DD159264A3 - Verfahren zur beimpfung bei fermentationsprozessen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Beimpfung bei Fermentationsprozessen, insbesondere von Biomassebildungsprozessen unter Anwendung von Mischkulturen. Der Erfindung liegt das Ziel der Erhoehung der Stabilitaet des Fermentationsprozesses bei gleichzeitiger Verbesserung technisch-oekonomischer Kennzahlen zugrunde. Die technische Aufgabe besteht darin, ein vorteilhaftes Regime der Bereitstellung von Impfmaterial zu schaffen. Erfindungsgemaess wird die Aufgabe geloest durch bevorzugte Nutzung des Ablaufs des Produktionsfermentors als Impfmaterial und die spezielle Ausgestaltung einer Impfmaterialkreislaufeinrichtung, der das Impfmaterial zugefuehrt und entnommen wird und das insbesondere eine aus mehreren, voneinander abgetrennten, Untereinheiten bestehende Lagereinrichtung enthaelt. Aufwendungen fuer Einrichtungen zur Impfmaterialherstellung, wie z.B. Impffermentoren, Verzoegerungen des Wachstumsprozesses, insbesondere solche infolge unguenstiger Kulturzusammensetzung, u. Risiken d. Impfmateriallagerung werden wesentl. eingeschraenkt.

Description

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Titel

Verfahren zur Beimpfung bei Fermentationsprozessen

.^J Anw endung s p; ebi e t der Er findung

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Verbesserung der Beimpfung von Fermentoren, insbesondere bei Prozessen zur Biomas segewinnung unter Anwendung von Mischkulturen. Es gehört in das Gebiet der technischen Mikrobiologie. Die Erfindung läßt sich der IPK C12N zuordnen.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen " '

Ein Verfahren zur Züchtung von Mikroorganismen im technischen

Prozeß umfaßt üblicherweise neben den Einrichtungen zur Reaktion der Mikroorganismen mit dem Nährmedium, der C-Quelle und dem Sauerstoff bei insbesondere aeroben Prozessen sowie Einrichv..' tungen zur Vorbereitung dieser Materialien und den Einrichtungen für die Aufarbeitung des Kulturmediums auch Einrichtungen zur Bereitstellung von Mikroorganismenrnasse als sogenanntes Impfmaterial. Diese Einrichtungen werden als notwendig erachtet, um dem Produktionsfermentor insbesondere beim Produktionsbeginn und nach Unterbrechungen der Produktion aus vorzugsweise technologischen Gründen Mikroorganismen in geeigneter Menge und in geeignetem Zustand zuführen zu können.. In der Regel wird dieses sogenannte Impfmaterial in vorzugsweise absatzweise arbeitenden Fermentoren von wesentlich"unter dem Volumen des Produktionsf ennentors liegenden Volumen produziert.

Nachteilig.dabei ist, daß das Impfmaterial bei einmaligem Betreiben des Impffermcntors in einer Menge anfällt, die wesentlich kleiner ist als die zur Füllung des Produktionsfermentors

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erforderliche Menge* Üblicherweise schafft man Abhilfe da- ' durch, daß der Produktionsfermentor durch Zugabe eines Mediums, das die erforderlichen Reaktanden enthält, 'auf die zur Produktionsdurchführung erforderliche Menge aufgefüllt wird. ' Das hat aber nachteilig zur Folge, daß die Konzentration der Produktionskultur im Reaktionsmedium gering ist, so daß zum einen die Gefahr besteht, daß eine bestimmte minimale Konzentration, die erfahrungsgemäß bei 2 - 5 g Mikroorganismenmasse pro 1 Fermentationsmedium liegt und unterhalb derer oft ein Wachstum'nicht oder nur stark verzögert eintritt, nicht erreicht wird« Andererseits wird, insbesondere bei Prozessen, die mit einer bestimmten, im allgemeinen günstigerv/eise hohen, Biomassekonzentration, insbesondere kontinuierlich, arbeiten sollen, in der Zeit des Wachstumsprozesses bis zum Erreichen eben dieser Konzentration der Produktionskultur im Fermentor kein voller Ausstoß erreicht, wodurch die Wirtschaftlichkeit des Prozesses eingeschränkt ist. Nachteilig ist weiterhin, daß, insbesondere bei der Kultivierung von Mischkulturen, die Zusammensetzung des im Impffermentor erzeugten Impfmaterials

D aufgrund der insbesondere bei Verwendung unterschiedlicher Fermentortypen für Impffermentoren und Produktionsfermentoren unterschiedlichen Kultivierungsbedingungen von der im Produktionsf ermentor abweicht und deshalb infolge der notwendigen Adaptionen Verluste in der Kulturleistung auftreten.

Es ist auch bekannt, Impfmaterial bereitzustellen dadurch, daß man bei Unterbrechung der Kultivierung aus technischen oder technologischen Gründen das Kultivierungsmedium im Fermentor, eventuell unter Zugabe geeigneter Substanzen, aufrahmen läßt und das Aufgerahmte im Fermentor oder in einem Aufrahmbehältnis lagert und es anschließend als Impfmaterial verwendet (British Patent Specifikation No. 1 214 957). Nachteilig dabei ist, daß Impfmaterial nur bei Unterbrechung des Prozesses anfällt. Grund der Unterbrechung ist aber oft eine Kontamination der Kultur, so daß das so bereitgestellte Impfmaterial zum Beimpfen des Prozesses nicht geeignet ist. Gleiches gilt, wenn die Biomasse während der Lagerung kontaminiert wird oder durch zur.lange Lagerdauer verdirbt. Dann muß jeweils die gesamte Biomasse verworfen werden.

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• Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zu schaffen, durch das eine stabile und ökonomisch vorteilhafte Fahrweise von Produktionsfermentoren durch eine kontinuierliche Bereitstellung von mit geringem Aufwand erzeugten Impfmaterial erreicht wird.

Darlegung des Y/esens der Erfindung

Aus dem Ziel der Erfindung ergibt sich die technische Aufgabe, ein Regime der Bereitstellung von Impfmaterial zu finden, das überwiegend ohne die üblicherweise erforderlichen Impffermen-...10 tor en auskommt, ungünstige Phasen verminderter Produktivität infolge ungünstiger Kulturzusammensetzung ausschließt und eine effektivere Nutzung vorhandenen Impfmaterials gestattet. Die gestellte Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß bevorzugt dem Produktionsfermentor selbst ständig oder periodisch ein festgelegter Anteil des dem eingestellten •Fließregime entsprechenden Massenstroms an Fermentorablauf entnommen und einer Impfmaterialkreislaufeinrichtung, enthaltend speziell ausgestaltete Einrichtungen zur zeitlich begrenzten Lagerung des Impfmaterials nach einer zweckmäßig gewählten Konservierungsmethode und zur Förderung des Impfmaterials vorn und zum Produktionsfermentor, zum Zwecke der Verwendung als Impfmaterial zugeführt und ihr erforderlichenfalls entnommen wird.

j Die Verwendung von Ablauf des Produktionsfermentors als Impfmaterial hat wesentliche ökonomische Vorteile. Insbesondere brauchen die bisher verwendeten Einrichtungen zum Zwecke der Erzeugung von Impfmaterial, insbesondere die Impffermentoren, nur über wesentlich geringere Zeiträume betrieben zu werden, können geringere Volumen aufweisen oder sind überhaupt nicht · erforderlich. Ein anderer Vorteil, insbesondere bei der Kultivierung von Mischkulturen, liegt darin, daß als Impfmaterial Fermentationsmedium verwendet wird, dessen Eigenschaften insbesondere bezüglich der Kulturzusammensetzving den Bedingungen während des Produktionsprozessen entsprechen, so daß Verluste, die sich während des Prozesses der Einstellung des Gleichgewichts zwischen den Kulturkomponenten ergeben können, vermieden werden.

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Die Entnahme des Teilstroms aus dem Produktionsprozeß zur Ein- · speisung in die Impfmaterialkreislaufeinrichtung erfolgt an geeigneten Stellen der Produktionsanlage. Erfahrungsgemäß ist es zweckmäßig, daß der Teilstrom den Einrichtungen zur Aufarbeitung des Fermentorablaufs, die dem Produktionsfermentor verfahrenstypisch nachgeschaltet sind, entnommen wird. Der Teilstrom kann so bemessen sein, daß er 0,1 bis 100 Ma.-% des gegebenenfalls νerfahrenstypisch abgetrennten Fermentorablauf mass enstroms entspricht, insbesondere dem, durch den erreicht ist, daß bei einer vorgegebenen Masse an Mikroorganismensuspension im Lagerbehältnis die Aufenthaltsdauer der Mikroorganismenmassesuspension im Lagerbehältnis geringer ist als die bei der angewandten Kultivierungsmethode zulässige Läge- · rungsdauer.

Die Lagerung der Mikroorganismenmasse wird erfindungsgemäß in solchen Lagereinrichtungen durchgeführt, die aus mehreren, voneinander abgetrennten, Einheiten bestehen. Diese voneinander abgetrennten Einheiten werden jeweils nacheinander und unabhängig voneinander befüllt. Damit wird vorteilhaft erreicht, daß Chargen weitgehend gleicher Eigenschaften der Mikroorganismenmasse entstehen, eine Vermischung frischer mit gelagerter Mikroorganismenmasse weitgehend unterbleibt und bei Störungen des Lagerungs- oder des Produktionsprozesses nur der jeweils betroffene Teil der Mikroorganismenmasse verworfen zu werden braucht.

Aus diesen Ergebnissen entsteht.ein wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Die angegebenen Vorteile werden bevorzugt dann wirksam, wenn durch die Unterteilung eine hohe Zahl von Untereinheiten entsteht. Vorteilhaft ist, wenn mehr als zwei Untereinheiten gebildet werden. Zweckmäßig ist es, das Volumen der Untereinheiten so festzulegen, daß in diesen Einrichtungen weitgehend gleiche räumliche Bedingungen, insbesondere bezüglich der Temperatur, entstehen. Auf diese Weise ist erreicht, daß die Qua- ' lität der gelagerten Biomasse räumlich konstant ist. Die Konstanz der physikalischen Bedingungen kann durch geeignete Zusatzeinrichtungen verbessert hergestellt v/erden. Die Untereinheiten können beliebig ausgestaltet sein. Insbesondere können

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sie auch durch Unterteilung einer Lagereinrichtung durch Trennwände, die als Kühlelemente ausgebildet sind, hergestellt werden. Es ist auch möglich, als Untereinheiten einzelne kleinere Behältnisse zu benutzen.

Günstigerweise enthalten die Untereinheiten Einrichtungen, mittels derer eine einfache Entnahme des gelagerten Materials möglich ist. Insbesondere soll die Entnahme kleinerer Mengen ohne wesentliche Beeinflussung des restlichen Inhaltes möglich sein. Dadurch ist gegeben, daß eine Überwachung der Qualität der Biomasse während der Lagerung möglich wird. Es ist zweckmäßig, Qualitätskontrollen turnusmäßig durchzuführen. Auf der Grundlage der Ergebnisse der Qualitätskontrollen kann die Auswahl der für die Nutzung als Impfmasse geeigneten Chargen erfolgen. Chargen, deren Eigenschaften bestimmten Qualitätsanforderungen nicht entsprechen oder deren Lagerzeit eine festgelegte, insbesondere die durch die angewendete Konservierungsmethode maximal zulässige^Grenze überschreitet, können dem Produktionsprozeß an geeigneter Stelle, insbesondere räumlich hinter der Entnahmestelle,zur weiteren verfahrenstypischen Aufarbeitung wieder zugeführt bzw. verworfen v/erden.

Das Gesamtvolumen der Lagereinrichtung kann so festgelegt sein, daß sie ein Volumen an Mikroorganismenmassesuspension enthält, das einer Mikroorganismenmasse im Lagerungsbehältnis von 1 bis 1000 Ma.-%, vorzugsweise 100 bis 250 Ma.-% derjenigen Masse

,) entspricht, die für die im Produktionsfermentor geforderten Arbeitsbedingungen erforderlich ist.

Die beschriebene Impfmaterialkreislaufeinrichtung, insbesondere die Lagereinrichtung, kann auch dann auf die beschriebene Weise benutzt werden, wenn das Impfmaterial gegebenenfalls anderen Einrichtungen zur Erzeugung von Impfmaterial, z. B. Impffermentoren, entnommen ist. Dieser Pail kann bevorzugt beim Produktionsbeginn eintreten. Vorteilhaft ist hierbei, daß der Impffermentor klein ausgeführt sein kann, weil das Impfmaterial jeweils einzeln bis zum Erreichen der zum Produktionsbeginn erforderlichen Masse gelagert werden kann.

Die Beimpfung des Produktionsfermentors-mit Impfmaterial wird erforderlichenfalls so ausgeführt, daß der Impfmaterialkreis-

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laufeinrichtung Impfmasse in einer Menge entnommen wird, durch die die gewünschte Konzentration an Mikroorganismenmasse im Produktionsfermentor erreicht wird. Dazu wird die erforderliche Anzahl von Untereinheiten des Lagerungsbehältnisses geleert, wobei die Auswahl der zu leerenden Untereinheiten nach den Qualitätseigenschaften der in den Untereinheiten gelagerten Mikroo-rganismenmasse erfolgt.

Das Verfahren ist anwendbar für mikrobiologische Prozesse mit. beliebigen Kultur/Substrat-Kombinationen, insbesondere bei Verwendung von Mischkulturen und/oder Mischsubstraten, und für Fermentationseinrichtungen beliebiger Form und Größe.

Ausführungsbei spi ele

Beispiel 1

In einem kleintechnischen Rührfermentor mit einem Arbeitsvolumen von 100 1 wird die Bakterienkultur MB 58 IMET B 346 bei einem pH-Wert von 4 +0,1 und einer Temperatur von 305 K + 1 K im kontinuierlichen Prozeß mit einer Verweilzeit von 5 h gezüchtet. Als Substrat dient Methanol. Die aktuelle Konzentration des Methanols im Fermentor beträgt 1 g/kg, die Biomassekonzentration 40 g/kg. Das anorganische Hährmedium enthält, bezogen auf 1 Liter, in Form von Ammoniak, Phosphorsäure, Kaliumchlorid und Sulfaten 5 mg Fe, 1900 mg N, 5 mg Zn, 1300 mg P₂°5> ^{8 m}S Mn» 580 mg K, 1,8 mg Cu, 60 mg Mg. Der Ener gieeintrag beträgt 8 W/kg. Zur Einstellung der Verweilzeit werden dem Fermentor stündlich 20 1 Fermentationsmedium entnommen.

An den Fermentor . ist eine Impfmaterialkreislaufeinrichtung folgender Art angeschlossen. Sie besteht aus VA-Rohrleitungen mit einem Durchmesser von 20 mm, einer Lagereinrichtung und je einer Pumpe zur Förderung des Fermentationsmediums zur Lagereinrichtung und von der Lagereinrichtung zum Fermentor. Die Lagereinrichtung hat ein Volumen von 200 1 und ist in 5 Kammern zu je 40 1 eingeteilt. Die Kammern sind einzeln über 3-Wege-Hähne mit den Rohrleitungen verbunden. Jede Kammer be-

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sitzt Stutzen zur Probenahme, Entleerung und Sterilisation. Die gesamte Einrichtung ist vor Betrieb dampfsterilisiert." Die Einrichtung ist mit dem Fermentor in der Weise verbunden, daß ihr Eingang mit dem Fermentoraustrittsstutzen und ihr Ausgang mit einem Fermentoreingangsstutzen über 3-V/ege-Hähne verbunden ist.

Der Impfmaterialkreislaufeinrichtung wurde Fermentationsmedium als Impfmaterial in einer Menge von zunächst 100 % des Fermentorablaufs zugeführt, bis die einzelnen Kammern nacheinander und getrennt befüllt waren. Dann wurde die erstbefüllte Kammer entleert und die der Impfmaterialkreislaufeinrichtung zugeführ-

) te Menge-auf 4 l/h reduziert. Nach Füllung der Kammer wurde das älteste Impfmaterial verworfen und die entsprechende Kammer dampfsterilisiert und neu befüllt. Auf diese Weise war in der Lagereinrichtung ständig eine Masse von 160 Liter Impfmaterial enthalten, davon waren 40 Liter nicht älter als 20 Stunden. Mach 2 Tagen Produktion im stabilen Zustand wurde der Fermentationsprozeß abgebrochen und nach 24 Stunden Unterbrechung neu begonnen. Der Fermentor wurde entleert, gereinigt und anschließend neu beimpft. Dazu wurden der Lagereinrichtung Proben aus Jeder .Kammer entnommen. Diese wurden der mikrobiologischen Kontrolle unterworfen. Alle Proben wiesen genügend gute Qualität auf, insbesondere war die Zusammensetzung der Kultur unverändert. Der Lagerungseinrichtung wurde daraufhin Impfmaterial in

^5 einer Masse von 100 kg entnommen und dem Fermentor zugeführt. Nach einer kurzen Lag-Phase begann der normale Fermentationsprozeß. Die entleerten Kammern der Lagereinrichtung wurden gesäubert, dampf sterilisiert und sukzessive wieder befüllt.

Beispiel 2 , '

Es wurde ein Prozeß gemäß Beispiel 1 betrieben. Als Impfmaterialkreislaufeinrichtung dienten 5 Plastbehältnisse mit einem Füllvolumen von je 50 Liter. Sie wurden nacheinander mit Fermentorablauf befüllt. Danach wurde das jeweils älteste Impfmaterial verworfen und das entsprechende Behältnis nach Sterilisation neu befüllt. Nach einer Produktionsdauer von 12 Ta-. gen bei einer Produktivität von 8 kg/th wurde die Kultur nach

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einem Fehler der Ammoniakdosiereinrichtung zur pH-Regelung irreversibel geschädigt. Der Prozeß wurde daraufhin abgebrochen. Die Qualitätskontrolle des Inhaltes der 5 Lagerungseinrichtungen ergab, daß nur die Impfrnasse des zuletzt befüllten Behältnisses geschädigt war. Das Material wurde verworfen. Der Prozeß wurde nach Durchführung der üblichen Reinigungsmaßnahmen mit dem frischesten vorliegenden Impfmaterial beimpft. Der Produktionsbeginn erfolgte praktisch ohne Lag-Phase.

Unter gleichen technischen Bedingungen wie in Beispiel 2 wurde der Hefestamm Lodderomyces elongisporus IMET H 128 bei einem pH-Wert von 4>1 ±0{\ und einer Temperatur von 305 K + 1 K sowie einer Luftzufuhr von 1,5 1/1.min gezüchtet. Als Substrat diente ein Erdöldestillat, dessen n-Alkane die Kettenlänge Gq - Cp5' überwiegend CLp - C.gj besitzen. Die Siedelage des Destillats betrug 230 - 360 ⁰C, die Konzentration des Destillats im Permentati on smedi um 14,8 %. Das Verfahren wurde mit einer Verweilzeit von 5 Stunden durchgeführt. Das Nährmedium war, bezogen auf einen Kubikmeter, wie folgt zusammengesetzt: Phosphorsäure (75 %) 54O ml, Kaliumchlorid 600 g, Magnesiumsulfat 275 g, Eisenchlorid 18 g, Mangansulfat 16 g, Zinksulfat 16,5 g und Kupfersulfat 1,7g· · ' Dem Prozeßwasser wurde zur Verbesserung des Sauerstoffübergangs ein Hilfsstoff vom Charakter eines Propylenoxid-Äthylenoxid-Adduktes in einer Konzentration von 600 mg/1 Prozeßwasser zugesetzt.

Der Prozeß wurde über einen Zeitraum von 18 Tagen mit einer Produktivität von 5 kg/th betrieben. Während. dieser Zeit wurde Fermentorablauf als Impfmaterial der Impfmaterialkreislaufein- : richtung zugeführt und das jeweils älteste Material verworfen. Dadurch war immer eine Impfmaterialmenge von 200 Litern vorhanden. Am 19· Tag des Produktionszeitraumes wurde die Verfärbung des Permentationsmediums beobachtet. Ursache war das Auftreten einer pigmentbildenden Begleitflora, die auf Lyse- und Stoffwechselprodukten der Hauptkultur wächst.

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Zum Zeitpunkt der Erkennung dieser Farbänderung war Impfmaterial der zuletzt befüllten Lagereinrichtungen betroffen.'Es wurde verworfen. Der Prozeß wurde unterbrochen und eine Reinigung des Permentors mit den üblichen Methoden durchgeführt. Die Neubeirnpfung des Permentors erfolgte sofort im Anschluß an die~Reinigungsarbeiten, wobei Material aus dem zweiten .und dritten Lagerbehältnis entnommen wurde. Sämtliche entleerten Lagerbehältnisse wurden sofort gesäubert, dampfsterilisiert und anschließend nacheinander wieder befüllt.

Claims (1)

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   Erfindungsanspruch

   1. Verfahren zur Beimpfung bei Fermentationsprozessen, insbe- ·. sondere bei Prozessen zur Biomassegewinnung unter Anwendung von Mischkulturen, gekennzeichnet dadurch, daß als Impfmaterial für die Beimpfung des Produktionsfermentors Mikroorganismenmassesuspension dient, die bevorzugt dem Produk-

   ... tionsprozeß selbst entnommen ist und daß das Impfmaterial dem Produktionsfermentor über eine Impfmaterialkreislaufeinrichtung zugeführt wird, der MikrοOrganismenmassesuspension kontinuierlich in einer Masse von 0,01 bis 100 Ma.-% des Permentorablaufs oder diskontinuierlich aus dem Permentorablauf zugeführt γ/ird und die insbesondere eine aus mehreren, bevorzugt mehr als zwei, voneinander stofflich abgetrennten und wahlweise mit Zusatzeinrichtungen für insbesondere eine zweckmäßig angewendete Konservierungsmethode versehenen Untereinheiten bestehende Lagereinrichtung enthält, deren Volumen so festgelegt ist, daß sie ein Volumen an Mikroorganismenmasse aufnehmen kann, das einer Mikroorganismenmasse in der Lagereinrichtung von 0,1 bis 1000 Ma.-/?, vorzugsweise 100 bis 250 Ma.-%,derjenigen Masse entspricht, die für die Einstellung der im Produktionsfermentor vorgesehenen Mikroorganismenmassekonzentration erforderlich ist und deren Untereinheiten unabhängig voneinander insbesondere befüllt und nach Maßgabe der Qualitätseigenschaften der in ihnen gespeicherten Mikroorganismenmasse entleert v/erden können.