterien_s die im Risiko der Degeneration der Bakterien und in der ungenügenden Reproduzierbarkeit bestehen, vermeiden«

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß der-betreffende Actinomyceten-Stamm in einer kontinuierlichen Submerskultur (öhemostat) unter Verwendung einer Mineralsalze, eine organische Kohlenstoff- und eine Stickstoffquelle enthaltenden Nährlösung gezüchtet wird«, Die Art des limitierenden Substrats in der Nährlösung, welches das Wachstum der Bakterien

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in der kontinuierlichen Kultur "begrenzt, und die Verdünnungsrate D im Ohemostaten (D = F/V; F ·.. Zuflußrate der Nährlösung und V »·« Volumen des Kulturgefäßes) sind von ent— 'scheidender Bedeutung für die Erhaltung der genetischen Stabilität der Actinomyceten-Kultiir. . .

Der Erfindung gemäß wird· als limitierendes Substrat in der Nährlösung die Stickstoffquelle verwendet« Die Verdünnungsrate D der kontinuierlichen Kultur soll 20 bis 40 % der maximalen Wachstumsrate des betreffenden Bakterienstammes in der verwendeten Nährlösung betragen· Die Kultivierung wird bei einer Kultivierungstemperatur im Bereich von 25 bis 37 ⁰C durchgeführte

Die kontinuierliche Kultur wird belüftet und bei mycelbildenden Actinomyceten hochtourig gerührt, um eine ausreichende Zerkleinerung des wachsenden Itfycels zu erreichen·

Das Verfahren wird folgendermaßen durchgeführtj

Zur Beimpfung der kontinuierlichen Kultur wird eine Vorkultur des zu kultivierenden Actinomyceten-Stammes hergestellt· Dazu wird eine Nährlösung gleicher Zusammensetzung wie für die kontinuierliche Kultur verwendet. Zur Beimpfung der Vorkultur werden entsprechend der Wachstumsform der Actinomyceten-Art Sporen, Mycel, Mycelfragmente oder Einzelzellen benutzt. Bei Verwendung von Mycel v/erden große Mycelteile bzw* lüycelpellets vorher durch Filtrieren durch ein geeignetes Bakterienfilter entfernt, so daß eine Suspension von lycelteilen möglichst geringer Größe gewonnen wird. Nach Erreichen der logarithmischen Wachstumsphase wird die Vorkultur in das leere Kulturgefäß des ohemostaten eingeimpft© Die Belüftung und die Rührung werden eingestellt. Die Wahl der Drehzahl des Rührers erfolgt in Abhängigkeit von der Actinomyceten-Art in der Weise, daß eine möglichst weitgehende Fraktionierung des Mycels gewährleistet wird, ohne daß es zur Lyse des Mycels kommto

Eine konstante Zuflußrate der Nährlösung, die Mineralsalze, eine organische Kohlenstoffquelle und als limitierenden Bestandteil eine Stickstoffquelle enthält, wird eingestellt, wobei die Verdünnungsrate D der kontinuierlichen Kultur 20 bis

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4-0 % der maximalen Wachstumsrate der Actinomyceten-Art in dieser Nährlösung betragen soll»·

Das Fließgleichgewicht der kontinuierlichen Kultur (steady state) ist erreicht, wenn mindestens die Mhrlösungsmenge zur Kultur zugeführt worden ist, die dem fünffachen Arbeitsvolumen des Kulturgefäßes entspricht«

Danach kann die aus dem Chemostaten abfließende Kulturlösung gesammelt und weiter verwendet v/erden» Die in der Kultur ent~ haltenen Bakterien sind über mehrere Wochen zu mindestens 99 % hinsichtlich ihrer genetischen Merkmale, wie z» B„ der Fähigkeit zur Bildung von Metaboliten und Enzymen, homogen und stabil« Sie können als Impfmaterial für Fermentationsverfahren in der technischen Mikrobiologie und als Ausgangsmaterial für Stammhaltung und -konservierung verwendet werden· Ebenso eignen sie sich als Ausgangsmaterial für experimentelle Zwecke in der mikrobiologischen und genetischen Forschung*

Ausführungsbeispiel

Das folgende Beispiel dient dazu, die Erfindung zu erläutern, ohne sie Eierauf zu beschränken©

Von einer Schrägagarkultur (AL 53-Agar) des Streptomyces hygroscopic us JA 6599/NG 60-93, Bildner des Macrolid-Antibiotikums Surimycin_s werden die Sporen durch Abschwemmen mit Glucose^· Mineralsalz-Medium gewonnen. Die Suspension wird durch ein G2-Bakterienfilter (YBB Schott & Gen*, Jena) filtriert, um damit große Mycelteile zu entfernen_c Mit der Sporensuspension werden 100 ml Glucose-Mineralsalz-Medium in der Weise beimpft, daß etwa 10 Sporen pro ml enthalten sind* Die Vorkultur wird im Fernbachkolben bei 30 ⁰O auf einem Reziprokschüttler mit einer Frequenz von 130 min 15 Stunden geschüttelte Die Vorkultur enthält darm Mycelflocken mit bis zu 20 Verzweigungen und wird in das leere Kulturgefäß'des Chemostaten. geimpft, das ein Arbeitsvolumen von 250 ml hat«, Danach werden sofort die Nährlösungszufuhr (Glueöse-Mineralsalz-Medium) mit einer Ver~ dünnungsrate von D =0,1 pro h, der Rührer, der aus einem horizontal am Ende der Rührerwelle befestigten Glasplättchen von 25 x 15 x 2 μ besteht, mit einer Drehzahl von 3000 ^

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und die Belüftung mit einer Rate von 0,1 1 Luft pro Stunde und 1 Kulturvolumen eingestellt* Die Kultivierungstemperatur beträgt 30 ⁰C ·

Die kontinuierliche Kultivierung wird unter den genannten Bedingungen 28 Tage lang durchgeführt. Während dieser Zeit sind die aus den Bakterien auf Agarmedium wachsenden Kolonien zu 100 % in der Lage, sowohl Luftmycel als auch das Antibiotikum Turimycin zu bilden_e Die in der Kultur enthaltene Population ist also hinsichtlich dieser beiden Eigenschaften homogen und stabilo

Zusammensetzung von Glucose-Mineralsalz-Medium:

(Angaben in g pro 1)

Glucose 2,0j Mi₄Ol (limitierendes Substrat) 0,08; KH₂PO₄ 2,72; Na₂HPO₄ *' 12 H₂O 7,16; NaOl 5,1; Na₂SO₄ 1,07; MgOl₂ · 6 H₂O 0,041; FeCl₂/., 0,0054; 1^InOl₂ 0,0039; Vitaminfree Oasamino . Acids (Difco Laboratories, Detroit) 0,1« Lösungsmittel aqua desto, pH-Wert 6,8,"

Zusammensetzung von AL 53-Agar:

(Angaben in g pro 1)

Saccharose 3,0; Dextrin 15,ü; Harnstoff 0,1; NaOl 0,5; KH₂PO₄ 0,5; Hefeextrakt 1,0; Pepton (bakto) 5,0; FeSO₄ (1%ig) 1 ml; Fadenagar 15,0; Lösungsmittel aqua dest;, pH-Wert 7?2o

Zur Prüfung der genetischen Homogenität und Stabilität werden aus dem Chemostaten täglich Proben entnommen, verdünnt und auf AL 53~Agar plattiert· Nach Inkubation bei 28 ⁰O wird die Luft« mycel-Bildungsfähigkeit der Kolonien visuell und die Turi~ mycin-Bildungsfähigkeit mit einem bekannten mikrobiologischen Testverfahren (Agardiffusionstest, Kahler und Noack, Zv Allg« Mikrobiolo 14· (1974), 529o) geprüft, wobei aus statistischen Gründen von jeder Probe mindestens 200 Kolonien untersucht werderu

Claims (1)

1. ~ ⁶ ~ 2 17273

   Erfindungsanspruch,

   Verfahren zur kontinuierlichen Herstellung genetisch homogener Actinomyceten-Kulturen, gekennzeichnet dadurch, daß Actin©« myceten in einer kontinuierlichen Submerskultur (Ghemostat) unter Belüftung und bei mycelbildenden Arten unter Mycelfraktionierung gewährleistender, jedoch Mycellyse ausschließen« der hochtouriger Rührung in einer Mineralsalze$ eine organische Kohlenstoffquelle sowie eine Stickstoffquelle_f die als wachs~ tumslimitierendes Substrat verwendet wird, enthaltenden Nährlösung bei einer Verdünnungsrate, die 20 bis 40 % der maximalen Wachstumsrate der betreffenden Actinomyceten-Art in dieser Nährlösung entspricht, und bei einer Kultivierungstemperatur im- Bereich von 25 bis 37 ⁰G kultiviert werden_s und daß die resultierende homogene Actinomyceten-Kultur als Impfmaterial für Fermentationen in der mikrobiologischen Industrie und als Ausgangsmaterial für Forschungszwecke und für Stammhaltung und «konservierung verwendet wird«.