DD161185A3 - Verfahren zur fluorografischen radioaktivitaetsbestimmung markierter makromolekuele und zellen - Google Patents
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Abstract
Die fluorografische Radioaktivitaetsbestimmung markierter Makromolekuele und Zellen ist in der medizinischen und veterinaermedizinischen Diagnostik sowie der molekularbiologischen und biochemischen Forschung anwendbar. Das Ziel der Erfindung besteht darin, durch eine Vorrichtung und ein technisch einfach durchzufuehrendes fluorografisches Verfahren die Routinediagnostik oekonomischer zu gestalten. Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung und ein Verfahren zu entwickeln, die eine quantitative Bestimmung der Radioaktivitaet von in waessrigen Suspensionen vorliegenden markierten Makromolekuelen, Viren und Zellen mittels Fluorografie zulassen. Erfindungsgemaess wird die Aufgabe dadurch geloest, indem eine Vorrichtung, bestehend aus Grundplatte, Membranfilter mit Stuetzschicht sowie einer Auftrageschablone mit 25 Bohrungen von einem Rahmen umgeben ist, wobei Auftrageschablone und Grundplatte mittels zweier Bolzen verbunden sind. Die gesamte Vorrichtung sitzt mit der Grundplatte auf einem evakuierbaren Behaelter auf. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass die markierten Makromolekuele als kreisfoermige Flecken auf einem Filterabschnitt fixiert und als Filmschaerzung nachgewiesen werden.
Description
Titel der Erfindung
Verfahren zur fiuorografischen Radioaktivitätsbestimmung markierter Makromoleküle und Zellen
Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung bezieht eich auf ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Aktivität von in wäßrigen Lösungen bzw. Suspensionen vorliegenden, mit schwachen ß-Strahlern (z. B. 3H, 14C) radioaktiv markierten biologischen (Nukleinsäuren, Proteinen) und anderen Makromolekülen, Viren sowie verschiedensten Zellen und Mikroorganismen.
Das Verfahren ist in der medizinischen und veterinärmedizinischen Diagnostik sowie der molekularbiologischen und biochemischen Forschung einsetzbar.
Anwendungsmöglichkeiten ergeben sich so z.B. beim Nachweis und der quantitativen Erfassung von Viren mit assoziierten Polymerasen, von Immunkomplexen, von biologischen bzw. enzymatischen Vorgängen, bei denen Makromoleküle synthetisiert, modifiziert oder abgebaut werden.
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen
Zur Bestimmung der Radioaktivität von mit schwachen ß-Strahlern markierten Makromolekülen oder Zellen werden diese als unlösliche Präzipitate durch Filtration auf Papier-, Glasfaser- oder Membranfilter fixiert und durch Waschen von nicht eingebauter und daher löslicher Radioaktivität befreit. Für die Messung der Radioaktivität der Präzipitate sind Flüssigkeitsszintillationszähler mit speziellen Küvetten erforderlich. Diese Geräte sind sehr kompliziert und teuer. Deshalb ist die Anschaffung meist nur größeren Forschungseinrichtungen und Kliniken möglich. Außerdem ist die Meßkapazität begrenzt und die Geräte benötigen eine qualifizierte Wartung. Schließlich fallen radioaktive und brennbare Lösungsmittelabfälle an.
Ziel der Erfindung
Ziel der Erfindung ist die quantitative Bestimmung der Radioaktivität von in wäßrigen Lösungen oder Suspensionen vorliegenden, mit schwachen ß-Strahlern (3H, 14C u.a.) markierten Makromolekülen, Viren und verschiedensten Zellen mit Hilfe eines generell anwendbaren und technisch einfach durchführbaren fiuorografischen Verfahrens, welches in der
Routinediagnostik einsetzbar ist. Damit wird die Auswertung vieler Tests und analytischer Methoden, die auf
Radioaktivitätsmessungen basieren, wesentlich vereinfacht und kostengünstiger gestaltet.
Darlegung des Wesens der Erfindung
Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zu entwickeln, das eine quantitative Bestimmung der Radioaktivität von in wäßrigen Lösungen oder Suspensionen vorliegenden, mit schwachen ß-Strahlern markierten Makromolekülen, Viren und verschiedensten Zellen mittels Fluorografie zuläßt.
Mit den erfindungsgemäßen Verfahren können derartige Materialien, die als Flecken auf Membranfilterfolien oder Glasfaserfilter fixiert sind, fluorografisch als Filmschwärzung nachgewiesen werden.
Dazu werden die Proben direkt oder deren unlösliche Präzipitate mittels einer geeigneten Filtrationsvorrichtung in Form kleiner, kreisförmiger Flecken auf einem quadratischen Glasfaser- oder Membranfilter fixiert. Der Durchmesser dieser Flecken muß relativ gering sein (etwa 6mm), um eine örtlich hohe Konzentration der Radioaktivität und damit eine möglichst starke Filmschwärzung und hohe Empfindlichkeit zu erzielen. Wegen des kleinen Fleckendurchmessers ist es weiterhin möglich, sehr viele Proben (25 Oder mehr) auf einem Filterabschnitt gleichzeitig auszuwerten. Nach dem Fixieren der Proben wird der Filter mit einer geeigneten Szintillatorsubstanz imprägniert.
Der fluorografische Nachweis der Radioaktivität erfolgt in modifizierter Form zu der in der Literatur beschriebenen Auswertung von Acrylamid-Elektrophoresegelen und dünnschichtchromatografischen Platten.
Durch visuellen Vergleich mit einer Standardreihe (Schwärzungsskala) ist eine halbquantitative Auswertung der
Filmschwärzung möglich, die für die meisten Zwecke der Routinediagnostik ausreicht. Eine quantitative Bestimmung kann mit einem Densitometer durchgeführt werden. Das fluorografische Verfahren ist sehr empfindlich, relativ einfach und erfordert im Gegensatz zur Flüssigkeitsszintillationszählung weder kostspielige Geräte noch speziell ausgebildetes Personal und Serviceleistungen.
Ausführungsbeispiel
Das Verfahren wird nachfolgend am Beispiel der Bestimmung von Viren mit assoziierten Polymerasen (z.B. bovines Leukämievirus (BLV), Hepatitis B-Virus [HBV]) erläutert. Zur radioaktiven Markierung werden die Viren mit einer der üblichen Methoden angereichert (z.B. Ultrazentrifugation oder Polyethylen-Glykolfällung), die Polymerasereaktion unter Zusatz eines 3H- oder ,4C-markierten Nukleosidtriphosphates in 100μΙ Testansätzen durchgeführt und die Reaktionsprodukte mit ΙΟΟμΙ eiskalter 10%iger Trichloressigsäure ausgefällt.
Erfindungsgemäß werden dann 25 Testansätze zu je 200 μΙ mittels einer geeigneten Filtrationsvorrichtung auf einem 60 x 60 mm Cellulosenitrat-Membranfilter abgesaugt.
Der Filter wird zur Entfernung löslicher radioaktiver Produkte etwa 10mal mit kalter 5%iger Trichloressigsäure gewaschen, aus der Apparatur entnommen und kann nach Trocknen bei etwa 60°C fluorografisch ausgewertet werden. Der Membranfilter wird dazu mit der Lösung einer Szintillatorsubstanz (z.B. 2,5 Diphenyloxazol, PPO; 10g in 20ml Toluol) getränkt, getrocknet und zur besseren Handhabung auf Karton befestigt. 60mm breite Röntgenfilmstreifen (HS 11; ORWO Wolfen) werden in Röntgenfilmkassetten mit den so behandelten Filtern, je nach der aufgetragenen Aktivität, zwischen 6 Stunden und 5 Tagen bei -78°C (Trockeneis) exponiert.
Eine Exposition bei -30°C (Tiefkühlschrank) ist auch möglich, erfordert aber längere Expositionszeiten.
Der Film wird mit Röntgenentwickfer (TR 30 + TS 30; ORWO Wolfen) unter üblichen Bedingungen entwickelt. Bei einer Exposition von 120Std. bei -78°C liegt die Nachweisgrenze bei etwa 1,7 Bq (100dpm) 3H bzw. 0,17 Bq (10dpm) ,4C. Zur Anfertigung der Standardreihe (Schwärzungsskala) werden 3H-DNA-Verdünnungen in logarithmischen Stufen im Bereich von 1,7 bis 3400 Bq (100 bis 10*dpm) verwendet.
Claims (1)
- -ι- 226 983 2Erflndungsanspruch:Verfahren zur fluorografischen Radioaktivitätsbestimmung markierter Makromoleküle und Zellen, gekennzeichnet dadurch, daß diese Materialien als kreisförmige Flecken auf einem Filterabschritt fixiert und ihre Radioaktivität fiuorografisch als Filmschwärzung nachgewiesen bzw. quantitativ bestimmt wird.Titel der ErfindungVerfahren zur fluorografischen Radioaktivitätsbestimmung markierter Makromoleküle und ZeilenAnwendungsgebiet der ErfindungDie Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Aktivität von in wäßrigen Lösungen bzw. Suspensionen vorliegenden, mit schwachen ß-Strahlern (z. B. 3H, 14C) radioaktiv markierten biologischen (Nukleinsäuren, Proteinen) und anderen Makromolekülen, Viren sowie verschiedensten Zellen und Mikroorganismen.Das Verfahren ist in der medizinischen und veterinärmedizinischen Diagnostik sowie der molekularbiologischen und biochemischen Forschung einsetzbar.Anwendungsmöglichkeiten ergeben sich so z.B. beim Nachweis und der quantitativen Erfassung von Viren mit assoziierten Polymerasen, von Immunkomplexen, von biologischen bzw. enzymatischen Vorgängen, bei denen Makromoleküle synthetisiert, modifiziert oder abgebaut werden.Charakteristik der bekannten technischen LösungenZur Bestimmung der Radioaktivität von mit schwachen ß-Strahlern markierten Makromolekülen oder Zellen werden diese als unlösliche Präzipitate durch Filtration auf Papier-, Glasfaser- oder Membranfilter fixiert und durch Waschen von nicht eingebauter und daher löslicher Radioaktivität befreit.Für die Messung der Radioaktivität der Präzipitate sind Flüssigkeitsszintillationszähler mit speziellen Küvetten erforderlich. 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Damit wird die Auswertung vieler Tests und analytischer Methoden, die auf Radioaktivitätsmessungen basieren, wesentlich vereinfacht und kostengünstiger gestaltet.Darlegung des Wesens der ErfindungDie Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zu entwickeln, das eine quantitative Bestimmung der Radioaktivität von in wäßrigen Lösungen oder Suspensionen vorliegenden, mit schwachen ß-Strahlern markierten Makromolekülen, Viren und verschiedensten Zellen mittels Fluorografie zuläßt.Mit den erfindungsgemäßen Verfahren können derartige Materialien, die als Flecken auf Membranfilterfolien oder Glasfaserfilter fixiert sind, fiuorografisch als Filmschwärzung nachgewiesen werden.Dezu werden die Proben direkt oder deren unlösliche Präzipitate mittels einer geeigneten Filtrationsvorrichtung in Form kleiner, kreisförmiger Flecken auf einem quadratischen Glasfaser- oder Membranfilter fixiert. Der Durchmesser dieser Flecken muß relativ gering sein (etwa 6mm), um eine örtlich hohe Konzentration der Radioaktivität und damit eine möglichst starke Filmschwärzung und hohe Empfindlichkeit zu erzielen. Wegen des kleinen Fleckendurchmessers ist es weiterhin möglich, sehr viele Proben (25 oder mehr) auf einem Filterabschnitt gleichzeitig auszuwerten. Nach dem Fixieren der Proben wird der Filter mit einer geeigneten Szintillatorsubstanz imprägniert.Der fluorografische Nachweis der Radioaktivität erfolgt in modifizierter Form zu der in der Literatur beschriebenen Auswertung von Acrylamid-Elektrophoresegelen und dünnschichtchromatografischen Platten.Durch visuellen Vergleich mit einer Standardreihe (Schwärzungsskala) ist eine halbquantitative Auswertung der Filmschwärzung möglich, die für die meisten Zwecke der Routinediagnostik ausreicht. Eine quantitative Bestimmung kann mit einem Densitometer durchgeführt werden. Das fluorografische Verfahren ist sehr empfindlich, relativ einfach und erfordert im Gegensatz zur Flüssigkeitsszintillationszählung weder kostspielige Geräte noch speziell ausgebildetes Personal und Serviceleistungen.AusführungsbeispielDas Verfahren wird nachfolgend am Beispiel der Bestimmung von Viren mit assoziierten Polymerasen (z. B. bovines Leukämievirus (BLV), Hepatitis B-Virus [HBV]) erläutert. Zur radioaktiven Markierung werden die Viren mit einer der üblichen Methoden angereichert (z.B. Ultrazentrifugation oder Polyethylen-Glykolfällung), die Polymerasereaktion unter Zusatz eines 3H- oder 14C-markierten Nukleosidtriphosphates in 100μΙ Testansätzen durchgeführt und die Reaktionsprodukte mit ΙΟΟμΙ eiskalter 10%iger Trichloressigsäure ausgefällt.Erfindungsgemäß werden dann 25 Testansätze zu je 200 μΙ mittels einer geeigneten Filtrationsvorrichtung auf einem 60 χ 60 mm Cellulosenitrat-Membranfilter abgesaugt.Der Filter wird zur Entfernung löslicher radioaktiver Produkte etwa 10mal mit kalter 5%iger Trichloressigsäure gewaschen, aus der Apparatur entnommen und kann nach Trocknen bei etwa 600C fiuorografisch ausgewertet werden. Der Membranfilter wird dazu mit der Lösung einer Szintillatorsubstanz (z.B. 2,5 Diphenyloxazol, PPO; 10g in 20ml Toluol) getränkt, getrocknet und zur besseren Handhabung auf Karton befestigt. 60mm breite Röntgenfilmstreifen (HS 11; ORWO Wolfen) werden in Röntgenfilmkassetten mit den so behandelten Filtern, je nach der aufgetragenen Aktivität, zwischen 6 Stunden und 5 Tagen bei -78°C (Trockeneis) exponiert.Eine Exposition bei -30°C (Tiefkühlschrank) ist auch möglich, erfordert aber längere Expositionszeiten.Der Film wird mit Röntgenentwickler (TR 30 + TS 30; ORWO Wolfen) unter üblichen Bedingungen entwickelt. Bei einer Exposition von 120Std. bei -780C liegt die Nachweisgrenze bei etwa 1,7Bq dOOdpm) 3H bzw. 0,17Bq (10dpm) 14C. Zur Anfertigung der Standardreihe (Schwärzungsskala) werden 3H-DNA-Ven1ünnungen in logarithmischen Stufen im Bereich von 1,7 bis 3400Bq (100 bis 10*dpm) verwendet.
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|---|---|---|---|---|
| WO1999026065A1 (en) * | 1997-11-18 | 1999-05-27 | Medicine Quantale Limited | Methods and apparatus for determining beta radiation spectra |
-
1981
- 1981-01-14 DD DD22698381A patent/DD161185A3/de unknown
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