DD202626A5 - Eine fluessigkeitschromatographie-saeule, verfahren zu ihrer herstellung und ihrem einsatz bei der fraktionierung - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Fluessigchromatografie-Saeule und Verfahren zu ihrer Herstellung, beispielsweise fuer die direkte Analyse von Blutserum. Ziel der Erfindung ist die Verbesserung der Elutionsgeschwindigkeit und der Haltbarkeit derartiger Saeulen. Erfindungsgemaess besteht die neue Fluessigchromatografie-Saeule aus einem mit hohem Fuellungsverhaeltnis gefuellten Bett vollstaendig poroeser, Vinylalkohol-Einheiten enthaltender und einen durchschnittlichen Korndurchmesser von 4 bis 20 mym aufweisenden Gelen, wobei das Gelbett einen Gleichmaessigkeitsgrad von 2,0 bis 4,0 zeigt und der genannte Gleichmaessigkeitsgrad sich ergibt aus HETP/Dp, wobei HETP der aequivalenten Fuellkoerperhoehe und Dp dem Massemittel-Korndurchmesser der Gele entspricht. Die erfindungsgemaesse Saeule wird hergestellt unter Vermeidung von abrupten Veraenderungen der Fliessgeschwindigkeit oder des Druckes waehrend des Vorganges der Saeulenbefuellung.

Description

Berlin, 20. 9. 1982 AP B 01 D/237 376/0 60 348 12

Flüssigchromatografie-Säule und Verfahren zu ihrer Herstellung .

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Plüssigchromatografie-Säule, welche aus vollständig porösen Gelen besteht, die Vinylalkohol-Einheiten enthalten. Im besonderen bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine schnell arbeitende Plüssigchromatografie-Säule von hohem Auflösungsvermögen, bestehend aus einem einheitlichen Gelbett in hohem Packungsverhältnis vorliegender vollständig poröser Gele, welche Vinylalkohol-Einheiten enthalten und ein"hohes Wasseraufnahmevermögen sowie eine verbesserte mechanische Festigkeit aufweisen. Die Säule eignet sich primär zur Durchführung der ge1chromatografisehen Separation unter Verwendung eines wäßrigen Eluenten. Die Erfindung bezieht sich des weiteren auf ein Verfahren zur Herstellung einer solchen Säule wie auch auf die Methode ihres Einsatzes bei der Fraktionierung. Der hier verwendete Begriff "vollständig porös" bedeutet, daß die feinen Poren über das gesamte Gelkorn verteilt sind. Mit dem Begriff "Vinylalkohol-Einheiten" ist eine Komponente der Formel

-GH-CH₀-i 2

OH

gemeint.

Die Plussigchromatografie ermöglicht die Fraktionierung eines Flüssiggemisches in dessen Flüssigbestandteile, wobei der Flüssigzustand aufrechterhalten wird. Es ist nicht erforderlich - wie bei der Gaschromatografie - Proben in den Gaszustand zu bringen; die gewünschten Substanzen kön-

-MKE 1982*038915

60 348 12 - 2 -

nen ohne Durchlaufen von Degradationen oder Veränderungen separiert werden. Daher wird die Flüssigchromatografie in verschiedenen Bereichen wie etwa in der Chemie, Biochemie und Pharmazie genutzt. Je nach dem Mechanismus der Separierung wird die Flüssigchromatographie unterteilt in die Gelchromatografie (im folgenden mit GO bezeichnet), die Verteilungschromatografie, die Adsorptionschromatografie, die Ionenaustauschchromatografie und andere.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

In Übereinstimmung mit den jüngsten beträchtlichen Fortschritten der Schnellchromatografie und deren gesteigerter Anwendung in vielen Bereichen besteht im Fachgebiet ein starker Bedarf daran, jene für ein wäßriges Lösungsmittel geeigneten GC-Säulen hinsichtlich ihrer Wirksamkeit zu verbessern, die zur Separierung wasserlöslicher Lösungsbestandteile in deren molekulare Größen unter Einsatz von Wasser oder einer wäßrigen Lösung als Eluent verwendet werden.

Zu den für ein wäßriges Lösungsmittel geeigneten GC-Säulen, die am breitesten Verwendung finden, gehören die destrangel- oder agarosegelgepackten Säulen. Diese in derartigen Säulen enthaltenen Gele gehören zu den weichen Gelen, folglich ist eine Schnellanalyse möglich. Hinsichtlich der "weichen Gele" sei auf die GB-OS 2 O61 954 A verwiesen. Als ein gegenüber den oben erwähnten Säulen bereits verbesserter Säulentyp wird eine Polyethylenglykoldimethakrylat-Gel-gepackte Säule genannt, welche jedoch hinsichtlich der Trennkapazität und der Fließgeschwindigkeit des Eluenten immer noch nicht befriedigen kann.

In der JP-OS 138 077/1977 wurde vorgeschlagen, ein wäßri-

i U I U.

60 348 12

ges Gel- zu verwenden, das durch Verseifen von Körnern eines Kopolymers von Diethylenglykoldimethakrylat oder dergleichen mit Vinylazetat sowie durch Vernetzen des verseiften Kopolymers mit Epichlorhydrin gewonnen wird, Diese Publikation enthält indes keine Beschreibung einer ausreichenden Separation bei hoher Fließgeschwindigkeit. Eine unzureichende Separation ist zum Teil auf die Korngröße der Gele zurückzuführen, welche bis zur Maschenweite 300 bis 400 reicht.

Hinsichtlich der Gewährleistung von relativ schneller Analyse und verbesserter Separation sind Säulen vorgeschlagen worden, die mit porösen Kieselgel gepackt sind; deren Oberfläche ist einer chemischen Behandlung unterzogen worden, um die Adsorption von gelösten Stoffen an dieser Oberfläche zu verhindern. Säulen dieses Typs werden in der Tat im weiten Umfang genutzt. Nun ist das Skelett der Gele jedoch anorganisch und damit ist es schwierig, deren Porendurchmesser in vergleichbarer Weise zu überprüfen; der Porendurchmesser ist ein wichtiges Merkmal von GC-Gelen, seine mangelhafte Kontrollierbarkeit hat zur Folge, daß sich der optimale Porendurchmesser-Bereich verengt. Darüber hinaus ist es schwierig, ein hohes Packungsverhältnis des Gelbettes zu erreichen, dies wirkt sich in einer geringen Haltbarkeit der Säule aus. Des weiteren muß sich bei Verwendung einer Kieselgelsäule der pH-Wert des eingesetzten Eluenten im Bereich von 3 bis 9 befinden. Selbst in diesem pH-Bereich wandern Spuren von Silikatmaterial in das abfließende Medium, dies beeinflußt die chromatografische Analyse in nachteiliger Weise.

Um eine leistungsstark gepackte Säule herzustellen, kommt es in ausschlaggebendem Maße darauf an, in welchem Zustand das Gelbett gebildet wird. Anschaulicher gesagt kommt es

ί. w ι y i ν

60 348 12

darauf.an, ein hochverdichtetes Gelbett in einer gleichmäßigen Weise herzustellen. Diesem Konzept folgend» wurde in der JP-OS 60 290/1978 vorgeschlagen, großkörnige und kleinkörnige Gele gleichmäßig zu vermischen, um so ein hohes Paekungsverhältnis des Gelbettes zu erhalten. Dieses Verfahren hat den Nachteil, daß es auf Grund des Vermischens von großkörnigen Gelen unweigerlich von einer gesteigerten "äquivalenten Füllkörperhöhe" (im folgenden als HETP-Wert bezeichnet) begleitet wird. Der HETP-Wert entspricht jener Säulenlänge, deren Ausbeute am abfließenden Medium im Gleichgewicht mit der mittleren Konzentration über jene Länge während der stationären Phase ist. Die Nachteile der oben erwähnten herkömmlichen Säulen stehen im Zusammenhang mit der inhärenten Hatur der Gele und dem Zustand des geformten Gelbettes.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung einer verbesserten Flüssigchromatografie-Säule, insbesondere einer schnell laufenden, hoch trennenden und dauerhaften Säule.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine verbesserte Flüssigchromatografie-Säule zu schaffen, welche ein gleichmäßiges hoch gefülltes Bett solcher Gele umfaßt, die keine Adsorption von gelösten Stoffen und damit eine unzureichende Komponententrennung bewirken (mit anderen Worten: die eine nichtionische, aber in hohem Maße wasseraufnehmende chemische Struktur aufweisen), welche eine im Optimalbe« / reich befindliche Porengröße und Porosität besitzt und, welche die Form von feinen Körnern aufweist, um damit eine

£, U I.U I U

60 348 12

hohe Auflösung und gleichzeitig eine gute mechanische Festigkeit aufweisen und für die chromatografische Schnellanalyse geeignet sind»

Ausführliche und intensive Untersuchungen des Beitrages der verschiedenen Paktoren zur Wirksamkeit der GC-Füllkörpersäule ergaben die Optimalkombination von Bedingungen für eine schnell laufende, in hohem Maße auflösenden Flüssigchromatografie-Säule von verlängerter Haltbarkeit.

Erfindungsgemäß wird eine Flüssigchromatografie-Säule zur Verfügung gestellt, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie aus einem mit hohem Füllungsverhältnis gefüllten Bett vollständig poröser, Yinylalkohol-Einheiten enthaltender und einen durchschnittlichen Korndurchmesser von 4 bis 20/Um aufweisenden Gelen besteht, wobei das Gelbett einen Gleichmäßigkeitsgrad von 2,0 bis 4,0 zeigt und der genannte Gleichmäßigkeitsgrad sichergibt aus HETP/Dp, wobei HETP der äquivalenten Füllkörperhöhe und Dp dem Massemittel-Korndurchmesser der Gele entspricht.

Erfindungsgemäß sind die Gele von einem Yinylkarboxylat-Homopolymer oder -Kopolymer abgeleitet. Bei dem Kopolymer handelt es sich um ein* Kopolymer aus Yinylkarboxylat und ein einen Isozyanuratring enthaltendes vernetzbares Monomer oder um ein Kopolymer aus Yinylkarbosylat und ein einen Zyanuratring enthaltendes vernetzbares Monomer, insbesondere um Triallylisozyanurat.

Das Yinylkarboxylat-Homopolymer oder Kopolymer kann erfindungsgemäß von einem Monomer abgeleitet sein, welches mindestens zwei Estergruppen von Yinylkarboxylat enthält, beispielsweise Divinyladipat.

60 348 12 _ 6 -

Die erfindungsgemäße Flüssigchromatografie—Säule ist insbesondere dadurch, gekennzeichnet, daß die Gele einen Wasserwiedergewinnungswert von 0,6 bis 2,0 ml/g sowie einen Vi/Vo-Wert von 1,0 bis 2,0 aufweisen, wobei Vi dem inneren 'Volumen des Gelkornes und Vo dem Hohlraumvolumen zwischen den Gelkörnern entspricht.

Die Gele weisen eine Hydroxylgruppenkonzentration von 3 bis 15 Milliäquivalent/g und ein Füllungsverhältnis von 0,66 bis 0,78 auf.

Bevorzugt besitzt die Säule einen Innendurchmesser von 4 bis 50 imn und eine Länge von 100 bis 600 mm.

Erfindungsgemäß wird eine verbesserte, insbesondere eine schnell laufende, scharf trennende und dauerhafte Flüssigchromatografie-Säule zur Verfügung gestellt»

Weiterhin wird ein Verfahren zur Herstellung einer derartigen verbesserten Flüssigchromatografie-Säule zur Verfugung gestellt.

Unter Verwendung einer derartigen verbesserten Flüssigchromatografie-Säule ist die Anwendung einer neuartigen Analysenmethode, beispielsweise für die Schnellanalyse von Blut, möglich.

Abbildung 1' verdeutlicht in einem Diagramm, wie Ve (. Peak—Slutions—

60 348 12

volumen - siehe weiter unten) und W (Peakbreite - siehe weiter unten) ermittelt werden, Auf deren Grundlage wird der HETP-Wert berechnet.

Abbildung 2 ist ein Chromatogramm einer Mischung aus handelsüblichem Thyroglobulin, Albumin, Myoglobin und Phenylalanin (durch UV-Absorption bei 254 nm nachgewiesen), welches unter Einsatz einer Flüssigchromatografie-Säule gemäß Ausführungsbeispiel 1 (siehe weiter unten) gewonnen wurde.

Die Abbildung 3 (a) und (b) zeigt Ghromatogramme, die durch Fraktionierung von Humanserum (durch UV-Absorption bei 254 nm nachgewiesen) gemäß Ausführungsbeispiel 3 (siehe weiter unten) gewonnen wurden. Abb. 3 (a) ist das Chromatogramm von normalem Humanserum. Abb. 3 (b) zeigt das Chromatogramm von Serum bei renalem Versagen.

Abbildung 4 ist das Chromatogramm des Serums bei renalem Versagen (durch UV-Absorption bei 254 nm nachgewiesen), gewonnen durch Fraktionierung gemäß Vergleichs-Ausführungsbeispiel 1 (siehe weiter unten).

Abbildung 5 (a) und (b) zeigt Chromatogramme, die durch Fraktionierung des bei Nierenversagen gegebenen Serums (durch UV-Absorption bei 254 nm nachgewiesen) unter Einsatz der Flüssigchromatografie-Säule gemäß Ausführungsbeispiel 4 (siehe weiter unten) gewonnen wurden. Abb. 5 (a) wurde bei einer Fließgeschwindigkeit von 1,0 ml/min gewonnen; Abbildung 5 (b) wurde bei einer Fließgeschwindigkeit von 2,0 ml/min gewonnen.

Abbildung 6 ist das Chromatograinm eines Gemisches (durch UV-Absorption bei 254 nm nachgewiesen), welches im Verlauf der Herstellung einer Agrochemikalie gebildet wurde, wobei

60 348 12 - 8 -

das Chromatogramm unter Einsatz der Flüssigchromatografie-Säule gemäß Ausführungsbeispiel 5 (siehe weiter unten) gewonnen wurde.

In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Plüssigchromatografie-Säule vermittelt, die ein hochverdichtetes Gelbett vollständig poröser Gele umfaßt, welche Vinylalkohol-Einheiten enthalten und einen durchschnittlichen Korndurchmesser von 4 bis 20 ,ma. aufweisen. Das Bett weist dabei einen Uniformitätsgrad von 2,0 bis 4,0 auf; dieser Uniformitätsgrad ergibt sich aus HETP/Dp, wobei HETP der äquivalenten Fiillkörperhöhe und Dp dem Massemittel-Korndurchmesser der Gele entspricht.

Bei den erfindungsgemäßen Gelen handelt es sich um vernetzte, vollständig poröse Polymergele, denen auf Grund des Vorhandenseins einer entsprechenden Menge von Vinylalkohol-Einheiten ein ausreichendes Wasseraufnahmevermögen verliehen wurde. Wie bereits erwähnt, wird durch den Begriff "vollständig porös" eine Gelstruktur gemeint, bei der Peinporen im gesamten Korn des Polymergels verteilt sind* Die unelastischen Gele derartiger Struktur weisen im trockenen Zustand eine große spezifische Oberfläche auf - im allgemeinen 5 bis 1000 m²/g -, hinsichtlich ihrer Porenstruktur unterliegen sie zwischen dem trockenen und dem nassen Zustand kaum einer Ve ränderung. Hinsichtlich des unelastischen Gels kann auf die GB-OS 2 061 954 A Bezug genommen werden.

Das Yorhandensein von Yinylalkohol-Einheiten der Formel

-CH-CH₂-OH

kann mittels Infrarot-Absorptionsspektroskopie nachge-

60 348 12 - 9 _

wiesen werden. Der wünschenswerte Gehalt an Vinylalkohol-Einheiten im Polymer kann in Abhängigkeit von der Art des der chromatografiechen Analyse zu unterziehenden gelösten Stoffes variieren« Er sollte beispielsweise zwischen dem an Gele wenig adsorbierbaren Saccarid und in hohem Maße an Gele adsorbierbarem/-r Protein, Aminosäure und dergleichen variieren. Der als Konzentration von Hydroxylgruppen ausgedrückte wünschenswerte Gehalt an Yinylalkohol-Einheiten liegt im allgemeinen zwischen 3 bis 15 mäq/g, vorzugsweise zwischen 4 und 10 mäq/g· Andere ionische hydrophile Gruppen wie etwa !Carboxylgruppen können im Polymer anwesend sein, sofern ihre Anwesenheit nicht eine solche Menge erreicht, die zur Adsorption von gelösten Stoffen oder anderen nachteiligen Wirkungen führt. Die Konzentration der Hydroxylgruppen kann ermittelt werden, indem das hydroxylgruppenhaltige Gel mit Essigsäureanhydrid in Pyridin zur Reaktion gebracht wird; sodann wird die Menge des Essigsäureanhydrids gemessen, die durch die Reaktion mit den Hydroxylgruppen verbraucht worden ist. Sie wird durch die äquivalente Masse pro Gramm des trockenen Gels, ausgedrückt.

Die erfindungsgemäßen Gele sollten einen ausreichenden 7ernetzungsgrad aufweisen, um die Peinporenstruktur aufrecht zu erhalten und eine mechanische Festigkeit zu bieten, die eine Chromatografie bei einer hohen Durchflußrate des Eluenten gestattet. Der vernetzende Teil sollte eine Struktur aufweisen, die gegenüber Hydrolyse widerstandsfähig ist. Bevorzugte erfindungsgemäße Gele enthalten eine Etherbildung, einen Isozyanurat-Ring oder einen Zyanurat-Ring im vernetzenden Teil.

Hinsichtlich der Merkmale der erfindungsgemäßen Gele ist es auch von Wichtigkeit, die Porosität bzw. die Wasser-Wiedergewinnung (im folgenden als W_R bezeichnet) zu kon-

60 348 12 - 10 -

trolliereru Unter dem Gesichtspunkt der Trennfähigkeit mag eine Steigerung des W₁₃-Wertes vorteilhaft sein, sie kann indes auch von einer Verminderung der mechanischen Festigkeit und/oder der Bildung eines ungleichmäßigen Gelbettes begleitet sein. Der Ww-Wert der erfindungsgemäßen Gele sollte sich generell im Bereich von 0,6 bis 2,0 ml/g (vorzugsweise 0,8 bis 2,0 ml/g; noch besser: 1,0 bis 1,8 ml/g) bewegen. Der Einsatz von Gelen mit derartigem W₁₃-Wert erleichtert die Bildung eines gleichmäßigen Gelbettes mit hohem Füllverhältnis, sichert die für die Trennung erforderliche Porosität und trägt so zur Herstellung einer für die Schnellanalyse geeigneten, in hohem Maße auflösenden Flüssigchromotografie-Säule bei. Der W_n-Wert (siehe Tauguo

ti

Takeuchi und Sadao Mori, "Gel Chromatography", herausgegeben von Kodansha K, K., Japan 1972) kann ermittelt werden, indem ein trockenes Gel der Masse W₁, das mit ausreichend destilliertem ?/asser ins Gleichgewicht gebracht worden ist, zwecks Entfernung des der Gel-Oberfläche anhaftenden Wassers bei 3 000 U/min und 10 ⁰C 60 min lang zentrifugiert, die Masse W₂ des Gels gemessen und der W_R-Wert nach der Formel

W₁

errechnet wird.

Eine Steigerung des Korndurchmessers der Gele in der Flüssigchromatografie-Säule erhöht vorteilhafterweise die Fließgeschwindigkeit des Eluenten, unvorteilhafterweise jedoch vermindert sie die Trennfähigkeit. Andererseits fördert eine Abnahme der Gel-Korngröße vorteilhafterweise die Trennfähigkeit, gleichzeitig vermindert sie aber unvorteilhafterweise auch die Fließgeschwindigkeit des Eluenten, Der wünschenswerte mittlere Korndurchmesser der im

Lu ι ν ι y u

60 348 12 - 11 -

Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verwendenden Gele liegt im Bereich von 4 bis 20 /um, vorzugsweise bei 6 bis 20 ,um, noch besser bei 8 bis 15/um. Erfindungsgemäß wird die Säule mit Gelen relativ kleiner Korndurchmesser gefüllt, um die Trennfähigkeit zu maximieren. Zusätzlich wird durch Bildung eines hohen Füllungsverhältnisses des Gelbettes eine Steigerung der Fließgeschwindigkeit des Eluenten erreicht. Auf diese Weise entspricht die erfindungsgemäße Säule den oben genannten zwei Forderungen nach hohem Auflösungsvermögen und schnellem Durchlauf, Der Massemittel-Korndurchmesser (im folgenden als "D " bezeichnet) der Gele wird mittels eines Zählgerätes namens "Coulter Counter" (Handelsbezeichnung eines von der Fa. Coulter Electronics Inc., USA, hergestellten und vertriebenen Apparates) gemessen. Der D -Wert berechnet sich nach • der folgenden Formel:

. Σ ⁴

Dp =

nd³

Darin steht d für den Korndurchmesser, η ist die Häufigkeit des Auftretens des KorndurGhmessers.

Heben dem oben erwähnten Dp muß die Korndurchmesser-Verteilung als ein Parameter in Betracht gezogen werden, der die zulässige Fließgeschwindigkeit des Eluenten beeinflußt. Für die erfindungsgemäße Säule wird eine Korndurchmesser-Verteilung (ausgedrückt als Massemittel-Korndurchmesser /Dp/ geteilt durch den Durchschnittsanzahl-Korndurchmesser /Dn/) von 1,5 oder weniger, vorzugsweise 1,2 oder darunter, empfohlen. Der Durchschnittsanzahl-Korndurchmesser Dn ergibt sich aus der Formel

60 348 12

Dn =

Σ *

Darin entsprechen η und d den oben genannten Bedeutungen.

Ein relativer Maßstab für den Uniformitätsgrad des Gelbettes ergibt sich aus der "verminderten äquivalenten Füilkörperhöhe" HETP/Dp. Dabei wird der HETP-Wert durch Ausfuhrung der Chromatografie unter vorherbestimmten Bedingungen ermittelt. Diese vorbestimmten Bedingungen richten sich auf jedwede GC-Säule unterschiedlicher Art, da die HETP-Werte unterschiedliche Größen annehmen, wenn die chromatografischen Bedingungen wie etwa die Fließgeschwindigkeit des Eluenten oder die Art des zu lösenden Stoffes variiert werden. Als ein Ergebnis unserer Untersuchung hat sich gezeigt, daß bei Anwendung der herkömmlichen Füllmethode mit konstantem Druck, bei der ein Gelschlamm mittels einer Hochdruckpumpe plötzlich in die Säule eingebracht wird, ein extrem ungleichmäßiges Gelbett gebildet wird. In der nach dieser konventionellen Methode gefüllten Säule zeigt der auf der Abflußseite der einzufüllenden Flüssigkeit befindliche Teil de3 Gelbettes einen im Vergleich zu anderen Teilen des Gelbettes extrem hohen Wert von HETP/Dp. Bis zu einem Füllverhältnis (siehe weiter unten) des Gelbettes von etwa 0,6 ist es möglich, auch mit der herkömmlichen Konstantdruck-Füllmethode ein verhältnismäßig gleichmäßiges Gelbett zu bilden. Wird das Füllverhältnis jedoch weiter gesteigert, dann nimmt auch der Ungleichmäßigkeitsgrad des Gelbettes beträchtlich zu. Zur Lösung dieses Problems wurden hinsichtlich beider Oharakteristika des Gels und der Fülltechnik der Säule Untersuchungen angestellt, welche ergaben, daß mit der Methode gemäß vorliegender Erfindung ein gleichmäßiges Gelbett von hohem Füllverhältnis hergestellt werden kann, DerHETP/Dp-

«j a υ ι ν

60 348 12

- 13 -

Wert der erfindungsgemäßen Säule liegt im Bereich, von 2,0 bis 4,0, vorzugsweise von 2,5 "bis 3,5. Steigt der HETP/Dp-Wert über 4,0 an, dann fällt die Trennfähigkeit der Säule deutlich ab. Ist der HETP/Dp-Wert kleiner als 2,0 , dann zeigt die Säule voraussichtlich eine hohe Trennfähigkeit, es wird jedoch sehr schwierig werden, die Säule unter reproduzierbaren Bedingungen herzustellen. In Abhängigkeit von den chromatografischen Bedingungen wie etwa vom Typ des verwendeten Eluenten und der Art des gelösten Stoffes nimmt der HETP-Wert unterschiedliche Beträge an. Der HETP-Wert, wie er im vorliegenden Text Verwendung findet, wird durch Ohromatografieren von 1 tigern (Masse-%) Ethylenglykol ermittelt, wobei destilliertes Wasser als Eluent bei 25 ⁰C und in einer Eluent-Fließgeschwindigkeit von .1,5 m/h (Oberflächenge schwindigkeit in einer Säule) verwendet werden. Vom so erhaltenen Chromatogramm (refraktometrisch nachgewiesen) werden - wie in Abbildung 1 (Anhang) dargestellt das Peak-Elutionsvolumen (Ve) und die Peakbreite (W) abgelesen (siehe Tsuguo Takauchi und Sadao Mori, "Gel Chromatography" , herausgegeben von Kodansha K. K,, Japan, 1972), sodann wird der HETP-Wert nach der Formel

HETP = L(W/4 Ve)² berechnet, in welcher L für die Länge der Säule steht.

Das Füllverhältnis des Gelbettes in der erfindungsgemäßen Säule sollte in Verbindung mit dem W^-Wert gesteuert wer-

Jx

den. Durch eine solche Steuerung wird es möglich, ein hohes Füllverhältnis zu erreichen, ohne dabei den HETP/Dp-Wert zu beeinträchtigen. Wenn Vt das Gesamtvolumen der Säule darstellt, Vg dem Volumen des Gel-Substrates entspricht, Vi das innere Volumen des Gelkornes repräsentiert und Vo für das Hohlraumvolumen zwischen den Gelkörnern steht, dann besteht bekanntermaßen die Beziehung

60 348 12 - 14 -

7t = Vo + (Vi + Vg)

für die gelgefüllte Säule. Das Füllungsverhältnis (im folgenden als Pd bezeichnet) der erfindungsgemäßen Säule wird als

Pd β 1 - (Vo/Vt)

ausgedrückt.

Um Vo zu berechnen, wird Vi durch Multiplizieren der Gel-Trockenmasse (a) mit W₀ ermittelt; Vg ergibt sich aus der Gleichung Vg = a/d, in welcher d die Gel-Dichte repräsentiert.

Vt ergibt sich direkt aus der Bauweise der Säule. Für die erfindungsgemäße Säule ist es wünschenswert, daß sich (Vi/Vo) im Bereich von 1,0 bis 2,0 - vorzugsweise 1,2 bis 1,8 - befindet, um so eine harmonische Kombination von W₀ und Pd zu realisieren. Um nennenswerte Verbesserungen der Chromatografie-Geschwindigkeit zu erzielen, aber auch um das Trennvermögen und die Haltbarkeit zu steigern, ist es erforderlich, daß sich bei der erfindungsgemäßen Säule das Hillverhältnis (Pd) im Bereich von 0,66 bis 0,78 (vorzugsweise 0,68 bis 0,74) befindet, wenn (Vi/Vo) im Bereich zwischen 1,2 und 1,8 liegt. Inzwischen ist eine Methode zur Bestimmung von Vo bekannt, bei welcher ein Poylmer mit einer im Vergleich zur relativen Moiekülmasse des Exklusionslimits größeren relativen Molekülmasse auf der gefüllten Säule entwickelt und Vo als das Peakvolumen des · auf dem Chromatogramm aufgezeichneten Eluats gewonnen wird. Diese bekannte Methode empfiehlt sich jedoch nicht, da sie dazu neigt, unter dem Einfluß der Verteilung der relativen Molekülmasse des entwickelten Polymers und der Struktur des Gelbettes signifikante Meßfehler hervorzurufen.

60 348 12 - 15 -

Im folgenden soll die erfindungsgemäße Säule näher beschrieben werden. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung anzuwendenden Gele können von einem Vinylkarbozylat-.Polymer oder -Kopolymer abgeleitet werden. Beispielsweise können die beabsichtigten Gele gewonnen werden, indem ein vollständig poröses Homopolymer oder Kopolymer eines einzelnen Monomers oder einer Vielzahl von Monomeren mit mindestens zwei Vinylkarboxylatgruppen oder aber auch ein durch Kopolymerisation des genannten Monomers mit einem eine einzelne Vinylkarboxylatgruppe enthaltenden Monomer gewonnenes vollständig poröses Kopolymer einer Umesterungs- oder Verseifungsreaktion in einem solchen Lösungsmittel unterzogen werden, welches Polyvinylalkohol nicht auflöst. Sodann werden die auf diese Weise gewonnenen vollständig porösen Polyvinylalkohol-Körner, welche die ursprüngliche Peinporenstruktur im wesentlichen beibehalten, mit einem netzmittel zur Reaktion gebracht. Beispielsweise wird Divinyladipat in Anwesenheit eines Radikalinitiators in Wasser gemeinsam mit Butylazetat auspensionspolymerisiert, wobei Butylazetat dazu dient, das resultierende Polymer porös zu machen. Das so erhaltene Polymer wird vermittels einer Reaktion in Methanol zu Polyvinylalkohol-Körnern umgewandelt, um Hydroxylgruppen zu bilden. Uunme.hr werden die Polymerkörner zwecks Gewinnung der beabsichtigten Gele einer Vernetzungsreaktion mit Epichlorhydrin in einem Gemisch aus Azeton und Dimethylsulfoxid unterzogen. Einzelheiten über die durch die oben dargestellten Vorgehensweisen gewonnenen Gele wurden in der JP-OS 64 657/1981 vom 1., Uovember 1979 dargelegt. ·

Anderenfalls können die zur Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung vorgesehenen Gele durch Kopolymerisa- _t tion eines Vinylkarboxylat-Monomers mit einem vernetzungsfähigen Monomer sowie anschließende Umesterungsreaktion o.a. gewonnen werden. Bedarfsweise kann das Polymer zur

60 348 12 - 16 -

Gewinnung der beabsichtigten Gele mit Epichlorhydrin oder anderen vernetzenden Mitteln nachgehärtet werden. Als Beispiele für ein vernetzbares Monomer mit zwei oder mehr ethylenisch ungesättigten Gruppen kann ein Monomer mit einem Isozyanuratring wie etwa Triallylisozyanurat, ein Monomer mit einem Zyanuratring wie etwa Triallylzyanurat und ein Divinylether wie etwa Diethylenglykoldivinylether erwähnt werden. Ton diesen eben genannten Monomeren wird Triallylisozyanurat am meisten bevorzugt, da es mit Vinylkarboxylat gut kopolymerisiert und das resultierende Gel eine ausgezeichnete mechanische Festigkeit aufweist. Bei dem Gel aus Triallylisozyanurat sind Porendurchmesser und Porosität leicht zu kontrollieren. Die Details derartiger Gele sowie der Verfahren zu ihrer Herstellung wurden in der Japanischen Patentanmeldung Ur. 85 243/1980 (25. Juni 1980) und der Japanischen Patentanmeldung Ir. 183 703/1980 (26. Dezember 1980) beschrieben. Beispielsweise können die beabsichtigten Gele gewonnen werden, indem in einem geeigneten molaren Verhältnis vermischtes Triallylisozyanurat und Vinylazetat suspensionskopolymerisiert werden, so daß sich der Vernetzungsgrad auf einen vorbestimmten Wert im Bereich von 0,20 bis 0,40 einstellt. Die Reaktion findet dabei in Anwesenheit von Butylazetat (um das Polymer.porös zu machen) und eines Radikalinitiators statt; sodann wird das auf diese Weise gewonnene vollständig poröse Kopolymer einer Umesterungs- oder Verseifungsreaktion in einer Methanollösung von IaOH unterzogen. Durch Steuerung der Umwandlung in der Umesterungs- oder Verseifungsreaktion kann jedweder gewünschter Gehalt an Vinylalkohol-Einheiten im Polymer leicht erreicht werden. Der oben erwähnte Vernetzungsgrad (X) kann unter Anwendung der folgenden Formel berechnet werden:

60 348 12 - 17 -

W₉ W₁ W

Dabei sind

M₁ relative Molekülmasse von Vinylkarboxylat, Mp relative Molekülmasse von Triallylisozyanurat, W₁ Masse des zur Polymerisation verwendeten Vinyl-

karboxylats, W₂ Masse des zur Polymerisation verwendeten Triallylisozyanurata.

In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer Flüssigchromatografie-Säule vermittelt, welches aus dem Befüllen vollständig poröser, Vinylalkohol-Einheiten enthaltender Gele in einem feuchten Zustand besteht und welches dadurch gekennzeichnet ist, daß es sich zusammensetzt aus den Schritten des

1) Überführens eines Gelschlammes in einen Füllapparat, welcher einer Säule abnehmbar angeschlossen ist, die an ihrem unteren Ende ein mit einem Filter ausgestattetes erstes Endverbindungsstück aufweist, worauf der

Füllapparat in einen komprimierbaren Zustand versetzt -

wird,

2) Durchleitens einer Füllflüssigkeit durch den Füllapparat und die Säule, um den Gelschlamm in die Säule zu bewegen und um die im Gelschlamm enthaltene Füllflüssigkeit vermittels des am ersten Endverbindungsstück befindlichen Filters abzuscheiden, wodurch ein Gelbett in der Säule gebildet wird,

60 348 12 - 18 -

3) schrittweisen oder kontinuierlichen Steigerns der Fließgeschwindigkeit der Füllflüssigkeit, um das Pullverhältnis des Gelbettes auf einen vorbestimmten Wert einzustellen,

4) Abnehmens der Säule vom Füllapparat und Anbringens eines zweiten mit einem Filter versehenen Endverbindungsstükkes am oberen Säulenende, um somit das gebildete Gel in der Säule zu halten,

in Schritt 2) erreicht dabei die in einer Fließgeschwindigkeit von 0,2 bis 1,5 m/h durchzuleitende Füllflüssigkeit vom Beginn des Einspeisens bis zu dessen Abschluß das Einbis Dreihundertfache des Innenvolumens der Säule·

Das Füllen eines GelSchlammes in eine Säule kann durch Einsatz einer Pumpe entsprechend dem allgemein bekannten Haßfüllverfahren (siehe Hiroyuki Hatano et al., "Experimental High-Speed Liquid Chromatography", herausgegeben von Kagaku Dojin, Japan, 1977) erfolgen. Gemäß dem Verfahren nach vorliegender Erfindung ist es von äußerster Wichtigkeit, während der Füllphase keinen abrupten Wechsel von Fließgeschwindigkeit oder Druck auf das Gelbett auszuüben. Erfindungsgemäß kann jedweder ,im Fachgebiet allgemein verwendeter Füllapparat genutzt werden. Bei der praktischen Ausführung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wird gewöhnlich ein Packer zum Befüllen des Gelschlammes in die Säule einem Säulenende angeschlossen. Weiterhin wird dem Packer eine Flüssigkeits-Übertragungsleitung von der irgendwo installierten Pumpe angeschlossen. Der obere Teil des Packers ist mit einer Verschlußvorrichtung versehen, welche dem Druck während des Packens nach dem Einschütten des Gelschlammes in den Packer standhält. Am Flüssigkeitsauslaßende der Säule ist ein mit einem Filter ausgestattetes erstes Endverbindungsstück angebracht, wobei dieser Filter

60 348 12 - 19 -

das Passieren der Flüssigkeit gestattet, das Passieren der Gelkörner jedoch verhindert. Bedarfsweise kann eine Zusatzsäule (im Fachgebiet allgemein als "Vorsäule" bekannt) mit dem gleichen Innendurchmesser wie die Hauptsäule dem oberen oder unteren Ende der Hauptsäule angeschlossen werden. Zweck des Einsatzes der genannten Zusatzsäule/n ist die Verbesserung der Gleichmäßigkeit des Gelbettes durch Entfernen besonders ungleichmäßiger Anteile des Gelbettes. Die ungleichmäßigen Anteile des Gelbettes neigen dazu, sich an den beiden Enden der Säule anzusiedeln, so daß die ungleichmäßigen Teile des Gelbettes leicht in der Zusatzsäule untergebracht werden können. Wird daher die Zusatzsäule mit den darin befindlichen ungleichmäßigen Anteilen des Gelbettes entfernt, dann sind somit auch die ungleichmäßigen Anteile leicht und vollständig beseitigt.

Der in die erfindungsgemäße Säule einzubringende Gelschlamm kann vorzugsweise dadurch hergestellt werden, daß Gele in einer Menge, die dem 1,1- bis 4,0fachen der Quantität der in die Säule zu füllenden Gele entspricht, zwecks Quellen der Gele mit einem Dispersionsmedium vermischt werden, welches dem gleichen Lösungsmittel entspricht, da.s auch als Flüssigkeit beim Befüllen der Gele verwendet wird. Die Schlammkonzentration kann sich geeigneterweise im Bereich von etwa 3 bis etwa 30 Yolumen-% bewegen. Kurz vor dem Einschütten des Gelschlammes in den Packer sind die Gele unter Einsatz von Ultraschallwellen o. ä. wünschenswerterweise im Dispersionsmedium gut zu dispergieren. Uach dem Eintragen des Gelschalmmes in den Packer ist der gesamte Befüllapparat in einen solchen Zustand zu versetzen, daß er dem Druck während des Packens standhalten kann.

Der obige Schritt 2) stellt den Schritt der Umwandlung der Gele in einen Gelschlamm zur Gelbettbereitung dar. Er be-

60 348 12 - 20 -

inhaltet eine Verbesserung, die der bisherigen fachlichen Praxis noch, nicht bekannt ist. Anschaulicher gesagt geht es darum, daß die im Säuleninneren bestehende Fließgeschwindigkeit der Füllflüssigkeit vom Beginn des Einspeisens der Füllflüssigkeit bis zu dem Punkt, an dem das Gesamtvolumen der durchgelaufenen Füllflüssigkeit das 1- bis 30Ofache des Säulen-Innenvolumens erreicht hat, bei 0,2 bis 1,5 m/h gehalten wird, um ein ungleichmäßiges Gelbett zu vermeiden, das sich in einem Anfangsstadium des Befüllvorganges bilden könnte. Fällt die Fließgeschwindigkeit der Füllflüssigkeit unter 2,0 m/h, dann sinkt nicht nur die Effizienz des BefüllVorganges, sondern es bildet sich auch ein Gelbett von zu geringem Füllverhältnis, welches damit einen nachteiligen Einfluß auf die für den nächsten Schritt erforderliche Qualitätsstabilität ausübt. Überschreitet die Fließgeschwindigkeit der Füllflüssigkeit den Wert von 1,5 m/h, dann neigt das Gelbett ebenfalls zu der oben erwähnten Ungleichmäßigkeit. Ist das Gesamtvolumen der durchgesetzten Füllflüssigkeit geringer als das Innenvolumen der Säule, dann bildet sich ein Gelbett von nicht ausreichender Länge, und dadurch kommt es unvorteilhafterweise im nächsten Schritt 3) zu einer raschen Bewegung des verbleibenden Gelschlammes in die Säule, was wiederum eine ungleichmäßige Ausbildung des Gelbettes zur Folge hat« Übersteigt indes das Gesamtvolumen der Füllflüssigkeit das 30Ofache des' Säulen-Innenvolumens, dann verringert sich nachteiligerweise die Effizienz des Befüllvorganges.

Hauptzweck des obigen Schrittes 3) ist die Gewinnung einer Hochleistungssäule durch Steigerung des Füllungsverhältnisses unter Beibehaltung der Gleichmäßigkeit des Gelbettes. In diesem Schritt wird die Fließgeschwindigkeit der Füll- ; flüssigkeit schrittweise oder kontinuierlich gesteigert. Zur Erreichung des genannten Zweckes kann die Fließgeschwin-

60 348 12 - 21 -

digkeit der Killflüssigkeit geeigneterweise so erhöht werden, daß der maximale Druckanstieg pro Meter des Gelbettes bis zu 60 kg/cm. /min und der mittlere Druckanstieg pro Meter des Gelbettes 2 bis 80 kg/cm /h beträgt* Übersteigt

2 der maximale Druckanstieg pro Meter des Gelbettes 60 kg/cm / min, dann wird die Gleichmäßigkeit des Gelbettes mit größerer Wahrscheinlichkeit erzielt. Liegt der mittlere Druckanstieg pro Meter des Gelbettes unter 2 kg/cm /h, dann nimmt die Effizienz des BefüllVorganges ab. Geht er indes über 80 kg/cm /h hinaus, dann zeigt sich unvorteilhafterweise die Tendenz zur Bildung eines ungleichmäßigen Gelbettes. Der Vorgang der Drucksteigerung wird gestoppt, sobald das Füllverhältnis des Gelbettes den beabsichtigten Wert erreicht hat. Bedarfsweise wird anschließend die Füllflüssigkeit für mehrere Stunden bei einer Fließgeschwindigkeit durch die Säule hindurchgeleitet, welche nicht größer ist als jene maximale Füllgeschwindigkeit, die beim Passieren der Füllflüssigkeit während des Füllvorganges zur Erreichung des beabsichtigten Füllverhältnisses erreicht wurde und bei der keinerlei Anteil des Gelbettes in der Säule zum Packer zurückgestoßen wird (gewöhnlich bis zur halben Maximal-Fließgeschwindigkeit), um auf diese Weise das gebildete Gelbett zu stabilisieren. Sodann wird die Hauptsäule vom Füllapparat abgenommen, das offene Ende der Säule wird mittels eines zweiten Endverbindungsstückes verschlossen, welches einen Filter von 2 bis TO/Um Porendurchmesser aufweist. Der Endpunkt des Drucksteigerungsvorganges ergibt sich ohne weiteres unter Berücksichtigung der vordem gewonnenen Beziehung zwischen dem Maximaldruck oder der Fließgeschwindigkeit und dem Füllverhältnis. Deutlicher ausgedrückt: die Beziehung zwischen dem Maximaldruck oder der Fließgeschwindigkeit und dem Füllverhältnis kann durch eine Methode ermittelt werden, bei welcher mehrfach gefüllte Säulen zunächst durch Füllen bei unterschiedlichen Maximaldrücken oder variierten maximalen Fließgeschwindigkeiten

60 348 12 - 22 -

hergestellt und die Füllverhältnisse der Säulen nachfolgend nach der eben beschriebenen Methode gemessen werden. Das Einstellen des Füllverhältnisses der erfindungsgemäßen Säule kann ohne weiteres durch Befüllen der Säule mit jenem Maximaldruck bzw, jener Fließgeschwindigkeit erreicht werden, die dem vorherbestimmten Füllverhältnis in bezug auf die oben gewonnene Beziehung entsprechen. Als Füllflüssigkeit kann Wasser oder verschiedene wäßrige Lösungen verwendet werden. Es wird jedoch empfohlen, Pufferlösungen oder wäßrige Lösungen von organischen und anorganischen Salzen in einer Konzentration von nicht mehr als 1 Mol/l zu verwenden, da Bedingungen vermieden werden sollten, bei denen die Gele stärker anschwellen, als dies bei der eigentlichen Chromatografie der Fall ist.

Bevorzugte Abmessungen der erfindungsgemäßen Säule sind 4 bis 50 mm Innendurchmesser und 100 bis 600 mm Länge. Es können Röhren aus rostfreiem Stahl, Glas, Polyethylen oder anderem Material verwendet werden, aber auch eine Röhre aus bestgeeignetem Werkstoff sollte unter Berücksichtigung der Art des Eluenten sowie des während der Gel-Befüllungsphase und bei der Chromatografie aufzuwendenden Druckes ausgewählt werden.

Im praktischen Einsatz der erfindungsgemäßen Säule können Wasser, verschiedene Pufferlösungen wie auch verschiedene wäßrige Lösungen organischer und/oder anorganischer Salze geeigneterweise als Eluent Verwendung finden, nichtsdestoweniger kann die Säule nicht nur zur herkömmlichen Verteilungschromatografie herangezogen werden, bei der ein polares Lösungsmittel verwendet wird; sie kann darüber hinaus auch zur kombinierten Chromatografie der Gel-Permeation und -Verteilung herangezogen werden, in der die oben genannten wäßrigen Lösungen unter Zusatz einer geeigneten Menge eines organischen Lösungsmittels zum Einsatz gelangen.

60 348 12 - 23 -

In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren der Blutkomponentenanalyse vermittelt, welches das Entwickeln von Blutserum auf einer Flüssigchromatografie-Säule beinhaltet· Bei der dabei verwendeten Säule handelt es sich um eine Säule mit hohem Füllverhältnis des aus vollständig porösen Gelen bestehenden Gelbettes, wobei diese Gele Vinylalkohol-Einheiten enthalten, einen mittleren Korndurchmesser von 4 bis 20 /um aufweisen, und wobei das Gelbett einen Gleichmäßigkeitsgrad von 2,0 bis 4,0 besitzt - der genannte Gleichmäßigkeitsgrad wird als HETP/Dp definiert, wobei HETP der äquivalenten Füllkörperhöhe der Säule und Dp dem Massemittel-Korndurchmesser der Gele entspricht. Bei der erfindungsgemäßen Säule handelt es sich um eine Hochleistungs-Flüssigchromatografie-Säule, die in der Lage ist, verschiedene in Wasser oder in einer wäßrigen Lösung organischer und/oder anorganischer Salze vorhandene ionische und nichtionische Substanzen wirkungsvoll zu separieren. Die vorliegende Flüssigchromatografie-Säule eignet sich insbesondere für die Trennung oder die Trennung und Identifikation von Blutbestandteilen; in diesem speziellen Gebiet besteht nach geeigneten Säulen eine starke nachfrage« Beim Durchführen des Trennens oder des Trennens und Bestimmens von Blutbestandteilen entsprechend der vorliegenden Erfindung wird bevorzugt, daß für Lösungsbestandteile einer relativen Molekülmasse, die jener von Albumin entspricht oder diese übersteigt, eine Säule mit Gelen eines rel, Molekülmasse-Exklusionslimits (basierend auf Dextran) von 100 000 und darüber verwendet wird; es wird weiter bevorzugt, daß für Lösungsbestandteile einer relativen Molekülmasse, die jener von Albumin entspricht oder diese bis hinunter zu 100 unterschreitet, eine Säule mit Gelen eines rel. Molekülmasse-Exklusionslimits (basierend auf Dextran) von 100 000 oder darunter verwendet wird; des weiteren wird empfohlen, daß verschiedene Pufferlösungen,

60 348 12

verschiedene wäßrige Lösungen organischer und/oder anorganischer Salze sowie deren Gemische in einer Konzentration von 0,05 "bis 0,5 Mol/Liter als Eluent verwendet werden und daß schließlich ein Ultraviolett-Spektrofotometer als Nachweisinstrument genutzt wird.

Wie oben beschrieben, stellen die erfindungsgemäße Säule und das erfindungsgemäße Verfahren zu deren Herstellung gemeinsam die Lösung bisher vorhandener Probleme dar. In der Praxis wird damit ein großer Vorteil wahrgenommen. In Zusammenfassung der erfindungsgemäßen Merkmale sei noch einmal festgestellt: die in die erfindungsgemäße Säule gefüllten Gele enthalten nichtionische Vinylalkohol-Einheiten im Polymerskelett, so daß die Adsorbierbarkeit der Lösungsbestandteile an die Gele in einer wäßrigen Lösung gering ist. Somit ist es möglich geworden, in Überwindung diesbezüglicher früherer Schwierigkeiten nunmehr eine direkte Analyse von Blutserum oder ähnlichen Substanzen mittels der Verteilungschromatografie oder der Adsorptionschromatografie vorzunehmen, so daß damit Angaben zu den Blutbestandteilen - häufig auch Angaben bezüglich der jeweiligen relativen Molekülmasse - gewonnen werden können.

Erfindungsgemäß wird eine Säule mit einem gleichmäßigen Gelbett von hohem Füllungsverhältnis dadurch geschaffen, daß abrupte Veränderungen von Fließgeschwindigkeit und Druck während des Befüllvorganges vermieden werden; damit wird es möglich, gleichzeitig die Geschwindigkeit des Eluierens und die Haltbarkeit der Säule in einem Maße zu verbessern, wie dies bei Verwendung herkömmlicher, mit wäßrigem Lösungsmittel arbeitender GC-Säulen nicht erreicht worden ist. Darüber hinaus enthält die erfindungsgemäße Säule Gele mit kleinem Korndurchmesser, sie erbringt damit zusätzlich zu den oben erwähnten Vorteilen ein verbessertes Auflösungsvermögen,

60 348 12 - 25 -

Ausführungsbeispiel

Die vorliegende Erfindung soll anhand der folgenden Ausführungsbeispiele detaillierter veranschaulicht werden, ohne daß dies einer Eingrenzung dea Geltungsbereiches der vorliegenden Erfindung gleichkommt.

Ausfuhrungsbeispiel 1

Zur Gewinnung eines Poly(divinyladipates) wurde ein Gemisch aus 80 g Divinyladipat (mit einer Reinheit von über 99 %), 200 g n-Butylazetat, 6,4 g Polyvinylazetat (mit einem Polymerisationsgrad von 500) und 1 g 2,2¹-Azobisisobutyronitril bei 70 ⁰C 20 h lang in 1,2 1 Wasser suspensionspolymerisiert, wobei das Wasser 1 Masse-% Polyvinylalkohol als Suspensionsstabilisator enthielt. Bach Vollendung der Polymerisation wurden die entstandenen Körner durch Filtration zurückgewonnen, zunächst mit Wasser und dann mit Methanol gewaschen und sodann getrocknet. Die Körner wurden gemeinsam mit 1 1 Methanol, welches 32 g Natriumhydroxid enthielt, in einen 2-1-Rundkolben eingefüllt und unter Verrühren 24 h lang bei 40 ⁰C gehalten. Nach Abschluß der Reaktion wurden die entstandenen Körner durch Filtration zurückgewonnen und dann mit Methanol sowie daran anschließend mit Azeton gewaschen.

Die so gewonnenen Polyvinylalkohol-Körner wurden gemeinsam mit einem flüssigen Gemisch aus 350 ml Dimethylsulfoxid, 350 ml Azeton, 37 g Epichlorhydrin und 16 g Natriumhydroxid in einen Rundkolben eingefüllt, dieses Gemisch wurde 24 h lang unter Verrühren bei 50 ⁰C gehalten. Nach Vollendung der Reaktion wurden die Körner vermittels Filtration zurückgewonnen und ausreichend mit heißem Wasser sowie daran anschließend mit Azeton gewaschen. Diese Filtrations-, Wasch- und Reaktionsschritte wurden noch einmal in der

60 348 12 - 26 -

oben beschriebenen Weise wiederholt.

Die resultierenden Körner wurden unter Verrühren gemeinsam mit einer MS wäßrigen Lösung von Natriumhydroxid 24 h lang bei 80 ⁰C gehalten, sodann wurden die Körner in ausreichendem Maße mit Wasser gewaschen. Der durchschnittliche Durchmesser der so gewonnenen Körner wurde unter Einsatz des "Coulter Counter Model ZB¹¹ (Handelsname) ermittelt. Es zeigte sich, daß der durchschnittliche Korndurchmesser 12,3 m betrug. Unter Anwendung der weiter oben beschriebenen Methode wurde ein W_R-Wert von 1,75 ml/g ermittelt. Ein Teil der gewonnenen Gele wurde bei 90 ⁰C mit Essigsäureanhydrid in einem Pyridin-Lösungsmittel zur Reaktion gebracht; bei Berechnung der OH-Gruppen-Konzentration (qQTj) im Gel anhand der Menge des in Reaktion gegangenen Essigsäureanhydrids zeigte sich, daß der q_o-rr-Wert 9,1 Milliäquivalent pro Gramm erreichte.

10 g (Trockenmasse) der so gewonnenen Körner wurden über Nacht in 100 ml destilliertes Wasser eingeweicht. Einer Säule von 7»5 nun. Innendurchmesser und 500 mm Länge wurde an einem Ende ein erstes mit einem Filter von 5/um Porendurchmesser versehenes Endverbindungsstück angesetzt, das andere offene Ende der Säule wurde einem Packer von 100 ml Innenvolumen angeschlossen. Der Packer ist an seinem oberen Teil mit einem GeIschlamm-Einlaß, einem Füllflüssigkeits-Einlaß (welcher über eine rostfreie Stahlleitung an eine Püllpumpe angeschlossen ist) und einem Druckmeßgerät ausgestattet. Nach dem Hineinfüllen eines Gelschlammes kann der Packer verschlossen werden. Der obengenannte angeschwollene Gelschlamm wurde einer ausreichenden, 10 min andauernden Dispersion unter Einsatz eines Ultraschall-Reinigungsgerätes unterzogen und dem Packer durch den Gelschlamm-Einlaß zugesetzt« Sodann wurde der Packer verschlossen.

L υ ι y ι y υ

60 348 12 - 27 - .

Nun wurde destilliertes Wasser (Pül!flüssigkeit) durch den Packer und die Säule 60 min lang mit einer Fließgeschwindigkeit von 1,0 ml/min/LY (Lineargeschwindigkeit) : 1,3δ m/h) hindurchgeleitet. Daran anschließend wurde die Fließgeschwindigkeit des destillierten Wassers bei einer durchschnittlichen Druckanstiegsrate von 20 kg/cm /h des GeI-bettes und einer maximalen Druckanstiegsrate des Gelbettes

von 20 kg/cm /min gesteigert, bis das Druckanzeigegerät

einen Wert von 85 kg/cm anzeigte. Sodann wurde weitere 3 Stunden lang destilliertes Wasser durchgeleitet, wobei das Manometer durch Steuern der von der Pumpe geförderten Wassermenge auf dem Anzeigewert von 85 kg/cm gehalten wurde, lach dem Einstellen des Durchlaufes von destilliertem Wasser wurde die Säule vom Packer abgenommen, und dem offenen Ende der Säule wurde ein zweites Yerbindungsend— stück angebaut, welches in seiner Bauweise dem ersten Yerbindungsendstück entsprach. Somit war das Füllen der Säule abgeschlossen. Die so erhaltene Säule zeigte einen HETP/Dp-Wert von 3»3, einen Vi/Yo-Wert von 1,54 sowie ein rel, Molekülmasse-Exklusionslimit (basierend auf Dextran) von etwa 2 000 000.

Auf der in obiger Weise ge¥/onnenen Säule wurde eine wäßrige Lösung aus handelsüblichem Thyroglobulin, Albumin, Myoglobin und Phenylalanin entwickelt und durch eine 0,05 Mol/l Phosphorsäure-Pufferlösung (pH 6,7) mit Efe^SO.-Gehalt in einer Konzentration von 0,2 Mol/l bei einer Fließgeschwindigkeit von 1,0 ml/min eluiert. Wie aus dem Chromatrogramm in Abbildung 2 hervorgeht, konnten die in der Reihenfolge ihrer relativen Molekülmassen ausfließenden Substanzen wirkungsvoll separiert werden. Die Analysezeit betrug nur etwa 20 min.

LU iU I V

60 348 12 - 28 -

Ausführungsbeispiel 2

Ein flüssiges Gemisch au3 100 g Vinylazetat, 32,2 g Triallylisozyanurat (X-Zahl: 0,25)» 10Og n-Butylazetat und 3,3 g 2,2^f-Azobisisobutyronitril wurde gemeinsam mit 0,8 1 Wasser, welches 1 Masse-$ Polyvinylalkohol als Suspensionsstabilisator enthielt, in einen zylindrischen Kolben von 2 1 Fassungsvermögen eingefüllt, das so erhaltene Gemisch wurde zwecks Bildung einer stabilen Suspension verrührt.Sodann wurde die Suspension 18 h lang auf 65 ⁰O erwärmt sowie daran anschließend unter Umrühren 5 h lang auf 75 ⁰C erwärmt, um die Suspensionspolymerisation zu bewirken. ITach Vollendung der Polymerisation wurden die entstandenen Körner durch Filtration zurückgewonnen, zunächst mit Wasser und dann mit Methanol gewaschen und . daran anschließend getrocknet. Die Körner wurden.gemeinsam mit 2 1 Methanol, welches 47 g Natriumhydroxid enthielt, in einen 3-1-EuncLkolben eingefüllt, das entstandene Gemisch wurde unter Umrühren 20 h lang bei .15 ⁰C gehalten, um die Umesterungsreaktion durchzuführen. Sodann wurden unter Durchführung der Sedimentationsklassifikation in Wasser in Gele (Dp: 9,8/Um, Dp/Dn: 1,28) gewonnen. Die gewonnenen Gele zeigten eine Hydroxylgruppen*- konzentration von 7,3 Milliäquivalent/g und einen W_R-Wert von 1,58 ml/g.

Hun wurden drei 7-g-Probemengen (Trockenmasse) der Gele ausgewogen. Jede der drei Gel-Teilmengen wurde über Nacht in 100 ml einer wäßrigen Lösung von ifäpSO, (0,2 Mol/l) eingetaucht und 5 min lang unter Einsatz eines Ultraschall-Homogenisators dispergiert. Jeder der entstandenen Gelschlämme wurde in den Packer gefüllt, welcher mit einer Vorsäule von 7,5 mm Innendurchmesser und 100 mm Länge verbunden worden war. Diese Vorsäule ihrerseits war einer

«ρ a

60 348 12 - 29 -

Hauptsäule aus rostfreiem Stahl mit 7,5 mm Innendurchmesser und 250 mm Länge angeschlossen, welche an ihrem anderen Ende ein erstes Endverbindungsstück aufwies, das mit einem Filter nach Art des in Ausführungsbeispiel 1 verwendeten ausgerüstet war. Vorsäule und Hauptsäule waren mit einer wäßrigen Ha₂SO₄-Losung (0,2 Mol/Liter) gefüllt worden· lach dem Verschließen des Packers wurde eine wäßrige 0,2 Mol/l Ua₂SO₄-Lb'sung (Füllflüssigkeit) durch Inbetriebsetzen der Pumpe 60 min lang bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/min (LV: 0,68 m/h) durch den Packer, die Vorsäule und die Hauptsäule hindurchgeleitet. Währenddessen wurde der Gelschlamm in die Hauptsäule gefördert, wobei gleichzeitig die vom GeIschlamm mitgeführte wie auch die als Füllflüssigkeit genutzte wäßrige ITa₂SO.-Lb'sung (0,2 Mol/l) durch das am unteren Ende der Hauptsäule angebrachte erste Endverbindungsstück ausgetragen wurde. Damit bildete sich in der Hauptsäule ein Gelbett. DararL anschließend wurde die Fließgeschwindigkeit der wäßrigen SO₄-Losung (0,2 Mol/l) bei einer durchschnittlichen

Drucksteigerungsrate von 5 kg/cm /h des Gelbettes und einer Maximaldrucksteigerungsrate des Gelbettes von 5 kg/ cm /min allmählich solange erhöht, bis das in Ausführungsbeispiel 1 erwähnte Druckanzeigegerät Werte von 26, 46 oder

57 kg/cm auswies. Unter Aufrechterhaltung des erreichten Druckes wurde die Füllflüssigkeit für weitere 2 Stunden durch die Säulen hindurchgeleitet. Sodann wurden der Packer und die Vorsäule abgenommen, jeder Säule wurde ein zweites Endverbindungsstück angesetzt, um das Gelbett zu fixieren.

Diese Säulen wurden hinsichtlich charakteristischer Eigenschaften und für die Einsatzpraxis wichtiger Merkmale untersucht. Die kennzeichnenden Merkmale, die im Rahmen der Erfindung von Bedeutung sind, werden in Tabelle 1 dargestellt.

60 348 12 - 30 Tabelle 1

Säule Ir. HETP/Dp Vi/Vo Pd

1	2	,95	1	,34	0,	67
CVI	CVI	,30	1	,61	0,	71
3	3	,34	1	,90	0,	74

Alle diese Säulen hatten ein rel. Molekularmasse Exklusionslimit (basierend auf Dextran) von etwa 30 000.

Auf Säule Nr. 1 wurde ein Gemisch aus handelsüblichem T-Globulin, Albumin von bovinem Blutserum, Albumin von Eiweiß sowie Myoglobin entwickelt, die Elution erfolgte unter Verwendung einer wäßrigen Lösung von 0,3 Mol/l HaCl (pH 7,0) und 0,1 Mol/l Natriumphosphat als Eluent. Jede Komponente wurde zu nahezu 100 % zurückgewonnen. Alle diese Proteine flössen in der Rangfolge der relativen Molekülmassen aus.

Auf der Säule Nr. 2 wurden 100,ul (1 mg) 1 %iges (Masse-%) wäßriges Ethylenglykol entwickelt, die Elution erfolgte mit destilliertem Wasser bei 15 ⁰C mit einer Fließgeschwindigkeit von 1,0 ml/min. Vom gewonnenen Chromatogramm wurde der HETP-Wert ermittelt. Dieser Vorgang wurde 800 mal wiederholt. Die HETP-Werte befanden sich im Bereich von 24,5 bis 25,6/um. Die Stabilität der HETP-Werte kann als Kennzeichen der verlängerten Haltbarkeit der Säule sowie des Nichtauftretens irgendwelcher Degradation der Säule gewertet werden.

Durch Säule Nr. 3 wurde wäßrige 0,2 Mol/l Na₉SO.über 240 h hinweg kontinuierlich in einer Fließgeschwindigkeit von

60 348 1.2 - 31 -

1,2 ml/min durchgesetzt; der danach ermitteltte HET? zeigte den günstigen Wert von 32,9/Um (HETP/Dp = 3,36). Es wurde keine Degradation der Säule beobachtet.

Ausführungsbeispiel 3

Auf den miteinander verbundenen Säulen Nr. 1 und Hr. 2, welche gemäß Ausführungsbeispiel 2 vorbereitet worden waren, wurde Humanserum entwickelt und durch eine wäßrige Lösung von 0,3 Mol/l HaOl und 0,1 Mol/l Uatriumphosphat (pH 7,0) bei einer Fließgeschwindigkeit von 1,0 ml/min unter Einsatz eines Ultraviolett-Spektrofotometers bei 250 nm (Wellenlänge) als Detektor eluiert. Abbildung 3 (a) zeigt ein Chromatogramm eines nach der eben genannten Vorgehensweise gewonnenen normalen Humanserums; Abbildung 3 (b) zeigt ein Serum-Chromatogramm bei Merenversagen, Auf dem gleichen Diagramm werden zwei durch Variieren der Sensitivität des Detektors gewonnene Chromatogramme gezeigt, um durch diese Verbindung die Haupt- und Hebenbestandteile des Serums aufzuzeigen. Aus diesem Chromatogrammen kann gefolgert werden, daß die erfindungsgemäße Flüssigchromatografie-Säule eine ausgezeichnete Auflösung der Substanzen bewirkt und daß sie insbesondere dafür geeignet ist, Gemische zu fraktionnieren, welche - wie Blut - viele Arten von Lösungsbestandteilen enthalten.

Vergleichendes Ausführungsbeispiel 1

Von den gemäß Ausführungsbeispiel 2 gewonnenen Gelen wurden 10 g abgewogen, welche der gleichen Quell— und Dispersionsbehandlung wie in Ausführungsbeispiel 2 unterzogen und dann in den Packer eingebracht wurden, welcher mit einer Säule von 7i5 mm Innendurchmesser und 500 mm Länge verbunden war. Der Gelschlamm wurde in die Säule eingebracht, wobei der Druck am Säuleneingang bei 79 kg/cm gehalten wurde. Unter

60 348 12 - 32 -

Beibehaltung dieses Druckes wurde die Püllflüssigkeit 4 Stunden lang durch die Säule hindurchgeleitet« Sodann wurde der gefüllten Säule zwecks Fixierung des Gelbettes ein zweites Endverbindungsstück angesetzt· Die so gewonnene Säule wies einen HETP/Dp-Wert von 7,1 auf. Unter Verwendung dieser Säule wurde mit der gleichen Prüfsubstanz wie in Ausführungsbeispiel 3 (Serum eines unter Hierenversagen leidenden Patienten) wie auch unter den gleichen Bedingungen wie in Ausführungsbeispiel 3 eine Chromatografie durchgeführt. Abbildung 4 zeigt das dabei erhaltene Chromatogramm. Aus dem Vergleich von Abbildung 4 und Abbildung 3 (b) kann geschlossen werden, daß die in der erfindungsgemäßen Weise gefüllte Säule.ein weitaus größeres Auflösungsvermögen als die in diesem Vergleichs-Ausführungsbeispiel 1 gewonnene Säule besitzt.

Ausführungsbeispiel 4

Ein Gemisch aus 100 g Vinylazetat, 41,4 g Triallylisozyanurat, 70 g n-Butylazetat und 3,3 g 2,2^f-Azobisisobutyronitril wurde in einen Kolben gegeben; Suspensionspolymerisation, Umesterung und Klassifikation wurden in im wesentlichen der gleichen Weise wie in Ausführungsbeispiel 2 vorgenommen, um Gele mit einem Dp-Wert von 9,4/um zu erhalten. Die Gele wiesen eine Hydroxylgruppenkonzentration von 7,1 Milliäquivalent/g und einen W„-Wert von 1,20 ml/g auf. Von diesen Gelen wurden 13 g ausgewogen und in der in Ausführungsbeispiel 1 beschriebenen Weise in eine aus rostfreiem Stahl bestehende Säule von 7,5 mm Innendurchmesser und 500 mm Länge eingebracht, um eine gefüllte Säule mit einem HETP/Dp-Wert von 2,75 und einem Vi/Vo-We-rt von 1,55 zu ergeben.

Unter Verwendung dieser Säule wurde mit Serum eines unter lierenversagen leidenden Patienten eine Chromatografie in

60 348 12 - 33 -

einer im wesentlichen dem Ausführungsbeispiel 2 gleichenden Weise durchgeführt, wobei hier allerdings die Analyse bei einer höheren Fließgeschwindigkeit des Eluenten erfolgte. Abbildung 5 (a) zeigt ein Chromatogramm, das bei einer Fließgeschwindigkeit des Eluenten von 1,0 ml/min gewonnen wurde; Abbildung 5 (b) zeigt das Chromatogramm der Fließgeschwindigkeit von 2,0 ml/min. Das bei der letztgenannten Geschwindigkeit aufgenommene Chromatogramm (Abb, 5b)-hier entspricht die Fließgeschwindigkeit einer Lineargeschwindigkeit von 2,72 m/h - zeigt nahezu die gleiche Auflösung wie das bei einer Fließgeschwindigkeit von 1,0 ml/ min (Abb, 5a) gewonnene Chromatogramm, Es kann somit die Schlußfolgerung gezogen werden, daß die in der erfindungsgemäßen Weise gefüllte Säule die Durchführung einer Hochgeschwindigkeitschromatografie mit hohem Auflösungsvermögen gewährleistet. Darüber hinaus zeigte die Säule auch noch nach Chromatografie von 150 Blutserumproben bei einer Fließgeschwindigkeit von 2,0 ml/min die gleiche Auflösung und Effizienz, wie sie nach Herstellung der Säule vorlag. Dies beweist- die verlängerte Haltbarkeit der erfindungsgemäß gefüllten Säule.

Ausführungsbeispiel 5

Ein Gemisch aus 100 g Vinylazetat, 32,2 g Triallylisozyanurat (Yernetzungsgrad: 0,25), 40 g n-Butylazetat und 3»3 g 2,2^r-Azobisisobutyronitril wurde suspensionspolymerisiert, gefiltert, extrahiert,einer Umesterung unterzogen und klassifiziert, wobei im wesentlichen in der in Ausführungsbeispiel 2 beschriebenen Weise vorgegangen wurde. Gewonnen wurden dabei Gele mit einem Dp—Wert von 13/um, einem Dp/Dn-Wert von 1,32, einer Hydroxylgruppenkonzentration von 8,2 Milliäquivalent/g und einem W„-Wert von 1,05 ml/g*4 Die so gewonnenen Gele wurden in im wesentlichen dem Ausführungsbeispjel 1 entsprechender Weise in eine

£ ϋ ι ϋ ι y ^

6θ 348 12 - 34 -

Säule von 7,5 nnn Innendurchmesser und 500 mm Länge gefüllt, um so eine gefüllte Säule von HETP/Dp 3,4 und Vi/Vo 1,20 su erhalten* Unter Einsatz dieser gefüllten Säule erfolgte die Chromatografie mit einem wäßrigen Gemisch aus Chloriden von HfjIir'-Dimethyl^^'-bipyridylium (NQ), N-Methyl-4-(4-pyridyl)-pyridinium (MQ) und N-Methylpyridinium (MS) das Gemisch entstand im Verlauf der Herstellung einer Agrochemikalie - durch Eluieren mit wäßriger 0,3 Mol/l HaCl bei einer Fließgeschwindigkeit von 1,0 ml/min. Das entstandene Chromatogramm ist in Abbildung 6 dargestellt. Es zeigt deutlich Fraktionen des Gemisches. Hieraus kann geschlossen werden, daß die erfindungsgemäß gefüllte Säule auch zur Fraktionierung und Erkennung von Elektrolyten mit niedriger relativer Molekülmasse wirkungsvoll eingesetzt werden kann.

Claims (12)

1. «#

   -35- 18.8.1982

   AP B 01 D/237 376/0 60 348/12

   Erfind ungs ans pr uch

   1. Flüsaigchromatografie-Säule, gekennzeichnet dadurch, da!3 sie aus einem mit hohem Füllungsverhältnis gefüllten Bett vollständig poröser, Yinylalkohol-Binheiten enthaltender und einen durchschnittlichen Korndurchmesser von 4 bis 20/üm aufweisenden Gelen besteht, wobei das Gelbett einen Gleichmäßigkeitsgrad von 2,0 bis 4,0 zeigt und der genannte Gleichmäßigkeitsgrad sich ergibt aus HETP/Dp, wobei HlTP der äquivalenten Stillkörperhöhe und Dp dem Massemittel-Korndurchmesser der Gele entspricht.
2. 2. Plüssigchromatografie-Säule nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Gele einen mittleren Korndurchmesser von 6 bis 15/Um aufweisen.
3. 3. Flüssigchromatografie-Säule nach einem der Punkte 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß die Gele von einem Yinylkarboxylat-Homopolymer oder -Kopolymer abgeleitet sind.
4. 4. Plüssigchromatografie-Säule nach Punkt 3, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem Kopolymer um ein Kopolymer aus Vinylkarboxylat und ein einen Isozyanuratring enthaltendes vernetzbares Monomer handelt.
5. 5. Plüssigchromatografie-Säule nach Punkt 3, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem Kopolymer um ein Kopolymer aus Vinylkarboxylat und ein einen Zyanuratring enthaltendes vernetzbares Monomer handelt·
6. 6. Plussigchromatografie-Säule nach Punkt 4, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem den Isozyanuratring ent-

   -3b- 13.8.1982

   AP B 01 D/237 376/0 60 348/12

   haltenden vernetzbaren Monomer um '^riallylisozyanurat handelt,
7. 7. Plüaaigchromatografie-Säule nach Punkt 3» gekennzeichnet dadurch, daß das Vinylkarboxylat-Homopolymer oder -Kopolymer von einem Monomer abgeleitet wird, welchea mindeatena zwei Eatergruppen von Yinylkarboxylat enthält·

   8· 3?lüsaigchromatografie-Säule nach Punkt 7, gekennzelehnet dadurch, daß ea aich bei dem mindeatena zwei ^inylkarboxylat-Satergruppen enthaltenden Monomer um Divinyladipat handelt.
8. 9. Plüasigchromatografie-Säule nach einem der vorgenannten Punkte 1 bia 8, gekennzeichnet dadurch, daß die Gele einen Waaaerwiedergewinnungawert von 0,6 bis 2,0 ml/g aowie einen Vi/Vo-Wert von 1,0 bia 2,0 aufweisen, wobei Vi dem inneren"Volumen dea Gelkornes und Vo dem Hohlraumvolumen zwiachen den Gelkb'rnern entspricht·

   10· Flüaaigchromatografie-Säule nach einem der Punkte 1 bia

   9, gekennzeichnet dadurch, daß die Gele eine Hydroxylgruppenkonzentration von 3 bia 15 Milliäquivalent/g aufweiaen.
9. 13. Plüaaigckromatografie-Säule nach einem der Punkte 1 bia

   10, gekennzeichnet dadurch, daß die Gele ein Püllungaverhältnia von 0,66 bia 0,78 aufweiaen.
10. 12. Verfahren zur Herateilung einer mit vollatähdig poröaen Vinylalkohol-Einheiten enthaltenden Gelen gefüllten Plüasigchromatografie-Säule im feuchten Zuatand, ge-

    13,8,1982

    AP B 01 D/237 376/0

    60 348/12

    kennzeichnet dadurch, daß das Verfahren folgende Schritte umfaßt:

    1) Überführen eines Gelschlammes in einen lüllapparat, welcher einer Säule abnehmbar angeschlossen ist, die an ihrem unteren Ende ein mit einem filter ausgestattetes erstes ^ndverbindungsstück"aufweist, worauf der Püllapparat in einen komprimierbaren Zustand versetzt wird;

    2) Durchleiten einer 5¹UlIflüssigkeit durch den Füllapparat und die Säule, um den Gelschlamm in die Säule zu bewegen und um die im Gelschlamm enthaltene Püllflüssigkeit vermittels des am ersten Sndverbindungsstück befindlichen Pilters abzuscheiden, wodurch ein Gelbett in der Säule gebildet wird;

    3) schrittweises oder kontinuierliches Steigern der Pließgeschwindigkeit der Püllflüssigkeit, um das Füllverhältnis des Gelbettes auf einen vorbestimmten ?/ert einzustellen; und

    4) Abnehmen der Säule vom Füllapparat und Anbringen eines zweiten mit einem Filter versehenen Endverbindungsstückes am oberen Säulenende, um somit das gebildete Gel in der Säule zu halten;

    in Schritt 2) erreicht dabei die in einer Fließgeschwindigkeit von 0,2 bis 1,5 m/h durchzuleitende Püllflüssigkeit vom Beginn des Einspeisens bis zu dessen Abschluß das -Ein- bis Dre!hundertfache des Innenvolumens der Säule·

    18,8,1932

    AP B 01 D/237 376/0

    60 348/12

    13· Verfahren zur Herstellung einer Plüssigchromatografie-Säule nach Punkt 12, gekennzeichnet dadurch, daß in Schritt 3) die Fließgeschwindigkeit der Killflüssigkeit dergestalt gesteigert wird, daß der Maximaldruckanstieg pro Meter des Gelbettes bis zu 60 kg/cm /min und der mittlere Druckanstieg des Gelbettes 2 bis 80 kg/cm /h betragen kann.
11. 14. Verfahren zur Herstellung einer Plüssigchromatografie-Säule nach einem der Punkte 12 und 13, gekennzeichnet dadurch, daß die Gele einen Massemittel-Korndurchmesser von 4bis 20 ,um aufweisen.

    15· Verfahren zur Herstellung einer iTüssigchromatografie-Säule nach einem der Punkte 12 oder 13, gekennzeichnet dadurch, daß die Säule einen Innendurchmesser von 4 bis 40 mm und eine Länge von 100 bis 500 mm besitzt·

    i6e Verfahren zur Herstellung einer Plüssigchromatografie-Säule nach einem der Punkte 12 bis 15, gekennzeichnet dadurch, daß die Gele von einem Kopolymer aus Vinylkarbozylat und Iriallylisozyanurat abgeleitet werden,»
12. 17. Verfahren zur Herstellung einer S'lüssigchromatografie-Säule nach Punkt 12 oder 13, gekennzeichnet dadurch, daß der Gelschlamm einen Gelgehal^aufweist, der das 1,1- bis 4fache der in die Säule einzufüllenden Gelmenge ausmacht,

    BierziLJLSeiten Zeichnungen