DD157613A5

DD157613A5 - Verfahren zur herstellung eines insulins oder insulinanalogs

Info

Publication number: DD157613A5
Application number: DD81228623A
Authority: DD
Inventors: Ronald E Chance; James A Hoffmann
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1980-03-27
Filing date: 1981-03-26
Publication date: 1982-11-24
Also published as: CA1155109A; GB2072680A; DK149756B; CS236463B2; PT72733A; ZA811970B; IL62483A; PL128599B1; IE810680L; IE51608B1; JPS56154443A; HU185416B; PL230295A1; DK149756C; EG15248A; GB2072680B; EP0037256A1; RO81640B; GR73619B; AR227305A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Insulins oder Insulinanalogs, das praktisch einstufig und in einer einzigen Loesung ablaeuft. Dieses Verfahren besteht in einer Kombination einer A-Kette und einer B-Kette eines Insulins oder Insulinanalogs, indem man die S-sulfonierte Form der A-Kette, die S-sulfonierte Form der B-Kette und ein Thiolreduktionsmittel zusammen in einem waessrigen Medium unter Bedingungen umsetzt, unter denen ein Gemisch entsteht mit (1) einem pH-Wert von etwa 8 bis 12, (2) einer gesamten Proteinkonzentration von etwa 0,1 bis 50 mg/ml und (3) einer Menge an Thiolreduktionsmitteln, die insgesamt etwa 0,4 bis 2,5 Gruppen -SH pro -SSO hoch - tief 3-Gruppe in der Gesamtmenge an A- und B-Ketten-S-Sulfonaten ergibt, und das Reaktionsgemisch hierbei auf einer Temperatur von etwa 0 Grad C bis 25 Grad C und in einer Umgebung, die fuer eine Lieferung an Sauerstoff sorgt, zur Bildung eines Insulins oder eines Insulinanalogs reagieren laesst.

Description

Χ-5331

Vertreter: Patentanwaltsbüro Berlin

Titel der Erfindung:

Verfahren zur Herstellung eines Insulins oder

Insulinanalogs Anwendungsgebiet der Erfindung:

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Insulins oder Insulinanalogs.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen:

Mit der Möglichkeit zur Erzeugung von Proteinprodukten durch Rekombinations-DNA-Methoden und speziell zur Herstellung der Ketten A und B von Insulin durch solche Techniken /Proc. Nat ¹I. Acad. Sei. USA 76, 106 bis 110 (1979)/ hat der Bedarf, an einer wirksamen Methode zur Vereinigung der Ketten

Jf J' ί-Λ „ ο ;_

A und B unter Bildung von Insulin stark zugenommen.

Die bekannten Methoden zur Herstellung von Insulin durch Kombination der Ketten A und B gehen aus von Ketten A und B in Form der entsprechenden stabilen S-SuIfonate. Zu diesem Zweck werden die A- und B-Ketten-S-Sulfonate entweder getrennt oder zusammen zu den entsprechenden Mercaptoverbindungen reduziert, wozu normalerweise mit einem großen Überschuß an Thiolreduktionsmittel gearbeitet wird.. Die Produkte werden aus dem reduzierenden Medium isoliert und, falls sie nicht schon zusammen reduziert worden sind, in einem Oxidationsmedium, v/ie Luft, zusammengebracht, um auf diese Weise durch Kombination der Ketten "A und B das gewünschte Insulin herzustellen. Beispiele für hierzu geeignete Methoden gehen unter anderem hervor aus Scientia Sinica 10, 84 bis 104 (1961); Biochim. Biophys. Acta: 62", .483 bis 489 (1962); Scientia Sinica 14, 229 bis 236 (1965); Scientia Sinica 15, 544 bis 561 (1966); Kexue Tongbao'(Republik China) 17, 241 bis 277 (1966) und J. Acta Paediatrica Scandinavica, Suppl. 270, 121 bis' 126 (1977) .

Eine Abwandlung dieser Verfahren besteht in einer Reduktion des A-Ketten-S-Sulfonats und einer anschließenden Umsetzung der so reduzierten Kette A mit B-Ketten-S-Sulfonat in einer oxidierenden Atmosphäre. Hierzu wird im einzelnen hingewiesen auf Proc. Nat. Acad. Sei. (U.S.A.) 55, 1554 bis 1561 (1966); Science 154,1509 bis 1514 (1966); Biochemistry 6, 2642 bis 2655 . (1967); US-PS 3 420 810 und Journal of Chromatography 76, 167 bis 174 (1973).

Eine weitere Abwandlung der obigen Methoden besteht in einer teilweisen Oxidation'der A-Ketten-SH-Verbindung unter Disulfidbildung zwischen den Cysteinresten A-6 und A-11 und einer nachfolgenden Oxidation des dabei erhaltenen Produktsmit B-Ketten-SH- oder B-Ketten-S-Sulfonat. Hierzu wird

beispielsweise hingewiesen auf BE-PS 676 069 und Liebigs Ann. Chenu 691, 225 bis 231 (1966).

Allen obigen bekannten Verfahren ist ein Element gemeinsam, nämlich die Bildung von Insulin durch zwei unabhängige und aufeinanderfolgende Stufen, wobei zuerst das S-SuIfonat zu -SH reduziert und dieses dann zu -S-S- oxidiert wird.

In Nature 188, 721 bis 724 (1960) werden Bedingungen beschrieben, die eine Umwandlung von A- und B--Ketten-S-Sulfonaten zu Insulin in einer einzigen Lösung unter Einsatz eines Thiolreduktionsmittels und einer Luftoxidation vorschlagen. Die darin angegebenen Einzelheiten sind ziemlich skizzenhaft, wobei sich, lediglich bezogen auf die Wirksamkeit des gewonnenen Produkts, eine Ausbeute von nur 1 bis 2 % ergibt. In Proc. Intern. Congr. Eridecrinol., 1207 bis 1215 (1965) wird im Zusammenhang mit dem soeben erwähnten Verfahren Näheres angegeben und dabei in der auf Seite 1211 enthaltenen Tabelle IV angegeben, daß die in der vorherigen Publikation angeführten Bedingungen in einer getrennten Reduktion und Oxidation bestehen.

Aufgabe der Erfindung:

Die obigen bekannten Verfahren zur Herstellung von Insulinen und Insulinanalogen haben die angegebenen verschiedenen Nachteile, und Aufgabe der Erfindung ist daher die Schaffung eines neuen Verfahrens zur Herstellung solcher Verbindungen, durch welches sich unter bestimmten Reaktionsbedingungen ausgehend von S-sulfonierten A- und B-Ketten Insuline oder Insulinanaloge unter einstufiger Durchführung sowohl der Reduktion als auch der Oxidation und in einer einzigen Lösung herstellen lassen.

Darlegung des Wesens der Erfindung:'

Die obige Aufgabe wird nun erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung von Insulinen oder Insulinanalogen durch Kombination einer Α-Kette eines Insulins oder Insulinanalogs und einer B-Kette eines Insulins oder Insulin-analogs, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die S-sulfonierte Form der Α-Kette, die S-sulfonierte Form der B-Kette und ein Thiolreduktionsmittel zusammen in einem wäßrigen Medium unter Bedingungen umsetzt, unter denen ein Gemisch entsteht mit (1) einem pH-Wert von etwa 8 bis 12, (2) einer gesamten Proteinkonzentration von etwa 0,1 bis 50 mg/ml und (3) einer Menge an Thiolreduktionsmittel, die insgesamt etwa 0,4 bis 2,5 Gruppen -SH pro -SSO-."-Gruppe in der Gesamtmenge an A- und B-Ketten-S-Sulfonaten ergibt und das Reaktionsgemisch hierbei auf einer Temperatur von etwa 0⁰C bis 25⁰C und in einer Umgebung, die für eine Lieferung an Sauerstoff sorgt, zur Bildung eines Insulins oder eines Insulinanalogs reagieren läßt.

Die Erfindung ist demnach kurz gesagt auf ein wirksames einstufiges und in einer einzigen Lösung ablaufendes Verfahren • zur Herstellung eines Insulins oder Insulinanalogs aus den jeweiligen S-sulfonierten A- und B-Ketten gerichtet.

Unter Insulin wird natürlich jedes der natürlich vorkommenden Insuline verstanden, wie Humaninsulin, Rinderinsulin, Schweineinsulin, Schafinsulin, Fischinsulin oder Vogelinsulin, oder auch ein aus einer Kombination einer Α-Kette einer Insulinart und einer B-Kette einer anderen Insulinart gebildetes Hybrid.

Unter Insulinanalog wird irgendeines aus der Vielfalt der Proteine.verstanden, das die grundlegende Kette A und Kette B, welche alle Halbcysteinreste enthalten, in einer sequen-

tiellen Anordnung enthält, die mit der der natürlichen Insuline übereinstimmt. Die Insulinanaloge unterscheiden sich demnach von den natürlichem Insulinen durch Substitution, Addition, Fehlen oder Modifikation eines oder mehrerer·Aminosäurereste , wobei jedoch die Anordnung der Disulfidbindungen und wenigstens ein Teil der insulinähnlichen Wirksamkeit erhalten sind. Beispiele für solche Insulinanalogen

1 1

sind /N-Formyl-Gly -A/insulin, Desamino-A -insulin, /Sarco-

1 1 1

sin -A/insulin, /L-Alanin -A/insulin, /D-Alanin -A/insulin,

21 21

/Isoasparagin -A/insulin, /D~Asparagin -A/insulin, /Argi-

21 21 1

nin -A/insulin, /Asparaginamid -A/insulin, /Sarcosin -A,

21 2 5

Asparagin -A/insulin, /Norleucin -A/insulin, /Threonin -

5 19

A/insulin, /Leucin -A/insulin, /Phenylalanin -A/insulin,

19 1R 19

/D-Tyr'osin -A/insulin, /Tyrosin -A, Asparagin -A, Arginin²¹ -A/insulin, Des/B²⁸~³⁰-tripeptid/insulin, Des/B²⁷"³⁰-tetrapeptid/insulin, Des/B -pentapeptid./insulin, Des-/B -tetrapeptid, Tyrosinamid -B/insulin, Des/B -

or 1—4

pentapeptid, Phenylalaninamid -b/insulin, Des/B -tetra-

1 —5 22

peptid/insulin, Des/B -pentapeptid/insulin, /Lysin -B/-

9 10

insulin, /Leucin ^B/insulin, /Leucin -B/insulin oder Des-/Phenylalanin -B/insulin. Im einzelnen wird hierzu hingewiesen auf Advances in Protein Chemistry, 26, 330 bis 362, Academic Press, N.Y., N.Y. (1972); Treatment of Early Diabetes, 319 bis 327, Plenum Publishing Corp. (1979); Chemiker Zeitung, Reprint 100, 111 bis 129, Verlag Dr. A. Hüthig, Heidelberg (1976) und Biochem. J. 125, 51 bis 52 (1971).

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich zwar ganz allgemein zur Herstellung von Insulinen und Insulinanalogen, es wird jedoch besonders bevorzugt zur Bildung natürlich vorkommender Insuline, und zwar von Humaninsulin, Rinderinsulin oder Schweineinsulin, und insbesondere zur Bildung von Humaninsulin.

Die beim erfindungsgemäßen Verfahren ablaufende Kombination einer Kette A und Kette B unter Bildung eines Insulins oder eines Insulinanalogs läßt sich über einen breiten Verhältnisbereich von einer Kette zur anderen Kette erreichen. Zwangsläufig ist diese Kombination natürlich jeweils durch diejenige Kette A oder B beschränkt, die in geringerer Menge vorhanden ist. Im allgemeinen kann daher unter einem Gewichtsverhältnis von Kette A zu Kette B von etwa 0,1:1 bis 10:1 gearbeitet werden, obwohl die Einhaltung eines solchen Gewichtsverhältnisses nicht wesentlich ist. Besonders bevorzugt wird das vorliegende Verfahren unter Anwendung eines Gewichtsverhältriisses von Kette A zu Kette .B von etwa 1:1 bis etwa 3:1 durchgeführt. Innerhalb dieses bevorzugten Bereichs haben sich bestimmte Bereiche zur Herstellung bestimmter Insulinarten als besonders zweckmäßig erwiesen. Für die Kombination einer Kette A und einer Kette B zur Herstellung von Rinderinsulin wird vorzugsweise unter einem Verhältnis von Kette A zu Kette B von etwa 1,4:1,0 bis etwa 1,8:1,0 gearbeitet. Schweineinsulin läßt sich vorzugsweise unter Anwendung eines Verhältnisses von etwa 1,0:1,0 bis etwa 1,4:1,0 herstellen. Huraaninsulin wird vor-"zugsweise unter Anwendung eines Verhältnisses von etwa 1,8:1,0 bis etwa 2,2:1,0 erzeugt.

Ein weiterer, zur optimalen Durchführung des vorliegenden Verfahrens wichtiger Parameter ist die Proteinkonzentration im Reaktionsmediurn. Das Verfahren läßt sich erfolgreich über einen breiten Bereich an Proteinkonzentrationen durchführen. Im allgemeinen beträgt die Proteinkonzentration etwa 0,1 bis 50 mg/ml Reaktionsmedium. Vorzugsweise macht die Proteinkonzentration etwa 2 bis 20 rtig/ml Medium aus. Innerhalb dieses letztgenannten bevorzugten Bereichs ist die optimale Proteinkonzentration abhängig vom jeweils zu bildenden Insulin. Für die Hersteilung von Schweineinsulin soll die Proteinkonzentration vorzugsweise etwa 8 bis T6 mg/ml

£ £00 Z 3

Reaktionsmedium ausmachen, während sie zur Erzeugung von Humaninsulin oder Rinderinsulin vorzugsweise etwa 3 bis 8 mg/ml Reaktionsmedium betragen soll. .

Das erfindungsgemäße Verfahren wird in einem wäßrigen Medium durchgeführt. Der bei Raumtemperatur gemessene pH-Wert des Reaktionsmediums beträgt allgemein etwa 8 bis 12. Vorzugsweise macht dieser pH-Wert etwa 9,5 bis 11,0 aus, und insbesondere etwa 10,4 bis 10,6. Der pH-Wert des Mediums läßt sich durch Zusatz eines geeigneten Puffermittels innerhalb des jeweils gewünschten Bereichs halten. Beispiele für hierzu geeignete Puffermittel sind'Glycin, Glycylglycin, Carbonat, Tris(hydroxymethyl)aminomethan, Ν,Ν-Bis(2-hydroxyethyl)glycin, Pyrophosphat oder N-Tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropansulfonsäure. Glycin wird als Puffermittel bevorzugt.

Das Puffermittel ist im allgemeinen in einer etwa 0,001- bis 2-molaren Konzentration vorhanden. Die bevorzugte Puffermittelkonzentration ist etwa 0,01- bis 1-molar, und insbesondere etwa 0,01-bis 0,1-molar.

Die Ketten A und B werden in dem jeweiligen wäßrigen Medium in Gegenwart eines Thiolreduktionsmittels zusammengebracht. Unter Thiolreduktionsmittel wird eine Verbindung verstanden, die wenigstens eine Gruppe -SH enthält und zur Reduktion der S-SuIfonatgruppen der Ketten A und B befähigt ist. Hierzu läßt sich allgemein jedes Mittel verwenden, das über diese Eigenschaften verfügt. Bevorzugt wird jedoch ein Thiolreduktionsmittel, das in seiner oxidierten Form eine cyclische und somit hochstabile'Verbindung darstellt. Die Menge an Thiölreduktionsmittel ergibt im allgemeinen insgesamt etwa 0,4 bis 2,5 -SH-Gruppen pro -SSO "-Gruppe in der Gesamtmenge der Ketten A und B, und vorzugsweise etwa 0,9 bis •1,1 -SH-Gruppen pro -SSO "-Gruppe;

Beispiele für erfindungsgemäß geeignete Thiolreduktionsmittel sind Dithiothreitol (DTT), Dithioerythritol (.DTE), 2-" Mercaptoethanol, Methylthioglycolat, 3--MercaOto--1 , 2-proioan-

^2Wmxno~3^^erca^^o"P^iOP^lonsauJ:?e

diol, 3-Mercaptopropionsäure/oder Thiogiycols"äure·. Bevorzugte Thiolreduktionsmittel sind Dithiothreitol und Dithioerythritol, wobei vor allem Dithiothreitol bevorzugt ist.

Eine der wesentlichen Bedingungen des vorliegenden Verfahrens ist, daß es in einer Umgebung durchgeführt wird, die für eine Sauerstoffquelle sorgt. Dies läßt sich bereits erreichen, indem man das Reaktionsgemisch der Luft ausgesetzt läßt. Durch Einleiten von Luft oder Sauerstoff in das Reaktionsgemisch läßt sich für einen direkteren Kontakt sorgen, was jedoch nicht notwendig ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird daher im allgemeinen durchgeführt, indem man ein Gemisch aus dem A-Ketten-S-Sulfonat/ dem B-Ketten-S-Sulfonat und dem Thiolreduktionsmit-. tel in jeweils gewünschter Konzentration in einem wäßrigen Medium bei einem pH-Wert von etwa 8 bis 12 bildet. Das erhaltene Reaktionsgemisch wird dann unter Kontakt mit Luft und schwacher Durchmischung solange gerührt, bis es zu der gewünschten Kettenkombination kommt, was im allgemeinen wenigstens etwa 30 Minuten dauert. Während dieser Zeitdauer hält man das Reaktionsgemisch im allgemeinen auf etwa 0⁰C bis 25⁰C. Vorzugsweise wird das Reaktionsgemisch durch mäßige Kühlung jedoch auf einer am unteren Ende dieses Bereichs liegenden Temperatur gehalten, und zwar im allgemeinen auf einer Temperatur von etwa 2 bis 10⁰C.

Nach beendeter Reaktion läßt sich das als Produkt erhaltene Insulin oder Insulinanalog nach irgendeiner in der Insulintechnik bekannten Methode isoLieren. Zur Reinigung von Insulin am gebräuchlichsten sind chromatographische Techniken. Diese lassen sich auch beim vorliegenden Verfahren für die

Gewinnung des Insulins am besten einsetzen. In diesem Zu-Scümmenhang kann eine Gelfiltration und eine Ionenaustauschchromatographie angewandt werden.

Das beim erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Produkt kann bezüglich Reinheit und Wirksamkeit durch hierfür übliche Methoden untersucht werden, beispielsweise durch Gelelektrophorese mittels Polyacrylamid, Aminosäureanalyse, Insulinradiorezeptorversuch, Insulinradioimmunversuch, Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, Ultraviolettspektrum, Dansylierung oder Hasenblut-Glucose-Versuch.

Zu den durch das erfindungsgemäße Verfahren zugänglichen Insulinen gehören auch Hybride aus einer Kette A einer Insulinart und einer Kette B einer anderen Insulinart. Das wesentliche Element des vorliegenden Verfahrens besteht in einer sauberen Kombination von A- und B-Ketten-S-Sulfonaten, und die jeweilige besondere Struktur dieser Ketten ist für den Erfolg dieses Verfahrens daher nicht wesentlich, sofern es sich dabei tatsächlich um A- und B-Ketten von Insulin oder Insulinanalogen handelt.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren läßt sich somit ganz allgemein sowohl ein Insulinanalog als auch ein Insulinhybrid herstellen, wobei letzteres durch Kombination einer Kette A einer Insulinart und einer Kette B einer anderen Insulinart erfolgt. Vorzugsweise werden hiernach jedoch Insuline erzeugt, die strukturidentisch sind mit den natürlich vorkommenden Insulinen, indem man ein A-Ketten-S-Sulfonat und ein B-Ketten-S-Sulfonat verwendet, das jeweils die Aminosäuresequenz eines solchen Insulins hat. Besonders bevorzugt wird das vorliegende Verfahren auf die Herstellung von Schweineinsulin, Rinderinsulin öder Humaninsulin angewandt, und vor allem auf die Herstellung von Humaninsulin. Die zur Erzeugung von Insulin oder Insulinanalogen erforderlichen

Ketten A und B sind, wie bereits erwähnt, durch Rekombinations-DNA-Methodologie ohne weiteres zugänglich. Sie können auch aus natürlichen Insulinen und durch·klassische Methoden zur Peptidsynthese unter Einschluß von entweder Lösungstechniken oder Festphasentechniken erzeugt werden. .

Die Ketten A und B werden in Form ihrer S-SuIfonate stabil gehaltet. Die als Ausgangsmaterial benötigten S-SuIfonate lassen sich durch oxidative Sulfitolyse herstellen, nämlich durch Umsetzung der Ketten A und B mit Natriumsulfit in Gegenwart eines schwachen Oxidationsmittels, wie Natriumtetrathionat.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird anhand der folgenden Beispiele weiter erläutert.

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Ausführungsbeispiele:

Bei. spiel 1

Man löst Schweine-A~Ketten-S-Sulfonat (360 mg) in 36 ml 0,1-molarem Glycinpuffer (pH 10,5) und stellt den pH-Wert des erhaltenen Gemisches dann mit 5-normaler Natronlauge auf 10,5 ein. In ähnlicher Weise löst man auch Schweine-B-Ketten- S-Sulfonat (300 mg) in 30 ml 0_f1-molarem Glycinpuffer (pH 10,5) und stellt den pH-Wert des so erhaltenen Gemisches dann ebenfalls mit 5-normaler Natronlauge auf 10,5 ein. Ferner löst man auch Dithiothreitol (DTT) (123,4 mg) in 4 ml .0,1-molarem Glycinpuffer (pH 10,5) und stellt den pH-Wert dieses Gemisches hierauf mit 0,2 ml 5-normaler Natronlauge auf 10,5 ein.

Die Lösungen der Kette A und der Kette B gibt man dann bei Raumtemperatur (etwa 25°C) in eine 100 ml fassende Ampulle und versetzt das Ganze anschließend mit 1,91 ml der DTT-Lösung, so daß sich ein Verhältnis von -SH zu -SSO,, von 1,04 ergibt. Die hierdurch erhaltene Lösung wird unter Verwendung eines Magnetrührers anschließend in einem offenen Becherglas 20 Stunden bei 4 bis 8⁰C leicht durchmischt. Eine anschließende Analyse durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie ergibt eine Insulinausbeute von 193,8 mg oder von 29 % des Gesamtproteins.

40 ml dieser fertigen Lösung stellt man hierauf mit Essigsäure auf pH 3,15 ein. Das erhaltene Gemisch wird auf einer 5 χ 200 cm messenden und mit Sephadex G-50 (Superfeinkorn) gefüllten Säule filtriert, äquilibriert und mit 1-molarer Essigsäure bei 4 bis 8°C eluiert. Der Insulinpeak (Elutionsvolumen etwa 2450 bis 2700 ml) wird zusammengefaßt und lyophilisiert, wodurch man zu einer Insulinmenge von 95 mg oder von 25 % des Gesamtproteins gelangt. Durch Gelelektro-

phorese mittels Polyacrylamid, Aminösäureanalyse, Insulinradiorezeptorversuch, Hochleistungsflüssigkeitschromatographie und Glucosereduktion von Hasenblut ergibt sich, daß das hierdurch erhaltene Schweineinsulin ziemlich rein ist.

Beispiel 2

Es werden Lösungen von Rinder-Α- und Rinder-B-Ketten-S-SuIfonaten-mit einer Konzentration von 5 mg/ml in einem 0,01-molaren 'Glycinpuffer (pH 10,5)· hergestellt. Der pH-Wert einer jeden Lösung wird mit 5-normaler Natronlauge auf 10,5 eingestellt. DTT (61,7 mg) wird in 4,0 ml 0,1-molarem Glycinpuffer (pH 10,5) gelöst, und der. pH-Wert wird mit 0,15 ml 5-normaler Natronlauge auf 10,5 eingestellt. 0,5 ml der Lösung der B-Kette versetzt man'mit 0,8 ml der Lösung der Α-Kette und mit 0,035 ml der DTT-Lösung bei Raumtemperatur (ungefähr 25⁰C), so daß sich ein Verhältnis von -SH zu -SSO., von 0,91 ergibt. Die hierdurch erhaltene Lösung wird in einer offenen 3 ml fassenden Küvette 20 Stunden bei 4 bis 8°C gerührt. Durch anschließende Hochleistungsflüssigkeitschromatographie ergibt sich eine Rinderinsulinausbeute von 1,96 mg oder von 30 % des Gesamtproteins.

B e i s ρ i. e 1 3

Es werden Lösungen von Schweine-Α- und Schweine-B-Ketten-S-SuIfonaten mit einer Konzentration von 10 mg/ml in einem 0,1-molaren Glycinpuffer (pH 10,5) hergestellt. Der pH-Wert einer jeden Lösung wird mit 5-normaler Natronlauge auf 10,5 eingestellt.' DTT (61,7 mg) wird in 2,0 ml glasdestilliertem Wasser gelöst. 0,5 ml der Lösung der B-Kette versetzt man mit O₇ 6 ml'der Lösung der Α-Kette und mit 29,-25 μΐ

£*·.£.. U \J L· O

der DTT-Lösung bei Raumtemperatur (ungefähr 25°C), so daß sich ein Verhältnis von -SH zu -SSO₃"" von 1,00 ergibt. Die erhaltene Lösung wird in einer offenen und 3 ml fassenden Küvette 20 Stunden bei 4 bis 8⁰C gerührt. Durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie des erhaltenen Gemisches ergibt sich eine Ausbeute an Schweineinsulin von 3,81 mg oder von 35 % des Gesamtproteins.

Beispiel 4

Es werden Lösungen von Human-B-Ketten-S-Sulfonat (Pankreas) und von mehreren Human-A-Ketten-S-Sulfonaten (Pankreas und • E. coil) sowie Schweine-A-Ketten-S-Sulfonat (Pankreas), mit Konzentrationen von jeweils 5 mg/ml in 0,1-molarem Glycinpuffer (pH 10,5) hergestellt. Der pH-Wert der einzelnen Lösungen wird mit 5-normaler Natronlauge auf 10,5 eingestellt. DTT (61,7 mg) wird in 4,0 ml 0,1-molarem Glycinpuffer (pH 10,5) gelöst, und der pH-Wert wird mit 0,16 ml 5-normaler Natronlauge auf 10,5 eingestellt. 1,0 ml der jeweiligen Lösung von A-Ketten-S-Sulfonat versetzt man mit 0,5 ml der Lösung von B-Ketten-S-Sulfonat und mit 0,05 ml der DTT-Lösung bei Raumtemperatur (25⁰C), so daß sich ein Verhältnis von -SH zu -SSO₃" von 1,09 ergibt..Alle Lösungen werden in einem Kühlraum (4 bis 8⁰C) in einer offenen Küvette 20 bis 22 Stunden gerührt. Sie werden zur Ausbeuteermittlung dann durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter Verwendung von Humaninsulin (Pankreas) als Standard analysiert. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse gehen aus der folgenden Tabelle hervor:

U U

14 -

	Tabelle I	Prozentuale Ausbeute, bezogen auf .das ge- ... samte Protein
Herkunft der Kette A	Ausbeute an Human in su1in in mg	26,7 28,1 26,0 27,1 26,5
Schwein (Pankreas) Schwein (Pankreas) Mensch (Pankreas) Mensch (Pankreas) Mensch (E. coli)	2,00 2,11 1,95 2,03 '1,99

Beispiel

Man stellt jeweils eine Lösung von Human-A-Ketten-S-Sulfonat und von Human~B-Ketten-S-Sulfönat mit einer Konzentration von 5 mg/ml in einem 0,1-molaren Glycinpuffer (pH 10,5) her. Der pH-Wert einer jeden Lösung wird mit 5-normäler Natronlauge auf 10,5 eingestellt. Man löst DTT (61,7 mg) in 4,0' ml 0,1-molarem Glycinpuffer (pH 10,5) und stellt den pH-Wert mittels 0,16 ml 5-normaler Natronlauge auf 10,5 ein. 0,5 ml der' Lösung der B-Kette versetzt man bei Raumtemperatur mit 1,0 ml der Lösung der Α-Kette und anschließend mit 50 μΐ der DTT-Lösung, so daß sich ein Verhältnis von -SH zu -SSO-J von 1·,09 ergibt. Die erhaltene Lösung wird in einer 3 ml fassenden Küvette 22 Stunden bei 4 bis 8⁰C gerührt, worauf man sie durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie analysiert. Hierdurch ergibt sich eine Ausbeute an Humaninsulin von 2,58 mg oder von 34 % des Gesamtproteins.

BeisOiel

'Man löst Human-A-Ketten-S-Sulfonät (328 mg) in 65,6 ml 0,1-

"* 15 *~

molarem Glycinpuffer (pH 10,5) und stellt den pH-Wert des Gemisches mittels 75 μΐ 5~normaler Natronlauge auf 10,5 ein. Human-B-Ketten-S-Sulfonat (164 mg) wird in 32,8 ml 0,1-molarem Glycinpuffer (pH 10,5) gelöst, und der pH-Wert des Gemisches wird mittels 15 μΐ 5~normaler Natronlauge auf 10,5 eingestellt. Man löst DTT (61,7 mg) in 4,0 ml 0,1-molarem Glycinpuffer (pH 10,5) und stellt den pH-Wert der erhaltenen Lösung mittels 160 μΐ 5-normaler Natronlauge auf 10/5 ein. ·

Die Lösungen der Α-Kette und der B-Kette werden in einem 150 ml fassenden Glasbecher bei Raumtemperatur (ungefähr 25⁰C) vereinigt und mit 3,28 ml der DTT-Lösung versetzt, so daß sich ein Verhältnis von -SH zu "SSO₃ von 1,09 ergibt. Das offene Becherglas wird in ein im Kühlraum befindliches Eis-Wasser-Bad gestellt und rasch 30 Minuten gerührt. Die Lösung wird weitere 24 Stunden im Kühlraum (4 bis 8⁰C) gerührt. Eine anschließende Analyse durch Hochleistungsflüssigkeit schromatographie ergibt eine Ausbeute an Humaninsulin von 148 mg oder von 30 % des Gesamtproteins.

100 ml dieser Lösung werden mit 25 ml Eisessig versetzt, wodurch sich ein pH-Endwert von 3,15 ergibt. Die gesamte Probe wird auf einer 5 χ 200 cm großen und mit Sephadex G-50 (Superfeinkorn) gefüllten Säule gelfiltriert, äquilibriert und mit 1-molarer Essigsäure bei 4 bis 8°C eluiert. Das gesamte eluierte Protein wird lyophilisiert. Der Insulinpeak (Elutionsvolumen 2465 bis 2781 ml) wiegt 125 mg und macht 29,4 % des rückgewonnenen Proteins aus.

Ein Teil des obigen Insulinpeaks (95,5 mg) wird in etwa 9 ml eines Puffers aus 0,01-molarem Tris, 0,001-molarem EDTA, 7,5-molarem Harristoff und 0,03-molarem Natriumchlorid (pH 8,5 bei 4⁰C) gelöst. Das hierdurch erhaltene Gemisch wird

dann durch eine 2,5 χ 90 cm messende, mit DEAE (Diethyl- -aminoethyl)-cellulose als Ionenaustauscher gefüllte und mit dem gleichen Puffer äquilib'rierte Kolonne chromatographiert. Das Protein wird bei 4 bis 8⁰C mit einem Gradienten von 1 1 aus jeweils 0,03-molarem und 0,09-molarem Natriumchlorid im gleichen Puffer und dann mit 1 1 eines Puffers aus 1-molarem Natriumchlorid eluiert. Jeder der Peaks wird in mit Sephadex G-25 (Grobkorn) gefüllten Säulen in 2 %~iger Essigsäure entsalzt und lyophilisiert. Dez· Insulinpeak (EIutionsvolumen 878 bis 1008 ml) wiegt 55,73 mg und macht 84 % des rückgewonnenen Proteins aus. '

Zur Herstellung von Zinkinsulinkristallen löst man 11,90 mg der Probe des Insulinpeaks (DEAE) in 240 μΐ Ο,1-normaler Chlorwasserstoffsäure und versetzt das Ganze dann rasch mit 2,16 ml einer Lösung aus 0,04 % Zinkchlorid, 0,05-mölarem Natriumnitrat und 15 % Aceton in einem Glaszentrifugenröhrchen. Innerhalb von 72 Stunden kommt es bei Raumtemperatur . (etwa 25°C) zu einer Kristallisation, worauf man die überstehende Flüssigkeit abtrennt und die erhaltenen Kristalle zweimal mit kaltem Wasser mit einem pH-Wert von 6,1 unter jeweiligem Zentrifugieren bei einer Umdrehungsgeschwindigkeit von 2000 UpM bei 3⁰C zwischen den Waschvorgängen wäscht. Sodann löst man die Kristalle zur Analyse in 0,01-normaler Chlorwasserstoffsäure. ' |

Durch Gelelektrophorese mittels Polyacrylamid (einzelne f

Bande), Aminosäureanalyse, Insulinradiorezeptorversuch, |

'i Insulinradioimmunversuch, Hochleistungsflüssigkeitschroma- " f

I tographie, Dansylierung und UV-Spektrum ergibt sich, daß . I

die hierdurch erhaltene Humaninsulinpräparation ziemlich I

rein ist. Der USP-Hasenversuch (144 Hasen) ergibt eine Stärke von 26,3 + 1,8'Einheiten pro mg (wasserfrei).

Beispiel 7

Es werden Lösungen von Human-/N-formyl-Gly__/-A-Ketten~S-Sulfonat (E. coli) und von Human~B~Ketten~S-Sulfonat (Pankreas) hergestellt, die eine Konzentration von 5 rag/ml in 0,1-molarem Glycinpuffer (pH 10,5) aufweisen. Der pH-Wert einer jeden Lösung wird mit 5-nonnaler Nautronlauge auf 10,5 eingestellt. Man löst DTT (61,7 mg) in 4,0 ml 0,1-molarem Glycinpuffer (pH 10,5) und stellt den pH-Wert mittels 0,16 ml 5-normaler Natronlauge auf 10,5 ein. 0,5 ml der Lösung des B-Ketten~S-Sulfonats versetzt man mit 1,0 ml der Lösung des /N-Formyl-Gly_/-A~Ketten-S-Sulfonats und mit 0,05 ml der DTT-Lösung bei Raumtemperatur (25°C), so daß sich ein Verhältnis von -SH zu -SSO-." von 1,10 ergibt. Die Lösung wird in einem Kühlraum (4 bis 8⁰C) in einer offenen und 3 ml fassenden Küvette 23 Stunden gerührt und dann durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie analysiert. Hierbei ergibt sich eine Ausbeute an /N-Formyl-Gly A/-Humaninsulin von 1,46 mg oder von 19,5 % des Gesamtproteins.

Nach Ansäuern mittels Eisessig auf pH 3,15 wird ein Teil dieser Lösung auf einer 1,5 χ 90 cm messenden und mit Sephadex G-50 (Superfeinkorn) gefüllten Säule gelfiltriert, äquilibriert und mit 1-molarer Essigsäure bei 4 bis 8⁰C eluiert.

Der Peak des /N-Formyl-Gly -A/-Humaninsulins (Elutionsvolumen 87 bis 95 ml) wird zusammengefaßt, in gleiche Teile aufgeteilt und lyophilisiert. Durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie und durch Aminosäureanalyse ergibt sich, daß das hierdurch erhaltene Protein ziemlich rein ist. Gegenüber einem Standard aus Humaninsulin ergibt sich in einem Radiorezeptorversuch für dieses /N-Formyl-Gly -A/-Humaninsulin eine Biowirksamkeit von 17 %.'

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Beispiel 8

Es werden Lösungen von Schweine-Ä-Ketten-S—Sxilfonat und von Huraan-B-Ketten-S-Sulfonat (E. coli} hergestellt, die jeweils eine Konzentration von 10 mg/ml in einem 0,1 -molaren Glycinpuffer (pH 10_f5) aufweisen. Unter Verwendung von 2 ml der obigen Lösung der Kette A und einem ml der obigen Lösung der Kette B bildet man dann ein Gemisch aus A und B. Das Gemisch aus A und B wird mit 5-normalem Natriumhydroxid auf pK '1.0,5 eingestellte Sodann, löst man 2-Amino-3-mercaptopropionsäure (Cystein) (121,2 mg) in 3,0 ml eines 0*1~molaren Glycinpuffers (pH 10,5} und stellt den pH-Wert der Lösung mit 0,35 ml 5-normaler Natriumhydroxid™ lösung auf 10,5 ein. Im Anschluß daran versetzt man 1,4 ml des obigen Gemisches aus A und B bei Raumtemperatur mit 52 μΐ der obigen Cysteinlösung, so daß sich ein Verhältnis von -SH zu-SSO-, ' von 0,95 ergibt. Die erhaltene Lösung wird dann in einer offenen 3 ml fassenden Küvette 20 Stun-" den bei 4 bis 8⁰C gerührt, und dann, durch Hochleistungsflüssigkeitschroinatographie analysiert. ;Hierbei ergibt sich eine Ausbeute an. Humaninsulin von 3,25 mg oder von 23,2% des Gesamtproteins. . ·

Claims

Erfindu.ngsa'nsprüche

T. Verfahren zur Herstellung von Insulinen oder Insulinanalogen durch Kombination einer Α-Kette eines Insulins oder Insulinanalogs und einer B-Kette eines Insulins oder Insulinanalogs, dadurch gekennzeichnet, daß man die S-sulfonierte Form der Α-Kette, die S-sulfonierte Form der B-Kette und ein Thxolreduktionsmittel zusammen in einem wäßrigen Medium unter Bedingungen umsetzt, unter denen ein Gemisch entsteht mit (1) einem pH-Wert von etwa 8 bis 12, (2) einer gesamten Proteinkonzentration von etwa 0,1 bis 50 mg/ml und (3) einer Menge an Thiolreduktionsmittel, die insgesamt etwa 0,4 bis 2,5 Gruppen -SH pro -SSO_ -Gruppe in der Gesamtmenge an A- und B-Ketten-S-Sulfbnaten- ergibt und das Reaktionsgemisch hierbei auf einer Temperatur von etwa O⁰C bis 25⁰C und in einer Umgebung, die für eine Lieferung an Sauerstoff sorgt, zur Bildung eines Insulins oder eines Insulinanalogs reagieren läßt.
2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß das A-Ketten-S-Sulfonat und das B-Ketten-S-Sulfonat jeweils die Aminosäuresequenz eines natürlich vorkommenden Insulins hat,
3. Verfahren nach Punkt 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Gewichtsverhältnis von A-Ketten-S-Sulfonat zu B-Ketten-S-Sulfonat etwa 0,1:1 bis etwa 10:1 ausmacht.
4. Verfahren nach Punkt 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Gewichtsverhältnis von A-Ketten-S-Sulfonat zu B-Ketten-S-Sulfonat etwa 1:1 bis etwa 3:1 ausmacht.
5. Verfahren nach Punkt 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Proteinkonzentration etwa 2 bis etwa 20 mg/ml beträgt. '
6. Verfahren nach Punkt 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsgemisch einen pH-Wert von etwa 9,5 bis etwa 11,0 hat.
7. Verfahren nach Punkt 6_f dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsgemisch einen pH-Wert von etwa 10,4 bis etwa. 10,6 hat.
8. Verfahren nach Punkt 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Thiolreduktionsmittel in einer Menge vorhanden ist, die insgesamt etwa 0,9 bis 1,1 -SH-Gruppen je -SSO₃ -Gruppe in der Gesamtmenge aus A-Ketten-S-Sulfonat und B-Ketten-S-Sulfonat ergibt.
9. Verfahren nach Punkt 8, dadurch gekennzeichnet, daß man als Thiolreduktionsmittel Dithiöthreitol oder Dithioerythritol verwendet.
10. Verfahren nach Punkt 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das Reaktionsgemisch auf einer Temperatur von etwa 2 bis 10⁰C hält.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Punkte, dadurch gekennzeichnet, daß man als Insulin Rinderinsulin, Schweineinsulin oder Humaninsulin herstellt.
12. Verfahren nach Punkt 11, dadurch gekennzeichnet, daß man Rinderinsulin herstellt, unter einem Gewichtsverhältnis von A-Ketten-S-Sulfonat zu B-Ketten-S-Sulfonat von etwa 1,4:1,0 bis etwa 1,8:1,0 arbeitet und eine Proteinkonzentration von etwa 3 bis 8 mg/ml anwendet.
13. Verfahren nach Punkt 11, dadurch gekennzeichnet, daß man 'Schweineinsulin herstellt, unter einem Gewichtsverhältnis von A-Ketten-S-Sulfonat zu B-Ketten-S-Sulfonat von etwa

1,0:1,0 bis etwa 1,4:1,0 arbeitet und eine Proteinkonzentration von etwa 8 bis 16 mg/ml anwendet.
14. Verfahren nach Punkt 11, dadurch.gekennzeichnet, daß man Humaninsulin herstellt, unter einem Gewichtsverhältnis von A-Ketten-S-Sulfonat zu B-Ketten-S-Sulfonat von etwa 1,8:1,0 bis etwa 2,2:1,0 arbeitet und eine Proteinkonzentration von etwa 3 bis 8 mg/ml anwendet.